UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA

“RESISTENCIA A PLAGAS EN FRESAS TRANSGÉNICAS”

INTEGRANTES:

Cancio Moya Linda Minely

Gutierrez Vasquez Palermo Nehemias

Marcelo Cruz Andy Yoel

Ñiquen Maqui Jefferson Esteban

Renilla Olivos Fátima Lorena

DOCENTE

Mg. Óscar García Minaya

Nuevo Chimbote – Perú

2024-I

1
2
ÍNDICE

ÍNDICE 3

I. INTRODUCCIÓN 5

II. MARCO TEÓRICO 7

1.1. VARIABLE 1: FRESAS TRANSGÉNICAS 7

1.2. VARIABLE 2 : PLAGAS 12

III. DESARROLLO TEÓRICO 22

IV. CONCLUSIONES 31

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 32

3
4
I. INTRODUCCIÓN

En la modernidad existen diversos cambios ocasionados por el avance

acelerado de la tecnología. Un caso importante que concierne al ámbito de la

biotecnología y la ingeniería genética es la de los organismos genéticamente

modificados (OGM), donde podemos encontrar a los famosos alimentos

transgénicos.

Se puede definir a los OGM como cualquier organismo al que se le haya

modificado el ADN, el cual se logra por medio de la ingeniería genética, donde

se le introduce un gen. Esto se realiza con la finalidad de alterar las propiedades

de tal organismo (Soro Arroyo et.al, 2021). Entre los alimentos modificados

genéticamente, se estudiará el caso de la fresa en este apartado.

La fresa (Fragaria x Ananassa) es una de las plantas más cultivadas,

conocida por su alto contenido de fenoles, fibras, micronutrientes y minerales; sin

embargo es muy susceptible a la antracnosis, que afecta a la finca, valor

económico y productividad antes y después de la cosecha (Shi et al., 2022).

La Antracnosis es una enfermedad causada por hongos del género

Colletotrichum, muy devastadora ya que afecta diversos órganos de la fresa como

raíces, frutos y hojas. (Fan et al., 2023).

La fresa pertenece a la familia Rosaceae y al género Fragaria. Deriva del

cruce entre la F. virginiana y la F. chiloensis, en Francia, 1765. El género Fragaria

está compuesto por 27 especies (Kirchbaun, 2022). Actualmente se conocen más

de 400 variedades (Benavides et. al, 2022).

Una fresa transgénica es la que ha sido modificada genéticamente por

medio de ingeniería genética. A estas se les incorpora genes de otras especies

5
para añadirles características deseadas y que sean de beneficio. Como

biotecnólogos podemos llevar a cabo la resistencia de la fresa transgénica en las

plagas.

Según “National Pesticide Information Center” (NPIC, 2021), las plagas

son plantas, animales, insectos, microorganismos u otros organismos no deseados

que interfieren con la actividad humana. Pueden infectar o morder a las personas,

destruir cultivos alimentarios, dañar propiedades, etc.

Actualmente, las estrategias de control usadas contra plagas de insectos se

basan en aplicar insecticidas sintéticos. La eficacia de estos tratamientos podría

verse perjudicada debido a la resistencia de poblaciones de insectos hacia estos

productos químicos (Cáceres et al., 2019).

Un estudio realizado en Venezuela entre 2013 y 2016 reveló en primera

instancia la presencia de Frankliniella occidentalis en cultivos de fresas. Se halló

que F. occidentalis se alimentaba en botones florales, flores y frutos en formación,

lo que ocasiona manchas marrones, necrosis y deformación de los frutos. La

variedad de fresa Chandler mostró cierta resistencia a esta plaga en algunas

localidades (Solano-Rojas et al., 2018)

En el mismo estudio se descubrió por primera vez en Venezuela la

presencia del ácaro bimaculado Tetranychus urticae en los cultivos de fresas. Se

realizó un análisis y los especímenes que se recolectaron fueron enviados al

laboratorio para que pudieran ser identificados. T. urticae se encontró en el envés

de las hojas de fresa, causando amarillamiento o enrojecimiento.(Solano-Rojas et

al., 2018).

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 La pregunta problema del trabajo se enfoca en estudiar si, ¿Podrían las

fresas transgénicas con resistencia a plagas ser una solución viable para reducir el

uso de pesticidas y proteger la salud humana y el medio ambiente?

El objetivo general es analizar la viabilidad de las fresas transgénicas con

resistencia a plagas como una solución para reducir las pérdidas por plagas y

mejorar la producción de fresas; y los específicos son analizar los mecanismos de

resistencia a plagas en fresas transgénicas, evaluar los beneficios potenciales de

las fresas transgénicas con resistencia a plaga y estudiar las consideraciones y

desafíos asociados con las fresas transgénicas, como la seguridad, el impacto

ambiental y la aceptación del consumidor.

