UD 7. Incubación y Conservación de Cultivos

UD 7.
INCUBACIÓN Y CONSERVACIÓN DE CULTIVOS
1.- INTRODUCCIÓN
El proceso mediante el cual se consigue el crecimiento de las bacterias.

Una vez sembradas en el medio adecuado se introducen en la estufa de incubación
(incubadora) a la temperatura y atmósfera más adecuada para el cultivo un tiempo
determinado.
Temperatura y tiempo de incubación dependen:
- Del tipo de microorganismo.
- De la observación o medición que queramos realizar.
- Del tipo de cultivo y del medio usado para el mismo.
El medio ambiente necesario para el crecimiento microbiano no sólo lo dan los
nutrientes y la temperatura de incubación, sino también la atmosfera en la cual se
lleva a cabo (Ej.: Microorganismos anaerobios).
Los cultivos en placa, en general, deben ser incubados en posición invertida para evitar
que la humedad condensada caiga sobre las colonias en crecimiento y pueda afectarle.
ESTUFAS INCUBADORAS
 Sus puertas no deben abrirse más de lo necesario.
 Deben mantenerse encendidas para tener una temperatura constante.
 Si se necesita cambiar de temperatura preferiblemente (cuando sea posible)
cambiar de estufa en lugar de cambiar la temperatura de la estufa.
2.- EFECTO TEMPERATURA.
 Generalmente: coincide con la temperatura óptima del microorganismo a

incubar, para su posterior identificación y/o recuento.
 En ciertos estudios de identificación, se utilizan medios especiales como, por
ejemplo, las siembras por picadura de gelatina que siempre se cultivan a 22°C.
 Si el cultivo se lleva a cabo con el fin de obtener datos sobre la movilidad o los
tipos de flagelos que puede presentar un microorganismo, la incubación
deberá realizarse a una temperatura inferior a la temperatura óptima de
crecimiento en unos 3-5°C.
 Si se trata de estudiar el potencial deterioro que puede tener un determinado
producto o alimento, la temperatura y condiciones de incubación dependerán
de las condiciones de almacenamiento previstas, o recomendadas, según el
producto o alimento en cuestión.
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3.- EFECTO TIEMPO
 En general: debe ser suficiente para que se formen el número de generaciones

suficientes para su identificación y recuento.
 Es función del tipo de cultivo, del microorganismo objeto de estudio y de la
finalidad del trabajo a realizar.
 Si transcurre demasiado tiempo puede ocasionar problemas:
o El envejecimiento de los cultivos → Puede interferir en las reacciones
específicas que de ellos se espera y ocasionar otras.
o La tasa de mutación aumenta → Puede cambiar el serotipo
predominante en el medio de cultivo y que no corresponda al inóculo
sembrado.
4.- CONSERVACIÓN DE CULTIVOS.
 Una vez conseguido un cultivo puro y perfectamente identificado, a veces,

resulta útil con su conservación durante períodos de tiempo más o menos
largos.
 En los laboratorios, principalmente de investigación, cada uno de los cultivos
puros se conserva para investigaciones posteriores, para poder confirmar las
pruebas ya realizadas, o incluso, simplemente para tomarlos como modelos. A
estas colecciones de cepas puras se las denomina ceparios.
 Existen diversos procedimientos para conservar y mantener cultivos
microbianos. El método adecuado depende del tipo de microorganismo y del
periodo de tiempo de conservación que se requiera.
 En general, estos métodos recurren a ralentizar el ritmo vital del
microorganismo, lo que se consigue mediante la bajada de temperatura, la
disminución de la actividad de agua del medio, o la conjunción de ambas.
 Se puede distinguir dos tipos de métodos de conservación de cultivos en
función del tiempo requerido: mantenimiento de periodo cortos y
conservación de periodos largos.
5.- MANTENIMIENTO EN PERIODOS CORTOS.
Semanas o meses (en ciertos cultivos incluso años)
REFRIGERACIÓN SIMPLE
 Habitual entre 4-8°C.
 Mantienen los medios de cultivo.
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 Muchos cultivos puros de bacterias, levaduras, hongos y otros
microorganismos, pueden permanecer viables durante varias semanas
(transferir periódicamente a medios de cultivo frescos)
 Algunos microorganismos (psicrófilos) son capaces de crecer a la T normal de
refrigeración.
 No necesita aparatos especiales.
CULTIVO EN AGAR INCLINADO.

