Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen

2017/2018

REACTION DE PRECIPITATION
REACTION D’AGGLUTINATION
Work is the best antidote for sorrow, my dear Watson.

-Sherlock Holmes-

Plan du cours :
I-Introduction

II-Rappels sur la réaction antigène-anticorps et ses applications

III-Réactions de précipitation : a. En milieu liquide.

b. En milieu gélifié.

IV. Réactions d’agglutination : a. Directe (active)

b. Indirecte (passive)

c. Inhibition d’agglutination

V. Conclusion.

I. Introduction :
Les méthodes immunochimiques sont toute méthode qui se base sur la mise en
évidence du complexe Ag-Ac (antigène-anticorps) lors de sa formation.

Ces techniques sont utilisées pour détecter soit des antigènes, soit des anticorps
quantitativement et/ou qualitativement.

II. Rappel sur la réaction Ag-Ac :

Grace à sa très grande spécificité, la réaction Ag-Ac in vitro sert comme base pour
plusieurs techniques immunologiques pour des buts de diagnostic, de détecter et
d’identifier et l’antigène et l’anticorps.

Caractéristiques :

1. Cette réaction est très rapide (de l’ordre de quelques secondes), réversible
(liaison non covalentes) et de faible énergie. Elle peut être représentée par
l’équation suivante :

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: k1
Ac + Ag Ag-Ac
k2
Avec : k1 = Constante d’association (dans le sens de la formation de la liaison)

k2 = Constante inverse (dans le sens de dissociation de la liaison)

La relation (k1/k2) représente la constante d’association K qui est une mesure de

l’affinité.

K (en Maj) peut être calculée aussi en mesurant la concentration du complexe Ag-Ac
et celles des Ag et Ac séparés (sous-forme non complexée). La relation devient
alors :

𝑘1 [𝐴𝑔−𝐴𝑐]
K= =
𝑘2 ൣ𝐴𝑔൧[𝐴𝑐]

2. Quatre types de forces sont mises en jeu dans la liaison Ag-Ac classées en
ordre décroissant de force :
• Force ionique (électrostatique)
• Liaisons hydrogènes
• Liaisons hydrophobes
• Forces de Van de Waals

La mesure de la somme des forces d’attraction et de répulsion permet aussi de

mesurer l’affinité d’un Ac pour son Ag.

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3. La complémentarité structurale entre l’Ac et l’Ag donne à notre interaction

une spécificité très élevée mais pas absolue (pas à 100%) (réaction
croisée).

4. Antigène uni/multivalent et uni/multi-déterminé :

Pour bien assimiler et comprendre cette notion, on va dire que la détermination

est représentée par le type d’épitope présent à la surface de l’Ag (un seul type
d’épitope = uni déterminé, plusieurs types = multi-déterminé) et que la valence
représente le nombre d’exemplaire de chaque type d’épitope à la surface de l’Ag.

Sur ce :

a. Antigène uni-déterminé et univalent : Possède un seul

type d’épitope à la surface (uni-déterminé) en un seul
exemplaire (univalent). Exemple les haptènes.

b. Antigène uni-déterminé et multivalent : Possède un seul

type d’épitope (uni-déterminé) avec au moins 2 exemplaires
(multivalent).

c. Antigène multi-déterminé et univalent : Possède plusieurs

types d’épitopes (multi-déterminé) avec un seul exemplaire
de chaque épitope (univalent).

d. Antigène multi-déterminé multivalent : Possède plusieurs

types d’épitopes (multi-déterminé) avec plusieurs (sup à 1)
exemplaires de chaque type (multivalent).

5. Si l’antigène est moléculaire et soluble, les complexes Ag-Ac forment un

précipité.
Si l’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex ?
...), les complexes immuns Ag-Ac forment donc un agglutinat.

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Anticorps mono/polyclonaux ?! Mono/poly spécifiques ?

Les Ac monoclonaux : sont des Ac tous identiques et produits par un seul
clone cellulaire car dirigés contre un seul épitope.

Les Ac polyclonale : Une préparation est dite polyclonale si elle contient un

mélange d’Ac capable de lier plusieurs types d’épitopes.

Différentes méthodes immunologiques

III. Techniques de précipitation :

Principe de l’immunoprécipitation et notion de courbe de précipitation (courbe de
Heidelberger et Kendall 1929) :

La réaction de précipitation comme déjà dit se déroule lorsqu’on mélange un

antigène moléculaire avec des anticorps. Elle comprend 3 étapes :

1- Liaison de l’Ac avec le déterminent de l’Ag.

2- Formation d’un réseau par réarrangement de cette liaison.
3- Agrégation (assemblement) des réseaux et formation de précipité visible à
l’œil nu.

Plus d’explications : Un peu d’imagination et ça vaut le coup :D.

