Plantilla Modelo Proyecto

CIPFP VICENTE BLASCO IBÁÑEZ
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
CFGS LABORATORIO DE ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD
DETECCIÓN DE Salmonella Y Listeria monocytogenes por

PCR
Presentado por: Inés Herrera Contreras
Dirigido por: Concepción Rubio y María José Torres
Valencia, diciembre
Inés Herrera Contreras
INDICE
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Tabla de contenido
1. Resumen.................................................................................................................1
2 Empresa colaboradora donde se realizan las FCT....................................................3
2.1 Presentación del puesto de trabajo............................................................................3
2.2 Seguridad e Higiene en el puesto de trabajo...............................................................5
2.3 Residuos....................................................................................................................5
3 Fundamentos científico-técnicos.............................................................................6
3.1 Salmonella.................................................................................................................6
3.1.1 Serotipos que existen y factores que provocan su crecimiento................................................6
3.1.2 Legislación.................................................................................................................................7
3.2 Listeria monocytogenes.............................................................................................8

3.2.1 Características...........................................................................................................................8
3.2.2 Peligrosidad...............................................................................................................................8
3.3 Polymerase chain reaction (PCR)................................................................................8

3.3.1 Fases que intervienen en la Reacción en Cadena de la Polimerasa...........................................9
3.3.2 Utilidades................................................................................................................................10
3.3.3 Desventajas.............................................................................................................................11
3.4 Recogida de muestras de superficies........................................................................11
3.5 Ensayo de Detección Molecular 2 para Salmonella...................................................11

3.5.1 Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)...................................................................12
4 Materiales y métodos.............................................................................................2
4.1 Materiales y aparatos................................................................................................2
4.2 medios de cultivo y reactivos.....................................................................................2
4.3 Método de esponja con aplicador para recogidade muestras.....................................2
4.4 Métodos para la detcción de Listeria monocytogenes o Salmonella...........................3
5 Resultados Y conclusiones.......................................................................................6
6 Bibliografía.............................................................................................................9
Lista de imágenes
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Imagen I: esquema de los ciclos de la replicación de ADN.
Imagen II: muestra antes de la desnaturalización.
Imagen III: viraje de color de la muestra en la desnaturalización.
Imagen IV: equipo de Detección Molecular para Salmonella 3MTM
Imagen V: explicación de la reacción LAMP.
Imagen VI: explicación del uso de la torunda.
Imagen VII: Digital Heatblock.
Imagen VIII: pipeteo durante el proceso de PCR.
Imagen IX: resultados generados por el equipo de Detección Molecular de Salmonella.
Lista de gráficas
Gráfica I: gráfica general del ensayo de Detección Molecular.
Gráfica II: ejemplo de gráfica de una superficie positiva en Listeria monocytogenes.
Gráfica III: ejemplo de gráfica de control negativo.
Gráfica IV: ejemplo de gráfica de control de reactivos
Listado de tablas
Tabla I: capítulo 1 del reglamento 2073/2005
Tabla II: capítulo 2 del reglamento 2073/2005
Listado de acrónimos
PCR → Polymerase Chain Reaction

ADN → Ácido desoxirribonucleico
ISO → Organización internacional de estandarización
ATP → Adenosín Trifosfato
pb → Pares de bases
l+d → Limpieza y desinfección
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Detección de Salmonella y Listeria monocytogenes por PCR
1. RESUMEN
En el sector alimentario es muy importante que los alimentos que llegan al consumidor estén aptos y
en perfecto estado para su consumo y así evitar intoxicaciones y/o infecciones de cualquier tipo.
En este trabajo se va a ver la importancia de un laboratorio de calidad en esta industria y sus

funciones para que todo vaya correctamente tanto en la limpieza de maquinaria y los ensayos
realizados en el laboratorio.
Por otro lado, se va a conocer dos de los tres patógenos más importantes en una empresa avícola,
junto con las técnicas que se llevan a cabo para evitar la contaminación en superficies y productos.
1
2
2 EMPRESA COLABORADORA DONDE SE REALIZAN LAS FCT

