مهم جدا

Faculté des Sciences de la Département de
Nature et de la Vie Biotechnologie

THESE
Présentée en vue de l’obtention du diplôme de
DOCTORAT
Spécialité : Interaction plante- microorganismes
Option : Microbiologie
Présenté par
Mme BOUCHENTOUF Leila

Intitulé
Rôle et importance des légumineuses alimentaires dans la fixation biologique d’azote.

Etude des BNL associées à Phaseolus vulgaris dans quelques régions de l’Ouest Algérien
Le 15/10/ 2018
Devant le jury composé de :

Présidente Mme FYAD LAMECHE F.Z. Porf. Université Oran 1 Ahmed Ben Bella
Examinateur M. ABDOULWAHID Djamel Eddine Prof. Université Abou Bakr Belkaid, Tlemcen
Examinateur M. DELLAL Abdelkader Prof. Université Ibn Khaldoun, Tiaret
Examinateur M. HASSANI Abdelkrim Prof. Université Ibn Khaldoun, Tiaret
Examinateur M. KIHAL Mabrouk Prof. Université Oran 1 Ahmed Ben Bella
Encadreur M. BEKKI Abdelkader Prof. Université Oran 1 Ahmed Ben Bella
Co-encadreur
Invité
Année universitaire 2017/2018

Remerciements
La réalisation de cette thèse fut une occasion merveilleuse de rencontre et
d’échanges avec de nombreuses personnes. Je ne saurais pas les citer
toutes. Je reconnais que chacune à des degrés divers, mais avec une égale
bienveillance, a apporté une contribution positive à sa finalisation. Mes
dettes de reconnaissance sont, de ce point de vue, énormes à leur égard.
Je remercie Monsieur BEKKI A.E.K., Professeur à l’Université Oran 1
Ahmed Ben Bella, pour avoir bien voulu être le directeur de ma thèse, ses
remarques successives et professionnelles ont permis d’améliorer les
différentes versions de ce travail. Je lui suis reconnaissante pour la
confiance qu’il m’a accordée.
Mes remerciements s’adressent à tous les membres du jury qui ont accepté
d’évaluer ce travail :
A Madame Fyad-Lamèche F.Z., Professeur à l’Université d’Oran 1 Ahmed
Ben Bella qui a bien voulu présidé ce jury.
A Monsieur Abdelwahed D., Professeur à l’Université Abou Bakr Belkaid,
de Tlemcen qui a accepté d’examiner ce travail.
A Monsieur Dellal A., Professeur à l’université Ibn Khaldoun, Tiaret,
d’avoir bien voulu juger ce travail.
A Monsieur Hassani A., Professeur à l’Université Ibn Khaldoun, Tiaret,
d’avoir accepté d’expertiser ce travail.
A Monsieur Kihal M., Professeur à l’Université d’Oran 1 Ahmed Ben
Bella, de me faire l’honneur d’évaluer ce travail.
Mes sincères remerciements s’adressent à toute l’équipe du laboratoire
LBRAP, collègues et étudiants ayant contribué à cette thèse.

Je remercie chaleureusement les membres du laboratoire à IRD-Dakkar
Sénégal, sous l’égide du Professeur Samba Sylla, pour m’avoir accueilli
pour la réalisation de la partie moléculaire, qu’ils trouvent ici l’expression
de ma profonde gratitude ainsi que M. Ndoye I., Diouf D., Rama, Tania et
tout le personnel.
Ma reconnaissance s’exprime également à l’égard de Monsieur Abdi
Mohammed (Sidi Lakhdar, Mostaganem), de Monsieur Benni Abdelnour
(Ain Témouchent), de Monsieur Atif (Directeur de la station ITCMI Hassi
Bounif, Oran), de Monsieur Labdi (Directeur de INRA, Sidi Bel Abbes), de
Monsieur le Directeur du CFPA (Tissemsilt) et de tous les agriculteurs qui
ont permis les essais aux champs. A M. Ghomri B.E.
Je tiens à remercier le professeur Jean-Jacques Drevon pour m'avoir
accueilli au sein de UMR 1222 à INRA Montpellier, pour une expérience
très bénéfique dans le cadre de l’échange scientifique.
Grand merci à tous mes collègues du département de Biotechnologie pour
leur soutient moral et leur encouragements. Trouver ici l’expression de
ma reconnaissance et mon pur dévouement.
Mes remerciements les plus profonds et sincères s’adressent à Mme
Merabet C. Mme Dib et Mme Boukhatem Z.F. ainsi qu’à Mme Ighil-hariz
Z et Melle Kadiri A.
A Mme Staali, M. HASSAINE et M. Dahane
Un remerciement sans égal à toutes celles et tous ceux qui ont fais que ce
travail s’achève.
Liste des tableaux
N° Titre Page
Tableau 1 Consommation humaine de légumineuses par habitant dans le monde……………………… 14
Evolution de la production de légumineuses alimentaires en Algérie durant la période 17
Tableau 2
2011/2015
Tableau 3 La culture du haricot en plein champ………………………………………………………… 23
Tableau 4 Recommandations proposées pour la culture des légumineuses……………………………... 31
Tableau 5 Les BNL associées à Phaseolus vulgaris…………………………………………………….. 37
Tableau 6 Localisation et informations relatives aux sites d’échantillonnage………………………….. 45
Tableau 7 Sites retenus pour les essais aux champs……………………………………………………... 68
Tableau 8 Quelques caractéristiques des graines du haricot (Phaseolus vulgaris) utilisées dans les
essais aux champs….………………………………………………………………………... 70
Tableau 9 Résultats de l’analyse granulométrique………………………………………………………. 76
Tableau 10 Résultats de l’analyse chimique des sols……………………………………………………... 78
Tableau 11 Synthèse des résultats des analyses des échantillons des sols………………………………... 84
Tableau 12 Effet du phosphore sur le nombre de nodule chez l’haricot aux champs…………………….. 85
Tableau 13 Résultat du piégeage en conditions contrôlées……………………………………………….. 89
Tableau 14 Origine des isolats…………………………………….……………………………………... 90
Tableau 15 Les groupes Duncun pour le poids aérien……………………………………………………. 95
Tableau 16 Les groupes Duncun pour le poids racinaire…………………………………………………. 95
Tableau 17 Caractéristiques macroscopiques des isolats…………………………………………………. 97
Tableau 18 Croissance des isolats à différentes concentrations de NaCl…………………………………. 101
Tableau 19 Effet de la température sur les isolats………………………………………………………… 103
Tableau 20 Tolérance aux pHs…………………………………….……………………………………… 104
Tableau 21 Effet des antibiotiques sur la croissance des souches………………………………………… 106
Tableau 22 Métabolisme glucidique des isolats………………………………………………………….. 109
Tableau 23 Dénombrement de la flore bactérienne dans les échantillons de sol…………………………. 122
Tableau 24 Moyennes annuelles totales des températures (T,°C ) et des précipitations (P, mm)………... 124
Tableau 25 Germination des graines dans les sites d’essai……………………………………………….. 128
Tableau 26 Dates relatives aux stades phénologiques de P. vulgaris en culture aux champs……………. 130
Tableau 27 Caractéristiques des plantes aux champs…………………………………………………….. 138
Tableau 28 Les groupes Duncun pour la variable sol…………………………………………………….. 140
Tableau 29 Les groupes Duncun pour la variable variété………………………………………………… 140
Tableau 30 Paramètres des nodules…………………………………….…………………………………. 142
Tableau 31 Les groupes Duncun pour la nodulation……………………………………………………… 149
Tableau 32 Poids enregistrés à la récolte dans les sites Oran, Mostaganem et Ain Témouchent………… 150
Liste des figures
N° Titre Page
Figure 1 Réduction de l’azote atmosphérique N2 sous forme ammoniacale……………………….. 6
Figure 2 Stratégie d’infection chez les Rhizobia……..………………………….…………………. 8
Dendrogramme représentant les relations phylogénétiques de légumineuses
Figure 3 11
Papilionoideae (Zhu et al., 2005) …………………………………………………………
Figure 4 Les trois grands modes d’exploitation des légumineuses…………………………………. 12
Figure 5 Diversité de production au sein des légumineuses à graines……………………………… 12
Figure 6 Production et commerce mondial des légumineuses à graines……………………………. 13
Figure 7 Complémentarité protéique de l’association céréales-légumineuses à graines…………… 15
Figure 8 Classification du haricot…………………………………….…………………………….. 18
Figure 9 Stades phénologiques du haricot………………………………………………………….. 19
Figure 10 Champ de haricot à Oulhaça (Ain Témouchent) …………………………………………. 43
Figure 11 Photos représentant l’état des lieux au champ à Ain Témouchent El Malah……………... 44
Figure 12 Localisation par satellite…………………………………….…………………………….. 46
Figure 13 Géolocalisation des sites d’échantillonnage par wilayat………………………………….. 46
Figure 14 Site d’échantillonnage à Ain Témouchent par commune…………………………………. 47
Figure 15 Fiche technique de la souche……………………………………………………………… 59
Figure 16 Les graines du haricot (Phaseolus vulgaris) utilisés dans les essais aux champs………… 70
Figure 17 Schéma du protocole d’essai……………………………………………………………… 71
Figure 18 Photos de la préparation de la parcelle (a) et de l’exécution du semis (b) à la station……. 72
Figure 19 Aspect des graines germées des différentes variétés de Phaseolus vulgaris……………… 88
Figure 20 Aspect des plantes de Phaseolus vulgaris L. nodulées en milieu hydroponique…………. 92
Figure 21 Valeurs des poids sec des parties aériennes………………………………………………. 93
Figure 22 Valeurs des poids sec des parties racinaires………………………………………………. 94
Aspect macroscopique de la souche Rhizobium tropici (CIAT 899), IH5 et IH4 sur
Figure 23 97
milieu YEM solide…………………………………….…………………………………..
Figure 24 Caractéristiques distinctives des BNL…………………………………………………….. 98
Figure 25 Aspect microscopique des isolats IH9 et IH19 après coloration de Gram (Gr × 1000) …. 99
Figure 26 Croissance des isolats en milieu YEM liquide……………………………………………. 100
Figure 27 Effet des antibiotiques sur la croissance des souches……………………………………... 107
Figure 28 Métabolisme glucidique…………………..………………………………………………. 110
Figure 29 Phénodendrogramme des souches………………………………………………………… 111
Figure 30 Différents profils électrophorétiques de restriction par HaeIII et MspI sur gel d’agarose... 114
Figure 31 Dendrogramme des profils de la digestion par HaeIII……………………………………. 116
Figure 32 Dendrogramme des profils de la digestion par MspI……………………………………… 117
Figure 34 Développement de l’essai dans la station de Hassi Bounif.………………………………. 131
Figure 35 Développement de l’essai dans la station de Oulhaça.……………………………………. 131
Figure 36 Développement de l’essai dans la station d’El Malah.……………………………………. 132
Figure 37 Développement de l’essai dans la station de Sidi Bel Abbès……………………………... 132
Figure 38 Développement de l’essai dans la station de Tissemsilt..………………………………… 132
Figure 39 Moyenne PSA en fonction des variétés…………………………………………………… 133
Figure 40 Moyenne PSA en fonction des régions……………………………………………………. 134
Figure 41 Moyenne PSR en fonction des variétés…………………………………………………… 135
Figure 42 Moyenne PSR en fonction des régions……………………………………………………. 135
Figure 43 Moyenne PSA/PSR en fonction des variétés……………………………………………… 136
Figure 44 Moyenne PSA/PSR en fonction des régions……………………………………………… 136
Figure 45 Moyenne de la hauteur de tige en fonction des variétés…………………………………... 139
Figure 46 Moyenne de la hauteur de tige en fonction des régions…………………………………… 139
Figure 47 Variété 104 cultivé dans le sol de Oulhaça………………………………………………... 144
Figure 48 Variété 104 cultivé dans le sol de Sidi Bel Abbès………………………………………… 144
Figure 49 Variété 29 cultivé dans le sol de Tissemsilt……………………………………………….. 145
Figure 50 Aspects racinaires de P. vulgaris en culture aux champs…………………………………. 147
Figure 51 Moyenne nombre de nodules en fonction des variétés……………………………………. 149
Figure 52 Moyenne nombre de nodules en fonction des régions…………………………………….. 149
Figure 53 Moyenne des poids des graines à la récolte en fonction des variétés……………………... 153
Figure 54 Moyenne des poids des graines à la récolte en fonction des trois zones de culture.……… 153
ABREVIATIONS
BNL : Bactéries nodulant les légumineuses
ATP: Adénosine Triphosphate.
CIAT: Centre International d'Agriculture Tropicale.
EAPR : Efficacité d’acquisition du P par les racines.
EUN: Efficacité d’utilisation de l’azote.
EUP: Efficacité d’utilisation du phosphore.
EUSR : Efficacité d’utilisation de la symbiose rhizobienne.
FAO : Organisation des nations unies pour l’alimentation et l’agriculture.
FSN: Fixation symbiotique de l'azote.
N: Azote.
C : Carbone
MO : Matière Organique
P: Phosphore.
YEM : yeast extract mannitol
RILs : Recombinant inbred lines
qx/ ha : quintaux/ hectare
PCR : Polymerase Chain Reaction
RFLP : Restriction fragment lenght polymorphisme
PGPR :Plante Growth Promoting Rhizobacteria

Table des matières
Introduction
1. Introduction ………………….………………………………………………………………….. 1
2. Situation actuelle………………….………………….………………………………………….. 2
3. Les objectifs de la thèse……………………..……………..…………………………………….. 4
1. Etude bibliographique
1.1. La symbiose Rhizobia- légumineuses……………………………………………………………..... 6
1.1.1 Etablissement de la symbiose fixatrice de l’azote………..…………………………………….. 6
1.1.2. Les étapes de la nodulation…………………………………………………………………….. 7
1.1.3. Spécificité symbiotique………………………………….…………………………………….. 8
1.1.4. Importance de la symbiose Rhizobia-légumineuses……………...……………………..……… 9
1.1.5. Le métabolisme de la fixation d’azote………………………………………...……………….. 9
1.1.6. Performances symbiotiques……………………………………………………………………. 10
1.1.7. Rôle de la rhizosphère dans la fixation symbiotique de l’azote……………………………….. 10
1.2. Les légumineuses……………………………………………………………………………………. 10
1.2.1. Principaux pays producteurs du haricot dans le monde……………………………………….. 13
1.2.2. Consommation des légumineuses à graines dans le monde…………………………………… 13
1.2.3. Les légumineuses alimentaires en Algérie………………………………………...…………… 15
1.2.3.1. Importance des légumineuses alimentaires en Algérie…………………………………….. 16
1.2.3.2. Le haricot………………………………………..………………………………………….. 17
1.2.3.2.1. Description morphologique et botanique……….………………………………………... 18
1.2.3.2.2. Classification et variétés………………………………………………………………….. 19
1.2.3.2.3. Organismes de recherche pour la culture du haricot……………………………………... 20
1.2.3.2.4. Culture du haricot en Algérie………………………………………………...…………... 21
1.2.3.2.5. La culture du haricot en plein champ…………………………………………………….. 23
1.2.3.2.5.1. Les exigences du milieu……………………………………………………………... 24
1.2.3.2.5.2. Condition de culture du haricot………………………………………….................... 24
1.2.3.2.5.3. Facteurs de l’environnement………………………………………………………… 24
1.2.3.2.5.4. Effet de la pluviométrie sur la croissance……………………………………………. 25
1.3. Aspect biotechnologique de la fixation d’azote…………………………………………................... 25
1.3.1. Importance de l’azote et du phosphore pour Phaseolus vulgaris ……………………………… 26
1.3.2. Nutrition azotée chez le haricot……………………………………………………................... 27
1.3.3. Potentiel fixateur d’azote du haricot…………………………………………………………… 27
1.3.4. Effet du phosphore et du potassium sur la symbiose…………………………………………... 28
1.3.5. Effet du stress salin sur la symbiose……………………………………………….................... 29
1.3.6. Efficacité d’utilisation du phosphore pour la FSN………………………………….................. 30
1.4. Les bactéries nodulant les légumineuses BNL……………………………………………................. 33
1.4.1. Principales caractéristiques..……………………………………………………….................... 33
1.4.2. Evolution taxonomique des rhizobiums.………………..……………………………………… 34
1.4.3. Diversité des BNL nodulant Phaseolus vulgaris………………………….……….................... 35
1.4.4. Mode d’infection chez Phaseolus vulgaris …………………………………………………………. 37
1.4.5. Gènes symbiotiques et phylogénie…………………………………………………………….. 38
1.4.6. Méthodes appliquées à l’étude de la diversité des BNL……………………………………….. 38
1.4.6.1. Méthodes phénotypiques …………………………………………………………………... 38
1.4.6.2. Méthodes génotypiques…………………………………………………………………….. 39
1.4.6.2.1 L’amplification in vitro de l’ADN………………………………………………………... 40
1.4.6.2.1.1. Principe de la PCR…………………………………………………………………… 40
1.4.6.2.1.2. Technique de la RFLP…………………………………………………….................. 40
1.4.6.2.2. Collection génomique.…………………………………………………………………… 41
1.4.7. Conservation du matériel biologique.………………………………………………………….. 41
2. Matériel et méthodes
2.1. Etats des lieux, prospections et choix de l’agroécosystème…………………………….…………… 43
2.2. Echantillonnage……………………………………………………………………………………… 45
2.3. Analyses physico-chimiques des sols……………………………………………………………….. 48
2.3.1. Analyses granulométriques….………………………………………………………….……… 48
2.3.2. Mesure du pH…………………………………………………………………..……………… 48
2.3.3. Détermination de la conductivité électrique…………………………..……………………….. 48
2.3.4. Dosage du calcaire total……………………………………..………………………………..... 49
2.3.5. Dosage du calcaire actif…………………...…………………………………………………… 50
2.3.6. Dosage du phosphore assimilable………………….…………………………………………... 51
Table des matières
2.3.7. Dosage du carbone total et de la matière organique…….………………………………..……. 51

2.3.8. Dosage de l’azote………………………………………………………………………………. 52
2.4. Collecte des nodules in natura……………………………….……………………………..……….. 54
2.5. Piégeage des rhizobia…………………………………………………...…………………..……….. 54
2.5.1. Préparation des graines……………………………………………………..………..………… 54
2.5.2. Culture en pots……………………………………………………………………….………… 54
2.5.3. Prélèvement des plantes……………………………………………………………...………… 55
2.5.4. Conservation des nodules……………………………………………………………………… 55
2.6. Isolement des bactéries à partir des nodules………………………………………………..………... 55
2.6.1. Stérilisation des nodules……………………………………………………………………….. 55
2.6.2. Isolement des bactéries………………………………………………………………………… 56
2.7. Purification des isolats……………………………………………………………………………….. 56
2.8. Détermination de quelques caractéristiques des isolats…………………………………….………... 56
2.8.1. Etude macroscopique……………………………………………………………….………….. 57
2.8.2. Etude microscopique………………………………………………………………..………..... 57
2.8.3. Caractéristiques distinctives des BNL……………………………………………..................... 57
2.8.4. Absorption du rouge Congo…………………………………………………………………… 57
2.8.5. Vitesse de croissance …….……………………………………………………….....……….... 57
2.8.6. Test mannitol- mobilité……..………………………………………………………...……….. 57
2.9. Mise en collection………………………….……………………………………………….………... 58
2.9.1. Vérification de la pureté des souches………………………………………………..………… 58
2.9.2. Conservation des isolats purs………………………………………………………..…………. 58
2.10. Etude physiologique………………………………………………………………………………... 60
2.10.1 Croissance en milieu YEM liquide………………………………………………………….... 60
2.10.2. Effet de la température…..…………………………………………………………………… 60
2.10.3 Croissance à différents pH…………………………………………………………………...... 60
2.10.4. Métabolisme glucidique………………………………………………………….................... 60
2.10.5. Effets des différents antibiotiques………………………………………………….………… 60
2.10.6. Solubilisation du phosphate………………………………………………………...………… 61
2.11. Test de nodulation………………………………………………………………………………….. 61
2.11.1. Préparation des graines………………………………………………………….…………..... 61
2.11.2. Préparation des suspensions bactériennes………………………………….………………… 61
2.11.3. Mise en place des plantules et inoculation………………………………………....………… 61
2.11.4. Estimation de la croissance des plantes………………………………………….…………… 62
2.11.4.1. Phénotype des plantes……………………………………………………………………... 62
2.11.4.2. Partie aérienne….……………………………...………………………………................. 62
2.11.4.3. Partie racinaire……………………………………………………………………………. 62
2.11.4.4. Analyse statistique…………………………………………………………........................ 63
2.12. Etude génotypique...………………………………………………………………………………... 63
2.12.1. Aseptisation des nodules…………………………………………………………...………… 63
2.12.2. Extraction et purification des l’ADN nodulaire…………………………………………........ 63
2.12.2.1. Extraction de l’ADN de nodules avec GES………………………………………………. 63
2.12.2.2. Contrôle de l’ADN total extrait…………………………………………………………... 64
2.12.3. Amplification de l’ADN……………………………………………………………………… 64
2.12.3.1. Amplification de l’ADN par PCR..…..……………………………………….…………... 64
2.12.3.2. Amplification de l’espace intergénique IGS……………………………………………… 65
2.12.3.3. Contrôle du succès des amplifications……………….…………………………………… 65
2.12.4. Analyse des fragments de restriction de l’ADN amplifié…………………………………….. 65
2.12.4.1. Digestion enzymatique…………………………………………………………................. 65
2.12.4.2. Analyse des profils RFLP…………………………………………………………………. 66
2.13. Essais aux champs…..……………………………………………………………………………… 66
2.13.1. Principe et objectif de l’expérimentation. ……………………………………………………. 66
2.13.2. Description des sites expérimentaux………………………………………………...………... 67
2.13.3 Dénombrement des populations natives……………………………………………..………... 69
2.13.4. Cultivars testés …………………………………………………………………….................. 69
2.13.5. Protocole d’essai………………………………………………………………………………. 71
2.13.6. Mise en place des essais.……………………………………………………………..……….. 72
2.13.7. Observation et notation.……………………………………………………………………..... 72
2.13.8. Récolte des plantes et paramètres mesurés……………………………………………………. 73
Table des matières
2.13.9. Conservation des nodules.…………………………………………………………………..... 73

2.13.10. Analyses statistiques………………………………………………………………………… 73
2.14. Estimation du rendement…………………………………………………………………………… 73
3. Résultats et discussion
Partie 1 : Diversité des BNL associées à Phaseolus vulgaris dans l’Ouest Algérien
3.1. Résultats des analyses physico-chimiques des sols…...……………………………………………... 75

3.1.1 La granulométrie………………………………………………………………………………... 75
3.1.2. L’analyse chimique…………………………………………………………………………...... 77
3.2. Piégeage des rhizobia..………………………………………………………………………………. 88
3.2.1. Germination des graines……………………………………………………………………….. 88
3.2.2. Paramètres de croissance……………………………………………………………………..... 88
3.3. Distribution des isolats………………………………………………………………………………. 90
3.4. Test de nodulation…………………………………………………………………………………… 91
3.4.1. Infectivité des souches isolées………………………………………………………………..... 92
3.4.2. Performances symbiotiques …………………………………………………………………… 93
3.5. Eude des isolats……………………………………………………………………………………… 96
3.5.1. Caractéristiques macroscopique……………………………………………………………….. 96
3.5.2. Absorption du rouge Congo…….…………………………………………………………..….. 98
3.5.3. Vitesse de croissance…..………………………………………………………………………. 98
3.5.4. Caractéristiques microscopiques……………………………………………………………..... 98
3.5.5. Estimation de la croissance en milieu YEM liquide…………………………………………… 100
3.5.6. Effet de la salinité …………………………………………………………………................... 101
3.5.7. Effet de la température………………………………………………………………………… 102
3.5.8. Tolérance aux pHs……………………………………………………………………………… 103
3.5.9. Résistance intrinsèque aux antibiotiques……………………………………………………..... 105
3.5.10. Solubilisation du phosphate…………………………………………………………………… 107
3.5.11. Métabolisme glucidique………………………………………………………….…………… 108
3.5.12. Analyse numérique…………………………………………………………………………… 110
3.6. Caractérisation génotypiques des isolats…………………………………………………………….. 112
3.6.1. Amplification de l’ADN……………………………………………………………………….. 112
3.6.2. Profils de restriction de la région IGS 16S-23S de l’ADNr…………………………………… 113
3.6.3. Analyse numérique…………………………………………………………………………….. 114
3.7. Conclusion partielle.………………………………………………………………………………… 119
Partie 2 : Etude du comportement des variétés de Phaseolus vulgaris aux champs
3.1. Dénombrement des populations natives de chaque échantillon de sol…..…………………………... 122

3.2. Mise en place des essais…………………………………………………….……………………….. 123
3.3. Données climatiques des stations expérimentales……………………………………………..…...... 124
3.4. Observation et notation ……………………………………………………………………………… 127
3.5. Estimation de la nodulation……………….…………………………………………………………. 141
3.6. Rendement à la récolte ………….……………..……………………………………………………. 150
3.7. Conclusion partielle..………………………………………………………………………………... 154
4. Conclusion générale et perspectives
4. Conclusion générale et perspectives……………………………………………………….................... 156

5. Références bibliographiques
5. Références bibliographiques………………………………………………………………………..…. 159

6. Annexes………………………………………………………………………………………………...
Introduction
Introduction
1. Introduction
La planète a des ressources encore abondantes qui peuvent être exploitées moyennant de
nouvelles technologies par exemple l’azote de l’air, dès lors qu’il peut être gratuitement
transformé en azote assimilable par les plantes (via les bactéries) ; il constitue une source
d’engrais immensément abondante à la condition de la conférer à beaucoup de plantes (Griffon,
2006).
L'azote est un constituant essentiel des acides aminés et des protéines, il est par conséquent un
élément minéral nécessaire pour tout organisme vivant. Il représente 78 % des constituants de
l’air et constitue en agriculture, après l’eau, le principal facteur limitant la croissance de la
plante qui ne peut l'utiliser que sous forme combinée (nitrate, ammoniaque ou urée) (Duhoux et
Nicole, 2004). Ce processus est sous la dépendance de certains organismes procaryotes
(bactéries et cyanobactéries) capables de réduire l'azote (N2) grâce au complexe enzymatique
nitrogénasique qu'ils renferment (Cleland et Harpole, 2010). Ce processus est appelé Fixation
Biologique de l'Azote (FBA). La FBA représente environ 108 tonnes N2 par an dans le cycle
biologique de l'azote, soit la moitié de la fixation totale de N2 sur terre (Ollivier et al., 2011).
Le caractère de fixation symbiotique de l’azote dont bénéficient les légumineuses alimentaires
est une composante essentielle des systèmes culturaux. Malheureusement, ces plantes se
caractérisent très souvent par des rendements faibles et instables, cela s’explique en particulier,
par leur sensibilité aux maladies et autres contraintes abiotiques (froid, chaleur, sols pauvres)
(FAO, 2011) ; et même par des contraintes socio-économiques (coût élevé des moyens de
production et des engrais chimiques).
Dans le cas précis du haricot (Phaseolus vulgaris), une légumineuse qui s'associe aux bactéries
du genre Rhizobium, la FBA revêt un intérêt particulier car elle offre une alternative à l'emploi
des engrais azotés trop coûteux et très polluants pour les eaux souterraines (Ollivier et al.,
2011). Cette fixation biologique de l’azote contribue approximativement à 16 % de l’apport
total d’azote dans les terres cultivées (Ollivier et al., 2011) .
Le haricot constitue un aliment de base en Amérique du sud, en Afrique et en Chine (CGIAR,

2012). Sa consommation est liée à sa forte teneur en protéines (25 %) ; pour certains pays, le
haricot est une culture de rente (Ribeiro et al., 2015). Au Sénégal par exemple, 80 % de la
récolte est exporté vers les pays d'Europe du nord qui fournissent aux producteurs les intrants
1
Introduction
agricoles nécessaires: semences enrobées de fongicides, engrais, produits phytosanitaires

(Guene, 2002).
L’Algérie comme beaucoup de pays en voie de développement, attribue une place de choix à
cette culture, et elle est plus ou moins répandue en sec et en frais dans plusieurs régions de
notre pays (ITCMI, 2010). Le haricot est un légume bien apprécié et recherché sur une longue
période de l’année, c’est pourquoi les agronomes estiment qu’on doit augmenter la production
d’autant plus que les conditions climatiques et pédologiques, surtout dans les régions littorales,
sont très favorables pour une culture rentable (Alkama, 2010). Une amélioration de la culture et
l’introduction de nouvelles variétés productives peuvent contribuer à une augmentation rapide
des rendements.
La symbiose mutuelle, d’importance agronomique et économique qui s’effectue entre les

légumineuses alimentaires et les rhizobia, nécessite la formation de nodules infectifs et
efficients, organe spécialisé sur les racines des plantes (Masson-Boivin et al., 2009). La
formation de ces nodules fixateurs est le résultat d’évènements consécutifs entre les deux
partenaires et résultant d’une communication moléculaire intensive entre la plante et la bactérie
et qui peut être très spécifique où à large spectre (Berrada et Fikri-Benbrahim, 2014).
L’étude de cette symbiose passe obligatoirement par l’étude des Bactéries Nodulant les
Légumineuses BNL (Heulin, 2014) qui constituent actuellement, un sujet d’intérêt pour les
chercheurs dans le monde en général et en Algérie en particulier (Tlemsani, 2006 ; Benadis,
2015) ; aussi des collections intéressantes ont été constituées par différents groupes, enrichies et
maintenues, voir même comparées et confrontées aux collections internationales de références,
ce qui a pu révéler leur valeur, originalité et performances. Cependant, elles restent mal
valorisées et peu connues des communautés scientifiques internationales par manque d'études
complètes, d'analyses fines et de publications.
2. Situation actuelle
Le territoire algérien couvre deux types de régions : une zone saharienne dominante (84 % du
territoire) et une zone côtière (16 %). L’agriculture est surtout concentrée dans la région nord
du pays où l’on trouve les meilleures terres et les conditions climatiques les plus favorables. La
surface des terres agricoles est de 20 % de la superficie totale du pays soit à peu près 47
millions d’hectares, dont 8 millions d’hectares de surface agricole utile (S.A.U.), 32 millions
d’hectares de parcours et 7 millions d’hectares de forêt (M.A.D.R., 2012). La surface irriguée
ne représente que 7 % de la SAU. Les principales cultures algériennes sont les céréales (33 %),
2
Introduction
l’arboriculture (6 %), les fourrages (6 %) et les cultures maraîchères (3 %) et le pays est très
dépendant des importations pour les produits de base (céréales, légumes secs, lait, oléagineux,
alimentation fourragère) (FAO, 2012). Ajoutez à cela la diminution des S.A.U. qui est passée
de 0,80 ha/ habitant en 1962 à 0,20 en 2010 (FAOSTAT, 2011), une régression qui ne cesse de
progresser faisant de l’Algérie le pays le moins doté en sols agricoles de tout le sud de la
Méditerranée, en plus, les risques érosifs très élevés qui font que l’Algérie est classée parmi les
pays aux sols les plus érodibles du monde (Touaibia, 2010). Les ressources en eau et en sol
sont sérieusement menacées. Ressources vitales et de production, ils connaissent actuellement
une dégradation en matière de quantité et de qualité (Touaibia, 2010). Les déficits de
pluviométrie, la fréquence et l’intensité des sécheresses et les pluies torrentielles accélèrent de
plus en plus le stress hydrique. Les conséquences ne cessent de s’amplifier et se traduisent par
un épuisement des ressources en eau et en sol et par l’aggravation des problèmes
environnementaux.
L’Algérie recèle, également, d’un milieu naturel très diversifié mais en matière agricole, elle
n'est pas autosuffisante et accuse chaque année un déficit important. Face aux besoins d'une
démographie galopante et d'une urbanisation rapide, se pose la question cruciale d'une gestion
durable des ressources naturelles en agriculture (Belaid, 2016). Actuellement, l’agriculture est
l’une des priorités du gouvernement qui a lancé depuis l’année 2000 le PNDA (Plan National
de Développement de l'Agriculture) et a accordé diverses subventions pour sa modernisation et
bien que les légumineuses alimentaires cultivées aient bénéficié de quelques programmes de
développement, la production agricole en légumes secs n’a pas connu l’amélioration
escomptée. Les raisons de cette situation sont d’ordre technique, socioéconomique et climatique
(Tlemsani, 2006). Un atelier national important et portant sur “Les enjeux et perspective du
compost en Algérie” a été initié à Oran (24-25 Décembre, 2015), par le bureau R20 MED,
regroupant de nombreux intervenants du secteur de l’agriculture, les directions de
l’environnement, des universitaires et des collectivités locales, au-delà de l’idée d’agir pour la
promotion d’une économie verte et d’amener le monde de l’agriculture à se tourner vers des
solutions durables (Journal Ouest Tribune Oran, 2015). L’aggravation de la pauvreté des sols
en Algérie ainsi que leur perte en fertilité organique fait par conséquent qu’il y a moins de 0,5
% de matière organique par hectare, seuil en deçà duquel le sol n’est plus considéré comme
agricole. Il y a bien urgence à penser à une autre agriculture pour notre pays.e
Dans le bassin méditerranéen, la symbiose Rhizobium-légumineuse alimentaires (Drevon et al.,

2003) est l’une des composantes les plus importantes des agrosystèmes ; cette symbiose peut,
3
Introduction
lorsqu’elle fonctionne bien, assurer une nutrition azotée adéquate aux plantes et garantir une
production convenable. Malheureusement, en Algérie ce processus naturel est affecté par
plusieurs contraintes parmi lesquels le stress hydrique (Cesar et al., 2011), le stress salin
(Bekki et al., 1987) et les variations de température (Merabet et al., 2006 ; Boulila et al., 2009
; Amrani et al., 2010 ; Boukhatem et al., 2012).
L'intérêt manifesté pour l'étude microbiologique de ce biotope a été motivé par plusieurs
facteurs : La facilité relative de l'isolement des microorganismes de la rhizosphère et des
nodules, les conditions climatiques de notre pays et leurs conséquences néfastes sur les
rendements des cultures de base (l’Algérie étant sous influence méditerranéenne et ses régions
Sud sont sous climats aride et semi-aride), la variabilité des sols en Algérie, leur dégradation
par la désertification et la progression du désert et les problèmes de la déforestation (Nehila et
al., 2016). Ainsi, conscients de ces différents problèmes et encouragés, malgré le manque de
moyens, les agronomes et les chercheurs académiques se sont attaqués essentiellement à deux
aspects: L'amélioration des rendements des cultures vivrières en particulier les légumineuses à
graines comme la fève (Ouslim et al., 2015), le pois-chiche (Mohamed Smain, 2015), le
haricot (Benadis, 2015), la lentille (Riah, 2014) et les légumineuses fourragères (la luzerne, le
trèfle) par le biais de l'inoculation par les bactéries symbiotiques fixatrices d'azote (Rhizobium )
(Merabet et al., 2010). Le progrès des connaissances et des approches dans ce domaine ont
conduit les chercheurs à tenir compte de la nature des sols et des conditions climatiques
régionales, ce qui a ouvert la voie fondamentale et appliquée de l'étude de la variabilité des
isolats et la sélection des souches performantes dans des conditions précises, ceci, s’est traduit
par la multiplication et la constitution de collections microbiennes importantes et diversifiées
(Gilling et Holmes, 2004) . Cependant, en dépit des expériences claires et convaincantes
menées dans différents laboratoires et dans des conditions de culture contrôlées (chambres de
culture et serres), les expériences conduites notamment par les inoculations aux champs, par des
souches de collections introduites ou par des souches locales sélectionnées, ne sont pas
concluantes pour l'instant (Benadis, 2015 ; Ouslim et al., 2015). Les mécanismes d'interactions
avec la microflore indigène et avec les constituants d'un sol donné, restent à élucider pour
optimiser et maîtriser ces inoculations. Les expériences menées au laboratoire jusqu'à ces
derniers jours ont permis d'établir que l'inoculation doit être effectuée avec des souches
adaptées, isolées de sols de la région et sélectionnées pour leurs performances (Merabet, 2007 ;
Boukhatem, 2012).
4
Introduction
3. Les objectifs de la thèse
Le présent travail s’intègre dans le cadre de la sélection de couples symbiotiques performants

haricot- rhizobia, vu son importance sur l’ensemble du bassin méditerranéen.
Les objectifs spécifiques visés lors de ce travail sont: la sélection des souches de rhizobia
indigènes à haut potentiel fixateur d’azote et aptes à induire la nodulation du haricot dans des
conditions de contraintes climatiques et édaphiques, l’évaluation, dans les conditions de culture
contrôlées du haricot, des performances symbiotiques des souches sélectionnées et l’étude
microbiologique, physiologique et génotypique partielle (par PCR-RFLP) de la biodiversité de
la collection de souches obtenues à partir des différentes régions de culture du haricot dans
l’Ouest Algérien.
Dans une seconde étape, vérifier si la biodisponibilité du phosphore affecte la nodulation et la

croissance N2 dépendante de la légumineuse par l’expression du contraste entre les lignées du
haricot (locale blanche et les Rils colorées), selon les dispositifs expérimentaux du FABAMED
(Groupe Coopératif de Recherche sur les légumineuses dans le Bassin Méditerranéen). Ceci
permettrait d’identifier des sols où l’offre du phosphore serait limitante pour la croissance du
haricot, voire des céréales associées comme il a était testé sur le blé en Camargue ou en rotation
avec le blé en Lauragais (Drevon et al., 2003), à Mateur en Tunisie, ou le maïs à Unai au Brésil
(Drevon et al, 2001). A l’Ouest de l’Algérie les essais comparatifs sur terrains (aux champs),
sont conduits afin d’estimer la nodulation des variétés étudiées et d’évaluer leur comportement
dans des conditions climatiques et édaphiques différentes ; en adoptant parfois une approche
participative des agriculteurs, les essais sont réalisés dans différents sites expérimentaux dans
les wilayas de Mostaganem, Oran, Ain Témouchent, Tissemsilt et Sidi Bel Abbes.
L’autre objectif est d’obtenir une variété combinant une bonne adaptation aux contraintes de
production, un rendement suffisamment élevé et des graines de qualité, associé à une symbiose
rhizobienne efficace pour la nutrition azotée, ainsi qu’une Efficacité d’Utilisation du Phosphore
(EUP) en vue d’économiser la fertilisation minérale et de diminuer les risques de pollution qui
y sont associés.
5
1. Analyse bibliographique
1.1. La symbiose Rhizobia-légumineuses
La symbiose fixatrice d’azote est un processus complexe déterminé par deux partenaires, cette
association est à bénéfice réciproque entre la légumineuse et les bactéries du sol appelées rhizobia.
L’un des systèmes les plus étudiés est celui associant les bactéries rhizobiales avec les
légumineuses (Patriarca et al., 2004 ; Gage, 2004; Stacey et al., 2006), car la plus grande partie
des légumineuses (88 % des espèces étudiées) interagissent avec les bactéries du genre Rhizobium
pour former des nodules fixateurs d'azote (de Faria et al., 1989).
La biogéographie explique la distribution actuelle des organismes vivants, de point de vue de

facteurs historiques et écologique, surtout concernant les légumineuses à large distribution (Doyle
et Luckow, 2003). Les familles des légumineuses fixatrices d’azote ne semblent pas partager un
ancêtre commun, le phénomène de nodulation est certainement apparu tout à fait indépendamment
parmi et même à l’intérieur de certaines familles (Duhoux et Nicole, 2004).
1.1.1. Etablissement de la symbiose fixatrice de l’azote

Le nodule est le résultat de l’infection des racines des légumineuses par les bactéries de la famille
des Rhizobiacées. Par ce dernier, la plante-hôte offre un micro habitat exceptionnellement
favorable à la bactérie tout en lui procurant des substrats carbonés provenant de la photosynthèse
(Duhoux et Nicole, 2004). Le processus de la fixation, lui-même, consiste en une réduction de
l’azote atmosphérique N2 sous forme ammoniacale (Figure 1). Cette réaction est catalysée par un
complexe enzymatique appelé Nitrogénase (Downie, 2005).
Nodules
Nitrogénase
Figure 1: Réduction de l’azote atmosphérique N2 sous forme ammoniacale

(d’après Rosenberg, 1997 et Masson-Boivin et al., 2009)
6
1.1.2. Les étapes de la nodulation
Le site de fixation symbiotique est le nodule ; le seul organe localisé sur la racine qui présente un
intérêt important pour le fonctionnement, la survie des bactéries et l’activité de la Nitrogénase
(Martinez-Romero et al., 2010). La formation des nodules (Figure 2) est le résultat d’un
dialogue moléculaire entre le microsymbiote et la plante-hôte (Foucher et Kondorosi, 2000;
Limpens et Bisseling, 2003). L’interaction commence avec la colonisation de jeunes poils
absorbants par les rhizobia et un échange d’un signale moléculaire. De leurs côtés, les bactéries
reconnaissent des flavonoïdes qui sont sécrétées par la plante- hôte, ces molécules induisent la
production de facteurs NOD par les rhizobia qui agissent essentiellement sur deux types de
cellules au niveau de la racine (cellules épidermiques et cellules corticales) (Oldroyd, 2001).
Au niveau des cellules épidermiques et grâce à une communication cellulaire par les flavonoïdes
ou les bétaines (Gage, 2004), les facteurs NOD qui sont exprimés par les gènes nod (les gènes les
plus étudiés), induisent une dépolarisation de la membrane plasmique, une induction de
l’expression de gènes spécifiques et une modification de la croissance polaire des poils absorbants
formant une structure dite en «crosse de berger» qui enferme les rhizobia (Esseling et al., 2003).
Donc la structure spécifique des facteurs NOD produits par chaque espèce de rhizobbium, sert
comme signal permettent la reconnaissance de la présence de la bactérie par sa plante hôte.
A partir de cette niche, les rhizobia pénètrent la cellule végétale par la formation d’un cordon
d’infection qui traverse d’abord le poil absorbant et se ramifie ensuite dans les cellules corticales
guidant ainsi les bactéries vers les couches cellulaires intérieures (Gage, 2004).
Simultanément à l’infection des poils absorbants, certaines cellules du cortex interne se

différencient et se divisent à plusieurs reprises, formant un primordium nodulaire. Elles sont alors
envahies par des rhizobia qui sont relâchés dans des cordons d’infection (Cermola et al., 2000 ;
Brewin, 2004).
Finalement, les cellules végétales infectées et les bactéries infectantes se différencient en cellules
capables de fixer et d’assimiler l’azote. La structure nouvellement formée, qui est composée des
bactéries différenciées en bactéroïdes enfermées dans une membrane de cellules de la plante,
s'appelle un symbiosome (Emerich et Krishnan, 2014).
7
Figure 2: Stratégie d’infection par les Rhizobia