Dans une solution qui contient des Ac et des Ag multivalents (plusieurs

épitopes, donc Ag capables de se lier à plusieurs Ac), un Ac1 par ses deux
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fragments Fab lie deux antigènes multivalents (chacun dans un fragment Fab).
L’Ag lié à un des fragments Fab de l’Ac1 se trouve lié à un Ac2 (vue qu’il est
multivalent = plusieurs exemplaires d’épitope à la surface). Cet Ac2 qui lie déjà un
Ag dans un de ses fragments Fab va lier un autre Ag multivalent dans son autre
fragment Fab. Ensuite vue que ce dernier Ag est multivalent (il lui reste encore
des épitopes libres) il va se lier à un 3ème Ac etc. … Et ainsi de suite jusqu’à la
formation d’une sorte de cercle ou de ce qu’on a appelé on haut : Un réseau. Ce
grand complexe Ags-Acs en atteignant une certaine taille va perdre sa solubilité
(vu que tous ses groupements solubles sont en interaction entre eux) et va donc
précipiter au fond de notre solution.

Interprétation de la courbe de Heidelberger et Kendall (courbe de précipitation) :

Cette courbe décrit les variations de la quantité de complexe Ag-Ac précipités en
fonction de quantité d’Ag ajoutée. En cas d’excès d’Ac par rapport aux Ag (Ag/Ac
= faible) (zone 1) ou le contraire (zone 3), il y’a formation de complexes immuns

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solubles dont la quantité est proportionnelle à la concentration d’Ag. En rajoutant

de plus en plus d’Ag (par rapport à la zone 1) on remarque la formation de
complexes immuns non soluble qui précipitent (comme décrit en haut) et peuvent
être visualisés soit à l’œil nu soit avec des techniques qu’on verra plus tard
comme la turbidimétrie et la néphélémétrie. On dit alors que la zone (ou région)
d’équivalence est atteinte (zone 2). Dans cette zone, la relation Ag/Ac possède
la valeur optimale pour la formation d’un maximum de précipitants.

Techniques de précipitation :

Précipitation en
milieu liquide

Test de
l'anneau (ring Néphélémétrie Turbidimétrie
test)

-Immunodiffusion
double:Ouchterlony
Précipitation en milieu gélifié

-Electrosynerese

-Électro-immunodiffusion
de Laurell

-Immunodiffusion
radial:Mancini

-Immunofixation

-Immunoélectrophorèse

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1. Précipitation en milieu liquide :

a. Test d’anneau (Ring test) :

Une solution d’antigène est disposée en couche au-dessus d’un antisérum dans un
tube à essaies sans mélanger, et on laisse reposer. Les Ag dissouts dans le sérum
vont diffuser un peu partout dans le milieu. Si les concentrations d’antigènes sont
judicieusement choisies et après quelques secondes, on remarquera l’apparition d’un
anneau blanc correspondant à la formation de complexes en réseau (càd quand il y’a
autant d’épitopes que de paratopes), c’est la zone d’équivalence (même principe que
celui de la courbe de précipitation).

Cet anneau se met entre les deux fractions de la solution, on observera alors de haut
en bas : Antigènes, anneau de précipitation ensuite les anticorps.

C’est une technique qualitative qui permet de déceler la présence d’Ac en utilisant
une concentration optimale d’Ag qui permet la précipitation.

Application du ring test : vérification (suivie) après chaque allo-immunisation chez

l’animal pour vérifier que tout marche bien.

Brève explication : après allo-immunisation (vaccination), normalement il y’a

production d’Ac contre l’Ag injecté à l’animal. On utilise cette technique pour vérifier
s’il y’a production d’Ac spécifiques produit contre cet Ag en cherchant les complexes
en réseaux (les anneaux blanc). Si ceux-ci apparaissent, la vaccination se déroule
dans le bon sens, si non quelque chose cloche et je ne sais vraiment pas ce que
c’est :’).

b. Néphélémétrie et turbidimétrie : Il s’agit de méthodes classiques qui

reposent sur les phénomènes de diffusion et d’absorption de la lumière
dans un milieu trouble du fait de la précipitation Ag-Ac.

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Un rayon LASER (Light Amplification by Stimulated Emission of

Radiations) et utilisé comme source de la lumière incidente : c’est un
émetteur de lumière monochromatique (une seule couleur) dans le visible
ou l’infrarouge, cohérente, possédant une intensité élevée, et susceptible
d’être concentrée en un réseau très fin.
b.1 Turbidimétrie : Un rayon laser émet une lumière incidente (L1) vers un
tube contenant d’éventuelles précipités Ac-Ag. L’intensité de la lumière
transmise (L2) (qui réussit à traverser le tube et qui a la même direction
que celle de L1) est mesurée à l’aide d’un photodétecteur et est alors plus
faible que celle de l’incidente du fait du phénomène d’absorption.
Cette technique évalue donc la diminution de l’intensité de la lumière lors
de sa traversé du milieu contenant les précipités Ag-Ac.