 Muchas bacterias pueden conservarse sobre la superficie de agar inclinado (el
medio depende del microorganismo)
 Pueden realizarse en tubos de ensayo o frascos provistos de tapones de rosca
para evitar que se sequen.
 Una vez han crecido pueden almacenarse en una zona oscura (T ambiente) o un
refrigerador.
 Debe hacerse un paso a intervalos entre un mes y dos años (depende de la
especie a conservar).
CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO.

 Algunos cultivos de bacterias (como el ácido láctico) no desarrollan bien en la
superficie de medios sólidos en condiciones aerobias, por tanto, es preferible
hacerlos en medios líquidos como leche tornasolada con levadura, glucosa y
yeso, o carne cocida de Robertson)
 Se debe realizar un pase cada 2-4 meses a un año.
 Los medios que llevan azucares añadidos deben contener yeso que actuará
como sistema amortiguador en caso de que se produzca un pH demasiado bajo.
6.- MANTENIMIENTO EN PERIODOS LARGOS.
Supone la conservación de años o decenas de años sin necesidad de pases de un medio

agotado a otro nuevo.
CONSERVACIÓN EN ACEITE
 Los cultivos que se dejan crecer en agar inclinado o los que fueron sembrados
en profundidad mediante inoculación por picadura, son posteriormente
cubiertos con parafina líquida estéril o aceite mineral estéril.
 Generalmente permanece su viabilidad durante varios años sin necesidad de
hacer pases.
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SUSPENSIONES EN SUERO DESECADO.
 Se suspende un asa del inóculo tomado de un cultivo de 24-48h en 2ml de
suero estéril y de esta suspensión se pone una gota de cada uno de una serie
de tubos de 50x6mm, estériles y provistos de tapones.
 Se secan al vacío (desecador con pentóxido de fósforo durante unos 7 días,
renovando el vacío cada 24h) a 5°C.
 Cada tubo, conteniendo una suspensión totalmente seca, se coloca dentro de
otro mayor de vidrio sódico de fácil fusibilidad al que se le hace el vacío y se
cierra la llama.
 Pueden permanecer en la nevera o en el congelador viables durante varios
años sin la necesidad de pases continuos.
CONGELACIÓN.
 También se denomina crioconservación.
 No recomendables los congeladores convencionales (hasta -20°C) por
proximidad de punto eutéctico (disolución de sólidos que solidifican como
sólidos separados)
 Se utilizan congeladores especiales (-70°C o -195°C)
 Inconveniente: aunque la congelación se haga muy rápido, se destruye cierta
parte de microorganismos incluso utilizando crioprotectores.
 Los periodos de conservación pueden ser superiores a 10 años.
LIOFILIZACIÓN.
 Permite desecar casi totalmente una estructura biológica, previamente
congelada, sublimando bajo presión reducida el agua (en forma de hielo) que
contiene.
 Los microorganismos se liofilizan en presencia de un agente protector y se
guardan en ampollas selladas al vacío.
 Se pueden llegar a lograr períodos de conservación de más de 20 años.
7.- VELOCIDAD DE CRECIMIENTO.
 Es el cambio de número de células en la unidad de tiempo, aunque también se