II. MARCO TEÓRICO

1.1. VARIABLE 1: FRESAS TRANSGÉNICAS

1.1.1. Definición

Las fresas transgénicas son aquellas que han sido alteradas

genéticamente mediante la incorporación de material genético de una

especie diferente. resistentes a enfermedades

Según la Organización Mundial de la Salud (2018), lo que se busca

con este procedimiento es aportar a las fresas ciertas características que

no se presentan naturalmente en ellas, por ejemplo, resistencia a

enfermedades y mejor calidad nutricional, además de otras características

agronómicas como el período de vida útil.

7
1.1.2. Beneficios e importancia de las fresas transgénicas

Según Chaves et al (2017) la característica principal en la fresa

transgénica son los compuestos fenólicos, que tienen antocianinas, dando

el color brillante a la fresa, una propiedad anticancerígena y

antiinflamatoria además de reducir el riesgo de problemas

cardiovasculares por medio de la inhibición de la oxidación del colesterol

LDL (lipoproteína de baja densidad);

La fresa transgénica contiene carbohidratos más bajos en calorías

y una fuente de vitamina C y fibra, superando en esta a las naranjas; Su

composición química es ácido ascórbico (64,omg), agua (91,75 g),

proteína (0,61 g), grasa (0,37 g), carbohidratos (7,02 g), fibra (2,3g) calcio

(14omg), potasio (166,0 mg/160 g) y vitamina A (27 UI) (Chandrakar et

al, 2018).

1.1.3. Bases Genéticas de la Modificación de Fresas

● Técnicas de modificación genética

Una de las maneras más sencillas de producir fresas con

características es dada por el cruce selectivo. La fresa cultivada que

comúnmente consumimos (Fragaria x ananassa) es resultado de la

hibridación de especies silvestres (AgTech América, 2021).

El método CRISPR () es una manera de edición genética donde se

alteran y modifican el gen de interés con gran precisión sin afectar de otra

forma los rasgos favorables de una variedad de élite. Así pues, se cambia

la secuencia de ADN del gen mediante cortes del genoma y así poder

agregar o eliminar genes que ya existen (Lee et al, 2021)

8
 Un método muy común es el uso de Agrobacterium tumefaciens

debido a su capacidad natural para transferir ADN a los genomas de las

diferentes plantas hospedadoras. Así pues, con este método se le pueden

agregar genes a conveniencia a las plantas que se desea modificar y así

mejorar sus propiedades (Thomson et al, 2020).

● Genes comúnmente modificados en fresas y su función.

En las fresas transgénicas, los genes se pueden modificar con el

objetivo de introducir características deseables como resistencia a

enfermedades, mejor calidad de frutos, aumento de la producción, o

adaptación a condiciones ambientales adversas. Algunos ejemplos de

genes frecuentemente modificados son los siguientes:

MYB10: Es un gen encargado de la producción de antocianinas,

los cuales proporcionan el característico color rojo al fruto de la fresa

(Castillejo et al, 2021).

FaPG1: Es un gen el cual tiene como propósito la pérdida de

firmeza de la pared de las células de las fresas. Su “silenciación” provoca

un retraso en la maduración de la frutilla, sin afectar color, sabor o tamaño

(Paniagua et al, 2017).

FaRIF: El Ripening Inducting Factor o FaNaCo35 contribuye a los

procesos de maduración de las fresas, como la vía de los fenilpropanoides,

la estructura de la pared celular, metabolismo de fitohormonas y

metabolismo aeróbico (Pizarro et al, 2021).

FaDREB1 : Aumenta la tolerancia de la planta hacia el estrés

abiótico. Las plantas que expresan de sobremanera este gen presentan

9
 mejor tolerancia a la salinidad y sequías que las plantas de tipo silvestre

(Li et al, 2012).

DREB: Los factores de transcripción de unión a elementos

sensibles a la deshidratación denominados de manera sintética DREB

tienen un rol esencial en el crecimiento, el desarrollo y las respuestas al

estrés de las plantas (Chai et al, 2020).

FaWRKY: Este gen podría actuar como un represor de ciertos

genes de defensa en lugar de activarlos. Esto podría llevar a una

disminución en la producción de proteínas y metabolitos defensivos

necesarios para combatir el patógeno. Su silenciamiento puede tener un

efecto positivo en la fresa.

1.1.4. Proceso de Creación de Fresas Transgénicas

● Objetivos y razones para el desarrollo de fresas transgénicas (mejora

de resistencia a plagas, enfermedades, y factores ambientales).

Según Sánchez (2021) la mejora de las cualidades

organolépticas del fruto y la disminución del reblandecimiento para

alargar la vida postcosecha del fruto, son unos de los principales

objetivos de los programas de mejora en este cultivo.

Según Beltrán (2018) el papel que los cultivos transgénicos

juegan en las estrategias de mejora genética de las plantas con las que

producimos comida para nosotros y los animales parece indispensable.

● Etapas del desarrollo desde el laboratorio hasta el campo.