Grupo SADA es una de las compañías de la división avícola del Grupo Valls Companys, es una
empresa avícola española, especializada en la producción avícola integrada, orientada al mercado
tradicional, a la distribución moderna y al Food Service. Su actividad se centra en la gestión total del
ciclo productivo del pollo, desde reproductoras, incubadoras, granjas de cebo y plantas de
procesamiento, hasta la distribución del producto final.
Está compuesta por 3 plantas de producción con una red comercial que cubre todo el territorio
español y parte de Europa, 5 delegaciones comerciales, 78 rutas de reparto capilar y 68 granjas
integradas de cebo de pollos.
A la semana se sacrifican 300.000 pollos y pasan por la sala de despiece 125.000 pollos por
semana para suministrar a los más de 1.500 clientes entre los que se encuentran supermercados
como Family cash y Fragadis.
El laboratorio realiza más de 2.500 análisis anuales para asegurar la calidad e inocuidad de
nuestros productos; así como los requerimientos de nuestros clientes.
2.1 PRESENTACIÓN DEL PUESTO DE TRABAJO

El puesto de técnico de calidad lleva consigo la responsabilidad de garantizar que todos los
protocolos son llevados a cabo. Las funciones que debe desarrollar en los distintos ámbitos son:
 Limpieza
- Inspección visual de la limpieza de todas las instalaciones.
- Cumplimiento y actualización de bases de datos de análisis de superficie.
- Muestreo de superficies para el análisis de Salmonella spp y Listeria
monocytogenes. Actualización de la base de datos.
- Muestreo para el análisis de Salmonella spp y Listeria monocytogenes en
ganchos, cintas, aguas de lavadoras de jaulones, equipos, escaldadores y otras
extraordinarias.
- Control de consumo de gerricanes de lavadora de cajas, ducha de desinfección
jaulones y centro de l+d de camiones vivo.
- Control de la correcta cumplimentación de los registros del personal interno y
externo de limpieza.
- Planificación de las limpiezas extraordinarias y/o frecuencias largas.
 Laboratorio
- Esterilización del material del laboratorio.
- Análisis indicadores producto final y actualización de la base de datos.
- Análisis indicadores producto final en fecha de caducidad y actualización de la
base de datos.
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- Análisis de mercaderías y actualización de la base de datos.
- Planificación de muestras necesarias para análisis semanales.
- Muestreo rutinario semanal de Salmonella en la piel cuello y despiece, y
gestión de bloqueo/desbloqueo de lotes.
- Muestreo rutinario semanal de Campylobacter en la piel cuello y actualización
de bases de datos.
- Análisis de Salmonella y test de inhibidores de compras pollo vivo/canales.
- Gestión de stock y realización de pedidos de abastecimiento del laboratorio.
- Verificación de pinchos de temperatura, sondas de cámaras y salas, estufas del
laboratorio.
- Gestión de residuos biológicos delaboratorio.
- Control de temperaturas ambiente de salas, cámaras y productos intermedios y
finales.
- Control de cloro libre diario y de la red de agua.
 Planta
- Controles de defectos de matadero y despiece/ envasado/ expedición/
mercaderías.
- Control del correcto estado de las instalaciones. Notificación de desperfectos a
los departamentos implicados para su subsanación.
- Control de etiquetado en tiempo real y verificación del correcto etiquetado.
- Verificación del correcto funcionamiento de las básculas y los detectores de
metales.
- Control de Buenas Prácticas de Higiene y Manipulación.
- Verificación de estanqueidad y medición de gases.
- Control de proceso operativo: temperaturas de entrada/salida del producto en
salas, temperaturas en cámaras y salas, etiquetado, control de duchas de
canales.
- Control de correcto eviscerado.
- Control de temperaturas y buenas prácticas a la expedición y estado higiénico a
la carga.
- Inspección de producto para verificar el cumplimiento de especificaciones.
 Documentación
- Gestión de no conformidades y acciones correctivas.
- Gestión de reclamaciones y base de datos. Devoluciones.
- Verificación/validación/corrección de nuevas etiquetas.
- Verificación diaria de hojas de control de etiquetados.
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- Verificación de correcta cumplimentación de hojas de control utilizadas en