(www.semencesdefrance.com)
Selon Masson-Boivin et al. (2009), dans l'interaction entre la plante- hôte et le rhizobium, les
composés phénoliques (flavonoïdes, chémo- attracteurs) exsudés par la plante- hôte entraînent
chez la bactérie la production de lipo-oligosaccharides spécifiques dénommés les facteurs Nod. Ce
sont des signaux moléculaires qui déclenchent la division des cellules corticales de la racine
conduisant à la formation d'un nouvel organe différencié chez la plante, le nodule ou nodosité. Il
existe deux types de nodules : des nodules déterminés et des nodules indéterminés. Les nodules
déterminés sont issus de l'auxèse des cellules du méristème apical qui cesse son activité à
maturation de la nodosité. Les nodules indéterminés sont issus de mérèses du méristème apical
persistant qui leur confère une croissance longitudinale. Le nodule du haricot est de type
déterminé (Amarger et al., 1997).
1.1.3 Spécificité symbiotique

L’une des caractéristiques majeures des associations rhizobium-légumineuses est leur spécificité
d’hôte. En effet, une espèce de rhizobium donnée n’est capable, en général, d’établir une relation
symbiotique efficace qu’avec un nombre limité de partenaires végétaux (Halbleib et Ludden,
2000). De même une espèce de légumineuse ne peut être nodulée que par un certain nombre
d’espèces de rhizobium (Tilak et al., 2005).
8
Cette spécificité est basée sur une communication moléculaire, c'est-à-dire un échange de signaux
des partenaires symbiotiques (Masson-Boivin et al., 2009).
1.1.4. Importance de la symbiose rhizobium-légumineuses

Grâce à leur aptitude d’établir une symbiose avec des bactéries du sol (rhizobium), les
légumineuses ne nécessitent pas l'apport d'engrais azotés ; la production de ces dernières demande
beaucoup d’énergie (Merabet, 2007). À ce propos, il est à signaler que l'énergie nécessaire à la
production chimique d'une tonne d'engrais azotés par l'industrie est évaluée à 2,5 tonnes de pétrole
(Lazrek-Ben Friha, 2008). Ce qui fait que le coût d'engrais azotés ne cesse d’augmenter
proportionnellement au prix du pétrole, raison pour laquelle l’association rhizobium-légumineuses
pourrait remplacer efficacement les engrais azotés chimiques à la fois très onéreux et polluants
(Denman et al., 2007).
D’autre part, la symbiose rhizobium-légumineuses est considérée comme une voie pour améliorer
les rendements des cultures vivrières en particulier les légumineuses à grains (fève, haricot,
lentille).
1.1.5. Le métabolisme de la fixation d'azote

Dans la symbiose fixatrice d'azote, chacun des deux symbiontes constitue pour l'autre une source
d'un élément clef de leur métabolisme (Bekki et al., 1987): l'azote moléculaire réduit par les
bactéroïdes est assimilé dans les cellules de la plante- hôte et exporté aux autres organes de la
plante par le flux xylémien en échange de photosynthétats acheminés sous forme essentiellement
d'acide dicarboxylique (Gage,2004). La plante fournit en outre un micro environnement très
particulier nécessaire à la fixation et synthétise les enzymes permettant l'assimilation rapide de
l'ammoniaque produit (Rees et Howard, 2000). Pour se faire, les BNL activent la nitrogénase qui
est un complexe enzymatique à deux composants: la dinitrogénase du composant l, protéine
tétramérique de 200 à 270 kd suivant les microorganismes et la dinitrogénase réductase ou
composant II, ferroprotéine dimérique d'environ 65 kd. Cette dernière porte un cofacteur
peptidométallique : le FeMoCo, qui est le site actif de la réduction de N2 en NH (Félix et al.,
1981 ; Ribet et Drevon, 1995 ; Bacha et Ounane, 2003).
La fixation de l’azote est un processus très couteux en énergie ce qui impose une régulation. La
transcription des gènes nif est réprimée par l’ammonium et aussi par le dioxygène (Downie,
2005), qui rend la fixation impossible en inactivant la nitrogénase (Halbleib et Ludden, 2000). Le
complexe nitrogénase le plus étudié comprend deux composantes métalloprotéiques : une
9
ferroprotéine (protéine Fe) et une ferro-molibdo-protéine (protéine FeMo). Les gènes qui codent
ces deux protéines et les autres protéines nécessaires à la réaction ou à sa régulation sont groupés
sur un même opéron appelé nif (pour Nitrogen fixation). La protéine FeMo est un tétramère de
230 kDa codé par les gènes nifD et nifK (Merabet et al., 2010). Elle contient le site réducteur du
substrat. La protéine Fe est un homodimère de 64 kDa codé par le gène nifH, c’est le composant
donneur d’électrons qui contient le site de liaison de l’ATP (Rees et Howard, 2000).
1.1.6. Performances symbiotiques
La symbiose permet aux légumineuses de se développer sur des sols pauvres en azote, ainsi
l’utilisation des légumineuses comme engrais vert permet de les enrichir en azote. Cette symbiose
est caractérisée par :
- Une spécificité plus ou moins stricte (Martinez- Romero, 2003)
- La nodulation d’une même plante par plusieurs espèces bactériennes dans certains cas.
-Une efficacité vis-à-vis de la fixation d’azote qui varie selon le microsymbiote(Chen et al., 2003)
1.1.7. Rôle de la rhizosphère dans la fixation symbiotique d’azote

La rhizosphère est la zone du sol qui entoure les racines. Les abords des racines sont le lieu d’une
intense vie microbienne dans laquelle la microflore tellurique est profondément modifiée
notamment sous l’influence des exsudats racinaires et des rapports de débris tissulaires. C’est le
lieu privilégié des échanges de matière et d’énergie entre le sol et son couvert végétal (Schut,
2001). Le fonctionnement physico-chimique de la rhizosphère résulte des actions exercées par les
plantes et les micro-organismes, des réactions en solution et avec les phases solides du sol (Davet,
1996).
1.2. Les légumineuses

La famille des légumineuses a une distribution mondiale et est estimée entre 16000 et 19000
espèces reparties en 750 genres (Morel, 2012). Les taxonomistes, sur la base de différences
florales, avaient divisé cette famille en trois sous-familles distinctes : les Mimosacées, les
Césalpiniacées et les Papilionacées. Selon la phylogénie du groupe des angiospermes (APG IV,
2016), ces dernières sont divisées elles-mêmes en groupes de genres communément appelés tribus
(Doyle, 2011). La nodulation par les rhizobia est plus fréquente chez les deux sous familles des
Mimosacées et des Papilionacées (plus de 90 % des espèces) (Doyle, 2011) ; les Papilionoideae
comprennent plus de deux tiers des espèces des trois sous familles. Cette sous famille est très
10
cosmopolite et compte près de 14000 espèces réparties en 476 genres de légumineuses tropicales
et tempérées (Zhu et al., 2005). Les plantes sont principalement des herbacées mais comprennent
aussi des arbres et des arbustes.
Les Papilionoideae ont une grande importance au niveau de l’agriculture ; elles sont cultivées pour
leurs graines riches en protéines ou pour leurs propriétés fourragères (MP3-Grain Legumes,
2010). Elles se divisent en deux groupes majeurs de plantes cultivées (Figure 3): les légumineuses
tropicales (ou Phaseoloides) comme notamment les genres Cajanus, Glycine (soja), Phaseolus
(haricot) et Vigna regroupés dans la tribu Phaseoleae.
Figure 3 : Dendrogramme représentant les relations phylogénétiques de légumineuses

Papilionoideae (Zhu et al., 2005) .
11
Les légumineuses sont devenues une composante essentielle de l’alimentation humaine et animale
(Figure 4) pour le monde entier et en particulier pour les populations à faible revenu (l'Asie et
l'Afrique) (Pachico, 2005). D’autre part, elles constituent une voie pour améliorer la fertilité des
sols et les rendements des cultures qui leur sont associées (M.A.D.R., 2013).
Les légumineuses alimentaires, quant à elles, représentent de part la superficie qu’elles occupent,
une place importante dans le système agraire et l’agroéconomie de nombreux pays du monde
(Schneider et al., 2015). En effet, les légumineuses alimentaires (Figure 5) occupent une part très
importante des travaux accomplis dans des domaines aussi divers que la génétique, l’entomologie,
la phytopathologie, la nutrition et la sélection variétale.
Figure 4 : Les trois grands modes d’exploitation des légumineuses (Schneider et al., 2015)
Pois
Haricots
Pois chiches
Lentilles
Fèves & féveroles
Figure 5 : Diversité de productions au sein des légumineuses à graines (Solagro, 2014)
12
1.2.1. Principaux pays producteurs de légumineuses à graines dans le monde

La proportion de la production mondiale de légumineuses à graines a augmenté entre 1970 et
2012 (FAO, 2016), passant de 7 % à 12,5 % de la production mondiale de céréales (maïs, riz, blé,
etc.). Le développement du soja (75 % de la production mondiale de légumineuses à graines)
explique cet accroissement. Mais les autres légumineuses, bien que minoritaires par rapport au
soja, sont elles aussi en augmentation sur cette période (+50 %) (Figure 6). L’Union européenne
produit moins de 2 % de la production mondiale de légumineuses à graines, soit 0,5 % du soja et
9 % des autres espèces cumulées.
En Europe, les légumineuses à graines représentent moins de 2 % des surfaces de grandes cultures
alors que cette part est généralement de 10 à 25 % sur les autres continents (avec notamment le
soja, le pois, le haricot et l’arachide) (Champ, 2014).
Million de tonnes
a) b) c) Années
Figure 6 : Production et commerce mondial des légumineuses à graines (FAO, 2016)

a) La production des légumineuses et des légumes secs durant 2010-2012 ; b) Total du commerce à
l'exportation générale durant 2010-2013 ; c) Total du commerce mondial global durant 2010-2013
Haricots frais Haricots secs Pois frais Pois secs
1.2.2. Consommation des légumineuses à graines dans le monde
Au niveau mondial, la consommation moyenne de légumineuses sèches (Tableau 1) est de 6,8

kg/personne et par an. L’Afrique (dont le Niger 35 kg/pers/an, le Rwanda 30 kg/pers/an et le
Cameroun 21 kg/ pers/an) et l’Amérique du Sud (dont le Nicaragua 20 kg/pers/an, Cuba 19
kg/pers/an et le Brésil 17 kg/pers/an,) se placent en tête. En ce qui concerne l’Afrique, ce niveau
de consommation est en progression sur les 15 dernières années. Ensuite, on retrouve l’Asie avec
un niveau de consommation équivalent à la moyenne mondiale, puis l’Australie et l’Amérique du
13
Nord autour de 4 kg/ personne/an (donc en dessous de la moyenne mondiale) et enfin en dernière
position, l’Europe avec seulement 2,7 kg/personne/an (FAO, 2011).
Au-delà des quantités consommées par personne, il est intéressant de souligner les spécificités
alimentaires en fonction de chaque continent : prédominance des haricots en Amérique, pois en
Europe et Australie, ou bien légumineuses plus spécifiques en Afrique, telles que le Niébé (pois à
vache, cornille ou dolique à oeil noir), le pois bambara (voandzou ou pois de terre) (Solagro,
2014).
Tableau 1:Consommation humaine de légumineuses par habitant dans le monde (FAO,2011)
Continent Kg/ personne/ an Ordre de consommation

Europe 2,7 Pois, Haricot, autres légumineuses
Amérique du nord 4,1 Haricot, autres légumineuses, Pois
Asie 6,3 Autres légumineuses, Haricot, Pois
Afrique 10,8 Autres légumineuses, Haricot, ¨Pois
Amérique du sud 10,8 Haricot, autres légumineuses, Pois
Australie 4,1 Pois, autres légumineuses, Haricot
Les légumineuses constituent un apport important et peu coûteux en protéines (18 à 30 % de la

graine sèche) (Baudoin, 2001). Graham et Vance (2003) estiment que les légumineuses
fournissent environ le 1/3 des protéines alimentaires. La répartition actuelle des protéines
consommées ( 2/3 animales et 1/3 végétales) ainsi que les régimes alimentaires riches en protéines
animales, en lipides et en sucres et trop faibles en fibres (Kesse-Guyot, 2013), sont un facteur
d’aggravation de risque de certaines maladies (maladies cardiovasculaires, certains cancers,
obésité) (OMS, 2015). Ainsi, céréales et légumes secs s’équilibrent lorsqu’ils sont consommés au
cours d’un même repas (Poncet, 2014), permettant d’obtenir tous les Acides Aminés
Indispensables (dont les 9 AAI) (Figure 7).
L’année 2016 est déclarée par Les Nations Unies (ONU), l’année internationale des
légumineuses : haricots, pois et lentilles qui « constituent une source bon marché, délicieuse et
nutritive de protéines et de micronutriments essentiels », rappelle l'ONU.
14
Figure 7 : Complémentarité protéique de l’association céréales-légumineuses à graines.
Frein Recommandations
1.2.3. Les légumineuses alimentaires en Algérie
En Algérie, les légumineuses alimentaires constituent après les céréales, la seconde source de
protéines pour l’alimentation humaine, malheureusement leur production reste toujours faible et
ne satisfait pas la demande. Elles représentaient 83800 ha de la surface agricole totale utilisée
(SAU) en 2011 (FAO, 2013). Elles sont cultivées sur les zones littorales jusqu’aux hauts
plateaux ; les espèces de légumineuses alimentaires les plus cultivées sont la lentille (Lens
culinaris L.), le pois chiche (Cicer arietinum L), le pois (Pisum sativum L), la fève (Vicia faba L.)
et le haricot (Phaseolus vulgaris L.) (Lazali, 2014).
Les légumineuses alimentaires ont reçu beaucoup d’attention de la part des services agricoles pour
augmenter les superficies et améliorer les niveaux de rendements (M.A.D.R., 2015), cependant
les résultats obtenus n’ont pas été à la hauteur des efforts consentis et les légumes secs restent une
filière défaillante car seul 1/3 de la consommation est couvert par la production nationale (journal
El Watan). Au-delà de la spéculation et de la dévaluation du dinar, la problématique du marché
des légumes secs en Algérie serait a priori celle de la production d’abord.
L’Algérie produit «en moyenne 800 000 à 900 000 quintaux» de légumineuses alimentaires, ce
qui répond aux besoins du marché à hauteur «de 30 à 35 %», selon Omar Zeghouane, directeur de
l’Institut technique des grandes cultures. Un document de la FAO datant de 2011 situait la part de
la production nationale à seulement 28 % du marché. Sur les 5 dernières années, «entre 80 000 et
85 000 hectares» ont été semés «toutes espèces confondues» (lentilles, pois chiches, fèves..).
Et jusqu’à 2013, l’Algérie n’avait pas besoin d’importer plus. Les chiffres du commerce extérieur
montrent que la facture d’importation a baissé en 2012 par rapport à l’année précédente. Les
superficies cultivées devraient être pourtant plus importantes (Belaid, 2016).
15
L’une des actions pour relancer la filière dans le cadre du programme du renouveau agricole
consiste donc à sensibiliser les agriculteurs pour une meilleure maîtrise des techniques de culture.
A côté de cela, il s’agira de mettre à leur disposition de nouvelles semences développées dans le
cadre d’un programme de recherche.
Avec plus de 82 000 quintaux (8 200 tonnes) de légumes secs produits durant la saison agricole
2010-2011, Aïn Témouchent s’illustre parmi les wilayas ayant réalisé les meilleures performances
dans ce domaine à l'échelle nationale, affirme la direction des services agricoles de la wilaya
(Algeria Invest – Rafik Bahri, 2011).
Aïn Témouchent s'est distinguée en particulier dans la production de pois chiches, estimée à
57.575 quintaux durant la compagne 2010-2011. La wilaya a également enregistré des productions
de 15.170 quintaux de fèves, 5.444 quintaux de haricots et 4.289 quintaux de pois secs. Cette
performance a été rendue possible grâce à la conjugaison de plusieurs facteurs, notamment le suivi
des itinéraires techniques, l’utilisation de labours profonds, d’engrais adéquats, et l’irrigation
d'appoint. Les avantages accordés aux producteurs dans plusieurs domaines et la célérité dans le
paiement des fellahs, ont aussi contribué à la concrétisation de ces résultats (DSA, 2013).
1.2.3.1 Importance des légumineuses alimentaires en Algérie

En Algérie (Tableau 2), les légumineuses alimentaires sont utilisées dans la rotation avec les
céréales car elles enrichissent le sol en azote. Au point de vue diététique, elles sont largement
cultivées vu leur importante source protéique qui est susceptible de remplacer les protéines
animales difficilement accessibles pour une large couche de la population algérienne
(Melakhssou, 2007).
Les légumes secs couvrent une superficie de 66.000 hectares (M.A.D.R., 2011) donnant une
production moyenne de 504.000 quintaux pour des besoins estimés à 2,8 millions de quintaux, soit
un taux de couverture de 15,7 %. Le reste des besoins, soit 1 million de quintaux, est importé pour
un montant de 123 millions USD. Il s’agit donc de remédier à cet état de fait par le programme de
développement des légumes secs selon le M.A.D.R. (2011), en visant une réduction importante de
l’importation et l’atteinte d’une production de 872.000 quintaux en 2014.
La wilaya d’Ain-Témouchent se distingue sur le territoire national par la production du pois

chiche Cicer arietinum soit 7000 ha évoqué par Bouziane M., le 3-8-2013, journal le Midi.
Chaque année, des rotations légumineuses / graminées sont réalisées par les agriculteurs qui, par
expérience, ont remarqué que cette combinaison donne un rendement meilleur.
16
Tableau 2 : Evolution de la production de légumineuses alimentaires en Algérie durant la période

2011/2015 (MADR, 2016)
Légumineuses
Année Fève Pois chiche haricot Pois sec Lentille
alimentaires
Evolution des superficies (hectares)
2011 87 296 37 090 27 734 1218 9943 11 090
2012 85 295 36 835 30 562 1573 9891 6244
2013 84 993 37 668 29 320 1427 10 808 5543
2014 90 507 37 499 33 295 1633 11 342 6458
2015 79 657 38 564 22 799 1764 9948 6319
Moyenne 85 550 37 531 28 742 1523 10 386 7131
Evolution de la production (quintaux)
2011 788 170 379 818 240 512 9525 74 353 82 152
2012 842 900 405 070 276 750 10 240 91 780 57 380
2013 958 330 423 862 349 800 13 614 105 859 63 184
2014 937 065 413 886 351 178 13 429 101 193 53 409
2015 831 815 434 961 229 470 14 137 101 242 49 354
Moyenne 871 656 411 519 289 542 12 189 94 885 61 096
Evolution des rendements (quintaux/hectares)
2011 9 10,2 8,7 7,8 7,5 7,4
2012 9,9 11 9,1 6,5 9,3 9,2
2013 11,3 11,3 11,9 9,5 9,8 11,4
2014 9,4 11,3 8 7,2 7 10,4
2015 10,4 11,3 10,1 8 10,2 7,8
Moyenne 10,2 11,0 10,5 7,8 8,8 8,7
Source : données statistiques agricoles-série B- DSASI/MADRP
1.2.3.2. Le haricot
Le haricot est originaire d'Amérique latine et centrale où il a été domestiqué depuis plus de 8000
ans. Aujourd’hui, il constitue l’une des légumineuses alimentaires les plus répandues dans le
monde. Les haricots secs se caractérisent par une teneur élevée de protéines (25%), de glucides
complexes (Brick et al., 2014) dont amidon 55,5% et cellulose 3% (Hubert, 1978), de vitamines
17
(B9) et de minéraux (3,5%) en particulier le potassium, le phosphore, le calcium, le magnésium, le

cuivre, le fer et le zinc (Gordon, 2004), eau 10,5 % et matières grasses 3% (Hubert, 1978).
Le haricot constitue un aliment de base pour environ 500 millions de personnes, en Amérique du
sud, en Afrique et en Chine (FAO, 2011). Cependant, pour certains pays, le haricot constitue une
culture de rente (Guene, 2002). Parmi les contraintes et limitations majeures à sa production, on
compte la faible fertilité des sols, les dégâts causés par les insectes sur les fleurs et certains agents
pathogènes responsables de maladies (ITCMI, 2010).
Le genre Phaseolus appartient à la sous tribu des Phaseolinae, elle-même incluse dans la tribu des
Phaseoleae qui font partie de la sous-famille des Papilionacées (Figure 8). Les caractéristiques
botaniques de cinq espèces ont été décrites chez : P. coccineus, P. acutifolius, P. lunatus, P.
polyanthus et P. vulgaris. Cette dernière espèce a fait l’objet d’une importante culture sur le plan
agricole, ce qui lui a valu une place prépondérante dans la culture mondiale du haricot (Zhang et
al., 2008 ; FAO, 2016).
Haricot commun : Phaseolus vulgaris
Règne : Plantae
Sous –règne : Tracheobionta
Division : Magnoliophyta
Classe : Magnoliopsida
Sous –classe : Rosidae
Ordre : Fabales
Famille : Fabaceae
Sous –famille : Papilionaceae
Tribu : Phaseoleae
Sous –tribu : Phaseolinae
Genre : Phaseolus
Espèce : Phaseolus vulgaris L.
Figure 8 : Classification du haricot (APG IV, 2016)
1.2.3.2.1. Description morphologique et botanique

Le haricot est une plante légumineuse, herbacée, annuelle, semée dans un sol soigneusement
bêché et riche en substances organiques, cultivé pour ses graines et ses gousses comestibles. Le
haricot est une plante à végétation relativement rapide dans des conditions favorables.
Les fleurs de couleur blanche, rose ou pourpre (Figure 9) donnent des fruits en gousses longues
droites ou légèrement courbées pouvant contenir plus de 12 graines de forme, de taille et de
couleur très variées à maturité. La couleur de la fleur est généralement indépendante de celle des
graines, mais l'association entre fleurs particulières et couleur des graines est connue.
18
Les graines sont rondes, ellipticales quelque peu aplaties ou arrondies. Le poids moyen pour 100
graines varie entre 12 et 100 g et selon les variétés. La durée des stades de développement varie
considérablement. Les graines semées directement dans un sol bien drainé germent au bout de 5 à 7
jours. Les semences du haricot gardent leur faculté germinative, dans des conditions adéquates,
durant 4 à 5 ans (ITGC, 2010).
A l'issue de la germination épigée, il y a deux feuilles opposées simples puis des feuilles trifoliées
à folioles cordifonnes. Les fleurs sont portées en grappes axillaires et terminales.
La durée de floraison (5 à 30 jours) et de remplissage des graines (23 à 50 jours) de même que la
date de maturation des graines (60 à 130 jours) varient considérablement selon les variétés
cultivées (Bargaz, 2012 ; Schmutz et al., 2014).
Le système radiculaire est faible et se situe peu profondément dans le sol. A la germination, la
plante est généralement à racines pivotantes mais peu après des racines adventives longues de 10 à
15 cm se développent sur toute la racine principale.
Sur les racines se développent, pendant la végétation (30 à 45 jour après le semis), des nodosités
au niveau desquelles se forment les bactéries fixatrices d’azote (Kolef, 1974).
76
78
77
77
Figure 9 : Stades phénologiques du haricot (ITCMI, 2010)
09 : Levée. 12 : 02 feuilles étalées.15 : Développement de la plante. 51 : Formation des boutons floraux.

61 : Début de la floraison. 71 : Nouaison. 75 : Maturation des gousses.76 : gousses remplies. 77 : fleurs de
haricot commun. 78 : Graines.
19
1.2.3.2.2. Classification et variétés

Le haricot est une plante à croissance déterminée ou indéterminée. Les variétés du haricot sont
classées en quatre groupes selon leur type de croissance, qui dépend notamment de la
caractéristique du bourgeon terminal. Le type I, est à croissance déterminée, les types II et III sont
eux aussi à port buissonnant mais le bourgeon terminal est végétatif et sa croissance est
indéterminée. Le type IV a également un bourgeon terminal végétatif à croissance indéterminée
mais à port grimpant typique sans ramification.
De très nombreuses variétés de haricots sont recensées (Goretti et al., 2014) et la diversité
variétale de l’espèce Phaseolus vulgaris est très grande et accroît constamment (Belluci et al.,
2014). On compte à présent plus de 350 différentes variétés, groupées en trois catégories : les
haricots à filets, les haricots mangetout (à gousse verte) ou beurre (à gousse jaune) et les haricots à
écosser. Du point de vue de la culture, on distingue deux grandes catégories : les haricots à rames
(exemple var. volubilis) et les haricots nains (exemple var. hanus) (APG III, 2009).
Plus de 14 000 cultivars sont répertoriés au niveau du principal conservatoire au Centre
International de l'Agriculture Tropicale (ClAT) situé à Cali en Colombie et dans le catalogue
européen des espèces et variétés, figurent plus de 1250 variétés inscrites de haricots, dont plus de
230 (près de 180 nains et plus de 50 à rames) pour la France et 115 pour l'Italie.
Sur la base de la teneur en protéine des graines, 76 accessions de haricot de l'Amérique latine
(Andes) et du Mésoamérique sont classées en neuf groupes. Tohme et al. (1996) utilisant la
technique de l'amplification aléatoire de fragments de restriction (AFLP), ont distingué 16 groupes
dans les accessions sauvages du Mésoamérique, de la Colombie et de la région sud des Andes.
Une collection mondiale comprenant plus de 40000 accessions existe au CIAT.
Il y a peu de temps, en Algérie, la diversité des variétés du haricot n’était pas grande, mais durant
ces dernières années, le nombre a augmenté par l’introduction des variétés nouvelles, plus
productives et d’une qualité supérieure telles que Michelet à rames, Coco blanc nain et à rames, et
la variété Contender (ITCMI, 2010).
1.2.3.2 .3. Organismes de recherches pour la culture du haricot

Différents organismes internationaux ont été mis en place pour développer la culture de Phaseolus
vulgaris et améliorer ses performances nutritionnelles et agronomiques (Brule et al., 2010). Le
CIAT est l'un des quinze centres de recherches dépendant du Groupe Consultatif pour la
Recherche Agricole Internationale (CGIAR) ; ses activités sont focalisées sur quatre types de
20
cultures : haricots, manioc, fourrages tropicaux et riz. Il dispose d'antennes en Amérique latine, en
Afrique et en Asie
21
En Afrique, l’Alliance panafricaine de recherche sur le haricot (PABRA) (Pan-African Beans

Reasearch Alliance) est un consortium formé par plusieurs organismes internationaux de
recherches : Eastern and Central Africa, Bean Research Network (ECABREN), Southern Africa,
Bean Research Network (SABRN) et CIAT, qui regroupe dix-huit pays de l'Afrique sub-
saharienne (Angola, Burundi, Cameroun, RD Congo, Éthiopie, Kenya, Lesotho, Madagascar,
Malawi, Mozambique, Rwanda, Afrique du Sud, Soudan, Swaziland, Tanzanie, Ouganda, Zambie
et Zimbabwe). L’Alliance vise à améliorer la sécurité alimentaire, les revenus et la santé des
agriculteurs pauvres en ressources sur le continent africain (Andriamihaja, 2013).
En Europe, le projet Phaselieu (acronyme de Improvement of sustainable Phaseolus production in

Europe for human comsumption : amélioration de la production durable de Phaseolus en Europe
pour la consommation humaine) avait notamment pour but d'établir un catalogue des ressources
génétiques du genre Phaseolus. Ce projet soutenu financièrement par la Commission européenne a
pris fin en 2001 ; il regroupait dix pays européens (Allemagne, Autriche, Belgique, Espagne,
France, Italie, Pays-Bas, Portugal et Royaume-Uni).
1.2.3.2.4. Culture du haricot en Algérie
La culture du haricot en sec et en frais est répandue plus ou moins dans toutes les régions de
l’Algérie. Les agronomes estiment qu’on doit augmenter la production d’autant plus que les
conditions climatiques et du sol dans le pays, surtout dans les régions littorales, sont très
favorables pour une culture rentable du haricot (ITCMI, 2010).
Le semis est effectué pendant le mois de mars ou avril sur le littoral et 15 à 20 jours plus tard dans
les régions des hauts plateaux. D’autres variétés sont aussi semées en été.
Le haricot est cultivé sous irrigation selon les besoins, à peu prés une fois par semaine ; il est
préférable d’irriguer après chaque cueillette. La plante est très sensible au manque d’eau surtout
avant la floraison et pendant la formation des gousses. Les besoins en eau pendant toute végétation
oscillent entre 350 à 450 m3 \ha, d’après la nature du sol et de ses réserves. C'est une espèce très
sensible au manque d'eau, ses besoins hydriques étant estimés à 250 mm de pluie pour un cycle
végétatif. Une nutrition phosphatée adéquate est aussi essentielle pour une croissance vigoureuse
du haricot et une bonne fixation d'azote (Faghire, 2012). Donc il paraît judicieux d'utiliser des
génotypes de plantes cultivées, en particulier symbiotiques, qui présentent une efficacité élevée
d'acquisition et d'utilisation de l'azote et du phosphore (Vincent et Drevon, 2001) et résistes aux
stress abiotiques et aux maladies (Singh et al., 2010).
22
Voici la fiche descriptive relative à l’haricot en Algérie selon l’institut technique des cultures
maraichères et industrielles de Staoueli, Alger (ITCMI, 2010) :
 La plante
- Nombre de graines au gramme : 2 à 5.
- Longévité moyenne de la graine : 3 ans.
- Germination : la levée s’effectue en 3 à 8 jours si la température du sol est suffisante
(10°C).
- Cycle végétatif : haricot nain : 45 à 65 jours ; haricot à rames : 55 à 65 jours.
 Les variétés les plus cultivées en Algérie

- Haricot nain mange tout : Contender, Djedida, Molière.
- Haricot nain à écosser : Coco de Prague, Pactole...
- Haricot à rames mange tout : Sidi Fredj, Blanc de juillet.
- Haricot à rames à écosser : Coco blanc, Coco de Prague…
- Les exigences
- Préfère les sols frais, légers se ressuyant bien.
- Température optimale : 15 à 25 °C.
- Craint le gel.
- pH :5,5 à 6,8.
- Salinité : Très sensible 2 à 3 mmhos /cm-1 (1,25 à 1,92 g / l).
- Craint l’humidité qui peut compromettre la nouaison.
 Les zones de production

Littoral et le sublittoral : Alger, Jijel, Blida, Tlemcen, Tizi ouzou, Bejaia, Oran, Mostaganem.
 Semis
- Primeur : sous abris fin décembre à fin février en région centre, Mi-janvier à mi- mars en région
Est
- Saison : 1ère quinzaine d’avril à 1ère quinzaine de juin région Est, mars à mi-mai dans les autres
régions
- A/Saison : début juin à mi août- littoral, Mi- juillet à fin août dans les autres régions
 Densité
Quantité 80 à 120 kg de semences / ha. Distances de plantation : 0,40 à 0, 70 m entre les lignes
0,10 m à 0, 15 m (en poquets) .
 Entretien de la culture
Binage, buttage, désherbage
 Fertilisation
Fumure organique : 15 t / ha de fumier décomposé.
Fumure minérale de fond :
- 50 à 80 unités de N / ha
- 80 à 100 unités de P/ ha
- 100 à 150 unités de K / ha
23
 Irrigation
Besoins estimés à :
- Primeurs : 1500 m3 / ha
- Saison : 2500 à 4400 m3 / ha
- A/Saison : 2000 à 3000 m 3/ ha
 Récolte
Manuelle : tous les 2 à 3 jours,
Mécanique : pour l’industrie.
Rendements : 5 à 6 t / ha
 Maladies et remèdes
- Pucerons : Pyrimicarbe, Lambda cyalothrine
- Fonte des semis : Propamocarpe-hydrochloride
- Rouille : Zinebe, Mancozebe
- Graisse du haricot sur feuilles et sur gousses : utiliser un produit cuprique.
- La bruche: Traiter les graines avec un insecticide (semences). Béta cyfluthrine SC.
1.2.3.2.5 La culture du haricot en plein champ

La culture du haricot en plein champ nécessite de la main d’œuvre, du matériel et de
l’approvisionnement (Tableau 3).
Tableau 3 : La culture du haricot en plein champ (pour 1Ha ; R 50Qx/Ha) (ITCMI, 2010)
Main d’œuvre Matériel Approvisionnement

Total
Opération Nbre Nbre
Montant DA Montant DA Quantité Montant DA DA
J H
Pépinière
Semence - - - - 100kg 10000 10000
Travail du sol
Labour 1 600 8 4000 - - 4600
Disquage +
0,5 300 4 2000 - - 2300
désherbage
Epandage d’engrais 0,5 300 - - 8 qx 48000 48300
Plantation et entretien
Semis en ligne 15 9000 - - - - 9000
Irrigation
6 3600 - - 2000m3 8000 11600
(aspersion)
Binage+désherbage
12 7200 - - - - 7200
+buttage
Traitement +
2 1200 8 4000 - 15000 60200
produits
Récolte
Récolte et transport 35 21000 4 2000 - - 23000
Amortissement
Matériel
- - - 25000 - - 25000
d’irrigation
- : non déterminé.
24
1.2.3.2 .5.1. Exigences du milieu

Les exigences du haricot en chaleur sont très grandes et cela pendant toutes les périodes de
développement. Les semences ne germent pas normalement qu’au dessus de +10°C. Le manque
de chaleur dans le sol cause la pourriture rapide des semences ; c’est pourquoi le semis doit se
faire après un réchauffement stable et à une température du sol qui varie entre +8 et +10°C. Les
exigences du haricot en chaleur sont particulièrement grandes pendant la période de floraison et de
nouaison. Une température de +25 à +28°C est considérée comme optimale (Kolef, 1974).
Le haricot exige beaucoup de lumière surtout pendant les premières étapes de son développement.
Durant toute la végétation, le haricot exige aussi de l’humidité de l’air et du sol. Plus tard, pendant
la floraison et la nouaison, la lumière diffusée et l’augmentation de l’humidité de l’air peuvent
favoriser considérablement la qualité des gousses et les rendements.
La sécheresse du sol aussi bien que l’excès de l’humidité (au dessous de 80 %) gênent le
développement des plantes et peuvent assez diminuer les rendements. Dans ces cas, des chutes
massives de fleurs peuvent être observées. Généralement le haricot se développe sur des substrats
à pH neutre ou légèrement alcalin. Il préfère les sols sableux humifères et silico-argileux et craint
les terres battantes, sèches et pauvres. Les exigences du haricot en sol sont modérées car il peut
réussir sur divers types de sol, mais les meilleurs résultats sont obtenus sur des terres perméables,
de bon état sanitaire et relativement riches en humus et éléments minéraux. (Kolef, 1974).
Dans le cadre des assolements, le haricot doit revenir tous les deux ou trois ans sur un même
terrain (ITCMI, 2010). Il est considéré comme un bon procédé pour toutes les cultures
maraîchères, les meilleures procédures sont les concombres, les choux, la pomme de terre. En
terre riche, il peut donner de bons résultats après les céréales (Shneider et al., 2015).
1.2.3.2 .5.2. Conditions de culture du haricot
On estime que 90% du haricot serait produit sous contrainte environnementale forte (Singh et al.,
1991), notamment acidité, toxicité aluminique et manganésique ou déficit hydrique, ou encore la
présence de pathogène comme l'anthracnose ou le virus de la mosaïque. Une étude menée par le
CIAT a montré que 60% des sols où est cultivé le haricot sont carencés en phosphore. Il a été aussi
rapporté que le haricot est plus sensible aux conditions extrêmes d'environnement que les céréales.
1.2.3.2 .5.3. Facteurs de l'environnement

Dans un sol riche en azote combiné, l'activité fixatrice des légumineuses est très réduite. Ce
phénomène est généralement observé dans les sols tempérés souvent trop riches en nitrate.
25
Les effets négatifs provoqués par le nitrate sur l’établissement de la symbiose et son
fonctionnement ont été rapportés par certains auteurs (Drevon et a1., l988).
Bien que les mécanismes d'inhibition de la nodulation et de la fixation soient nombreux, il existe
des possibilités pour minimiser l'effet du nitrate. Des études suggèrent la sélection d'associations
rhizobium/légumineuses peu sensibles à cette inhibition (nodules possédant des réserves
importantes de substrat énergétique, une faible activité nitrate réductase ainsi qu'une teneur élevée
en uréides). Le criblage des variétés pour leur capacité de nodulation et la fixation en présence de
nitrate peut être réalisé simplement en observant la nodulation et la fixation d'azote des
légumineuses cultivées sur des milieux riches en nitrate.
1.2.3.2.5.4. Effet de la pluviométrie sur la croissance des légumineuses

La position biogéographique de l’Algérie et la structure de ses étages bioclimatiques (aride et
semi–aride) lui permet d’être un pays relativement important en ressources biologiques (faune et
flore) (Abdelgherfi, 2003). À ce propos, la production des légumineuses dans les régions
méditerranéennes est largement dépendante de la disponibilité en eau et en azote. Dans ces
régions, le climat est caractérisé par une faible pluviométrie souvent mal répartie (Climat France,
2015). Au niveau national, cette diminution de la pluviométrie d’une saison à l’autre, est
accompagnée, d’une chute importante de la production végétale (Boulbaba et al., 2009).
Par ailleurs, chez les légumineuses, le changement climatique et l’effet délétère de la sècheresse
s’exercent non seulement sur la plante- hôte, mais aussi sur la croissance et la survie des
populations du rhizobium du sol (Singloton et al., 1982), sur le développement et le
fonctionnement des nodosités, donc sur la capacité fixatrice d’azote de l’association symbiotique.
1.3. Importance biotechnologique de la fixation d’azote
La fixation d’azote permet aux plantes de s’adapter aux conditions défavorables de

l’environnement et du sol. Parmi les aspects biotechnologiques de la fixation d’azote :
 Amélioration des légumineuses existantes (adaptation à la sécheresse, à l’acidité des sols,
sélection des souches plus compétitives) (Franche et al., 2009).
 Création de nouvelles symbioses, en particulier avec les céréales, la méthode actuelle de
génie génétique permet d’incorporer le gène de la fixation de l’azote atmosphérique aux
plantes qui ne le possèdent pas, comme le riz par exemple. cette technique évite l’emploi
d’engrais azotés coûteux, souvent polluants, utilisés dans le sol pauvre en azote organique
(Bergensen et Potgal, 1987).
26
 Créer de nouvelles souches fixatrices à partir des bactéries ne possédant pas cette propriété
naturellement et pour mieux améliorer l’activité fixatrice de l’azote, il faut comprendre et
améliorer l’activité fixatrice des souches symbiotiques.
 Il est conclu que ces différences génétiques pour la fixation du N2 sous bas P dépendent de
l'efficacité d'utilisation du P (EUP), qui est liée à la répartition du P entre les organes, et
que le ratio PUEN peut être utilisé pour sélectionner des lignées plus tolérantes à la
carence en P. (Drevon et al., 2011).
1.3.1. Importance de l’azote et du phosphore pour Phaseolus vulgaris

L’azote exerce une influence déterminante sur le rendement et la croissance de la plante et la
couleur du feuillage et c’est l’azote disponible qui règle le rythme de la végétation, il permet le
démarrage rapide du thallage et bien que les nodosités des racines commencent à se développer
après une bonne végétation, un apport en azote est parfois nécessaire au début de la végétation ; il
peut pousser et accélérer la formation et le développement des racines et des plantes (Kolef,
1974).Une carence en azote peut diminuer le poids du fruit, provoquer une maturité avancée et
induire une coloration précoce par opposition à un excédent en azote qui donnera une coloration
moins intense, une diminution du gout et un retard de maturité.
Le phosphore « P » est aussi un élément essentiel de la nutrition minérale des plantes (Mandri et
al., 2012). En effet, dans des régions tropicales et méditerranéennes, la production du haricot est
sévèrement limitée par la déficience des sols en cet élément (Shen et al., 2001).
La déficience en P affecte les paramètres de croissance chez Phaseolus vulgaris en réduisant la
croissance racinaire (Bernal et al., 2005). Cette contrainte n’affecte pas seulement l’établissement
de la culture et sa croissance mais aussi la nodulation et la fixation biologique d’azote (Tang et
al., 2001).
La carence phosphatée est très fréquente en zones tropicales et difficilement remédiable dans les
pays dépourvus de gisement de phosphate. La quantité d'azote fixé par le haricot est fortement
limitée par la carence des sols en phosphore (Pereira et Bliss, 1987). Ssali et Keya (1983) ont
démontré que l'application de 150 kg P20/ha sur le haricot, dans un Nitosol du Kenya, permet de
multiplier par trois le nombre des nodules et par dix la quantité d'azote atmosphérique fixée et le
rendement en graines a augmenté de 29%, tandis que le prélèvement de N combiné du sol à
diminué. En Tanzanie, Amijee et al. (1988) avaient obtenu une forte nodulation et des rendements
très importants chez le haricot inoculé avec la souche de Rhizobium ClAT 899 et ayant reçu 180
kg P20/ha sous forme de triple superphosphate. Chez le haricot, la formation des nodules est très
27
sensible à la concentration en P. La teneur en P des nodules est plus élevée que celle des racines.
Le nodule est un puits très attractif en milieu pauvre en phosphore. Pereira et Bliss (1987) ont
montré que dans ces conditions, les nodules s'enrichissent plus rapidement en P que les autres
parties végétales. C'est le poids total de nodules qui augmente, et non l'activité spécifique de
l'organe. Le phosphore joue donc un rôle particulier pour le nodule. Chez le haricot, Pereira et
Bliss (1987) ont montré qu'il existe des différences entre cultivars quant à leur tolérance à la
carence phosphatée. Cependant, dans une étude réalisée en Colombie sur 30 variétés de
Phaseolus, Graham et Rosas (1979) n'ont pu identifier un matériel capable de fixer l'azote dans
des sols pauvres en phosphore. Ils suggèrent l'épandage de faible quantité de phosphore dans la
raie de semis.
1.3.2. Nutrition azotée chez le haricot

Comme pour la plupart des légumineuses la nutrition azotée du haricot se fait ainsi soit par
assimilation des nitrates du sol (par la nitrate réductase de la plante) soit par fixation biologique
d'azote atmosphérique (par la nitrogénase de la bactérie). Ces deux processus sont
complémentaires au cours du cycle de croissance de la plante. La nitrate réductase intervient
essentiellement avant la floraison et la nitrogénase prend la relève au début de la floraison soit 2
semaines après le semis chez le haricot (Franco et al., 1979) et se poursuit jusqu'au début de la
formation des gousses. Une deuxième période d'activité maximale de la nitrate réductase peut
apparaître après la formation des gousses et les deux processus peuvent être concurrents lors d'un
apport d'azote nitrique, qui augmente l'activité de la nitrate réductase tout en diminuant l'activité
de la nitrogénase (Félix et al., 1981). L'activité nitrogénasique suit une courbe de croissance
exponentielle avec une activité maximale pendant la période de floraison et diminue pendant le
remplissage des gousses. Obaton et al. (1982) ont montré qu'au champ c'est essentiellement
l'assimilation du nitrate qui prédomine au début du cycle, la fixation d'azote intervient au dernier
stade.
1.3.3. Potentiel fixateur d'azote du haricot

