Tap Tous La Chromatographie

Université d’El-Oued
Département de biologie cellulaire et

moléculaire
Cours de techniques d’analyses biologiques

Support pédagogique pour les étudiants de 3ème année biochimie
et toxicologie, licence LMD
Elaboré par l’enseignant Abdelhak MEDJOUR

Université D’El-Oued Année 2016/2017
Cours de T.A.B. 3ème Année Biochimie et toxicologie, licence LMD
Chapitre 3 : Méthodes physicochimiques

3.1. Méthodes chromatographiques
3.1.1. Définition et principe
3.1.1.1. Définition
La chromatographie, méthode d’analyse immédiate, sépare les constituants d’un
mélange par entraînement au moyen d’une phase mobile, liquide ou gaz, le long d’une phase
stationnaire (solide ou liquide fixé).
La première chromatographie a été réalisée par le botaniste russe TSWETT, en 1905.
Pour reproduire une expérience inspirée de celle qu’il avait effectuée, on utilise le montage dans
la figure ci-dessous qui permet de séparer les pigments d’une feuille d’épinard.
Expérience inspirée de celle de TSWETT.

Le dépôt est obtenu en écrasant, sur l’emplacement prévu à cet effet, un disque de 0,5
cm de diamètre découpé dans la feuille, à l’aide d’un agitateur en verre. Le chromatogramme
est mis en place dans la cuve préalablement saturée pendant 30 minutes, le solvant monte le
long de la feuille de papier par capillarité. Le solvant est la phase mobile, la feuille de papier
constitue la phase fixe ou stationnaire. Les différents pigments migrent à des vitesses différentes
et lorsque le front du solvant atteint la partie supérieure du chromatogramme, on note la position
des spots (figure ci-dessous).
Chromatogramme des pigments

d’une feuille d’épinard.
1 | P a g e
Enseignant M. MEDJOUR A.
3.1.1.2. Principe
Le principe de la chromatographie est basé sur la migration différentielle des divers
solutés contenus dans l’échantillon analysé et obtenue par la partition des solutés entre les
phases fixe et mobile. Chaque molécule du mélange à séparer est soumise à une force de
rétention, affinité du soluté pour la phase fixe, et à une force de mobilité, entraînement du soluté
par la phase mobile (entraînement qui dépend essentiellement de la solubilité de la molécule
dans la phase mobile). La résultante de ces deux forces étant variable selon la molécule, chacune
d’elle migrera à une vitesse qui lui est propre.
La chromatographie est également une méthode d’analyse quantitative permettant le
dosage des constituants d’un mélange analysé.
3.2. Différents types de chromatographie et leurs applications en biologie
3.2.1. Chromatographie de partage
3.2.1.1. Principe
Cette chromatographie liquide-liquide est appelée chromatographie de partage, parce
que fondée sur la partition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non
miscibles, l’un constituant la phase stationnaire, l’autre la phase mobile.
3.2.1.1.1. Le coefficient de partage
Lorsqu’un soluté A est distribué entre deux liquides non miscibles (S et S’), il s’établit
un équilibre :
⇔ ′
On appelle coefficient de partage le rapport des
concentrations de soluté dans les deux phases à l’équilibre,
′
à une température donnée :
La transposition de cette partition entre deux phases

liquides dans un système chromatographique est rendue possible
par la fixation de l’un des solvants sur un support inerte, l’autre
constituant la phase mobile.
Un soluté très soluble dans la phase fixée migrera lentement, la force de rétention
prédominant la force d’entraînement. A l’inverse un soluté soluble dans la phase mobile migrera
rapidement. distance parcourue par le soluté

On appelle rapport frontal Rf. (ou référence front) le rapport : distance parcourue par le solvant
Un soluté très soluble dans la phase fixe aura un Rf faible ; très soluble dans la phase
mobile son Rf sera élevé et proche de 1.
2 | P a g e
3.2.1.2. Technologie de la chromatographie de partage

3.2.1.2.1. Appareillage
La chromatographie de partage liquide-liquide peut être réalisée :
 Sur colonne : la colonne est remplie d’un support imprégné d’un solvant fixe.
L’ensemble constitue la phase stationnaire. Le solvant fixe doit être adsorbé sur le support, en
une couche suffisamment épaisse pour exercer son rôle de solvant à l’égard des solutés entraînés
par le solvant mobile de développement. Il est naturellement impossible d’obtenir des supports
totalement inertes, donc il est pratiquement impossible de déterminer, dans ce type de
chromatographie, ce qui relève du partage ou de l’adsorption :
 Sur papier : la feuille de papier, sur laquelle le dépôt a été fait, est introduite dans la
cuve contenant la phase fixe, le plus souvent aqueuse. La cellulose du papier, très hydrophile
se sature en eau, qui constitue la phase fixe ; cette opération nécessite plusieurs heures. Ensuite,
la phase mobile est introduite dans l’augette située à la partie supérieure de la cuve. La phase
mobile migre par capillarité, la séparation des solutés s’effectue par partage entre les deux
solvants.
Remarque :
Dans cette technique de chromatographie descendante, l’intervention du papier comme
phase stationnaire ne peut être négligée. En revanche, la chromatographie ascendante ou radiale
sur papier et la chromatographie sur couche mince sont des chromatographies d’adsorption.
Mais il est certain que dans les mécanismes de séparation, le partage intervient pour une part
plus ou moins importante, compte tenu de l’eau adsorbée par la phase stationnaire solide et
polaire.
3.2.1.2.2. Solvants
Un partage est caractérisé par ses deux solvants de développement, l’un fixe, l’autre
mobile. Les deux solvants sont caractérisés par leur différence de polarité et leur non-
miscibilité. Généralement, le solvant fixe est polaire ; c’est d’ailleurs très souvent l’eau. Le
solvant mobile, non polaire, est constitué fréquemment d’un mélange de solvants plus ou moins
apolaires, selon les nécessités de la séparation.
En chromatographie descendante sur papier, on utilise généralement un solvant
diphasique où phases polaire et non polaire non miscibles sont préparées dans une ampoule, ce
qui permet à la phase mobile d’être saturée en phase stationnaire et réciproquement.
Pour la séparation de substances très hydrophobes, donc très solubles dans la phase
organique, il est préférable de procéder à une chromatographie en phases inversées ; la phase
mobile est polaire, la phase fixe apolaire.
3 | P a g e
Cuve de chromatographie descendante.
3.2.1.2.3. Support
Le support est le solide poreux imprégné de liquide, son intervention en tant
qu’adsorbant est inévitable et peut quelquefois être prépondérante sur l’effet de partage.
Le papier est choisi en fonction de critères expérimentaux (épaisseur, texture). Les
supports pour colonne sont très variables : cellulose, gel de silice. etc.
3.2.1.3. Analyse des fractions
L’analyse des fractions est presque toujours qualitative, la chromatographie de partage
est essentiellement une méthode d’analyse immédiate. Elle est quelquefois quantitative.
3.2.1.3.1. Analyse qualitative
Les dépôts ne sont pas quantitatifs. L’identification des composés du mélange peut se
faire selon plusieurs procédés :
 Par utilisation de témoins : ce sont des composés supposés du mélange dont on dépose
des solutions pures sur le même chromatogramme. On compare la migration des témoins à celle
des spots de l’échantillon analysé ;
 En caractérisant la migration d’un soluté du mélange par son Rf : à une température
donnée, pour un système chromatographique défini (support, solvants de développement), le Rf
est caractéristique d’un soluté :
distance parcourue par le composé

distance parcourue par le solvant mobile
4 | P a g e
Si la chromatographie dure trop longtemps, au point de ne plus pouvoir mesurer la

distance parcourue par le front du solvant, on détermine le Rf (par rapport à un témoin) :
distance parcourue par le composé

distance parcourue par le témoin
Remarque :
Dans le cas où l’on chromatographie des substances incolores, il est nécessaire de
visualiser les spots : plusieurs procédés peuvent être utilisés :
 Par fluorescence ;
 Par une réaction chimique colorée appelée révélation
 Les unes générales, utilisées pour un groupe de composés, comme la réaction à
la ninhydrine pour les acides ammés et la réaction de Molisch pour les sucres ;
 Les autres spécifiques, employées pour une seule substance, comme la réaction
de Millon pour la tyrosine par exemple.
3.2.1.3.1. Analyse quantitative
La chromatographie de partage peut quelquefois donner lieu au dosage des solutés
séparés.
Dans ce cas, les dépôts sont quantitatifs. Les procédés consistent en :
 Une planimétrie des spots. Cette méthode, assez grossière, utilise la proportionnalité qui
existe entre le logarithme de la surface du spot et la concentration du soluté ;
 Une élu1ion : les spots sont découpés, élués dans un solvant convenable, dosés par
absorptiométrie moléculaire ;
 Une densitométrie, directe sur chromatoplaque. Ce procédé courant mesure la densité
optique du spot, grandeur proportionnelle à 1a concentration.
3.2. Chromatographie d’adsorption
3.2.1. Principe
La chromatographie d’adsorption est basée sur le partage des solutés entre l’adsorbant
fixe et la phase liquide, mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par
adsorption et une force d’entraînement par la phase mobile. L’équilibre qui en résulte aboutit à
une migration différentielle des solutés de l’échantillon à analyser, ce qui permet leur
séparation.
L'adsorption est la fixation des molécules dissoutes par la phase fixe solide. Cette
fixation est due à l’établissement de liaisons secondaires de surface entre l’adsorbant et la
molécule adsorbée : liaisons dipôle-ion, ou dipôle-dipôle ou liaisons de Van der Waals.
5 | P a g e
3.2.2. Eléments de la chromatographie d'adsorption