Avantages de la turbidimétrie : Réalisée sur un simple spectrophomètre.

Inconvenant : Nécessite une concentration relativement élevée de réactif

Applications : dosage α1microglobuline, CRP, Albumine, transferrine, haptoglobine,
β2 microglobuline, les apoprotéine, LDL-cholestérol, PPS, PPR, PPU.

b.2.Néphélométrie : C’est une technique qui permet également la mesure

de la formation de complexes immuns Ag-Ac. Le monochromateur
(LASER) émet des rayons lumineux vers la cuve de mesure (qui contient
l’antisérum), les complexes immuns dispersent ces rayons (diffraction),
ces derniers (les rayons) sont focalisés par un système optique vers un
photodétecteur qui nous permettra de dessiner une courbe de calibrage
(qui ne nous intéresse pas). Enfin et selon cette courbe, nous pourrons
déterminer la concentration de ce qu’on veut doser :D

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Finis pour les précipitations en milieu liquides, maintenant :

2. Précipitations en milieu gélifié : La réaction de précipitation ne se déroule
pas que dans les milieux liquide mais dans les semi-solides (gélifiés) aussi.
Lorsque des antigènes solubles et des Ac sont mis dans une boite avec des
puits contenants un milieu gélifié (comme le gel d’agarose), vont diffuser selon
un gradient de concentration. Cette diffusion est soit simple, soit pulsée
(aidée) par un champ électrique. Quelque part entre deux puits, il y’aura une
réaction Ag-Ac avec une proportion optimale des deux réactifs (Ag et Ac)
qui permettra la formation d’un précipité sous forme d’arc, c’est la zone
d’équivalence.

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Caractéristiques des gels d’agarose :

• Issues de l’agar ?
• Inertes chimiquement.
• Visqueux à 50°C ce qui permettra d’inclure
les Ag et Ac sans qu’ils soient dénaturés et
leur permettra aussi de diffuser.
• Solides à 37°C.
• Transparents, permettant l’observation des
précipités.

a. Test d’Ouchterlony (immunodiffusion double

radiale) : Même principe citer en haut. On met les réactifs dans le gel
d’agarose et on les laisse diffuser, dans les zones de réaction ou les
proportions des réactifs sont optimales, on note la formation d’arc de
précipitation. En cas de similarité de deux antigènes, les arcs de précipitation
fusionnent. Si notre solution est complexe (plusieurs variétés d’Ag et d’Ac),
on observe la formation de plusieurs arcs de précipitations. Ceux-ci vont se
croisés en cas d’Ags différents. Ils vont former ce qu’on appelle un «
éperon » en cas de similarité partielle.

Buts :
• Analyse qualitative des solutions d’Ag et Ac (déceler la présence d’un Ag ou
Ac précis)
• Détection des Ag et études des relations entre eux (la notion d’arc fusionnés,
croisés ou sous forme d’éperon).
Exemple d’application : recherche de la protéine de Bence Jones.

b. Test de Mancini (immunodiffusion radiale simple) : Le but de ce test est de

rechercher une substance moléculaire soluble précise (antigène précis). Pour
cela, on recouvre des plaques avec un gel incorporé d’Ac spécifique de l’Ag
recherché de façon homogène (à des concentrations égales). Dans des puits
creusés dans notre plaque, on dépose notre échantillon d’analyse à (qui

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contient l’Ag recherché) à différentes concentrations. L’antigène diffuse de

façon radiale (sous forme de rayon de roue) dans notre gel. Ainsi et après un
petit moment, les arcs précipitations sont remplacés par des anneaux de
précipitation (zone d’équivalence -_- ) autour des puits. Le diamètre des
anneaux de précipitation est directement proportionnel à la concentration de
l’antigène. Autrement dit, plus la surface de notre anneau est grande, plus la
concentration de l’antigène est abondante.

L’utilisation d’étalons de concentrations connues permet d’établir une courbe

d’étalonnage, voici une petite explication avec un exemple : dans le schéma
qui suit, on connait la concentration de l’Ag dans tous les puits sauf le G et le
F. On peut déterminer la concentration de l’Ag dans ces deux derniers en

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comparant leurs diamètres avec ceux des autres puits (dont on connait la
[Ag]).
Inconvénients : devoir attendre au moins 18 heures pour que le précipité se
forme, de plus la précision de la méthode est faible.
Sensibilité : 50mg/l.

c. Electro-immuno-quantification de Laurell ou électrophorèse en fusée

(Rocket) : Cette méthode est un mélange entre l’électrophorèse des protéines
et l’immunoprécipitation. Dans un gel contenant des anticorps, on y dépose
des antigènes dans la cathode et les font migrer vers l’anode (+). Après
quelques heures on observe la formation de précipitations étalées et
incurvées sous forme de fusées « rockets » qui peuvent être colorées.