Las nuevas técnicas de selección vegetal, a través de

metodología modernas de ingeniería genética, por otro parte, son

10
simplemente técnicas innovadoras mejoradas y refinadas de mayor

precisión de los métodos de fitomejoramiento existentes, y han sido

diseñadas para incrementar la velocidad y eficiencia del

fitomejoramiento. Estas metodologías son llamadas nuevas técnicas de

mejoramiento de plantas (Von Bothmer,2022).

Con los avances científicos desarrollados por los centros de

investigación y universidades se ha logrado la generación de variedades

de fresa mejoradas, las cuales muestran resistencia o tolerancia probada

a problemas fitosanitarios. Esto significa una disminución en la

aplicación de agroquímicos, lo que disminuye el impacto ambiental.

Además, la disponibilidad de las variedades mexicanas de fresa

permitirá obtener una mejor competitividad en el mercado nacional y

extranjero, esto permitirá un uso más eficiente de los recursos naturales.

Con lo anterior se pretende alcanzar un nivel mayor en las

exportaciones de fresa ya que estas han sufrido variaciones en cuanto a

volumen y valor de exportación (Rodríguez et.al,2016)

11
1.2. VARIABLE 2: PLAGAS

1.2.1. Definición y clasificación

Según la Organización de las Naciones Unidas para la

Alimentación y la Agricultura (2020) son organismos que directa o

indirectamente causen pérdidas económicas o dañen las plantas de

fresa, afectando su rendimiento, calidad y valor comercial.

De acuerdo a Carrillo (2019) nos brinda plagas que afectan a las

fresas que se pueden clasificar: masticadoras, chupadoras, perforadoras

y nemátodos.

1.2.2. Condiciones adecuadas para la proliferación de plagas

De acuerdo a Carrillo (2024) las plagas proliferan preferentemente

en verano, debido a ciertas condiciones que favorecen su diversificación.

Los motivos son:

● Aumento de la temperatura: Las temperaturas cálidas aceleran el

metabolismo de las plagas, así como su desarrollo y reproducción.

● Mayor disponibilidad de alimentos: Cuando la cantidad de

alimentos es abundante, las plagas aumentan. Casos como restos

de comida, jardines frutales y basura aportan alimento del que se

alimentan las plagas.

● Humedad: La mayoría de las plagas prosperan en zonas húmedas.

12
1.2.3. Impacto Económico del área Agrícola de las Plagas

Según Agroasemex (2019), las plagas no solo disminuyen la

producción agrícola, sino que también deterioran la calidad de los

cultivos, lo que tiene grandes repercusiones en el sector rural.

Asimismo, la Universidad Politécnica de Valencia (2021)

menciona que, en la producción de fresa, las plagas ocasionan pérdidas

económicas, reduciendo la calidad y el valor comercial.

1.2.4. Colletotrichum acutatum

● ¿Qué es?

Las especies de C. acutatum son patógenos destructivos de

plantas en todo el mundo. Hasta la fecha, este complejo era uno de los

grupos más grandes del género Colletotrichum con 43 especies

aceptadas en todo el mundo. Las formas de los conidios suelen hacer

que haya una identificación incorrecta (Plant, 2023).

● Enfermedad que causa (Antracnosis)

La antracnosis es una enfermedad que afecta a diversos cultivos.

Produce lesiones hundidas de color naranja en frutos jóvenes, los cuales

se secan, mueren y permanecen en el árbol durante todo el tiempo. Las

hojas afectadas presentan lesiones acuosas, amarillamiento, marchitez

y necrosis en los bordes, sus ramas infectadas sufren muerte regresiva,

lo que provoca la pérdida de frutos y debilitamiento del árbol (Suzanne,

2009).

13
● ¿Por qué ataca a la fresa?

La antracnosis es una enfermedad que puede infectar a

diferentes partes de la fresa, causando lesiones ovaladas de color

marron, gris y negro en las hojas, estolones y pedúnculos florales; si

las condiciones son adecuadas para el crecimiento del hongo las

lesiones contendrán pequeñas esporas anaranjadas (Figura 1); las

hojas infectadas formarán manchas marrones circulares irregulares y

también la producción de esporas anaranjadas (Sistema Nacional De

Vigilancia Y Monitoreo De Plagas, 2017).

Figura 1. Síntomas de la antracnosis y lugar de ocurrencia

La antracnosis en la fresa es causada principalmente por el

hongo Colletotrichum acutatum, aun así la fresa sigue siendo huésped

de otras especies como C. gloesporoides y C. fragariae; C. acutatum

14
 se encuentra en todas las regiones productoras de fresa, así como en

los cultivos y en la maleza. (Comisión de la Fresa de California, 2017).