3.2.2.1. Adsorbants
Les adsorbants sont des solides très divisés (l’adsorption est un phénomène de surface)
; c’est ainsi que 1 g d’alumine pour chromatographie peut représenter une surface de l’ordre de
100 m2.
La qualité d’un adsorbant dépend de sa pureté, de sa surface, de son homogénéité, de sa
teneur en eau. Il est caractérisé par les critères expérimentaux suivants :
 La capacité d’adsorption. On distingue les adsorbants faibles (à faible capacité
d’adsorption) comme l’alumine, le talc ou le carbonate de sodium, les adsorbants forts (à
capacité d’adsorption élevée) comme le gel de silice ou l’alumine active ;
 La polarité. Certains adsorbants présentent une forte bipolarité électrique comme le gel de
silice ou l’alumine, tandis que d’autres, au contraire, ont une faible polarité comme le charbon
actif ;
 La granulométrie. Les adsorbants sont commercialisés sous forme de granules calibrés ; la
séparation est meilleure mais plus lente si les grains sont fins.
Dans la technique de chromatographie à haute performance, on peut utiliser comme
phase stationnaire des silices greffées polaires. La nature du greffon fixé sur les groupements
silanols permet de moduler le caractère polaire de la phase stationnaire.
Silices greffées polaires.
3.2.2.2. Solvants
Un soluté fixé par un adsorbant est entraîné par la phase mobile. Pour un système
chromatographique donné (caractérisé par une phase stationnaire, la température, la pression et
le soluté), le pouvoir éluant dépend de la polarité du solvant.
Prenons comme exemple une phase stationnaire constituée d’un adsorbant polaire (le
gel de silice), d’un soluté polaire adsorbé et d’un solvant polaire (le méthanol). Le solvant
polaire possède un pouvoir éluant élevé, fortement adsorbé, il déplace le soluté. En revanche
un solvant apolaire comme l’éther de pétrole possédera un mauvais pouvoir éluant, mais
entraînera un soluté apolaire.
6 | P a g e
On utilise soit un solvant pur, soit un mélange monophasique de solvants.

3.2.3. Techniques expérimentales
La chromatographie d’adsorption est appliquée selon différentes techniques :
 Sur colonne : ouverte à pression ambiante, en « flash chromatographie » à moyenne
pression, en HPLC ;
 Sur papier : en chromatographie ascendante ou radiale ; dans cette technique le papier
constitue la phase fixe ;
 Sur couche mince : le gel adsorbant est coulé sur une plaque (verre, aluminium ou
plastique), mêlé à un liant (plâtre).
3.2.3.1. Chromatographie d’adsorption sur colonne à pression ambiante
3.2.3.1.1. Colonne ouverte
Il existe dans le commerce des colonnes à robinet : à défaut il est simple de réaliser un
montage similaire avec une canne de verre de 1 cm de diamètre ou une pipette à usage unique
de 10 ml. Le remplissage de la colonne est effectué avec soin, et l’adsorbant est régulièrement
disposé de manière à réaliser un lit homogène, sans fissure ni bulle.
Colonne ouverte de chromatographie

d’adsorption
Trois techniques de remplissage sont utilisées :

 À sec : on introduit l’adsorbant en poudre dans la colonne, puis on l'imbibe de solvant, le
contenu de la colonne est tassé ; on peut terminer le tassage par une légère dépression ;
 Humide : on verse d’abord un certain volume de solvant dans la colonne, puis on y fait
pleuvoir l’adsorbant pulvérulent. Cette technique est excellente pour les grains très fins,
l’adsorbant sédimente lentement, réalisant un lit homogène. En revanche, les résultats sont
peu satisfaisants avec des grains de gros diamètre ou pour un adsorbant mal calibré ;
7 | P a g e
 Technique de la suspension : on réalise une bouillie de l’adsorbant dans le solvant, après

dégazage sous vide, on l’introduit dans la colonne. On homogénéise et tasse le lit par
agitation ou rotation de la colonne.
3.2.3.1.2. Introduction à l’échantillon
On amène le solvant à l’affleurement de l’adsorbant. Il convient de ne jamais laisser une
colonne à sec, ce qui provoquerait l’apparition de fissures et de bulles. L’échantillon à analyser
est déposé sous forme d’un disque étroit, en une seule fois, à la surface du solide adsorbant, en
évitant toute turbulence. Il est introduit au sein même de l’adsorbant, à l’aide de quelques cm3
de solvant que l’on fait percoler lentement.
3.2.3.1.3. Développement
Le développement (élution) est fait en percolant la phase mobile à débit constant. On
peut s’aider pour cela d’un réservoir contenant le solvant et adapté en haut de colonne. Si la
vitesse de percolation est insuffisante, on peut créer une dépression en bas de colonne ou une
surpression en haut. Cette dernière technique s’appelle la chromatographie éclair ou « flash
chromatographie ». Elle n’ajoute rien au pouvoir de résolution de la chromatographie,
contrairement à I’HPLC. En revanche elle permet de gagner un temps considérable.
3.2.3.1.4. Analyse des fractions
 Analyse par développement
Cette analyse consiste à faire cheminer les solutés ; les constituants se séparent, mais restent
dans la colonne.
Si les composés sont colorés, les zones visibles sous forme de disques s’échelonnent dans la
hauteur de la colonne. Si les composés incolores sont fluorescents, on peut observer les zones
de fixation par fluorescence, à l’aide d’une lampe à ultraviolets. Le cas échéant, on peut révéler,
par une réaction colorée, ces zones de fixation. La colonne sèche est sortie puis, à l’aide d’un
pinceau, on imbibe la colonne de révélation, le long d’une génératrice.
 Analyse par élution
Lorsque le développement est achevé, si l’on continue à verser le solvant, la progression des
zones se poursuit et l’on peut recueillir dans l’effluent les différentes fractions séparées de
l’échantillon. L’ensemble des fractions de l’éluat constitue un chromatogramme liquide.
La courbe d'élution (figure ci-dessous) est le graphe représentant la concentration du soluté
dans l’éluat, en fonction du volume d’élution.
Le diagramme d’élution présente 4 pics ; deux d’entre eux, les fractions C et D apparaissent
sous forme d’un pic avec épaulement, témoignant d’une séparation incomplète. Chaque fraction
8 | P a g e
est caractérisée par son volume de rétention (VA pour la fraction A. VB pour la fraction B, etc.)
et est utilisée pour l’identification d’un composé dans un système chromatographique donné.
Lorsque la courbe d’élution est enregistrée sur table traçante, l’abscisse est évaluée en temps,
calibrée par la vitesse de défilement du papier.
On parle alors de temps d’émergence ou de temps de rétention des solutés.
Les temps d’émergence et les volumes d’élution sont des grandeurs proportionnelles à débit
constants :
V= d x t
V = volume d’élution
d = débit
t = temps d’émergence
Courbe d'élution
3.2.3.2. Chromatographie d'adsorption sur couche mince (CCM)

3.2.3.2.1. Matériel
L’adsorbant (gel de silice, gel de cellulose, etc.) mélangé à un liant est uniformément
étalé sur une plaque de verre, d’aluminium ou un support plastique.
Cuve à chromatographie pour couche mince.
3.2.3.2.2. Technique
La cuve, remplie du solvant mobile, est saturée en vapeur avant la chromatographie. La
saturation de la cuve a pour but de limiter l’évaporation de la phase mobile depuis la
chromatoplaque.
9 | P a g e
Les dépôts sont effectués sous forme de petits cercles ou de courts segments, à l’aide
d’une pipette de dépôt capillaire. Le développement est assuré par migration du solvant par
capillarité.
Les solutés de l’échantillon se distribuent entre les deux phases. En fin de
développement les spots sont révélés.
Remarque :
L’adsorption n’est pas toujours le seul mécanisme mis en jeu lors d’une
chromatographie sur couche mince. En effet, si la phase mobile est un mélange de solvants, au
cours de la saturation de la cuve il s’établit un équilibre entre les phases liquide et gazeuse.
L’introduction d’une chromatoplaque dans ce mélange de vapeurs, peut provoquer la fixation
sélective de certains solvants au détriment d’autres. Dès lors, une certaine proportion de la
chromatographie s’effectue selon un mécanisme de partage.
3.3. Chromatographie en phase inversée
C’est une chromatographie liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire se
distingue par son apolarité. Elle est représentée, la plupart du temps, par des silices greffées
apolaire. Il existe des greffons apolaires de taille différente, de 2C à 18C, donc de polarités
différentes (figure ci-dessous)
Silice greffée orgonosilanée Silice greffée chaîne aliphatique 18C.