L’étalonnage est possible sur cette technique, Si une préparation d'antigène

de référence est analysée simultanément, cette technique permet de
déterminer la concentration de l'antigène grâce à une courbe d’étalonnage.

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Application : dosage des protéines : (ex. faire le profil protéique sérique)

Le résultat est accessible en quelques heures.

d. Contre-immunoélectrophorèse ou Electrosynérèse ou migration

électrophorétique en sens opposé : C’est une technique qualitative en gel
d’agarose vierge à fort effet d’électroendosmose (EEE) ?!
Déroulement : Dans un milieu à pH donné (exemple pH 8.2 pour les Ag
nucléaires solubles), l’Ag et l’Ac possèdent des charges différentes (Ag est –
alors que l’Ac +). On les met dans le gel dans les pôles qui possèdent les
mêmes charges qu’eux pour faire en sorte qu’ils migrent vers le milieu de la
plaque, càd qu’on met l’Ag dans l’anode (-) et l’anticorps dans la cathode (+).
Les réactifs vont donc s’éloigner de leurs points de dépôts, ainsi si le sérum
analysé contient des Ac dirigés contre l’Ag évalué, des complexes immuns
vont se formés dans le point de rencontre des deux réactifs. Ces complexes
sont perçus sous forme d’arcs de précipitation colorés (zone d’équivalence).

Application : Cette technique a été proposée au début pour détecter les Ac

(marqueurs) ou les Ag (Ah HBs) de l’hépatite B. Elle est aussi utilisée pour
mettre en évidence les auto-Ac spécifiques de différents antigènes nucléaire
(traitée en haut).

Dans cette image, on a utilisé un sérum témoin (dont on est sure qu’il contient
des auto-Ac anti-antigène nucléaires soluble et on a remarqué la formation
d’arc de précipitation après sa rencontre avec l’Ag.

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Même principe pour les autres sérums. De ce fait, les sérums contenants les
auto-Ac-anti-antigènes nucléaires sont : le témoin, S1 et S5.
Les restants ne les contiennent pas.
e. Immunoélectrophorèse : A la différence de l’électrophorèse des protéines
sérique qui permet d’identifier ceux si selon leur position dans le gel (gamma
globuline, albumine...), l’immunoélectrophorèse permet d’identifier les
protéines « antigène » en les séparant par électrophorèse selon leur mobilité
dans le gel ensuite en ajoutant des Ac spécifiques à ces protéines.
Cette technique est donc un mélange entre l’électrophorèse et
l’immunoprécipitation.
Elle se déroule en deux temps à
cause de la complexité de la solution
antigénique (comportent plusieurs
types d’Ag) :
1) Dans un premier temps : Dans
un gel vierge, les molécules
antigéniques sont séparées
dans un champ électrique
grâce à leur différence de
mobilité dans ce champ.
2) Dans un deuxième temps et
après que la séparation est
jugée suffisante, un antisérum
est placé dans une rigole
parallèle au sens de migration
des Ag.
Les Ag et Ac diffusent librement
dans le gel et donnent des arc (lignes) de précipitation selon le même
principe de l’immunodiffusion d’Ochterlony.
Cette technique est hautement discriminative et a permis la mise en
évidence de plus de 30 molécules antigéniques différentes dans le sérum
humain en utilisant comme Ac un sérum animal antisérum humain.
Application : Etude semi quantitative des concentrations ?
Identification d’un composant monoclonal en cas
de gammapathie monoclonale (synthèse accrue
d’Ig par un seul clone cellulaire) : Si
l’électrophorèse des protéines sériques révèle un
pic monoclonal de gammaglobulines (correspond
sur le tracé électrophorétique à une bande mince,
étroite et très homogène), on ajoute alors notre
rigole qui contient des Ac anti-Ig suspecté, et on
attend la précipitation. Ceci nous permet de
préciser la classe et la sous classe des Ig qui
réalisent notre pic électrophorétique.

