Principios Básicos de Instrumentación en Laboratorio

PRINCIPIOS BÁSICOS DE
INSTRUMENTACIÓN EN
LABORATORIO
CONTENIDO
 Espectrofotometría
 Fluorometría
 Turbidimetría.
 Descripción de equipos y aplicaciones en el laboratorio clínico
ESPECTRO
ELECTROMAGNETICO
ESPECTROMETRIA
• La energía radiante (radiación electromagnética) puede manifestarse
como movimiento ondulatorio (radiación electromagnética) o como si
estuviese integrada por un flujo de partículas discretas o paquetes
ondulatorios energéticos denominados “fotones”, es decir
presentando propiedades electromagnéticas y energéticas. Ambos
modelos son complementarios.
La luz tiene una naturaleza dual:
•Como onda
•Como una corriente de partículas o paquetes de energía (fotones)
ESPECTROMETRIA
• Cuando se incide sobre la materia con una energía radiante, tienen
lugar determinadas transiciones electrónicas desde unos orbitales a
otros. Estas transiciones electrónicas determinan cambios en el
estado energético de átomos o moléculas, cambios que son
característicos de cada especie atómica o molécula, por ello cada
átomo o molécula absorbe una energía radiante de características
definidas.
• En base a este comportamiento, se aplican las técnicas analíticas
espectroscópicas para identificar y/o cuantificar en muestras
biológicas los parámetros indicadores de estados fisiológicos o
patológicos
ESPECTROMETRIA: Medición de la intensidad
de la luz
I. ESPECTROFOTOMETRÍA O FOTOMETRÍA
• Se le llama espectrofotometría a la medición
de la cantidad de energía radiante que absorbe
un conjunto de elementos o un elemento en su
estado puro.
Colorimetría y
Espectrofotometría
como
procedimientos
analíticos
Las técnicas colorimétricas se
fundamentan con la medición de la
absorción de radiación visible por
sustancias coloreadas.
Sin embargo, cuando una muestra a

determinar no posee coloración, es
necesario llevar a cabo un tratamiento de
color empleando substancias que que
reaccionen de forma proporcional con el
compuesto de interés
Las diferentes sustancias se analizan mediante
reacciones coloreadas. Cuanto mayor es la concentración
de la sustancia a analizar mayor es el color de la
reacción.
También es posible que la muestra pueda ser
“leída” cuando su espectro de absorción se
encuentra en las regiones no visibles del
espectro, como las referentes a las regiones de
UV o infrarroja
La diferencia entre colorimetría y
espectrofotometría consiste en el tipo de instrumental
empleado:
El colorímetro es un aparato en los que la longitud de onda se

selecciona por medio de filtros ópticos que son insertados en
este.
En el espectrofotómetro la longitud de onda es seleccionada

mediante dispositivos monocromadores los cuales están
integrados a la máquina.
• Todas las sustancias pueden absorber energía radiante. La absorción
de las radiaciones UV, visibles e IR depende de la estructura de las
moléculas, y es característica para cada sustancia química. El color de
las sustancias se debe a que absorben ciertas longitudes de onda de
la luz blanca que incide sobre ellas y sólo dejan pasar a nuestros ojos
aquellas longitudes de onda no absorbida.
Espectro de absorción: es un gráfico
que muestra cómo varía A (є) al variar
la longitud de onda
Una solución que absorbe el rojo pero no el amarillo y
el azul con la combinación de estos dará un color
verde.
Luz incidente Luz absorbida Luz emergente

Amarillo
Rojo
Amarillo
Azul
Azul
} Verde
Por lo anterior podemos aplicar un sencillo
método para precisar con cual filtro podríamos
leer una solución dependiendo el color de esta
Cuando la solución sea roja no se deberá utilizar

un filtro de color rojo porque justamente ese es el
color que no absorbe.
Color del Rango Soluciones
filtro espectral coloreadas
Azul 400-465 Roja, Naranja,