Silices greffées apolaires.
La phase mobile est polaire et hydrophile, elle contient généralement un modulateur de

polarité (méthanol, acétonitrile, n-propanol).
Les séparations sont fondées sur des interactions hydrophobes entre les molécules à
séparer et la phase stationnaire.
Dans la pratique, cette chromatographie ne s’applique qu’en HPLC, elle porte le nom
de RP-HPLC (Reversed-Phase HPLC).
La RP-HPLC s’applique bien à la séparation de petites molécules apolaires : lipides,
acides aminés, peptides. Elle peut s’appliquer également à la séparation des protéines, mais
provoque leur dénaturation.
Les composés ioniques tels que A- se séparent mal dans ce type de chromatographie,
d’où l’utilisation d’une technique appelée paire d’ions : on forme un ensemble neutre et apolaire
tel que (A- C+) qui est chromatographié.
10 | P a g e
3.4. Chromatographie par échange d’ions

3.4.1. Définition
Les échangeurs d’ions sont des macromolécules insolubles portant des groupements
ionisables ayant la propriété d’échanger de façon réversible certains de leurs ions, au contact
d’autres ions provenant d’une solution.
Schéma d’une résine échangeuse de Schéma d’une résine échangeuse d’anions

cations (résine cationique). (résine anionique).
On appelle résines cationiques celles qui échangent réversiblement des cations :
R-G-X+ + C+ R-G-C+ + X+
On appelle résines anioniques celles qui échangent réversiblement des anions:
R-G+Y- + A- R-G+A- + Y-
La chromatographie par échange d’ions se pratique le plus souvent sur colonne, mais méthode
peut être transposée sur couche mince. Du papier échangeur d’ions est également
commercialisé. Enfin l’échange d’ions peut être réalisé en « batch » : la résine est mise en
présence de la solution et agitée mécaniquement.
3.4.2. Propriétés des échangeurs d’ions
3.4.2.1. Support
Les propriétés du support vont conditionner les propriétés mécaniques et chimiques de
l’échangeur d’ions et par conséquent ses possibilités d’utilisation en HPLC de même que sa
résistance aux acides et bases.
D’autre part, sa porosité déterminera l’accessibilité des solutés de l’échantillon aux
groupements fonctionnels.
Le support peut être minéral, mais il est plus souvent organique, constitué soit d’une
résine de copolymérisation, soit de polyosides (dextrans ou celluloses).
A titre d’exemple, on peut décrire une matrice hydrocarbonée formée de copolymérisation de
styrène et de divinylbenzène (DVB) (figure ci-dessous).
11 | P a g e
Réseau d’un copolymère DVB-styrène.
 Le pontage : c’est le divinylbenzène qui crée la réticulation du polymère : le nombre de

ponts varie en changeant le rapport DVB/styrène appelé taux de pontage. Ce rapport varie
de 1 à 30 pourcent ;
 La dimension des pores : elle dépend du taux de pontage. Leur diamètre varie de 5 à 3,5
nm, il est d’autant plus petit que le taux de pontage est grand. Pour des petits ions, on choisit
un taux de pontage de 8 à 10 p. 100, et pour les ions importants un taux de 1 à 4 p. 100.
3.4.2.2. Groupements fonctionnels des résines
Les groupements fonctionnels chargés sont fixés par covalence sur le support.
 Groupements fonctionnels des résines cationiques : d’après leurs aptitudes à l’ionisation,
ces résines sont classées en :
 Résines cationiques fortes : sulfoniques (très fortement ionisées, quel que soit le pH):
 Résines cationiques faibles : carboxyliques (non ionisées en milieu fortement acide) :
 Résines cationiques très faibles : phénoliques (uniquement ionisées en milieu alcalin):
 Groupements fonctionnels des résines anio-niques

Ces résines sont également classées en :
12 | P a g e
 Résines anioniques fortes :

 Résines à groupements amines quaternaires : par exemple :
 Résines à groupements aminés tertiaires.

 Résines anioniques faibles :
 Résines à groupements aminés secondaires et primaires.
3.4.2.3. Granulométrie
C’est le classement des granules de résine selon leur grosseur. La granulométrie
caractérise la dimension des grains de résine. Ils ont un diamètre variant de 30 à 800 µm sont
calibrés par tamisage. La granulométrie est exprimée en mesh (unité d’origine anglo-saxonne).
Granulométrie Diamètre
inférieur à 20 mesh supérieur à 850 µm
de 20 à 50 mesh de 850 à 300 µm
de 50 à 100 mesh de 300 à 150 µm
de 100 à 200 mesh de 150 à 75 µm
de 200 à 400 mesh de 75 à 38 µm
supérieure à 400 mesh inférieur à 38 µm
Les échanges sont d’autant plus actifs que la résine est divisée ; mais, en contre-partie,
l’écoulement est plus rapide avec de gros grains. Le choix de la granulométrie est un compromis
entre ces deux phénomènes.
3.4.2.3. Capacité de rétention d’un échangeur d’ions
C’est le nombre de milliéquivalents d’ions que la résine peut échanger par unité de
masse (on l’exprime par gramme de résine sèche) ou par unité de volume (par cm3 de résine
humide).
13 | P a g e
Exemples :
Pour l’amberlite IR-4B, qui est une résine anionique, la capacité de rétention est de 2,5
meq/cm3 pour la résine humide et 10 meq/g pour la résine sèche.
Pour l’amberlite IRC-50, qui est une résine cationique, la capacité de rétention est de
3,5 meq/cm3 pour la résine humide et 10 meq/g pour la résine sèche.
3.4.3. Réaction d’échange d'ions
La réaction d’échange d’ions permettra la résolution d’un mélange, si la résine présente
une affinité différente pour les ions du mélange. La constante, qui caractérise l’affinité de la
résine pour un ion, peut être assimilée à la constante d’équilibre d’un système chimique. Soit
un système simple, dans lequel deux ions monovalents A et B sont échangés :
As + Br Ar + Bs
Les indices s et r signifient « en solution » et « sur la résine ». Pour ces ions

monovalents, on définit la constante de sélectivité comme suit : .
Soit :
Si > 1, cela indique une affinité préférentielle de la résine pour A.

Si < 1, cela indique une affinité préférentielle de la résine pour B.
L’affinité dépend :
 De la charge des groupements fonctionnels de la résine, charge qui dépend de leur nature
et éventuellement du pH ;
 De la densité de charge de l’ion, grandeur qui dépend de la charge et de la taille de lion.
Un ion est d’autant plus fixé qu’il est chargé et, à charge égale, qu’il est petit ;
 De la concentration des ions ;
 De l’accessibilité des groupements fonctionnels. La vitesse des échanges est contrôlée
par deux facteurs :
 La diffusion des ions, au travers du film liquide, entourant les granules de résine ;
 La diffusion des ions à l’intérieur de la résine, qui dépend de la porosité de cette
dernière, donc de son degré de réticulation.
3.4.4. Différentes étapes d’une chromatographie sur échangeur d’ions
3.4.4.1. Préparation et remplissage de la colonne
La résine, préalablement conditionnée sous la forme ionique requise pour la séparation,
est mise en suspension dans le tampon de développement.
14 | P a g e
La colonne est remplie sans fissures ni bulles. Le volume de résine utilisé s’appelle le
lit de résine « bed volume » = BV). Ce volume est déterminé en tenant compte de la capacité
de rétention de la résine, du volume et de la concentration de l’échantillon et de l’affinité de la
résine.
Colonnes de chromatographie.
3.4.4.2. Étape de fixation

Envisageons, à titre d’exemple, le cas d’un cation retenu par une résine sulfonique sous
forme acide (H+) :
Après avoir déposé le mélange à analyser, on règle la vitesse d’écoulement. Elle est
généralement exprimée en gouttes/min ou en ml/min. Il est préférable de l’exprimer en BV/min
car la vitesse d’écoulement est fonction du volume de résine. Une vitesse d’écoulement de 0,1
à 0,2 BV/min est généralement adoptée pour des résines de 20-50 mesh (850 à 300 µm), vitesse
qui est diminuée pour des résines de grains plus petits.
Exemple : Si le volume de résine est de 20 cm3 dans la colonne, et si l’on recueille 1 ml

d’éluat par minute, quelle est la vitesse en BV/min ? Elle est égale à 0,5 /
3.4.4.2. Élution
L’élution consiste à déplacer l’ion fixé par un autre, de densité de charge et de
concentration plus élevées :
Le cation C+ est élué, la résine sulfonique est sous forme sodique.
Pour éluer un ion, on doit prendre en considération :
 La nature de l’ion régénérant : on utilisera de petits ions fortement chargés Cl-. HO-, Na+,
H+… ;
15 | P a g e
 La quantité de réactif régénérant (concentration et volume) ; généralement on en utilise 2 à

5 fois plus que la capacité de rétention théorique ;
 La vitesse d’écoulement : l’élution se fait à la vitesse de 0,05 à 0,1 BV/min.
Il existe également une élution par gradient : gradient de pH ou de force ionique.
Les solutés de l’échantillon sont tous fixés sur la résine, mais ils présentent à son égard des
affinités différentes. Si l’élution est pratiquée avec variation (continue ou discontinue) de pH
(gradient de pH) ou de force ionique (gradient de force ionique), on obtiendra une élution
différentielle des différents solutés. Leur analyse dans l’effluent, par un détecteur de sortie de
colonne, permet l’enregistrement d’un graphe appelé le chromatogramme liquide, et qui rend
compte de la résolution de l’analyse.
Séparation de 3 acides aminés,

fixés sur une résine cationique,
élués par un gradient continu
croissant de pH.
3.4.5. Polyosides chargés : celluloses et dextranes (sephadex)

Ces échangeurs sont utilisés pour la séparation de macromolécules ionisées : protéines
et acides nucléiques.
3.4.5.1. Échangeurs d’ions
La matrice (cellulose ou dextrane) porte les groupements chargés. On dispose
d’échangeur d’anions et de cations.
Les échangeurs anioniques sont :
 Le DEAE-polyoside (diéthylaminoéthyle) échangeur anionique faible :
 Le QAE-polyoside (quaternaire aminoéthyle) échangeur anionique fort :
16 | P a g e
Les échangeurs cationiques sont :

 Le CM-polyoside (carboxyméthyle) : échangeur cationique faible :
 Le SP-polyoside (sulfopropyle) : échangeur cationique fort :
3.4.5.2. Technique d’utilisation