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f. Immunofixation : Technique qualitative qui ressemble à

l’immunoélectrophorèse sauf qu’elle est plus sensible et plus rapide.
Appliquée également pour mettre en évidence la nature et de préciser le
typage d’un Ig monoclonale (myélome …) décelés à l’électrophorèse des
protéines sériques/urinaires.
Principe :
1) Séparation électrophorétique.
2) Immunoprécipitation par des immun-sérums monospécifiques
suivie d’une coloration.

g. Immuno- sélection :
Principe :
Elle permet la détection de chaînes lourdes libres présentes en faible quantité
dans des liquides biologiques.
Faut rappeler qu’un Ac est composé de 2chaines lourdes et 2 chaines légères.
Pour les chaines lourdes, elles sont comme suit :

Pour les chaines légères, il existe deux types : Lambda et kappa (identiques
pour une seul Ac.
Dans la technique d’immunoselection visant à diagnostiquer la maladie des
chaines lourdes, on incorpore un gel d’un antisérum anti chaines légères
lambda et kappa. On rajoute le sérum du patient dont on a suspecté la
présence de la maladie.

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Ce sérum contient des Ac normaux et des chaines lourdes libres (s’il est
malade). Après un moment, les Ac anti-Kappa et Lambda vont se lier aux
chaines légères des Ac normaux du patient, ce qui causera la précipitation (en
forme d’obus « rockets ») de tous les Ac normaux en entier (tous l’Ac se
précipite). De ce fait il ne restera plus que les chaines lourdes libres qui
diffuseront dans le gel librement. Ensuite, on lave notre préparation pour
enlever les complexes précipités. On rajoute des Ac anti-chaînes lourdes et on
observe. Si la réaction de précipitation est positive (entre Ac anti-chaînes
lourdes libres), le patient est donc malade, sinon il est sein.
Application : Recherche de la maladie des chaines lourdes alpha le plus
souvent, rarement gamma ou mu.

Un petit récapitulatif pour finir les techniques de précipitation :

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IV. Réaction d’agglutination :

L’agglutination est la formation de réseaux (complexes immuns = agglutinat)
entre des Ac et des antigènes particulaires ou cellulaires (insolubles) : bactéries,
hématies, billes de latex …
C’est une réaction identique dans son principe à celle de la précipitation, la seule
différence c’est qu’elle est visible directement à l’œil nu à cause de la grande
taille des Ag.
Selon le type d’Ag, on distingue : Hémagglutination, agglutination aux billes de
latex, agglutination de bactéries …
Les paramètres de l’agglutination : le degré d’association entre l’antigène et les
Ac est influencé par une variété de facteurs et qui peut être (le degré) altéré en
changeant ces facteurs, on citera :
• La charge des particules : Les des particules inertes comme les GR,
les bactéries, les billes de latex ont une charge négative sur leurs
surfaces dû à la présence de molécules membranaires qui leurs
confèrent cette charge. Quand ces particules chargées sont
suspendues dans une solution saline (Na+ + Cl-), deux phénomènes
se produisent : le premier étant la répulsion entre eux (vu qu’elles
ont la même charge). Le deuxième est la formation de ce qu’on
appelle le potentiel zêta. Voici comment ça se passe : D’abord faut
savoir que les Ag ont une charge positive (preuve ? la gamma
globuline migre vers le pôle négatif lors de d’électrophorèse).

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Les ions Na+ et Cl- ont un effet de blindage, ils vont s’accumuler
sous forme de nuage autour des particules et des Ac (blindage) par
attraction (selon les charges) tendant à les neutraliser (Na+ +++
autour des particules, Cl- +++ autour des Ag) ce qui va d’abord
diminuer la répulsion entre les particules et influencer (gêner)
l’accès aux Ac pour se lier à leurs Ag. Le zêta potentiel est donc la
différence entre la charge situé la surface des particules et celle du
nuage ionique externe. In vitro, et pour de meilleurs résultats, ce
potentiel est augmenté (càd que les charges externes du nuage
sont diminuées) en utilisant une solution à basse force ionique.
Lorsque le potentiel Zêta augmente à l'ajout de solution de basse
force ionique (càd que les forces du nuage sont diminuées), les
globules rouges (par exemple) s'éloignent, permettant d'augmenter
l'accessibilité des antigènes aux anticorps, augmentant ainsi la
rapidité de fixation des anticorps.

• Le type d’Ac : Les anticorps de classe IgM sont les plus efficaces
pour l’agglutination, ceci à cause de leur grande taille (5 domaines
CH dans les chaines légères) et aussi à cause de leur capacité à
s’organiser en
pentamère (forme
circulante = 5 unités
de bases d’Ac
jointes par une
chaine J). Cette
propriété de
polymérisation
(pentamère) rend les
IgM susceptibles de
jouer le rôle d’un
pont entre les
particules fixés
(particule—Ac—particule) contrairement aux IgG et voici pourquoi :
La distance entre les fragments Fab (qui fixent l’Ag) des IgG est trop

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petite pour permettre à l’Ac de lier deux particules et surmonter les

forces électrostatique entre eux pour former ainsi un pont même si il
est dans sa forme la plus distendue (notion de flexibilité des chaines
lourdes assurée par la région charnière de l’Ac).