Amarilla, Verde,
Turbias
Verde 500-570 Roja, Amarilla,
Violeta, Naranja,
Azul
Rojo 640-700 Azul, Verde,

Amarilla
• Esta espectrofotometría utiliza radiaciones del campo
UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm
(UV cercano) y de luz visible de 400 a 630 nm.
• Se rige por una ley muy importante: la ecuación de
Beer-Lambert.
LEY DE LAMBERT Y BEER
LEY DE LAMBERT Y BEER
Relaciona la concentración de una
solución y la capacidad de transmitir una
radiación monocromática
A = abc A = εbc
a = coeficiente de absorción o absortividad (L·g-1·cm-1)

b = longitud interna de la celda (cm)
c = concentración (mol, g·L-1)
ε= coeficiente de absorción molar o absortividad molar,
coeficiente de extinción molar( (L·mol-1·cm-1)
Po = 100 fotones 50 fotones = P
Haz monocromático T = 0.5 = 50%
Po = Potencia radiante
A = log Po/P = -logT= log100
P = Potencia emergente %T
T= Transmitancia
A = Absorbancia
La Ley de Lambert y Beer afirma que la concentración de
una sustancia coloreada es directamente proporcional a la
cantidad de luz absorbida e inversamente proporcional al
% de luz transmitida.
Curva Patrón o de
Calibración
El razonamiento para el proceso de
determinación de una concentración
desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las
cuales también se sabe su absorbancia (curva
patrón), es posible interpolar (intercalar) la
concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)
Curva de calibración: representación gráfica
en un eje de coordenadas de absorbancia
(ordenadas) frente a concentración (abscisas).
Para construir la curva de calibración (que debe
ser una recta) se ensayan varias soluciones de
concentraciones conocidas y se determinan sus
absorbancias, luego se representan
gráficamente sus concentraciones frente a sus
absorbancias.
La concentración de la muestra a analizar se
obtiene por interpolación de su absorbancia en
la curva de calibración.
CURVA PATRÓN
0.6
0.5
A
Absorbancia del problema
B 0.4
S
0
R 0.3
B
A
0.2
N
C
Interpolación
I
0.1
A
0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración mg/lt
Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con
la concentración, se comprende la existencia de una relación de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:
A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.
Si despejamos C1 = Conc del problema
A1 (problema) * Conc estándar

Conc. (problema) =
A2 (estándar)
Ley de Lambert y Beer

ESPECTROFOTÓMETRO
• Fuente de radiación: es el origen de la emisión energética en forma de
radiación electromagnética lo suficientemente potente y estable para que
sea posible su detección y su medida una vez que ha atravesado la
muestra.
• Sistema de depósito de la muestra biológica
• Selector de longitud de onda: tiene la función de seleccionar o discriminar
una banda estrecha de longitud de onda de las procedentes de la fuente de
radiación con la finalidad de aumentar la sensibilidad de la medida de
absorbancia.
• Detectores: sistemas que amplifican y transforman la energía radiante no
absorbida por la muestra en energía eléctrica y la convierten en una señal
eléctrica y cuantificable.
• Sistemas de registro y presentación de datos.
Espectrofotómetro Mecanismo Interno
MCI MCI
Para medir Luz Visible Para medir Luz Visible y U.V.
MCI
Para medir Luz Visible y U.V.
Diferentes tipos de espectrofotómetros

Fuente luminosa
Lámpara de deuterio:
Para la región UV (160 – 375
nm)
Lámpara de Tugsteno:
Para la región Visible/IR
cercano
(350 – 2500 nm)
Lámpara arco de xenón: (200 –

