U.T.

11:
Cromatografía

Módulo:
ANÁLISIS INSTRUMENTAL

Laboratorio de Análisis y
Control de Calidad
 UT 11: CROMATOGRAFÍA

1. Introducción

2. Clasificación de la técnicas cromatográficas

3. Cromatografía plana

4. Cromatografía en columna

5. Parámetros básicos de cromatografía

1
 1. Introducción

• El objetivo básico de las diferentes técnicas cromatográficas consiste

en separar los componentes individuales de una mezcla.
• Una separación es una operación en la que una mezcla se divide en
dos o más partes de distinta composición.
• De forma que cada una de las fracciones obtenidas se enriquece en
un componente.
• Permite mejorar la:
 SELECTIVIDAD: La separación evitará la interferencia de especies
con propiedades similares al analito.
 SENSIBILIDAD: Puede transferir el analito a una nueva fase en un
volumen más pequeño aumentando su concentración,
obteniéndose señales analíticas mucho mayores.
• Permite separar componentes de una mezcla aun cuando estos
sean similares en propiedades, cosa que resulta imposible por
otros métodos.

2
 Introducción

• La cromatografía nació como técnica de separación pero se ha

transformado en diferentes técnicas analíticas al acoplárseles
diferentes sistemas de detección de los componentes que se van
separando.

• Así, por lo tanto esta técnica permite la separación, identificación

y la cuantificación de los componentes separados.

• Aplicaciones:
 Analíticas
 Preparativas

3
 Introducción

Mezcla de solutos Fase estacionaria

Fase
Detector
móvil

• Los componentes que se han de

Señal
separar se distribuyen entre dos
fases, una de la cuales está en
reposo, llamada fase TR1 TR2 TR3
estacionaria y otra que se
Tiempo
mueve en una dirección definida
llamada fase móvil.

• Se basa en la diferencia de velocidad con que los componentes de

una mezcla se mueven a través de la fase estacionaria (FE) mediante
el flujo de la fase móvil (FM); este movimiento se denomina elución.

4
 Introducción

• La fase móvil pasa continuamente sobre la fase estacionaria.

• La muestra se inyecta o se coloca en la fase móvil.
• Según van avanzando junto con la fase móvil, los componentes de la
muestra se van repartiendo entre ambas fases, en función de la
diferente afinidad que cada uno de los componentes de la mezcla
tenga por cada fase:
 Las sustancias que son retenidas por la fase estacionaria se
mueven más lentamente.
 Las que son débilmente retenidas avanzan con mayor rapidez.
• El fundamento de la separación está en alguna o algunas de las
propiedades físicas o físico-químicas de los analitos: solubilidad,
adsorción, volatilidad, tamaño, carga, afinidad biológica, etc. Es muy
improbable que dos especies presenten cuantitativamente las mismas
propiedades frente a un sistema cromatográfico dado.

5
 2. Clasificación de las técnicas cromatográficas

• Según el estado físico de la fase móvil y la fase estacionaria:

 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS. La fase móvil es un líquido.
Si la fase estacionaria es:
 Un sólido: cromatografía líquido-sólido.
 Un líquido inmiscible con la fase móvil depositado en la
superficie de un sólido: cromatografía líquido-líquido.
Actualmente se emplean partículas muy pequeñas para la
fase estacionaria y una presión de entrada de la fase móvil
relativamente alta denominándose: cromatografía líquida
de alta eficacia o de alta presión (HPLC).
 CROMATOGRAFÍA DE GASES. La fase móvil es un gas inerte.
Si la fase estacionaria es:
 Un sólido: cromatografía gas-sólido.
 Un líquido retenido por un sólido inerte: cromatografía gas-
líquido o más comúnmente conocida como cromatografía
de gases (CG).