Par contre, les fragments Fab des IgM pentamériques sont

suffisamment loin pour permettre de lier les particules sans être
influencé par les forces électrostatiques entre les particules.

Remarque :

Les antigènes agglutinants (IgM en majorité) sont capables de produire une

agglutination des particules en suspension dans un milieu salin de [Na Cl] = 0,15 M.

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• Les antigènes : L’agglutination est influencée par l’emplacement et

le nombre de déterminants antigénique. Ainsi, moins il y’a
d’antigènes et/ou plus les déterminants antigéniques sont
profondément enterrés dans la membrane cellulaire, plus
l’agglutination devient difficile, et vice versa ….
Il y’a d’autres facteurs influençant la réaction d’agglutination comme les
concentrations d’Ag et d’Ac qui permettent l’agglutination quand elles sont à une
proportion optimale (zone d’équivalence déjà traitées), le pH, la température …. Et
qui ne seront pas abordés dans ce cours.
L’agglutination est utilisée comme un test qualitatif de la présence d’anticorps dans
le sérum sanguin et pour déterminer le groupe sanguin.

Agglutination active/directe et passive/indirecte :

Quand l’antigène est un constituant naturel de la particule, la réaction
d’agglutination est dite agglutination directe ou active. D’autre part, quand la
réaction d’agglutination se déroule entre un Ag soluble attaché à une particule
insoluble, la réaction d’agglutination est dite passive ou indirecte.
Notion d’Ac complets et incomplets : Les Ac complets sont des Ac naturel capable de
se lier aux déterminants antigéniques des particules et de les agglutiner en absence
de toute substance supplémentaire, exemple : la forme circulante pentamérique des
IgM. Par ailleurs, les Ac incomplets sont des Ac qui se lient aux antigènes des
particules sans former de ponts entre ces derniers, donc sans les agglutiner,
exemple : Les IgG.

1) Agglutination active/directe : Comme déjà dit, l’Ag est un constituant naturel

de la particule, exemple : les bactéries et les hématies. Elle est utilisée
respectivement pour faire une sérologie bactérienne (ASLO) et pour
déterminer le groupage sanguin.
Agglutination de bactéries :
Pour détecter un Ac (réaction de Widal) : On ajoute des suspensions de
bactéries (antigènes) dans le sérum d’un patient. Si les réactifs sont en
proportion optimale, l’agglutination témoigne de la présence dans le sérum du
patient d’un Ac spécifique de la bactérie ajoutée.
Pour détecter un Ag (réaction de Gruber) : On ajoute à une culture
bactérienne des Ac spécifique dont on connait la classe et le type de bactéries
contre lesquelles ces Ac sont dirigés. L’agglutination témoigne de la présence
de la bactérie recherchée. Cette méthode est donc utile pour typer les
bactéries.

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Hémagglutination : est une méthode utilisée pour détecter la présence d’Ac

agglutinants (IgM) en utilisant des hématies comme particules contenants les
Ag. Dans un échantillon de sérum contenant des Ac anonymes, on ajoute une
suspension de globules rouges (dont on connait le groupage). Si les deux
réactifs sont présents en proportion optimale, il y’aura formation de ponts
cellulaires donc agglutination, et ainsi on pourra savoir le type d’Ac présent
dans le sérum.
Certain Ac comme les IgG se lient au Ag des érythrocytes mais sont trop petit
pour pouvoir former des agglutinats (on a déjà expliqué le pourquoi). Pour
pouvoir les identifier par la méthode de l’hémagglutination, on procède par ce
qu’on appelle le test de Coombs dont le principe est d’utiliser une substance
supplémentaire pour pouvoir les agglutiner (notion d’Ac incomplets).
Test de Coombs : Aussi appelé Anti-Human-Globulin test (AHG test). Il va
employer des Ac contre les IgG humaines d’où son nom AHG. Il est basé sur
deux grands principes : (1) Les Ac d’une espèce (ex : humaine) sont
immunogènes lorsqu’ils sont introduits dans l’organisme d’une autre espèce
(ex : les lapins) et conduisent à la production d’Ac contre les Ac introduits.
(2) Les Ac d’une espèce (ex : humaine) et qui jouent le rôle d’Ag dans
l’espèce différente (ex : lapin) ont un déterminant antigénique situé dans leur
fragment Fc ou vont se lier les Ac (du lapin) produits contre eux (des
humains). Cette liaison ne concerne pas les fragment Fabs, ils resteront donc
libres.
Ainsi, si des Ac IgG humaines sont attachés à leurs épitopes sur les
érythrocytes et qu’on ajoute des d’Ac de lapin anti-IgG humaine, ces derniers
(Ac de lapin) vont se lier aux déterminants antigéniques des IgG humains
(fragments Fc) et joueront ainsi le rôle de pont cellulaire entre les érythrocytes
fixés par les IgG humains ce causera la précipitation. Ce pont est fait ainsi :
Erythrocyte—IgG—Ac de lapin (AHG)—IgG—Erythrocyte.
Voici un schéma qui décrit bien tous ce qui a été dit jusqu’ici sur le test de
Coombs :

Il y’a deux versions de test de Coombs, le directe (qu’on verra maintenant) et

l’indirect (qu’on verra plus tard). Mais les deux sont basés sur les mêmes deux
principes déjà cités en haut.