Colletotrichum acutatum es el organismo responsable de la

antracnosis en las fresas, causando daños en su cultivo y, en menor

grado, afectando también a cítricos, arándanos, aguacates, papayas,

duraznos, entre otros. La entrada comienza mediante la formación de

un apresorio, que desarrolla una hifa que infecta al tejido vegetal,

ocurriendo la dispersión de conidios por medio de agua; pudiendo

desarrollar rápidamente síntomas o quedarse en estado quiescente,

incluso en la cosecha (Senasica, 2017).

III. DESARROLLO TEÓRICO

1) GENOMA DE LA FRESA

La fresa pertenece a la familia Rosaceae y tiene un genoma

muy pequeño debido a la falta de retrotransposones, que son

generalmente abundantes. Cómo ejemplo tenemos el caso de la frutilla

cultivada (Fragaria x ananassa: 2n=8x=56) es un poliploide con 56

cromosomas resultante de la hibridación interespecífica entre dos

especies de frutillas silvestres, también octoploides. Una de estas

frutillas es originaria del sur (F. chiloensis: 2n=8x=56) y la otra del

norte de América (F. virginiana: 2n=8x=56). La x en el nombre

científico hace referencia a su condición de híbrido. Se estima que el

tamaño del genoma varía entre 708 Mb y 720 Mb. El genoma de la

fresa es octoploide debido a numerosos eventos de poliploidía que

15
 involucran a cuatro especies ancestrales, que proporcionaron un

conjunto completo de cromosomas para el organismo fructífero. Esto

da como resultado una célula con ocho copias de cada cromosoma,

creando una célula octoploide. Las cuatro especies parentales

identificadas como donantes fueron F. vescasubsp. bracteata, F.

iinumae, F. viridis y F. nipponica (Whitaker et.al,2020).

FIGURA 2. Colinealidad a escala cromosómica de los subgenomas de F. ×

ananassa, F. vesca, F. iinumae y Rubus occidentalis.

La colinearidad del genoma también se conserva en gran medida

entre la fresa cultivada y la frambuesa. Sin embargo, hay algunas

inversiones cromosómicas entre los dos genomas. Esto sugiere que la

estructura del genoma de la frambuesa ha divergido más de la estructura

del genoma de la fresa durante millones de años de evolución.

El diagrama de colinealidad a escala cromosómica proporciona

información valiosa sobre la estructura del genoma de la fresa cultivada.

16
 Tabla 1. La anotación v1.0.a2 de F. ananassa contiene 108.447

genes codificadores de proteínas y 127.701 transcripciones.

En el proceso de desarrollo de la fruta para Pizarro (2018) la

maduración es un paso crítico para el desarrollo de la calidad del sabor en

las frutas. Este carácter ha disminuido significativamente en muchas frutas

carnosas en las últimas décadas. Esto es particularmente significativo en

la fresa (Fragaria × ananassa), donde los cultivares actuales se derivan de

una colección limitada de germoplasma.

17
 Los avances en la genómica de la fresa ofrecen muchas

oportunidades para la investigación genética. Más del 90% de los genes se

identifican mediante evidencia basada en la transcripción, y esta

información se puede utilizar para hacer comparaciones detalladas con

genes de otras especies, para identificar genes que controlan fenotipos

específicos y para facilitar el aislamiento de estos genes.

2) GEN FaWRK1

El gen FaWRKY1, el cual codifica un factor de transcripción WRKY

del grupo IIc y es homólogo al gen WRKY75 de Arabidopsis thaliana,

desempeña un papel en la respuesta de defensa de la planta contra la

antracnosis del fruto, causada por Colletotrichum acutatum. (Gala, 2021)

● Secuencia del gen FaWRKY1

Tabla 2. Secuencia del gen FaWRKY1 e información adicional

La tabla también muestra que hay una gran cantidad de diversidad

entre los genes codificadores de proteínas. Algunos genes son cortos y solo

producen una isoforma, mientras que otros son largos y producen muchas

isoformas. Esta diversidad refleja la complejidad de las funciones que

desempeñan las proteínas en el organismo.

18
3) GENOMA DEL HONGO COLLETOTRICHUM ACUTATUM

El complejo de la especie C. acutatum contiene la mayor parte de esta

diversidad dentro de un grupo de especies relativamente relacionadas. Este

artículo de Perspectiva presenta una revisión del conocimiento actual sobre la

filogenia, biología y patología de C. acutatum . También demuestra la

idoneidad de C. acutatum para el estudio de la evolución de familias de genes

a escala fina para descubrir eventos evolutivos en el genoma que están

asociados con la evolución de caracteres fenotípicos importantes para las

interacciones con el huésped (Baroncelli et. al ,2017)

El genoma de alta calidad se ensambla con un tamaño de 62,78 Mb y

15.845 genes codificadores de proteínas(Wang,2023).

Se ha investigado el rol del gen FaWRKY1 en la defensa de la fresa.