Le haricot a été décrit par plusieurs auteurs comme étant une légumineuse à faible capacité de
fixation d'azote, comparée à d'autres espèces de légumineuses comme le soja (Preira et Bliss,
1987; Isoi et Yoshida, 1991). Ce phénomène est dû en partie aux conditions des sols de la culture
mais aussi, à la compétitivité des souches de Rhizobium indigènes ineffectifs. Le rendement et le
développement du haricot sont très dépendants de la teneur en azote du sol. Or les sols tropicaux
sont pour la plupart déficients en cet élément (Graham, 1981). De ce fait le haricot produit en
28
système intensif est fertilisé en azote et la gestion des intrants azotés dans l'agriculture générant
d'importants reliquats azotés en début de culture ce qui empêche le haricot d'exprimer au mieux
son potentiel de fixation symbiotique. C'est le cas dans les exploitations maraîchères du haricot de
la zone des Niayes où la nodulation est en partie limitée par les apports d'engrais azotés à des taux
très élevés (250 à 300 kg urée/ha). Cependant, l'existence d'une grande variabilité génotypique
pour le potentiel fixateur d'azote du haricot décrit par Bliss (1993) permet de sélectionner des
variétés à très fort potentiel fixateur d'azote. Ainsi, des efforts ont été faits dans la sélection des
variétés RHIZ à nodulation profuse (Kipe-Nolt et al., 1993), ou dans la sélection de variétés
précoces (Chaverra et Graham, 1992) ou dans la sélection de variétés présentant une sénescence
tardive des nodules (Vikman et Vessey, 1993).
1.3. 4. Effet du phosphore et du potassium sur la symbiose
Pour des raisons environnementales et/ou économiques, l’agriculture se situe aujourd’hui dans une
perspective de faibles niveaux d’intrants et de durabilité. Or, dans de nombreux agrosystèmes les
principaux facteurs qui limitent la production de biomasse sont, outre l’eau, l’azote et le
phosphore. Dans ce contexte, il parait judicieux d’utiliser des génotypes de plantes cultivées, en
particulier symbiotiques, qui présentent une efficacité élevée d’acquisition et d’utilisation de
l’azote et du phosphore (Bargaze et al., 2011a, 2011b). Les flux de protons et d’anion organiques
libérés par les racines nodulés ont montré que les variétés différentes se distinguent par des efflux
de H+ (et probablement d’anions organiques) différents ; or les protons et les anions organiques
sont susceptibles de contribuer à mobiliser le phosphore dans la rhizosphère, en particulier en sols
calcaire, et donc d’améliorer l’efficacité d’acquisition de phosphore. Les résultats montrent que le
phosphore améliore l’effet de l’inoculation sur les paramètres de nodulation et de la biomasse
aérienne à un stade précoce de développement végétatif. Dans le cas du potassium, l’amélioration
ne touchant que le nombre des nodules, la biomasse aérienne, due à la fertilisation phosphatée, est
observée. L’apport simultané du phosphore et du potassium améliore les paramètres de la
nodulation et de la production de biomasse aux deux stades de prélèvements.
La teneur en azote due à l’apport du phosphore est plus importante que celle obtenue avec l’apport
du potassium.
Ces résultats soulignent le rôle essentiel du phosphore et dans une moindre mesure celui du
potassium dans le symbiose Rhizobium-Phaseolus vulgaris, ce qui constitue une voie
d’amélioration intéressante dans la production du haricot dans les environnements pauvres en ces
éléments (Zaman-Allah et al., 2004).
29
1.3.5. Effet du stress salin sur la symbiose Phaseolus vulgaris-rhizobia

Le stress salin constitue l’une des contraintes environnementales qui limite la production des
légumineuses en région aride et semi aride. Environ 40 % de surface dans le monde a le problème
de salinité potentiel ; la plupart de ces zones sont localisées dans les zones tropicales et la zone
méditerranéenne (Cordovilla et al., 1994 ; Zahran et al., 1994).
La plupart des légumineuses compte sur la fixation biologique, nitrate, et/ou l’assimilation
d’ammonium, pour satisfaire leur besoin en azote sous stress (Bouhmouch et al., 2005 ; 2000).
Plusieurs rapports montrent que les légumineuses fixant l’azote sont plus sensibles à la salinité
que les légumineuses qui dépendent seulement de la forme minérale (Youssef et Sprent, 1983,
Lauter et al., 1981).
La variabilité génétique considérable à la tolérance au sel, parmi les espèce des légumineuses a
été rapporté (Bouhmouch et al., 2005).
Quelques arbres des légumes comme Prosopis et Acacia spp. sont les plus tolérantes au sel,
cependant les légumineuses à graines ont été reconnues depuis longtemps comme non plus ou
seulement modérément tolérant à la salinité (Faghire et al., 2011). Cicer arietinum, Phaseolus
vulgaris et Pisum sativum sont connu d’être extrêmement sensible au stresse salin, cependant
Glycine max et Vicia faba sont particulièrement considéré comme des légumineuses à graines
tolérante à la salinité (Abdel wahab et Zahran, 1981 ; Delgado et al., 1994).
Différent de leurs légumineuses hôtes, les rhizobia peuvent survivre dans la présence d’extrême
concentration du sel et montrent des variations marquées, pour la tolérance au sel. Quelques
souches sont inhibées par la concentration 100 mM de NaCl (Singleton et al. 1982, Yelton et al.,
1983), alors que les souches R. meliloti et R. fredii poussent à la concentration 300 mM de sel
(Sauvage et al., 1983).
L’osmotolérance des souches de rhizobia peut supporter des grandes modifications dans
l’osmolarité sans diminution du nombre des cellules vivantes (Singleton et al., 1982) ; par
conséquence, leur multiplication dans la rhizosphère de la plante- hôte ne va pas être affectée par
les sols salés, comme c’est le cas pour les souches sensibles.
L’échec de la symbiose sous stress salin, peut être dû à l’échec des rhizobia à l’établissement dans
la rhizosphère, ou l’échec de processus d’infection due à l’effet de salinité (Singleton et Bohlool,
1984).
Le stress salin réduit la nodulation des légumineuses en inhibant très tôt les événements
symbiotiques (Amira et Abdul, 2011).
30
Au Maroc par exemple, la salinité des sols cultivée est devenue un réel problème, pour continuer
de cultiver le haricot commun dans des sols. Il y a un besoin urgent pour sélectionner des cultivars
appropriés et des souches de rhizobium adaptées, et étudier l’effet du stress salin sur la symbiose
entre les deux partenaires (Bouhmouch et al., 2005).
1.3.6. Efficacité d’utilisation du phosphore pour la fixation symbiotique d’azote chez le

haricot
Par leur fixation symbiotique d’azote atmosphérique, les légumineuses jouent un rôle important
pour la sécurité alimentaire et la fertilité de sols. Elles contribuent non seulement à un bilan positif
du cycle de l’azote, mais disposent aussi de mécanismes favorables à la biodisponibilité du
phosphore. L’un de ces mécanismes est l’efflux de protons qui est associé à l’utilisation de N2
comme source d’azote, et s’accompagne d’une forte consommation d’oxygène liée à la réduction
symbio-rhizobienne de N2, processus coûteux en énergie. Il en résulte une acidification de la
rhizosphère qui favorise la solubilisation du P lié aux composants minéraux du sol, le rendant ainsi
assimilable par les plantes et les microorganismes (Drevon et al., 2011).
L’efficacité d’utilisation du phosphore (UEP) chez une légumineuse induirait un cycle vertueux
pour la fertilité des sols : avec une faible quantité de P disponible en début de cycle cultural, une
légumineuse efficace pourra assurer sa nutrition azotée (Alkama et al., 2012) par une symbiose
rhizobienne dont l’activité augmentera la disponibilité du P, ce qui en retour stimulera la fixation
d’azote.
Les résultats de Benadis et al. (2014) ont montré que la déficience en P diminue la consommation
d’O2 des racines nodulées du haricot et affecte les paramètres de croissance en particulier la
nodulation en diminuant le nombre, la taille et la biomasse sèche nodulaire. La nodulation est plus
sensible à la carence en P que la croissance des plantes.
Il n’existe pas en Algérie, de mise au point sur les légumes secs traditionnels en particulier le
haricot. Leurs itinéraires de production relativement sobres en intrants, leur ancrage territorial, leur
qualité nutritionnelle ou encore leur prix d’achat abordable pour les consommateurs en font des
produits très intéressants au regard de la transition alimentaire devenue indispensable à notre
société. Les raisons sont d’ordres techniques, socioéconomiques et climatiques, le tableau 4
(adapté de Solagro, 2014) permet d’avoir une idée sur des recommandations proposées.
31
Tableau 4 : Recommandations proposées pour la culture des légumineuses

(adapté de Solagro, 2014).
Statistiques
Frein Recommandation
Manque de connaissances globales des acteurs Renforcement du suivi statistique par l’ajout d’un
agricoles et non agricoles (surfaces, rendements, code spécifique pour chaque culture de
zones de productions, importations / exportations, légumineuses.
débouchés et utilisations). Mise en place de publication du type bilan annuel
pour les utilisations en alimentation humaine des
légumineuses
Recherche
La recherche variétale a principalement concerné Développer la sélection variétale à l’ensemble des
quelques légumineuses et quelques génomes. espèces pour renforcer les aptitudes agronomiques
La diversité des variétés de légumes secs tend à (stabilité de rendement), techniques et
s’atténuer et des variétés anciennes sont menacées nutritionnelles.
voire disparaissent. Améliorer la conservation et la mise en culture des
variétés anciennes.
Développer les projets de recherche pour la sélection
variétale.
Variabilité interannuelle des rendements des Renforcer l’accompagnement technique et l’appui de
légumineuses à graines, frein majeur selon les structures de proximité telles que les chambres
agriculteurs. d’agriculture, les coopératives etc. (qualité de semis,
désherbage).
Diversifier les légumineuses à graines cultivées,
complémentarité possible vis-à-vis des impacts
climatiques.
Développer les cultures associées (céréale +
légumineuse) permettant de stabiliser le rendement
de la légumineuse.
Développer un dispositif assurantiel plus adapté aux
légumineuses à graines (classées cultures à forte
valeur ajoutée).
Agronomie
Manque de perception des intérêts agronomiques Favoriser l’échange d’expériences de terrain,
des légumineuses (dont leurs restitutions azotées) notamment entre agriculteurs.
par les agriculteurs conventionnels, et donc Développer les approches systèmes de cultures
rentabilité économique à l’échelle de la rotation. incluant des légumineuses.
Renforcer la place de l’intérêt agronomique des
légumineuses dans les rotations dans les programmes
pédagogiques de l’enseignement agricole (lycée,
CFPA, établissements universitaires).
L’intégration de légumineuses dans une rotation Travail complémentaire nécessaire sur le contrôle
permet de diminuer l’utilisation globale de produits des bio-agresseurs.
phytosanitaires mais la culture de légumineuse elle- Allongement des rotations ou les cultures associées.
même reste sensible aux stress du milieu. Poursuivre la structuration de filière légumes secs
Absence ou insuffisance de produits phytosanitaires pour porter des démarches techniques et
homologués pour les légumineuses à graines, administratives.
considérées comme des cultures mineures. Diversifier les légumineuses à graines cultivées et les
Diminution de l’intérêt agronomique des débouchés à haute valeur ajoutée tout en maintenant
légumineuses par un retour trop fréquent dans la des rotations longues.
rotation au regard de l’intérêt économique de la Encourager une augmentation du nombre
légumineuse cultivée. d’agriculteurs cultivant des légumineuses.
32
Eviter les phénomènes de concentrations de surfaces

chez certains, pouvant conduire parfois à un temps
de retour trop court de la culture sur une même
parcelle.
Triage et conditionnement
Manque d’outils de triage et conditionnement des Faciliter les dispositifs de subventions pour les
légumineuses pour l’alimentation humaine. investissements de triage et conditionnement
(individuel et collectif).
La présence de ces outils est indispensable et permet
de redévelopper des surfaces de production dans des
zones où ces cultures ont disparu, ou bien dans de
nouvelles zones de productions.
Nécessité de disposer d’outils performants de triage La gestion de volumes significatifs (marché de la
et de conditionnement (maîtrise des coûts de grande distribution) de légumineuses.
production, adaptation des tailles de Mise en place d’une organisation logistique
conditionnements en fonction de la demande). performante en mutualisant les moyens avec l’appui
Peu de personnels qualifiés pour utiliser avec d’une collectivité, dans le cadre d’une coopérative.
efficacité ces outils.
Commercialisation
Concurrence des importations de légumineuses Accompagner les démarches qui permettent une
(Chine, Canada, Inde, Australie, Argentine). haute valeur ajoutée : signes d’identification de
l’origine et de la qualité.
Agriculture biologique, commerce équitable,
mentions valorisantes.
Développer l’approvisionnement en circuit court de
proximité.
Implication des territoires pour valoriser les
productions locales.
Tensions potentielles sur l’approvisionnement Accompagner les porteurs de projets dans la
(volumes disponibles, concurrence entre débouchés. réalisation d’études de marché en amont.
Soutenir les démarches contractuelles et
pluriannuelles pour permettre la mise en place de
filières.
Absence de filière entre producteurs et acheteurs. Construction de partenariat.
Santé et alimentation
Forte diminution de la quantité de légumineuses Identifiées les légumineuses en tant qu’apport de
consommées. protéines.
Perception négative des légumineuses de la part des Mise en place d’une communication des pouvoirs
consommateurs (image dépassée, méconnaissance publics
des vertus nutritionnelles et environnementales). Communication sur les bénéfices nutritionnels et
santé des légumes secs.
Utilisation des légumineuses en restauration
collective : plats protidiques végétariens.
Promouvoir les légumineuses dans les formations
professionnelles en lien avec l’alimentation.
Ressources financières
Le frein des ressources financières est identifié Une réflexion doit être menée sur le financement de
comme transversal à tous les autres freins. l’ensemble des leviers précédemment identifiés.
33
1.4. Les bactéries nodulant les légumineuses BNL

Du grec rhiza : racines et bio : vie, le rhizobium est le nom attribué aux bactéries capables
d’induire une nodulation et de fixer l’azote (Sprent, 2001) en association symbiotique avec les
eucaryotes photosynthétiques de la famille Fabaceae (légumineuses) (Ibanez et al., 2009).
Récemment le terme « rhizobia » a été substitué par le terme de BNL (Bactéries Nodulant les
Légumineuses) (Zakhia et al., 2004). Les microsymbiontes des légumineuses appartiennent à
trois principales sous-classes phylogéniques distinctes : alpha, beta et gamma-protéobactéries.
Dans la majorité des cas, la fixation de l’azote atmosphérique a lieu à l’intérieur du nodule
(racinaire ou caulinaire), organe de symbiose entre la légumineuse et la bactérie (Duhoux et
Nicole, 2004). Dans les nodosités, les bactéries fixent l’azote atmosphérique qui est utilisé par les
plantes, en retour les plantes leur fournissent de l’énergie (Schut, 2001). Les rhizobia se
développent bien dans le sol et en général, sont présents dans la terre cultivée.
1.4.1. Principales caractéristiques

Les rhizobia représentent 0,1 à 8 % de la flore totale du sol (Sadorwsky et Graham, 1998), ce
sont des coccobacilles ou bâtonnets réguliers (Bergey’s, 1984) de 0,6 à 0,8 µm de large sur 1 à
4µm de long, à Gram négatif, aérobies strictes, non sporulants (Bekki et al., 1987 ; Jordan,
1984 ; Tortora et al., 2003 ; Saad et al., 2006).
Ils sont généralement très mobiles quand ils sont jeunes grâce à la présence d’un seul flagelle
polaire ou 2 à 6 flagelles péritriches. Ces bactéries se trouvent soit à l’état libre ou à l’état
symbiotique sous forme de bactéroïdes avec une taille dix fois plus grande. Ces derniers ont une
forme en X, Y et T (Dommergues et Mangenot, 1970).
Ce sont également des bactéries mésophiles, leur température optimale de croissance se situe entre
25 à 30 °C. Certaines espèces se développent à des températures allant de 40,5 à 42,5 °C
(Boukhatem, 2012).
La plupart des rhizobia préfèrent les pH neutres (Jordan, 1984), d’autres au contraire, tolèrent des
pH très bas (Vincent, 1970) c’est le cas de Bradyrhizobium japonicum qui supporte des pH de
l’ordre de 3,5 à 4 (Dommergues et Mangenot, 1970). Il a été montré que des souches de
rhizobium peuvent croitre à des pH alcalin allant jusqu’à 12 (Kulkarni et al., 2000).
Sur milieu classique, Yeast Extract Mannitol (YEM), ces bactéries forment des colonies de 2 à 4
mm de diamètre après 3 à 5 jours d’incubation, de couleur blanchâtre ou beige, circulaires,
convexes, semi translucides ou opaques, élevées et mucilagineuses (Benadis et al., 2014 ;
34
Benslama et al., 2014). Elles possèdent la propriété de sécréter des exopolysaccharides

(Shamseldin et al., 2016).
Ces bactéries sont généralement très exigeantes en carbone ce qui leur confèrent un métabolisme
glucidique assez diversifié (glucose, mannitol, sucrose…). L’extrait de levure est utilisé comme
source principale d’azote pour leur culture. Il est également utilisé comme source de sels
minéraux.
La tolérance à la sécheresse et à la salinité sont notées parmi les propriétés des rhizobia
autochtones (Bekki et al., 1987 ; Merabet, 2007 ; Boukhatem, 2012 ; Baha et al., 2014).
1.4.2. Evolution taxonomique des rhizobia
La première bactérie nodulant une légumineuse a été isolée en 1888 par Beijerink, et initialement
nommée Bacillus radicicola, puis renommée Rhizobium leguminosarum (Frank, 1889). Plus tard,
la taxonomie des rhizobia a été fortement influencée par la plante- hôte qu’ils sont capables de
noduler (Fred et al., 1932). Dans la classification initiale des bactéries, les rhizobia ont été décrits
comme Gram négatif, aérobie, bactéries non sporulantes, et le critère principal était leur capacité
de nodulation. Plus tard, deux groupes de rhizobia ont été distingués sur le critère de leur vitesse
de croissance (Jordan, 1982) : le genre Rhizobium à croissance rapide, et le genre
Bradyrhizobium à croissance lente.
Il est apparu qu’il existait d’autres différences (Robledo et al., 2011), ce qui a causé un
changement de la méthode de classification remplacée par des techniques plus fiables comme les
méthodes comparatives (sérologie, coefficient de Chargaff ADN/ARN, hybridation ADN/ADN) et
l’analyse des plasmides (Saoudi, 2008).
Les premiers biovars ont été décrits dans l’espèce R. leguminosarum proposé par Jordan (1984) ;
selon cette proposition, les espèces R. leguminosarum, R. trifolii et R. phaseoli devenaient des
biovars (ou symbiovar proposé par Rogel et al. en 2011) d’une seule et même espèce R.
leguminosarum (Ramírez-Bahena et al., 2008).
A partir d’un genre et quatre espèces en 1981, les rhizobia sont répartis actuellement, en 14 genres
et 98 espèces symbiotiques . Quatre genres d’alpha-protéobactéries constituent les symbiotes
majoritaires de la plupart des espèces de légumineuses rencontrées à travers le monde : Rhizobium
(Franck, 1889), Ensifer (anciennement Sinorhizobium) (Chen et al., 1988; de Lajudie et al.,
1994; Young, 2003), Mesorhizobium (Jarvis et al., 1997), et Bradyrhizobium (Jordan, 1982).
Les espèces du genre Sinorhizobium ont été transférées dans le genre Ensifer par décision de la
Commission Judiciaire du Comité International sur la Systématique des Procaryotes (Tindall,
35
2008). Toutefois il existe d’autres genres d'α-protéobactéries, induisant des nodules, moins
fréquemment isolés, ayant une distribution géographique réduite et un spectre d'hôtes limité, et
découvertes plus récemment : Azorhizobium (Dreyfus et al., 1988), Methylobacterium (Sy et al.,
2001; Jourand et al., 2004), Phyllobacterium (Valverde et al., 2005), Ochrobactrum (Trujillo et
al., 2005; Zurdo- Pineirro et al., 2007), Devosia (Rivas et al., 2002), Shinella (Lin et al., 2008)
et Microvirga (Ardley et al., 2012). Par ailleurs, des symbiotes de légumineuses ont également été
trouvés dans le phylum des β-protéobactéries, Burkholderia (Moulin et al., 2001; Chen et al.,
2003a,b; 2005) et Cupriavidus (anciennement Ralstonia) (Chen et al., 2001; Chen et al., 2003;
Vandamme et Coenye, 2004). D’autres études auraient également identifié la présence de
protéobactéries du groupe γ : Pseudomonas (Shiraishi et al., 2010), dans les nodules des
légumineuses (Benhizia et al., 2004; Mahdhi et al., 2011; Huang et al., 2012). Il est intéressant
de noter que certains genres de rhizobium sont très proches de bactéries phytopathogènes comme
Agrobacterium. Leur différence phylogénétique par rapport aux rhizobia laisse penser qu’ils ont
acquis leurs gènes nod par un transfert de plasmides (Rivas et al., 2009 ; Rashid et al., 2015).
Depuis la proposition de Woese, de classer les bactéries sur la base du séquençage de l’ADN
ribosomique 16S (Woese et al., 1984), la taxonomie polyphasique moderne à conduit à la
description de nouveaux genres et espèces et de profonds changements ont été apporté dans la
taxonomie des symbiotes des légumineuses (Berrada et Fikri-Benbrahim, 2014).
La classification des rhizobia n’est pas définitive, elle s'affine et s'enrichit d’année en année avec
de nouvelles espèces et de nouveaux genres grâce à l’exploration de la diversité des symbiotes
associés aux légumineuses dans le monde (Weir, 2016). Récemment, la notion de symbiovar (sv)
a été introduite pour différencier les bactéries d’une même espèce mais qui possèdent une gamme
d’hôtes différents, par exemple l’espèce R. leguminosarum regroupe les symbiovars phaseoli,
trifolii et viciae qui nodulent réciproquement les espèces des genres Phaseolus, Trifolium et
Vicia/Pisum (Riah, 2014). La distinction en biovars repose sur le spectre d’hôte qui est lui-même
lié au type de gènes symbiotiques hébergés par la souche (Rogel et al., 2011).
1.4.3. Diversité des BNL nodulant Phaseolus vulgaris
Le haricot est une plante capable de former des nodules effectifs avec des groupes bactériens
génétiquement hétérogènes d'origines différentes (Pifiero et al., 1988; Martinez et al., 1988;
Laguerre et al., 1993 ; Eardly et al., 1995).
36
Le terme Bacillus-phaseolus a été appliqué au Rhizobium du haricot par Beijerinck (1888) afin de
le distinguer de toutes les autres souches de Rhizobium. Plus tard, Schneider (1892) proposa le
nom de Rhizobium frankü var majus pour les Rhizobium symbiotiques en les distinguant de
Rhizobium frankü var minus pour P. vulgaris. Cependant les désignations de Schneider n'étaient
pas valables sur le plan taxonomique et Rhizobium phaseolus devient la forme acceptée en 1926.
R. phaseoli est couramment utilisé pour l'identification des Rhizobium munis de flagelles, bien
vacuolisé. Selon la littérature, les souches de Rhizobium nodulant le haricot peuvent être séparées
en deux groupes. Le premier groupe contient les Rhizobium qui forment des nodules effectifs chez
le haricot, ce sont R. leguminosarum bv. phaseoli (Jordan, 1984), R. leguminosarum bv. trifolii,
R. etli, R. tropici. Le second groupe contient les rhizobia qui sont capables de former des nodules
ineffectifs tels que B. japonicum, A. caulinodans, et R. leguminosarum bv. viciae (Sardowsky et
a1., 1988; Waelkens et a1., 1995; Michiels et a1., 1998).
Les espèces de rhizobia telles R. gallicum, R. giardinii, avaient été proposé comme nouvelles
espèces (Amarger et al., 1997), en plus de R. etli et R. leguminosarum bv phaseoli retrouvés à
l’extérieur de l’Amérique latine dans des sols à haricots.
Sinorhizobium spp. nodulant Phaseolus vulgaris est nouveau dans les sols du bassin
méditerranéen. De 300 isolats de la collection Tunisienne, les 08 taxons suivants ont été identifiés:
R. gallicum, R. etli, R. leguminosarum bv phaseoli, R giardinii, S. fredii, S. meliloti, S. medicae et
pseudo agrobacterium (Mhamedi et al., 1999). Cette grande diversité a aussi été révélée par des
études sérologiques avec 62 % des isolats répartis en 19 sérogroupes (Fekki et al., 2000) de plus
la structure des populations des rhizobia vari selon la géographie. Au Maroc, 02 isolats ont été
identifiés comme R. leguminosarum bv phaseoli, quatre comme Pseudoagrobacterium et six
comme R. tropici. B (Bouhmouch et al., 2000) qui a été précédemment trouvé dans des sols
tropicaux de l’Amérique latine et l’Afrique mais pas sur le sol Tunisien. Pour l’Algérie, Benadis
(2015) a identifié 5 souches comme étant R. etli, 3 R. leguminosarum, 11 R. gallicum, 2 R. loti et
6 Agrobacterium.
19 et 30 rhizobia du Maroc et de la Tunisie respectivement ont été trouvés pour être au moins
comme effectif ou plus effectif que R. tropici B CIAT899 dans la symbiose avec les cultivars du
coco local. En test de nodulation selon Benadis (2015), les souches 17 et 2 de R. etli étaient les
plus efficientes de la collection des souches isolées d’Ain Témouchent.
Actuellement, différentes souches de Rhizobium ont été identifiées comme microsymbiotes de
Phaseolus vulgaris. La classification actuelle est illustrée dans le tableau 5.
37
Tableau 5: BNL associées à Phaseolus (Berrada et Fikri-Benbrahim, 2014 ; Shamseldin et al., 2016)
Classe: Alphaproteobacteria
Ordre: Rhizobiales Plante d’isolement Référence
Famille: Rhizobiaceae
Genre/Espèce/Symbiovar
R. leguminosarum Frank, 1889
symbiovar phaseoli Phaseolus vulgaris Frank, 1889 ; Jordan, 1980
R. tropici Phaseolus, Medicago, Macroptilieum Martinez-Romero et al., 1991
R. endophyticum Phaseolus vulgaris Lopez et al., 2010
R. phaseoli Phaseolus Lopez et al., 2010
R. etli Phaseolus, Segovia et al., 1993
symbiovar phaseoli Phaseolus Souza et al., 1994
R. gallicum Phaseolus vulgaris Amarger et al., 1997
symbiovar phaseoli Phaseolus vulgaris Amarger et al., 1997
symbiovar gallicum Phaseolus vulgaris Amarger et al., 1997
R. giardinii Phaseolus vulgaris Amarger et al., 1997
symbiovar phaseoli Phaseolus Amarger et al., 1997
symbiovar giardini Phaseolus vulgaris Amarger et al., 1997
R. lusitanum Phaseolus vulgaris Valverde et al., 2006
R. vallis Phaseolus vulgaris Wang et al., 2011
R. freirei Phaseolus vulgaris Dall’Agnol et al., 2013
R. azibens Phaseolus vulgaris Mnasri et al., 2014
R. paranaense Phaseolus vulgaris Dall’Agnol et al., 2014
Famille : Phyllobacteriaceae Plante d’isolement Référence
Phyllobacterium endophyticum Phaseolus vulgaris Flores-Félix et al., 2013
Classe: Betaproteobacteria
Ordre : Burkholderiales Plante d’isolement Référence
Famille : Burkholderiaceae
Cupriavidus necator Phaseolus vulgaris da silva et al., 2012
1.4.4. Mode d’infection chez Phaseolus

Le mode d'infection le plus étudié et le plus courant est l'infection intracellulaire où l'entrée des
bactéries dans la plante a lieu à travers des poils absorbants, et a été observé chez des
légumineuses tempérées (exemples : Medicago, Trifolium, Pisum) et certaines légumineuses
tropicales et subtropicales (exemples : Lotus, Phaseolus, Glycine) (Gage, 2004). Chez les espèces
tropicales exemple Phaseolus (Yin et al., 2011), les nodules de types déterminés sont initiés à
partir du cortex externe dont la persistance du méristème est très éphémère et la croissance en
longueur du nodule est limitée. Ce processus se traduit par une forme sphérique et un état de
différenciation identique pour toutes les cellules (Ferguson et al., 2010) qui sont ensuite
reconnues par des récepteurs spécifiques de la plante (Kouchi et al., 2010 ; Lindström et al.,
2010).
38
1.4.5. Gènes symbiotiques et phylogénie
La taxonomie des rhizobiums ne reflète pas les propriétés symbiotiques. La description des gènes
symbiotiques est également utile pour l'identification correcte de rhizobiums et des études de
biogéographie de Rhizobium (Rivas et al., 2009). La classification a changé quand Ramírez-
Bahena et al. (2008) ont révisé le statut taxonomique de R. trifolii, R. phaseoli et R.
leguminosarum, en intégrant R. trifoli dans R. leguminosarum et conservant R. phaseoli comme
espèce distincte (Rivas et al., 2009).
Les gènes symbiotiques chez Rhizobium sont impliqués dans la nodulation (nod) et la fixation de
l’azote (nif). Ils sont souvent regroupés en cluster de gènes ou « îlot symbiotique», latéralement
transférables (Martínez-Romero et al., 2010)
1.4.6. Méthodes appliquées à l’étude de la diversité des BNL
La diversité des rhizobia peut être évaluée par un ensemble de méthodes basées sur des
caractéristiques phénotypiques et génotypiques.
1.4.6.1. Méthodes phénotypiques
Les méthodes phénotypiques incluent toutes les techniques ne faisant pas appel aux acides
nucléiques et reposent sur la détermination des caractéristiques morphologiques, biochimiques, et
physiologiques des bactéries via des techniques standardisées (Vandamme et al., 1996 ;
Merabet, 2007). Les critères morphologiques fournissent des renseignements concernant les
caractéristiques de la cellule bactérienne (forme, présence de flagelles, coloration Gram) et
l’aspect des colonies observées sur la boîte de culture (taille, forme, couleur, état de la surface)
(Benslama, 2015). L’étude des caractères physiologiques impliqués dans l’identification
bactérienne repose sur la détermination de la vitesse de croissance, la capacité d’utiliser
différentes sources de carbone, la croissance à différentes variations de température, du pH, de sels
et d’antibiotiques (Boukhatem et al., 2012).
Ces analyses physiologiques sont souvent influencées par les facteurs environnementaux (Ouslim,
2015). Les caractéristiques phénotypiques classiques sont toujours admises comme étape
primordiale pour la description et l’identification des souches d’une même espèce (Vandamme et
al., 1996 ; Cohan, 2002 ; Merabet, 2007). Il est important de noter que les taxonomistes
bactériens prescrivent que ces critères phénotypiques soient pris en compte lorsqu'un auteur veut
donner un nom à une nouvelle espèce (Berrada et Fikri-Benbrahim, 2014).
39
Les collections de culture des micro-organismes (constitution de souchier) occupent une position
centrale en microbiologie (Scriban, 1982) car elles constituent une source continue de souches
répertoriées. Toute recherche constructive dans ce domaine, requiert des centres fiables et
adéquats susceptibles de fournir des cultures correctement conservées. En raison de leur fonction
de dépositaires d’organismes vivants délivrables ; les collections de cultures sont des instigateurs
de recherche (Beunard, 1994).
Ainsi les souches caractérisées sont potentiellement et continuellement disponibles pour les
chercheurs (Gillings et Holmes, 2004). La collection de culture des organismes vivants permet
également de faire croître un individu et de l’étudier ce qui peut être impossible avec les
spécimens desséchés et si les cultures vivantes de ces organismes sont toujours utilisables, on
obtiendra plus d’information en biologie comparative (Gillings et Holmes, 2004)
L’isolement est couteux en temps et en moyens et peut même ne pas être possible à cause des
interventions de l’homme et sous l’action de l’environnement. Il est difficile de reproduire les
mêmes opportunités aux mêmes moments et dans les mêmes conditions d’isolement (Gillings et
Holmes, 2004). L’acquisition des souches à partir d’une grande variété d’hôtes et de zones
géographiques différentes est indispensable pour l’étude de la variabilité, la diversité génétique et
en taxonomie.
La liste des souches conservées ainsi que toute information disponible les concernant
(caractéristiques métaboliques, taxonomiques,…) permet de rechercher des souches microbiennes
possédant des particularités intéressantes (tolérance au NaCl, croissance à des températures
extrêmes…). Généralement chaque laboratoire ayant isolé des souches, à sa propre façon
d’organiser sa collection ; à chaque souche il convient une fiche technique contenant toutes les
informations qui puissent aider à son utilisation, l’ensemble de ces fiches constitue un catalogue
propre au laboratoire.
1.4.6.2. Méthodes génotypiques
Ces méthodes sont basées sur l’analyse des molécules d’ADN ou d’ARN, soit au niveau de
l’ensemble du génome, soit en ciblant certains fragments du chromosome ou de plasmides
bactériens. Les progrès réalisés dans la connaissance de l’ADN bactérien permettent des
comparaisons beaucoup plus fines entre les bactéries et une classification plus rigoureuse. Si la
classification des rhizobia était longtemps basée sur leur capacité de nodulation et leurs
caractéristiques morphologiques, le séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S (Woese et al.,
1984), puis d'autres gènes dans le cadre des études MLSA (multilocus sequence analyses of
different protein-coding housekeeping genes), s’est progressivement imposé comme critère
40
essentiel pour la taxonomie et la classification phylogénétique des rhizobia indépendamment de

leur caractéristiques phénotypiques ou symbiotiques (Rivas et al., 2009). Graham et al. (1991)
ont suggéré des normes minimales pour la validation de nouvelles espèces bactériennes, qui sont
fondées sur les caractéristiques génotypiques (séquençage du gène ARNr 16S, hybridation
ADN/ADN, analyse RFLP…) et la description des caractéristiques morphologiques et
symbiotiques. Plusieurs techniques ont été proposées pour l’étude de la diversité taxonomique des
rhizobia et de leur classification par exemple la méthode FTIR (Fourier transformed infrared
spectroscopy), la spectroscopie de masse et les microarrays (Merabet, 2007).
1.4.6.2.1. L’amplification in vitro de l’ADN
1.4.6.2.1.1. Principe de la PCR
Les méthodes de typage génétique utilisent généralement des techniques qui permettent de classer
les micro-organismes étudiés en un nombre distinct de génotypes. La PCR (Polymerase Chain
Reaction) a permis le développement de nombreuses techniques de typage génétique qui on
l’intérêt d’être universelles, simples et rapides. Elles ont beaucoup servi pour la description de
nouveaux taxons de BNL.
La réplication in vitro d’un brin d’ADN est possible à partir d’amorces et d’une enzyme (ADN
polymérase). Cette réaction de polymérisation en chaine est classiquement réalisée à l’aide d’une
polymérase thermostable, la Taq polymérase et consiste en la répétition de trois étapes thermiques
réalisées successivement : une étape de dénaturation de l’ADN (90 °C- 95 °C), une étape
d’hybridation des amorces sur les séquences complémentaires de l’ADN dénaturé (30 °C- 65 °C ,
selon la séquence et la longueur de l’amorce), une étape d’extension des amorces par l’ADN
polymérase (72 °C).
1.4.6.2.1.2. La technique RFLP
Différents niveaux d’analyse de la diversité génétique peuvent se distinguer tant par le support de
l’information génétique concerné (ADN/ Protéine) que par la technique utilisée, comme par
exemple la PCR-RFLP ou polymorphisme des longueurs de fragments de restriction. L’ADNr 16S
ou 23S avec ou sans l’IGS (espace intergénique entre les gènes d’ADNr 16S et 23S) ou bien
d’autres gènes impliqués dans la symbiose ou la fixation d’azote, sont amplifiés avec des amorces
universelles définies en alignant les séquences disponibles. Le produit de la PCR est ensuite digéré
par des enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui
reconnaissent spécifiquement une séquence courte (4 à 8 bases) et coupent la chaine de l’ADN
chaque fois qu’elles reconnaissent cette séquence élémentaire. L’ADN se trouve ainsi fragmenté
41
en morceaux de différentes longueurs. Il existe de nombreuses enzymes de restriction, chacune

reconnaissant une séquence particulière et caractéristique. Cette technique fournit principalement
des profils spécifiques.
1.4.6.2.2. Collection génomique
Permise par les progrès des biotechnologies et de l’informatique, la génomique vise à dresser un
inventaire de l’ensemble des gènes d’un organisme (génome), et les progrès rapides en
biotechnologie ont considérablement augmenté la demande de meilleures méthodes de prévention
ainsi que la rapidité de la disponibilité d’informations stables concernant les propriétés
microbiennes (Aguilar et al., 2004).
Jusqu’à présent les collections sont assez stables et reproductibles, mais dans le futur elles se
transformeront en banque d’ADN entier provenant de cellules natives ce qui peut être préférable
au dépôt de simples séquences nucléotidiques et donc l’accès au génome entier permettrait de
mieux comprendre la diversité.
Les instituts de collection de cultures microbiennes tendent à se transformer en collection de
génomes et beaucoup d’entre elles ont déjà progressé pour devenir centre de ressources
biologiques. Ces centres renferment des collections d’organismes cultivables, des fragments
replicables de ceux-ci (exemple : génomes, plasmides …), tissus et cellules ainsi qu’une base de
données concernant des informations moléculaires, physiologiques et structurales (genbank,
2016).
1.4.7. Conservation du matériel biologique
Le seul moyen d’assurer qu’un caractère spécifique important, spécialement au niveau d’un micro-
organisme, provenant d’un écosystème ou d’une plante est utilisable pour l’étude et le
développement, c’est de bien conserver la souche microbienne car les hôtes et leur micro-
organismes associés sont dans un état de co-évolution dans les écosystèmes naturels où la
conservation in situ est la meilleure technique (Gillings et Holmes, 2004).
La valeur cumulative des collections de culture comme source de référence augmente inversement
à la diminution des habitats et des écosystèmes naturels et ne pouvant prédire l’évolution des
organismes vivants, il est de notre responsabilité envers les générations future de préserver ces
cultures aussi raisonnablement que l’on puisse (Arnold et Scott, 1991).
42
Plusieurs possibilités sont offertes pour maintenir les souches en survie et conserver toutes leurs
propriétés à court, moyen et long terme. Si on veut conserver un échantillon important on doit
combler les conditions suivantes :
- Utilisation d’un milieu pas trop riche dans un contenant bien bouché,
- Stockage à température constante
- Stockage à l’abri de la lumière
Dans le cas des BNL, les nodules récoltés peuvent être conservés stériles dans du glycérol. Ce
mode de conservation des souches via les nodules est préconisé pour l’étude génotypique.
43
2.1. Etats des lieux, prospections et choix de l’agroécosystème :
Afin de bien cadrer le sujet, une étude préliminaire et des enquêtes sur le terrain sont effectuées en
débutant par le choix de l’agroécosystème. Plusieurs zones à vocation agricole, sont choisies dans
l’Ouest Algérien: Mostaganem, Tissemsilt, Sidi Bel Abbes, Oued Tlélat, Oran et Ain Témouchent
(Figures 10, 11)
A B
Figure 10: Champ de haricot dans la wilaya d’Ain Témouchent
A : à Oulhaça (par Laabas S., 2011) ; B : à El Maleh (par Bouchentouf L., 2008)
Toutes ces zones connaissaient un des meilleurs essort agricultural sur le téritoir national,
malheuresement lors des dernières décinnies, elles enregistrent des fluctuations importantes des
rendements. Les enquêtes et les questions posées aux cultivateurs aux champs, ont permis de
contribuer à diriger les recherches selon les besoins et de mettre à jour les problèmes et difficultés
rencontrées lors des cultures des légumineuses.
Les prospections sur le terrain ont montré que les cultures des légumineuses alimentaires sont en
régression par conséquent des rendements non stables et non satisfaisants à l’Ouest Algérien.
Pratiquement tous les agriculteurs partagent le même constat à propos du haricot impliquant le
manque des semences très efficaces, les aléas climatiques et la pluviométrie qui sont les
principales causes du déclin de la production dans les zones précitées et qui sont à vocation
agricole par excellence.
Les premières questions posées aux agriculteurs ont révélé que les plantations débutent entre le 15
jusqu’au 24 février à raison de 60 kg pour une superficie de 1 ha en moyenne, sur des sols
43
argileux à haut pouvoir de rétention d’eau après une bonne saison pluviale. Une bonne récolte est
estimée jusqu’à 8 quintaux de haricot. L’action de l’ombre des arbres à proximité des plantes
procure une certaines fraicheur et maintient l’humidité ce qui explique une bonne croissance des
plantes bordant le champ par rapport au centre de celui-ci. Les agriculteurs affirment par
expérience que les sols laissés en jachère ou après rotation légumineuses- céréales, donnent de
bons rendements.
Néanmoins, dans la majorité des cas, les champs présentent un mauvais rendement, une chlorose et
une faible nodulation. Un taux très bas de nodulation est constaté sur les plantes in natura qui
peuvent présenter 2 ou 3 nodules voir une absence totale de nodulation (Figure 11) bien que les
agriculteurs confirment ne pas utiliser de fertilisants chimiques pour améliorer la production.
A B
Figure 11 : Photos représentant l’état des lieux au champ à Ain Témouchent El Malah
(par Bouchentouf L., 2008)
A : Culture du haricot au champ B : Chlorose du haricot C : Absence de nodules in situ
44
2.2. Echantillonnage :
Selon les enquêtes préalablement effectuées, 22 échantillons sont choisis de sols cultivés en
légumineuses alimentaires notamment le haricot, le pois chiche, le petit pois, la fève ainsi que les
céréales (blé, orge) dans les différentes zones précitées de l’Ouest Algérien (Tableau 6).
Tableau 6 : Localisation et informations relatives aux sites d’échantillonnage
Nombre de
Zone Coordonnées Code Propriété
sites
Site 1 M1 Exploitant privé
36°08’34’’ N Site 2 M2 Exploitant privé

Mostaganem Latitude
Longitude 0°27’38’’ E Site 3 M3 Exploitant privé
Site 4 M4 Exploitant privé
Site 1 ER1 Exploitant privé
Oran Site 2 ER2 Exploitant privé
Latitude 35°42’N Site 3 OR1 Exploitant privé
(commune Longitude 0°30’ O
Altitude 109 m Site 4 OR2 Exploitant privé
d’Oran)
Site 5 HB1 Exploitant privé
Site 6 HB2 Exploitant privé
Oran
(commune Latitude 35°33’N
Longitude 0°27’0 Site 1 OT Exploitant privé
de
Altitude 133m
Oued Tlélat)
Site 1 AT1 Exploitant privé
Ain Latitude 35° 14’ 35’’ N Site 4 AT4 Exploitant privé
Longitude 01° 26’ 83’’ E Site 5 AT5 Exploitant privé
Témouchent
Altitude 150 m Site 6 AT6 Exploitant privé
Centre de
Latitude 50°35’48’’ N formation
Tissemsilt Longitude 01°49’28’’ E Site 1 TS professionnelle
Altitude 840 m et
d’apprentissage
Sidi Bel Latitude 35° 10’ 35’’ N
Longitude 00° 38’ 52’’ O Site 1 SB Station INRA
Abbès
Altitude 490 m
45
Les sites d’échantillonnage sont représentés sur les figures suivantes 12, 13, 14 :
Figure 12 : Localisation par satellite (Google earth, 2011)

(Positionnement par rapport au littoral)
Figure 13 : Géo- localisation des sites d’échantillonnage par wilayat (représentés en couleur)
(www.cartealgérie.departement.html).
46
N
Figure 14 : Site d’échantillonnage à Ain Témouchent par commune (représentées en couleur)

(www.carte algérie.com)
47
2.3 Analyses physico-chimiques des sols :
Les méthodes d'analyses des sols, sont basées sur les travaux de Mathieu et Pieltain (2003) et sont
composées de deux parties : les analyses physiques (granulométriques) et chimiques (carbone, pH et
conductivité, calcaire total et actif, phosphore, matière organique) .
Les analyses des sols sont réalisées au laboratoire de Pédologie du département de Biologie, au
laboratoire de Microbiologie du département de Biotechnologie et à l’Institut National de
Recherche Agronomique (INRA) de la wilaya de Sidi Bel Abbes.
2.3.1. Analyse granulométrique (Rouiller et al., 1994)
Elle consiste à classer les éléments du sol d'après leurs grosseurs (Annexe 01) et à déterminer le
pourcentage de chaque fraction (Bonneau et Souchier, 1979). Elle est déterminante du
comportement physico-chimique des autres paramètres lorsqu’on parle de perméabilité ou de
drainage.
2.3.2. Mesure du pH (Callot-Dupuis, 1980)
A 50 g de terre fine (séchée à l’air libre) y sont ajoutés 200 ml d’eau distillée (pour mesurer le pH
eau), ou 200 ml de KCl 0,1 N (pour mesurer le pH KCl), le contenu est agité pendant 02 h, à l’aide
d’un agitateur, puis laisser reposer 03 h pour mesurer le pH. Les résultats sont traités selon les
normes suivantes :
Sol neutre : pH= 7 (6,5 – 7,5)
Sol extrêmement acide : pH <4,4
Sol très acide : 4,4<pH<5,5
Sol moyennement acide : 5,5< pH<6,5
Sol légèrement à moyennement alcalin : 7,5 < pH <8,5
Sol alcalin : 8,5< pH< 9
Sol très alcalin : pH> 9
2.3.3. Détermination de la conductivité électrique (Aubert, 1978)
Le principe consiste à déterminer la conductivité électrique de l’eau pour déterminer la salinité de

l’extrait du sol.
48
10 g de terre fine sont ajoutés à 100 ml d’eau distillée. Mettre dans un flacon, chauffer puis agiter
pendant 30 min, filtrer en utilisant du papier filtre. Après filtration, mesurer la conductivité
électrique du filtrat.
La mesure est effectuée grâce au conductimètre. L’interprétation du résultat est faite selon
l’échelle internationale de salure.
Sol moins salé : CE< 0,5
Sol légèrement salé : 0,5< CE <1
Sol salé : 1< CE< 2
Sol très salé : 2< CE <4
Sol extrêmement salé : CE< 4
Le département d’agriculture et d’alimentation d’Australie apporte plus de précisions à cette
échelle d’interprétation en rapport avec la texture du sol. L’interprétation de la salinité du sol est
fonction et de sa texture et de la conductivité électrique de l’extrait aqueux (Department of
Agriculture and Food – salinity measures. Units and classes 2012).
2.3.4. Dosage du calcaire total (Callot-Dupuis, 1980) (Annexe 01)
On utilise la propriété du carbonate de calcium qui se décompose sous l’action d’un acide, en eau
et gaz carbonique, ce dernier est recueilli dans un tube gradué en ml.
L'échantillon à analyser est acidifié, en milieu fermé, par une solution d'acide chlorhydrique. En
présence de carbonates, il y a dégagement de dioxyde de carbone dont on mesure le volume.
CaCO3 + 2HCl CO2 + CaCl2 + H2O
Pour calculer le taux du calcaire total, on applique la formule suivante :
CaCO3% = [(p x V)/ (P x v)] x 100
p : poids du CaCO3 pur utilisé pour l’étalonnage.