planta.
- Control de caducidades.
- Gestión de toma de muestras de agua y análisis de los resultados.
- Gestión de visitas de empresas externas de control de plagas, análisis y
establecimiento de medidas de corrección si aplica.
- Gestión de calibración de equipos: planificación, revisión documentación,
detectores, masa patrón, básculas, sondas, pinchos, estufas, medidor de
gases, aturdidor, etc.
- Asistencia a las demandas de los Servicios Veterinarios Oficiales.
- Preparación de Auditorias.
- Formación en calidad a manipulación de alimentos.
2.2 SEGURIDAD E HIGIENE EN EL PUESTO DE TRABAJO

La empresa ofrece ropa protectora de trabajo: pantalón, chaqueta, guantes, zapatos de seguridad y
gorro integral que cubre boca, cabello y nariz, para entrar a las distintas zonas de producción.
2.3 RESIDUOS
Los residuos cárnicos de las muestras tomadas por el laboratorio para controles analíticos son
segregados en contenedores de categoría 3 “no aptos para el consumo humano” categoría 3 y los
residuos generados por los análisis son autoclavados durante 15 minutos a 121 ºC.
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3 FUNDAMENTOS CIENTÍFICO-TÉCNICOS
En este proyecto se va a explicar las técnicas para la detección de Salmonella spp y Listeria
monocytogenes mediante la Polymerase Chain Reaction. Para ello, es fundamental previamente
conocer la morfología y características de los patógenos para determinar la técnica a emplear.
3.1 Salmonella
La Salmonella es un bacilo gram negativo que pertenece a la familia de las enterobacterias, es una
bacteria omnipresente y resistente que puede sobrevivir durante varias semanas en un ambiente
seco y varios meses en agua.
Se sitúa en el intestino de personas y animales sanos transmitiéndose a las personas,

principalmente a través del consumo de alimentos crudos o poco cocinados y provocando una
infección gastrointestinal llamada “Salmonelosis”, siendo una de las cuatro causas de enfermedades
diarreicas a nivel mundial.
En Europa, es la causa mayoritaria de brotes en las personas de origen alimentario, y representa la

segunda enfermedad zoonótica más notificada después del Campylobacter. El serotipo más
predominante en los cuadros de Salmonella humana es Salmonella enteritidis.
3.1.1 Serotipos que existen y factores que provocan su crecimiento

Existen dos serotipos de Salmonella:
 Serotipos tifoideos (Typhi y S. Paratyphi): cuyo reservorio exclusivo son los seres
humanos, por lo que sólo son transmisibles por contacto entre personas causando un
síndrome potencialmente mortal conocido como fiebre tifoidea o paratifoidea.
 Serotipos no tifoideos (S.enteritidis y S.typhimurium), que son agentes zoonóticos, es
decir, se transmiten de los animales y de sus productos derivados a las personas,
aunque también se pueden transmitir por contacto con animales o personas infectadas
causando mayoritariamente síntomas gastrointestinales.
La temperatura y el tiempo son dos factores claves en el crecimiento de Salmonella. En los

alimentos frescos se multiplica a una velocidad muy elevada, pudiendo duplicar su número cada 15-
20 minutos si la temperatura es alta. Por debajo de 5 ºC, no crece, pero sobrevive en alimentos
congelados.
Actualmente para carne de ave fresca, los criterios microbiológicos se regulan por el Reglamento
2073/2005 de la comisión de 15 de noviembre del 2005, relativo a los criterios microbiológicos
aplicables a los productos alimenticios.
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3.1.2 Legislación
Según establece el Reglamento (CE) nº 2073/2005 de la Comisión de 15 de noviembre de 2005, las
frecuencias de muestreo para canales y carne fresca de ave de corral consisten en una sesión de
muestreo semanal, para verificar el cumplimiento de los criterios de higiene de proceso y de
seguridad alimentaria.
Las frecuencias de muestreo para canales y carne fresca de aves de corral serán de una sesión de
muestreo semanal. El día de la toma de muestras cambiará cada semana, de modo que queden
cubiertos todos los días de la semana.
El Reglamento establece dos criterios para carne de ave fresca:
 Criterio de Seguridad Alimentaria.