En un estudio anterior realizado por nuestro equipo, se analizó el gen

FaWRKY1, el cual codifica un factor de transcripción WRKY del grupo IIc

y es homólogo al gen WRKY75 de Arabidopsis thaliana. Este estudio reveló

que el gen desempeña un papel en la defensa de la planta contra la antracnosis

del fruto, causada por Colletotrichum acutatum (Garrido, 2021).

4) EXPLICACIÓN GENÉTICA

El hongo de especie Colletotrichum inocula por medio de los conidios,

producidos en acérvulos y rara vez en setas, y las ascosporas formadas y

liberadas desde peritecios. Según nos aclara la investigación realizada por el

doctor Garrido-Gala (2021) cuando el hongo Colletotrichum Acutatum

infecta a la Fragaria x Ananassa, esta última tiene diversos cambios

19
biológicos, siendo el más importante y conveniente para este estudio la

expresión de genes implicados en la transcripción, síntesis y secreción de

nuevas proteínas. Algunos genes de relevancia son los defensivos, como las

relacionadas con la síntesis y señalización de las principales rutas reguladoras

de la defensa en plantas, mediadas por las fitohormonas ácido salicílico (SA)

y ácido jasmónico (JA).

La ruta defensiva de SA es efectiva pero no única, en contra de

patógenos biotrofos y hemibiotrofos; así como el JA se activa frente a

necrotofos (la C. Acutatum actúa de forma biotrofa y necrotofa).

Ambas rutas interaccionan antagónicamente y son finamente

reguladas, de forma que el tipo de respuesta desplegada por la planta frente a

los distintos tipos de patógenos (biotrofos, necrotrofos o hemibiotrofos)

depende de un delicado balance entre ellas. Sin embargo, los mecanismos de

defensa se activan de forma incompleta.

En particular, los genes codificantes de factores de transcripción

FaWRKY70 y FaWRKY33 participan en la regulación cruzada de las rutas

de SA y JA, e incrementan su expresión de forma continua. Esto sugiere que

el control represivo de FaWRKY33 sobre la ruta de SA no funciona

adecuadamente y es solo parcial en los tejidos de fresa infectados por C.

acutatum, lo que puede conducir a un antagonismo con la ruta de JA, haciendo

que FaWRKY70 bloquee la expresión de aquellos genes de defensa de

respuesta a JA de mayor eficacia en la planta para evitar el desarrollo

necrotrofo del hongo, de forma que esta ruta de JA tampoco transcurre de

forma efectiva y el patógeno puede progresar en su desarrollo e infección.

20
 De hecho, la manipulación de las rutas de señalización mediadas por

SA y JA es una estrategia empleada habitualmente por bacterias y hongos

patógenos para burlar las defensas del huésped.

Por esta razón se recomendó el silenciamiento de este gen en las

fresas, pues esto indica que la participación de tal gen es negativo y tiene

efectos indeseables en la defensa contra la infección provocada por C.

Acutatum.

5) MATERIALES A USAR

1. Preparación del material fúngico y vegetal:

● Agar papa dextrosa (PDA)

● Agua destilada estéril

● Tween-80 al 0,03% (v/v)

● Lana de vidrio

● Cámara de Neubauer

● Frutos de fresa (Fragaria × ananassa cv. Primoris)

2. Elaboración de los plásmidos para la modificación de las fresas:

● Plásmidos binarios (pK7WG2.0 y pKGWFS7.0)

● Vector binario pFRN

● Vector de entrada pDNOR221

● Vector pFRN para construcción de silenciamiento de ARNi

● Cepas AGL0 de Agrobacterium tumefaciens

● Medio Luria-Bertani (LB)

● Antibióticos adecuados

21
 ● Medio de agar MacConkey modificado (MMA)

3. Agroinfiltración de frutos y diseño experimental:

● Lejía comercial (1:60 v/v)

● Medio rico estéril MS (0,25 × Murashige Skoog y 4 g de sacarosa por

litro)

● Agujas cortas (23Gx25 mm)

● Suspensión de conidias de C. acutatum (10^5 conidias/mL)

● Discos de papel de 5 mm

4. Ejecución del ensayo histoquímico GUS:

● X-gluc 2 mM

● Tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 7,5)

● EDTA 10 mM

● Triton X-100 al 0,1% (v/v)

● Ferricianuro de potasio 1,0 mM

5. Extracción de ARN total y qPCR:

● DnaseI (Invitrogen)

● Kit de limpieza RNeasy MinElute (QIAGEN)

● Espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific)

● Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Alemania)

● Kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad)

● SsoAdvanced TM SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad)

22
6) PROCEDIMIENTO A EJECUTAR (CON SUBPASOS)

La técnica utilizada para la modificación genética de la fresa es la de

agroinfiltración. Una definición aportada por la U.S. DEPARTMENT OF

AGRICULTURE (USDA, 2014) dicta a la agroinfiltración como una técnica

de transformación genética de las plantas mediante inyección o infiltración al

vacío de Agrobacterium o un virus de las plantas que transporta un gen

deseado, la cual proporciona un sistema de seguimiento a la expresión

transitoria de los genes. Una extensión hecha por Ramirez et. al (2018)

menciona que la agroinfiltración consiste en el proceso de forzar el ingreso

de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens al interior de un tejido de

la planta empleando una jeringa para tal propósito. Esta técnica ha sido muy

usada para distintas plantas como la lechuga, la papa, las uvas, el tomate, las

fresas, la soya, entre muchos otros ejemplos.