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Test de Coombs direct : Ce test n’est pas vraiment direct mais il est
considéré ainsi, il constitue donc un cas particulier et voici pourquoi :
Dans ce test, les Ac anti-immunoglobulines sont mélangés à des érythrocytes
(GR) qui sont suspectés d’avoir des Ac liés à leur surface (Ac liés aux Ag des
GR). Plus d’explications dans cet exemple : un nouveau-né Rh+ est suspecté
d’avoir la maladie hémolytique du nouveau-né causée par des Ac IgG anti-Rh
maternels qui sont liés aux GR du bébé (Les IgG sont capables de traverser la
barrière placentaire). Si cette susception s’avère juste, les Ac anti-IgG
maternels (AHG) vont se fixer au fragments Fc des Ac IgG maternels, former
un pont cellulaire et causer l’agglutination.
Revenant à la notion de ‘test direct’, il est appelé ainsi car il détecte
directement les Ac anti-Rh (igG maternels). Autrement dit, comme si les IgG
de la maman fixés aux GR du bébé jouent directement le rôle d’Ag de ces
GR et dont les Ac correspondant sont les AHG ajoutés pour faire le test.
Autrement autrement (2 fois) dit :p, les GR du bébé sont prélevés avec les IgG
maternels à leur surface (contrairement au test indirect), il ne reste donc plus
qu’à ajouter les AHG pour obtenir l’agglutination.

2) Agglutination passive/Indirecte : Comme déjà précisé, l’Ag (qui doit être

solubles) dans ce type d’agglutination est n’est pas un composant naturel de
la particule inerte (qui est insoluble) mais fixé expérimentalement.
Exemple : sur les
hématies
(érythrocytes = GR),
les billes de latex …

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Exemples d’application :
a. Test de Coombs indirect
b. Test du latex (agglutination au latex)
c. Test de Waaler-Rose.

a. Test de Coombs indirect : Ce test est utilisé pour détecter la présence d’Ac
non pas sur les surfaces des particules mais dans le sérum du patient.
Ainsi, un sérum contenant des Ac à qui on ajoute des particules (qui dit
particules dit Ag) peut ne pas causer d’agglutination (Ac igG). Mais si on
ajoute ultérieurement des Ac anti-IgG, il y’aura formation de ponts, donc
agglutination. Ce test est communément utilisé dans la détection d’Ac anti IgG
dirigés contre le Rh dans le sang d’une femme qui est Rh-.
Petite information : une maman Rh- peut devenir sensible à l’Ag Rh lors
de sa première grossesse d’un enfant qui est Rh+. Ceci se produit par le
passage de quelques globules rouges du bébé (qui est Rh+) dans la
circulation de sa maman lors de la période prénatale et particulièrement
lors de l’accouchement, ce qui déclenchera une réaction immunitaire
chez la maman conduisant à l’apparition d’Ac IgG anti-Rh dans son
sang. Ainsi, si la maman est suffisamment immunisée contre l’Ag Rh,
son prochain bébé sera dans le risque de tomber malade de la maladie
hémolytique du nouveau-né comme on a vu dans le test direct de
Coombs.
Revenant à notre test de Coombs indirect. Contrairement au test direct ou les
GR sont prélevés avec les IgG à leurs surfaces, celui-ci (l’indirect) consiste
d’abord à la réaction entre les IgG présent dans l’échantillon de sérum de la
maman avec les GR ajoutés (d’ailleurs c’est pour ça qu’il est appelé indirecte).
Puis on ajoute nos Ac anti-IgG (AHG) comme dans le test direct.

Comme conclusion pour les deux tests de Coombs on va dire que le test
direct mesure les Ac déjà liés sur les surfaces des GR alors que l’indirect
mesure ceux libres dans le sérum du patient. Voici une très belle illustration
qui les résume parfaitement concernant la maladie hémolytique néo-natale :

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b. Test du latex (agglutination au latex) : C’est un test qualitatif dont le but est
de détecter la présence de certains Ac. L’antigène reconu par ces Ac qu’on
recherche est fixé à des particules de latex (billes de latex).