Según indica la legislación el Criterio de Seguridad Alimentaria define la aceptabilidad
de un producto y es aplicable a los productos comercializados.
Fase en la que se aplica el

Categoría de alimento Microorganismo n c Límite Método analítico de referencia
criterio
EN/ISO 6579 (para detección)

Salmonella21
Typhimurium Esquema White-Kaufmann-
1.28. Carne fresca20 Ausenciaen25 Productos en el mercado
5 0
de aves de corral g durante su vida útil
Salmonella Le Minor
Enteritidis
(para el serotipo)
Tabla I. Capítulo 1 del reglamento 2073/2005
 Criterio de Higiene del Proceso.

Este criterio no implica la destrucción del producto sino establecer medidas correctoras
en la higiene del proceso.
Método Fase en la que

Categoría de Microorgani Acción en caso de
n c Límite analítico de se aplica el
alimento smo resultados insatisfactorios
referencia criterio
Ausencia en Mejoras en la higiene del

2.1.5. 25 g de una sacrificio y revisión de los
Desde el 1.1.2012 EN/ISO 6579
Canales de c=5 en Pollos de (para Canales tras el controles del proceso, del
Salmonella muestra
pollos de engorde detección) origen de los animales y de
spp. (10) conjunta de
engorde y 50 enfriamiento las medidas de
piel
pavos bioseguridad en las
explotaciones de origen
del cuello
Tabla II. Capítulo 2 del reglamento 2073/2005
7
3.2 Listeria monocytogenes
La Listeria monocytogenes es un saprófito ubicuo, que vive en ambientes de tierra vegetal y que se
ha aislado en más de 45 especies de mamíferos domésticos y salvajes, en 22 especies de aves, así
como peces, crustáceos, insectos, aguas residuales y naturales, ensilados, forrajes, leche y otros
alimentos.
3.2.1 Características
Listeria es una bacteria gram positiva, con forma de bacilo corto, con flagelos peritricos, no
formadora de esporas, catalasa positivo y anaerobio facultativo. Ocasionalmente, pueden adoptar
forma cocoide. Es móvil a temperaturas entre 25 °C y 35 °C.
Puede crecer en ambientes aeróbicos, microaeróbicos y anaeróbicos, pero es sensible a una

combinación de altas concentraciones de dióxido de carbono y bajas temperaturas.
Listeria monocytogenes es resistente a tratamientos de calor que están al límite de la

pasteurización, como 74 °C/segundo en leche cruda o de 82 °C en carne de pollo envasada al
vacío. La resistencia al calor aumenta en condiciones favorables de pH, actividad de agua y si las
bacterias han proliferado a temperatura ambiente antes del tratamiento. Por el contrario, si se han
multiplicado en condiciones de frío, la resistencia disminuye.
3.2.2 Peligrosidad
Listeria monocytogenes causa listeriosis, enfermedad que afecta a los humanos pudiendo tener
graves consecuencias como gastroenteritis, septicemia, aborto y meningitis, principalmente en
inmunodeprimidos, embarazadas y ancianos.
La infección por Listeria monocytogenes tiene dos formas de presentación de la enfermedad,