Una metodología general del tratamiento de la fresa Fragaria x

ananassa fue aplicado para el silenciamiento del gen FaWRKY1 con el

propósito de que aumente la resistencia a una plaga de hongos dada por la

especie de hongos Colletotrichum acutatum. Esta metodología, que dio

resultados positivos, fue obtenida del artículo realizado por Higuera et. al

(2019) el cual consiste en el siguiente proceso:

● Preparación del material fúngico y vegetal

El hongo Colletotrichum acutatum CECT se cultiva en agar papa

dextrosa (PDA) a 20 C° con fotoperiodo 16/8. El PDA es uno de los medios

más utilizados para el aislamiento y cultivo de hongos (Griffith et. al, 2007).

23
 Se preparan suspensiones madre de conidios (10,6 conidios/mL)

raspando la superficie de micelios de cuatro semanas de edad en agua

destilada estéril con Tween-80 al 0.03% (v/v), y luego se filtran en lana de

vidrio antes de cuantificar los conidios usando una cámara de Neubauer. Para

las inoculaciones de patógenos, se hacen suspensiones diluidas de 10.5

conidios/mL.

● Obtención de los plásmidos para la modificación de las fresas

Los plásmidos binarios (pK7WG2.0 y pKGWFS7.0) se solicitan

exportados, así como el vector binario pFRN.

Para sobreexpresión de forma transitoria el gen FaWRKY1 en frutos

de fresa, se emplea el plásmido pK7”G2::FaWRKY1 (35S::FaWRKY1). Para

la localización espacial y visualización del transgén (gen de un organismo que

ha sido incorporado en el genoma de otro organismo) posteriormente a la

agroinfiltración, se amplifica un fragmento de ADN de 1035 pb que porta el

promotor CaMV35s completo a partir del vector pK7WG2.0 con los

cebadores p35S-attBfw y p35S-attBrv y luego clonar en el vector de entrada

pDNOR221. Luego, tal fragmento de ADN se transfiere al vector de destino

pKGWFS7.0 y así obtener el derivado del plásmido

24
pKGWFS7::pCaMV35s::GUS (p35S::GUS) donde el gen de la β-

glucuronidasa se controla bajo el control del promotor CaMV35.

FIGURA 3. Plásmidos binarios pK7WG2.0 y pKGWFS7.0 y

vector binario pFRN

Antes de continuar al siguiente apartado, es conveniente explicar lo

que es el ARNi. El ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo que la

mayoría de células eucariotas manejan para silenciar genes mediante la

25
degradación del ARN mensajero(ARNm). De acuerdo a una definición de

The National Center for Biotechnology Information (NCBI, 2017), el ARN

de interferencia (RNAi) o el Silenciamiento Génico a nivel Post-

Transcripcional (PTGS) es una respuesta biológica conservada al ARN

bicatenario que media la resistencia a los ácidos nucleicos parasitarios

endógenos y patógenos exógenos, y regula la expresión de genes

codificadores de proteínas.

Se construye el casete silenciador FaWRKY1-RNAi de la siguiente

manera: una región no conservada de 272 pb de este gen, correspondiente a

los primeros 91 aminoácidos, se amplifica por PCR a partir de

pK7WG2::FaWRKY1 usando cebadores específicos WRKY1-RNAi directos

e inversos y se clona en pCR8. /GW/TOPO (Invitrogen) como vector de

entrada. Luego, el fragmento clonado se transfirió al vector de destino pFRN

para obtener la construcción de silenciamiento de ARNi, pFRN::FaWRKY1-

RNAi. La correcta orientación sentido y antisentido del fragmento de ADN

WRKY1 de 272 pb, espaciado por el intrón CHS, se confirmó mediante

secuenciación antes de realizar manipulaciones adicionales.

Todas estas construcciones, junto con sus vectores vacíos

correspondientes, se introducen en la cepa AGL0 de Agrobacterium

tumefaciens mediante el método de choque térmico de congelación-

descongelación. Las cepas de A. tumefaciens se cultivan a 28°C en medio

Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados. Cuando el cultivo alcance

una densidad óptica de aproximadamente 0.8 a 600 nm (OD600), las células

se recolectan y se resuspenden en un medio de agar MacConkey modificado

26
(MMA) (Spolaore et al., 2001). Después, se incuba durante 1 hora a 22°C en

oscuridad, se inyectan suspensiones de Agrobacterium en los frutos utilizando

jeringas de un mililitro.