puede definir en términos de variación de masa.
 El crecimiento es una función esencial en los seres vivos, ya que estos tienen un
tiempo de vida definido, y la especie solo puede sobrevivir como el resultado
del crecimiento en una población.
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 Los microorganismos son capaces de duplicarse, mediante un complejo sistema
de reacciones bioquímicas (mas de 2000) muy variadas (rotura, unión,
polimerización, ensamblaje de los diferentes componentes…)
 La determinación de la velocidad de crecimiento en un cultivo sirve para:
 Estudios en relación con el deterioro de bienes de consumo.
 Determinar la vida útil de los alimentos.
 Estudiar el uso de agentes conservadores en los alimentos.
 Cuando resultan insuficientes los análisis de calidad de los sistemas de
conservación.
 Determinar la velocidad de producción de productos de fermentación.
 Estudiar el efecto de la temperatura de incubación, del medio de cultivo
escogido, etc.
 Para determinar si el proceso de incubación con fines analíticos resulta
correcto.
8.- CINÉTICA DE CRECIMIENTO BACTERIANO.
El crecimiento bacteriano es la división de una bacteria

en dos células hijas en un proceso llamado fisión binaria,
escisiparidad o bipartición.
Suponiendo que no se produzca una mutación, las células
hijas serán genéticamente idénticas a la célula original.
De esta forma tiene lugar la duplicación local de la
población bacteriana, si bien es cierto que las dos células
hijas creadas tras la división celular no tienen que
sobrevivir necesariamente. Si el número de
supervivientes supera la unidad, en promedio, la
población bacteriana experimenta un crecimiento exponencial.
Este crecimiento exponencial vendrá limitado a la disponibilidad de alimentos.
Presenta 4 fases bien diferenciadas:
a) FASE DE ADAPTACIÓN (fase lag o fase de latencia): las bacterias se adaptan a
las condiciones de crecimiento. Es el periodo en el que las bacterias
individuales están madurando y no tienen aún la posibilidad de dividirse. En
esta fase se produce la síntesis de ARN, enzimas y otras moléculas. En esta fase
los microorganismos están latentes.
b) FASE EXPONENCIAL (fase logarítmica): Período caracterizado por la duplicación
celular. El número de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es
proporcionar a la población actual (cinética de primer orden). Si el crecimiento
no se limita, la duplicación continuará a un ritmo constante, por lo tanto el
número de células o la población se duplican con cada periodo de tiempo
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consecutivo. Este crecimiento no continua indefinidamente ya que el medio
llega pronto al agotamiento de nutrientes mientras se acumulan los deshechos.
c) FASE ESTACIONARIA: La tasa de crecimiento disminuye como consecuencia del
agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos tóxicos. Esta fase se
alcanza cuando las bacterias empiezan a agotar los recursos que están
disponibles para ellas. Esta fase se caracteriza por un valor constante del
número de bacterias a medida que la tasa de crecimiento de las bacterias se
iguala con la tasa de muerte bacteriana.
d) FASE EN DECLIVE: O muerte, donde las bacterias se quedan sin nutrientes y
mueren.

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INCUBACIÓN Y CONSERVACIÓN DE CULTIVOS

El proceso mediante el cual se consigue el crecimiento de las bacterias.

2.- EFECTO TEMPERATURA.

 Generalmente: coincide con la temperatura óptima del microorganismo a

 En general: debe ser suficiente para que se formen el número de generaciones

4.- CONSERVACIÓN DE CULTIVOS.

 Una vez conseguido un cultivo puro y perfectamente identificado, a veces,

5.- MANTENIMIENTO EN PERIODOS CORTOS.

Semanas o meses (en ciertos cultivos incluso años)

CULTIVO EN AGAR INCLINADO.

CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO.

6.- MANTENIMIENTO EN PERIODOS LARGOS.

Supone la conservación de años o decenas de años sin necesidad de pases de un medio

7.- VELOCIDAD DE CRECIMIENTO.

 Es el cambio de número de células en la unidad de tiempo, aunque también se

8.- CINÉTICA DE CRECIMIENTO BACTERIANO.

El crecimiento bacteriano es la división de una bacteria

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