Enzimas Holocelulósicas - 20240424 - 141940 - 0000

Producción de
enzimas
holocelulósicas a
partir de hongos
Enzimología
Equipo 3
Introducción
Los plásticos contaminan, una alternativa es el uso de
biopolímeros producidos microbianamente para fabricar
bioplásticos biodegradables en ambientes normales.
Los hongos son degradadores primarios de residuos
lignocelulósicos.
Hidrolizaron la paja de trigo pretratada para la
producción de azúcares reductores, empleados en la
fermentación microbiana y producir PHB (Ácido
polihidroxibutírico).
Aspergillus nidulans se utilizó para desarrollar un
sistema de hidrólisis enzimática eficiente y de bajo
costo, generando azúcares reductores a partir de biomasa
lignocelulósica.
Metodología
La paja de trigo se recolectó localmente en los campos de
investigación experimentales del ICAR-Instituto Indio de
Investigación Agrícola (IARI) en Nueva Delhi:
Se recogió, se lavó y se secó al sol durante 2 días antes de

cortarla en trozos aproximadamente de 0,5 a 1,0 cm y se secó
en un horno con circulación de aire durante 48 h a 60 °C.
Finalmente, se molió hasta que espesó 10 mm con una

amoladora y se almacenó
Se utilizó un cultivo de hongos de A. nidulans
previamente aislado, caracterizado y mantenido en la
colección de cultivos de la división de Microbiología,
ICAR, en el instituto ya mencionado.
El hongo se cultivó y se mantuvo en placas con agar

papa dextrosa (PDA) suplementado con estreptomicina
(30 ppm) antes de usarlo para preparar un inóculo de
esporas de hongos activo.
Se utilizaron dos aislados de bacterias halófilas: B.

gladioli 2S4R1 y B. cereus LB7. Seleccionados para la
producción de PHB [33, 34] de Rann of Kutch,
Gujarat, India, lixiviados de paja de arroz pretratada.
Se produjo un extracto crudo de cóctel de enzimas
holocelulósicas a partir de A. nidulans mediante SSF
utilizando paja de trigo molida. Se utilizó medio mineral
de Reese (RMM) sin fuente de carbono (agente humectante)
y la relación sólido-líquido se mantuvo en 1:10.
Se tomaron 10g de paja de trigo molida en un frasco

Erlenmeyer de 1L y se agregaron 100 ml de RMM. La paja
de trigo y la suspensión de RMM se esterilizaron por
autoclave a 121 °C en 20 minutos a 15 psi. Los matraces se
inocularon con cultivo de A. nidulans que tenía un recuento
de esporas de 109 esporas ml-1 (medido con hemocitómetro)
y se depositaron a 30 °C en una incubadora de DBO por 9
días.
Hubo cambios en el pH (5,0–7,0) con un incremento de 0,5,

utilizando NaOH 0,1 N y HCL, la temperatura (20– 40 °C)
con un incremento de 5 ° C .
Para la extracción del cóctel de enzimas crudo se usó un
tampón de citrato de 1:10 mediante filtración con tela muselina
y centrifugación a 10.000 rpm por 10 minutos.
La enzima cruda se concentró después de precipitarla en