El género Agrobacterium es un grupo muy especial de patógenos

debido a su capacidad de transferir sus genes al genoma del huésped, en este

caso significa la transferencia de genes desde una célula procariota a una

eucariota. Para usarse correctamente como herramienta biotecnológica se

deben modificar elementos particulares. Primero se debe eliminar los

oncogenes para quitarle su capacidad patogénica (Ferrín 2021). En el caso del

presente informe, no es necesario usar el T-DNA, pues el plásmido binario

pFRN puede ser independiente.

Figura 4. Plásmido TI de la Agrobacterium Tumefaciens

27
● Agroinfiltración de frutos y diseño experimental.

Se recolectan fresas en la etapa rosada/girando con aproximadamente

un 25% de pigmentación. Todos los frutos se extraen junto con sus pedicelos

de diez centímetros de largo, se esterilizan con lejía comercial diluida (1:60

v/v) y se cultivan sumergiendo los pedicelos en un medio estéril rico en MS

(0.25 × Murashige Skoog y 4 g de sacarosa por litro). Cada fresa se mantuvo

en este medio durante todo el ensayo (6 días), con cambios de medio fresco

cada dos días. Se utilizó un protocolo modificado de agroinfiltración

previamente descrito; para reducir la variabilidad entre los frutos y poder

comparar la respuesta de defensa a las inoculaciones de patógenos entre

mitades de la misma fruta. Así, se infiltra una mitad de la fruta con

Agrobacterium que llevaba la construcción transgénica de interés y la mitad

opuesta con Agrobacterium que llevaba el vector vacío como control. Para

diferenciar claramente ambas mitades de la fruta para futuras manipulaciones,

se retiraron dos sépalos de la mitad correspondiente a las construcciones de

interés (ya sea de silenciamiento o sobreexpresión) antes de la

agroinfiltración. Se utilizaron agujas cortas (23Gx25 mm) para la infiltración

para asegurar que cada suspensión de Agrobacterium se mantuviera en su

respectiva mitad de la fruta sin propagarse a la otra mitad. La agroinfiltración

se realizó en el centro de cada mitad de la fresa. Aunque se infiltró 1 ml de

suspensión de Agrobacterium en la mayoría de las mitades de las fresas, este

volumen se ajustó ligeramente según el tamaño del fruto para evitar derrames.

28
 Dos días después de realizar la agroinfiltración, se inocula ambas

mitades del fruto con C. acutatum usando discos de papel de 5 mm empapados

en una suspensión de 10^5 conidias/mL. Los discos impregnados se

colocaron sobre la superficie de la fresa, principalmente en el punto donde se

realizó la agroinfiltración. Un grupo de frutos agroinfiltrados se mantienen

como “frutos no infectados” y no se inocula con el patógeno. Todos los frutos

se almacenan en una cámara cerrada con una humedad del 75-80% a 25°C

durante cinco días. Cada día se recolectan tres frutos y las muestras de cada

una de las dos mitades de los frutos recolectados se congelan de inmediato en

nitrógeno líquido y luego se trasladan a -80°C hasta su uso.

Se selecciona y utiliza frutos sanos cultivados siguiendo un diseño

experimental repetido 2 veces durante 2 años. Para el silenciamiento del gen

FaWRKY1 se agroinfiltraron 144 de 288 frutos con la construcción

pFRN::FaWRKY1 en la mitad de la fruta y el vector vacío en la mitad opuesta

pero no hubo una agroinfiltración correcta en la mitad opuesta. 120 de los 144

fueron inoculados con el patógeno en ambas mitades, quedando 24 frutos sin

inoculación como control, analizando el silenciamieno de FaWRKY1 sin

infección. Se recolecta 3 frutos cada 24 horas durante 6 dias de los cuales se

analizó la expresión del gen FaWRKY1 mediante RT-qPCR, siguiendo un

número y protocolo similares en la sobreexpresión de FaWRKY1, pero

usando el plásmido 35S:: FaWRKY.

29
● Ejecución del ensayo histoquímico GUS

Se usa un total de 30 mitades de frutos de transformación transitoria

de fresa (se recolectaron tres frutos cada 24 horas durante 7 días). Las

actividades GUS en fresa se llevan a cabo, utilizando una solución de tinción

modificada siguiendo las indicaciones del fabricante (Gold Biotechnology),

que contiene: 2 mM de X-gluc en un tampón de fosfato de sodio de 100 mM

(pH 7,5), 10 mM de EDTA, 0,1% (v/v) de Triton X-100 y 1,0 mM de

ferricianuro de potasio.