La réaction d’échanges d’ions est, d’un point de vue théorique, similaire à celle décrite
pour les échangeurs d’ions étudiés précédemment, mais les échangeurs polyosidiques
présentent une certaine porosité qui limite l’accès des groupements fonctionnels aux très
grosses molécules. Cet effet de tamis moléculaire, accroît le pouvoir résolutif d’une séparation.
3.4.5.2.1. Chromatographie sur colonne
La colonne est remplie, sans irrégularité, puis équilibrée (l’effluent doit avoir alors la
même composition que l’éluant). Lorsque le dépôt de l’échantillon est fait, on procède à une
élution soit en modifiant le pH, soit en modifiant la force ionique de l’éluant. On peut opérer
avec gradient continu ou un gradient discontenu.
3.4.5.2.2. Technique en « batch » (procédé en cuve)
L’échantillon à séparer est mis au contact de l’échangeur dans un récipient, sous
agitation. Cette technique est utilisée pour des purifications pratiquées à grande échelle.
3.4.6. Applications de la chromatographie par échanges d’ions
L’échange d’ions est utilisé au laboratoire, depuis la préparation de l’eau déminéralisée
jusqu’à l’analyse de traces ioniques dans un échantillon. Cette technique chromatographique
s’applique particulièrement à l'analyse et à la séparation de sels minéraux, d’acides aminés
(hydrolysats de peptides), de peptides (peptides hormonaux en particulier), de protéines, de
nucléotides, d’acides nucléiques, de lipides ionisés, de glucides ionisés. Les exemples sont
multiples.
17 | P a g e
3.5. Gel-filtration (ou chromatographie d’exclusion ou tamisage moléculaire)

3.5.1. Principe
Le gel-filtration est une technique chromatographique qui permet de séparer des
molécules, en fonction de leur taille et de leur forme.
On utilise des granules de gel poreux, le diamètre des pores étant une caractéristique de
chaque type de gel.
Un mélange de solutés de masses molaires variables traverse une épaisseur donnée de
gel : les grosses molécules, celles dont le diamètre est supérieur à celui des pores, sont exclues
et sont éluées les premières ; les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement,
car incluses, leur migration est freinée en diffusant dans le gel.
La séparation est donc réalisée par le fait que les solutés sont élués dans l’ordre inverse
des masses moléculaires. Il existe une relation linéaire entre le volume d’élution et le logarithme
de la masse moléculaire.
Variation du volume d’élution en fonction de la

Schéma du tamisage moléculaire. masse moléculaire du soluté au cours d’un
tamisage moléculaire. V 0 = volume mort de la
colonne.
3.5.2. Gels
On peut distinguer les gels hydratés et les gels permanents. Les premiers acquièrent leur
porosité après gonflement dans l’eau, les seconds possèdent d’emblée une structure réticulée.
3.5.2.1. Gels hydratés
Dans le commerce, on trouve des gels comme le Sephadex, faits à partir de polyosides
bactériens : les dextrans (poly D-glucopyranosyl α1-6). Les Sephadex présentent une grande
affinité pour l’eau, ils s’hydratent fortement (fixant jusqu’à 10 fois leur masse d’eau) et gonflent
jusqu’à former un réseau, dont le nombre et les dimensions des mailles sont déterminés par les
liaisons établies dans l’édifice moléculaire formé par le dextran hydraté figure ci-dessous.
18 | P a g e
La quantité d’eau retenue par un gel donné est appelée « gain d’eau », elle est exprimée
en grammes d’eau fixée par gramme de substance sèche.
Les gels polyosidiques sont insolubles dans l’eau et dans les solutions salines, stables
dans les solutions alcalines ou faiblement acides, mais hydrolysés par les acides forts. De plus,
ces gels doivent être protégés d’une hydrolyse enzymatique, consécutive à une contamination
bactérienne.
Structure réticulée d’un gel

polyosidique. Plus le taux
d’enchevêtrement est élevé,
plus les mailles sont serrées.
3.5.2.2. Gels permanents

Ces gels à porosité permanente sont organiques ou minéraux.
Les gels organiques sont des copolymères. La réticulation est créée à la
copolymérisation, ce qui détermine par conséquent la porosité. Ces gels sont stables
chimiquement et mécaniquement : ils sont ainsi utilisables en milieu aqueux et non aqueux et
supportent les hautes pressions.
Les gels minéraux sont des gels de silice à structure lacunaire, à pores larges ; ces gels
à matrice dure ne gonflent pas.
Pour ce type de gel, il est évident que les effets d’adsorption s’ajoutent à ceux du
tamisage moléculaire.
3.5.2.3. Caractéristiques d’un gel
Un gel est caractérisé par :
 Le gain d’eau ;
 Le diamètre des pores, exprimé en Å ou en nm ;
 Le diamètre des granules, exprimé en mm ou en mesh.
3.5.3. Etude théorique de la gel-filtration
On considère une colonne de volume total Vt, et remplie d’un gel solvaté. Le volume
total est donné par la relation Vt = V0 + Vi+ Vg, expression dans laquelle :
 V0 représente le volume vide correspondant au volume d’eau externe aux granules ;
 Vi représente le volume d’eau interne et correspond au volume d’eau contenu dans les
grains ;
 Vg représente : le volume du gel matrice.
19 | P a g e
Un soluté sera distribué entre l’eau interne et l’eau externe suivant un coefficient de distribution
KD.
 Si KD = 0 : le soluté est totalement exclu et ne pénètre donc pas dans les granules ;
 Si 0 < KD < 1 le soluté est partiellement inclus, le taux de pénétration augmente avec
KD ;
 KD = 1 est une valeur théorique, qui correspond à une inclusion totale du soluté dans le
gel ;
 KD> 1 correspond à un soluté inclus et adsorbé de surcroît par le gel.
Pour comprendre le tamisage moléculaire, on peut prendre l’exemple simple d’un mélange
M de deux solutés A et B, dont les constantes de distribution sont respectivement égales à 0 et
1.
Si l’on dépose le mélange M au sommet de la colonne, le soluté A sera élué pour un volume
d’élution égal à V, le volume vide. Le soluté B sera élué pour un volume d’élution égal à V0 +
Vi (volume vide + volume interne).
Diagramme d’élution du mélange

M (séparation complète).
L’analyse de cette courbe d’élution montre que la séparation des deux solutés A et B est
complète.
Le volume d’élution de A est égal à V0, celui de B à V0 + Vi. Les concentrations d’A et
B dans l’effluent sont dans le rapport des concentrations dans le mélange.
Les volumes élués E' et E" sont sensiblement plus élevés que le volume de l’échantillon
E. Ce phénomène de dilution varie avec les conditions expérimentales et la nature des solutés.
Mais il ressort de l’interprétation du diagramme d’élution que la séparation est d’autant
plus complète que le volume de l’échantillon est faible devant celui de la colonne. Si le volume
de l’échantillon E est supérieur à Vi, la séparation est incomplète.
Pour améliorer la résolution de cette séparation il convient de diminuer le volume de
l’échantillon ou d’augmenter celui de la colonne.
20 | P a g e
L’expression générale qui relie le volume d’élution d’un soluté à son coefficient de
distribution est : Ve = V0+KD.Vi
Diagramme d’élution du mélange

(séparation incomplète).
Si l’on veut séparer complètement les deux solutés A et B de coefficient de distribution

et , il faut que le volume de l’échantillon E soit inférieur à :
= V0+ . Vi
= V0+ . Vi
3.5.4. Technique du tamisage moléculaire
Ce type de chromatographie est pratiqué sur
colonne ou sur couche mince.
3.5.4.1. Chromatographie sur colonne
Schéma d’une colonne en tamisage

moléculaire. Le tube d’élution est de
petit diamètre pour éviter la dilution et
le mélange des solutés élués.
21 | P a g e
3.5.4.1.1. Aspect technologique sommaire

La colonne dont les dimensions sont déterminées avec soin est remplie du gel
préalablement conditionné. Le remplissage doit être régulier, une poche d’air en haut de
colonne (chambre de mélange) est à proscrire. Puis l’échantillon est déposé avec soin au
sommet de la colonne et l’on procède à l’élution (l’éluant étant placé dans le réservoir prévu à
cet effet). La colonne doit totalement être dépourvue de bulles d’air, y compris dans le volume
mort de bas de colonne (manchon, tamis, tube d’élution etc.).
3.5.4.1.2. Exploitation des résultats
Détermination du volume d’élution Ve d’un soluté : Ve est caractéristique du soluté,
dans un système chromatographique donné. Dans le cas général, où le volume de l’échantillon
est négligeable devant celui de la colonne, Ve, est déterminé comme il est indiqué sur le graphe
de la figure suivante.
Détermination du volume
d’élution d'un soluté.
3.5.4.2. Chromatographie sur couche mince

Le tamisage moléculaire, sur couche mince, est une technique plus rapide et plus simple
à utiliser que la chromatographie sur colonne. Elle présente l’inconvénient d’être une méthode
dans laquelle on ne recueille aucune fraction.
3.5.6. Applications
Les applications du tamisage moléculaire sont analytiques ou préparatives. Il n’est pas
possible de dresser une liste exhaustive des applications analytiques. On peut citer à titre
d’exemple :
 La déminéralisation de solutions protéiques,
 La séparation de peptides, protéines, triglycérides, osides, dispersions de produits
organiques, etc.
22 | P a g e
Cette technique a même été utilisée pour séparer des virus, d’un autre point de vue, le
tamisage moléculaire permet la détermination masses molaire de macromolécules et elle est
appliquée de façon courante aux protéines.
La colonne est préalablement étalonnée à l’aide de marqueurs : mélange de 4 à 5 protéines
pures de masses moléculaires connues.
Puis, sur la courbe étalon lg M = f (VE), on reporte le volume d’élution de la protéine
analysée, ce qui permet de déterminer le logarithme de sa masse moléculaire.
La méthode a un avantage certain, sa simplicité et sa rapidité d’exécution, mais présente
également quelques inconvénients :
 L’utilisation d’une échelle logarithmique peu précise,
 L’obtention de résultats anormaux avec des molécules asymétriques (fibrinogène,
lysozyme).
3.6. Chromatographie d’affinité
3.6.1. Principe
Les protéines forment avec certaines molécules ou macromolécules des complexes
spécifiques et réversibles.
La chromatographie d’affinité est basée sur les interactions entre un ligand, lié par
covalence à un support inerte qui constitue la phase fixe, et son partenaire d’affinité en solution.
Dans le complexe de nature biologique, dont la formation est à la base de la
chromatographie d’affinité, l’un des partenaires au moins est une protéine ; cette protéine peut
constituer le ligand fixe ou le partenaire d’affinité en solution. Les interactions qui conduisent
à la formation du complexe P + L PL sont représentées par une constante de
fixation K qui est l’équivalent d’une constante d’équilibre chimique :
Principe de la chromatographie
d’affinité.
23 | P a g e
Afin de décrire les opérations qui permettent une séparation par ce type de
chromatographie, on envisagera la purification d’une enzyme en utilisant, comme ligand fixe,
un inhibiteur de cette enzyme.
La première opération consiste à préparer le gel d’affinité, en fixant le ligand sur un
support. Une colonne est remplie de ce gel d’affinité, on y fait passer la solution aqueuse
contenant l’enzyme à purifier (le partenaire d’affinité spécifique de l’inhibiteur fixe) (figure ci-
dessous). Celle-ci est retenue, alors que les contaminants en solution passent librement. On
élimine toute trace de produits indésirables par des lavages successifs.
Enfin on élue l'enzyme retenue en décomposant le complexe. Pour cela, on modifie les
conditions de milieu : changement de pH, utilisation d’un dénaturant réversible où l’on fait
passer une solution contenant un ligand ayant, pour la macromolécule retenue, plus d’affinité
que le ligand fixe.
Les différentes étapes d’une

