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    Microscopía Fluorescente

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    Mariana Carrillo
    Este documento describe la microscopía de fluorescencia, incluyendo la fluorescencia, los tipos de fluorócromos, y sus usos y aplicaciones. La microscopía de fluorescencia permite identificar componentes celulares submicrométricos y otras entidades con un alto grado de especificidad utilizando fluorócromos y lámparas de alta potencia. Algunos ejemplos de aplicaciones incluyen inmunofluorescencia, detección de sondas, y localización de anticuerpos.

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    Este documento describe la microscopía de fluorescencia, incluyendo la fluorescencia, los tipos de fluorócromos, y sus usos y aplicaciones. La microscopía de fluorescencia permite identificar componentes celulares submicrométricos y otras entidades con un alto grado de especificidad utilizando fluorócromos y lámparas de alta potencia. Algunos ejemplos de aplicaciones incluyen inmunofluorescencia, detección de sondas, y localización de anticuerpos.

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    Este documento describe la microscopía de fluorescencia, incluyendo la fluorescencia, los tipos de fluorócromos, y sus usos y aplicaciones. La microscopía de fluorescencia permite identificar componentes celulares submicrométricos y otras entidades con un alto grado de especificidad utilizando fluorócromos y lámparas de alta potencia. Algunos ejemplos de aplicaciones incluyen inmunofluorescencia, detección de sondas, y localización de anticuerpos.

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    de 10

    MICROSCOPÍA

    FLUORESCENTE
    Fluorescencia
    ■ Proceso en el que un espécimen absorbe y subsecuentemente irradia luz, en un
    intervalo de tiempo de usualmente de pocos nanosegundos y cuya energía es
    menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación que absorbida.

    Fluorocromo Fluoróforo
    Diagrama de Jablonksy
    Tipos de Fluorócromos
    ■ Intrínsecos: aminoácidos aromáticos, NADH, Flavinas, derivados del piridoxyl y
    clorofila.

    ■ Puntos cuánticos: nanocristales (2-50 nm) que re-emiten luz en longitudes de onda
    específica dependiendo de su tamaño.

    ■ Extrínsecos: Dansyl, fluoresceína y rodamina, caracterizados por su fotoestabilidad.


    • Clorofila es claro ejemplo de fluoróforo intrínseco.
    • Permite estudiar PSII durante transporte electrónico en
    fotosíntesis y la sensibilidad del PSII a diferentes
    estreses
    • Los excitones del proceso fotoquímico anterior son
    reemitidos como luz, que produce un pico en el espectro
    en torno a 690-730nm (zona roja del espectro)

    • Cuanto más pequeños los puntos, menor es la longitud


    de onda Por ello la luz emitida vira del azul al rojo a
    medida que el tamaño del punto se incrementa

    • Utilizados como marcadores de biomoléculas. La


    fotoestabilidad es una de las principales características
    de este tipo de colorantes
    Microscopia de fluorescencia
    ■ Herramienta que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución
    microscópica.
    ■ Permite identificar células, componentes celulares sub-micrométricos y otras
    entidades con un alto grado de especificidad.
    ■ Utilizan lámparas halógenas de alta potencia (~300 Watts) aunque los hay de
    mejores materiales como lámparas de vapor de mercurio
    ■ Diferentes sondas fluorescentes permiten apreciar distintos tipos de moléculas
    gracias a las técnicas de marcado específico
    Usos y Aplicaciones
    ■ Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moléculas de la muestra misma.

    ■ Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra observadas selectivamente por tinción. Ej:,
    proteínas, anticuerpos, DNA, RNA, etc.

    ■ Sobre objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución, siempre que su
    emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, virus.

    ■ Inmunofluorescencia y detección de sondas.


    ■ Time Series (Series Temporales).
    ■ Distribución de orgánulos en la célula.
    ■ Análisis de superficies de materiales.
    ■ Localización de anticuerpos (inmunocitoquímica).
    ■ Monitorización de moléculas (ej. Ca).
    Técnicas utilizadas
    1. DAPI: tiñe el DNA de color azul brillante. Permite enumerar
    microorganismos.

    Desventaja: No discrimina entre células vivas y muertas.


    2. Tinción de Viabilidad: permite discriminar entre células vivas y
    muertas

    Desventaja: solo apropiado para cultivos puros, pueden interactuar con objetos no
    celulares en muestras ambientales
    3. Green Fluorescent Protein: Detección y rastreo de organismos
    introducidos en ambientes naturales.
    Bibliografía
    ■ DEVELOPMENT OF A LOW-COST EPIFLUORESCENCE MICROSCOPE; Ormachea, O., Villazón. a.; et al 2017
    ■ LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y SU APLICACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO DE BACTERIAS
    FITOPATÓGENAS; Franco, Y.; et al 2005
    ■ OLYMPUS MICROSCOPY; Davison, M., Abramowitz, M.; et al 2011
    ■ FLUORESCENCIA; Monteleone, M.; et al 2017
    http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/BioCel/1504634347.
    pdf
    ■ FLUORÓFOROS Y SUS APLICACIONES; Wood, C.; et al 2015
    https://www.cio.mx/talleres/tmcmf/archivos/CW_Fluoroforos.pdf
    ■ FLUORESCENCIA; Bacic, F., Cabrera, P., Zamorano, C., Vilar, J.; et al 2014
    http://www.scian.cl/archivos/uploads/1409836870.8698
    ■ RED FLUORESCENCE OF CHLOROPHYLL; Garcia-Pomar, J., Garcia-Pomar, R.; et al 2015

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