6
 ..Clasificación de las técnicas cromatográficas

• Según los mecanismos físicos o químicos responsables de la

separación de los componentes:
• CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN. La fase estacionaria sólida y la
puede ser fase móvil líquida o gaseosa. Las sustancias a separar se
adsorben en mayor o menor grado en la superficie de las partículas
de la fase estacionaria.
• CROMATOGRAFÍA DE REPARTO. La fase estacionaria es un líquido
retenido en un soporte sólido y la fase móvil es un líquido o un gas.
La separación se produce en función de la diferente solubilidad de
los componentes entre ambas fases (coeficiente de reparto).
• CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO. La fase
estacionaria es un sólido que presenta aniones o cationes unidos
covalentemente a ella. La fase móvil es un líquido en donde los iones
que porta son atraídos por fuerzas electrostáticas hacía la fase
estacionaria. Para separación de sustancias iónicas ( de intercambio
catiónico retiene cationes FE carga(-) ej carboxilos, fosforilos.., y de
intercambio aniónico FE carga (+) retiene aniones, ej DEAE celulosa

7
 ..Clasificación de las técnicas cromatográficas

• Según los mecanismos físicos o químicos responsables de la

separación de los componentes:

 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD.
 Se utilizan interacciones altamente específicas ( enzima
–sustrato, antígeno anticuerpo) entre unas moléculas que
han sido fijadas covalentemente a la fase estacionaria sólida
y las moléculas de la muestra, que van en la fase móvil.

 Posteriormente, la molécula retenida y separada del resto, es

desalojada por algún procedimiento que debilite esa
interacción (cambio de pH, fuerza iónico, etc.).

8
 ..Clasificación de las técnicas cromatográficas
• Según los mecanismos físicos o químicos responsables de la
separación de los componentes:
 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR o filtración
en gel.
 En ella no existe interacción entre la fase estacionaria y los
componentes de la muestra.
La fase estacionaria actúa como un simple tamiz. Son polímeros
lineales entrecruzados (es decir, que forman
enlacestransversales).dextranos, agarosa (Sepharosa y Biogel A) y
poliacrilamida
La fase móvil, líquida o gaseosa, arrastra los componentes de la
muestra a través de este tamiz.
El tamaño de los poros u oquedades de la partículas sólidas del
tamiz determina que moléculas pueden penetrar en su interior.
Las moléculas mayores son excluidas y eluidas rápidamente,
mientras que las pequeñas penetran y realizan un mayor recorrido
por el interior de la fase estacionaria.
La separación se produce en función del tamaño/forma.
9
 Animaciones cromatografía en columna
Cromat columna: http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/anim/separ_anim.htm
Cromat exlusión
-http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/cromat/crom-exclusion.html
-http://biomodel.uah.es/tecnicas/peli-
externa.htm?pag=http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/e
s/GELifeSciences-es/products/gel-filtration-
gf/&peli=http://www.youtube.com/embed/oV5VB5kO3tQ?rel=0
cromat intercambio iónico:http://biomodel.uah.es/tecnicas/peli-
externa.htm?pag=http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/e
s/GELifeSciences-es/products/ion-exchange-chromatography-
iex/&peli=http://www.youtube.com/embed/q3fMqgT1do8?rel=0
Cromat afinidad:-
- http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/cromat/crom-afinidad.html
-http://biomodel.uah.es/tecnicas/peli-
externa.htm?pag=http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/e
s/GELifeSciences-ES/products/affinity-chromatography-
ac/&peli=http://www.youtube.com/embed/FUAQKjKT99Y?rel=0

Columna: http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/anim/separ_anim.htm

10
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

• Según la disposición de la fase estacionaria:

 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.
 La fase estacionaria está contenida en un tubo a través del
cual se desplaza la fase móvil por gravedad o presión.

 CROMATOGRAFÍA PLANA.
 La fase estacionaria se encuentra en un soporte plano
(superficie plana) y la fase móvil líquida, se desplaza por
capilaridad y gravedad.
 EN PAPEL: que actúa como fase estacionaria o como soporte
para un líquido que hace de fase estacionaria.
 EN CAPA FINA: la fase estacionaria es un sólido finamente
dividido fijado a un soporte plano de vidrio o plástico o un
líquido embebido en el soporte sólido.

11
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

Según la
forma de • Cromatografía plana: papel / capa fina
llevar a cabo • Cromatografía en columna
la separación:
Según la F.M. gas • Cromatografía de gases
naturaleza
de la fase
móvil: F.M. líquida • Cromatografía de líquidos
Según el
• Cromat. de adsorción
fundamento
de la Según la • “ de cambio iónico
separación: naturaleza F.E. sólida
de la fase • “ de exclusión
estacionaria: • “ de afinidad

F.E. líquida • Cromatografía de reparto

12
 3. Cromatografía plana

Muestra: tres Fase

componentes estacionaria
mezclados
Se dispone una mezcla
sobre una fase estacionaria

Se hace fluir una fase

móvil sobre la estacionaria

Fase
móvil
Dependiendo de la afinidad
relativa por ambas fases, los
componentes de la mezcla
primitiva se separan
x3
x2
x1
xd

13
 Cromatografía plana

• Se usa generalmente para análisis cualitativo.

