SUBMDULO: PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLGICOS PRUEBAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS MTRA: Ma.

Del Pilar Huerta Ruz

PRUEBAS BIOQUMICAS

ENZIMA QUE POSEE EL MICROOG/ TCNICA

REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

Tincin de Gram

1. 2. 3. 4.

Cristal violeta Lugol Alcohol/Acetona Safranina o Fuscina

Se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

Poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana: Grampositivas y Gramnegativas

Las bacterias Gram positivas retienen el colorante primario (cristal violeta)=prpura Las bacterias Gram negattvas no retienen el colorante primario por lo que se tien del colorante de contraste (safranina) = rojo

Prpura

Rojas

Catalasa. Con un asa de inoculacin (no hiero)recoger el centro de una colonia pura de 18-24 hrs. y colocarla sobre un portaobjetos limpio, agregar una gota de agua oxigenada sobre el microorganismo

Catalasa

Perxido de hidrgeno

Se investiga la presencia de la enzima catalasa en el microorganismo, que es capaz de descomponer el perxido de hidrgeno o agua oxigenada en agua y oxgeno, que se desprende en forma de burbujas en el medio.

La presencia de la enzima catalasa en el microorganismo,

Si el microorganismo es catalasa + se observar de inmediato la aparicin de burbujas (liberacin de gas)

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

Oxidasa. Sobre el Reactivo impregnado en disco colocar con un aplicador de madera en forma abundante cultivo puro de colonias. No usar asas o alambres de inoculacin. Los productos de oxidacin formados al esterilizar el alambre dan reacciones falsas positivas. Identificar bacterias que contengan el Sistema de citocromos que nos permita diferenciar gramnegativos Identificar microorganismos que carecen de la enzima.

Prueba positiva: Vire del indicador de incoloro a prpura o violeta en 10 segundos. Espere un tiempo Mximo de 60 segundos. Prueba Negativa: Sin cambio del indicador en los primeros 60 segundos.

Citocromooxidasa

Tetrametilo de la pfenilendiamina

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

O/F Oxidacin/ Fermentacin

Se inoculan dos tubos por picadura y uno de ellos se coloca en sello de aceite mineral estril y otro tubo sin el sello. Los tubos son incubados a 37 C durante 24hrs.

Medio OF con Dextrosa de Hugh y Leifson. Aceite mineral

Identificar bacterias, constituye un pilar importante de los criterios de Cowan y Steel en las pruebas de Bioqumicas de Seleccin Primaria para la identificacin bacteriana.

-Utilizacin de Hidratos de carbono por la va oxidativa o va fermentativa. -Movilidad y - produccin de gases

Medio OF con Dextrosa de Hugh y Leifson. (Verde) A= Amarillo/ verde =oxidativa. Los microorg. oxidativos producen cido slo en el tubo abierto expuesto al oxgeno atmosfrico. B=Amarillo/amarillo=ferm entativa C= Verde/ verde= no utiliza el hidrato de carbono (asacaroltico). Observe el ligero vire a alcalino (azul) debido a la utilizacin de protenas (peptonas) del medio.

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

Ureasa. A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubacin. Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color. Incubacin: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C.

Urea

Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo.

Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.

Agar urea El medio vira con el rojo de fenol del amarillo al rojo.

UREA

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

Movilidad (Medio Mio)

A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por puncin profunda con ansa recta. Incubacin: En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 C.

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de inoculacin.

Movilidad

Medio Mio Morado 1.Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas all de la lnea de siembra. 2.Resultado negativo: Crecimiento solo en la lnea de siembra 2 1

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PRINCIPIO DE LA PRUEBA

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RESULTADO IMAGENES

Ornitina descarboxilasa (Medio Mio)

Descarboxilasa

La descarboxilacin es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas atacan los aminocidos en su carboxilo terminal (COOH), para formar una amina o diamina y CO2. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas

Actividad de ornitina

Medio Mio Descarboxilasa +=: color prpura. -=: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la superficie del medio + -

Indol (Medio Mio)

Kovacs o de Erlich.

Produccin de indol. Se realiza despus de las dos anteriores.

Medio Mio 1.Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. 2.Resultado negativo el color del reactivo revelador permanece incoloro amarillento 2 1

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PRINCIPIO DE LA PRUEBA

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RESULTADO IMAGENES

Descarboxilasa y deaminasa . Descarboxilaci n de la Lisina Siembra Por puncin profunda con aguja de inoculacin. Incubacin En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C.

gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo. La lisina es el sustrato para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta

1.Descarboxilaci n de la lisina: +=pico y fondo violeta. 2 -=:pico violeta/fondo amarillo: 3. Desanimacin de la lisina: +=pico rojizo/fondo amarillo 4.Produccin de cido sulfhdrico:+= ennegrecimiento del medio, pico y fondo 5.Produccin de gas

Agar de hierro lisina (LIA) Morado

4/5

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PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

-galactosidasa. galactosidasa El caldo se distribuye aspticamente en tubos estriles, realizar una suspensin bacteriana densa del microorganismo. Incubar a 37. C desde 1 a 24 Hrs,

Orto-nitro-fenil--Dgalacto-piransido (OPNG)

la presencia en el microorganismo de la enzima galactosidasa, utilizando el ortonitro-fenil--Dgalactopiransido (OPNG)

Esta prueba permite detectar con mayor rapidez la fermentacin de la lactosa, al evidenciar la enzima galactosidasa ms rpidamente.