Cette méthode est utilisée par exemple dans la recherche du facteur

rhumatoïde (FR). Dans ce cas l’antigène fixé aux billes de latex est l’IgG et
l’Ac qu’on recherche est l’IgM anti-igG et qui représente le facteur rhumatoïde
(FR). Autrement dit, le FR va jouer le rôle d’Ac contre les IgG fixés aux billes
de latex et qui joueront le rôle d’Ag. Le FR va s’attacher aux IgG particulaires,
former des ponts et s’agglutine.

c. Test de Waaler-Rose (la titration) : C’est pratiquement le meme principe que

celui de l’agglutination au latex, sauf que la titration utilise des GR de groupe
O et Rh- comme particules et non pas des billes de polystérène.

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Elle est utilisée également pour recherché le facteur rhumatoide dans le

sérum des patients.
La question que vous vous posez peut etre en tete est : si le groupage et O et
le Rh est négatif, ou vont se fixer les IgG anti-GR humains (AHG) ? La
réponse est simple : Les antigènes des GR ne sont pas représentés
uniquement par les système Rhesus et ABO, il en ont pleins d’autres dans
leurs surface.

Application des méthodes d’agglutination :

1- diagnostic des anémies hémolytiques auto-immunes (coombs direct et
indirect)
2- maladies hemolitiques du nouveau né
3- Détection des facteurs rhumatoïdes : réaction de latex et Waaler-Rose.
4- Détection des autoanticorps antithyroïdiens : thyroperoxydase,
thyroglobuline.
5- Diagnostic de la syphilis treponema pallidum hemagglutination (TPHA) et
veneral disease research laboratory (VDRL).

3) Innhibition de l’agglutination : Cette méthode se base sur un principe assez

simple qui est le suivant : l’addition d’un Ag soluble à des Ac (dirigés contre
cet Ag) avant d’introduire les billles de latex recouvertes de cet Ag (Ag
insoluble) vas inhiber le phénomène d’agglutination car les Ac vont se
combiner en premier lieu aux Ag soluble. Et si l’Ag soluble est présent en
excès, les Ac vont tous se lier à lui et il n’y aura donc pas d’agglutination.
Ce principe a été utilisé pour savoir si une femme est enceinte ou non ou ce
qu’on appelle le tes de grossesse.
Le principe de ce test est la detection dans les urines de l’Hormone
gonadotrophine chorionique (HGC) qui une hormone glycoprotéique

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sécrétée par le trophoblaste de l’embryon en cours de développement et qui

augmente rapidement dans les urines dans les premiers stades de grossesse.
Faut préciser que cette hormone se compose de deux sous unités α et β. La
sous unité α est identique à celle retrouvée LH, FSH et TSH. Alors que la β
possède une region C-terminale unique à elle. Sur ceux, on va utiliser dans
notre test de grossesse des Ac dirigés contre la sous unité β et non pas α
pour éviter qu’ils (Ac) se lient aux autres hormones et fausser ainsi le résultat
du test.
Le test se déroule comme suit : On ajoute à un échantillon d’urines de la
patiente des Ac anti-β HGC suivi par l’ajout de particules de latex recouvertes
par l’hormone HGC. Si l’HGC est présente dans l’urine de notre patiente, elle
va (l’HGC) neutraliser les Ac, il n’y aura donc pas d’agglutination des
particules de latex (revoir le principe de l’inhibition d’agglutination), le test est
positif et la maman est alors en ceinte :D. Si cette hormone est abscente, les
Ac vont lier les particules de latex, et on observera une agglutination de ces
derniers. Le test est alors négatif est la maman n’est pas enceinte :’( !
Remarque : on peut utiliser pour ce test soit des billes de latex soit des
hématies.
Les réactifs (Ac-anti HGC et les billes de latex recouvertes d’HGC) doivent
être en proportion optimale pour l’agglutination.

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V. Conclusion :
Il existe de nombreuses techniques permettant de détecter les antigènes
ou les anticorps.
Le choix de la technique est fonction de différents paramètres :
- la concentration de l’antigène ou de l’anticorps.
- la forme de l’antigène (soluble ou particulaire).
- La sensibilité et la spécificité de chaque technique.

Bibliographie :
➢ Cour Officiel De la Faculté De Médecine D’Alger 2017/2018.
➢ Immunology & Serology in Laboratory Medicine, 5th Edition
By : MARRY LOUISE TURGEON.
➢ JANEWAY’S IMMUNOBIOLOGY, 9TH EDITION By : KENNETH
MURPHY & CASEY WEAVER.
➢ Atlas de poche d’immunologie par : Gerd-Riidiger Bunnester
et Antonio Pezzutto.
➢ Immunology A SHORT COURSE, 7TH EDITION By : Richard
Coico and Geoffrey Sunshiine.
➢ Quelques sites internet.

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