V : volume du gaz carbonique dégagé par l’échantillon du sol.
P : poids de l’échantillon du sol.
v : volume du gaz carbonique dégagé par le CaCO3.
49
Les valeurs sont interprétées comme suit :

Sol non calcaire : CaCO3T< 1%
Sol peu calcaire : 1%< CaCO3T<5%
Sol modérément calcaire : 5%< CaCO3T< 25%
Sol fortement calcaire : 25% < CaCO3T< 50%
Sol très fortement calcaire : 50%< CaCO3T< 80%
Sol extrêmement calcaire : CaCO3T> 80%
2.3.5. Dosage du calcaire actif (Drouineau – Galet, 1942) (Annexe 01)
La fraction du calcium actif est déterminée après agitation de la suspension du sol additionnée
d'oxalate d'ammonium. La quantité d'oxalate résiduelle est dosée par titrimétrie en présence d'une
solution de permanganate de potassium.
Dans le sol, une partie plus ou moins importante du calcaire total se trouve à l’état de fines
particules actives pour les végétaux, cette fraction est facilement solubilisée par les eaux riches en
gaz carbonique.
Pour le dosage du calcaire actif, on utilise la propriété du calcium se combinant aux oxalates
d’ammonium pour donner de l’oxalate de calcium insoluble. L’excès de solution d’oxalate
d’ammonium et ensuite dosé par une solution de permanganate de potassium en milieu sulfurique.
2 KMnO4 + 5(NH4)2C2O4 + 8H2SO4 2MnSO4 +K2SO4 +5(NH4)2SO4 +10CO2 +8H2O
La teneur en calcaire actif exprimée en % est obtenue à partir de la formule suivante :
Calcaire actif %=1,25 x(N-n)
N-n : correspond à la quantité d’oxalate de calcium précipitée, donc à la quantité d’oxalate d’ammonium
qui réagit avec le calcaire actif.
N : nombre de ml de KMnO4 utilisé pour titrer la solution d’oxalate d’ammonium.
n : nombre de ml de KMnO4 utilisé pour titrer l’extrait de sol.
Les normes sont :
Sol peu calcaire : 0%< CaCO3T<5%

Sol moyennement calcaire : 5% <CaCO3T< 15%
Sol calcaire : 15%< CaCO3T< 30%
Sol très calcaire : CaCO3T >30%
50
2.3.6. Dosage du phosphore assimilable (Duchaufour, 1959) (Annexe 01)

Dans le sol, le phosphore assimilable se trouve essentiellement sous forme de phosphate de
calcium (mono, bi ou tricalcique), de Fer et d’aluminium.
Les phosphates de calcium sont extraits par une solution d’acide à faible concentration, alors que
ceux du Fer et d’aluminium le sont surtout par une solution alcaline.
La teneur en phosphore assimilable est donnée par la formule suivante :
P2O5% = 25Q/P
P : poids de terre de la prise d’essai.

Q : teneur en mg/l
Les normes pour l’interprétation des résultats sont :

Teneur basse : P<10 mg/l
Teneur moyenne : 11mg /l<P <31 mg/l
Teneur élevée : 31 mg/l <P<51 mg/l
Teneur très élevée : P>56 mg/l
2.3.7. Dosage du carbone total et de la matière organique (Anne, 1945)
1 g de sol séché à l’air est pesé dans une tare à poids connu, il est ensuite placé au four pendant 6 h
à 58°C. Après l’échauffement, l’échantillon est pesé à nouveau. La teneur en matière organique
totale du sol s'obtient généralement en dosant la teneur en carbone.
La matière organique est oxydée par un mélange de bichromate de potassium et d'acide sulfurique;
L'excès de bichromate est titré par le sel de Mohr.
L’oxydation s'effectue à chaud, à l'ébullition pour que cette oxydation soit complète, le temps
d'ébullition doit être de 5 min.
Pour 10 ml de solution de bichromate de potassium à 8 % additionnée de 15 ml d'acide sulfurique
concentré, la prise d'essai de sol ne doit pas excéder 30 mg.
Les formules suivantes permettent de calculer :
MO % = (P2 - P1) / (P3 – P1)
51
C % = MO % / 1,72
MO: Matière Organique.

P1 : Poids de tare.
P2 : Poids de tare plus 1g d’échantillon avant échauffement.
P3 : poids de tare plus 1g d’échantillon sec après échauffement.
C : Carbone organique.
Les normes sont :

Très faible : <1%
Faible : 1%< MO < 2%
Moyenne : 2%< MO <3%
Forte : 3%< MO <5%
Très forte : MO >5%
2.3.8. Dosage de l’azote
Pour le dosage de l’azote, 1g de sol est minéralisé en milieu acide sulfurique (20 ml) en présence
de cuivre et d’un catalyseur (10 g K2SO4 + 1 g CuSO4). Les ions ammonium sont transformés en
ammoniac par passage en milieu alcalin. Le NH3 est entrainé par la vapeur d’eau et estimé par
dosage volumétrique acide /base. La distillation se fait par prise de 20 ml et la titration se fait par
le pH mètre dans l’acide borique par l’acide sulfurique (0,05 N).
N%= V/v x(T-B) x Nx 1,4/S

N%= 250/20x (T-B) x 0,05x 1,4/= (T-B) x 0,875
N%= (T-B) x 0,875
V : volume de la fiole jaugée égale 250 ml

v : volume prélevé de la fiole égale 20 ml
S : poids du sol (1 g)
N : normalité de l’acide sulfurique égale 0,05 N
T : volume de l’acide sulfurique lu sur la burette lors du titrage pour l’échantillon
B : volume de l’acide sulfurique lu sur la burette lors du titrage pour le témoin.
52
Normes d’interprétation de l’azote total :

N< 0,05%
0,05%<N<0,1%
0,1%<N<0,15%
0,15%<N< 0,25% riche
N> 0,25% très riche
Rapport C/N :
C/N : ≤ 10 satisfaisant
10< C/N <12 peu élevé
12< C/N< 15 assez élevé
C/N >15 2levé
53
2.4. Collecte des nodules in natura

La collecte des nodules est réalisée à partir des racines de la légumineuse Phaseolus vulgaris L.
selon les techniques préconisées par Vincent (1970) ainsi que Somasegaran et Hoben (1994).
Un trou d’environ 15 cm est creusé autour de la plante et 20 cm dans le sol pour extraire la plante
et son appareil racinaire. Manuellement, la terre est débarrassée au niveau des racines sans
toutefois endommager les nodules. Les racines avec leurs nodules si présents, sont lavées
délicatement, à l’eau de robinet, des restes de terre.
2.5. Piégeage des rhizobia
Différentes combinaisons de piégeage sont exécutées avec les variétés du haricot sur les différents
sols afin d’estimer leur pouvoir infectif et efficient.
Le matériel végétal utilisé est la variété fermière locale blanche de Phaseolus vulgaris L. de Ain
Témouchent fournie par un exploitant privé. La semence était conservée dans une chambre froide
et présente un tégument blanc lisse et une graine charnue exempte de tout agent de conservation.
Les semences sont triées en procédant, sur les lots mis à notre disposition, à l'élimination des
graines endommagées ou présentant un écart de taille et de pigmentation par apport à la classe la
plus représentative. Toute graine présentant des signes d’altération est écartée.
2.5.1. Préparation des graines
Les graines sont désinfectées à l’hypochlorite de sodium (32°) durant 10 min, puis rincées 5 fois à
l’eau distillée stérile afin d’éliminer les traces du désinfectant. Elles sont ensuite mises à germer
aseptiquement sur de l’eau gélosée 1 % (Tillard et Drevon, 1988) (Annexe 02); les boîtes de Pétri
ainsi préparées sont mises à l’obscurité à 28°C.
2.5.2. Culture en pots
La symbiose est conduite dans des pots en plastique perforés et désinfectés préalablement à l’eau
javellisée à 12° ensuite séchés. Après germination des graines, les plantules dont la longueur des
radicelles atteint 2 cm, sont transférées dans les pots contenant 100 g de chaque échantillon de sol
à raison de trois graines par pot.
Les pots sont placés sous une intensité lumineuse de 2000 Lux, durant une photopériode de 16 h et
sont arrosés par capillarité avec de l’eau distillée stérile et la solution nutritive (Annexe 02) en
alternance et à la demande.
54
2.5.3. Prélèvements des plantes
En pleine floraison, les plantes sont dépotées, les mottes de terre sont éliminées et la partie racinaire est
nettoyée doucement par trempage dans de l'eau afin d'éviter autant que possible d'abîmer le système
racinaire. Les racines sont examinées pour détecter la présence de nodules. Ces derniers sont détachés
des racines, comptés à l'état frais et un nodule par plante est coupé transversalement pour rechercher la
présence d'une zone rouge ou rose résultant de la production de léghémoglobine.
Les parties aériennes et racinaires des plantes sont séparées au niveau du nœud cotylédonaire. Chaque
partie de la plante est mise en sachet et séchée à 70°C pendant 48h.
2.5.4. Conservation des nodules
L'utilisation de souches de rhizobia isolées à partir des nodules prélevés sur des légumineuses est la
méthode la plus efficace pour constituer une collection. Il n’est pas toujours évident de pratiquer les
techniques d’isolement immédiatement après le prélèvement des nodosités, et pour que celles-ci ne
subissent pas de détérioration irréversibles, il est recommandé de les conserver.
Les nodules séchés sur papier filtre sont conservés directement au réfrigérateur à 4° C pour un
usage immédiat. Pour une longue conservation, les nodules récoltés sont conservés secs dans des
tubes contenant le chlorure de calcium CaCl2 (qui doit être de couleur blanche pour être actif) et
surmonté de coton cardé (Vincent, 1970). Les nodules conditionnés de cette façon pourront être
conservés plus d'un an au réfrigérateur (Vincent, 1970; Cleyet- Marel, 1983).
La deuxième méthode de conservation consiste à placer les nodules dans des Eppendorfs
additionnés de glycérol stérile à 60 %. Sur chaque flacon sont mentionnés la date et le lieu de
collecte ainsi que la date de conservation.
2.6. Isolement des bactéries à partir des nodules
2.6.1. Stérilisation des nodules

Les nodules conservés, dans un agent dessicatif, sont auparavant mis dans l’eau au réfrigérateur
toute une nuit pour les hydrater et de ce fait ils gonflent. Les nodules sont immergés dans
l’hypochlorite de sodium à 32° pendant 10 minutes ensuite immergés dans l’éthanol absolu
pendant 5 à 10 secondes, ensuite sont rincés 10 fois à l’eau distillée stérile (Vincent, 1970). Les
nodosités formées sur les racines sont lavées à l’eau courante pour éliminer les grosses particules
du sol ; elles sont ensuite immergées dans l’hypochlorite de sodium à 32° pendant 10 minutes
ensuite rincées à l’eau distillée stérile (Vincent, 1970). A l’aide d’une pince flambée à l’alcool,
55
elles sont transférées dans de l’alcool absolu pendant 5 minutes puis rincées 5 à 6 fois dans de
l’eau distillée stérile.
2.6.2. Isolement des bactéries

Les nodules désinfectés, sont écrasés sur milieu YEM solide (Annexe 02) et l’extrait de chaque
nodule est ensemencé par des stries d’épuisement de manière à avoir des colonies isolées et donc
faciles à caractériser. L’opération est réalisée dans des conditions d’asepsie totale. Les boîtes sont
incubées à 28 °C et le développement des colonies est suivi régulièrement. Le type colonial le plus
représentatif est choisi pour procéder à la purification des souches par repiquages successifs sur
milieu YEM solide.
2.7. Purification des isolats

- Par stries d’épuisement
De chaque boîte incubée, des colonies bien isolées sont repiquées et ensemencées par stries
d’épuisement sur le milieu YEM solide. Après incubation à 28 °C pendant 48 h à 72 h, l’opération
est renouvelée de la même façon jusqu’à l’obtention de cultures pures.
- Par la méthode de dilutions

Une série de tubes, contenant 9 ml d’eau physiologiques stérile (Annexe 02) est utilisée pour
diluer les suspensions bactériennes difficiles à purifier. Les dilutions sont effectuées jusqu’à 10-7.
0,1 ml des trois dernières dilutions est étalée séparément sur trois boîtes de Pétri contenant du
milieu YEM solide avec deux répétitions pour chaque dilution, l’ensemble des boîtes est incubé à
28 °C pendant 48 h à 72 h.
2. 8. Détermination de quelques caractéristiques des isolats
La détermination des caractères morphologiques, biochimiques et physiologiques des isolats

retenus permet d'aboutir à une meilleure connaissance des souches BNL obtenues.
La méthode utilisée pour la détermination des caractéristiques des souches, est celle préconisée et
standardisée par l'American Society of Microbiology (Smibert et Krieg, 1984; Novikova, 1994).
Cette méthodologie insiste sur la qualité de la technique de conservation, le nombre de répétitions
et l'importance des témoins.
56
2.8.1. Etude macroscopique

Les colonies bactériennes pures apparues sur le milieu YEM gélosé, sont soigneusement observées
à l’aide d’une loupe binoculaire pour permettre de révéler la couleur, la forme, la taille, le contour
et la viscosité (Dommergues et Mangenot, 1970).
2.8.2. Etude microscopique

Après la coloration différentielle, les cultures sont examinées au microscope photonique pour
déterminer le Gram, la forme des cellules, le mode d’association et la pureté de la culture
(Dommergues et Mangenot, 1970). L’observation à l’état frais permet de déceler la mobilité.
2.8.3. Caractéristiques distinctives des BNL

Un certain nombre de caractères physiologiques et métaboliques propres aux bactéries associées
aux nodules des légumineuses, en particulier les BNL, sont recherchés. En citant la bibliographie
spécifique (Jordan, 1984 ; Vincent, 1970, 1982 ; Somasegaran et Hoben, 1994), il s’agit d’une
part des tests distinctifs entre le genre Rhizobium et le genre Agrobacterium et d’autre part, de
tester l’absorption, par les isolats, du rouge Congo faiblement concentré et de vérifier leur vitesse
de croissance pour la distinction entre les souches à croissance rapide et les souches à croissance
lente.
2.8.4. Absorption du rouge Congo

Les colonies typiques aux rhizobia absorbent faiblement le rouge Congo (Jordan, 1984;
Somasegaran et Hoben, 1994) par rapport aux contaminants ou les souches occupant le nodule
sans fixation de l’azote. Le test consiste à ensemencer les isolats, par stries d’épuisement, sur
milieu YEM gélosé contenant 0,0025 % de rouge Congo et les incuber à 28 °C pendant une
semaine.
2.8.5. Vitesse de croissance

Les bactéries nodulant les légumineuses, en particulier les rhizobia, présentent deux types de
croissance : les bactéries à croissance lente (genre Bradyrhizobium) et les bactéries à croissance
rapide (genres Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, …). Pour cela les isolats sont
ensemencés par stries d’épuisement sur milieu YEM gélosé additionné de bleu de bromothymol.
L’aptitude à modifier le pH en 24 h distingue les bactéries à croissance rapide de celles à
croissance lente dont l’acidification du milieu est tardive (après 5 à 6 jours).
57
2.8.6. Test mannitol-mobilité
Le test du mannitol-mobilité (Annexe 02) a pour but de confirmer la mobilité des isolats observée
sous microscope à l’état frais. La technique consiste à ensemencer le culot par piqure centrale au
fil droit et incuber les cultures à 28 °C pendant 72 h en suivant quotidiennement le virage de
l’indicateur coloré et la formation de l’arborescence autour de la piqure.
2.9. Mise en collection
Avant de répertorier les isolats et les mettre en collection il faut vérifier leur pureté
2.9.1. Vérification de la pureté des souches
A partir des colonies retenues après les tests précités, les souches sont repiquées par la méthode
d'épuisement sur milieu YEM solide en boîtes de Pétri et incubées à 28 °C pendant 48 h à 72 h
(Vincent, 1970). L'opération est répétée plusieurs fois jusqu'à l'apparition de colonies pures et
identiques après repiquages successifs.
2.9.2. Conservation des isolats purs
Les colonies typiques et propres aux bactéries nodulant les légumineuses (BNL) sont retenues en
fonction de l’aspect macroscopique. D’après l’aspect microscopique, les cellules en forme de
bacilles courts et Gram négatif sont conservées selon deux méthodes:
- Conservation courte durée : les souches sont repiquées stérilement sur milieu YEM solide
incliné (Vincent, 1970) et incubées à 28 °C. Après 48 h à 72 h d’incubation, les tubes
étiquetés sont conservés au réfrigérateur à + 4 °C. Il est recommandé de repiquer
régulièrement les souches tout les 06 mois environ (Beunard, 1994).
- Conservation longues durée à -20 °C: pour une conservation dépassant les 6 mois, les
souches doivent être ensemencées dans du milieu YEM liquide et incubées à 28 °C pendant
deux jours et additionné de glycérol à 60 % (V/V). Pour plus de sécurité les souches
doivent être conservées en plusieurs exemplaires avec différentes méthodes.
Les souches isolées dans notre laboratoire sont répertoriées selon la fiche présentée en figure 15.
58
ORN :
Autres noms :
Genre et espèce :
Plante d’isolement :
Type d’isolement (in situ, piégeage au laboratoire) :
Date d’isolement :
Isolé/ envoyé par :
Pays :
Localisation précise :
Type de nodules (de racine, de tige) :
Nod + sur :
Nod – sur :
Fix + sur :
Fix – sur :
Phénotype :
Résistance aux antibiotiques :
Propriétés
Phages :
Plasmides :
Bibliographie :
Diffusion :
Date de mise en collection :
Remarques :
Figure 15: Fiche de renseignements de la souche
59
2.10. Etude physiologique
2.10.1. Croissance en milieu YEM liquide
Dans le but de déterminer les différentes phases de croissance des souches, 1 ml de chaque
préculture (après 48h d’incubation) est ensemencé dans 100 ml de milieu YEM liquide.
Les flacons sont placés sous agitation à 28 °C et la croissance des cellules est estimée au
spectrophotomètre en mesurant, à intervalle régulier, la densité optique à 600 nm.
2.10.2. Effet de la température
Afin d’estimer les températures optimales et maximales de croissance, le test est effectué en une
série de 03 tubes du milieu YEM liquide. Pour chaque souche, un volume de 1 ml d’une préculture
est prélevé et ensemencé dans 100 ml de milieu YEM liquide et stérile. Les tubes sont incubés
pendant 48 h à 72 h à différentes températures (4°C, 7°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C,
40°C, 45°C).
2.10.3. Croissance à différents pH
Les souches sont cultivées sur le milieu YEM liquide tamponné à différents pH 5,3 ; 5,6 ; 5,8 ; 6,8
; (témoin 7) ; 7,8 ; 8,8 ; et 9,8 (Hainque et al., 2008). La croissance est évaluée dans chaque tube
à 600 nm à intervalle régulier d’incubation.
2.10.4. Métabolisme glucidique
Les souches sont cultivées sur le milieu YEM solide additionné de l’indicateur de pH le pourpre de
Bromocrésol (BCP à 0,2 %). Le mannitol est remplacé par l’un des sucres suivants : arabinose,
fructose, galactose, saccharose, glucose, xylose, sorbitol, lactose, maltose et raffinose.
L’ensemencement est effectué en touches à la surface et les boîtes sont incubées à 28 °C pendant
72 h.
2.10.5. Effet des antibiotiques
La surface du milieu YEM est inondée par chaque suspension bactérienne (100 µl) qui est ensuite
étalée à l’aide d’un étaloir stérile flambé à l’alcool et à l’aide d’une pince stérile. Les différents
60
disques d’antibiotiques sont déposés, à l’aide d’une pince stérile, à la surface de la gélose de façon
à ce que la distance entre deux disques soit comprise entre 2,5 à 3 cm.
Les antibiotiques utilisés sont : chloramphenicol (C) (30 µg), sreptomycine (S) (10 µg),
ampicilline (AMP) (10 µg), tetracycline (TE) (30 µg), rifampine (10 µg), erytromycine (E) (15
µg), acide nalidixique (NA) (30 µg).
2.10.6. Solubilisation du phosphate
Le test de solubilisation du phosphate a été effectué sur milieu PVK bicalcique solide additionné
de bleu de bromophénol (Annexe 02).
Les boîtes de Pétri sont ensemencées par touches (3 à 4 souches par boîte de Pétri) à partir de
suspensions bactériennes issues de précultures fraîches (DO de 0,1). Les boîtes sont incubées à
28°C et la lecture des résultats est suivie jusqu’à 7 jours pour repérer la présence de zones claires
autour des colonies (Afzal et Bano, 2008).
2.11. Test de nodulation

Dans le but de vérifier l’appartenance, des souches étudiées aux BNL, le test de nodulation est
réalisé in vitro sur des plantules inoculées par les souches purifiées est conservées précédemment
pour évaluer leur potentiel d’infectivité et d’efficience (Hungria et al., 1991; Thrall et al., 2000;
Murray et al., 2001) en conditions contrôlées.
2.11.1. Préparation des graines de Phaseolus vulgaris L.

Les graines sont désinfectées à l’hypochlorite de sodium (32°) durant 10 min puis rincées à l’eau
distillée stérile 10 fois afin d’éliminer les traces du désinfectant. Elles sont ensuite mises à germer
aseptiquement sur eau gélosée (1 %) dans des boîtes de Pétri à 28 °C, pendant 4 à 5 Jours (Tillard
et Drevon, 1988).
Le test est réalisé avec les graines du haricot Phaseolus vulgaris L de Ain Témouchent, la variété
locale de couleur blanche.
2.11.2. Préparation des suspensions bactériennes
Chaque souche est ensemencée en milieu YEM liquide pendant 48 h, la densité de croissance
correspond au tube N° 0,5 de Mc Farland (Annexe 02).
61
2.11.3. Mise en place des plantules et inoculation
L’habilité des micro-organismes à noduler et à fixer l’azote avec la plante-hôte est un caractère
important et pratique pour les BNL et doit être analysé en détail (Graham et al., 1991) ; les tests
de nodulation doivent être conduits dans des tubes appropriés (Beck et al., 1993). Après
l’isolement et les caractéristiques morphologiques, culturales, biochimiques et physiologiques, une
première approche pour identifier les isolats est leur capacité et aptitude à former des nodules avec
la plante-hôte, en conditions bactériologiques contrôlées.
Après germination des graines, l’ensemble des plantules obtenues dont les radicelles ne dépassent
pas 2 cm sont transférées aseptiquement dans des tubes Gibson recouverts de papier aluminium et
pourvus de deux trous servant pour le repiquage, l'arrosage ou l'inoculation des plantules. Le test
est réalisé à raison de 3 tubes pour chaque souche et un tube témoin remplit de solution nutritive
dépourvue d’azote (Puppo et Rigaud, 1975). Ces plantules sont inoculées avec 1 ml de la
suspension bactérienne de chaque souche retenue après 48 h d’incubation (DO = 0,1). Les tubes
sont recouverts afin de maintenir les racines à l’obscurité et placées par la suite dans une chambre
de culture (type SANYO. Electric Biomedical.Co., Ltd. Model MLR-350) à une température de 23
°C, 70 % d’humidité relative, une photopériode de 16 h avec une intensité lumineuse de 2000 Lux.
Une semaine après, les plantules du haricot sont ré-inoculées par 1 ml de chaque suspension
bactérienne (Abdel-wahab et Zaharan, 1981). Toutes les plantes sont arrosées aseptiquement par
la solution nutritive stérile tous les deux jours pour compenser la quantité d’eau perdue lors de la
transpiration de la plante.
2.11.4. Estimation de la croissance des plantes
2.11.4. 1. Phénotype des plantes
Au stade de floraison, lorsque la nodulation est potentiellement optimale (Drevon et al., 2003),
toutes les plantes sont récupérées afin de mesurer le poids sec de la partie aérienne et racinaire. Le
phénotype des plantes est noté et la surface foliaire comparée.
2.11.4.2. Partie aérienne :

Les parties aériennes sont soigneusement enveloppées dans du papier et laissées séchées à la
température de 60 °C pendant trois jours.
Une fois les échantillons complètement secs (vérifier cela par une constance du poids), leur poids
sec est déterminé à l'aide d'une balance électronique à précision.
62
2.11.4.3. Partie racinaire
Les nodosités formées sur les racines sont récupérées puis désinfectées à l’hypochlorite de sodium
12° pendant 10 min et rincées à l’eau distillée stérile ensuite conservées dans du glycérol (60 %) à
-20 °C (Vincent, 1970). Les racines sont soigneusement essuyées avec du papier absorbant pour
éliminer les traces de la solution nutritive ensuite enveloppées dans du papier et laissées à
température ambiante pour sécher pendant 15 jours. L'évaluation consiste à mesurer le nombre des
nodules par plantes ou la biomasse sèche.
2.11.4.4. Analyse statistique
Toutes les valeurs du test d’inoculation représentent la moyenne de trois répétitions. Les résultats
ont fait l’objet d’une analyse de la variance pour l’effet souche. Le seuil de la probabilité utilisé
pour déterminer la signifiance est p< 0,05, quand le logiciel STATISTICA indique un effet
significatif.
2.12. Etude génotypique
L’analyse phénotypique des isolats est suivie, dans une seconde étape, par une caractérisation
moléculaire partielle utilisant la PCR -RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorphism of PCR
amplified fragments) pour l’analyse de la région intergénique de l’ADNr IGS 16S-23S (Laguerre
et al., 1996 ; Laguerre et al., 2003).
Cette partie du travail est réalisée à l’IRD Dakar au Sénégal sous l’aimable direction du
Professeur N’Doye Ibrahima et ses collaborateurs du laboratoire LCM Bel Air.
2.12.1. Aseptisation des nodules
Avant l'extraction, les nodules sont d'abord stérilisés superficiellement. 05 exemplaires de nodules
de taille moyenne sont choisis, à raison de 1 nodule par tube Eppendorf, et sont aseptisés dans
l’hypochlorite de calcium 3,3 % (p/v) pendant 3 à 5 min puis rincer dans de l’eau distillée stérile,
suivie d’une aseptisation à l’éthanol absolu 96° pendant 3 à 5 min puis rincer 3 fois à l’eau distillée
stérile.
Les nodules sont relavés une autre fois à l’eau distillée stérile et resuspendus. L’eau est éliminée à
la fin.
63
2.12.2. Extraction et purification de l’ADN nodulaire
2.12.2.1. Extraction de l’ADN de nodules avec GES (Guanidine thiocyanate, EDTA, Sarcosyl)
Chaque nodule est broyé, à l’aide d’une tige en verre stérilisée à l’alcool absolu et passée à la
flamme, dans 100 µl de tampon de broyage (TES/ Saccharose, pH 8,0 stérilisé) (Annexe 02). 10 µl
de lysozyme (20 mg/ml) sont rajoutés par nodule. Après homogénéisation, les tubes sont vortexés
pendant 20 sec et incubés à 37°C pour 15 min.
250 µl de tampon GES (Krasova-wade et al., 2003) (Annexe 02) sont rajoutés dans
l’homogénéisat. Le mélange est vortexé pendant 20 sec et incubé à 65°C pour 15 min. Il peut être
gardé à cette étape pendant 3 jours à 4°C.
L’homogénéisat est centrifugé à 15000 rpm pendant 15 min à 4°C et le surnageant est récupéré.
L’ADN est précipité à partir du surnageant avec 180 µl d’éthanol absolu refroidi et mélangé
doucement par mouvement va et vient. Le contenu du tube et laisser 3 min sur la paillasse.
Le précipité est centrifugé à 15000 rpm pendant 15 min à 4°C. Le surnageant est éliminé et le
culot contenant de l’ADN est gardé.
L’ADN ainsi obtenu est lavé deux fois, avec 500 µl de l’éthanol absolu refroidi, par centrifugation
à 15000 rpm pendant 15 min à 4°C. L’ADN peut être gardé à cette étape dans de l’éthanol absolu
pendant 2 mois à 4°C.
L’ADN est séché quelques minutes en laissant les tubes sur la paillasse.
L’ADN extrait est dissout dans un volume de NaOH 8 mM stérilisé permettant une dissolution
complète (de 50 à 200 µl).
2.12.2.2. Contrôle de l’ADN extrait
Dans chaque puit, sont déposés 2,5 µl d’ADN extrait additionné de 2,5 de tampon de charge. La
qualité et la quantité de l’ADN extrait sont contrôlées par électrophorèse horizontale sur gel
d’agarose 0,8 % (p/v) dans du tampon TBE1X (Tris-HCl 1,1 % p/v ; Na2EDTA2H2O 0,1% p/v ;
acide borique 0,55 % p/v) à 100 Volt pendant 1 h.
64
2.12.3. Amplification de l’ADN
2.12.3.1. Amplification de l’ADN par réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
La réaction en chaîne par polymérase (PCR Polymerase Chain Reaction) permet d’amplifier de
façon exponentielle un fragment d'ADN cible pour faciliter son étude.
Au cours des réactions d’amplification par PCR, l’ADN extrait est utilisé comme matrice. Les
réactions d’amplification sont faites en utilisant un thermocycleur de type Perkin – Elmer modèle
2400. Tous les cycles d’amplification sont précédés d’une première étape de 94 °C pendant 5 min
et suivi d’une étape finale de 72 °C pendant 7 min pour une synthèse complète des fragments.
2.12.3.2. Amplification de l’espace intergénique IGS (inter-gène ADNr 16S-23S)
Au cours des amplifications de l’intergène 16-23 (IGS), les amorces FGPS 1490-72 (5’ TGC GGC
TGG ATC CCC TCC TT3’), définie par Navarro et al (1992) vs FGPL 132-38 (5’CCG GGT
TTC CCC ATT CGG 3’) définie par Ponsonnet et Nesme (1994) sont utilisées. La première a
servi de front (forward) et la seconde de reverse. Le cycle d’amplification est le suivant :
dénaturation à 94 °C pendant 30 sec, hybridation des amorces à 57 °C pendant 30 sec, élongation à
72 °C pendant 30 sec. Ce cycle est répété 35 fois de suite.
Les mixtes d’amorces (2,5 µl de chaque amorce à 10 mM) et d’ADN sont ajustés à 25 µl par tube
de réaction PCR avec de l’eau ultra-pure.
Pour un volume réactionnel de 25 µl, 2,5 U de Taq ADN polymérase, 10 mM de tris HCl (pH 9 à
température ambiante), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 ; 200 µM de chaque dNTP (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP) et les stabilisateurs dont le BSA pour améliorer la PCR.
2.12.3.3. Contrôle du succès des amplifications
Le succès des amplifications par PCR est contrôlé par électrophorèse horizontale, à 100 Volt
pendant 1 h, en déposant 2,5 µl de tampon de charge additionné de 2,5 µl de produit PCR et le
marqueur de poids moléculaire, sur gel d’agarose 1% (p/v) dans du tampon TBE 10X (tris-HCl 1,1
p/v ; Na2EDTA.2H2O 0,1 p/v ; acide borique 0,55 % p/v), suivi de la coloration du gel pendant 30
min dans une solution de bromure d’éthidium (BET) (1 µg/ml) et une révélation sous lumière UV
grâce à la fluorescence du bromure d’éthidium piégé entre les molécule puis le gel est
photographié.
65
2.12.4. Analyse des fragments de restriction de l’ADN amplifié
2.12.4.1. Digestion enzymatique
Après le contrôle des amplifications de l’espace intergénique des souches bactériennes, on procède
à la digestion enzymatique par certaines enzymes de restriction, choisies pour leur fréquence de
coupure.
La RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) consiste à couper par différentes

endonucléases (enzymes) de restriction, un fragment d'ADN amplifié par PCR donnant, pour
chaque endonucléase, un profil de restriction type (Laguerre et al., 1996).
2.12.4.2. Analyse des profils RFLP
Suivant l'intensité de la bande d'amplification, 7 à 10 µl de produit PCR sont digérés par deux
enzymes de restriction Hae III (qui reconnait le site de restriction de la séquence 5’-GG_CC-3’) et
Msp I dans un volume réactionnel (10 unités par 20 µl de volume réactionnel) à 37 °C pendant au
moins 2h. Les fragments digérés sont déposés sur gel d'agarose Metaphor (FMC Bioproducts,
Rockland, USA) horizontal à 2,5 % (p/v) . Ils sont ensuite soumis à une électrophorèse. Après 3 h
de migration à 80 V dans une cuve horizontale contenant du tampon TBE, le gel est coloré pendant
30 min dans une solution de BET et photographié ensuite sous UV après rinçage.
Visuellement on compare les bandes après migration aux bandes du Smart Ladder. Le Smart
Ladder est un marqueur de poids moléculaire qui sert d’étalon puisqu’il est composé de fragments
d’ADN double-brin linéaires de tailles connues, régulièrement réparties respectivement entre 200
et 10000 pb.
Les profils de bandes caractéristiques ainsi obtenus ont été comparés entre eux afin de pouvoir
différencier les profils génotypiques des souches bactériennes précédemment isolées.
2.13. Essai au champ
2.13.1. Principe et objectifs de l’expérimentation
Les facteurs environnementaux peuvent avoir un effet limitant sur l’établissement de la symbiose
entre les légumineuses et les rhizobia. La composition chimique et physique du sol, les conditions
climatiques et même les techniques culturales utilisées influencent largement les rendements
(Attar et al., 2012).
66
L’essai en plein champ permet de :
- Effectuer une étude comparative entre les lignées des variétés introduites et locale.
- Observer le comportement au champ et la nodulation des lignées contrastantes du haricot en essai

chez les producteurs.
67
2.13.2. Description des sites expérimentaux
Trois sites expérimentaux sont choisis à Tissemssilt, Ain Témouchent et Sidi Bel-Abbes (Tableau
7).
Ces sols diffèrent en texture, en couleur et aussi selon la culture précédente et la flore végétale
prédominante.
Le premier site d’expérimentation est choisi dans un terrain de 10 hectares, appartenant à un
exploitant privé, situé à Oulhaça dans la commune de Beni-Saf (wilaya d’Ain Témouchent ). La
parcelle est un sol noir, ayant comme précédent cultural la carotte.
Le deuxième site est localisé dans le Centre de Formation Professionnel et d’Apprentissage
(CFPA) de la willaya de Tissemsilt. La parcelle d’essai est un sol brun claire riche en éléments fins
et couvert de Gazon.
Le troisième site se trouve au niveau de la station expérimentale de l’INRAA (Institut National de
Recherche Agronomique) de la wilaya de Sidi Bel Abbès. Ce terrain est réservé à la culture des
légumineuses alimentaires, la parcelle d’essai est un sol marron clair, n’ayant pas de culture
précédente mais laissé en jachère.
Un quatrième site est choisi dans la station expérimentale ITCMI (Institut Technique des Cultures
Maraichères industrielles) dans la commune de Hassi Bounif à 12 km à l’est d’Oran.
La parcelle d’essai est d’un sol beige à brun claire, riche en éléments fins, ayant comme précédent
cultural la pomme de terre.
Le cinquième site d’expérimentation est choisi dans un terrain de 06 hectares, appartenant à un

exploitant privé et localisé dans la commune de Sidi Lakhdar, à 100 km à l’est de la wilayat de
Mostaganem. Ce terrain est réservé à la culture des légumineuses alimentaires. Le sol est beige à
orange clair, riche en éléments gros.
68
Tableau 7: Sites retenus pour les essais aux champs
Zone Localisation Code Propriété
Exploitant privé
Mostaganem Sidi Lakhdar M4
(Tlemsani, 2006)
ITCMI
Oran Hassi Bounif HB
ferme pilote
EL Maleh AT8 Exploitant privé

Ain
Témouchent
Oulhaça AT9 Exploitant privé
CFPA
Tissemsilt Tissemsilt TS
(Laabas, 2011)
Sidi Bel
Sidi Bel Abbes SB Station INRA
Abbes
69
2.13.3. Dénombrement des populations natives

Le but est de déterminer la concentration bactérienne contenue dans chaque échantillon de sol pour
estimer l’activité microbienne des différentes rhizosphères étudiées.
1 g de sol est mis en agitation dans 9 ml d’eau distillé stérile. A partir de cette suspension mère, 5
dilutions sont effectuées dans de l’eau physiologique stérile. 0,1 ml de chaque dilution est étalée
sur la gélose nutritive en boite de Pétri (Annexe 02), puis incubée à 28 °C pendant 24 h. Les boîtes
qui contiennent un nombre de colonies entre 30 et 300 sont prises en considération, ceci nous
permet de calculer le nombre d’UFC (Unités Formant Colonie) dans 1 ml de chaque suspension.
2.13.4. Cultivars testés
Des essais comparatifs ont été conduits sur la lignée locale du haricot variété fermière (HVF) et 07
lignées recombinantes (Rils) du haricot Phaseolus vulgaris L. (115, 147, 124, 104, 83, 34, 29)
(Figure 16), ce sont des lignées contrastantes en efficacité d’utilisation du phosphore (EUP) pour
leur fixation symbiotique d’azote (FSN) ; elles ont pu être identifiées parmi la descendance du
croisement de la lignée BAT 477 sélectionnée pour son adaptation aux contraintes abiotiques, et
DOR 304 pour sa tolérance aux contraintes biotiques, en particulier virales. La caractérisation
physiologique et moléculaire de ces génotypes contrastants, et leur intérêt agro-écologique, font
l'objet d'un programme soutenu par le CIAT (Centre International d’Agriculture Tropicale).
Les semences sont délivrées par le laboratoire INRA-SupAgro UMR 1222 Eco & Sols (Ecologie
Fonctionnelle & Biogeochimie des Sols) sous la direction du Dr. DREVON Jean Jaques.
Les essais sont réalisés pendant la saison douce du mois de février à mars qui est la période de
culture du haricot au nord de l’Algérie.
Les analyses physicochimiques des sols sont traitées en 2.3.1.
Les variétés du haricot utilisées dans nos expériences sont mentionnées dans le tableau 8 et figure
16.
70
Tableau 8 : Quelques caractéristiques des graines du haricot (Phaseolus vulgaris) utilisées

dans les essais aux champs.
Code Couleur Caractéristique
115 Noire Tolérantes
147 Noire Sensibles
104 Beige Tolérantes
83 Beige Sensibles
34 Noire Tolérantes
29 Beige Sensibles
124 Brune Sensibles
HVL Blanche Locale
29 83 104
115 147 34
Figure 16 : Les graines de Phaseolus vulgaris utilisées dans l’essai au champ

(origine : INRA-SupAgro UMR 1222 Eco & Sols)
71
2.13.5. Protocole d’essai

Dans la zone méditerranéenne, la croissance des plantes et la production agricole sont soumises à
des facteurs majeurs limitant leur développement (L’Taief et al., 2009). En Algérie,
particulièrement, les plantes sont périodiquement soumises à une combinaison de contraintes
incluant le manque d’eau, les températures élevée, mais aussi la limitation en N, P et d’autres
nutriments.
Selon le protocole défini par le Groupe Coopératif de Recherche sur les légumineuses dans le
Bassin Méditerranéen (FABAMED, 2009), le semis est effectué à raison de 12 graines par ligne
selon le schéma (Figures 17, 18). La distance entre deux graines est de 10 cm. La profondeur du
semis est égale à 3 cm. les plantes sont quotidiennement arrosées.
1 2 3 4 5 6
120 cm
50 cm
Figure 17 : Schéma du protocole d’essai selon FABAMED
72
a b
Figure 18 : Préparation de la parcelle (a) et de l’exécution du semis (b) à la station ITCMI