listeriosis no invasiva, la cual corresponde a la forma leve de la enfermedad y listeriosis invasiva, la
cual se describe como la forma grave de la enfermedad y que puede causar septicemia, meningitis y
ser mortal; la probabilidad de que se desarrolle depende de distintos factores.
3.3 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Es una técnica de laboratorio que permite la producción (amplificación) rápida de millones a miles
de millones de un segmento específico de ADN, que así se podrá estudiar en mayor detalle. Esta
técnica permite detectar cualquier microorganismo en pacientes, alimentos u objetos contaminados.
La PCR implica el uso de fragmentos cortos de ADN sintético, denominados cebadores, para
seleccionar un segmento del genoma que se amplificará, y luego múltiples sesiones de síntesis de
ADN para amplificar ese segmento.
8
Imagen I: esquema de los ciclos de la replicación de ADN. La reacción empieza con la

separación de la doble hélice, llamándose desnaturalización térmica, esta sustituye a la
helicasa y a las topoisomerasas. En el primer ciclo se produce el acoplamiento de los
primers sobre la cadena correspondiente. El segundo y tercer ciclo es la de amplificación.
Cuando la amplificación finaliza vuelve a comenzar el ciclo.
Fuente: National Human Genome Research Institute
3.3.1 Fases que intervienen en la Reacción en Cadena de la Polimerasa
DESNATURALIZACIÓN
En el proceso de la replicación natural la molécula de ADN molde debe separarse para que la
polimerasa pueda realizar la copia. La desnaturalización térmica a 95 ºC consigue romper los
puentes de hidrógeno y dado que en todo momento se mantendrán temperaturas elevadas la
renaturalización no se producirá. Es una etapa crítica, el ADN molde se debe desnaturalizar
completamente.
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Imagen II: muestra antes de aplicar calor, Imagen III: viraje de color después de
el ADN esta unido en una cadena. aplicar calor y producirse la
Fuente: Laboratorio Sada desnaturalización con los fragmentos de
ADN separados.
Fuente: Laboratorio Sada
HIBRIDACIÓN
En esta fase se produce un descenso de temperaturas para permitir que los cebadores se unan por
complementariedad al DNA molde y así la polimerasa pueda empezar a replicar.
Para cada secuencia de ADN que se vaya a amplificar se diseñan primers específicos. Existen dos
tipos de primers, el directo que contiene exactamente la misma secuencia de la cadena que
leeríamos en un genBank en dirección 5’-3’, y el reverso que es idéntico a la secuencia de la cadena
inferior y se acoplará con la cadena superior.
EXTENSIÓN
Última fase donde la polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre
de la región en que han hibridado los cebadores.
3.3.2 Utilidades
Esta prueba tiene múltiples aplicaciones como por ejemplo en la medicina forense o diagnósticos,
también se puede aplicar para mutagénesis dirigida, pruebas de paternidad y para la detección de
agentes infecciosos, tal y como se expondrá en este proyecto.
10
3.3.3 Desventajas
A pesar de tener muchas ventajas este proceso también hay que tener en cuenta que solamente se
puede reproducir partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20
– 40 pb, se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea
sintetizar, la polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN y se puede contaminar con otro
ADN dando falsos positivos.
3.4 RECOGIDA DE MUESTRAS DE SUPERFICIES

El objetivo de la recogida de muestras es controlar la eficacia de la limpieza y desinfección de las
superficies de maquinarias del matadero que entran en contacto con los alimentos.
Esta recogida de muestras se realiza con una torunda, es decir, se trata de una esponja de celulosa
con aplicador hidratada con 10 mL de tampón neutralizante dentro de una bolsa. El tampón
neutralizante eliminará la acción de los posibles restos de desinfectante que alterarían el ensayo en
el caso de su presencia en la superficie.
3.5 ENSAYO DE DETECCIÓN MOLECULAR 2 PARA Salmonella

Para la detección de Salmonella spp se utiliza
el ensayo de Detección Molecular 3MTM.
Imagen IV: equipo de Detección Molecular para