Caldo de OPNG 1.Prueba positiva: Aparicin de un color amarillo establece por liberacin del o-nitrofenol. 2.Prueba negativa: incoloro despus de 24 hrs

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

Citrato

Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie del pico de flauta un inculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar. Incubacin A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces

Mediante esta prueba se determina si el M es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono y energa

Agar Citrato de Simons 1.Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad 2.Negativo: El medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. La lactosa est presente en una concentracin 10 veces superior a la glucosa, el sulfato de hierro se adiciona al medio para detectar la formacin SH2 por la bacteria, originndose sulfuro ferroso que es de color negro. El indicar pH rojo fenol es amarillo a un pH cido, rojo a un pH alcalino y anaranjado rojizo a un pH inicial del medio 7,4 a)Capacidad de un microor. de atacar un hidrato de carbono (glucosa y lactosa o ambas) b) Produccin o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono. c)Produccin de cido sulfhdrico SH2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono. Agar Hierro de Kligler 1).Fermentacin de la glucosa y no de la lactosa: pico alcalino(rojo) y fondo cido (amarillo) 2) Fermentacin tanto de la glucosa como de la lactosa: Pico cido, fondo cido (amarillos ambos) 3) No hay fermentacin ni de glucosa ni lactosa: Pico y fondo alcalino (ambos rojos)

Agar Hierro de Kligler (AHK)

La inoculacin del medio se realiza en picadura hasta unos 0,6 cm del fondo, y sin volver a cargar se siembra en estras la superficie del pico de flauta. Inoculacin: a 35 a 37.C durante 18 a 24 Hrs

2a

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

Voges Proscauer

Por inoculacin directa, a partir del cultivo en estudio. Incubacin En aerobiosis, a 3537C hasta por 3 das Aadir 0.2 ml de hidrxido de potasio al 40% y 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 1015 minutos. Observar el color de la superficie del medio.

hidrxido de potasio al 40% y 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto a 2.5 ml de cultivo

Se basa en la conversin de acetil-metilcarbinol (acetona), el cual es el metabolito final de la glucosa, a diacetilo a travs de la accin del hidrxido de potasio al 40% y el oxgeno atmosfrico.

Observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la va butanodilica. Si es as , se forma un producto intermedio (acetona) que forma un complejo de color rojizo con el naftol

Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP) 1.Positivo: Desarrollo de un color rojo en pocos minutos, despues de una completa agitacin del tubo. 2.Negativo: Ausencia del color rojo

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN El nitrito procedente de la reduccin de clulas puede detectarse aadiendo alfanalfilamina y cido sulfanlico producindose un color rojo.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES

Reduccin de Nitratos

Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potsico

Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de een la respiracin. el nitrato puede ser reducido a nitrito o en un paso ms a gases (xidos de nitrgeno). Las Enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positivos.

Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido a ms que a nitritos producindose gas. Si al aadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificacin)

. Positivo = color rojo Negativo= ausencia de color

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN Agar TSI 3. Pico rojo fondo rojo: el microorg. es no fermentador de azcares. 4. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorg. produce gas. 5.EL ennegrecimiento del medio indica que el microorg. produce cido sulfhdrico.

RESULTADO IMAGENES

Fermentacin de carbohidratos, produccin de gas y H2S

Siembra A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubacin A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Mismos fundamentos que el medio AHK

El agar TSI es un medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.

2 4

1. Pico rojo fondo amarillo: el microorg. fermenta solamente la glucosa. 2. Pico y fondo amarillo el microor. fermenta glusosa, lactosa y/o sacarosa

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN reactivo de Kovacs o de Erlich

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RESULTADO IMAGENES

Determinacin de indol, movilidad y cido sulfhdrico (SIM)

Siembra A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por puncin profunda con ansa recta. Incubacin En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 C.

El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.

Movilidad Produccin de indol y cido sulfhdrico

Medio Sim Amarillo Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende ms all de la lnea de siembra. Cepas H2S positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs o de Erlich.

Indol positivo

H2S +

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Rojo de Metilo

Siembra Por inoculacin directa, a partir del cultivo en estudio. Incubacin En aerobiosis, a 3537C hasta por 3 das.

Rojo de metilo al 0.04%,

Aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio.

La glucosa puede ser metabolizada por los microorg, a travs de distintas vas metablicas. Segn la va utilizada,se originarn produc. finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico), o produc. finales neutros (acetil metil carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un indicador como rojo de metilo,para revelar la presencia de productos cidos

revelar la presencia de productos cidos

Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP) Positivo: color rojo. Negativo: color amarillo.

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN Cloruro frrico

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Fenilalanina

Fenilalanina deaminasa . Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un inculo denso estriando la superficie del medio. Incubacin Incubar de 18 a 24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Luego, se debe realizar el revelado: agregar unas gotas de una solucin acuosa de cloruro frrico al 10%

El aminocido fenilalanina sufre la desaminacin oxidativa catalizada por la enzima fenilalanina deaminasa (es una flavoprotena),par a producir cido fenilpirvico y amonaco. La presencia del cido fenilpirvico se demuestra con el agregado de cloruro frrico en medio cido, con el cual se forma un quelato de color verdoso entre el cido fenil pirvico y los 3+ iones Fe . Adems, en este medio se suele -

Produccin de cido

Agar Fenilalanina El anlisis de los resultados debe realizarse dentro de los primeros 5 minutos. Positivo: desarrollo de color verde plido a intenso en el pico de flauta y en el lquido de condensacin. Negativo: sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del reactivo cloruro frrico.

Adems, en este medio se suele poner en evidencia la produccin de pigmentos melnicos, como en el caso de Morganella morganii.

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REACTIVO UTILIZADO PARA DETERMINAR LA REACCIN

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

DETERMINA:

MEDIO DE CULTIVO UTIZADO ,COLOR /E INTERPRETACIN

RESULTADO IMAGENES