chromatographie d’affinité
3.6.2. Phase stationnaire le gel d’affinité

Cette phase est constituée d’un effecteur (ligand), fixé par covalence à un support poreux
par l’intermédiaire d’une chaîne latérale : le bras fixateur (appelé « spacer » en anglais).
Schéma d’un gel d’affinité.
3.6.2.1. Supports
Les supports utilisés en chromatographie d’affinité doivent présenter les propriétés sut
vantes :
 Être insolubles dans l’eau, mais mouillables ;
 Être poreux ;
 Être stables chimiquement et mécaniquement ;
24 | P a g e
 Porter des groupements fonctionnels réactifs permettant la fixation des spacers

On utilise des dérivés de polymères osidiques : la carboxyméthylcellulose et les sépharoses
activées (chaînes de dextranes activées par des groupements particulièrement réactifs : bromure
de cyanogène) et le gel de polyacrylamide.
3.6.2.1.1. Dérivés de la carboxyméthyl cellulose (CM-cellulose)
La CM-cellulose aminohexylique et la CM-cellulose hydrazide permettent la fixation
d’effecteurs portant une fonction carboxyle.
CM-cellulose aminohexylique CM-cellulose hydrazide
Le premier comporte un spacer, relativement long, assurant une certaine distance entre
le ligand et le support, ce qui réduit les contraintes stériques et facilite la réaction de
complexation.
Le second comporte un spacer court ; il se prête à la fixation d’effecteurs de masse
moléculaire élevée.
La CM-cellulose aminohexylique succinylée (n = 6) et la CM-cellulose
aminododécylique succinylée (n = 12) sont des supports utilisés pour fixer des effecteurs
comportant une fonction -NH2 réactive.
CM-cellulose aminohexylique (n = 6) ou aminododécylique (n = 12) succinylée.
La longueur du bras suspenseur est choisie de manière à limiter les contraintes stériques.
3.6.2.1.2. Fixation de l’effecteur sur le support

L’étude exhaustive des différentes techniques de fixation sort du cadre de ce manuscrit
: on peut cependant, à titre d’exemple, décrire la fixation d’effecteurs sur les dérivés de la CM-
cellulose.
25 | P a g e
La fixation est faite en établissant des liaisons amides, liaisons stables qui permettent la
réutilisation fréquente des gels d’affinité, et leur utilisation à des pH extrêmes acides ou
basiques.
Lorsque les groupements -NH2 et -COOH sont suffisamment réactifs, il suffit de mettre
en contact le ligand et le support pour que la liaison amide s’établisse. Dans le cas contraire il
est nécessaire d’activer l’une ou l’autre de ces deux fonctions.
Fixation d’un inhibiteur de la trypsine : la paraaminobenzamidine

sur la CM-cellulose aminohexylique succinylée.
Fixation d’une protéine sur la CM-cellulose aminohexylique succinylée. Pour cette

fixation, le carboxyle est préalablement activé sous forme de N-hydroxysuccinimidester.
3.6.3. Effecteurs
Peuvent être effecteurs (ligands fixes) toutes les substances capables de former des
complexes stables avec les molécules à isoler et possédant, par surcroît un groupement réactif
assez éloigné du site actif pour que celui-ci reste librement accessible après la fixation.
26 | P a g e
Les effecteurs utilisés sont :

 Pour la purification des enzymes :
 Des substrats et analogues de substrats ;
 Des inhibiteurs réversibles ;
 Des effecteurs allostériques ;
 Des coenzymes.
 En immunologie :
 Des haptènes ;
 Des antigènes ;
 Des anticorps ;
 Pour l’étude des protéines réceptrices :
 Des hormones.
3.6.4. Rôle des différents facteurs
Le gel activé est initialement mis en suspension dans un tampon additionné de substance
dont le rôle est de protéger la liai son entre le ligand et le support. Immédiatement avant la
séparation, le gel est lavé et l’échantillon est déposé.
La dimension de la colonne, le volume du lit de gel sont adaptés à la quantité
d’échantillon à traiter et à la capacité de rétention du gel.
La réaction de complexation est faite au sein d’un tampon de pH, force ionique et
composition définis. Les tampons à base de composés aminés ou carboxyliques doivent être
proscrit quand ils interfèrent avec des groupements appartenant aux deux partenaires du
complexe.
Le pH correspond à une valeur ne provoquant pas la dénaturation de la protéine et pour
laquelle la stabilité du complexe entre effecteur et partenaire est maximale. Le pH et la force
ionique sont choisis de manière à éviter les interactions entre le support et les partenaires
d’affinité (généralement des protéines).
La température joue également un rôle en conditionnant la durée de formation du
complexe : si l’on opère à basse température, la durée de l’opération s’en trouve
considérablement augmentée.
Après l’étape de fixation, les groupements restés libres sont bloqués, puis le complexe
partenaire-effecteur fixe est lavé plusieurs fois par des tampons de force ionique définie.
La dernière opération, la désorption ou élution est réalisée, soit par un tampon de pH
différent induisant un changement de conformation de la protéine, soit par un milieu de force
ionique donnée, soit par une compétition avec un ligand libre.
27 | P a g e
3.6.5. Applications de la chromatographie d’affinité

La technique est adaptée soit à l’analyse, soit à la préparation de substances biologiques.
Elle est pratiquée selon les cas, en colonne ou en batch (procédé en cuve utilisé pour les
purifications à grande échelle).
La chromatographie d’affinité a été utilisée :
 En zymologie, pour l’extraction d’enzymes et la purification d’extraits enzymatiques ;
 En immunologie, pour la purification d’anticorps ;
 En protéinochimie, pour l’étude des protéines membranaires ;
 En chimie des acides nucléiques, pour le fractionnement de divers acides nucléiques
(ARNm, ARN ribosomaux, etc.).
3.7. Chromatographie liquide haute performance HPLC (en anglais) CLHP (en français)
La chromatographie liquide haute performance, utilisée en routine depuis 1975 a réduit
en moyenne de 10 fois le temps nécessaire à l’analyse de nombreux composés biochimiques.
On est passé à des durées de quelques minutes alors qu’auparavant une chromatographie
requérait quelques dizaines de minutes.
Gain de temps et haut pouvoir de résolution sont les maîtres mots de cette technologie.
3.7.1. Généralités
L’HPLC n’est pas un principe en soi, chaque type de support permet de réaliser une
chromatographie dont le principe est déjà connu et appliqué en pression ambiante : adsorption,
exclusion-diffusion, ionique, phase inversée, etc.
L’HPLC se distingue des systèmes classiques par :
 Une augmentation de la vitesse d’échange entre phases solide et liquide ;
 Un accroissement du nombre des plateaux théoriques.
Ceci a été rendu possible par l’utilisation en HPLC de particules de granulométrie fine et
de grande résistance mécanique. Dans ces conditions, la phase liquide mobile percole sous
pression.
Les premiers systèmes fonctionnaient sous des pressions pouvant atteindre 600 bars ; les
progrès réalisés sur les supports ont permis de réduire considérablement les pressions de travail
aux alentours d’une centaine de bars.
Le tableau ci-après extrait d’une page de publicité Prolabo pour des colonnes vendues par ce
fournisseur, montre à l’évidence que le nombre de plateaux théoriques est une fonction inverse
de la granulométrie. Granulométrie Nombre de plateaux
(en µm) théoriques par mètre
Relation entre le nombre de plateaux 3 110 000 à 150 000
théoriques et la granulométrie des colonnes
Sup-Rs (Prolabo). 5 60 000 à 80 000
28 | P a g e
Le tableau suivant compare le nombre de plateaux théoriques que l’on peut calculer dans
divers systèmes chromatographiques. Il est éloquent de constater que l’on passe de 100 plateaux
en chromatographie liquide en colonne ouverte à 5 000 en HLPC, et 50 000 en micro HLPC.
On rappelle qu’en chromatographie sur colonne, on appelle plateau théorique la portion
de colonne dans laquelle un soluté est en équilibre de répartition entre les phases mobile et
stationnaire.
L’HPLC analytique traite des quantités d’échantillon de l’ordre du microgramme ; en
HPLC semi-préparative on traite des quantités d’échantillons de l’ordre du milligramme et en
HPLC préparative, de l’ordre du gramme.
Comparaison du nombre de plateaux théoriques dans divers systèmes

chromatographiques
Nombre de plateaux
Type de chromatographie
théoriques par mètre
Chromatographie liquide en colonne ouverte, à pression 100 à 1 000
ambiante.
Chromatographie « éclair » (« Flash-chromatographie »). 500 à 1 500
HPLC. 25 000 à 50 000
Micro HPLC. 50 000 à 150 000
Chromatographie gazeuse. 2 000 à 20 000
Chromatographie gazeuse capillaire. 100 000 à 200 000
3.6.2. Analyse et traitement des signaux