acetona enfriada. El extracto enzimático crudo se mezcló con
acetona fría en proporción 1:4 y se almacenó a -20 °C durante
la noche. Después de su centrifugación, se decantó el
sobrenadante y el sedimento se suspendió en 10 ml de tampón
antes de centrifugarlo nuevamente y desecharse. Al terminar
la incubación, se añade 1ml del tampón (con pH de 10,8) para
finalizar la reacción. Se introdujeron 3 ml de solución de
DNSA en la reacción para detenerla y se mantuvieron en un
baño de agua a 100 °C durante 15 min. Las muestras se
enfriaron a temperatura ambiente (casi 30 °C) y se
cuantificaron espectrofotométricamente a 575 nm. El
concentrado de enzima se mantuvo a 4 °C.
Se cuantificaron actividades celulolíticas como carboximetilcelulasa
(CMCase), celobiohidrolasa (FPasa), xilanasas y β-glucosidasa en el
extracto enzimático crudo concent
Pretratamiento y sacarificación de la paja de arroz.
Se pretrataron 5g de paja de arroz picada y molida con NaOH al 1% y H2SO4
(pretratamiento con álcali y ácido) durante 1 hora a temperatura ambiente en
condiciones estáticas y 121 °C durante 20 m en un autoclave, respectivamente.
Después de la incubación, la muestra se filtró con una tela de muselina y se lavó
con agua destilada hasta neutralidad, se secó en una estufa con circulación de aire
y se almacenó a temperatura ambiente para su posterior uso en sacarificación. La
sacarificación de paja de arroz pretratada con álcali y ácido se realizó según el
método NREL LAP-009 por Brown y Torget [44]. Se administró paja de arroz
pretratada (1,2 g) en botellas con tapa de rosca de 50 ml y se aplicaron enzimas
crudas concentradas derivadas de A. nidulans a 25 y 50 FPU g-1 gramo de sustrato
seco
La actividad enzimática del extracto de enzima
holocelulósica de hongos en futuros experimentos.
Se extrajeron hasta 20 ml del volumen con un tampón
de citrato 0,05 M (pH 4,8) y la mezcla se incubó en un
baño de agua con agitador a 50 °C durante 72 h. Se
tomaron muestras de alícuotas de la mezcla a las 24,
48 y 72 h, y se cuantificó mediante HPLC la cantidad
de azúcares reductores liberados. El sistema HPLC
utilizado en el estudio utilizó una bomba binaria
Waters 515 y un detector de índice de refracción (RID)
junto con un horno de columna para mantener la
temperatura constante de la columna BIORAD
Aminex HPX-87H a 50 °C durante todo el
experimento.
El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando herramientas
estadísticas en línea del ICAR-Instituto Indio de Investigación
Estadística Agrícola (IASRI),
Resultados
Varios hongos son conocidos por su capacidad para producir
enzimas inducibles como celulasas y hemicelulasas cuando se
cultivan con sustratos como biomasa lignocelulósica,
desechos de alimentos, desechos sólidos municipales y otros
desechos industriales. Estas enzimas se pueden utilizar
eficientemente para la hidrólisis de residuos agrícolas
lignocelulósicos para la generación de azúcares fermentables
que a su vez son importantes para producir biocombustibles y
bioplásticos.
La máxima actividad enzimática se produjo a 30 °C, pH 6,0 y

tiempo de incubación de 7 días. La hidrólisis enzimática de la
paja de arroz produjo una cantidad significativamente mayor de
azúcares reductores (8,484 a 30,91 gL-1 ) y el empleo de B. gladi-
oli 2S4R1 y B. cereus LB7 dio como resultado la producción de
26,80 % y 20,47 % de PHB en una célula. base de peso seco
Resultados
El hongo se cultivó en paja de trigo con medio mineral Reese.
Después de 216hrs de fermentación en estado sólido a 30 °C y pH
6, el extracto enzimático de A. nidulans demostró la mayor
actividad: CMCasa 68,58 (±0,55), FPasa 12,0 (±0,06), Xilanasa 27,17
(±0,83). y β-glucosidasa 1,89 (±0,037).
Se produjeron azúcares reductores (8,484 a 30,91 gL-1 ) que luego
se usaron para producir PHB utilizando aislados de bacterias
halófilas. Burkholderia gladioli 2S4R1 y Bacillus cereus LB7
acumularon 26,80% y 20,47% de PHB del peso seco celular,
respectivamente. Las enzimas holocelulósicas podría
desempeñar un papel en la hidrólisis enzimática de materiales
lignocelulósicos y en la producción de PHA a partir de materias
primas menos costosas, como las agrícolas.
Conclusión
En este estudio se utilizó Aspergillus nidulans para producir un cóctel de enzimas
holocelulósicas, para desarrollar un sistema de hidrólisis enzimática de bajo costo para la
hidrólisis de la paja de arroz, que finalmente se utilizó para producir PHB. Se encontró
que el extracto enzimático produce CMCasa 68,58 UI ml-1 FPasa 12 UI mL-1 , , xilanasa
27,17 UI ml-1 y β-glucosidasa 1,89 UI ml-1 en fermentación en estado sólido. Se descubrió
que las condiciones de crecimiento variables, como la temperatura de incubación y el pH,
afectaban la actividad enzimática del extracto enzimático.
El desarrollo y uso de un proceso de hidrólisis enzimática y de producción de PHB tan

eficiente y de bajo costo ayudará a reducir el costo de producción de PHA, haciendo que
su producción industrial sea más económica.
¡Muchas
gracias por
su atención!

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