• Se lleva a cabo en un recipiente cerrado (cámara o tanque
cromatográfico) para evitar la evaporación del disolvente (fase móvil)
que satura la afmósfera.

14
 Cromatografía plana

• Cuando los componentes de la muestra no son visibles se hace

necesario el empleo de un reactivo que “revele” su posición. En el
caso de las proteínas y aminoácidos se usa la ninhidrina.
• Cromatografía en papel
 Fase estacionaria: papel de filtro; la celulosa retiene una cierta
cantidad de agua y puede dar lugar a un mecanismo de reparto
de los componentes de una muestra aplicados sobre ella cuando
se hace fluir un disolvente de polaridad distinta de la del agua.
• Cromatografía en capa fina (CCF o TLC)
• Fase estacionaria: sólido hidrofílico finamente dividido, soportado en
forma de capa delgada sobre una placa de cristal, lámina metálica o
de plástico: sílice, alúmina o acetato de celulosa
• Eluyentes: ( FM) éteres, ciclohexano, acetato de etilo etanol, acético,
agua ( de menos polares a más polares

15
 4. Cromatografía en columna

Fuerza impulsora de la fase móvil:

• Gravedad
• Presión

16
 Clasificación de los métodos cromatográficos en
columna

17
 5. Parámetros básicos de cromatografía

• Consideraremos una separación

cromatografía en columna por elución:
La muestra avanza constantemente
por la columna por constante adición
de fase móvil (FM).

• Los componentes de la muestra son

arrastrados hacía la salida de la
columna, empujados por la FM, a
diferentes velocidades, en función de
su afinidad por ambas fases, en una
serie continua de transiciones entre
las fases.

• Como consecuencia de las diferentes movilidades, los componentes se

separan en bandas que pueden ser detectadas por algún sistema a la
salida de la columna: dando lugar a un CROMATOGRAMA.

18
 Cromatograma

• Cromatograma: representación gráfica de la señal (proporcional a la

concentración de soluto) que genera un detector situado en el
extremo de la columna, frente al tiempo o volumen de elución.

• Información cualitativa:
 Posición del pico:
Tiempo de retención

• Información cuantitativa:
 Área bajo los picos

19
 Caracterización del pico cromatográfico: Retención y
factor de capacidad
• Si una sustancia no interacciona con la fase estacionaria, se
desplazará a la misma velocidad que la FM y emergerá de la columna
cuando el volumen total de FM utilizado sea igual al volumen no
ocupado por la FE en el interior de la columna: VOLUMEN MUERTO;
volumen de fase móvil requerido para eluír un componente no retenido
• El volumen de FM que se requiera para eluír un componente que sí
interaccione con la FE será mayor al muerto: VOLUMEN DE
RETENCIÓN Si el caudal de FM es cte. se puede expresar el volumen
en tiempo:
• TIEMPO MUERTO (tM): tiempo que tR tarda en salir un componente
que no se retiene.
TIEMPO DE tM t'R
RETENCIÓN (tR): Pico
Tiempo que tarda en cromatográfico
Señal

salir un componente
w1/2: Ancho de pico
determinado.
Pico del componente a la semialtura
Los tiempos se toman
no retenido w: Ancho de pico
en los max. de los
picos.
.VM=tM. Flujo Aplicación (t=0) Tiempo
20
 Retención y factor de capacidad

• La RETENCIÓN es la capacidad real de la fase estacionaria para

retardar la salida de un componente.

• Tiempo de retención corregido, tiempo de retención menos tiempo

muerto: t’R= tR – tM

• FACTOR DE CAPACIDAD O FACTOR DE RETENCIÓN:

k= t’R/ tM  k= ( tR-tM)/tM
• Es una medida de la fortaleza con que la FE retiene a un
componente.
• Factores de retención grandes favorecen una buena separación,
pero incrementan el tiempo de elución y la anchura del pico.
• Los valores de factores de capacidad para una separación óptima
deben estar entre 2 y 5.
En CG el factor de retención depende de la temperatura y del
empaquetado de la columna (FE).
En CL depende de la composición de la FM y la FE.