La représentation graphique de l’élution d’un composé, exprimée en concentration en
fonction du temps, ou en concentration en fonction du volume de l’effluent est une courbe de
distribution typiquement gaussienne.
Remarque : Le volume de rétention (aussi appelé volume d’élution) est lié au temps de
rétention (aussi appelé temps d’émergence) par une relation simple :
V (volume d’élution) = D (Débit) x t (temps).
La mesure de la concentration dans l’effluent est :

 Une absorbance si la détection est pratiquée par absorptiométrie moléculaire UV ou
visible ;
29 | P a g e
 Une intensité de lumière fluorescée si la détection est faite par fluorimétrie ;

 Un indice de réfraction si la détection est réfractométrique.
Courbe d’élution en HPLC.
0 = Temps de l'injection
V0 = volume mort de la colonne, c’est le volume d’élution d’une substance qui n’interagit pas
avec la phase stationnaire, on l’appelle aussi volume vide : car il correspond au volume
intergranaire
t0 = temps mort = Vo/Débit
t - t0 = temps de rétention réduit
V = volume de rétention total = volume de solvant nécessaire pour éluer le composé
V- V0 = volume de rétention réduit
Wb = largeur du pic à la base
Wh = largeur du pic à mi-hauteur
Le volume de rétention d’un composé est donné par la relation suivante :
V = V0 + K Vs
Expression dans laquelle :

V0 représente le volume mort de la colonne.
Vs le volume de la phase stationnaire.
K : le coefficient de distribution du composé entre la phase mobile et la phase fixe.
K' s'appelle facteur de capacité ou de rétention : ′
30 | P a g e
K’ varie avec la force d’élution du solvant, K’ diminue quand la force d’élution du solvant
augmente.
α est le coefficient de sélectivité, il rend compte de l’efficacité de la séparation de deux pics
voisins (figure suivante).
Coefficient de sélectivité :

′

′
Si α = 1, cela indique que les structures des composés analysés sont trop proches pour
permettre leur séparation effective dans le système utilisé. La valeur minimum de α que l’on
doive accepter est 1,1. En dessous, on change d’éluant ou de phase stationnaire.
Le coefficient de sélectivité α ne prend pas en compte la largeur des pics, aussi définit
on le coefficient de résolution de 2 pics voisins (R) comme le rapport entre les volumes de
rétention des 2 pics et la moyenne arithmétique des largeurs à la base des pics (figure ci-
dessous) :
Coefficient de résolution de 2 pics

voisins :
,

31 | P a g e
Le nombre de plateaux théoriques N se calcule en appliquant la relation empirique :
Dans cette relation, le rapport

est constant quel que soit le pic, car lorsque le
volume de rétention (Vi) augmente, la largeur à la base (Wi) augmente également.

Une autre relation empirique permet d’estimer le nombre N :
L = longueur de la colonne (en mm)
dp = diamètre des particules (en µm).
La hauteur d’un plateau théorique (HETP = height equivalent of a theoretical plate) est
calculée par la relation :
3.6.3. Technologie
3.6.3.1. Appareillage
Un chromatographe liquide haute performance comporte une (ou plusieurs) pompe(s)
qui propulse l’éluant dans une colonne analytique.
L’injection de l’échantillon à analyser est pratiquée en introduisant un faible volume de
produit (quelques µl) dans l’éluant sous pression.
Après leur séparation, les différents constituants de l’échantillon sont détectés en sortie
de colonne. Un calculateur assure l’acquisition et le traitement des données.
L’éluant la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, il doit être nécessairement
dégazé, afin de ne pas introduire de bulles d’air dans la colonne de dégazage ; le dégazage se
pratique avec barbotage d’hélium ou ultrasons (le dégazage par barbotage d’hélium) est
considérablement plus efficace que celui aux ultrasons).
La pompe
 Pour une élution isocratique (le solvant utilisé possède le même pouvoir éluant durant
toute l’élution), on utilise une pompe simple, réglable en pression, ou en débit ;
 Pour une élution en gradient (de polarité, de force ionique, ou de pH) on utilise un
dispositif appelé « gradient former ».
Il existe des « gradients haute pression » qui comportent autant de pompes qu’il y a de
solvants dans le gradient (2, 3 ou plus) les solvants sont mélangés après avoir été montés en
pression.
Il existe également des gradients basse pression, ils sont constitués d’une électrovanne multi
voies et d’une pompe. Considérons à titre d’exemple, un gradient constitué par un mélange de
3 solvants A, B et C, dont on veut faire varier les proportions.
32 | P a g e
Les flacons des 3 solvants sont connectés aux 3 entrées de l’électrovanne. Celle-ci sur une
période de T secondes, va s’ouvrir t1 secondes pour A, t2 secondes pour B et t3 secondes pour
C ; (t1 + t2 + t3 = T).
Puis le mélange est monté en pression, et t1, t2 et t3 varient en fonction du temps selon un
programme délivré par le système informatisé qui pilote le « gradient former ».
Chromatogramme d'HPLC Schéma simplifié d’un HPLC à élution

isocratique.
Le système d’injection est constitué le plus souvent d’une vanne rhéodyne 6 voies (figures ci-
dessous : A et B).
La boucle d’injection (capacité de 5 à 5 000 µl) est remplie dans un premier temps
(figure ci-dessous A), puis dans un deuxième temps en tournant la vanne on procède à
l’injection (figure ci-dessous B).
Pour réaliser une injection dans de bonnes conditions, il convient :
 De ne pas surcharger la colonne ; si l’échantillon est trop important on aboutit à des pics
très larges et des phénomènes de traîne, autant de facteurs qui concourent à diminuer le
pouvoir de résolution de la chromatographie ;
 D’injecter très rapidement.

La durée d'une injection est égale à :
/
Conclusion : Pour injecter rapidement, on injecte des échantillons de faible volume.
33 | P a g e
A. Remplissage de la boucle d’injection. B. Vanne rhéodyne en position d’injection.
La (les) colonne(s)
Colonnes et précolonnes (colonnes de protection) sont commercialisées prêtes à
l’emploi.
Exemple de colonne : L (longueur) : 125 mm
ID (diamètre interne) : 4,6 mm
Stationary phase : spherisorb ODS2 (garnissage de la colonne), 5 mm (granulométrie).
Elle est constituée d’un tube en acier in oxydable, terminé par 2 frittés, 2 filetages
permettent le raccord avec les tuyaux de l’appareil.
Le fritté protège la colonne de particules non dissoutes et homogénéise le flux.
La colonne est remplie de matériaux divers, selon le type de chromatographie que l’on
souhaite mettre en œuvre. Pour être utilisable en HPLC, le matériel de garnissage doit résister
aux fortes pressions.
Le problème de la reproductibilité des mesures exige :
 Une granulométrie parfaitement maîtrisée (3, 5, 7 ou 10 µm) ;
 Un garnissage de densité constante.
La température
On travaille généralement en isotherme, certains HPLC sont équipés d’un dispositif de
gradient de température sous forme d’une jaquette de colonne à programmation de température.
La détection
Les détecteurs utilisés sont :
 L’absorbance UV-Visible : On peut mesurer des absorbances à longueur d’onde fixe, en
utilisant des filtres interférentiels, ou à longueur d’onde variable, en utilisant un réseau (190-
700 nm). On se placera à une longueur d’onde pour laquelle la mesure d’absorbance sera
maximale pour chaque composé élué. Certains HPLC sont équipés d’un dispositif appelé
« stop flow », qui arrête la pompe lorsqu’un composé élué se trouve dans la cuve
spectrophotométrique à circulation dans laquelle se fait la mesure d’absorbance, ce qui
34 | P a g e
permet à l’appareil, dans un second temps, de tracer des spectres d’absorption ou de

fluorescence de la molécule contenue dans la cuve à circulation ;
 La réfractométrie : C’est une méthode universelle, mais moins sensible que la mesure
d’absorbance. Elle est fondée sur la relation entre l’indice de réfraction de la solution (n) et
la concentration (c) du soluté (n0 est l’indice du solvant, k une constante dépendant de la
nature du soluté) : n = n0 + kc ;
 La fluorescence : C’est une méthode très sensible, mais non universelle, car elle ne
s’applique qu’aux composés fluorescents ;
 La mesure de conductance : Utilisable pour les substances chargées, cette méthode est
délicate car la conductance est sensible aux variations de température ;
 Les mesures électrochimiques : Ces méthodes sont spécifiques et sélectives ;
 Les réactions chimiques : On utilise une dérivation post-colonne (figure ci-dessous), qui
révèle par une réaction chimique colorée ou fluorescente les composés chromatographiés.
On a aussi couplé des HPLC à des spectromètres de masse.
Dérivation post-colonne pour

révélation.
3.6.4. Principales phases d’une HPLC

A) Préparation de l’échantillon
Cette préparation vise à :
 Protéger la colonne analytique des contaminants ;
 Diminuer les limites de détection ;
 Améliorer la sélectivité ;
 Augmenter la précision et l’exactitude.
35 | P a g e
 Elle consiste en premier lieu en une purification de l’échantillon.

