PCR

Fundamentos y aplicaciones

Virología Médica
Víctor Hugo Jiménez Mendoza
 REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)

1985 - Mullis & Falloona

Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
 Síntesis de ácidos nucleicos:
generalidades

 La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en

dirección 5’ 3’

 Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de

una cadena nueva utilizando una hebra molde
 Las DNA polimerasas además de la hebra molde,
necesitan un iniciador (primer o cebador de
extensión)
 La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa
RNA-dependiente.
 Basta un primer

Cadena líder
(Leading Strand)

Primer (riboNTPs)

Fragmento de Okasaki

Cadena rezagada
(Lagging Strand)

LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´→ 3´.

Eventos en la Replicación del DNA:
•Apertura de las cadenas (orígen de replicación)
•Colocación de los iniciadores (primers de RNA)
( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las
cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
•Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
•Eliminación de los iniciadores de RNA.
•Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA
ligasa)
•
 ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN
LA SINTESIS DEL DNA POR PCR

• Hebra Templado
•Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de
nucleótidos complementaria a la hebra templado.
La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesis
de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
• dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
• DNA Polimerasa
PCR
Temperatura
100
Melting
94 oC

50

0
Tiempo

3’ 5’
DNA de 5’ 3’
cadena doble
PCR
Temperatura
100
Melting
94 oC

50

0
Tiempo
3’ 5’

DNA de
cadena simple Cal
or

5’ 3’
PCR
Temperatura
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

Hibridación
de primers

5’
5’ 3’
PCR
Temperatura
100
Melting Melting
30 ciclos
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’

Cal
5’
or

5’

Calo
5’
r
5’ 3’
PCR

Temperatura
100
Melting Melting
30ciclos
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 3’
PCR

Temperatura
100
Melting Melting
30ciclos
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’
5’ 3’
Cal
5’
or

5’

Cal
or
5’
 PCR
Temperatura
100
Melting Melting
30ciclos
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’

5’
5’

5’
5’
PCR

Temperatura
100
Melting Melting
30ciclos
94 oC Extension 94 oC
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’ 5’ 5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’

5’
5’
El numero de copias del DNA delimitado por los
primers se duplica en cada ciclo de PCR.

Numero de copias
1 2 4 8 16 32 64

0 1 2 3 4 5 6
# ciclos
 VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS

 ALTA SENSIBILIDAD
 ALTA ESPECIFICIDAD
 RAPIDEZ

DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado específico o productos amplificados previamente)
 Detección de cantidades mínimas (diagnóstico
tempranoen pacientes asintomáticos)
 Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga
viral)
 Evaluación de terapia - pronostico de recaída
 Detección de cepas resistentes a antibióticos
 Detección temprana de Citomegalovirus y otros
patógenos en pacientes con trasplante de
órganos (por inmunosupresión y mayor riesgo a
infecciones latentes)

MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER
SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR

•Sangre - Bacterias
•Mucosa - Hongos
•Tejido - Parásitos
•Orina - Virus
•Heces - Mutaciones en Genes
•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de
genes
Bibliografía
 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis
KB, et al.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with
a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–491


 Griffiths, J.F. A. et al. (2002). Genética. McGraw-Hill Interamericana.



 Coleman, WB y Tsongalis, GJ (2006). Molecular Diagnostics: For the

Clinical Laboratorian. Humana Press


 Butler, JM (2005). Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and

Genetics of STR. Academic Press pgs 63-84



Gracias