Oran (par Bouchentouf L.)
2.13.6. Mise en place des essais
Les essais sont installés en conditions sèches après la préparation du lit de semence et des billons.
Aucun fertilisant ni désherbant n’est apporté à la culture, le désherbage étant exécuté à la main.
Aux extrémités de chaque parcelle, deux billons ont été ajoutés pour réduire l’effet de bordure,
alors que les lignées centrales ont servit pour la récolte. Le système d’irrigation est de type
gravitaire. Les pratiques culturales sont les mêmes que celles réalisées par les agriculteurs.
Cependant la croissance des plantes des essais est sous dépendance de la fixation de N2 et sans
ajout de fertilisants chimiques. L’irrigation est effectuée deux fois par semaine pendant les deux
premières semaines afin de garantir une bonne croissance et éviter toute éventuelle contrainte liée
au déficit en eau. A partir de la troisième semaine, les plantes ont reçu une irrigation par semaine
jusqu’à la fin de leur cycle de culture.
2.13.7. Observation et notation
Durant le cycle végétatif des plantes, les principaux stades de développement des légumineuses
sont notés. La recherche des nodules est effectuée sur les plantes se trouvant aux extrémités de
chaque billon. L’état phytosanitaire est suivi périodiquement.
73
2.13.8. Récolte des plantes et paramètres mesurés
Les plantes sont récoltées au stade de floraison correspondant à une nodulation optimale qui se
traduit par une meilleure FSN (Fixation Symbiotique d’azote).
2.13.9. Conservation des nodules
Les nodules obtenus au stade floraison, après les essais conduits en conditions naturelles, sont
conservés dans du glycérol après désinfection et rinçage plusieurs fois à l’eau distillée stérile.
Les nodules ainsi conservés seront utilisés pour des études physiologique et moléculaire ultérieurs.
2.13.10. Analyse statistique
Toutes les valeurs représentent la moyenne de trois répétitions. Les résultats ont fait l’objet d’une
analyse de variance pour les paramètres hauteur de tige, longueur des feuilles, largeur des feuilles
et le nombre de nodules. Le seuil de la probabilité utilisé pour déterminer la signifiance est p<
0,05, quand le logiciel STATISTICA indique un effet significatif. Les moyennes et les écarts types
ont été calculés par le logiciel Excel.
2.14. Estimation du rendement
Le poids des gaines obtenues à la récolte en fin du cycle du haricot, est estimée sur trois sites
(Oran, Mostaganem et Ain Témouchent) afin de comparer entre les régions et entre les variétés
(RILs et variété locale).
74
Partie 1: Diversité des BNL associées à Phaseolus
vulgaris dans l’Ouest Algérien
3.1. Résultats des analyses physico-chimiques des sols
Les critères déterminants la sélection de bactéries symbiotiques dans un écosystème reposent, en

plus de la compatibilité avec la plante hôte, sur la capacité d’adaptation aux sols et sur la
compétitivité avec les autres souches pour l’infection (Amira et Abdul, 2011). L’infectévité et
l’efficience varient en fonction de l’espèce bactérienne et la capacité de la plante à fixer l’azote qui
dépend elle-même de nombreux facteurs environnementaux.
Les sites expérimentaux retenus pour cette étude, appartiennent à différentes conditions
écologiques. L’ensemble des paramètres physico-chimiques est inclus pour une analyse globale
permettant de classer les sites étudiés, d’apprécier la fertilité naturelle des sols, d’expliquer les
déficiences des rendements et d’orienter le choix des cultures (Soltner, 2005).
Les résultats des analyses des différents échantillons de sols figurent dans le tableau 9. Les
analyses physiques ont permis de déterminer la texture de chaque sol.
3.1.1. La granulométrie
La granulométrie est le premier paramètre à étudier vu les conséquences directes qu’elle engendre
sur la végétation (Baize, 2000).
Les résultats de l’analyse granulométrique (Tableau 9) montrent un pourcentage élevé en sables et

en limons. Lorsque la texture est désignée par ces deux éléments prédominants, le sol est dit
limono-sableux et qui présente une faible rétention d’eau. Globalement les sols ont des textures
équilibrées.
75
Tableau 9 : Résultats de l’analyse granulométrique

Zone Code Argile % Limon % Sable % Type de sol
M1 15,03 16,32 59,34 Sablo-limoneux
M3 20 50,80 10 Limono-sableux
Mostaganem
M5 18,40 13,12 10 Argilo-limoneux
M6 70,10 16 20 Argilo-limoneux
T1 25,03 37,32 38 Limono-argileux
T2 29,50 34,96 39,61 Limono-argileux
T3 10,45 25,80 70,89 Limono-sableux

Ain Temouchent
T5 15,40 45 40,44 Limoneux
T6 14,10 55,03 31 Limoneux
T8 18,93 33,75 49,86 Limoneux

T9 20 40 40 Limoneux
ER1 14,62 19,42 44,08 Limon-sableux
ER2 15 20 40 Limono-sableux
OR1 20 40 40 Limoneux
Oran
OR2 21 35 49 Limoneux
HB1 18 33 50 Limoneux
HB2 22 40 40 Limoneux
Oued Tlélat OT 60 6 20 Argilo-limoneux
Tissemsilt TS 12 38 50 Limono-sableux
Sidi Bel Abbes SB 27 45 28 Limono-argileux
76
L’analyse granulométrique a révélé des différences de texture de l’ensemble des échantillons des
sols selon le triangle des textures (Annexe 01). La différence est visible entre les échantillons des
régions et au sein même de chaque région.
La richesse des sols T5, T6, T8, T9, OR1, OR2, HB1 et HB2 en limon, induit l’augmentation de la
surface d’évaporation et autorise la capillarité jusqu’à la surface (Baize, 2000).
Les sols incluant le sable dans leur texture (M4, T3, T4) sont des sols bien aérés, faciles à travailler
mais aussi pauvre en réserve d’eau et éléments nutritifs ; leur capacité d’échange anionique et
cationique est faible (Richer, 2010).
3.1.2. Analyse chimique
L’analyse chimique des sols prélevés (Tableau 10) est effectuée dans le but de rechercher
d’éventuelles corrélations entre la présence ou l’absence d’une microflore active notamment les
bactéries nodulant les légumineuses (BNL) et les principales caractéristiques chimiques du sol
correspondant.
77
Tableau 10 : Résultats des analyses chimiques des sols
C.E. CaCO3T CaCO3A Azote MO C

Zone Code pHeau pHKCl
(mS/cm) (%) (%) (%) (%) (%)
M1 7,53 7,06 0,2 0,8 1,25 0,99 1,072 0,623
M2 8,60 7,80 1,213 43,29 8,5 0,89 1,066 0,619
M3 8,00 7,80 0,208 2,41 9,2 0,45 1,027 0,597

Mostaganem
M4 7,91 7,71 0,937 30,64 7,37 0,52 0,604 1,039
M5 7,72 7,65 0,35 14,51 4,5 0,89 0,617 1,062
M6 8,11 7,97 0,265 0,8 12,3 0,75 0,636 1,094
T1 7,96 7,68 150,4 64,51 9,4 0,60 1,070 0,622

T2 8,08 7,71 291 38,70 11,5 0,30 1,236 0,718
T3 8,05 7,6 149,6 69,35 15,2 0,55 1,049 0,610
T4 7,86 7,4 627 0,8 2,62 0,65 1,173 0,682
Ain
T5 7,96 7,68 150,4 64,51 9,4 0,87 1,070 0,622
Témouchent
T6 8,08 7,71 291 38,70 11,5 0,35 1,236 0,718
T7 8,05 7,6 149,6 69,35 15,2 0,25 1,049 0,610
T8 8,32 8,19 0,6 20 5,5 0,70 1,936 0,984
T9 8,22 7,68 0.05 0,8 9,4 - 10 5,23
ER1 8,00 7,49 515 40,32 13,4 0,64 1,164 0,676
ER2 7,92 7,72 378 30,64 5,6 0,75 1,129 0,656
OR1 8,02 7,8 156 31,45 1,5 0,38 1,138 0,661

Oran
OR2 7,91 7,70 2,920 32,25 20 0,65 1,225 0,712
HB1 7,96 7,65 1,560 45,16 12,5 0,07 1,094 0,636
HB2 7,92 7,6 2,04 4,83 7,25 0,13 1,162 0,675
Oued Tlélat OT 8,00 7,80 2,12 54,83 12,5 - 1,26 0,732
Tissemsilt TS 7,31 7,65 0,15 21 3,37 - 2,46 1,28
Sidi Bel
SB 8,85 - 0,2 132 6 - 2,1 1,05
Abbes
CE : conductivité électrique ; MO : matière organique ; C : carbone total
78
Le pH influence la forme et la disponibilité des éléments nutritifs dans l’eau d’irrigation. Il devrait
se situer entre 6,5 et 8,4. A ces valeurs, la solubilité de la plupart des micro-éléments est optimale
(Rieul et Ruelle, 2003).
Les valeurs du pHeau des échantillons varient entre 7,31 et 8,85. Selon la classification la plus
courante chez les agro-pédologues, les sols prélevés sont légèrement à moyennement alcalins (Ain
Témouchent), à alcalin (Sidi Bel Abbès). Sur le plan agronomique, la valeur du pH des sols est
proche du pH optimal (Baize, 2000). Le KCl ajouté à la suspension du sol permet la libération des
protons adsorbés sur les argiles, ainsi, la libération de ces protons fait diminuer la valeur du pH.
Les écarts entre le pHeau et pHKCl sont réduits, ce qui traduit le plus souvent une acidité potentielle
appelée acidité d’échange de faible à moyenne (Aubert, 1978). La différence oscille entre 0,2 (sol
M4) et 0,94 (sol OR1) ce qui est corroboré par les teneurs en Ca2+ qui sont comprises dans des
limites allant de moyennes à riches (Aubert, 1978).
La différence entre les deux pH traduit également et indirectement l’état biologique du sol, l’un
des points capitaux de sa fertilité. Les échantillons qui présentent un écart inférieur à 0,4 (M3, T2,
T3, OR2, OS2, HB1, HB2, OT), traduisent un sol lourd où la faiblesse de l’activité microbienne ne
permet pas une biodégradation satisfaisante des éléments utiles aux plantes contrairement aux
autres sols.
Le pH du sol affecte la survie des bactéries nodulant les légumineuses, partenaires de Phaseolus
vulgaris et diminue leur survie notamment dans les écosystèmes à plantes pérennes (Ballard et al.,
2003). L'acidité est préjudiciable aux plantes- hôtes (Giller et Wilson, 1991), mais il existe une
énorme variabilité de comportement. La tolérance des bactéries symbiotiques serait liée à leur
aptitude à réguler leur pH cytoplasmique (Reddell, 1993). Des études ont montré que les rhizobia
présentent des réponses variées face aux variations du pH (Glenn et Dilworth, 1994).
Le pH varie selon la pédologie du sol. La fertilisation et l’amendement des sols permettent aussi de
modifier le pH. Ce dernier, varie aussi en fonction des saisons et donc de l’activité microbienne
dans la rhizosphère.
Le stress salin est l’un des principaux facteurs qui limite la production des légumineuses
particulièrement quand la nutrition azotée dépend principalement de la fixation symbiotique de
l’azote.
La salinité ou teneur en sels dissouts, constitue un paramètre très important de la qualité de l’eau.
La pression osmotique de la solution du sol augmente proportionnellement à la salinité, ce qui
entraine une réduction de la qualité de l’eau utilisable par les plantes. Les principaux sels
79
responsables de la salinité de l’eau sont les sels de calcium (Ca2+), de magnésium (Mg2+), de
sodium (Na+), de potassium (K+), les chlorures (CI-), les sulfates (SO42-) et les bicarbonates
(HCO3-) (Harivandi, 1999).
Un excès de sodium peut également être à l’origine de la toxicité chez certaines plantes, or le
sodium est absorbé par les cultures en même temps que l’eau et celui-ci se concentre dans les
feuilles tandis que l’eau s’échappe par transpiration. Une fois que la concentration de cet élément
atteint le seuil de tolérance de la culture on peut constater des toxicités qui se manifestent par des
brûlures et des desséchements des feuilles qui aboutissent toujours à une mort certaine du végétal.
Les échantillons de sol utilisés au cours de cette étude, ont montré des valeurs de conductivité
électrique comprise entre 0,2 mS/cm et 2,92 mS/cm d’après l’échelle internationale de salure.
Dans la majorité des cas, les échantillons sont non salés, à l’exception du sol HB1 qui affiche une
valeur de 1,56 mS/cm, cette salinité est due à l’eau salée utilisée pour l’irrigation dans la station.
Quant au taux de salinité élevée (2,92 mS/cm) de l’échantillon OR2 (Oran Ouest), il est dû à la
capillarité et l’évaporation de l’eau salée de la nappe phréatique.
Chez la symbiose Phaseolus vulgaris- Rhizobium, la salinité peut influencer la croissance et la
multiplication du Rhizobium, mais la sensibilité des souches des BNL, d’une manière générale,
s’exprime différemment d’une espèce à l’autre à l’intérieur d’un même groupe (Merabet, 2007).
Le lessivage de l’hiver dû à la pluviométrie peut intervenir dans l’abaissement de la salinité
(Tchentcheli, 1990) et élimine jusqu'à 50 % de sel (Daoud, 1993).
Les résultats obtenus montrent que la culture du haricot dans les différentes régions étudiées n’est
pas soumise au stress salin.
On parle de sol calcaire lorsque la terre contient de 10 à 30 % de carbonate de chaux. Le dosage
indique que les sols étudiés (T1, T3, OT) sont calcaires ce qui explique la dureté de cette terre,
donc leur capacité de rétention d’eau est faible (Aubert, 1978) ; ils présentent également une
certaine instabilité qui favorise la pénétration des gelées. Les éléments fertilisants sont mal retenus,
ce qui provoque par exemple la chlorose des feuilles (Gerbeaud, 2005) (le calcaire actif gêne
l'assimilation du fer par les végétaux).
La présence du CaCO3 limite le nombre de nodules dans un sol qui devient très compact et
s’oppose à la pénétration d’eau, ce qui a été remarqué sur les racines des plantes cultivées
principalement sur le sol T1 et qui sont dépourvues de nodules. Ce test confirme l’alcalinité des
sols précités. Lorsque le sol se décalcifie (lessivage), le départ d’ions Ca2+ laisse la place à un
nombre supplémentaire d'ions H+ ce qui provoque à plus ou moins long terme une acidification.
Dans les zones tempérées de l’Ouest Algérien, les cations ne sont pas lessivés étant donné les
80
conditions climatiques (une forte évaporation conjuguée à de faibles précipitations). Cette

situation est propice au blocage, sous des formes non assimilables par la plante, des éléments tels
que P, Fe, Mn, Cu et Zn (Aubert, 1978).
Le dosage de la quantité d’azote dans les sols a révélé qu’ils contiennent une quantité importante
en azote (Tableau 8). Les résultats obtenus mettent en cause la pratique culturale de la rotation
céréales- légumineuses en permanence, de l’addition du fumier et de l’amendement des sols des
cultures précédentes mais aussi peuvent être la conséquence de la variabilité des paramètres
climatiques où la faible pluviométrie ne permet pas le lessivage des éléments minéraux et perturbe
le cycle de l’azote.
La teneur de l’azote dans le sol change en fonction de la température suite à l’activité des micro-
organismes, le taux d’humidité du sol, l’apport et le moment de l’application de l’azote aux
cultures précédentes (Verhallen et al., 2006). Dans une bonne terre végétale, la teneur en azote du
sol est de l'ordre d'un gramme par kilogramme de terre dans les horizons superficiels, dont 1 à 2%
de cette quantité est sous forme minérale et le reste est essentiellement sous forme organique. De
même Bertschinger et al. (2003), signalent qu’après utilisation du fumier mûr, il y a une
augmentation lente de la teneur en azote minéral du sol.
Le cycle global du C est l'un des cycles les plus importants sur la planète, par son impact direct sur
plusieurs systèmes physiques et biologiques ainsi que la variation globale des différents gradients
de températures. La dynamique de la matière organique du sol est un facteur déterminant des
propriétés physiques, chimiques et biologiques du sol et participe à l'émission de gaz à effet de
serre (N2O, CH4 et CO2) d'origine agricole, soit 20 % des émissions gazeuses totales (Pendall et
King, 2007).
La matière organique (MO) représente l'indicateur principal de la qualité des sols (Robert, 1996),
à la fois pour des fonctions agricoles (la production et l'économie) et pour les fonctions
environnementales (parmi elles la séquestration du carbone et la qualité de l'air). La matière
organique du sol est considérée comme un constituant important, mais aussi la principale source
d’alimentation et d’énergie pour les organismes vivants du sol. Cette dernière est formée
principalement par la décomposition de la matière fraîche des végétaux et des micro-organismes
(Gardiner et Miller, 2008). Les principales composantes de la MO du sol sont la fraction légère
du sol, le carbone organique du sol et l’azote total du sol (Gregorich et al., 2008). Cependant, la
qualité et la teneur de la MO du sol sont influencées par certains facteurs, comme le pH, la
température, l’humidité, la texture, la qualité et la quantité des résidus ajoutés et spécialement
l’activité des micro-organismes (Samahadthai et al., 2010).
81
Le résultat du dosage chimique indique que le sol T9 (Ain Témouchent) est le sol le plus riche en
matière organique (10 %) comparé aux autres sols, donc il présente probablement une forte activité
microbienne. Les sols de Tissemsilt (TS) et Sibi Bel Abbès (SB) ont des teneurs moyennes en
matière organique (2,46 % et 2,1 % respectivement). La teneur élevée en matière organique
permet une amélioration de la vie biologique et le réchauffement des sols.
Par contre, le carbone est un critère déterminant de la stabilité structurale du sol qui renseigne sur
l’aptitude de ce dernier, à résister aux différents paramètres de dégradation. Il peut être affecté par
le taux de décomposition, le climat, et les caractéristiques du sol. Le carbone organique du sol
représente approximativement 2/3 de l’ensemble du C terrestre et il est important dans la
détermination des propriétés chimiques et physiques du sol (Oelbermann et al., 2006).
Le faible pourcentage en carbone indique une faible stabilité structurale du fait que des recherches
ont montré que plus le carbone est présent plus le sol est stable et fonctionnel, c’est le cas du sol
T9 de Ain Témouchent, qui s’avère être le sol le plus riche en carbone comme indiqué dans le
tableau 10 (une teneur de 10%). Sa présence en quantité suffisante dans le sol peut réduire les
risques d’érosion, renforcer la filtration des éléments polluants avant qu’ils n’atteignent l’eau
souterraine, augmenter le rendement et diminuer l’émission de CO2 dans l’atmosphère (Ghimire et
al., 2012). Cet élément est aussi impliqué dans la dynamique de l'eau et la résistance à l'érosion par
l'eau et le vent comme il affecte aussi la dynamique et la biodisponibilité des principaux éléments
nutritifs (Latati et al., 2014).
Lorsqu’un sol contient des valeurs élevées de la matière organique et par conséquent un taux élevé
en carbone, il est considéré comme un sol riche en activité microbienne où la souche de Rhizobium
doit être capable de concurrencer efficacement les autres micro-organismes vis-à-vis de la source
de carbone et résister aux antagonistes (Martinez-Romero, 2003). Cette activité microbienne
entraîne une certaine compétition entre les bactéries, et peut diminuer la quantité des rhizobia dans
le sol.
Par ailleurs, d'autres propriétés physiques du sol telles que l'épaisseur et la texture peuvent
influencer le stockage du C (USDA, 2013). Les sols argileux, de porosité fine (M5, M6, SB)
auraient davantage de site de protection du C (teneur supérieure à 1 %), étant ainsi peu accessible
aux décomposeurs du sol et serait alors stocké en plus grande quantité que dans un sol sableux
(Latati et al., 2013).
Les échantillons des sols analysés sont pauvres en matière organique qui permet la constitution du
complexe argilo-humique qui absorbe et met en réserve l’eau. Le sol riche en MO améliore la vie
82
biologique (faune et flore). Les réserves du carbone organique dans un sol résulte de l’équilibre
entre les apports de matière organique et leur minéralisation (Arrouays et al., 2002 ; Loveland et
Webb, 2003).
Dans les échantillons de sols analysés, le rapport C/N est très faible et ne dépasse pas 3. Dans ces
sols la décomposition de la matière organique est très rapide.
Les techniques de gestion des terres affectent considérablement la quantité de carbone organique
du sol. Par exemple, dans un agroécosystème complexe, la réduction du travail du sol et une
augmentation des résidus végétaux laissés sur le sol, augmentent la teneur en carbone organique du
sol et la séquestration du carbone (Van Groenigen et al., 2011).
Le tableau 11 résume les interprétations des principaux paramètres dosés où l’on remarque que
83,33 % des sols sont légèrement et moyennement alcalins à alcalins; les sols sont moins salés
dans 75 % des cas et la majorité des sols sont faibles en matière organique (66,66 %).
83
Tableau 11 : Synthèse des résultats des analyses des échantillons des sols
Matière
Sol pH Salinité Calcaire total Calcaire actif Azote
organique
M1 Neutre Moins salé Non calcaire Peu calcaire Très riche Très faible
M2 Alcalin Moins salé Fortement calcaire Moy. calcaire Très riche Très faible
M3 Lég. à moy. alcalin Moins salé Peu calcaire Moy. calcaire Très riche Très faible
M4 Lég. à moy. alcalin Lég. salé Fortement calcaire Moy. calcaire Très riche Faible
M5 Lég à moy. alcalin Moins salé Moy. calcaire Peu calcaire Très riche Faible
M6 Lég. à moy. alcalin Moins salé Non calcaire Moy. calcaire Très riche Faible
T1 Lég. à moy. alcalin Moins salé Très fortement calcaire Moy. calcaire Très riche Très faible
T2 Lég. à moy. alcalin Moins salé Fortement calcaire Moy. calcaire Très riche Très faible
T3 Lég. à moy. alcalin Moins salé Très fortement calcaire Moy. calcaire Très riche Très faible
T4 Lég. à moy. alcalin Lég. salé Non calcaire Peu calcaire Très riche Très faible
T5 Lég. à moy. alcalin Moins salé Peu calcaire Peu calcaire Très riche Très faible
T6 Lég. à moy. alcalin Moins salé Peu calcaire Peu calcaire Très riche Faible
T7 Lég. à moy. alcalin Lég. salé Peu calcaire Peu calcaire Très riche Très faible
T8 Lég. à moy. alcalin Lég. salé Moy. calcaire Moy. calcaire Très riche Très faible
T9 Lég. à moy. alcalin Moins salé Peu calcaire - - Forte
ER1 Lég. à moy. alcalin Moins salé Fortement calcaire Moy. calcaire Très riche Très faible
ER2 Lég. à moy. alcalin Moins salé Fortement calcaire Moy. calcaire Très riche Très faible
OR1 Lég. à moy. alcalin Moins salé Fortement calcaire Peu calcaire Très riche Faible
OR2 Lég. à moy. alcalin Très salé Fortement calcaire Calcaire Très riche Faible
HB1 Lég. à moy. alcalin Salé Fortement calcaire Moy. calcaire Pauvre Faible
HB2 Lég. à moy. alcalin Moins salé Peu calcaire Moy. calcaire Moyen Faible
OT Lég. à moy. alcalin Moins salé Très fortement calcaire Moy. calcaire - Faible
TS Neutre Moins salé Moy. calcaire - - Moyenne
SB Alcalin Moins salé Moy. calcaire - - Moyenne
Lég. : Légèrement ; Moy. : Moyennement ; - : non effectué
Le phosphore (P) est indispensable pour les plantes surtout au stade jeune. Il intervient dans la
plupart des réactions fondamentales de la cellule. Les molécules H2PO4-, HPO4-- sont les formes
assimilables même si on estime le phosphore sous forme de P2O5 . Le tableau 12 présente la
relation des taux de P2O5 et la présence de nodules in natura aux champs où le sol OR1 présente le
meilleur taux de nodulation (22 nodules/plante) suivie du sol M5 (12 nodules/plante). La
déficience en P affecte les paramètres de croissance (Bernal et al., 2005) et modifie l’ultra-
structure cellulaire. La teneur en P des nodosités est beaucoup plus élevée que celle des autres
84
organes de la plante. Des résultats similaires ont été rapportés par Alkama et al. (2012) et Lazali
et Drevon (2012) sur des essais à Tizi ouzou et à Sétif. Les différences notées entre les sols sont
en fonction de la fertilité du sol (teneurs en N et P) et les biomasses aériennes diffèrent d’un sol à
un autre et selon la variabilité génotypique.
Tableau 12: Effet du phosphore sur le nombre de nodules chez le haricot in natura.
P2O5 Nombre de
Sol C% Teneur en P
(mg/l) nodule / plante
M1 0,623 - - -
M2 0,619 - - -
M3 0,597 0,375 Basse 00,00
M4 1,039 1,025 Basse 00,00
M5 1,062 1,525 Basse 12
M6 1,094 0,850 Basse 00,00
T1 0,622 6,845 Basse -
T2 0,718 5,621 Basse -
T3 0,610 4,233 Basse -
T4 0,682 20,275 Moyenne -
T5 0,640 6,27 Basse -
T6 1,520 9,67 Basse -
T7 0,830 16,53 Moyenne -
T8 0,984 15,40 Moyenne -
T9 5,230 2,15 Basse 03
ER1 0,676 0,125 Basse 00,00

ER2 0,656 0,075 Basse 00,00
OR1 0,661 2,800 Basse 22
OR2 0,712 0,250 Basse -
HB1 0,636 0,550 Basse -
HB2 0,675 0,850 Basse -
OT 0,732 0,725 Basse -
TS 1,280 - - -
SB 1,050 - - -
- : non effectué
85
La prépondérance de la minéralisation de P par rapport à sa mobilisation dépend de la proportion

C/N/P ou C/P du sol (Latati et al., 2014). Les quantités du phosphore peuvent être insuffisantes
soit parce que le sol en est naturellement mal pourvu (Betancourt et al., 2012), soit parce que ses
réserves ont été progressivement épuisées par des récoltes successives.
Il est reconnue que la teneur en azote due à l’apport du phosphore est plus importante que celle
obtenue avec l’apport du potassium et que des recherches ont montrées que l’azote réduit la
nodulation, tandis que le phosphore l’augmente (Drevon et al., 2011). Le nombre de nodule
augmente considérablement en fonction des teneurs en phosphore qui devient dans ce cas un
facteur limitant. Ces résultats soulignent le rôle essentiel du phosphore et dans une moindre
mesure celui du potassium dans la symbiose Phaseolus vulgaris- Rhizobium, ce qui constitue une
voie d’amélioration intéressante de la production du haricot dans les environnements pauvres en
ces éléments (Zaman-Allah et al., 2004).
Olivera et al. (2004) ont montré l’impact de la nutrition phosphatée sur la croissance des plantes
du haricot, sur la fixation symbiotique de l’azote, sur l’assimilation des composés carbonés et
l’accumulation des acides aminés, aussi bien que sur le taux d’azote, du phosphore et de l’ATP
dans les tissus des plantes du haricot. Braschi et al. (2003) ont rapporté que les différents taux de
la matière organique additionnés augmentent le phosphore extrait sous des régimes différents
d’humidité du sol par l’inhibition de la solubilisation du phosphore. Les sols moins fertiles en
particulier les sols déficients en P, constituent l’une des contraintes de la production du haricot
(Alkama et al., 2012), c’est le cas de certaines zones céréalières en Algérie. La présence du P reste
primordiale pour la satisfaction des besoins nutritifs des végétaux (Hinsenger, 2011).
La dynamique du phosphore dans les sols calcaires est un problème extrêmement complexe ce qui
explique la teneur en phosphore assimilable de moyenne à faible dans les sols étudiés. Selon
Hamdy et Makhlouf (2002) la fixation ou la mobilisation des ions phosphoriques est
remarquablement influencée par les sels. Cet effet bénéfique correspond généralement à une
interaction positive phosphore- salinité lorsque cette dernière est modérée (Madani, 2008).
L’activité des micro-organismes dans le sol est d’une grande importance pour les cycles de la
matière. Les diverses activités assurées par les groupes de micro-organismes telluriques permettent
la mise à disposition de composés minéraux simples (carbone, phosphore, soufre, sels
d’ammoniaques et autres) au niveau du sol, faciles à assimiler par les plantes et nécessaires pour
leur développement (Davet, 1996).
L’absence de la nodulation in natura aux champs lors des prospections, est remarquée sur des
plants de petite taille avec présence de chlorose de la partie aérienne. L’absence de nodulation est
86
due principalement aux teneurs d’azote élevées combinées aux teneurs basses de phosphore (cas
des sols M3 et ER2).
D’une façon générale, les sols de la région d’Ain Témouchent sont instables à cause de la quantité
de calcaire élevée qui rend le sol très perméable et provoque le lessivage des éléments minéraux
(Gerbeaud, 2005). Le caractère limoneux de la majorité des sols de cette région, est en faveur de
l’évaporation et de la perte d’eau. Selon Benadis (2015) qui a rapporté des résultats similaires, les
agriculteurs ne disposent pas de système d’irrigation artificiel pour palier aux fluctuations de la
pluviométrie.
87
3.2. Piégeage des rhizobia

.2.1. Germination des graines
Le taux de germination des graines de toutes les variétés testées du haricot, selon la méthode
utilisée (Tillard et Drevon, 1988), est de 100 % (Figure 19). Ces graines ne nécessitent pas une
scarification car le traitement à l’hypochlorite de sodium à 32° et le trempage successif dans l’eau
distillée stérile fragilisent les téguments des variétés colorées (RILs) ainsi que la variété locale
(HVL).
Figure 19: Aspect des graines germées des différentes variétés de Phaseolus vulgaris L.
(photos par Bouchentouf L.) après 5 jours d’incubation à l’obscurité et à 28°C sur de l’eau gélosée à 1%
3.2.2. Paramètres de croissance
Après 30 jours de culture en conditions contrôlées, une moyenne de huit plantes sur dix, du haricot
variété locale (HVF), ont nodulé. En comparant les plantes cultivées sur les mêmes sols, les
différences morphologiques sont presque négligeables, même pour la taille et le nombre de nodule.
La différence est notée au niveau des plantes cultivées dans des sols différents (Tableau 13).
Les plantes du haricot cultivées sur le sol T4 (Ain Témouchent) présente le meilleur taux de
nodulation (moyenne de 27 nodule/plante). Ce sol à pH 7,86 convenable au couple Phaseolus
vulgaris- Rhizobium, est pauvre en calcaire et adéquat en phosphore (20,275 mg/l) pour
l’installation de la symbiose. L’absence totale des nodules dans les sols (M1, T1 T2 OR2) est due
essentiellement aux concentrations basses en phosphore (Drevon et al., 2011), conjugué à la
salinité pour le sol OR2 ce qui constitue une contrainte majeure pour la nodulation (Saadallah et
al., 2001).
Les conditions écologiques défavorables peuvent localement empêcher la nodulation chez une
espèce, qui ailleurs possèdent des nodules très développés (De Lajudie, 1994) ce qui explique
l’absence de nodulation chez le haricot cultivé sur le champ OR1 alors qu’il nodule en conditions
contrôlées (10 nodules/plante) ce qui peut être expliqué par le lessivage des éléments minéraux
bloqués sous des formes non assimilables.
88
Tableau 13 : Résultat du piégeage en conditions contrôlées
Longueur de la tige Longueur des Largeur des Nombre de Taille des

Sol
(cm) feuilles (cm) feuilles (cm) nodules nodules (mm)
M1 16 05,5 03,5 00 -
M2 30 07 04,5 12 1-2
M3 14,5 06 03 03 2-5
M4 9,5 04 02,5 00 -
M5 10 04 03 00 -
M6 11 05 04 00 -
T1 09 03 02 00 -
T2 11 04 03 00 -
T3 12 04 03 02 1-3
T4 21 5,5 04 27 2-5
T5 16 05,5 03,5 00 -
T6 30 07 04,5 12 1-2
T7 14,5 06 03 03 2-5
T8 9,5 04 02,5 00 -
OR1 12,5 04 2,5 10 2-5
OR2 13,5 4,5 2,5 00 -
ER1 20 07 4 25 5-6
ER2 12 06 03 - -
HB1 11 03 1,5 01 3-4
HB2 10,5 03 02 01 3-4
OT 11,5 04 2,5 02 2-5
89
La fixation symbiotique de l’azote atmosphérique par la nodosité avec les légumineuses a pour
effet d’augmenter la teneur en N dans les différentes parties de la plante (aérienne et racinaire).
Les résultats ont montré que les biomasses aériennes et racinaires des plantes, dans des conditions
de culture contrôlées, ont été limitées en pots. La nodulation est donc parfois plus affectée par les
conditions climatiques que par les caractéristiques physico-chimiques des sols.
3.3. Distribution des isolats
Une totalité de 200 isolats est obtenue à partir de nodosités récoltées in situ ou après piégeage ; le
tableau ci-dessous regroupe les résultats obtenus.
Tableau 14 : Origine des isolats

Nbre de nodule Méthode
Région /plante d’isolement
12 Piégeage
Mostaganem 3 Piégeage
12 In natura
2 Piégeage
Ain 27 Piégeage
Témouchent 30 Piégeage
3 In natura
10 Piégeage
25 Piégeage
Oran 1 Piégeage
1 Piégeage
22 In natura
Oued Tlélat 2 Piégeage
90
Malgré une large couverture des sites, la distribution des isolats par site géographique montre que
le nombre de souches par site n’est pas homogène, cela étant dû au fait que pour certaines zones de
prospection, la quantité de sol prélevé était insuffisante pour des piégeages à répétition et que le
nombre de nodosités obtenues était faible.
En général, l’abondance des rhizobia est corrélée négativement avec certains facteurs
pédologiques incluant l’azote et positivement avec le taux de carbone organique et les capacités
d’échange cationique (Thrall et al., 2007), ce qui pourrait expliquer l’abondance de la nodulation
dans des sols provenant de certains endroits tels que Ain Témouchent.
L’abondance rhizobienne dans ces sols est aussi fortement liée aux différences dans la nodulation
et la croissance de la plante-hôte (Thrall et al., 2000). La nodulation est un phénomène qui se
produit sous certaines conditions où la plante favorise d’abord son développement végétal au
dépend de la formation de nouveaux organes comme les nodosités couteuses en énergie.
Les nodules obtenus après culture en conditions contrôlées ont une forme déterminée (ronde) et
leur couleur varie de rose à blanche, cependant pour confirmer leur statut de BNL, les isolats
doivent renoduler leur plante- hôte. La culture du haricot est effectuée en système hydroponique
sous conditions contrôlées en solution nutritive et le matériel végétal ayant fait l’objet de cette
étude est constitué de la variété locale blanche (HVL).
3.4. Test de nodulation
Le test de nodulation est réalisé, en conditions contrôlées, pour estimer la capacité des souches à
réinfecter leur plante-hôte Phaseolus vulgaris. La capacité d’induire la formation des nodules sur
les racines de la légumineuse hôte constitue un critère d’authentification essentiel dans la
caractérisation des rhizobia. Cette approche permet d’évaluer l’infectivité de chaque isolat avec la
plante-hôte à partir de laquelle il a été isolé.
Une intensité lumineuse optimale est nécessaire pour obtenir la nodulation et la fixation de l'azote
maximale. Par le biais de la photosynthèse qu'elle régit, la lumière intervient indirectement sur la
fixation d'azote (Dommergues et Mangenot, 1970).
Le test de nodulation fini par la récolte des plants au stade floraison (45 JAS) et le nombre de
nodules compté. Ce dernier a atteint la valeur la plus élevée (nodules/ plants) pour la plante
inoculée avec l’isolat.
Dans le test de nodulation, la concentration de l’inoculum apporté aux plantes est similaire et par
conséquent, le potentiel de nodulation de chaque variété dépend de l’efficience de la souche.
91
3.4.1. Infectivité des souches isolées
Chez Phaseolus vulgaris, et dans des conditions optimales, les nodosités apparaissent en moyenne
après 30 à 45 jours après l’inoculation des plantules (Figure 20) (Tlemsani, 2006 ; Kermani et
Khedim, 2007) avec une concentration de l’inoculum de 105 à 106 bactéries par graine (Laabas,
2011). La concentration des isolats testés, après croissance en milieu YEM liquide (à 28 °C
pendant 48 h), correspond à la turbidité du tube N° 0,5 de Mc Farland. Les isolats présentent des
réponses positives au test de nodulation par la formation de nodules types. La coloration rose à
l’intérieur des nodules est une indication de l'activité fixatrice du nodule, expliquée par la présence
de la leghémoglobine.
a b
Figure 20: Aspect des plantes de Phaseolus vulgaris L. nodulées en milieu hydroponique
(photos par Bouchrentouf L.) a : vue d’ensemble ; b : racines nodulées ; c : nodules sphériques
92
3.4.2. Performances symbiotiques
Les plantes inoculées sont comparées, dans un premier temps, aux plantes témoins en considérant
la hauteur de la tige, le développement général de la plante et la couleur de la partie foliaire. Les
souches considérées infectives ont initié la formation de nodosités mais leurs plantes- hôtes ne
présentent aucune différence de croissance comparativement aux témoins non inoculés. A
l’opposé, les souches considérées comme efficientes ont induit une croissance plus importante des
parties aériennes.
Les résultats démontrent qu’environ 60% des souches renodulantes sont efficientes et améliorent
nettement la masse du feuillage et sa couleur ; cette première estimation phénotypique est
confirmée en testant une seconde fois les souches fixatrices sous les mêmes conditions contrôlées
et en quantifiant le poids sec de la partie aérienne et de la partie racinaire. Cela permettra de mettre
en évidence les souches les plus performantes.
Le test d’efficience a été effectué en utilisant une sélection de souches qui avaient prouvé leur
efficience d’après l’aspect général des plantes et l’estimation des poids secs des différentes parties
des plantes inoculées (Figure 21, 22).
2,5
Biomasse sèche en gr
1,5
0,5
0
IH1
IH2
IH3
IH4
IH5
IH6
IH7
IH8
IH9
IH10
IH11
IH12
IH13
IH14
IH15
IH16
IH17
IH18
IH19
IH20
IH21
IH22
IH23
IH24
IH25
IH26
IH27
IH28
IH29
IH30
Isolat
Figure 21 : Valeurs des poids secs des parties aériennes
Effets des différentes souches sur la biomasse sèche aérienne de Phaseolus vulgaris après 45 JAS.
93
1,8
1,6
Biomasse sèche en gr
1,4
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0 Isolat
IH1
IH2
IH3
IH4
IH5
IH6
IH7
IH8
IH9
IH10
IH11
IH12
IH13
IH14
IH15
IH16
IH17
IH18
IH19
IH20
IH21
IH22
IH23
IH24
IH25
IH26
IH27
IH28
IH29
IH30
Figure 22 : Valeurs des poids secs des parties racinaires (PR)
Effets des différentes souches sur la biomasse sèche racinaire de Phaseolus vulgaris après 45 JAS.
Certaines bactéries isolées à partir des nodosités racinaires du haricot sont incapables de renoduler
leur plante- hôte lors d’un test de nodulation (Mnasri et al., 2007) ce qui a été observé chez les
souches qui n’ont provoqué aucune infectivité au niveau des racines de leur plantes-hôtes ce qui
constitue près du quart des souches. Ce résultat peut être dû à la perte du pouvoir infectif des
bactéries vis-à-vis de leur plante- hôte (Mnasri et al., 2007), à la non stabilité génétique des
souches au cours du stockage (Biederbeck et Grissier, 1993; Fomeg-As, 2004), à la perte de
l’information symbiotique notamment leur gènes nod, à la composition de la solution nutritive ou
à des problèmes techniques relatifs à cette méthode (conditions défavorables à l’établissement de
la symbiose : température, humidité, éclairage).
Il arrive des fois lors des purifications des isolats que les souches endophytes naturellement
présentes dans les nodosités (Rosenblueth et Martinez-Romero, 2006 ; Lin et al., 2008) soient
isolées aux dépends des souches rhizobiennes nodulantes co-existantes ; ces souches présentant un
effet PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) et sans présence de nodules, permettent
l’amélioration de la croissance végétale comparativement aux plantes non-inoculées,
94
Les analyses statistiques de variance ont été effectuées pour chaque souche. Seul le poids sec a été
pris en considération pour estimer l’efficience des souches (Tableau 15, 16).
Quatre semaines après l’inoculation, toutes les plantes testées nodulent. Toutes les souches
retenues sont efficientes (poids de la plante inoculée significativement supérieur à celui du témoin
non inoculé chez la majorité tandis que les souches sont seulement infectives).
Chez les rhizobia, les performances symbiotiques avec l’hôte végétal sont un critère important
pour inclure une bactérie dans la famille des BNL. La proposition d’une nouvelle espèce doit
comportée l’étude du spectre d’hôte.
Tableau 15 : Les groupes Duncun (sig : 0,000) pour le poids sec aérien (PA)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
IH30 IH22 IH21 IH1 IH20 IH25 IH18 IH9 IH4

IH26 IH21 IH1 IH20 IH11 IH24 IH23 IH19
IH29 IH11 IH25 IH24 IH2 IH13 IH15
IH27 IH24 IH12 IH18 IH17 IH5
IH12 IH2 IH23 IH16 IH14
IH2 IH18 IH8 IH3
IH18 IH23 IH13 IH6
IH23 IH8 IH17 IH7
IH13 IH16
Tableau 16 : Les groupes Duncun (sig : 0,000) pour le poids sec racinaire (PR)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
IH30 IH29 IH21 IH11 IH13 IH1 IH8 IH2 IH25 IH16 IH5 IH9
IH26 IH28 IH11 IH13 IH1 IH12 IH22 IH19 IH20 IH23 IH10
IH29 IH27 IH13 IH1 IH12 IH3 IH18 IH24 IH14 IH6 IH15
IH28 IH21 IH1 IH12 IH3 IH8 IH2 IH25 IH4 IH17
IH22 IH18 IH24 IH14
IH18 IH2 IH4
IH2 IH19
95
3.5. Etude des isolats