Plusieurs méthodes de purification sont utilisables : filtration sur membrane de 0,2 µm,
centrifugation, recristallisation, déprotéinisation, etc.
 Puis, éventuellement, une dissolution dans un solvant approprié. Le choix du solvant de
l’échantillon influencera la séparation et dépendra du type de chromatographie mis en œuvre.
B) Injection
C) Elution
On procède au dégazage des solvants, par entraînement à l’aide de gaz peu solubles,
inertes et peu absorbants, l’hélium étant le gaz à privilégier, ou aux ultrasons.
 L’élution isocratique : c’est la plus simple à mettre en œuvre donc elle est à privilégier ;
elle ne fait intervenir qu’un seul éluant, solvant ou mélange de solvants ;
 L’élution par gradient : on utilise des gradients de pH ou de force ionique en
chromatographie ionique, des gradients de polarité en chromatographie d’adsorption ou en
chromatographie en phase inversée.
Exemples :
Gradient binaire : eau/méthanol
Ces deux solvants sont miscibles. 1’eau est très polaire, le méthanol beaucoup moins. Plus le
mélange des deux solvants est riche en eau, plus il est polaire, plus il est riche en méthanol,
moins il est polaire.
Gradient ternaire : eau/acide acétique/acétonitrile
L’eau est le solvant le plus polaire, l’acétonitrile (CH3-C≡N) le solvant le moins polaire, l’acide
acétique (CH3- COOH) est appelé le solvant modulateur car, miscible aux deux précédents, il
est à la fois polaire (-COOH) et apolaire (CH3-).
On comprend dès lors qu’en faisant varier les proportions de ces trois solvants, il est
possible de faire varier la polarité de l’éluant.
Il est nécessaire de contrôler le gradient : (la figure ci-dessous A) montre un gradient
linéaire parfait et un gradient en gradins. Ce deuxième gradient est acceptable si les hauteurs
des marches sont toutes égales.
(La figure ci-dessous B) montre un exemple de gradient binaire programmé. L’optimisation
d’un gradient est une démarche expérimentale ; il existe des logiciels qui facilitent cette
optimisation.
D) Analyse des fractions
 Analyse qualitative :
Les différents constituants de l’échantillon sont caractérisés par leurs temps d’émergence.
36 | P a g e
Le contrôle de qualité de l’analyse est fait par une étude statistique des données :
 Essais de répétabilité ;
 Détermination de la valeur la plus probable (représentée par le mode de la distribution
gaussienne des valeurs) ;
 Détermination des paramètres de distribution des valeurs (écart-type et étendue).
Il est aussi indispensable de déterminer la limite de détection, qui est la plus petite quantité
ou concentration détectée, c’est-à-dire une mesure significative par rapport aux fluctuations
possibles des mesures statistiques.
Il faut aussi déterminer la limite d’évaluation, c’est-à-dire la plus petite quantité ou
concentration au-dessus de laquelle on peut faire une détermination quantitative fiable.
 Analyse quantitative :
Les concentrations sont calculées en comparant les aires des pics des inconnus à celles
d’étalons ; en l’absence d’un intégrateur, on peut comparer les hauteurs, à condition que les
largeurs à la base des pics soient sensiblement égales.
 Utilisation d 'un étalon externe
Supposons que l’on dose le composé X dans l’échantillon ; pour cela, on réalise une
deuxième chromatographie, identique à la première, en injectant le même volume d’une
solution étalon du composé X, de concentration connue : CE.
′é
′é
 Utilisation d’un étalon interne

L'étalon interne est une substance de nature différente de celle de X, qui est le composé
analysé, qui n’interfère pas avec les constituants de l’échantillon et que l’on ajoute à
l’échantillon avant l’injection.
L'analyse est précédée d’un calibrage ; on détermine pour chaque constituant X de
l’échantillon un facteur de réponse tel que :
é
′é
Lors de l’analyse, le calculateur détermine la concentration de X dans l’échantillon en

appliquant la formule :
.

é
37 | P a g e
3.6.5. Applications
HPLC d’adsorption
La phase stationnaire est constituée d’un solide polaire et adsorbant : silice non greffée,
silice greffée polaire. chromosorb, etc.
La phase mobile est un éluant isocratique apolaire ou un gradient de polarité.
HPLC phase inversée : (RP- HPLC)
La phase stationnaire est un solide apolaire, c’est une silice greffée apolaire, par exemple
une silice greffée l8 carbones.
La phase mobile est un éluant isocratique polaire ou un gradient de polarité.
HPLC d’exclusion stérique
La phase stationnaire est un solide poreux, silice poreuse à groupements silanols bloqués
ou supports organiques, polymères réticulés.
La phase mobile est un éluant isocratique inerte.
HPLC ionique
La phase stationnaire est une silice greffée chargée ou un support acrylique chargé.
La phase mobile est un gradient de pH ou de force ionique.
B. Exemple de programmation d’un

gradient binaire. De 0 à 5 min : élu1ion par
un gradient linéaire de composition variant de
40% de A + 60% de B à t = 0, à 90% de A +
10% de B.
A. Gradient linéaire parfait,
De 5 à 10 min : élution isocratique par un
gradient en gradins.
solvant de composition fixe : 90% de A + 10%
de B.
De 10 à 15 min : élution par un gradient
linéaire de composition variant de 90% de A +
10% de B à 100% de A et 0% de B.
38 | P a g e
3.8. Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

La chromatographie en phase gazeuse est une transposition de la chromatographie sur
colonne dans laquelle la phase mobile liquide a été remplacée par un gaz. Historiquement, la
CPG a commencé par la séparation des premiers termes des hydrocarbures, par différence
d’absorbalité de ces composés entraînés par un gaz inerte sur un solide.
3.8.1. Généralités
3.8.1.1. Définitions
La CPG gaz-solide est une chromatographie d’adsorption, la phase stationnaire étant un
solide adsorbant.
La CPG gaz-liquide est une chromatographie de partage, la phase stationnaire étant un
liquide non volatil réparti sur un support inerte.
Le gaz vecteur est le gaz qui véhicule les solutés.
La phase mobile est constituée du gaz vecteur et des solutés gazeux.
3.8.1.2. Principaux modules d’un chromatographe en phase gazeuse
Un tel chromatographe comprend (figure ci-dessous) :
 La colonne, disposée dans un four thermostaté ; c’est la partie fondamentale ;
 Un dispositif d’injection de l’échantillon ;
 Un détecteur.
Schéma d’un chromatographe

en phase gazeuse.
3.8.2. Principe de la chromatographie en phase gazeuse
Les différents solutés gazeux vont se séparer par migration différentielle le long de la
phase stationnaire. Comme en chromatographie liquide, on peut définir le Rf :
é

39 | P a g e
3.8.2.1. Migration différentielle

La migration différentielle est assurée :
 En CPG gaz-solide par les différences d’adsorbalité. Le Rf est d’autant plus faible et le temps
d’émergence élevé que l’adsorption de la molécule par la phase solide est élevée ;
 En CPG gaz-liquide, la migration différentielle est obtenue par les différences de solubilité
dans le liquide fixe. Le soluté se partage entre le gaz vecteur et le liquide stationnaire. Le Rf
est d’autant plus petit et le temps d’émergence élevé que la solubilité est grande.
3.8.2.2. Facteurs qui influent sur la séparation
 L’échantillon
Les échantillons liquides sont injectés à l’aide d’une micro-seringue graduée dans la
chambre de vaporisation, au travers d’un bouchon généralement constitué de téflon. La chambre
de vaporisation est portée à une température telle que la vaporisation est immédiate : c’est
généralement celle du four ; quelquefois c’est une température supérieure à celle de la colonne.
La quantité d’échantillon injecté doit être faible.
La surcharge d’un chromatographe, c’est-à-dire l’introduction d’une quantité d’échantillon
supérieure à la capacité de travail de la colonne, est à proscrire, la largeur des pics augmentant
avec la quantité des échantillons.
Les limites de sensibilité sont, selon les appareils, de l’ordre du µg et même du pg. Un autre
facteur est important, c’est la rapidité d’introduction et de vaporisation de l’échantillon.
Le traitement de l’échantillon varie selon les substances analysées :
 Lorsque les solutés à analyser sont directement volatilisables, les substances sont
extraites, purifiées, solubilisées dans un solvant volatil pur et chromatographiés ;
 Lorsque les solutés ne sont pas volatils à la température du chromatographe ou bien sont
décomposés à cette température, il faut les transformer avant l’analyse en dérivés
volatils stables ; les acides aminés sont estérifiés par le butanol, les acides gras estérifiés
par le méthanol, les oses réduits en alditols, puis acétylés.
 La température
Le temps d’émergence est inversement proportionnel à la température absolue.
En CPG isotherme, la température est maintenue rigoureusement constante : dans certains
cas une variation de 1°C modifie le volume de rétention de 5 %. On adopte une température
légèrement supérieure au point de vaporisation du constituant le moins volatil.
Sur les appareils, la température varie, elle augmente dans le temps selon un programme
rigoureusement reproductible d’un essai à l’autre. Cette dernière technique permet de réduire
les temps de séparation en facilitant l’élution à haute température des solutés très retenus. D’un
40 | P a g e
point de vue technique, la colonne est maintenue dans un four à bain d’air thermostaté. La
période de mise en régime est souvent longue et nécessite un long conditionnement préalable
de l’appareil.
 La phase stationnaire
En CPG gaz-solide, les adsorbants gel de silice, alumine, etc. peuvent subir différents
traitements, afin de modifier leur pouvoir adsorbant. Ils sont introduits dans la colonne à densité
constante après avoir été lavés, séchés et tamisés. Le remplissage de la colonne est effectué par
vibration et aspiration. Les colonnes sont commercialisées préconditionnées.
En CPG gaz-liquide, la phase stationnaire est un support imprégné d’un liquide. Le support
doit présenter une adsorption minimale de façon à interférer le moins possible avec le partage
du soluté entre les phases gazeuse et liquide.
Pour éliminer ce pouvoir adsorbant, on est amené à lui faire subir un traitement préalable :
lavage à l’acide, puis imprégnation de silanes (DMCS, diméthylchlorosilane et HMDS,
hexaméthyldisilane).
Le support se présente sous forme de grains de diamètre de l’ordre de 150 à 200 µm ; cette
dimension est un compromis, des grains très fins augmentent les échanges (augmentation du
nombre de plateaux théoriques) mais nécessite l’utilisation d’une forte pression d’entrée, avec
une importante perte en charge.
Le support doit présenter une faible porosité, de manière à limiter la diffusion de la phase
mobile dans le support. La surface du grain doit permettre la rétention du film liquide qui
constitue la phase stationnaire.
Les supports utilisés sont : le chromosorb (brique réfractaire pilée), le kieselguhr (terre de
diatomées), le quartz, le carborandum, etc.
Le liquide stationnaire est un hydrocarbure, une silicone, un ester, un polyol, caractérisé par
sa température d’utilisation et sa polarité.
On fixe généralement 20 parties de liquide sur 100 parties de support.
On dissout la phase fixe dans un solvant volatil, le support est introduit dans cette solution
puis l’ensemble est chauffé afin d’éliminer le solvant.
 La colonne
Les colonnes sont métalliques, en plastique pour des séparations à basse température, en
verre et joints Téflon lorsque le métal des colonnes risque de provoquer une décomposition
catalytique de l’échantillon analysé. Diverses formes ont été utilisées ; rectilignes, en U, en
spirales ; cette dernière est la plus employée car elle permet de limiter l’encombrement de
l’appareil.
41 | P a g e
La longueur de la colonne accroît l’efficacité de la séparation en augmentant le coefficient