21
 Dispersión de bandas y eficacia

• A lo largo de una columna, a medida que transcurre el tiempo y los

componentes van avanzando, aumenta la separación entre los picos,
pero también el ensanchamiento de los mismos debido a la difusión
de las moléculas:
• Como la difusión se debe a movimientos al azar las bandas adoptan
una forma gausiana.
• Cuanto más agudos sean los picos mayor será la EFICACIA del
sistema cromatográfico (mejor separación).

22
 Dispersión de bandas y eficacia

• La eficacia de una columna depende de sus características intrínsecas

y de las condiciones de trabajo:
 Tamaño de partícula de fase estacionaria.
 Homogeneidad de la fase estacionaria.
 Velocidad del flujo de la fase móvil.
 Temperatura de trabajo.
 Presión, etc.

23
 Factor de selectividad o de separación

• La selectividad es la capacidad de la
columna de separar dos sustancias
• Se mide con el factor de selectividad o
de separación , relación entre los
factores de capacidad de las sustancias
que se separan, retención relativa
calculada para dos picos adyacentes
σ=K’B/K’A
Siendo A el componente con el tiempo
de retención más corto K>1,
convención

Factor de selectividad: da idea de

la bondad de la separación de los
picos, diferencia entre los tiempos de
retención de dos picos a separar

24
 Resolución

• Expresa el grado de separación que

se puede obtener en un sistema
cromatográfico para dos
componentes dados.
• Se puede observar directamente
sobre el cromatograma: los picos
están resueltos si no se solapan y
están perfectamente delimitados.
• Se calcula:
𝑡𝑅𝐵−𝑡𝑅𝐴 2∆𝑡𝑅
Rs= =
(𝑤𝐵+𝑤𝐴)/2 𝑤𝐵 +𝑤𝐴

A partir de resoluciones de 1,5 los

picos están bien resueltos.

25
 Optimización de las separaciones
cromatográficas

• Hay tres parámetros que determinan la resolución de una

separación y que hay que maximizar:
 La eficacia de la columna (estrechez de los picos):
 Reducir el tamaño de las partículas de la fase móvil (obliga a
aumentar la presión de la fase móvil).
 Ajustar la velocidad de la fase móvil.
 El factor de capacidad (tiempos de retención):
 Cambiar composición de fase móvil.
 Cambiar la superficie de interacción de la fase estacionaria.
 Cambiar temperatura de elución.
 La selectividad (diferencia entre los tiempos de retención
de dos picos a separar):
 Cambiar composición de fase móvil.
 Cambiar la superficie de interacción de la fase estacionaria.
 Cambiar temperatura de elución.

26
 Características analíticas y aplicaciones

• Son técnicas rápidas, sencillas y relativamente de bajo coste, con

gran aplicabilidad como herramienta de SEPARACICÓN.
• Se emplea también para la identificación CUALITATIVA y para la
determinación CUANTITATIVA.
ANÁLISIS CUALITATIVO
• La cromatografía en si misma es una técnica ciega. Como mucho,
puede informar del número de compuestos químicos, de un
determinado tipo, presentes en la muestra: Número de picos.
• Según los picos van eluyendo, estos son detectados por un método
inespecífico como: UV, conductividad eléctrica o ionización de llama.
• Solo si conectamos la salida a un instrumento de identificación como
IR, espectrometría de masas o RMN, podemos identificar
específicamente los compuestos separados.
• El único parámetro cualitativo es el tiempo de retención, por lo que la
identidad solo puede ponerse de evidencia usando patrones y
comprobando sus tR, utilizando exactamente las mismas condiciones
cromatográficas.
27
 Características analíticas y aplicaciones

ANÁLISIS CUALITATIVO
• Por lo tanto, puede usarse solo para reconocer:
LA PRESENCIA de componentes en mezclas que contengan un
número limitado de posibles especies de las que se conozca su
identidad.
LA AUSENCIA de ciertos componentes  si no aparece un pico
con el mismo tiempo de retención que un patrón.

ANÁLISIS CUANTITATIVO
• Está basado en la medida del área del pico cromatográfico del analito,
en comparación con el área de uno o más patrones inyectados bajo
las mismas condiciones cromatográficas.