● Extracción de ARN total y qPCR

El ARN completo de los tejidos de fresas se aisla siguiendo los pasos

anteriores, tratándose con DnaseI para el exterminio de ADN residual y

purificación con el kit RNeasy MinElute (QIAGEN). El ARN purificado se

cuantifica con el espectrofotómetro, la integridad del ARN se comprueba con

el bioanalizador, la síntesis de ADNc de primera cadena se hizo con el uso de

1 μg de ARN purificado para la reacción de 20 μL. Se diluye 5 veces con agua

libre de nucleasa a las reacciones de RT antes de la RT-qPCR.

Se diseñan conjuntos de pares de cebadores utilizando un software

llamado Oligo Primer Analysis, probando mediantes análisis de curva y

verificando la no ampliación no específica. Los niveles de expresión se

calcularon mediante el método 2 −ΔΔCT normalizando y elongandose. Las

ejecuciones de RT-qPCR utilizan cebadores específicos de 2 réplicas en la

misma ejecución y 3 en diferentes ejecuciones. Las eficiencias medias del

PCR fueron calculadas mediante LinRegPCR, mientras que todos los

cebadores RT-qPCR utilizados tienen eficiencias similares.

30
 El nivel de silenciamiento de sobreexpresión de FaWRKY1 se calcula

cada tiempo y normaliza el valor de expresión relativo del gen entre la mitad

del fruto agro infiltrado y la otra mitad con el vector de control.

● Evaluación de daños en los tejidos del fruto y análisis estadístico.

Se observa fenotípicamente y evalúa el daño tisular de 70 frutos para

el experimento de sobreexpresión 4 días después de la inoculación de C.

acutatum. La gravedad del daño se lleva a cabo en una escala de 5 dando

como resultado: tejidos asintomáticos 2, lesiones débiles visibles 3, lesión

moderada 4, región agrandada muy afectada 5. se calcula 2 ratios diferentes:

daño interno y externo, los frutos en los que ambas mitades estaban infiltradas

se utilizaron como control con fines estadísticos, indicando que no hay

diferencia entre ambas mitades de la fruta.

Se analizan los datos de Real Time-qPCR estadísticamente en

Microsoft Excel utilizando el software Real Statistics, versión 5.4.2. La

normalidad de todos los datos se verifica mediante la prueba de Shapiro-Wilk

(α = 0.05). Se realizó un ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de

Dunnett o la prueba post hoc de Tukey con niveles de significancia α = 0.05

y 0.01. Se usaron tres réplicas biológicas (n = 3).

Utilizando la técnica de agroinfiltración en frutos, se logra tanto la

sobreexpresión como el silenciamiento transitorio del gen FaWRKY1. Se

descubrió que este gen actúa como un regulador negativo de la resistencia del

fruto de fresa contra C. acutatum, en contraste con su papel como regulador

positivo de la resistencia frente al patógeno bacteriano Pseudomonas syringae

pv. Tomato DC3000, determinado mediante complementación en A. thaliana.

31
7) RESULTADO FINAL DE LA FRESA

Figura 5. Fragaria x ananassa sana.

Figura 6. Fragaria x ananassa infectada con la plaga Colletotrichum

acutatum.

Figura 7. Fragaria x ananassa resistente a la plaga de Colletotrichum

acutatum.

32
IV. CONCLUSIONES

● El gen FaWRKY1 se identificó como un regulador importante en la

resistencia de la fresa contra patógenos. Actúa como un regulador negativo frente

a Colletotrichum acutatum, que causa antracnosis en las fresas.

● Las técnicas de agroinfiltración permiten la sobreexpresión y el

silenciamiento transitorio de genes en los frutos, demostrando ser herramientas

muy útiles y valiosas para estudiar la función de genes específicos en la respuesta

de defensa de las plantas.

● La evaluación fenotípica del daño tisular en frutos después de la

inoculación con C. acutatum nos ayudó a entender el impacto de la infección y de

las respuestas de defensa mediadas genéticamente.

● El uso de análisis estadísticos rigurosos, incluyendo ANOVA y pruebas

post hoc, nos da la seguridad de que los resultados obtenidos sean confiables y

reproducibles.

● La modificación genética de fresas para mejorar su resistencia a plagas no

solo es viable, sino que también presenta un potencial significativo para reducir el

uso de pesticidas y mejorar la productividad agrícola. Así pues, esto es de suma

importancia en la protección y conservación ambiental.

33
V. SUGERENCIAS

● Realizar pruebas de campo a gran escala para evaluar el rendimiento de

las fresas transgénicas en condiciones reales de cultivo y verificar su eficacia en

la resistencia a la antracnosis.

● Explorar la posibilidad de combinar la modificación genética con otras

estrategias de manejo integrado de plagas para lograr un control más sostenible y

efectivo de la antracnosis en las fresas.

● Investigar el impacto a largo plazo de las fresas transgénicas en el medio

ambiente y la biodiversidad para garantizar la sostenibilidad de esta tecnología.

● Realizar estudios sobre la percepción del consumidor y la aceptación

pública de las fresas transgénicas para abordar las preocupaciones y promover la

transparencia en la producción y comercialización de estos alimentos.

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