Dans notre étude un ensemble de souches de rhizobia ont été isolées de différentes régions de
l’Ouest Algérien. Ces souches ont été caractérisées phénotypiquement et leur autentification autant
que BNL (Zakhia et al., 2004) nodulant Phaseolus vulgaris L. a été confirmée par le test de
nodulation en hydroponie. La caractérisation génotypique partielle a montré une diversité
interspécifique établie par les profils RFLP (Laguerre et al., 1994).
Il est bien connu que les facteurs environnementaux tels que la salinité, la sécheresse, l’acidité, les
engrais chimiques, les métaux lourds et les pesticides compromettent la survie, la croissance et la
capacité à fixer l’azote des souches de rhizobia (de Lajudie, 2004), d’où l’intérêt de connaitre
leurs caractéristiques phénotypiques et biochimiques qui conditionnent leur survie, leur
adaptabilité aini que leur compétitivité ce qui représente une étape indispensable à la réponse des
plantes aux champs (Zerhari et al., 2000 ; Diouf et al., 2008).
La caractérisation phénotypique traditionnelle est toujours admise comme étape primordiale pour
l’identification et la séparation des bactéries nouvellement isolées (Merabet et al., 2010). Elle
constitue chez les rhizobia les mieux étudiés, la base de la description formelle de taxon, depuis les
espèces et les sous-espèces jusqu’aux genres et familles (Berrada et Fikri-Benbrahim, 2014).
L’identification microbienne repose actuellement sur une approche polyphasique (Weir, 2016)
faisant intervenir des caractéristiques phénotypiques, génotypiques et phylogénétiques.
3.5.1. Caractéristiques macroscopiques

Parmi les caractéristiques morphologiques et culturales utilisées pour la caractérisation et
l’identification des rhizobia, une des plus remarquables est leur croissance sur milieu YEM
(Vincent, 1970). Après incubation pendant 48-72 h à 28 °C, les colonies apparues sont circulaires
à contour régulier sur milieu YEM gélosé (Tableau 17). Après plusieurs purifications par
repiquage, toutes les colonies sont de couleur blanche ou crème, de surface lisse et bombées
(Figure 23) ; ces résultats sont en accord avec ceux décrits par de Lajudie (2004). La viscosité
augmente avec le temps pour certaines souches (Tableau 17) ; elle est due à la production
excessive des exopolysacharides (Zahran et al., 1994).
La croissance sur milieu YEM solide, chez la plupart des souches, est plus lente par rapport à la
croissance sur milieu YEM liquide car les bactéries, sous conditions d’aérobiose réduite, voient
leur croissance ralentir par contre en milieu liquide l’aérobiose est améliorée par l’agitation qui
réduit la durée de croissance des souches sauf pour quelques unes.
96
Tableau 17 : Caractéristiques macroscopiques des isolats
Croissance
Diamètre
Souches Aspect Couleur Contour Forme Opacité YEM
(mm)
solide
IH1 Visqueux Blanche Régulier Circulaire - Opaque 5 jours
IH2 Lisse Blanche Régulier Circulaire - Translucide 5 jours
IH3 Lisse Blanche Régulier Circulaire 0,3 - 0,8 Opaque 48h
IH4 Lisse Blanche Régulier Circulaire - Opaque 48h
IH6 Lisse Blanche Régulier Circulaire 2 - 2,5 Opaque 5 jours
IH7 Lisse Blanche Régulier Circulaire 1 - 1,5 Translucide 48h
IH8 Lisse Blanche Régulier Circulaire - Translucide 48h
IH9 Visqueux Blanche Régulier Circulaire 0,5-1,5 Opaque 5 jours
IH10 Visqueux Blanche Régulier Circulaire 1-2 Opaque 48h
IH11 Lisse Blanche Régulier Circulaire 2-3 Opaque 48h
IH12 Lisse Blanche Régulier Circulaire 2-3 Opaque 5 jours
IH15 Lisse Crème Régulier Circulaire 1-2 Opaque 5 jours
IH16 Lisse Blanche Régulier Circulaire 3 Translucide 48h
IH18 Lisse Blanche Régulier Circulaire - Translucide 5 jours
IH19 Lisse Blanche Régulier Circulaire 0,3 - 0,8 Opaque 48h
IH20 Lisse Blanche Régulier Circulaire - Opaque 48h
IH22 Lisse Blanche Régulier Circulaire 2 - 2,5 Opaque 5 jours
IH23 Lisse Blanche Régulier Circulaire 1 - 1,5 Translucide 48h
IH24 Lisse Blanche Régulier Circulaire - Translucide 48h
IH25 Visqueux Blanche Régulier Circulaire 0,5-1,5 Opaque 5 jours
IH26 Visqueux Blanche Régulier Circulaire 1-2 Opaque 48h
IH29 Lisse Blanche Régulier Circulaire 0.5-3 Translucide 48h
IH30 Lisse Blanche Régulier Circulaire 0.5-3 Translucide 48h
CIAT899 Visqueux Blanche Régulier Circulaire 2–3 Opaque 5 jours
a b c
Figure 23: Aspect macroscopique de la souche Rhizobium tropici (CIAT 899) (a), IH5 (b)
et IH14 (c) sur milieu YEM solide après culture à 28 °C pendant 72 h.
97
3.5.2. Absorption du rouge Congo
La croissance sur milieu YEM solide au Rouge Congo permet d’exclure d’éventuels contaminants
par rapport à l’absorption du rouge. L’incubation des isolats à l'obscurité n’a pas engendrée
l’absorption du rouge Congo ; les colonies restent ainsi blanches ou deviennent rarement rosées
(Figure 24).
3.5.3. Vitesse de croissance
La croissance sur milieu YEM liquide additionné de bleu de bromothymol (BBT) a permis de
mettre en évidence l’appartenance des souches isolées au groupe des rhizobia à croissance rapide
(Figure 24).
D’après ces résultats morphologiques, les caractéristiques des souches sont en accord avec la
description de Jordan (1982, 1984) et Vincent (1970) pour rhizobium à croissance rapide.
Chaque colonie a été purifiée et conservée au froid pour la suite du travail.
60% des isolats ont acidifié le milieu YEM additionné de BBT révélé par virage de l’indicateur à
différents degré.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
IH23 IH19
IH14
IH5
IH4
a b
Figure 24 : Caractéristiques distinctives des BNL (photos par Bouchentouf L.)
a : Croissance sur milieu YEM au Rouge Congo ; b : Croissance sur milieu YEM au BBT
(1 : IH1 ; 2 :IH2 ; 3 :IH3 ; 4 :IH11 ;5 :IH14 ;6 :IH15 ;7 :IH19 ;8 :IH22 ;9 :IH23 ;10 :IH28 ;11 :IH4 ;12 :IH5 )
98
3.5.4. Caractéristiques microscopiques
Après la coloration de Gram, l’observation au microscope photonique a montré que tous les isolats
étudiés présentent les caractéristiques morphologiques des rhizobia (Dommergues et Mangenot,
1970). Ils sont en forme coccobacille, colorés en rose (Gram négatif) isolées ou associés (Figure
25).
Ce test n’est jamais définitif car dans la nature un grand nombre d’organismes sont à Gram
négatif ; il peut simplement exclure un contaminant à Gram positif (Cleyet-Marel, 1992).
Toutes les souches pures présentant les caractéristiques des rhizobia sont conservées en double
exemplaire sur milieu YEM solide incliné et dans du glycérol 60% (V/V).
a b
Figure 25 : Aspect microscopique de l’isolat IH9 (a) et IH19 (b) après coloration de
Gram (Grossissement × 1250).
de Phaseolus vulgaris L. (Grossissement X 1000)
99
3.5.5. Estimation de la croissance en milieu YEM liquide

La croissance des souches en milieu YEM liquide (Annexe 02) est réalisée dans le but de
déterminer la densité optique (λ= 600 nm) de chaque souche. La figure 26 présente la croissance
des souches à différents intervalles de temps d’incubation.
1 1
0,8 IH1 0,8 IH6
0,6 IH2 0,6 IH7
Densité optique (DO)
0,4 0,4 IH8

IH3
0,2 0,2
IH4 IH9
0 0
6h 18h24h48h54h72h78h IH5 IH10
6h 18h24h48h54h72h78h
1 1
0,8 IH11 0,8 IH16
0,6 IH12 0,6 IH17
0,4 IH13 0,4 IH18
0,2 0,2
IH14 IH19
0 0
6h 18h24h48h54h72h78h IH15 6h 18h24h48h54h 72 78h IH20
1 1
0,8 IH21 0,8 IH26
0,6 IH22 0,6 IH27
0,4 IH23 0,4 IH28
0,2 0,2
IH24 IH29
0 0
IH25 IH30
6h 18h24h48h54h72h78h 6h 18h24h48h54h72h78h
Heure (h)
Figure 26 : Croissance des isolats en milieu YEM liquide à 28 °C
D’une manière générale, les rhizobia à croissance rapide présentent une turbidité entre 2 à 3 jours
avec une vitesse de dédoublement chaque 2 à 4 h (Somasegaran et Hoben, 1994). Les isolats
obtenus présentent un temps de génération oscillant entre 1 h 42 min jusqu’à 3 h 75 min.
100
3.5.6. Effet de la salinité
Certaines régions souffrent de la salinité due à l’évaporation élevée de l’eau présente dans le sol.
Ce problème peut affecter la symbiose Rhizobium-légumineuses en diminuant la croissance et la
survie des deux partenaires (Zakhia et al., 2004). Afin de déterminer la concentration minimale
inhibitrice (C .M .I) du NaCl sur la croissance des souches isolées, le milieu YEM liquide
additionné de différentes concentrations a donné les résultats mentionnés en tableau 18. Les
isolats montrent une croissance entre 100 et 400 mM, au-delà, la croissance est inhibée.
Tableau 18 : Croissance des isolats à différentes concentration de NaCl (28 °C, 72 h)

NaCl (mM)
Isolat 100 200 300 400 500 600
IH1 + + + + - -
IH2 + + + + - -
IH3 + + + + - -
IH4 + + + + - -
IH5 + + + + - -
IH6 + + + + - -
IH7 + + + + - -
IH8 + + + + - -
IH9 + + + + - -
IH10 + + + + - -
IH11 + + + + - -
IH12 + + + + - -
IH13 + + + + - -
IH14 + + + + - -
IH15 + + + + - -
IH16 + + + + - -
IH17 + + + + - -
IH18 + + + + - -
IH19 + + + + - -
IH20 + + + + - -
IH21 + + + + - -
IH22 + + + + - -
IH23 + + + + - -
IH24 + + + + - -
IH25 + + + + - -
IH26 + + + + - -
IH27 + + + + - -
IH28 + + + + - -
IH29 + + + + - -
IH30 + + + + - -
+ : présence de croissance, - : absence de croissance
Différents de leur plantes hôtes, les rhizobia peuvent survivre en présence de concentration de
NaCl et montrent des variations marquées pour la tolérance au sel ; des travaux sur les souches R.
meliloti et R. fredii ont montré qu’elles poussent à des concentrations de NaCl de 300 mM
(Sauvage et al., 1983). La multiplication des cellules rhizobiennes dans la rhizosphère de la plante
hôte, n’est pas affectée par les sols salés.
101
Les résultats montrent que les isolats ont la capacité de croitre à la concentration de 300 mM. Les
limites de tolérance à la salinité entre les rhizobia peuvent varier considérablement d’une espèce à
une autre (Bekki, 1983) et même entre les souches de la même espèce (Merabet, 2007). Face aux
concentrations élevées de sel, les cellules des rhizobia accumulent des molécules protectrices
comme les acides aminés et les carbohydrates pour réguler leur pression interne ce qui fait d’elles
de très bonnes candidates dans le cadre de réhabilitation des sols à contrainte saline.
Le comportement différent des souches isolées vis-à-vis des différentes concentrations de NaCl
peut être du à la composition chimique de leur paroi (Pelmont, 1995). Dans notre cas, les souches
présentant un comportement identique envers les concentrations de NaCl sont de la même origine.
3.5.7. Effet de la température :

Une température de +25 à +28 °C est considérée comme la température optimale pour la
croissance du haricot, ce qui se rapproche de l’optimum de croissance pour les souches (Tableau
19) et du Rhizobium en général (Dommergues et Mangenot, 1970). Un temps humide et froid
continu, souvent le cas pendant l’hiver et le printemps en Algérie, gène fortement le
développement des plantes et donc la sélection des variétés tardives parait judicieuse. Les rhizobia
sont des bactéries mésophiles (Graham, 1991) qui se développent à des températures situées entre
10 °C et 37 °C.
Smmerfield (1979) a souligné que la température exerce une forte influence sur les phases
végétatives de la plante. La germination est rapide entre 31,8 et 33 °C, une température de 48 °C
limite cette dernière (Saxena et al., 1987) ceci est en parfaite concordance avec les températures
de croissance des souches isolées.
102
Tableau 19: Effet de la température sur les isolats pendant 72 h

Température
Isolat 4 °C 7 °C 10 °C 15 °C 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 40 °C 45 °C
IH1 - + + + + + + + + -
IH2 - + + + + + + + + -
IH3 - + + + + + + + + -
IH4 - + + + + + + + + -
IH5 - + + + + + + + + -
IH6 - + + + + + + + + -
IH7 - + + + + + + + + -
IH8 - + + + + + + + + -
IH9 - + + + + + + + + -
IH10 - + + + + + + + + -
IH11 - + + + + + + + + -
IH12 - + + + + + + + + -
IH13 - + + + + + + + + -
IH14 - + + + + + + + + -
IH15 - + + + + + + + + -
IH16 - + + + + + + + + -
IH17 - + + + + + + + + -
IH18 - + + + + + + + + -
IH19 - + + + + + + + + -
IH20 - + + + + + + + + -
IH21 - + + + + + + + + -
IH22 - + + + + + + + + -
IH23 - + + + + + + + + -
IH24 - + + + + + + + + -
IH25 - + + + + + + + + -
IH26 - + + + + + + + + -
IH27 - + + + + + + + + -
IH28 - + + + + + + + + -
IH29 - + + + + + + + + -
IH30 - + + + + + + + + -
3.5.8. Tolérance au pH
L’effet du pH sur la croissance des souches a révélé que celles-ci se comportent de manière
indifférente vis-à-vis du pH du milieu de culture. En effet, la quasi-totalité des souches poussent
convenablement à des pH allant de 4,5 à 9 (Jordan, 1984); elles tolèrent le pH 5,6 alors qu’elles
sont complètement inhibées au delà de pH 9. Les résultats de la tolérance aux pH acides et alcalins
103
sont consignés en tableau 20. Les pH acides (pH 5,6 et 6) sont plus tolérés que les pH alcalins
(supérieur à pH 8,6). Toutes les souches présentent une croissance optimale à pH 6 jusqu’à pH 8.
L’inhibition totale de la croissance des isolats est observée à pH 9,6.
Tableau 20 : Tolérance aux pH (28 °C, 72 h)

pH
Isolat 4,6 5 5,6 6 6,6 7 7,6 8 8,6 9 9,6
IH1 - - + + + + + + + - -
IH2 - - + + + + + + + - -
IH3 - - + + + + + + + - -
IH4 - - + + + + + + + + -
IH5 - - + + + + + + + + -
IH6 - - + + + + + + + - -
IH7 - - + + + + + + + - -
IH8 - - + + + + + + + - -
IH9 - - + + + + + + + - -
IH10 - - + + + + + + + - -
IH11 - - + + + + + + + - -
IH12 - - + + + + + + + - -
IH13 - - + + + + + + + - -
IH14 - - + + + + + + + - -
IH15 - - + + + + + + + - -
IH16 - - + + + + + + + - -
IH17 - - + + + + + + + - -
IH18 - - + + + + + + + - -
IH19 - - + + + + + + + - -
IH20 - - + + + + + + + - -
IH21 - - + + + + + + + - -
IH22 - - + + + + + + + - -
IH23 - - + + + + + + + - -
IH24 - - + + + + + + + - -
IH25 - - + + + + + + + - -
IH26 - - + + + + + + + - -
IH27 - - + + + + + + + - -
IH28 - - + + + + + + + - -
IH29 - - + + + + + + + - -
IH30 - - + + + + + + + - -
De manière générale, les résultats obtenus avec les souches concordent parfaitement avec ce qui a
été rapporté par Jordan (1984) qui a constaté que les bactéries appartenant à la famille des
Rhizobiaceae, symbiotiques, tolèrent parfaitement les pH allant de 4,5 à 9. La tolérance aux pH les
104
plus acides allant de 3,5 à 4,5, a été rapportée aussi pour les souches appartenant aux espèces de
Rhizobium, Bradyrhizobium et Mesorhizobium (Maâtallah et al., 2002).
La corrélation entre le comportement des bactéries vis-à-vis du pH du milieu de culture et celui de

leur sol d’origine est controversée par plusieurs auteurs. Par contre, d’autres auteurs ont conclu
que les souches tolérantes à la salinité pourraient être isolées des sols à différents pH (Zerhari et
al., 2000).
Dans notre cas, le caractère alcalin de quelques souches est plutôt en relation avec la préférence du
haricot pour des sols à pH légèrement alcalin en présence de calcaire. Il serait légitime de penser
que ces souches auraient un caractère adaptatif.
Il est à remarquer qu’au sein d’un même site d’échantillonnage, les souches présentent des profils
de résistance différents avec une moyenne de 20 % des souches tolérant 40 °C en conditions
expérimentales d’après les résultats du tableau, l’origine des souches n’influe pas sur leur
tolérance aux hautes températures.
3.5.9. Résistance intrinsèque aux antibiotiques
Les rhizobia résistent différemment aux antibiotiques (ATB) et le profil d’antibiorésistance est
utilisé comme critère de différenciation entre les souches (Jordan, 1984) au même rang que
l’approche moléculaire comme par exemple chez les souches associées au pois chiche au Portugal
(Alexandre et al., 2006).
De manière générale, les isolats ont exhibé une grande résistance aux antibiotiques testés. Il ressort
des résultats obtenus (Tableau 21) que l’effet inhibiteur de l’antibiotique dépend de sa nature, de
sa concentration dans le milieu de culture et de la souche bactérienne. Les antibiotiques agissent
selon différents modes d’action selon le NCCLS (2000) (National Committee for Clinical
Laboratory Standards).
A une concentration de 10 μg, l’ampicilline (Amp.) et la streptomycine (S.) ont un effet non
inhibiteur chez 60 % des souches qui montrent une bonne résistance. Le chloramphénicol (C.),
l’érythromycine (E.), la rifampine (R.) et l’acide nalidixique (NA), sont actifs sur 30 % des
souches. 50 % des isolats ont toléré tous les antibiotiques. A fortes doses, l’effet inhibiteur de la
tétracycline (30 mg) est hautement remarqué chez l’ensemble des souches.
L’étude de l’effet des antibiotiques a permis également d’identifier, au sein de chaque groupe, des
souches ayant un caractère de multiple résistance ou sensibilité. En effet, en comparant les isolats
entre eux et selon qu’ils soient originaires de différents sols, les souches, toute origine confondue,
105
se répartissent en 3 groupes: les souches sensibles ne résistant qu’à un seul antibiotique, les
souches résistantes en présence de tous les antibiotiques testés et les souches qui présentent une
sensibilité ou une résistance variable selon l’antibiotique (Figure 27).
Tableau 21: Effet des antibiotiques sur la croissance des souches (28 °C, 72 h)
Antibiotique
Isolat C TE NA AMP RD E S
IH1 - - - - - - +
IH2 - - + - - - -
IH3 - - - - - - -
IH4 - - - + - - +
IH5 - - - - - - -
IH6 - - - + - + +
IH7 - - - - - - +
IH8 - - - + - - +
IH9 - + + + - + +
IH10 - - - + - - +
IH11 - - - + - - +
IH12 - - - + - + -
IH13 - - - - - - +
IH14 - - - - - - +
IH15 - - - - - - -
IH16 - - - - - - -
IH17 + - - + - + +
IH18 - - - - - - +
IH19 - - - - - - -
IH20 - - - - - - -
IH21 - - - - - - +
IH22 - - + + - - -
IH23 - - - - - - +
IH24 - + - + - + +
IH25 - - - - - - +
IH26 - - - + - - +
IH27 - - - + - + +
IH28 - - - + - - +
IH29 - - + + - -
IH30 - - - + + -
S : Streptomycine ; NA : Acide Nalidixique; T : Tétracycline ; E. : Erythromycine ; C :

Chloromphénicol ; AMP : Ampicilline ; RD : Rifampine ; + :croissance ; - : pas de
croissance.
106
Le résultat obtenu s’accorde avec certains travaux réalisés sur d’autres bactéries d’origine
symbiotique. En effet, les antibiotiques tels que l’acide nalidixique et l’érythromycine ont été
rapportés pour leur faible effet inhibiteur sur les rhizobia nodulant le pois chiche (Maâtallah, et
al., 2002). Selon Mohammed et al., (2000) et Zerhari et al., (2000), la rifampicine est
l’antibiotique le moins efficace pour affecter la croissance des rhizobia.
Ces trois antibiotiques, même à forte dose, affectent moins la croissance des souches. Par ailleurs,
le caractère de multiple résistance, exhibé par la majorité des bactéries vis-à-vis de plusieurs
antibiotiques, a été rapporté. La même constatation a été faite chez différentes espèces du genre
Rhizobium (Cole et Elkan, 1979).
IH22 IH28
Figure 27 : Effet des antibiotiques sur la croissance des souches en présence des 7 disques
d’antibiotiques
Le mécanisme de résistance aux antibiotiques le plus répondu chez les bactéries Gram négatif est
l’inactivation extra ou intracellulaire de l’antibiotique, ce qui abouti à la perte de l’affinité de
l’antibiotique pour sa cible. Un autre mode connu de résistance consiste à la modification de la
cible de l’antibiotique (Younes, 2010).
3.5.10. Solubilisation du phosphate
Le phosphore joue un rôle important dans le transfert de l’énergie nécessaire à la croissance des
plantes. Dans la rhizosphère, les bactéries qui solubilisent le phosphore (PSB) font partie du
groupe des PGPR et contribuent à l’augmentation de la FSN notamment dans les sols déficients
en P. La collection obtenue ne compte aucun isolat PSB après ensemencement sur milieu
Pycovskaya (Annexe 02).
107
Plusieurs travaux ont rapportés que les souches de Rhizobium et Bradyrhizobium solubilisent le
phosphate et améliorent considérablement la croissance des plantes légumineuses et non
légumineuses. Une équipe iranienne (Alikhani et al., 2006) a examiné l’activité solubilisatrice
chez différents rhizobia natifs des sols iraniens. Elle a constaté que l’indice de solubilisation IS est
compris entre 2,48 pour Rhizobium leguminosarun bv. vicia et 1,41 pour Mesorhizobium ciceri,
M. mediterraneum et Sinorhizobium meliloti.
3.5.11. Métabolisme glucidique
L’utilisation des sucres est un bon indicateur de l’adaptabilité des souches dans des conditions
adverses (Diouf et al., 2008). Les souches isolées pouvaient utiliser la gamme des sept sucres
carbonés (Tableau 22) en plus du mannitol qui est le sucre de choix des rhizobia (Vincent, 1970).
Ces résultats rejoignent ceux de Marsudi et al. (1999) qui ont trouvé que les souches à croissance
rapide métabolisaient plus les disaccharides (Figure 28).
108
Tableau 22 : Métabolisme glucidique des isolats
Source glucidique
Isolat Glu Man Gal Malt Sacc Sorb Cell Raff Fru Ara Lac
IH1 + + + + + - - + - + +
IH2 + + + + + - - + + + +
IH3 + + + + + + - + - - -
IH4 + + + + + + - + - - +
IH5 + + + + + + - + + + +
IH6 + + + + + + - + + + +
IH7 + + + + + + - + + + -
IH8 + + + + + + - + + + +
IH9 + + + + + + - + + - +
IH10 + + + + + + - + - - -
IH11 + + + + + + - + - - +
IH12 + + + + + + - + - - +
IH13 + + + + + + - + + + -
IH14 + + + + + + - + + + +
IH15 + + + + + + - + + + -
IH16 + + + + + + - + + - +
IH17 + + + + + + - + - - -
IH18 + + + + + - + - - +
IH19 + + + + + + + + - - -
IH20 + + + - + + + + + + -
IH21 + + + + + - + + - - -
IH22 + + + + + + + + + + -
IH23 + + + + + + + + + + -
IH24 + + + + + + + + - - -
IH25 + + + + + + + + - - -
IH26 + + + + + - + + - - -
IH27 + + + + + + + + - - -
IH28 + + + + + + + + - - -
IH29 + + + + + + + + - - -
IH30 + + + + + - + + - - -
Glu : glucose ; Man : mannitol ; Gal : galactose; Malt: maltose; Sacc: saccharose; Sorb: sorbitol; Cell:
cellobiose; Raf: raffinose; Fruc: fructose; Ara: arabinose; Lac: lactose.
109
IH30
IH23 IH23 IH29
IH4 IH5 IH4 IH5 IH14
IH15
Mannitol Saccharose
Figure 28 : Métabolisme glucidique. La coloration jaune indique une acidification du milieu

YEM additionné des glucides. (photos par Bouchentouf L.)
3.5.12. Analyse numérique
Les résultats de la caractérisation phénotypique sont codifiés sous forme binaire et un

phénodendrogramme est construit par le logiciel STATISTICA 7.
Au total, 48 caractères phénotypiques ont été pris en compte dans l’établissement de la matrice
basée sur 30 isolats et qui est utilisée pour une analyse en groupes hiérarchique elle-même basée
sur le carré des distances euclidiennes et une moyenne non pondérée des groupes associés. Les
observations sont interprétées en code binaire, 1 pour une croissance positive sur des milieux au
pH différents, concentration en sel, température d’incubation, résistance aux ATB ou enfin
lorsqu’il y a dégradation des sucres avec virage de la couleur de l’indicateur de pH. A l’opposé, 0
indique une absence de croissance ou une sensibilité aux ATB.
La matrice obtenue a permis de dessiner un phénodendrogramme (Figure 29) qui différencie trois
sous groupes distincts A1, B1 et B2 qui renferme le plus grand nombre de souches.
D’une manière générale, les souches associées à une même espèce n’appartiennent pas aux même
sous groupes, ceci montrant une grande diversité de phénotypes rhizobien au sein d’une même
espèce échantillonnée.
110
Tree Diagram for 30 Variables

Single Linkage
Euclidean distances
2.6
2.4
2.2
2.0
Linkage Distance
Cluster A Cluster B
1.8
1.6
1.4
1.2
A1 B1 B2
1.0
0.8
IH22 IH24 IH19 IH29 IH25 IH8 IH14 IH13 IH6 IH17 IH20 IH7 IH30 IH4 IH18
IH28 IH21 IH2 IH9 IH12 IH16 IH15 IH5 IH27 IH26 IH23 IH3 IH10 IH11 IH1
Figure 29 : Phénodendrogramme des souches
Le phénodendrogramme est composé d’un grand groupe et de deux branches séparées représentant
les deux souches IH22 et IH28 isolées de Oued Tlétat et ayant des caractéristiques phénotypiques
différentes des autres souches. Elles résistent à l’ampicilline et ne dégradent pas le lactose.
Le grand groupe formé de 28 souches est divisé en deux clusters A et B, dont 4 souches séparées
en branches à part (IH24, IH21, IH19, IH2) et qui présentent une bonne croissance foliaire lors du
test de nodulation (IH19 et IH2).
Le cluster A comporte un sous groupe cluster A1 regroupant les souches IH14, IH15 et IH13
isolées de Ain Témouchent.
Le cluster B comporte deux sous groupes cluster B1 avec deux souches IH27 et IH17 qui ne
dégradent pas le fructose, l’arabinose et le lactose, et de branches séparées ainsi que le cluster B2
qui regroupe 06 souches (IH30, IH18, IH11, IH10, IH4 et IH1) et qui ont la capacité de dégrader le
111
raffinose et dont la souche IH4 croit à une température qui atteint 40°C ; cette souche peut être
proposée comme inoculum bactérien de régions semi-arides. Les autres souches de ce groupe
forment des branches séparées.
Les caractères phénotypiques restent des tests simples mais distinctifs permettant la comparaison
avec les données anciennes et nouvelles (Zakhia et de Lajudie, 2006). La connaissance des
caractères phénotypiques reste primordiale pour la sélection de souches tolérantes candidates pour
la production d’inoculum adapté aux conditions pédo- climatiques extrêmes.
Il faut souligner l’importance des interactions plantes - rhizobia dans les réponses des plantes en
conditions de stress ceci ouvre de nouvelles voies de recherche pour l’amélioration des cultures
sous contraintes hydriques par exemple (Bresson et al., 2013).
La formation des nodosités sur la partie racinaires du haricot n’est possible qu’avec certaines
souches de rhizobia. La spécificité des interactions entre la bactérie et la plante hôte intervient au
cours des différentes étapes de la formation des nododités après activation des gènes bactériens
responsables de la nodulation (Mulder et al., 2005).
3.6. Caractérisation génotypique des isolats
Afin de déterminer quels étaient en conditions naturelles de culture les génotypes bactériens à
l'origine des nodosités formées sur le haricot, les isolats retenus ont fait l'objet d'une étude de
caractérisation génotypique partielle. Les isolats échantillonnés à partir de nodosités du haricot a
montré qu'il était possible de regrouper les isolats selon deux niveaux de similarité, l'un pour
lequel les profils étaient identiques l'autre pour lequel une partie du profil était commune.
3.6.1. Amplification de l’ADN

Après extraction et digestion de l'ADN total par des enzymes de restriction, l'analyse du
polymorphisme de longueur des fragments de restriction est réalisée.
Cette analyse a permis de différencier 4 grands groupes, eux mêmes plus ou moins diversifiés et 2
groupes répartis parmi les groupes. Certains génotypes étaient conservés parmi les isolats des sites
représentatifs.
La méthode de la PCR- RFLP reste une méthode facile et rapide dont la technique débute par
l’étape de vérification des produits PCR par l’amplification du segment d’ADN codant pour
l’espace intergénique IGS .
112
Le haricot est une plante capable de former des nodules effectifs avec des bactéries génétiquement
hétérogènes et parmi les facteurs influençant cette hétérogénéité les conditions climatiques, dont
les fluctuations imprévues lors du cycle végétatif du haricot, et des précipitations non suffisantes
aux besoins de la culture, de plus la texture, la teneur des sols en calcaire et le phosphore
assimilable sont les facteurs les plus discriminants connus pour notamment l’agroécosystème de
Ain témouchent qui est caractérisé par des sols calcaires et déficitaires en P nécessaire et limitant
la production du haricot (Drevon et al., 2011).
Les performances symbiotiques, sont les critères les plus recherchés, mais pas absolues pour la
différenciation entre les espèces bactériennes symbiotiques. La capacité des légumineuses d’être
nodulées par les espèces de Rhizobium apparait comme règle selon Laguerre et al. (1991, 1997).
Suite à ces résultats, il était intéressant d'étudier la diversité génétique de rhizobium nodulant
Phaseolus vulgaris dans les différentes régions géographiques de l’Ouest Algérien.
3.6.2. Profils de restriction de la région IGS 16S-23S de l’ADNr
Les isolats ont été analysés par PCR-RFLP de la région IGS 16S-23S de l’ADNr. Un fragment
unique a été amplifié pour chaque isolat (Figure 30). Les souches ont donné une amplification
dans la gamme de taille attendue, entre 1030 à 1215 paires de base, ce qui est conforme à la
variabilité connue de la taille de ces régions d’ADN.
Les profils générés par l’enzyme de restriction Hae III ont mis en évidence 14 profils ou types
chez les souches nodulant le pois et la lentille (Riah, 2014). Chaque profil regroupe de 1 à 0
isolats. Les différents profils sont représentés dans la figure 30.
La digestion par les deux enzymes de restriction (HaeIII et MspI) utilisées pour leur pouvoir
discriminants dans l’affiliation des légumineuses alimentaires (Laguerre et al., 1997) ont donnés
des profils distincts. Les résultats ont montré que la collection des souches isolées à partir des
échantillons de sol d’Ain Témouchent a révélé une diversité intéressante.
113
M M M M
MspI gel A HaeIII gel B
HaeIII gel A MspI gel B
Figure 30: Différents Profils électrophorétiques de restriction HaeIII et MspI par RFLP de la
région IGS 16S-23S de l’ADNr. La première colonne indique la position des bandes du
marqueur de masse moléculaire (M).
Les profils de digestion enzymatique des isolats provenant d’autres sites d’Ain Témouchent
(Benadis, 2015) ont permis d’affilier les souches aux espèces R. etli, R. leguminosarum, R.
gallicum, R. loti, 6 Agrobacterium et un groupe non déterminé.
3.6.3. Analyse numérique
Le dendrogramme (Figures 31, 32) et l’analyse en clustering (selon la matrice et la distance

euclidienne) des profils de restriction montre deux grands groupes cluster A et cluster B. Ce
dendrogramme permet d’avoir une idée sur la similarité des souches.
Cette diversité est en accord avec les résultats obtenus par Michiels et al. (1998) qui ont montré
que Phaseolus vulgaris est considéré comme une plante- hôte non sélective. Plusieurs espèces de
rhizobium sont en symbiose avec P. vulgaris (Martinez Romero, 2003). Le spectre des rhizobia
infectant le haricot reste large et les souches de rhizobium nodulant le haricot peuvent être divisées
114
en deux groupes selon l’effectivité. Le premier groupe contient les rhizobia qui forment des
nodules effectifs chez le haricot tel que R. leguminosarum biovar phaseoli (Frank, 1889 ; Jordan,
1984), R. tropici (Martinez-Romero et al., 1991), R. etli biovar phaseoli (Segovia, et al., 1993 ;
Hernandez-Lucas et al., 1995 ; Mhamdi et al., 1999), R. gallicum biovar gallicum et biovar
phaseoli, R. giardinii biovar giardinii et biovar phaseoli (Amerger et al., 1997), R. lusitanum
(Valverde et al., 2002) et Herbaspirillum lusitanum (Valverde et al., 2003).
Le second groupe renferme les rhizobia qui sont capables de former des nodules ineffectifs tels
que B. japonicum, A. caulinodans et R. leguminosarum biovar viciae (Sardowsky et al., 1988 ;
Waelkens et al., 1995 ; Michiels et al., 1998)
Tandis que l’identification au niveau des espèces est basée sur l’analyse génétique
chromosomique, l’identification de symbiovars est basée sur les gènes de nodulation qui sont
portés par le plasmide symbiotique (pSym) dans le genre Rhizobium.
Le gène nodC est couramment utilisé pour définir les symbiovars (Garcia-Fraile et al., 2010).
L’analyse des symbioravs en rhizobia est aussi importante que celle des espèces, puisque la
diversité des hôtes des rhizobia, la promiscuité des légumineuses et des études de biogéographie-
coévolution doivent être fondées sur l’analyse des symbiovars plutôt que celle des espèces par
exemple. P. vulgaris n’est pas considéré comme une légumineuse de promiscuité du fait qu’elle
forme des nodules avec de nombreux symbiovars différents (qui abritent différents gènes nodC).
De cette façon, le haricot est fréquemment nodulé par les symbiovars phaseoli, gallicum, giardinii,
mediterranense (Rogel et al., 2011) et par des souches provenant d’autres groupes qui
appartiennent à des symbiovars indéfinis (Valverde et al., 2011). Parmi ces symbiovars,
seulement sv. phaseoli semble être exclusif pour la nodulation du haricot (Valverde et al., 2011)
et donc le plasmide de symbiovar phaseoli devrait avoir évolué avec les plantes du haricot. Par
ailleurs, R. etli est le majeur endosymbiote du haricot.
UPGMA « Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean » est une méthode très simple,
basée sur le groupement des séquences les plus similaires, indépendamment de leur vitesse
d'évolution et de leurs parentés phylogénétiques, sans déterminer d’ancêtre commun (Goodfellow,
1971).
115
Figure 31 : Dendrogramme des profils de la digestion par HaeIII
116
Figure 32 : Dendrogramme des profils de la digestion par MspI
Divers travaux ont montré que dans les populations de Rhizobium isolées des nodosités racinaires,
toute une variété de génotypes sont capables de noduler la même plante- hôte (Laguerre et al.,
2003; Tian et al. 2010; Mutch et al., 2004). Cependant, la dominance d’un génotype particulier
varie en fonction du génotype végétal (Laguerre, 2003; Mutch et al ., 2004; Tian et al., 2010).
En effet, la diversité et la structure des populations retrouvées dans les nodosités ne sont pas
toujours le reflet de la structure des populations naturelles du sol. Pour un même sol étudié, la
structure des populations nodulantes se montre différente selon la plante piège utilisée (Laguerre
et al. , 2003). Répertorier les espèces de différentes régions et qui sont acclimatées à toutes les
contraintes pédo-édaphiques, ainsi que la mise en évidence de la diversité intraspécifique
117
(Faghire, 2012) des souches bactériennes fixatrice d’azote et qui leur sont associées, sont un
préalable pour la conservation de la biodiversité autant du partenaire végétal que microbien.
118
3.7. Conclusion partielle

Les analyses physicochimiques effectuées sur les différents échantillons de sol montrent que les
pH des sols à réaction alcaline (83,33 % des cas) sont souvent des sols calcaires, ou dont le
complexe absorbant est saturé par des ions sodium. Un sol alcalin peut entraîner une solubilisation
incomplète de certains éléments comme le fer et le manganèse.
La majorité des sols (66,66 %) sont faibles en matières organiques qui jouent un rôle important
dans le fonctionnement global du sol, au travers de ses composantes qui définissent la notion de
fertilité. Elles sont essentiellement décrites par les teneurs en carbone et en azote. L’évolution de la
matière organique incorporée au sol s’accompagne d’une diminution progressive du rapport C/N.
La culture du haricot dans les différentes régions étudiées n’est pas soumise au stress salin (sol
moins salé dans 75 % cas). Le phosphore reste le facteur limitant dans l’établissement de la
symbiose Rhizobium- Phaseolus vulgaris.
Lors de cette étude, l’isolement et la constitution d’une collection de BNL associées à P. vulgaris,
à permis de mettre en évidence une diversité rhizobienne. Les résultats obtenus démontrent une
certaine diversité autant phénotypique que génotypique des souches isolées associées à Phaseolus
vulgaris dans l’Ouest Algérien. Malgré une pauvre représentativité des souches due au
phénomène de non-renodulation qui a été noté chez certaines souches isolées de quelques zones,
cette étude confirme que les BNL isolées associées au haricot sont exclusivement à croissance
rapide dont la renodulation et l’efficience de ces espèces bactériennes demeurent des phénomènes
assez nouveaux (Hoque et al., 2010).
La position phylogénétique des souches de rhizobia isolées n’a aucune relation avec leur
efficience, vu la performance de quelques souches, en conditions contrôlées. En outre, cette
phylogénie n’a aucune relation avec le profil de tolérance des souches au pH et aux températures.
Les souches retenues sont considérées provisoirement comme des bactéries associées aux nodules
car elles ont toutes une croissance rapide sur milieu YEM, sont Nod+ et Fix +
(infectives et
efficientes). Cependant, la position taxonomique de ces souches doit être confirmée par une
caractérisation génotypique complète.
De plus l’étendue de la zone d’échantillonnage, avec des sites possédant des conditions
pédoclimatiques assez diversifiées, a aussi permis de montrer que le comportement, in vitro des
souches isolées, vis-à-vis de différents facteurs, est indépendant de l’origine géographique des
souches, de la conductivité du sol échantillonné ainsi que de la température.
Ces résultats permettent de conclure que dans la mesure où les souches soient utilisées comme
inoculum, elles doivent être des souches autochtones et sélectionnées préalablement sur la base de
119
leur efficience et leur tolérance aux contraintes abiotiques dominantes dans ces régions.
En dehors de ces informations utiles et utilisables dans l’étude de la biodiversité et la taxonomie,

notamment polyphasique, les caractères phénotypiques offrent autant d’opportunités pour
sélectionner des souches efficientes, compétentes et indifférentes aux divers stress
environnementaux. Ainsi, ces approches d’ordre fondamental et pratique permettent la
détermination d’une symbiose efficace et bénéfique pour les plantes- hôtes.
La faible nodulation et la de la réponse réduite des plantes dans certains essais peuvent être
attribuées à la présence d’une large et inefficiente population native des rhizobia ainsi qu’aux
facteurs environnementaux et génétiques de la plante- hôte Paseolus vulgaris (Faghire, 2012).
Les résultats montrent que la variabilité génotypique des graines affecte les paramètres de
croissance et de la nodulation (Bargaz et al., 2011a). Il faut signaler que le fonctionnement de ces
symbioses n’est pas toujours optimal et dépend des caractéristiques du sol, de l’espèce bactérienne,
de la plante- hôte et des conditions environnementales. Dans ce contexte, la sélection de génotypes
locaux ayant un potentiel de rendement élevé, efficace dans l’utilisation des éléments nutritifs et
tolérants aux stress abiotiques (pH, salinité, température) sera d’une importance stratégique. La
sensibilité de la symbiose haricot- BNL aux stress environnementaux comme les températures
élevées et la sécheresse des sols est apportée par de nombreux travaux récents (Benadis, 2015).
Enfin, l’exploitation des symbioses légumineuses- rhizobia et le choix des variétés des
légumineuses adéquates contribueront à la préservation et à la bonne gestion des écosystèmes de
l’environnement et de la biodiversité. La pratique de ces symbioses en rotation avec la culture
céréalière (Latati, 2015) permettrait de réduire l’utilisation des engrais chimiques et fournira un
bon substitut dans un agroécosystème fonctionnel pour une agriculture durable.
120
Partie 2 : Etude du comportement des variétés de
Phaseolus vulgaris aux champs en conditions
naturelles
3.1. Dénombrement des populations natives de chaque échantillon de sol
Le sol n’est pas un environnement homogène mais une mosaïque des micro-organismes qu’il
héberge. Le dénombrement des populations natives consiste donc à déterminer et évaluer la
concentration bactérienne dans chaque échantillon de sol. Le tableau 23 montre que la
concentration et la diversité des micro-organismes varient d’un habitat à un autre. Selon Thomas
et Mbina (2007), les principaux facteurs conditionnant le nombre et la diversité bactérienne
incluent la composition du sol, le pH, l’humidité et la profondeur.
Les micro-organismes occupent des microenvironnements et des microniches dans le sol, leur
activité et survie dépendent des conditions de ce sol, en l’occurrence de la disponibilité de l’eau
(Pansu et al., 2010), des éléments inorganiques et organiques ainsi que de leur compétitivité avec
d’autres microorganismes. Les différents sols présentés dans le tableau 23, montrent que la taille
des populations varie d’une zone à une autre. Des différences significatives sont uniquement
observées entre le sol de Mostaganem et celui d’El Malah suivies des autres sols.
Tableau 23: Dénombrement de la flore bactérienne dans les échantillons de sol
Sol UFC/g de sol