Salmonella 3MTM
Los ensayo de Detección Molecular para Salmonella 3MTM usan una amplificación isotérmica
mediada por asas para amplificar rápidamente secuencias de ácidos nucleicos con alta
especificidad y sensitividad, combinada con bioluminiscencia para detectar la amplificación. Los
resultados presuntivos positivos se informan en tiempo real, mientras que los resultaos negativos se
muestran una vez terminado el ensayo.
3M Food Safety cuenta con certificación de la Organización Internacional para la Estandarización

(ISO) 9001 de diseño y fabricación.
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El Control Negativo (NC), provisto en el kit, es un medio de enriquecimiento estéril, por ejemplo,
Agua Peptonada Tamponada pero nunca agua.
3.5.1 Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

La reacción LAMP se realiza a una temperatura continua y constante mediante una Bst polimerasa
muy robusta que abre la hebra de forma mecánica y 6 primers diferentes se unen, esto genera de
forma exponencial pirofosfatos que se convierten en ATP mediante la ATP-sulfurilasa y por último,
interviene la enzima Luciferasa que usa el ATP para generar luz.
Imagen V: explicación visual de la reacción LAMP

Fuente: Bioser
La luz generada en la reacción es detectada por el equipo generando unas curvas de crecimiento
que se plasman en una gráfica general y una específica de cada muestra analizada. El equipo en
los primeros 5 minutos se asegura de donde procede la luz que detecta para evitar errores o falses
positivos.
Unidades relativas de luz Positivo en Listeria
Control de reactivos en Listera y Salmonella
Control negativo
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Gráfica I: gráfica general del ensayo de Detección Molecular. Cada línea de colores marca un
pocillo con su correspondiente muestra, junto con los controles negativos y de reactivos.
Gráfica II: ejemplo de gráfica de superficie positiva en Listeria monocytogenes. La gráfica

muestra como el equipo ha detectado durante la amplificación el crecimiento de luz,
indicando el positivo de la muestra; este crecimiento llega a su máximo y seguidamente se
produce un descenso.
Para verificar el buen funcionamiento tanto del equipo como de los reactivos y del proceso, se
somete al mismo proceso un control negativo y un control de reactivos. Estos controles son un
algoritmo que ya lleva incorporado cada equipo de Detección Molecular, independientemente del
ensayo que se esté realizando.
Gráfica III: ejemplo de gráfica del control Gráfica IV: ejemplo de gráfica del control de
negativo. reactivos.
Fuente: equipo Detección Molecular de Salmonella 3M .
TM
Fuente: equipo Detección Molecular de Salmonella 3MTM.
13
4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 MATERIALES Y APARATOS
Se requiere de pipetas de extracción y puntas con filtro, termobloque (Digital Heatblock) y un equipo
de Detección Molecular 3M junto con un ordenador, estufa, agua de peptona para Salmonella y
Fraser – Devi / Half- Fraser para la Listeria y torundas Sponge - Stick con tampón neutralizante.
4.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Artículo Identificación Cantidad Contenido Comentarios
Solución rosada
Tubos de Solución 96 (12 tiras En gradillas y
en tubos 580 µl de LS por tubo
Listeria para Lisis (LS) de 8 tubos) listos para usar
transparentes
moncytogene
Tubos de reactivos Mezcla de detección y
s 96 (12 tiras
para Listeria Tubos amarillos Amplificación Listo para usar
de 8 tubos)
moncytogenes específica liofilizada
Salmonella Solución rosada
Tubos de Solución 96 (12 tiras En gradillas y
spp en tubos 580 µl de LS por tubo
para Lisis (LS) de 8 tubos) listos para usar
transparentes
Tubos de reactivos Tubos verdes 96 (12 tiras Mezcla de detección y Listo para usar
del Ensayo de de 8 tubos) Amplificación
14
Detección Molecular
específica liofilizada
2 para 3MTM
96 (12 tiras
Tapas adicionales Tapas verdes Listo para usar
de 8 tubos)
Tubos Mezcla de detección y
16 (2 bolsas
Control de reactivos transparentes amplificación de
de 8 tubos Listo para usar
(RC) con tapa de control liofilizada de
individuales)
bisagra ADN
4.3 MÉTODO DE ESPONJA CON APLICADOR PARA RECOGIDA DE MUESTRAS