de sélectivité α de deux pics voisins :
En revanche le coefficient de résolution R diminue : car la largeur des pics

augmente.
Les définitions du coefficient de sélectivité α et du coefficient de résolution R ont été
données au cours de l’HPLC.
L’augmentation du diamètre détériore les fronts, comme le montre la figure suivante :
Fronts d’un constituant

d’échantillon dans une colonne de
petit diamètre (a) et de grand
diamètre (b). La largeur de pic Wa,
est inférieure à celle Wb.
Le choix de la taille d’une colonne résulte donc d’un compromis. En CPG d’adsorption
on utilise des colonnes de 1 m de long et de 3 mm de diamètre. En CPG de partage on travaille
avec des colonnes pouvant atteindre 5 m.
La grande innovation, ces dernières années, est la CPGC, chromatographie capillaire,
qui permet d’obtenir un nombre de plateaux égal à 100 000/m.
La colonne capillaire (L = 5 à 10 m, diamètre de 100 à 250 µm) est utilisée en
chromatographie gaz-liquide, sans support ; la paroi interne du capillaire sert de support.
3.8.3. Technologie
3.8.3.1. Trace des pics
La figure ci-dessous décrit le tracé obtenu avec un détecteur différentiel de
chromatographe en phase gazeuse. Il existe une grande analogie avec celui que l’on obtient en
HPLC.
Un système d’acquisition et de traitement de données détermine les temps d’émergence
et calcule l’aire des pics.
Tracé obtenu avec un détecteur

différentiel.
42 | P a g e
Le pic d’air est donné pour certains détecteurs, les catharomètres :

 t0 est le temps de rétention de l’air ;
 t le temps de rétention d’un soluté ;
 t’= t-t0, le temps de rétention réduit ;
 H représente la hauteur du pic ;
 Wb la largeur du pic à la base ;
 Wh la largeur du pic à mi-hauteur.
3.8.3.2. Différents types de détecteurs
 Le détecteur à catharomètre
Un catharomètre est une cellule de conductivité thermique ; le détecteur est constitué de deux
catharomètres montés en pont de Wheatstone. La cellule de mesure est traversée par la phase
mobile, gaz vecteur et solutés gazeux.
Préalablement le pont est équilibré : les deux cellules étant traversées par du gaz vecteur, les
points A et B sont amenés au même potentiel (en agissant sur les résistances R et R').
Lorsqu’un soluté gazeux traverse la cellule de détection, le pont est déséquilibré et le courant
de déséquilibre est amplifié et enregistré.
 Détecteur à ionisation de flammes (FID)

C’est un détecteur à une voie, beaucoup plus sensible que le précédent.
Le gaz vecteur, en sortie de colonne est mélangé à de l’hydrogène, puis brûle entre deux
électrodes : il s’établit un courant entre les électrodes dû à l’ionisation de la flamme. Ce courant
est constant lorsque le gaz vecteur est pur et le scripteur de l’enregistreur trace une ligne de
base. Si un soluté organique accompagne le gaz vecteur, sa combustion modifie l’intensité du
courant et cette variation est enregistrée sous forme d’un pic.
43 | P a g e
 Détecteur à capture d’électrons

Une source d’électrons est disposée en sortie de colonne. Lorsqu’une molécule est frappée
par le flux d’électrons, elle prend une charge négative lorsqu’elle est capable de fixer un ou
plusieurs électrons.
L’anion, ainsi formé, est attiré alors par une anode, créant un courant qui sera amplifié et
enregistré.
 Spectrographie de masse
Le spectrographe de masse est utilisé pour détecter et identifier les solutés de l’échantillon
à analyser.
3.8.4. Exploitation des résultats
La chromatographie en phase gazeuse est une méthode d’analyse immédiate qualitative
et quantitative.
Les solutés sont caractérisés par leur temps d’émergence qui est comparé à celui d’un
étalon. En ce qui concerne leur dosage, l’aire des pics est proportionnelle à la concentration des
solutés. On peut procéder à un étalonnage de l’appareil en utilisant des étalons, internes ou
externes comme en HPLC. Les méthodes de calcul sont identiques.
3.8.5. Domaine d’application de la CPG
La CPG est le domaine de l’analyse fine, puisque sa sensibilité atteint le pg. Elle
s’applique bien à la détection de traces, comme dans le cas de la toxicologie, de la répression
des fraudes ou de la médecine légale. En biologie, cette technique est applicable à différents
dosages : stéroïdes, acides gras et oses ; mais elle nécessite une purification et une stabilisation
des échantillons, ce qui est quelque fois fastidieux.
En microbiologie, les produits de fermentation sont analysés par CPG : il existe une
taxonomie des anaérobies fondée sur la nature et la quantité des alcools et acides produits.
44 | P a g e

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Université d’El-Oued

Département de biologie cellulaire et

Cours de techniques d’analyses biologiques

Elaboré par l’enseignant Abdelhak MEDJOUR

Chapitre 3 : Méthodes physicochimiques

Expérience inspirée de celle de TSWETT.

Chromatogramme des pigments

La transposition de cette partition entre deux phases

3.2.1.2. Technologie de la chromatographie de partage

Cuve de chromatographie descendante.

Si la chromatographie dure trop longtemps, au point de ne plus pouvoir mesurer la

distance parcourue par le composé

3.2.2. Eléments de la chromatographie d'adsorption

Silices greffées polaires.

On utilise soit un solvant pur, soit un mélange monophasique de solvants.

Colonne ouverte de chromatographie

Trois techniques de remplissage sont utilisées :

 Technique de la suspension : on réalise une bouillie de l’adsorbant dans le solvant, après

3.2.3.2. Chromatographie d'adsorption sur couche mince (CCM)

Cuve à chromatographie pour couche mince.

Silice greffée orgonosilanée Silice greffée chaîne aliphatique 18C.

La phase mobile est polaire et hydrophile, elle contient généralement un modulateur de

3.4. Chromatographie par échange d’ions

Schéma d’une résine échangeuse de Schéma d’une résine échangeuse d’anions

On appelle résines cationiques celles qui échangent réversiblement des cations :

Réseau d’un copolymère DVB-styrène.

 Le pontage : c’est le divinylbenzène qui crée la réticulation du polymère : le nombre de

 Résines cationiques faibles : carboxyliques (non ionisées en milieu fortement acide) :

 Résines cationiques très faibles : phénoliques (uniquement ionisées en milieu alcalin):

 Groupements fonctionnels des résines anio-niques

 Résines anioniques fortes :

 Résines à groupements aminés tertiaires.

Les indices s et r signifient « en solution » et « sur la résine ». Pour ces ions

Si > 1, cela indique une affinité préférentielle de la résine pour A.

3.4.4.2. Étape de fixation

Exemple : Si le volume de résine est de 20 cm3 dans la colonne, et si l’on recueille 1 ml

 La quantité de réactif régénérant (concentration et volume) ; généralement on en utilise 2 à

Séparation de 3 acides aminés,

3.4.5. Polyosides chargés : celluloses et dextranes (sephadex)

 Le QAE-polyoside (quaternaire aminoéthyle) échangeur anionique fort :

Les échangeurs cationiques sont :

 Le SP-polyoside (sulfopropyle) : échangeur cationique fort :

3.4.5.2. Technique d’utilisation

3.5. Gel-filtration (ou chromatographie d’exclusion ou tamisage moléculaire)

Variation du volume d’élution en fonction de la

Structure réticulée d’un gel

3.5.2.2. Gels permanents

Diagramme d’élution du mélange

Diagramme d’élution du mélange

Si l’on veut séparer complètement les deux solutés A et B de coefficient de distribution

Schéma d’une colonne en tamisage

3.5.4.1.1. Aspect technologique sommaire

3.5.4.2. Chromatographie sur couche mince

fixation K qui est l’équivalent d’une constante d’équilibre chimique :

Les différentes étapes d’une

3.6.2. Phase stationnaire le gel d’affinité

Schéma d’un gel d’affinité.

 Porter des groupements fonctionnels réactifs permettant la fixation des spacers

CM-cellulose aminohexylique CM-cellulose hydrazide