Mostaganem 150.104
Oran 100.103
El Malah 90.104
Oulhaça 162.103
Tissemsilt 116.103
Sidi Bel Abbes 50.103
L’abondance des bactéries dans le sol de Oulhaça est plus importante que celle du sol de
Tissemsilt et de Sidi Bel Abbes ; cette abondance de bactérie semble être liée à la teneur en
matière organique des sols (10 %) (Robert, 1996). La faible concentration bactérienne constatée
dans le sol de Sidi Bel Abbes pourrait être due soit à sa faible teneur en matière organique (2,1 %)
soit à des conditions défavorables
122
telles que les faibles précipitations et le pH alcalin qui entravent le développement de la flore
microbienne du sol indispensable pour la croissance et la nutrition des plantes (Hatimi, 2001).
La biomasse microbienne constitue une matrice de transformation pour les matières naturelles
organiques dans le sol et agit comme un réservoir labile de nutriments disponibles pour les
végétaux ; c’est un indicateur sensible de la dynamique de la matière organique (Rifat et al.,
2010). Ainsi, le dénombrement est un outil précieux pour la compréhension et la prédiction des
effets des changements de la fraction microbienne dans les sols (Latati et al., 2013).
De plus, les micro-organismes dans le sol sont un compartiment à la fois stockeur des éléments
essentiels C, N et P et transformateur des nutriments. Ils renseignent sur le fonctionnement
biologique du sol et répondent rapidement aux changements des pratiques culturales (Pendall et
King, 2007) en raison de la réduction de la compétition spécifique ou interspécifique dans la
rhizosphère notamment de Phaseolus vulgaris.
Estimer l’influence des changements environnementaux sur les populations bactériennes revient à
estimer le fonctionnement de l’écosystème du sol (Cleland et Harpole, 2010). Le caractère
sélectif de la rhizosphère est par conséquent plus important vu qu’il modifie la composition des
micro-organismes présents. Finalement l’activité microbienne totale se trouve modifiée avec en
retour des conséquences pour la plante (Marilley et al., 2007). La faiblesse de l’activité biologique
entraine alors une augmentation du taux de matière organique due à la très lente décomposition de
cette dernière et aussi une pénurie de nutriments absorbables par les plantes du fait de la
minéralisation qui est limitée. Enfin, la nutrition se fait mal : le pH perturbe l’équilibre
électrochimique et empêche l’absorption des éléments nutritifs par la plante (Madani, 2008).
3.2. Mise en place des essais

En Algérie, la culture du haricot en plein champ est conduite en général au printemps sous un
climat doux et tempéré. La parcelle est préparée pour le semis en bêchant le sol pour l’aération et
le réchauffement. Le sol doit être nivelé et préparé pour l’irrigation en billon. Le semis se fait
directement en place à la main, dans des conditions naturelles au mois de mars à avril, chaque
parcelle est préparée pour le semis et le désherbage est exécuté à la main.
Les essais ont été conduits dans des conditions naturelles dans six stations expérimentales :
Mostaganem (Sidi Lakhdar), Oran (Hassi Bounif ITCMI), Ain Témouchent (El Malah, Oulhaça),
Tissemsilt (CFPA), et Sidi Bel Abbès (INRA).
123
3.3. Données climatiques des stations expérimentales
Afin de déterminer la relation entre les conditions climatiques et le développement des cultures du
haricot, les données climatiques (source : climate data.org ; wheatherbase ; office national de
météorologie ONM) de chaque station ont été récoltées (moyenne annuelle totale pour la
température et les précipitations durant la période 2005 - 2011 (Tableau 24)
Tableau 24 : Moyennes annuelles totales des températures (T °C) et des précipitations (P

mm)
Mois 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Mostaganem
P mm 50 34 33 26 28 5 1 3 13 34 60 60
T °C 11,8 12,5 14,0 16,0 18,5 21,8 24,3 25,1 231,1 19,7 15,5 12,6
Oran
P mm 51 45 41 36 27 8 1 2 14 34 55 62
T °C 12,2 12,9 14,4 16,1 18,6 21,6 24,1 25,2 22,8 19,8 15,9 13,7
Ain Témouchent
P mm 62 66 51 49 37 14 1 3 15 42 71 74
T °C 10,8 11,5 13,2 15,1 17,9 21,5 24,9 25,7 22,8 19,2 14,7 11,8
Sidi Bel Abbès
P mm 66 52 43 46 34 14 2 3 17 39 56 70
T °C 8,3 10,1 11,2 13,9 16,5 20,5 24,0 24,6 21,3 16,6 12,1 9,0
Tissemsilt
P mm 58 50 47 36 45 18 4 4 24 36 53 58
T °C 6,0 6,7 9,2 11,8 16,0 21,0 25,6 25,6 21,4 15,6 10,3 6,3
124
L’Algérie subit depuis les années 70 une sécheresse récurrente avec une baisse de précipitations
d’environ 10 % durant les 20 dernières années, entraînant ainsi un dérèglement du calendrier
agricole et une baisse des rendements allant jusqu’à 50 %. Les caractères climatiques et
édaphiques déterminent la répartition de la végétation naturelle et des potentialités agricoles
(Nedjraoui, 2003).
La wilaya de Mostaganem se caractérise par un climat semi aride moyen à hiver chaud. La wilaya
est l'une des plus agricoles du pays, elle bénéficie d'un climat favorable à l’agriculture, elle a
développé une agriculture diversifiée notamment la production de primeurs et de maraîchages. La
température est douce, les écarts thermiques sont faibles et les brises de mer et de terre sont en
alternance quasi quotidienne. Sur l'année, la température moyenne à Mostaganem est de 17,9 °C et
la précipitation moyenne est de 347 mm.
Oran quant à elle, bénéficie d'un climat méditerranéen qui tend vers le semi aride moyen à hiver
tempéré, caractérisé par une sécheresse estivale, des hivers doux, un ciel lumineux et dégagé en
été. Pendant les mois d'été, les précipitations deviennent rares voire inexistantes. L'anticyclone
subtropical recouvre la région oranaise pendant près de quatre mois. En hiver, les pluies sont bien
plus importantes à Oran qu'elles ne le sont en été. La température moyenne annuelle est de 18,1 °C
et il tombe en moyenne 376 mm de pluie par an ; la faiblesse des précipitations et leur fréquence
(72,9 jours par an) sont aussi caractéristiques de ce climat.
Le climat d’Aïn Témouchent est semi aride. Les précipitations sont plus importantes en hiver
qu'en été. Aïn Témouchent affiche une température annuelle moyenne de 17,4 °C. Sur l'année, les
précipitations moyennes sont de 485 mm mais elles restent irrégulières ce qui influence le cycle
végétatif du haricot en grande culture aux champs. La ville d’El Malah bénéficie d'un climat
tempéré chaud. En hiver, les pluies sont bien plus importantes à El Malah qu'elles ne le sont en été.
Elle affiche une température annuelle moyenne de 18,0 °C. Chaque année, les précipitations sont
en moyenne de 438 mm. La ville de Oulhaça se situe dans l’étage bioclimatique humide. Le climat
y est chaud et tempéré. En hiver, les pluies sont bien plus importantes, les précipitations sont en
moyenne de 435 mm. La température moyenne annuelle est de 17,4 °C.
Le climat de Sidi Bel Abbès est très chaud en été et froid en hiver avec rarement de la neige. L'été,
les pluies sont moins importantes qu'elles ne le sont en hiver. La ville affiche une température
annuelle moyenne de 15,7 °C. Sur l'année, la précipitation moyenne est de 442 mm.
125
Notant que la région de Sidi Bel Abbès suivi de la région de Mostaganem, sont les plus affectées
par l’érosion en rappel à l’impact néfaste de l’érosion sur l’agriculture et les volumes d’eau
mobilisables (Touaibia, 2010) vue que la culture du haricot demande beaucoup d’eau.
L'hiver dans la ville de Tissemsilt se caractérise par des précipitations bien plus importantes qu'en
été. En moyenne la température est de 14,6 °C. Sur l'année, la précipitation moyenne est de 433
mm. La wilaya est caractérisée par un climat continental sec et froid en hiver et chaud en été. Il est de
type semi aride dans le Sud et le Centre. La région est à vocation céréalière et les rotations céréales –
légumineuses sont pratiquées à titre privé.
Il est bien établi qu’aux températures sub -optimale (<20°C), la croissance des micro-organismes
dans la rhizosphère, l'infection et le développement du nodule seraient plus affectés que le
fonctionnement même de la symbiose. De même les fortes températures, dites supra- optimales
(>40 °C) inhibent la nodulation et réduisent l'activité fixatrice de N2 (Kichou et Sahraoui, 2001;
Mafongaya, 2004). Il est probable que les réponses à la température varient considérablement
suivant les souches impliquées. Lorsque les températures du sol sont élevées en surface, la
nodulation a tendance à être localisée dans les horizons plus profonds ce qui explique le
développement du système racinaire du haricot (Bargaz, 2012).
En condition de déficit hydrique, la croissance et la survie des rhizobia sont affectées (Hungria et
Vargas, 2000), la nodulation est réduite et le fonctionnent de nodules (fixation de N2) est diminué
(Bacha et Ounane, 2003; Ounane et al., 2003; Lazali, 2009). Les deux partenaires (haricot,
rhizobia) et toutes les étapes de l'établissement et de fonctionnement de la symbiose sont sensibles
au stress hydrique (Reddy et al., 2003). En règle générale, l'excès d'eau est préjudiciable à la
fixation de N2. Il existe de très grandes variations entre les variétés du haricot et probablement
aussi les provenances.
Belaid (2016) rapporte que les semis de blé, par exemple, ont été terminés très en retard durant la
campagne 2015-2016, en partie à cause de la sécheresse et dans le cadre des rotations, de
nombreux travaux ont montré que les légumes secs peuvent être semés en janvier à conditions de
maîtriser le désherbage chimique ou mécanique réduisant ainsi les jachères dans le cadre du
renouveau agricole (DSA, 2016). Des travaux marocains ont montré que les variétés tardives sont
plus productives lorsqu'elles sont semées en hiver plutôt qu'en mars (PNTTA, 2000). Ce sont là
des acquis de la recherche agronomique.
126
En conclusion, la région littorale, s’identifie sur le plan bioclimatique, à un régime méditerranéen

caractérisé par deux saisons bien distinctes : une période pluvieuse en moyenne de cinq mois,
débutant en novembre jusqu’au mois de mars et une période sèche plus longue, qui s’étale sur sept
mois consécutifs allant du mois d’avril jusqu’au mois d’octobre. Par ailleurs, l’été est souvent
atténué par la brise de mer. Les amplitudes thermiques sont fortement atténuées et sont
dépendantes des températures de la surface de la mer dont la brise joue un rôle particulièrement
important en faisant largement baisser les températures maximales et en réduisant ainsi les
amplitudes thermiques. Avec une humidité atmosphérique importante, l’évapotranspiration est
diminuée et des précipitations occultes sont provoquées.
L’étude comparative des résultats enregistrés pour les sites d’essai montre:
- Une diminution considérable des précipitations moyennes annuelles
- Une augmentation des températures moyennes annuelles
- Une semi aridité accentuée
- Un décrochement vertical d’un sous étage à un autre de chaque station observée selon les
climagrammes d'Emberger.
L'évolution progressive de la période de sécheresse impose à la végétation une forte
évapotranspiration (Lahouel, 2014) ce qui lui permet de développer des systèmes d'adaptations
modifiant ainsi le paysage en imposant une végétation xérophile qui devient un phénomène du
littoral. Par conséquent, les agriculteurs tendent à délaisser la culture du haricot pour se retourner
vers des espèces xérophiles et de ce fait les semis des variétés du haricot sont plus appropriés à
partir de fin février.
3.4. Observation et notation
Les principaux stades de développement des plantes sont notés durant le cycle végétatif dans les
sites expérimentaux et les plantes sont déterrées au stade de floraison pour vérifier la présence de
nodules sur leurs racines.
Les différences sont presque négligeables en comparant les graines germées sur les six sols. Le
travail de Hampton et al. en 2013, a montré que la qualité des graines est influencée par les
niveaux élevés de CO2 et des températures. Une germination totale est enregistrée chez les deux
RILs 83 et 147 cultivées sur le sol de Sidi Bel Abbès (Tableau 25) ainsi que les variétés 124 et
147 cultivées sur le sol de Mostaganem.
127
Tableau 25 : Germination des graines dans les sites d’essai

(Totale 12 graines par ligne)
El Sid bel
Variété Oran Mostaganem Oulhaça Tissemsilt
Malah Abbes
104 03 10 5 08 07 08
115 03 11 9 08 10 08
124 06 12 9 - - -
147 05 12 10 07 09 12
83 08 10 8 08 11 12
34 09 10 10 10 08 10
29 07 09 11 08 11 11
HVL 02 05 06 - - -
- : semis non effectué
La germination des graines colorées à Mostaganem est totale comparée à la variété locale HVL
(5/12), cette variété doit être sensible aux températures basses car les semences ne germent pas
normalement qu’au dessus de +10 °C ou que les conditions édaphiques sont défavorables ; sur le
site d’Oran, le sol HB (Hassi Bounif) est un sol calcaire et le haricot se développe lentement sur un
sol calcaire ce qui explique le faible taux de germination de toutes les variétés. Les légumineuses
tel le haricot s’adaptent normalement à des pH allant jusqu’à 8 (pH des sites légèrement alcalins à
alcalins). La salinité du sol (cas du sol HB Oran) empêche le développement de la variété locale
blanche en comparaison avec les RILs colorées qui s’avèrent plus résistantes.
Les variétés étudiées semblent être bien adaptées sur le sol de Oulhaça et Tissemsilt en montrant
une levée au bout de 09 à 11 jours chez la plus part des variétés (Tableau 26). Cette adaptation est
moins exprimée sur le sol de Sidi Bel Abbes où la germination est notée après 20 jours, le résultat
obtenu peut être due aux basses températures qui sont liées à la période de plantation. La
température exerce une forte influence sur les phases végétatives de la plante du haricot
(Summerfieled et al., 1979) . Selon Kolef (1974), la germination est rapide entre 31,8 et 33 °C et
une température de 48 °C limite cette dernière d’après Saxena (1987). Les espèces de
128
légumineuses comme le haricot s’adaptent aux conditions météorologiques locales ce qui est
constaté pour les RILs dans la majorité des cas.
Le suivi des différents stades végétatifs révèle des durées rapprochées pour les variétés en
comparaison entre les stations (Tableau 26).
A la station INRAA Sidi Bel Abbès, le semis a été menée sous fertilisation azotée pour cela
l’accumulation de l’azote fixé biologiquement n’a pas été prise en considération (les résultats
obtenus servent de modèle pour les études ultérieures). Le suivi de la croissance, débutée au stade
2 à 4 feuilles, montre une grande variabilité de la phase de croissance entre les RILs où la RIL 147
a une levée plus longue que celle de la RIL 115.
129
Tableau 26 : Dates relatives aux stades phénologiques de Phaseolus vulgaris en culture aux champs
Ain Temouchent Tissemsilt Sidi Bel Abbes Oran Mostaganem
Variété Stade végétatif
Date Date Date Date Date
Semis 08 Avril 13 Avril 02 Mars 21 Mars 21 Mars
Levées 16 Avril 25 Avril 25 Mars 1 Avril 05 Avril
147 3à4F 25 Avril 04 Mai 19 Avril 10 Avril 12 Avril
Floraison 05 Juin 14 Juin 17 Mai 3 Mai 25 Avril

115 3à4F 25 Avril 01 Avril 17 Avril 12 Avril 11 Avril
Floraison 05 Juin 15 Juin 16 Mai 05 Mai 02 Mai



Floraison 03 juin 13 Juin 18 Mai 02 Mai 05 Mai
Floraison 04 Juin 14 Juin 15 Mai 06 mai 02 Mai
Semis 21 Mars 21 Mars 21 Mars
Levées 03 Avril 03 Avril 03 Avril
- -
124 3à4F 13 Avril 14 Avril 13 Avril
Floraison 06 mai 08 mai 06 mai
Semis 21 Mars 21 Mars 21 Mars
Levées 04 Avril 04 Avril 05 Avril
- -
HVL 3à4F 13 Avril 13 Avril 15 Avril
Floraison 06 mai 07 mai 10 mai
- : non effectué
130
La phase de croissance chez les RILs semées (Figure 34, 35, 36, 37, 38 ; photos par Bouchentouf
L.) était d’un mois environ et cela correspond au cycle végétatif du haricot où après trois à quatre
jours de la levée de la plante, les cotylédons se fanent et la première feuille trifoliée apparait.
Après l’apparition de la première feuille trifoliée la deuxième apparait au bout d’un mois ; à ce
stade, le pied du haricot possède en moyenne une dizaine de feuilles trifoliées mais cela dépend
aussi des variétés (Hubert, 1978).
Figure 34: Développement de l’essai à Oran (Hassi Bounif).
Figure 35: Développement de l’essai à Oulhaça.
131
Figure 36 : Développement de l’essai à El Malah.
Figure 37 : Développement de l’essai à Sidi Bel Abbès (INRA).
Figure 38: Développement de l’essai à Tissemsilt.
132
Le développement des plantes testées sur les différents sites présentent une bonne croissance en
général et une bonne résistance aux maladies qui peuvent éventuellement toucher le haricot (Singh
et Schwartz, 2010). La biodiversité des variétés semées au niveau de l’exploitation agricole peut
permettre aux agro-écosystèmes, capables de maintenir leur propre fertilité du sol, de régler la
protection naturelle contre des parasites et d’améliorer la productivité (Scherr et McNeely, 2008).
La restauration de la fertilité du sol passe par la culture des légumineuses qui la maintiennent et
l’améliorent. Le haricot fixe l'azote atmosphérique, qui peut être utilisé par les autres plantes ou
peut être excrété des nodules dans le sol et être utilisé par d'autres plantes qui poussent tout près
(Dahmardeh et al., 2010) ; en outre, et comme chez les autres légumineuses (Corre-Hellou et al.,
2006), la décomposition des résidus du haricot améliore le sol en azote qui sera disponible pour les
cultures de l’année suivante. Le développement aérien des plantes du haricot est un indice de la
fixation biologique d’azote dont le taux est relatif au poids de toute la surface foliaire.
L’analyse statistique est effectuée sur 3 plants en moyenne par le test MANOVA et le test de
Duncun par le logiciel Statistica 7; la moyenne et les écarts- types ont été calculés par Excel.
Les moyennes des poids secs des parties aériennes, sur tous les sites d’essai (Figure 39), montrent
une bonne croissance des RILs 104, 115 suivis de la variété HVL.
1,6
1,4
1,2
1
Poids (gr)
0,8
0,6 M PSA
0,4
0,2
0
147 124 115 104 HLV Variété
Figure 39 : Moyenne poids secs aériens en fonction des variétés
133
L’analyse statistique montre que la différence, en poids des parties aériennes, n’est pas
significative (α= 0,5%).
En fonction des régions, les biomasses aériennes les plus faibles ont été enregistrées dans la région
d’Oran (Figure 40) par contre les biomasses les plus élevées ont été enregistrées dans la région de
Ain Témouchent où la biomasse aérienne maximale a atteint 2,119 gr± 0,021.
1,6
1,4
1,2
PSA (gr)
1
0,8
0,6
M PSA
0,4
0,2
0 Région
Mostaganem Ain Temouchent Oran
Figure 40 : Moyenne poids sec aérien en fonction des régions
L’analyse statistique montre que la différence, en poids des parties aériennes, n’est pas
significative (α= 0,5%).
La rotation jachère-céréales est le système de culture le plus répandu pour la production céréalière
en Algérie. En fait, le remplacement de la jachère par des cultures de légumineuses dans les
systèmes de production agricole en Algérie, est devenu une nécessité stratégique pour la sécurité
alimentaire dans un contexte de hausse des prix des produits alimentaires dans le monde (Alkama
et al., 2009).
En plus de la sécheresse, la déficience en P, dans certains cas, est aussi un facteur limitant de la
croissance racinaire et de la nodulation des légumineuses, particulièrement chez Phaseolus dans
les zones méditerranéennes (Alkama et al., 2012). La figure 41 montre un poids racinaire élevé
pour la variété 104 qui se distingue par rapport aux autres RILs et la variété locale ainsi que pour
la région de Mostaganem (figure 42).
134
1,8 a
1,6
1,4
1,2
Poids (gr)
1 ab b
b
0,8 b
0,6 MPSR
0,4
0,2
0
147 124 115 104 HLV Variété
Figure 41 : Moyenne poids secs racinaires en fonction des variétés
L’analyse statistique montre trois groupes dont la variété 104 qui présentent une différence
hautement significative (p<0,05).
0,62 a
0,6
0,58
gr
b
0,56
c
0,54
0,52 M PSR
0,5
0,48
0,46
Mostaganem Ain Temouchent Oran Région
Figure 42 : Moyenne des poids secs racinaires en fonction des régions
L’analyse statistique montre trois groupes (a,b, c) présentant une différence hautement
significative (p<0,05).
135
Une variation significative des biomasses aériennes au détriment des biomasses racinaires est
remarquée pour les RILs et la variété locale (Figure 43) ainsi que pour les différentes régions et
entre les champs au sein de la région d’Ain Témouchent (Figure 44).
1,8
1,6
1,4
1,2
Poids (gr)
0,8 M PSA
0,6 MPSR
0,4
0,2
0
Variété
147 124 115 104 HLV
Figure 43 : Moyenne poids secs aériens (PSA) comparée aux poids secs racinaires (PSR) en
fonction des variétés
1,6
Poids (gr)
1,4
1,2
0,8
M PSA
0,6
M PSR
0,4
0,2
0
Mostaganem Ain Temouchent Oran Région
Figure 44 : Moyenne poids secs aériens (PSA) comparée aux poids secs racinaires (PSR) en
fonction des régions
136
La biosphère terrestre est formée par la végétation et l'épaisseur du sol impliquée dans le cycle
global du C et de la matière organique indispensable pour l’activité biologique . Chaque saison,
une partie de la matière végétale meurt et se décompose dans le sol sous l'action de micro-
organismes tandis que le reste se répartit en C minéral et organique. Pour comprendre le
comportement et l’influence des variétés du haricot testées comme couvert végétal aux champs
dans les différentes régions, les caractéristiques des plantes sont relevées au stade de floraison
(Tableau 27) où la fixation biologique d’azote est à son maximum et se traduit par le
développement aérien des plantes (Figure 45, 46).
L’observation de la couleur verte des plantes et de leur croissance est une première indication de
l’activité fixatrice d’azote.
La variabilité des écosystèmes est due à la multiplicité des espèces végétales, elles-mêmes
combinées aux différents types de sols tandis que le couple sol/végétation subit, sous les
contraintes météorologiques périodiques qui pilotent la capacité de stockage des réservoirs, les
transferts du carbone au sein du système sol/végétation ainsi que les échanges avec l'atmosphère
(Denman et al., 2007).
137
Tableau 27 : Caractéristiques des plantes aux champs
Couleur
Hauteur Longueur Largeur
Variétés des
de tige (cm) de feuilles (cm) de feuilles (cm)
feuilles
Oulhaça
115 16,2 8,7 6,2 Vert ++
147 14,5 6,8 5,6 Vert +++
104 14,5 8,8 6,8 Vert ++
83 14,6 8,5 6,6 Vert ++
34 18 8,9 6,2 Vert +++
29 17 8,2 6,3 Vert +++
Tissemsilt
115 14,2 8,2 7 Vert +
147 15,5 7,7 6,3 Vert +
104 16,2 9 7,2 Vert+
83 16,7 8,5 7,6 Vert +
34 15 9,8 6 Vert +
29 16,3 7,3 6,2 Vert +
Sidi Bel Abbes
115 20,2 8,3 6,3 Vert +++
147 13,4 7,5 6,5 Vert +++
104 26 7,6 4,7 Vert +++
83 17,4 8,5 6,6 Vert ++
34 14,5 7,5 5 Vert +++
29 19 9,2 6,5 Vert ++
Oran
104 20,1 8,2 4,1 Vert +
115 19,3 7,5 5,2 Vert ++
124 17,1 6,1 3,4 Vert +
147 16,2 7,2 4,3 Vert +
HVL 10,1 5,1 2,5 Vert +
Mostaganem
104 17,2 5,5 3,5 Vert +++
115 17,4 7,4 4,6 Vert +++
124 12,1 4,1 3,5 Vert ++
147 15,3 6,3 4,5 Vert ++
HVL 14,2 5,1 4,2 Vert ++
El Malah
104 17,4 5,4 6,2 Vert +++
115 17,8 5,4 5,6 Vert +++
124 13,5 4,1 5,5 Vert +
147 14,6 4,3 6,6 Vert ++
HVL 13,4 5,1 6,2 Vert ++
Vert +: présence de la couleur jaune; Vert ++: présence modérée de la couleur jaune ; Vert +++ :
absence de la couleur jaune.
138
18
cm
16
14
12
10
8
M HT (cm)
6
0
115 147 124 104 83 34 29 HVL
Figure 45 : Moyenne de la hauteur de tige en fonction des variétés

60 jours après le semis
30
cm
25
20
15
10 HT (cm)
0 Région
Mostaganem Ain Oran
Temouchent
Figure 46 : Moyenne de la hauteur des tiges en fonction des régions

60 jours après le semis
139
Pour le sol, la différence de la hauteur des tiges est statistiquement significative (α=5%). Le teste
de Duncun (p< 0,05), présente trois principaux groupes (Tableau 28). Le même test sépare les sols
en fonction de la largeur des feuilles en quatre groupes avec une différence hautement
significative.
Tableau 28 : Les groupes Duncun pour le sol
Hauteur de tige Longueur feuille Largeur feuille

Sol HT LF LrF
Sig. : 0,000 Sig.: 0,053 Sig. : 0,000
Mostaganem a b ab
Oran ab c a
El Malah a ac ab
Sidi Bel Abbes b a a
Oulhaça a ab b
Tissemsilt a b c
Six groupes sont formés en fonction de la variété (Tableau 29) où l’on remarque une différence
significative pour la longueur de la feuille en fonction de la variété contrairement en fonction du
sol.
Tableau 29: Les groupes Duncun pour la variété
Hauteur de tige Longueur feuille Largeur feuille

Variété HT LF LrF
Sig. : 0,000 Sig. : 0,000 Sig. : 0,000
34 b a c
147 a a a
104 e ab bc
29 d ab b
115 c ab bc
83 b c bc
HVL cd d bc
L’échantillon de 12 plantes montre qu’il y une différence statistiquement significative pour le

sol*variété pour les trois paramètres mesurés à un seuil d’erreur 5% (Sig. :0,000 pour la hauteur
de la tige, la longueur des feuilles et la largeur des feuilles).
140
3.5. Estimation de la nodulations
Dans la rhizosphère des légumineuses et dans le sol adhéré aux racines, les rhizobia se multiplient
aux dépends des exsudats racinaires et divers dépôts où certains d’entres eux vont infectés la
racine. D’autre part, cette fraction est influencée par des changements qui touchent les populations
bactériennes. Les résultats ont montré que l’établissement et le taux de nodulation varient selon la
variété semée. L’activité des populations microbiennes a des conséquences directes, sur le
développement de la plante (Marilley et al., 2007).
Dans les stations expérimentales, le constat nodulaire montre des variations importantes au niveau
de chaque site et pour chaque variété (Tableau 30). Cela pourrait être expliqué par divers facteurs
environnementaux, ou par des différences du potentiel de la fixation symbiotique d’azote des
partenaires dont les rhizobia natifs.
Les résultats des paramètres de la nodulation, initiée par les rhizobia natifs, restent très faibles pour
les sites Mostaganem et Oran pour la plupart des variétés (Tableau 30).
La variabilité génotypique a affecté la nodulation qui est importante (≥30 nodules) et enregistrée
pour les RILs 147 et 34. Le même résultat est enregistré par Benadis (2015) pour les RILs 115,
83, 34 et la variété locale (20 à 30 nodules/plants) testées à Ain Témouchent.
Une nodulation de 20 à 30 nodules/plants est remarquée pour les RILs 83 et 115. La variété locale
occupe une position intermédiaire avec 15 nodules/plant. Le groupe le plus important est composé
des six RILs avec un nombre de nodule compris entre 2 et 10. Les mêmes RILs non nodulées sont
enregistrées sur le site de Sidi Bel Abbès. L’établissement et la biomasse de la nodulation varie
selon les génotypes testés (Figures 47, 48, 49).
141
Tableau 30 : Paramètres des nodules
Nombre de Taille des nodules

Variété
nodules (mm)
Oulhaça
104 tolérante 11 1-2
147 sensible 35 1-3
83 sensible 2 <1
34 tolérante 8 1-2
29 sensible 9 ≤3
Tissemsilt
104 tolérante 5 5
115 tolérante 14 14
147 sensible 21 21
83 sensible 29 29
34 tolérante 31 31
29 sensible 3 3
Sidi Bel Abbès
104 tolérante 00 -
115 tolérante 00 -
147 sensible 00 -
83 sensible 00 -
34 tolérante 00 -
29 sensible 00 -
Oran
147 sensible 00 -
124 sensible 02 1-2
HVL 15 1-2
Mostaganem
147 sensible 00 -
124 sensible 00 -
HVL 00 -
El Malah
147 sensible 00 -
124 sensible 00 -
HVL 00 -
142
Le meilleur taux de nodulation est enregistré sur le sol de Oulhaça. Ces résultats suggèrent
l’existence de populations indigènes très importantes de bactéries symbiotiques dans le sol de cette
station (Boulbaba et al., 2009), leur capacité d’infecter et de noduler les racines du haricot est
exprimé par le nombre de nodules qui atteignent 35 nodules chez la variété 104 tolérante. La
nodulation dans cette station est supérieure à celle des autres stations où l’arrosage était effectué
quotidiennement et donc la baisse de la pluviométrie en saison sèche n’a pas un effet néfaste sur la
nodulation. Un résultat similaire à été obtenu par Boulbaba et al. (2009), et même par Purcell et
al. (1997) sur deux cultivars de soja. La sensibilité de la symbiose haricot-rhizobia aux stress
environnementaux comme les températures élevées et la sécheresse des sols est rapportée par de
nombreux travaux dont Hungria et Vargas (2000).
La production nodulaire est aussi importante sur le sol de Tissemsilt, mais le système racinaire et
la partie aérienne sont moins développées chez la plupart des variétés ; ce résultat peut être
expliqué par les quantités de phosphore qui sont insuffisantes naturellement dans le sol, ou par une
carence en azote qui influence la croissance de la plante et le système racinaire (Figure 49).
La déficience de la nodulation dans plusieurs essais peut être attribuée à la présence d’une large et
inefficiente population indigène des rhizobia et aux facteurs génétiques de la plante (Andrade et
Hungria, 2002). Ainsi, lorsqu’une légumineuse est en présence d’une population de rhizobium qui
lui est spécifique, celle-ci sélectionne préférentiellement certains génotypes pour former des
nodosités racinaires. Cette sélection en fonction de la plante hôte peut être liée aux exsudats
racinaires de rhizodépôts qui constituent des sources de carbone et d’énergie pour les
microorganismes rhizosphériques, et de flavonoïdes privilégiant la nodulation par certains types de
BNL (Maj et al., 2010). Seules quelques études ont montré qu’au sein d’une même espèce
végétale, la diversité génétique de la plante hôte influence la structure de la diversité génétique des
populations de rhizobia associées (Berrada et Fikri- Benbrahim, 2014).
Deux facteurs biologiques majeurs peuvent être impliqués. Le premier facteur consiste dans
l'inadéquation des populations natives de rhizobia compatibles avec le génotype de la légumineuse
que l'on souhaite planter. L'établissement de la symbiose est très sensible à de petites variations de
la densité des populations natives compatibles (Zaman-Allah et al., 2015). Le deuxième facteur
concerne la présence d'ennemis et maladies. Parmi les ennemis, les nématodes qui affectent la
symbiose fixatrice de N2 en inhibant la nodulation et en limitant de façon drastique la fixation de
N2. La compétition des mauvaises herbes ou des rejets de souche peuvent affecter la légumineuse
et, par conséquence son aptitude à fixer N2 (Dommergues et al., 1999) ce qui favorise la culture
143
des légumineuses annuelles qui contribuent à la fixation de N2 afin de provoquer une forte
disponibilité en P et K (Dahmardeh et al., 2010)..
a b
Figure 47 : Variété 104 tolérante cultivé dans le sol de Oulhaça

a: partie aérienne ; b : partie racinaire ; c : nodule
stade floraison
c
a b
Figure 48: Variété 104 tolérante cultivé dans le sol de Tissemsilt
a : partie aérienne ; b : partie racinaire, c : nodules
stade floraison
144
a b
Figure 49: Variété 29 sensible cultivé dans le sol de Sidi Bel Abbès
a : partie aérienne ; b : partie racinaire
stade floraison
La nodulation est totalement absente chez les variétés cultivées dans la station de Sidi Bel Abbes ;
les plantes sont traitées par des fertilisants azotés, ces derniers ont entrainé une augmentation de la
biomasse aérienne et une diminution de la nodulation (Boulbaba et al., 2009), ce qui explique
l’absence totale de la symbiose Rhizobium-Phaseolus vulgaris . L’enracinement des plantes est
très important en agronomie en ce qui concerne l’alimentation en eau et en éléments minéraux.
Le type de sol peut être aussi à l’origine de tels résultats, comme il a été suggéré par Tellawi et al.
(1986) qui a constaté que les facteurs édaphiques affectent significativement le nombre, la
biomasse des nodules et l’absorption de l’azote.
Ces dernières années, la région de Sidi Bel Abbes a reçu des précipitations très faibles et le sol est
pauvre en éléments nutritifs. Ces conditions défavorables empêchent le développement de la flore
microbienne du sol indispensable pour la croissance et la nutrition des plantes (Hatimi, 2001)
La forme des nodules, sphérique et cylindrique, indique que les nodules sont doté d’une activité
méristématique et d’une capacité de reprise après le déficit hydrique (Aggoun et al., 2005).
L’emplacement des plantes choisies au hasard dans la parcelle est sujet à un certain nombre de
facteurs externes tels que la densité d’implantation, les fumures organiques apportées et la texture
du sol. La variabilité des biomasses racinaires peut être également due aux fluctuations climatiques
à priori la pluviométrie (Benadis, 2015).
La nodulation effective est un paramètre essentiel pour l’établissement d’une symbiose rhizobium-
légumineuse effective. Les résultats montrent une grande variabilité de la nodulation entre les
cultivars testés du fait que les Phaseoleae sont réputées être nodulées par les symbiontes
bactériens à croissance lentes et rapides (Blaire et al., 2013) ce qui peut être à l’origine des
145
variations nodulaires vu l’initiation des premières étapes de la nodulation par les signaux émis des
deux partenaires, nécessaires pour le développement et la finalisation de la nodulation. La
variabilité montrée dans nos expérimentations peut être le résultat du comportement de Phaseolus
vulgaris en promiscuité rhizosphérique élevée et d’une compatibilité inadéquate entre les cultivars
et leurs partenaires (Hungria et al., 2000).
La plupart des nodules sont situés sur la racine (Figure 50) dans un rayon de 5 cm et à une
profondeur entre 3 et 10 cm. La taille des nodules est égale ou supérieure à 5 mm de diamètre ce
qui est en accord avec les valeurs notées par Sprent (2001) ; dans d’autres cas elle est inférieur à 1
mm.
Par rapport aux autres légumineuses, la culture du haricot est très sensible au stress abiotique et
principalement au phosphore (Alkama et al., 2012). La plante réagit et implique plusieurs
mécanismes pour augmenter l’absorption du P comme la modification de l’exploration du sol par
des racines en augmentant la surface d’absorption de P (Lynch et Brown, 2001). Aussi la
prolifération du système racinaire induit une surface d’échange racinaire plus importante, par
conséquent, la probabilité d’infection par les rhizobia est plus accrue. Le haricot est utilisé
dernièrement comme plante modèle pour comprendre l’importance de l’architecture de la racine
pour l’acquisition des ressources du sol dont la croissance végétale à besoin (Faghire, 2012).
Plusieurs études ont montrés que les nodules positionnés sur les racines latérales sont plus actifs
durant la formation des graines et peuvent fournir une fixation significative de l’azote durant la
phase de reproduction de la plante (Kyei-Boahan et al., 2002).
146
Figure 50: Aspect racinaire de P. vulgaris en culture au champ (photos par Bouchentouf L.)
a : racines nodulées b : formes des nodules
c : taille des nodules d : coupe à main levée dans un nodule sphérique
147
Aux champs, l'application des engrais phosphatés est essentielle pour réduire au minimum les
pertes de rendement. La fertilisation phosphatée a augmenté de 900 millions de tonnes en 1913
jusqu’à 17000 millions de tonnes dans les années 1980 (Hart et al., 2004). Cette dernière
augmentation est due, d’une part, à la croissance de la population mondiale (Zapata et Roy,
2004), d’autre part, la majeure partie du P appliqué au sol est immobilisée sous formes
indisponibles difficilement utilisées par la plante (Hash et al., 2002). Ainsi, certains experts
pensent que les ressources en minerais de phosphate risquent de s’épuiser d’ici 60 à 80 années
(Liu et al., 2004).
En réponse aux niveaux bas de P disponible dans la rhizosphère, les plantes, en outre le haricot
développe des mécanismes morphologiques, physiologiques, biochimiques et moléculaires
fortement spécialisés pour acquérir et utiliser le P de l'environnement comme l’augmentation du
rapport partie racinaire-partie aérienne, changements de la morphologie et de l'architecture des
racines avec une augmentation du nombre des poils racinaires, prolifération et élongation des poils
racinaires.
la croissance racinaire est beaucoup moins affectée entraînant en terme de matière sèche, une
diminution du rapport parties aérienne /racinaire (Bernal et al., 2005; Alkama, 2010). Chez le
haricot, ce rapport baisse de 5 chez les plantes en conditions de suffisance en P, tandis qu’il baisse
de 1,9 en cas de déficience.
Les nodosités constituent des puits importants pour le P en lien avec le coût énergétique élevé de la
fixation symbiotique de l’azote. Il est bien établi que la biomasse nodulaire est fortement corrélée
à la disponibilité en P de la plante (Alkama, 2010). La carence en P diminue le nombre de
nodosités par plante et/ou la masse individuelle des nodosités. Cependant, la limitation de P a
également comme conséquence l'activation d'une voie respiratoire alternative provoquant ainsi une
diminution du taux de la photosynthèse et de la conductivité stomatique (Hinsinger et al., 2001).
Les végétaux et les microorganismes ont développé des mécanismes à plusieurs facettes de
réponse pour acquérir le P dans leur environnement où plus de 100 gènes sont impliqués dans
l'adaptation des plantes à la déficience en P (Drevon et al., 2003).
Afin de comparer la nodulation du haricot (Figures 51, 52) soumis aux conditions climatiques
fluctuantes, la quantification du nombre des nodosités racinaires de la plante du haricot était la
moyenne de 3 plants qui ont été analysés par le test MANOVA et le test de Duncun (Tableau 31)
par le logiciel Statistica 7 (les intervalles de confiance sont calculés au seuil d’erreur de 5%
(p<0,05) selon le test de Duncun. Les moyennes et les écarts- types ont été calculés par Excel.
148
16
N nodule
14
12
10
8
6 M N nd
4
2
0
115 147 104 83 34 29 124 HVL Variété
Figure 51 : Moyenne nombre de nodules (MNnd) en fonction des variétés
30
25
20
N nodule
M N nd
15
10
5
0
Région
Figure 52 : Moyenne nombre de nodules (MNnd) en fonction des régions
Tableau 31 : Les groupes Duncun pour la nodulation
Sol N nd Variété N nd
Sig : 0,000 Sig. : 0,000
Mostaganem bc 29 a
Oran bc 115 b
Ain Temouchent b 83 c
Sidi Bel Abbes a 147 c
Tissemsilt c 34 d
104 d
La corrélation entre la variabilité génotypique et la déficience en P a été déjà démontré par Jebara
et al. (2001) et Ribet et Drevon (1995)
149
3.6. Rendement à la récolte

Le poids des graines en gramme pour chaque RIL récoltée est présentée en tableau 32. Les
résultats ont montré que le rendement en graines des RILs contrastantes est plus élevé que la
variété locale. Le rendement en graines sèches montrant une corrélation significative a été notée
entre le nombre de nodules enregistré par plantes et le rendement en graines sèches, les RILs
colorées à nodulation importante présentent un poids supérieur à la récolte (Tableau 32).
Tableau 32 : Poids enregistrés à la récolte dans les sites Oran, Mostaganem et Ain
Témouchent
Nbre de Longueur
Nbre de Nbre de
Sol Variété graines de gousse Poids en gr
plants gousses
semées (cm)
104 12 10 20 10 130,123
115 12 11 25 12 88,056
Oran 124 12 12 20 11 48,416
147 12 12 40 11 91,736
HVL 12 02 16 12 21,636
104 12 08 12 9 41,021
115 12 07 13 9 39,123
Mostaganem 124 12 07 13 10 42,216
147 12 08 14 10 38,954
HVL 12 07 12 9 36,425
104 12 09 16 10 39,876
115 12 08 16 11 40,033
Ain
124 12 09 12 10 34,819
Témouchent
147 12 10 20 10 44,159
HVL 12 05 13 10 33,250
150
Les variétés 104 (130,123 g) et 147 (91,736 g) se distinguent par rapport aux autres variétés en
général sur le site HB en particulier. La salinité du sol affecte différemment les génotypes de
Phaseolus vulgaris où l’on remarque des lignés sensibles et d’autre tolérantes au sel (Saadellah et
al., 2001), donc la variété locale est considérée comme sensible au stresse salin, en la comparant
aux autres variétés colorées testées sur le même sol de la station HB Oran (Figure 53, 54).
Sur le sol de Mostaganem, les 05 variétés ont le même comportement en développement végétatif
et en poids, de plus, l’absence du stress salin améliore la croissance de la variété locale HVL. Les
légumineuses à graines sont reconnues depuis longtemps comme non ou seulement modérément
tolérantes à la salinité. Phaseolus vulgaris est connu être sensibles au stresse salin par opposition à
Vicia faba qui est particulièrement considérée comme tolérante à la salinité (Ouslim et al., 2014)
ce qui poussent les agriculteurs à s’orienter vers la culture de la fève dans les sols salés ou les sols
irrigués en eau salée et négliger celle du haricot.
Chez le haricot, les essais pour augmenter le rendement ont débuté depuis longtemps mais les
résultats obtenus n’étaient pas toujours positifs. Il est probable que la sélection variétale et le choix
des souches rhizobiennes efficientes natives et adaptées aux conditions de l’agroécosystème reste
la meilleure stratégie à suivre pour augmenter la production en graines du haricot (Benadis, 2015).
Les génotypes (graines de grand et petit calibre) influent également sur les rendements. Les
graines de petite taille, par exemple, présentent dans les sols argileux, une bonne nodulation
souvent accompagnée d’une amélioration de la biomasse aérienne comme a rapporté Faghire
(2012). L’application de 45 à 90 unités de phosphore par hectare permet l’augmentation en grain
de 72 et 63 % respectivement et une réponse meilleure pour la première dose (45 unités). Les
différences génétiques de P. vulgaris pour la fixation d’azote, sous basses concentrations en P,
dépendent de l’efficacité d’utilisation du P (EUP), qui est liée à sa répartition entre les organes
(Vincent et Drevon, 2001).
Au champ, la fixation de l'azote potentielle est limitée par des contraintes environnementales
biotiques ou abiotiques limitant l’établissement de la symbiose (Bilalis et al., 2010), cette dernière
peut se faire seulement si la légumineuse rencontre, dans le sol, la souche de rhizobia compatible
et qui en même temps présente un pouvoir d'infectivité (Graham, 2008).
La plante joue un rôle dominant par rapport à la bactérie et que tout facteur affectant l'état
physiologique de la plante (maladie, déficience nutritionnelle, toxicité, salinité, contraintes
hydrique,…) retentit directement sur l'activité fixatrice de l'azote de la bactérie symbiotique
151
(Ambachew et al., 2015). En effet, l’acidification de la rhizosphère durant la fixation du N2 par les
légumineuses est l’un des principaux mécanismes qui contrôlent la biodisponibilité du P dans le
sol (Devau et al., 2010).
Par ailleurs, le sol est le lieu de développement des plantes et donc le déterminant des rendements
des cultures ce qui explique les différences enregistrées des poids sur les sites expérimentaux.
Aussi, la faible productivité agricole dans beaucoup de pays africains est liée à la pauvreté des sols
en éléments minéraux indispensables aux cultures (Guene et al, 2004).
L’utilisation de variétés cultivées à haut rendement est freinée par deux difficultés: l’épuisement
des sols, encore accéléré par les aléas climatiques, et la déficience des sols en phosphore (Dawson
et Hilton, 2011). Les solutions envisagées et développées par les agronomes pour répondre à ces
deux problèmes consistent à planter des légumineuses à haut potentiel fixateurs d’azote qui
peuvent pratiquement remplacer les engrais chimiques si ils sont utilisés comme “engrais verts”,
enfouis dans le sol; ce qui peut être proposé dans la station de Sidi Bel Abbès pour la
multiplication des semences du haricot vue que l’absence des nodules n’entraves pas le
développement et par conséquent le rendement en graines.
En culture en association, il est admis qu’il y a une absorption plus élevée du P qu’en
monoculture, ce dernier peut être expliqué par une augmentation de l’exsudation d’acides
organiques par les légumineuses en augmentant la disponibilité du P dans le sol, avec une
facilitation de l’acquisition de ce P par les céréales (Hinsinger et al., 2011). L’augmentation de la
concentration du P assimilable dans la rhizosphère sous l’effet de la culture en association est
rapportée par Betencourt et al. (2012) et Latati et al. (2014) dans le système d’association blé
dur-pois chiche et maïs-niébé respectivement ce ci peut être appliqué dans la région de Tissemsilt
en utilisant le couple blé- haricot.
L’utilisation des ressources est donc plus efficace en culture associée qu’en monoculture où il en
résulte une meilleure conservation de la fertilité des sols (Bilalis et al., 2010), de plus,
l’introduction du haricot peut rendre les éléments NPK plus assimilables pour les cultures
céréalières associées. Dans une expérience sur terrain, une augmentation significative par rapport à
la monoculture est observée sur le rendement du maïs associé avec le haricot et la féverole (Li et
al., 2003), grâce à l’amélioration de la biodisponibilité du P dans la rhizosphère.
152
gr 140
120
100
80
60
M Poids (gr)
40
20
0
104 115 124 147 HVL Variété
Figure 53: Moyenne des poids des graines à la récolte en fonction des variétés dans les trois
zones de culture
140
gr
120
100
80
60
M Poids (gr)
40
20
0
Oran Mostaganem Ain Temouchent Région
Figure 54: Moyenne des poids des graines à la récolte en fonction des trois zones de culture
153
3.7. Conclusion partielle :