1. Lavar las manos con agua y jabón y secar con toallas de un solo uso.
2. Previamente a la toma de muestra identificarla con el nombre o con el código del equipo del
que se va a tomar la muestra.
3. Asépticamente (con la ayuda de un guante) coger la esponja por el aplicador y frotar en la
superficie a controlar, cambiar la dirección de la esponja en 90 grados para seguir frotando.
4. Introducir la esponja en la misma bolsa y cerrarla con los alambres.
Imagen VI: explicación visual del uso de la torunda.
4.4 MÉTODOS PARA DETECCIÓN DE Listeria o Salmonella

1- Toma de la muestra. Se pasa una torunda por toda la superficie una vez limpia y
desinfectada, añadir agua de peptona hasta tapar la esponja de la torunda y incubar 24
horas a 41ºC si es Salmonella, pero si es Listeria vertemos Fraser – Devi / Half- Fraser
hasta cubrir la esponja y incubamos 24 horas a 36 ºC.
15
2- Encender el Digital Heatblock, el ordenador y el equipo de PCR y atemperar las bolsas.
3- Verter 20 µl de cada bolsa a los tubos de agua de peptona de color rosa que proporciona el
kit, cada bolsa requiere de un tubo. Para el negativo verter 25 µl de un tubo de agua de
peptona estéril para Salmonella o de Fraser – Devi / Half- Fraser para la Listeria.
4- Colocar en el Digital Heatblock durante 15 minutos a 100ºC.
Imagen VII: termobloque Digital Heatblock es el equipo que calienta las muestras para
que se produzca la desnaturalización.
5- Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente.

6- Trasvasar de los tubos con líquido rosa 20 µl a los tubos eppendorf de color verde. Para el
positivo coger 20 µl del negativo y verter en el tubo eppendorf transparente que proporciona
el kit.
16
Imagen VIII: pipeteo durante el proceso de la PCR.

7- Programar el equipo, poner todos los tubos en la gradilla e introducirlos al equipo de

detección molecular.
8- Cerrar y dejar el proceso 1 hora. El equipo realizará un informe con los resultados.
17
5 RESULTADOS Y CONCLUSIONES
A continuación se van a mostrar datos y resultados reales de una PCR para la detección de
Salmonella y Listeria en distintas superficies de trabajo.
Imagen IX: resultados generados por el equipo de Detección Molecular de Salmonella.

Fuente: laboratorio Sada
Esta fotografía se divide en dos bloques, el bloque 1 que corresponde a la Salmonella, pocillos
verdes de la izquierda y el bloque 2 que corresponde a la Listeria monocytogenes, pocillos amarillos
de la derecha.
18
Bloque 1:
Viendo la imagen podemos decir que el resultado obtenido es negativo en la presencia de
Salmonella por lo que las muestras están libres de dicha bacteria. Los pocillos D2 y E2 son
los pocillos de control donde está el control negativo (NC) y el control de reactivos (RC)
respectivamente; su color azul nos indican que esta todo correcto.
Bloque 2:
En este caso podemos observar varias cosas:
1. El pocillo llamado A7 de color amarillo nos indica que ha habido un error durante el
proceso de preparación, por lo que hay que repetirlo.
2. El pocillo G7 de color rojo nos indica que hay un positivo, por lo que la superficie tiene
presencia de Listeria. En este caso hay que limpiar otra vez la zona, echar biofilm y
desinfectar con especial, que es distinto al que se usa diariamente y se volverá a coger
muestra para repetir la PCR.
3. Los pocillos E8 y F8 son los pocillos de control donde está el control negativo (NC) y el
control de reativos (RC) respectivamente; su color azul nos indican que esta todo
correcto.
4. Los pocillos restantes de color verde nos indican que son negativas y por lo tanto están
libres de Listeria.
Id. de Id. de Tipo de ensayo Gen Tipo de Número de Resultado