28
 Métodos de análisis cuantitativo

• CALIBRACIÓN DIRECTA, ABSOLUTA O DE PATRÓN EXTERNO

 La muestra y los patrones deben ser inyectados de la misma
forma y en el mismo volumen.
 A veces, solo se usa un solo patrón y se relaciona la señal (S) que
produce, linealmente, con su concentración (C):
S=K.C
Se calcula K y se utiliza para la muestra con la señal obtenida.
 El principal inconveniente es la irreproducibilidad en la inyección
al trabajar con pequeños volúmenes.
• CALIBRACIÓN RELATIVA O MÉTODO DEL PATRÓN INTERNO
(PI)
 Supera los problemas de irreproducibilidad y permite que varíen
las condiciones de operación sin comprometerse la cuantificación.
 El PI debe:
 Resolverse completamente de los picos adyacentes.
 No estar presente en la muestra que se va a analizar.
29  No producir ningún efecto interferente.
 Métodos de análisis cuantitativo

• MÉTODO DE LA NORMALIZACIÓN DE LAS AREAS

 Permite conocer el porcentaje de cada componente en la mezcla
muestra.
 Se puede aplicar siempre que:
1. Todos los componentes producen algún pico.
2. Todos los componentes se separan.
3. Todos los picos están completamente resueltos.
 Se suma el área de todos los picos y se estable el porcentaje que
representa cada uno de ellos.
𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝐴
 %𝐴 = Á𝑟𝑒𝑎 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙X100

 El método solo es válido si el factor de respuesta de todos los

componentes es el mismo, es decir, iguales cantidades de
distintos componentes dan la misma área. Si esto no es así, la
áreas deberán ser corregidas por un factor de respuesta para
cada componente.
30
 Cálculo del factor de respuesta

• El cálculo del factor de respuesta para cada componente se realiza

experimentalmente:
1. Se pesa una cantidad exactamente conocida (WA) del patrón del
componente que se va a estudiar.
2. Se somete este patrón a la cromatografía y se determina su área
en el cromatograma AA.
3. Se calcula el factor de respuesta de ese componente:

(FR)A =WA/AA

31
 Número de platos teóricos

El número de platos teóricos es un modelo para

explicar la eficacia de una columna cromatográfica;
supone que la columna contiene gran número de
capas o secciones separadas, los platos teóricos
(concepto imaginario). Los equilibrios para la
separación de la muestra entre la fase estacionaria y
la móvil tienen lugar en esos platos.
El número de platos teóricos depende de las
propiedades de la columna( altura, FM, FE..) y de la
sustancia a separar

Se utiliza este concepto para evaluar la eficacia de

las columnas, pero solo sirve para comparar si se
hace determinando un mismo compuesto

32
 Eficacia de la columna: altura equivalente de
plato teórico
La eficacia de una columna se caracteriza
cuantitativamente mediante dos parámetros:
número de platos teóricos (N) y altura del plato (H)
A menor altura del plato H(  y mayor número de
platos teóricos) mayor eficacia
L es la longitud de la columna
2
L t 
N   N  16   R 
H W 

• La eficacia de una columna puede variar entre: N

= cientos - miles; H = décimas - milésimas de
cm.

33
 ejemplo cálculo cuantitativo por calibrado

Para analizar dos hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA), de

un suelo, se pesan 2,520 g de suelo seco y se extraen los HPA con
25 mL de un disolvente adecuado. Se filtra, se toma 1 mL del
extracto y se diluye a 10 mL en un matraz aforado. De esta dilución
se toman 5μL y se inyectan en un equipo de HPLC obteniéndose
una señal de 0,218. Cuando se analizan en las mismas
condiciones 5 μL de patrón 20,00 mg/L de fluorantreno la señal
medida es de 0,259. Indicar la concentración de HPA en el suelo,
en mg de fluoranteno/g suelo
S=K.C; 0,259=K*20,00mg/L; K=0,259/20,00mg/L= 0,013L/mg
Aplicando esa K para la señal de la muestra
0,218=0,013C, C=0,218/0,013= 16,76mg/L

16,76mg/L.1L/1000mL.10mL/1mL.25mL/2,520g=1,66mg
fluoranteno/g suelo

34