1000nm)
Cubeta para muestra
1 cm
Vidrios silicatos, Cuarzo o sílice fundida

plástico UV (<350 nm)
Vis (350 – 2000
nm)
UTILIDAD DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA
•Química analítica
•ELISAS
Ventajas:
• 1) Rapidez
• 2) Uso fácil
• 3) Precisión extrema
• 4) Versatilidad
• 5) Eficiencia en el costo
• 6) Sensibilidad
• 7) Preparación mínima de la muestra
Inconvenientes:
• 1) En aquellas muestras que requieren disolución es necesario que esta se lleve a
cabo en el disolvente adecuado.
• 2) Los problemas asociados con dichas celdas incluyen la aparición de burbujas que
dan lugar a bandas erróneas.
• 3) Suele aparecer la banda del disolvente, pudiendo llegar a interferir.
II. NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA
• Son métodos analíticos basados en la dispersión de partículas suspendidas
en líquidos.
• -Turbidimetría: es la medición de la luz transmitida a través de una
suspensión, tiene la ventaja de permitir la valorización cuantitativa, sin
separar el producto de la solución. Las mediciones, pueden efectuarse con
cualquier espectrofotómetro.
• -Nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida
(generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º). Utiliza como
instrumento el nefelómetro (en el que el detector se ubica con un ángulo
que oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). Se suele utilizar para concentraciones
más diluidas. Permite mayor sensibilidad con concentraciones menores de
partículas suspendidas. Constituye un método más exacto para la medida de
la opacidad.
• Factores para la elección entre turbidimetría y nefelometría:
• Intensidad de la radiación transmitida o dispersada con la intensidad
de la radiación procedente de la fuente.
• Tamaño de las partículas dispersantes.

UTILIDAD
Turbidimetría:
• Se utiliza para el análisis de fibrinógeno, triglicéridos, complejos Ag-Ac
y otras sustancias.
• Aplicable cuando la dispersión es suficientemente grande
(concentración alta de partículas).
Nefelometría:
• Preferible para concentraciones bajas de partículas, ya que la
dispersión es menor y la disminución de intensidad del haz incidente
es pequeña.
• Se suele utilizar para medir concentraciones específicas de colonias
de bacterias en algún medio de cultivo.
MÉTODOS DE EMISIÓN
FLUORESCENCIA
• Causada única y exclusivamente por rayos ultravioleta. El
término fluorescencia proviene del mineral que presenta este
fenómeno por naturaleza, la fluorita.
• La fluorescencia se produce cuando una molécula absorbe luz de

una determinada longitud de onda(energía), y emite luz de una
longitud de onda superior (menor energía).
FOSFORESCENCIA
• La fosforescencia es un fenómeno en el cual ciertas sustancias
tienen la propiedad de absorber energía y almacenarla, para después
emitirla gradualmente en forma de luz .
• El principio físico en el que se basa la fosforescencia es el mismo que

el de la fluorescencia,la principal diferencia radica en la forma de
emitir la luz absorbida. En la fluorescencia es casi simultánea, y en la
fosforescencia es retardada.
QUIMIOLUMINISCENCIA
• Fenómeno que en algunas reacciones químicas,
la energía liberada no sólo se emite en forma de
calor o de energía química sino en forma de luz.

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PRINCIPIOS BÁSICOS DE

Sin embargo, cuando una muestra a

El colorímetro es un aparato en los que la longitud de onda se

En el espectrofotómetro la longitud de onda es seleccionada

Luz incidente Luz absorbida Luz emergente

Cuando la solución sea roja no se deberá utilizar

Azul 400-465 Roja, Naranja,

Rojo 640-700 Azul, Verde,

a = coeficiente de absorción o absortividad (L·g-1·cm-1)

Haz monocromático T = 0.5 = 50%

Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estándar

Ley de Lambert y Beer

Diferentes tipos de espectrofotómetros

Lámpara arco de xenón: (200 –

Vidrios silicatos, Cuarzo o sílice fundida

• Tamaño de las partículas dispersantes.

• La fluorescencia se produce cuando una molécula absorbe luz de

• El principio físico en el que se basa la fosforescencia es el mismo que

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