pozo muestra Objetivo pozo Lote de kit
A1 564 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
B1 565 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
C1 566 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
D1 567 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
E1 568 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
F1 569 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
G1 570 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
H1 571 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
A2 572 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
B2 573 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
C2 574 Salmonella-2 Muestra 10033009 Negativo
D2 Salmonella-2 Control 10033009 Válido
negativo
E2 Salmonella-2 Control de 10033009 Válido
reactivos
A7 241 L. Muestra 9982282 Error
monocytogenes-2
B7 242 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
19
C7 243 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
D7 244 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
E7 245 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
F7 246 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
G7 247 L. Muestra 9982282 Positivo
monocytogenes-2
H7 248 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
A8 249 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
B8 250 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
C8 251 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
D8 252 L. Muestra 9982282 Negativo
monocytogenes-2
E8 L. Control 9982282 Válido
monocytogenes-2 negativo
F8 L. Control de 9982282 Válido
monocytogenes-2 reactivos
20
6 BIBLIOGRAFÍA
INFORMACIÓN SALMONELLA:
https://seguridadalimentaria.elika.eus/fichas-de-peligros/salmonella/
https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/salmonella-(non-typhoidal)
INFORMACIÓN LISTERIA:
https://acsa.gencat.cat/es/actualitat/butlletins/acsa-brief/listeria-monocytogenes/
https://www.achipia.gob.cl/wp-content/uploads/2018/03/Ficha-Peligro-04-Listeria-v01.pdf
INFORMACIÓN DE LA PCR:
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de
%20la%20polimerasa.pdf
21
____________________________ Título proyecto
Anexos
Anexo I: Protocolo – Detección Molecular ASSAY 2

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CIPFP VICENTE BLASCO IBÁÑEZ

CFGS LABORATORIO DE ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD

DETECCIÓN DE Salmonella Y Listeria monocytogenes por

Presentado por: Inés Herrera Contreras

Dirigido por: Concepción Rubio y María José Torres

2 Empresa colaboradora donde se realizan las FCT....................................................3

2.1 Presentación del puesto de trabajo............................................................................3

2.2 Seguridad e Higiene en el puesto de trabajo...............................................................5

3.2 Listeria monocytogenes.............................................................................................8

3.3 Polymerase chain reaction (PCR)................................................................................8

3.4 Recogida de muestras de superficies........................................................................11

3.5 Ensayo de Detección Molecular 2 para Salmonella...................................................11

4.1 Materiales y aparatos................................................................................................2

4.2 medios de cultivo y reactivos.....................................................................................2

4.3 Método de esponja con aplicador para recogidade muestras.....................................2

4.4 Métodos para la detcción de Listeria monocytogenes o Salmonella...........................3

Imagen II: muestra antes de la desnaturalización.

Imagen III: viraje de color de la muestra en la desnaturalización.

Imagen IV: equipo de Detección Molecular para Salmonella 3MTM

Imagen V: explicación de la reacción LAMP.

Imagen VI: explicación del uso de la torunda.

Imagen VII: Digital Heatblock.

Imagen VIII: pipeteo durante el proceso de PCR.

Imagen IX: resultados generados por el equipo de Detección Molecular de Salmonella.

Gráfica I: gráfica general del ensayo de Detección Molecular.

Gráfica II: ejemplo de gráfica de una superficie positiva en Listeria monocytogenes.

Gráfica III: ejemplo de gráfica de control negativo.

Gráfica IV: ejemplo de gráfica de control de reactivos

Tabla I: capítulo 1 del reglamento 2073/2005

Tabla II: capítulo 2 del reglamento 2073/2005

PCR → Polymerase Chain Reaction

ISO → Organización internacional de estandarización

ATP → Adenosín Trifosfato

l+d → Limpieza y desinfección

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3.5 ENSAYO DE DETECCIÓN MOLECULAR 2 PARA Salmonella