Citometria de Flujo

CITOMETRIA DE
FLUJO
Manuel Oviedo Martínez
Hematología
372
UABC
 Consiste en una placa gruesa de cristal en
forma de porta, cuya porción central está
dividida en tres bandas perpendiculares al eje
longitudinal de la cámara.
 De ellas, las dos laterales se hallan
sobreelevadas 0´1 mm con respecto a la
central, y en esta última hay grabado un
retículo cuadrangular.
 La banda central puede estar, a su vez,
subdividida en dos semibandas idénticas y
separadas por un surco paralelo al eje
longitudinal de la banda.
 En cada una de estas dos semibandas hay
grabado un retículo idéntico.
 Lectura y ajuste de concentración celular: Como se cuentan
los linfocitos presentes en 4 cuadrados grandes del
retículo, hay que dividir por 4 la cifra obtenida en el
recuento, para calcular el número de leucocitos que hay en
1 cuadrado grande.
Como la longitud de cada uno de

los lados de los cuadrados grandes
es de 1 mm, y la longitud del
espacio comprendido entre éstos y
el cubre es de 0´1mm; hay que
multiplicar por 10 el resultado
anterior, para determinar el
número de linfocitos existentes, no
en 0´1mm3 , sino en 1mm3 .
 En definitiva, para su cálculo puede
emplearse la siguiente fórmula:
 RL= L/4 x 10 x D
 RL= Recuento de linfocitos (número de
linfocitos por mm3 de la suspensión
celular).
L = Linfocitos contados en 4 cuadrados
grandes.
D= Factor de dilución.
 Es una técnica de análisis
celular multiparametrico
 Es una tecnología
(proceso) que permite la
medida simultánea de
múltiples características
físicas de una sola célula.
 Estas medidas son
realizadas mientras las
células (partículas) pasan
en fila, a una velocidad de
500 a 4000 células por
segundo, a través del
aparato de medida en una
corriente de fluido .

 Fluidos
 Optica
 Electrónica
 para introducir y
restringir las
células para análisis
 fuente de excitación
 un sistema colección.
 Para convertir las señales ópticas en señales
electrónicas proporcionales y digitalizarlas
para análisis computacional.
 Identificar y enumerar subpoblaciones
celulares únicas y definidas.
 Seleccionar y separar físicamente
subpoblaciones de células deseadas
 Medir capacidad funcional de subpoblaciones
celulares definidas
 Un fluorocromo es una molécula química que
absorbe la luz a una determinada longitud de
onda (ENERGIA ) energía de excitación y emite
a una longitud superior (MENOR ENERGIA)
 Interacciona con la
luz de excitación
procedente de el
láser. Se utiliza
unido a anticuerpos
específicos
(monoclonales )
para antígenos de la
célula. La cantidad
de fluorescencia con
la cual una célula se
tiñe es proporcional
a la cantidad de
sitios de unión.
 Unión de sitios específicos con anticuerpos
marcados con fluorocromos El fluorocromo
absorbe energía del láser El fluorocromo
libera energía absorbida por : Vibración y
disipación del calor. Emisión de fotones a una
mayor longitud de onda
llamada fluorescencia (1,2,3).
El citómetro de flujo detecta como las
células interactúan con un rayo láser en
términos de cómo la célula :
 desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC)
 emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2.
FL3)(1).
 Fase pre-citometría: preparación de los
reactivos, preparación de las células, diseño
del protocolo y coloración de las células con
los reactivos fluorescentes.
 Fase de citometría de flujo : involucra el
procesamiento de las células marcadas y la
recolección de los datos para cada una de las
medidas (parámetros) realizados en cada
célula individual.
 Fase de análisis: análisis de los datos
recolectados
 La mezcla de células
teñidas con diferentes
fluorocromos es forzada a
pasar a través de una
aguja creando una delgada
fila de líquido que contiene
las células.
 A medida que cada célula
pasa en frente del láser,
desvía el rayo incidente y
las moléculas teñidas
unidas a la célula van a ser
excitadas y emiten luz
fluorescente.
 Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la
luz desviada y las emisiones fluorescentes, la
información es digitalizada y procesada por
el computador.
 Los resultados son presentados a manera de
histogramas o "dot-plots"
 Hematología : tipificacion y conteo de células ,
reticulocitos y análisis de medula ósea .
 Farmacología :estudios de cinética celular
 Inmunología :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje
tisular
 Oncología :Diagnostico y pronostico ,monitores
de tratamientos
 Microbiología :diagnostico bacteriano y virico
,estudios de sensibilidad a los antibióticos
 Genética : Cariotipo y diagnostico de portador y
diagnostico prenatal.
 Análisis de un número estadísticamente significativo
de células ( 1000 a más de 100.000 células).
 Múltiples marcajes de una sola célula.
 Análisis de alto numero de partículas en corto tiempo
(5.000 eventos /seg. ).
 Alta sensibilidad y objetividad.
 Medidas separadas de cada célula (no sólo el
promedio).
 Medidas cuantitativas : discriminación de las células
según la cantidad de marcador.
 Múltiples parámetros : define subpoblaciones
complejas.
 Miles de células por segundo .
 Poca información morfológica de la célula
 No proporciona información de la
localización celular en un tejido
 Puede analizar solamente una cantidad
limitada de material (10 millones de células /
hora)
 Necesita suspensión de células individuales.
 Costos de la tecnología
 Método destructivo.
 Incapacidad de visualizar las células que se
analizan.
 Pipetas volumétricas
 Pipetas de Ostwald-Folin
 Pipetas graduadas
 Micropipetas
 Bulbo
 TD
 Volumen
 Tiempo de
almacenamiento
 Temperatura con gran
exactitud
 no están graduadas y
sólo permiten medir un
volumen único.
 Tubo de vidrio delgado
 Para pequeños volúmenes de sangre
 Se calibran para soplar
 Se calibran con
agua
 No son muy
exactas
 Es más exacta la
que esté más
cercana
 Se calibran con
mercurio
 Debe
enjuagárseles
con el líquido de
dilución
 Azul de Cresilo Brillante
Solución fisiológica al 0.5% para tinción de reticulocitos, la substancia
granulo filamentosa de éstos se tiñe de azul negro.
Presentación por 100 ml.
Reactivo de Turk
Solución de violeta de genciana ácido acético, lista para su uso.
Para conteo de leucocitos en Cámara de Neubauer.
Thrombo - Count
Solución de oxalato de potasio con cloruro de mercurio,
Para conteo directo de trombocitos.
Presentación por 50 ml.
Reactivo de Hayem´s
Solución de cloruro de mercurio isotónica para conteo en eritrocitos en
la cámara.
 El ácido acético contenido en la solución de
Türk hemoliza los eritrocitos y el colorante
contenido tiñe los leucocitos.
 Llenado de la pipeta
 Aspirar sangre en una pipeta de leucocitos
hasta la marca 1.0, seguidamente
 aspirar solución de Türk hasta la marca 11.
La dilución es 1:10.
 También es posible una dilución de 1: 20
(sangre hasta la marca 0.5 y
 solución de Türk hasta la marca 11).
 Mezclar cuidadosamente la sangre

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