Tema-13.

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Control de Aguas

1º Grado Superior en Química y Salud Ambiental

ENRIQUE FLÓREZ

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
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PREPARACIONES
MICROSCÓPICAS
Tema 13.3

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Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
1. Confección de preparaciones. Normas
generales
Las preparaciones nos sirven para:
1. Observar microorganismos vivos (movilidad).
2. Fijar los microorganismos y utilizar colorantes
para aumentar el contraste de las estructuras o
microorganismos que se van a observar.

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Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
1. Confección de preparaciones. Normas
generales

1. Portaobjetos y cubreobjetos deben estar

perfectamente limpios, secos y exentos de grasa.
2. Observa las más rigurosas normas de asepsia.
3. Esteriliza el asa, poniéndola al rojo en toda su
longitud, antes y después de utilizarla. Antes de
utilizarla, déjala enfriar.
4. Flamea la boca del tubo, después de destapar y
antes de volver a tapar. No toques la parte del
tapón que queda dentro del tubo ni dejes este
sobre la mesa de trabajo.

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1. Confección de preparaciones. Normas

generales

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Material

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2. Preparaciones vitales
El examen en fresco de una suspensión microbiana es esencial siempre que se
desee observar microorganismos vivos y conocer sus características
(morfología, tamaño real, color, movimientos). Se preparan de la forma
siguiente:
1. Deposita una gotita de líquido, con asa o pipeta, en el centro de un
portaobjetos.
2. Formando un ángulo de 45º desliza un cubreobjetos sobre el portaobjetos
hasta que toque la gota dejándolo caer sobre la misma.
La lámina de líquido que queda entre el cubre y el porta debe ser lo más fina
posible sin llegar a rebosar los bordes del cubre.
4. Observa lo más rápidamente posible por el microscopio.

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3. Tinción negativa
1. Se prepara, de la forma habitual, una extensión muy fina utilizando un
portaobjetos limpio.
2. En un extremo se deposita una gota de solución de nigrosina al 2 %
3. Se toma otro portaobjetos y se apoya uno de sus extremos sobre el porta
anterior, de manera que toque la gota de nigrosina formando un ángulo de
30º, moviéndolo para extender la nigrosina sobre la superficie del primer
porta, obteniendo así una extensión uniforme y muy delgada del colorante
4. Se deja secar al aire.
5. Junto con este método, se puede aplicar un método de tinción simple con el
fin de poner de manifiesto la presencia de cápsulas.

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4. Coloraciones vitales
 Se utilizan para preparados en fresco.
 Los colorantes utilizados no matan al ser vivo, ya que se concentra en el
soma de los mismos sin afectar a la viabilidad.
 Algunos ejemplos de colorantes vitales son:
o Azul de metileno
o Verde Jano
o Azul brillante cresos
o Rojo neutro
o Azul de nilo
 Los colorantes para mohos y levaduras son:
o Azul de lactofenol
o Azul de algodón
o Azul de metileno alcalino

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5. Tinción simple

 Se utiliza un solo colorante: Azul de metileno.

 Las células tienen una composición química diferente a la
de su entorno, de modo que ambos se comportan de
forma diferente frente a un colorante.
 Un colorante es una sustancia coloreada que combinada
con otra confiere a ésta un determinado color.
 El colorante tiene las células (azul de metileno), o no
(nigrosina).

VIDEO tinciones: https://www.youtube.com/watch?v=1Zu6HHcEXSA

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5. Tinción simple

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5. Tinción simple

Y observar con el objetivo de inmersión.

AZUL DE METILENO, YOGUR: https://www.youtube.com/watch?v=IDGEoUU7ngo

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6. Tinción de Gram
o Método diferencial de doble tinción, base del análisis e
identificación preliminar de las bacterias y de su primera
clasificación.

o Se basa en el hecho de que distintos tipos de células tienen

distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma
diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los
microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de
tinción.

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6. Tinción de Gram
 El fundamento radica en la diferente estructura de la pared
celular de ambos grupos:
 Las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano
en su pared. 80-90%
 Las Gram- tiene una capa de peptidoglicano mucho mas fina
que constituye el 10-20%.

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S. aureus
6. Tinción de Gram

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Escherichia spp.

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6. Tinción de Gram
Gram positivas: No decolorables en etanol y
apareciendo de color púrpura. Resisten la acción del
decolorante tras un tratamiento con un colorante
básico (violeta de genciana) y lugol, como los
Staphylococcus y Bacillus.

Gram negativas: Son decoloradas y teñidas

posteriormente con un colorante de contraste como la
fucsina diluida (o safranina). Aparecen de color rojo,
como Pseudomonas y Escherichia.

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7. Proceso de tinción de Gram

1. Se prepara una extensión fijada al calor (o con metanol), a partir de
un cultivo fresco de no más de 18-24 h
2. Se tiñe con solución de violeta cristal durante 1-2 minutos.
3. Se lava inmediatamente con agua abundante para quitar el exceso de
colorante.
“todas las células tanto gram+, como gram- estarán teñidas de azul”.
4. Se añade solución de lugol (solución yodo yodurada) y se deja
reposar un minuto.
5. Se decanta el lugol, se seca con papel secante y se lava el porta con
etanol al 95 % (o con alcoholes metilados industriales), hasta el
momento que ya no se desprenda color violeta de la extensión
(bastarán de 5 a 15 segundos).

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7. Proceso de tinción de Gram

6. Se lava abundantemente con agua.

”la delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el complejo
cristal-violeta-yodo y la célula se decolora.

7. Se añade solución del colorante de contraste, fucsina fenicada

durante 20-30 s (o safranina durante 1 minuto).

8. Se lava con agua abundantemente el portaobjetos y se seca al aire

(o suavemente con papel de filtro limpio)
9. Se cubre con un cubreobjetos.
10. Se observa al microscopio con el objetivo de inmersión.

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https://www.youtube.com/watch?v=FceD8FFhuew

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8. Tinción de esporas

Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium

forman endosporas que son muy resistentes a las altas
temperaturas, a la falta de humedad y a los productos
químicos tóxicos. También son muy resistentes a los
colorantes bacteriológicos (se ve como zonas
incoloras).
Una vez teñidas, su decoloración suele ser muy difícil.

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8. Tinción de esporas
Método de Bartholomew y Mittwer:
1. Se prepara una extensión en la forma habitual y se fija
intensamente a la llama, para lo cual se pasa unas 20
veces por la misma.
2. Se tiñe durante 10 minutos con solución saturada
de verde malaquita.
3. Se lava suavemente con agua fría durante 10 segundos.
4. Se tiñe con solución de safranina al 0,25 % durante
15 segundos
5. Se lava con agua y se seca con papel secante.

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8. Tinción de esporas

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