La situation actuelle du programme de développement de légumineuses alimentaires indique que
la production locale toutes espèces confondues, couvrent 25 % des besoins de consommation de la
population algérienne en 2015 (MADRP, 2016). Le haricot peut être cultivé en grande culture,
sans limitation. Son adaptabilité en fait une culture adéquate à de nombreuses conditions
pédoclimatiques dans des systèmes agroculturaux variés. Il est souvent cultivé dans des zones
d’argiculture marginale, où plus de 50 % des sols sont carencés en phosphore il en résulte une
faible production de graines (FAO, 2013). Ceci limite le développement d’une activité
économique viable de la filière haricot. La production massive en graines du haricot à besoin
d’éléments nutritifs comme l’azote, le phosphore et le potassium, essentiels pour la croissance
végétale en quantité suffisante (ITCMI, 2010).
Les différences dans la biomasse et la nodulation existant entre les différents génotypes testés du
haricot ont montré différents niveaux de tolérance aux conditions environnementales de la région
testée en particulier la faible disponibilité de leur sol en P. Sous ces conditions, les réponses au
stade floraison des plantes ne sont pas toujours inter-corrélées et ont présenté des différences qui
pourraient aussi être dues au calibre des graines. L’importance de la teneur des génotypes à
grosses graines en P semblerait être due à l’augmentation de l’activité phytase des graines. Bien
que l’exsudation des racines nodulées en phosphatase acide contribue à la libération du P dans le
sol à partir des formes organiques pour son absorption racinaire ultérieure, elle demeure une
perspective à approfondir aussi bien dans les nodosités que dans la rhizosphère (Bargaz, 2012).
L’alternative d’utilisation des biofertilisants a pour but l’amélioration du rendement des

légumineuses à graines. Cela consiste à apporter en masse les microorganismes sélectionnés ; les
rendements des cultures sont par conséquent améliorés sur des sols pauvres limitant de ce fait les
apports d’intrants (Yameogo et al., 2013). La stabilité des cultures en association attribuée à la
restauration partielle de la diversité perdue sous la monoculture (Betencourt et al., 2012), est une
autre alternative qui fournit une assurance élevée contre l'échec des cultures du haricot,
particulièrement dans les régions sujettes aux conditions climatiques extrêmes telles que le gel, la
sécheresse et les inondations (Lithourgidis et al., 2011) le cas de la région de Tissemsilt.
La diversification des ressources en protéines végétales, ainsi que l’amélioration des sols dégradés
permettront de répondre aux impératifs socio-économiques pour assurer la sécurité alimentaire du
pays et mener une agriculture biologique d’une façon durable tout en préservant l’environnement
et la biodiversité de la flore microbienne des sols algériens.
154
Les différents sites d’essai sont de ce fait groupés en trois catégories : la région littorale qui est
composée des régions : Oran, Mostaganem et Ain Témouchent où la culture du haricot peut être
pratiquée à grande échelle en privilégiant les variétés d’hiver, Sidi Bel Abbès (station INRA) est
préconisée pour le développement des semences où la fertilisation azotée améliore le poids et la
qualité des graines et enfin la région de Tissemsilt où la culture en association céréales-haricot
s’avère être la meilleure composante agriculturale de cet agroécosystème.
Le MADRP (2016) a envisagé un programme de relance des légumineuses alimentaires dans le

Plan Felleha 2019 ; ce programme sera réalisé dans les wilayas potentielles productrices de
légumineuses alimentaires telles que Ain Témouchent, Sidi Bel Abbes, Tlemcen, Mascara,
Mostaganem, Relizane, Tiaret, Tissemssilt, Chlef, Ain Defla, Médéa, Constantine, Mila, Guelma,
Skikda, Annaba, El Tarf, Bouira, Souk Ahres et Sétif.
155
C’est dans la politique d’une agriculture durable et d’optimisation des pratiques agricoles
conservatrices de l’environnement que la relance des cultures des légumineuses alimentaires,
d’une manière durable, repose sur l’exploitation des interactions légumineuses microorganismes
rhizosphériques pour une production de graines destinées à la consommation humaine. La
stratégie menée est l’intégration d’une approche interdisciplinaire entre les chercheurs et le
secteur utilisateur. Cette approche a pour objectif, à long terme, l’amélioration du rendement du
haricot, ainsi que l’amélioration de la fertilité des sols déficitaires en P et la vulgarisation de
l’intérêt de la culture des légumineuses en rotation avec les cultures céréalières. A moyen terme
et dans les 5 ans à venir, l’Algérie espère couvrir ses besoins de consommation en légumes secs
à hauteur de «50 % par la production nationale». A l’horizon 2019, ces besoins devraient
atteindre «2,9 millions de quintaux» (Belaid, 2016).
Les études sur les symbioses, les écosystèmes et l’environnement dans le milieu méditerranéen
est de grand intérêt durable ; de plus, elles sont encore d’avantage qu’ailleurs, essentielles, pour
s’adapter aux conditions climatiques particulièrement dures dans notre pays où la pluviométrie
reste insuffisante et irrégulière. Pour répondre à une combinaison d’objectifs, comme remédier
aux différentes contraintes biotiques et abiotiques que subit la production du haricot locale dans
un agroécosystème ciblé et au sol déficitaire en P et préserver la biodiversité de l’écosystème,
des enquêtes préliminaires et des connaissances du besoin actuel étaient nécessaires à mener. Les
légumineuses alimentaires d’un intérêt agroalimentaire et agronomique, sont en régression à
cause des rendements non stables et non satisfaisants à l’Ouest Algérien où la courbe de la
production est en déclin.
Pour mieux comprendre la situation actuelle, 22 parcelles ont été ciblées dans cinq régions
différentes : Mostaganem, Oran, Ain Témouchent, Sidi Bel Abbes et Tissemsilt. Les analyses
physicochimiques des différents échantillons de sol, qui constitue l’habitat naturel pour le
système fonctionnel des interactions entre les microorganismes et les racines du haricot, ont
montré que les sols sont de textures équilibrées, à pH légèrement alcalin à alcalin, moins salés, et
faibles en matières organiques, peu calcaires et déficitaires à moyennement déficitaires en P.
cette situation de contraintes limitant la production du haricot est accentuée avec le déficit
hydrique et l’instabilité de la pluviométrie durant le cycle de croissance du haricot (Drevon,
2001).
Pour évaluer le potentiel de la fixation biologique d’azote de la variété locale blanche et les
variétés colorées introduites (RILs), des séries de piégeages ont été conduites en utilisant les
156
différents sols. Le résultat a montré que la nodulation de la variété locale est faible en prenant
compte le nombre de nodosités.
Une grande variabilité a été enregistrée entre les cinq régions. Les meilleures productions en
biomasse végétale ont été enregistrées sur les sites de Mostaganem, suivi par la région d’Oran.
La composition pédologique du sol influe directement sur le rendement en biomasse végétale.
L’utilisation des lignées recombinantes du haricot pour l’utilisation du P dans FSN, des lignées
RILs avec la variété locale, ont fait l’objet de tests multilocaux dans six parcelles. Les résultats
ont montré que la variabilité génotypique a induit un taux d’infection élevé par les rhizobia
natifs. Cette variabilité a affecté les paramètres de croissance végétale ainsi que le taux de
nodulation.
Pour écarter l’action du climat sur la symbiose haricot-rhizobia, les essais ont été conduits in
vitro et ont révélé que les propriétés des sols combinées à la variabilité génétique affectent la
nodulation et les paramètres de croissance. L’arrosage régulier a montré l’effet de l’eau sur la
croissance.
L’étude de la variabilité des isolats et la sélection de souches performantes dans des conditions
édapho-climatiques précises a été effectuée sur les nodosités récoltées in natura et après
piégeage suivi des isolements qui ont permis la constitution d’une collection de 30 isolats
répondant aux caractéristiques phénotypiques des BNL. A chaque souche correspond une fiche
technique qui permet de choisir une souche donnée pour des tests ultérieurs.
La culture des souches sur des milieux de cultures différents, a été effectuée pour l’étude de la
salinité, de la température et des pH.
Pour la sélection des isolats solubilisateurs de P inorganique, les résultats ont montré qu'aucune
souche n’est solubilisatrice de P.
Dans le but de prouver l’efficience de cette collection, un test de nodulation a été lancé en
conditions contrôlées. Les isolats de la collection ont ré-initié une nodulation avec leur plantes
hôtes. Deux isolats (IH4 et IH5) se sont montrés très efficients sous conditions de culture
contrôlées.
L’étude génotypique partielle, par PCR-RFLP, a montré une certaine diversité parmi les souches
isolées des différentes régions.
Afin de valoriser les résultats précédents, trois sites ont été choisis pour l’étude des rendements
en graines sèches : Mostaganem, Oran et Ain Témouchent . La croissance végétale des plantes
157
des variétés testées a montré que la variabilité génotypique a affecté plus la nodulation et le
rendement en graines sèches que la croissance végétale de la plante.
A travers les résultats obtenus via l’ensemble de ces approches complémentaires, nous avons pu
répondre à l’objectif principal de cette thèse qui consistait en une compréhension plus
approfondie de la physiologie et de la croissance de la symbiose haricot-rhizobia.
A la lumière des résultats obtenus sous conditions de culture contrôlées, les symbioses P.
vulgaris-rhizobia testées ont montré des variations importantes. La réponse la plus fréquente est
la réduction de la biomasse nodulaire et aérienne des plantes testées. Ces génotypes ont montré
différents niveaux de tolérance aux conditions environnementales dans certaines régions en
particulier la faible disponibilité de leur sol en P.
Sous ces conditions, les réponses au stade floraison et reproductif des plantes ne sont pas
toujours inter corrélées et ont présenté des différences qui pourrait être liées non seulement aux
conditions environnementales dont la déficience en P mais aussi aux facteurs génétiques et le
calibre des graines. L’exsudation des racines nodulées en phosphatase acide contribue à la
libération du P dans le sol, elle demeure une perspective à approfondir aussi bien dans les
nodosités que dans la rhizosphère.
Les caractères édaphiques et climatiques déterminent la répartition de la végétation et les

potentialités agricoles. Par ailleurs, l’avenir de l’agriculture et du secteur agroalimentaire
algérien dépend de la capacité de la recherche agronomique et agroalimentaire à résoudre les
problèmes fondamentaux.
Bien que le haricot soit une plante sensible au déficit en P, la sélection de symbioses haricot-
rhizobia à haute EUP pour la FSN sous déficit en P resterait une voie très prometteuse pour
améliorer la production de cette espèce sur des sols à faible disponibilité en P.
Les résultats satisfaisants sur terrain ont permis de mettre en valeur les potentialités de la région
agricole de Mostaganem et Ain Témouchent.
Cette étude doit être complétée par les perspectives suivantes :

 la caractérisation complète des souches dans le cadre du remaniement de la taxonomie
(de Lajudie, 2016).
 par des tests plus approfondis sur la relation taux du phosphore- nodulation aux champs.
 par l’étude des souches les plus performantes pour la production d’inoculum dans
l’objectif de l’amélioration des rendements du haricot dans les zones du littoral et
sublittoral.
158
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6. Annexes
Annexe 01:
- Triangle des textures
A : Argiles (clay) (0 à 2 μm).

LF : Limons (loam) Fins (2 à 20 μm).
LG : Limons Grossiers (20 à 50 μm).
SF : Sable (sand) Fin (50 à 200 μm).
SG : Sable Grossier (200 μm à 2mm).
- Dosage du calcaire total :

On dépose 1g de terre fine (séchée à l’air) dans le flacon, et on rempli l’appendice latéral du flacon avec 5ml de
HCl à 0,5N, après avoir lié le flacon au calcimètre de Bernard amener au zéro les niveaux de l’eau dans la colonne et dans
l’ampoule, répandre l’acide sur l’échantillon,en suite à l’aide de l’ampoule, on rétabli le niveau et on lis le volume de CO 2
dégagé (en cm2), Une fois le dégagement de CO2est terminé, nous baisse l’ampoule du calcimètre jusqu’à ce que le niveau
de l’eau de cette dernière soit dans un même plan horizontal que celui dans la colonne,en fin on dépose 1g du CaCO3 pur ,
pour l’étalonnage de l’appareil, tel qu’il provoque un dégagement gazeux.
.2 Dosage du calcaire actif (Méthode Drouineau-Galet, 1942):
Peser 10g de sol séché à l’air, les Introduire dans un flacon de 500ml y ajouter 250ml de la solution d’oxalate
d’ammonium à 0,2N, ensuite on agite durant 2h à l’aide d’un agitateur,puis filtrer directement la solution dans un pécher de
250ml,en rejetant les premiers ml du filtrat,avec une pipette de 10ml prélever 10ml de filtrat que l’on versera dans un
bécher de 100ml, y ajouter dans ce dernier 10ml de H2SO4 au 1/10, ensuite porter le contenu du bécher à une température
de 60°.puis placer le bécher sur un agitateur magnétique surmonté d’une burette graduée en ml et contenant du
permanganate de potassium en solution déci normale,la titration par le permanganate se fait jusqu’à l’obtention d’une
couleur rose persistante,soit n le nombre de ml de KMnO4 versé ;titrer de la même façon,10ml de la solution d’oxalate
d’ammonium utilisée. Soit N le nombre de ml de KMnO4 verser pour le témoin.
.3 Dosage du phosphore assimilable (Méthode Duchaufour-P, 1959) :
En milieux acides, les phosphates donnent de l’acide phosphorique. Ce dernier, en présence de molybdate
d’ammonium et en milieu acide, forme des complexes phosphomolybdiques. Ces complexes en la priorité d’être réduit par
une solution de chlorure stanneux, ils sont alors transformés en bleu de molybdène. En mesurant au colorimètre l’intensité
du bleu de molybdène, on détermine la concentration en acide phosphorique.
A. Extraction :
1. à l’acide :
Après avoir Peser 1g de sol broyé, homogénéisé et passé au tamis de 0.2mm, verser la prise d’essai dans un tube à
centrifuger de 100ml, y ajouter 50ml de solution acide tamponnée ; agiter durant 30mn le contenu du tube, ensuite
centrifuger durant 10mn, à 3000t/mn ; puis filtrer sur un filtre blanc n°111 à diamètre 110mm, le filtrat recueilli constituera
la solution d’extraction A, et sera récupéré dans une fiole de 100ml. ; Et on verse de nouveau 50ml de solution acide
tamponnée,qu’on agite durant 30mn,et on la centrifuge pendant 10mn à 3000t/mn ;à la fin ,on verse le surnageant sur le
filtre utilisé précédemment.
2. à la soude :
Après avoir Peser 1g de sol broyé, homogénéisé et passé au tamis de 0.2mm, verser la prise d’essai dans un tube à
centrifuger de 100ml, y ajouter 50ml de NaOH 0.1 N ; agiter durant 30mn le contenu du tube, ensuite centrifuger durant
10mn, à 3000t/mn ; puis filtrer sur un filtre bleu n°111 à diamètre 110mm, le filtrat alcalin constituera la solution
d’extraction B, et sera récupéré dans une fiole de 100ml. ; Et on verse de nouveau 50ml de NaOH 0.1N,qu’on agite durant
30mn,et on la centrifuge pendant 10mn à 3000t/mn ;à la fin ,on verse le surnageant sur le filtre utilisé précédemment,et on
complète la fiole à 100ml.
B .Dosage colorimetriques du Phosphore :
1. Dans la solution d’extraction A :
Dans un erlènmeyèr de 100ml, verser : 20ml de la solution d’extraction A, y ajouter 25ml d’eau déminéraliser, et
5ml de solution molybdique. ; laisser reposer pendant 10mn, puis ajouter 1 ou 2 gouttes de Sncl2 dans la fiole, pour réduire
le complexe phosphomolybdique, en fin colorimétrie au bout de 5 mn, a 730nm.
2 .Dans la solution d’extraction B :
Mettre dans un tube à centrifuger de 100ml : 20ml de solution d’extraction B, y ajouter 4ml de H2SO4 N (pour
précipiter les acides humiques), puis centrifuger pendant 10mn à 3000t/mn ; et recueillir le surnageant dans un erlènmeyer
de 100ml ; en suite verser dans le tube à centrifuger 10ml d’eau déminéralisée et 1 ml de H2SO4N, et disperser à l’aide d’un
agitateur ; puis centrifuger à nouveau durant 10mn à 3000t/mn,et recueillir le surnageant dans l’erlenmeyer de
100ml,ajouter dans l’erlenmeyer 13ml d’eau déminéralisée,puis 2ml de solution molybdique,laisser reposer durant 10mn,et
colorimétrie au bout de 5 mn à 730nm.sila solution d’extraction est coloré en jaune par des acides fulviques,il est préférable
de colorimétrie à 660nm,a fin de ne pas être gêné par la coloration jaune.
C. les solutions :
1. pour l’extraction acide :
Solution acide tamponnée :Dans une fiole jaugée de 1000 ml, verser : 40ml de H2SO4 0.1N, y ajouter 3g (NH4)2O4, puis
compléter avec de l’eau déminéralisée, le pH de la solution obtenu doit être compris entre 2.7 et 2.8 (vérifier au pH mètre)
Les solutions pour l’extraction acide basique: NOaH N/10 et N/5
3. Pour le dosage de la solution d’extraction A :
Solution molybdique :
Dissoudre 25g de molybdate d’ammonium dans 200ml d’eau déminéralisée chaude, puis Filtrer la solution ; d’autre
part, diluer 280ml de H2SO4 concentré, le volume obtenu doit être compris entre 660 et 800ml, Après refroidissement,
verser dans une fiole de 1 litre la solution molybdique puis l’acide sulfurique dilué, à la fin compléter à 1 litre avec de l’eau
déminéraliser.
Solution de chlorure stanneux :
Dissoudre 25g de SnCL2 2H2O.dan une fiole de 1 litre contenant de l’acide chlorhydrique dilué à 10% en
volume.,compléter à 1 litre avec de l’acide dilué,on peut filtrer si cela et nécessaire
NB : ne préparer cette solution qu’au moment de l’emploi, sinon conserver cette solution à l’abri de la lumière.
Solution étalon de P2O5 (1g/l) :
Peser exactement 1,917g de phosphate monopotassique (KH2PO4), Les introduire dans une fiole jaugée de 1000 ml,
compléter le contenu à 1 litre de l’eau déminéralisée ; À la fin, ajouter une goutte de chloroforme
Solution étalon de P2O5 (10mg/l) :
Verser10ml de la solution (1g/litre) dans une fiole de 1000ml, ensuite compléter jusqu’à 1000 ml avec de l’eau
déminéralisée.
Gamme d’étalonnage
1. pour l’extraction acide :
Préparer la gamme suivante dans des erlenmeyers de 100ml :
N° des erlenmeyers: T 1 2 3 4 5
Concentration en mg/l du P2O5 0 1 2 3 4 5
ml de solution étalon (P2O5 préparé
à 10mg/l) 0 5 10 15 20 25
ml de solution acide tamponnée 20 20 20 20 20 20
ml d'eau déminéralisée 25 20 15 10 5 0
ml de solution de molybdate 5 5 5 5 5 5
laisser reposer 10 mn
Nombre de gouttes ajoutées de
SnCl2 2 2 2 2 2 2
DO Etalon (à 730nm) 0.10 0.38
6 5 0.605 0.700 0.785 0.850
2. pour l’extraction à la soude :

Opérer comme ci-dessus, mais en remplaçant la solution acide tamponnée par de la solution de soude N/5 et de la
solution d’acide sulfurique normale.
N° des erlenmeyers: T 1 2 3 4 5
Concentration en mg/l du
P2O5 0 1 2 3 4 5
ml de solution étalon (P2O5

préparé à 10mg/l) 0 5 10 15 20 25
ml. de NaOH N/5 10 10 10 10 10 10
Ml. De SO4H2 N 5 5 5 5 5 5
ml. d’eau déminéralisée 30 25 20 15 10 5
ml.de sol.de molybdate 5 5 5 5 5 5
Laisser reposer 10mn
Nombre de gouttes ajoutées

de SnCl2 2 2 2 2 2 2
Annexe 02
Tableau : composition du milieu nutritif pour la culture et l’inoculation des plantes in vitro :
Quantité en (g)
Macro-élément KH2PO4 0.2
MgSO4 .7H2O 0.2
KCL 0.2
CaSO4.2H2O 0.2
Na2Fe EDTA 0.025
NaMoO4 0.004
Micro-élément NaMoO.2H2O 0.004
MnSO4 .2H2O 0.002
CuSO4.5H2O 0.002
ZnSO4 ; 7H2O 0.003
H3BO3 0.01
CaCL2.4H2O 0.12
Eau distillée 1l
Tableau : Composition du Milieu Yeast Extract Mannitol (Y.E.M)

Ingrédients Quantité en (g)
K2HPO4 0.5
MgSO4 0.2
NaCl 0.1
CaCO3 0.1
Mannitol 5
Glutamate de Sodium 0.5
Extrait de levure 0.5
EAU distillée 1L
Eau physiologique : 9 g NaCl dissout dans 1L distillée.
Eau gélosée: 0,7 g Agar dissout dans 1L eau distillée.
Gélose nutritive : composition en g/l : extrait de levure :2 ; extrait de viande : 1 ; peptone : 5 ; agar : 15 .
Milieu PVK (Pycovskaya, 1948) : composition en g/l : glucose :10 ;NaCl :0,2 ; MgSO47H2O : 0,41 ; NH4NO3 :
0,373 ; FeCl3 : 0,003 ; CaHPO4 : 0,7. Chaque produit est dissout dans 100ml d’eau distillée. Le milieu est complété
à 1L avec l’eau distillée, 3g d’extrait de levure, 20g d’agar et ajusté à pH 7.
Mannitol- mobilité ( en g/l) :hydrolysat trypsique de caséine:10,0 g ; mannitol:7,5 g ;rouge de phénol:0,04 g ;
nitrate de potassium:1,0 g ; agar:3,5 g ; pH = 7,6
Les solutions et les milieux sont autoclavés à 120°C-20min.
Extraction au tampon GES :
Tampon de broyage : TES / saccharose, pH 8, stérilisé
TES : Tris HCl 20mM pH 8
EDTA 2Na 1mM pH 8
NaCl 50mM
Saccharose 8% p/v
Conservé à 4°C
Lysozyme : 20mg/ml (dans le tampon TE 1X (tris- HCl 10 mM, EDTA 1 mM ; stérilisé)
Préparé d’avance et gardé à – 20°C. ne pas dépasser 2 mois de conservation.
GES (Guanidine thiocyanate, EDTA, Sarcosyl)
Guanidine thiocyanate 0,5 mM
EDTA (2Na°) 100 Mm (pH 8)
N-Lauryl sarcosine 1% p/v
Preparation de guanidine thiocyanate 5M: chauffer à 65°C jusqu’à la dissolution 30g de guanidine thiocyanate et 30 ml
d’eau distillée stérilisée ; après le refroidissement ajuster le volume (QSP) à 50 ml avec de l’eau distillée stérile.
Ethanol absolu gardé à – 20°C
NaOH 8 mM stérilisé
Une solution de NaOH concentrée est préparée d’avance et gardée à 4°C. Les dilutions sont faites au besoin. Ne pas
dépasser 6 mois de conservation.
HEPES 0,1 M
Préparer HEPES 1 M et faire une dilution au 1/10
McFarland N°5 (15x108 UFC/ml) : BaCl2 (1,175 %) :0,5ml ; H2SO4 : 9,5ml;
Analyses statistiques
PA
Duncan
souche N Sous-ensemble
1 2 3 4 5 6 7 8 9
30,000 3 ,13500
26,000 3 ,16733
28,000 3 ,20333
29,000 3 ,21367
27,000 3 ,28767
22,000 2 ,63900
21,000 2 ,69900 ,69900
1,000 3 ,91500 ,91500 ,91500
20,000 3 1,03000 1,03000 1,03000
11,000 2 1,04800 1,04800 1,04800
25,000 3 1,09100 1,09100 1,09100
24,000 3 1,10967 1,10967 1,10967
12,000 3 1,16867 1,16867 1,16867
2,000 3 1,17533 1,17533 1,17533
18,000 3 1,22100 1,22100 1,22100 1,22100
23,000 3 1,27400 1,27400 1,27400 1,27400
8,000 3 1,34333 1,34333 1,34333
13,000 3 1,35767 1,35767 1,35767
17,000 3 1,44433 1,44433
16,000 3 1,45433 1,45433
3,000 3 1,59233
6,000 3 1,59433
7,000 3 1,60000
9,000 3 1,98767
19,000 3 1,99900
10,000 3 2,03300
15,000 3 2,07033
5,000 3 2,16067
14,000 3 2,18200
4,000 3 2,77333
Sig. ,417 ,118 ,056 ,068 ,098 ,066 ,053 ,310 1,000
Les moyennes des groupes dans des sous-ensembles homogènes sont affichées.
En fonction des moyennes observées.
Le terme d'erreur est Carré moyen(Erreur) = ,039.
a. Utilise un nombre d'échantillons des moyennes harmoniques = 2,857.
b. Les tailles des groupes sont inégales. La moyenne harmonique des tailles des groupes est utilisée. Des niveaux d'erreur
de type I ne sont pas garantis.
c. Alpha = .05.
a
Tests multivariés
Effet Valeur D ddl de Erreurddl Sig.

l'hypothèse
b
Trace de Pillai 1,000 53212,848 4,000 33,000 ,000
b
Lambda de Wilks ,000 53212,848 4,000 33,000 ,000
Ordonnée à l'origine b
Trace de Hotelling 6450,042 53212,848 4,000 33,000 ,000
b
Plus grande racine de Roy 6450,042 53212,848 4,000 33,000 ,000
Trace de Pillai 1,374 18,640 8,000 68,000 ,000
b
Lambda de Wilks ,001 298,545 8,000 66,000 ,000
Sols
c
Trace de Pillai 2,979 21,016 20,000 144,000 ,000
Lambda de Wilks ,000 89,459 20,000 110,398 ,000
Var
c
Trace de Pillai 3,333 17,994 40,000 144,000 ,000
Lambda de Wilks ,000 94,146 40,000 126,988 ,000

Sols * Var
c
a. Plan : Ordonnée à l'origine + Sols + Var + Sols * Var
b. Statistiqueexacte
c. La statistique est une borne supérieure de F qui produit une borne inférieure pour le seuil de signification.
Tests des effets inter-sujets
Source Variable dépendante Somme des ddl Moyenne des D Sig.

carrés de type III carrés
a
Nnd 6920,083 17 407,064 2171,007 ,000
b
LrF 19,923 17 1,172 7,815 ,000
Modèlecorrigé c
LF 35,996 17 2,117 17,866 ,000
d
HT 422,743 17 24,867 87,367 ,000
Nnd 5311,243 1 5311,243 28326,630 ,000
LrF 2049,160 1 2049,160 13665,283 ,000
Ordonnée à l'origine
LF 3516,812 1 3516,812 29673,099 ,000
HT 14292,551 1 14292,551 50214,557 ,000
Nnd 2798,416 2 1399,208 7462,442 ,000
LrF 4,827 2 2,413 16,093 ,000
Sols
LF ,757 2 ,378 3,193 ,053
HT 90,432 2 45,216 158,860 ,000
Nnd 526,672 5 105,334 561,784 ,000
LrF 4,639 5 ,928 6,187 ,000
Var
LF 13,790 5 2,758 23,271 ,000
HT 102,481 5 20,496 72,010 ,000
Nnd 3536,727 10 353,673 1886,254 ,000
LrF 10,813 10 1,081 7,211 ,000
Sols * Var
LF 21,064 10 2,106 17,773 ,000
HT 230,900 10 23,090 81,123 ,000
Nnd 6,750 36 ,188
LrF 5,398 36 ,150
Erreur
LF 4,267 36 ,119
HT 10,247 36 ,285
Nnd 12267,000 54
LrF 2092,410 54
Total
LF 3614,050 54
HT 14960,110 54
Nnd 6926,833 53
LrF 25,321 53
Total corrigé
LF 40,263 53
HT 432,990 53
a. R deux = ,999 (R deux ajusté = ,999)

b. R deux = ,787 (R deux ajusté = ,686)
c. R deux = ,894 (R deux ajusté = ,844)
d. R deux = ,976 (R deux ajusté = ,965)
Nnd
Duncan
sols N Sous-ensemble
1 2 3
Sb 18 ,000
OL 19 12,737
Ts 17 17,353
Sig. 1,000 1,000 1,000
Les moyennes des groupes dans des sous-ensembles
homogènes sont affichées.
a. Utilise un nombre d'échantillons des moyennes
harmoniques = 17,963.
b. Alpha = .05.
LrF
Duncan
1 2 3
Sb 18 5,839
OL 19 6,179
Ts 17 6,565
Sig. 1,000 1,000 1,000

b. Alpha = .05.
LF
Duncan
1 2
Sb 18 7,972
OL 19 8,163 8,163
Ts 17 8,276
Sig. ,105 ,331
Les moyennes des groupes dans des sous-

ensembles homogènes sont affichées.
Le terme d'erreur est Carré moyen(Erreur) =
,119.
a. Utilise un nombre d'échantillons des
moyennes harmoniques = 17,963.
b. Alpha = .05.
HT
Duncan
1 2
OL 19 15,447
Ts 17 15,547
Sb 18 18,217
Sig. ,579 1,000
Les moyennes des groupes dans des sous-
ensembles homogènes sont affichées.
Le terme d'erreur est Carré moyen(Erreur) =
,285.
a. Utilise un nombre d'échantillons des
moyennes harmoniques = 17,963.
b. Alpha = .05.
Nnd
Duncan
Var N Sous-ensemble
1 2 3 4
29,00 9 4,000
115,00 9 8,333
83,00 9 10,333
147,00 9 10,667
34,00 9 13,000
104,00 9 13,333
Sig. 1,000 1,000 ,111 ,111
Les moyennes des groupes dans des sous-ensembles homogènes sont

affichées.
b. Les tailles des groupes sont inégales. La moyenne harmonique des
tailles des groupes est utilisée. Des niveaux d'erreur de type I ne sont pas
garantis.
c. Alpha = .05.
LrF
Duncan
Var N Sous-ensemble
1 2 3
34,00 9 5,889
147,00 9 5,889
104,00 9 6,100 6,100
29,00 9 6,211 6,211
115,00 9 6,311
83,00 9 6,722
Sig. ,115 ,283 1,000

b. Les tailles des groupes sont inégales. La moyenne
harmonique des tailles des groupes est utilisée. Des niveaux
d'erreur de type I ne sont pas garantis.
c. Alpha = .05.
LF
Duncan
Var N Sous-ensemble
1 2 3
147,00 9 7,033
29,00 9 8,100
104,00 9 8,367 8,367
115,00 9 8,378 8,378
83,00 9 8,389 8,389
34,00 9 8,544
Sig. 1,000 ,112 ,327

b. Les tailles des groupes sont inégales. La moyenne
harmonique des tailles des groupes est utilisée. Des niveaux
d'erreur de type I ne sont pas garantis.
c. Alpha = .05.
HT
Duncan
Var N Sous-ensemble
1 2 3 4 5
147,00 9 14,267
34,00 9 15,656
83,00 9 15,978
115,00 9 16,589
29,00 9 17,178
104,00 9 18,744
Sig. 1,000 ,208 1,000 1,000 1,000
b. Les tailles des groupes sont inégales. La moyenne harmonique des tailles des
groupes est utilisée. Des niveaux d'erreur de type I ne sont pas garantis.
c. Alpha = .05.
a
Tests multivariés
Effet Valeur D ddl de l'hypothèse Erreurddl Sig.

b
Trace de Pillai ,989 2493,167 2,000 56,000 ,000
b
Lambda de Wilks ,011 2493,167 2,000 56,000 ,000
Ordonnée à l'origine b
b
Trace de Pillai 1,885 32,329 58,000 114,000 ,000
b
Lambda de Wilks ,003 36,375 58,000 112,000 ,000
souche
c
a. Plan : Ordonnée à l'origine + souche

b. Statistiqueexacte
c. La statistique est une borne supérieure de F qui produit une borne inférieure pour le seuil de signification.
Tests des effets inter-sujets
Source Variable dépendante Somme des ddl Moyenne des D Sig.

carrés de type III carrés
a
PA 39,141 29 1,350 34,999 ,000
Modèlecorrigé b
PR 11,239 29 ,388 63,273 ,000
PA 137,307 1 137,307 3560,563 ,000
Ordonnée à l'origine
PR 25,186 1 25,186 4112,195 ,000
PA 39,141 29 1,350 34,999 ,000
souche
PR 11,239 29 ,388 63,273 ,000
PA 2,198 57 ,039
Erreur
PR ,349 57 ,006
PA 184,300 87
Total
PR 37,976 87
PA 41,339 86
Total corrigé
PR 11,588 86
a. R deux = ,947 (R deux ajusté = ,920)

b. R deux = ,970 (R deux ajusté = ,955)
PR
Duncan
souch N Sous-ensemble
e 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
30,000 3 ,06700
26,000 3 ,07267
29,000 3 ,08933 ,08933
28,000 3 ,09767 ,09767
27,000 3 ,10233 ,10233
21,000 2 ,22800 ,22800
11,000 2 ,24300 ,24300
13,000 3 ,30767 ,30767 ,30767
1,000 3 ,37000 ,37000 ,37000 ,37000
12,000 3 ,37633 ,37633 ,37633
3,000 3 ,37667 ,37667 ,37667
8,000 3 ,39667 ,39667 ,39667
22,000 2 ,40150 ,40150 ,40150
18,000 3 ,40933 ,40933 ,40933
2,000 3 ,45900 ,45900 ,45900 ,45900
19,000 3 ,47000 ,47000 ,47000
24,000 3 ,53333 ,53333
25,000 3 ,59667 ,59667
20,000 3 ,59867 ,59867
14,000 3 ,60067 ,60067
4,000 3 ,60467 ,60467
16,000 3 ,68567 ,68567
23,000 3 ,75067
6,000 3 ,78267
17,000 3 ,82700
7,000 3 ,82967
5,000 3 1,14067
10,000 3 1,14933
15,000 3 1,18467
9,000 3 1,51067
Sig. ,638 ,056 ,051 ,073 ,051 ,200 ,071 ,057 ,234 ,053 ,532 1,000
b. Les tailles des groupes sont inégales. La moyenne harmonique des tailles des groupes est utilisée. Des niveaux d'erreur de type I
ne sont pas garantis.
c. Alpha = .05.
International Journal of Agriculture and Crop Sciences.
Available online at www.ijagcs.com
IJACS/2015/8-4/631-637
ISSN 2227-670X ©2015 IJACS Journal
Study of culture of six symbiotic cultivars bean and

survey of their nodulation under field natural
conditions in West Algeria
Bouchentouf Leila 1, Laabas Saadia1, Boukhatem Zineb Faiza1, Ighil Hariz Zohra2,
Bekki Abdelkader1
1 . Laboratoire de Biotechnologie des Rhizobiums et Amélioration des Plantes, département de Biotechnologie,
faculté des sciences, Université Oran, Algérie B.P : 16 Es-senia
2 . Département de biologie, Faculté des Sciences, Oran, Algérie B.P. : 16 Es-Senia
Corresponding author email: leilabouchen@yahoo.fr
ABSTRACT: Leguminous host-plants which develop symbiotic relationships with nitrogen-fixing

bacteria are essential for reducing chemical fertilizers use. Thus, the ability of legumes including bean
to fix nitrogen from the bacteria such as rhizobia, housing within root nodules could be enhanced
because of their particular agricultural and ecological importance. Consequently, we tried in the
present work to improve the growth conditions of leguminous plants in particular, common bean in
Algeria by increasing and developing the symbiotic interaction relating to bean –rhizobia symbiosis. In
this paper results obtained from field experiments conditions have shown difference in plants growth
and nodulation.The physical and chemical analysis showed that the loam soil of Oulhaça, with an
important rate of organic matter, is the best for bean culture. pH, salt, CaCO3 and phosphorus value
were noted. Morphological and symbiotic properties, tested in three reference areas, showed diversity
in plants growth and colors in field trials conducted on six genotypes (115, 147, 104, 83, 34 and 29) of
common bean (Phaseolus vulgaris L.) contrasting in efficacy of using phosphorus in order to estimate
their nodulation and their behavior under climatic and pedologic conditions. The variety 104 presented
the best rate of nodulation and is more adapted on Oulhaça soil when in the same conditions; the
variety 83 presented the lower number of nodules.The presence of indigenous population in soil
sample and nodules in roots of Phaseolus vulgaris indicate the possibility of getting potentially
effective adaptable rhizobial strains that enhance bean productivity. Weak symbiotic properties
observed during nodulation status survey might partly be responsible for growth variation and
reduction in nodules.
Key words: Bean varieties – root nodules – nitrogen fixation –- Phaseolus vulgaris-Rhizobium
symbiosis – climatic and soil conditions- .
INTRODUCTION
Symbiotic nitrogen fixation feature is an essential component in cultural systems however, the
associated leguminous plants are characterized by low yield and this is explained by sensitivity to biotic and
abiotic factors like temperature, drought and soil paucity (Baudoin, 2001) as constraints limiting production. Soil
nitrogen is one of the most important regulatory players in the symbiotic interaction between leguminous host-
plants and Bacteria Nodulating Legume (BNL) (Griffon, 2006). A better understanding and developing new
technologies of this symbiosis would contribute to obtain a healthy environment (Bohlool et al., 1992).
Legume plants, such as Phaseolus vulgaris L. known as common bean are well characterized for its
symbiotic association with BNL, it fixes considerable amounts of atmospheric nitrogen which is incorporated to
soil (Tamimi, 2002). Bean is the one of the major leguminous crops grown in the world and its seeds are widely
consumed. It is an important legume for human nutrition and a major protein (25%) and calorie source
(Anderson, 2003), but its yield remain low to moderate due to its scarce nodulation, chemical fertilizers high
inputs (Garcia et al., 2004). Yields often too low can be improved by a higher N supply through symbiosis with
efficient rhizobial strains (Kaschuk et al., 2005; Hungria et al., 2000).
Algerian agronomists think that production may increase because climatic and pedologic conditions are
highly suitable in littoral areas (Abdelguerfi, 2003); improvement of culture conditions and introduction of new
productive varieties may contribute to increase yields. Bean variety diversity was not too important in Algeria,
but during the last years, its number is increasing by introduction of new cultivars such as Michelet and
Intl J Agri Crop Sci. Vol., 8 (4), 631-637, 2015
Contender, their adaptability depends on the climatic conditions predominating in cultivated area.
Biogeographical position of Algeria and its bioclimatic stage structures including moisture, arid and semi-arid
areas, make it very interesting for biological resources (Abdelgherfi, 2003). These areas are characterized by
fluctuation in precipitations (Boulbaba et al., 2009). For leguminous plants, climatic changes and drought affect
not only host plants but also growth and presence of rhizobial population in soil, development and nodules
functions and so nitrogen fixation capacity.
Most published works on the ecology of BNL show that microorganisms are affected by changes in soil
factors such as moisture, temperature, pH, soil toxicity, nutrient deficiencies and organic matter. The variation
in nodule number and color induce variation in growth and yield of the host due to variation in fixed nitrogen
(Lupwayi and Mkandawire, 1996; Amijee and Giller, 1998).
In Mediterranean regions, bean production is limited by soil phosphorus deficiency (Shen et al., 2001). The total
percentage of phosphorus (P) in soil is approximately around 0.04 to 0.10%, but only 1.00 to 2.50% can be
absorbed by plants. The low availability of phosphorus nutrition in soils has became the ‘‘limiting factor’’ for root
growth (Kanako et al., 2004).
In this context, we aimed in this work to compare between three reference areas showing differences in
bean plants development and nodulation. It seems that nitrogen fixation is the major factor limiting vegetal
growth with possible implication of phosphorus biodisponibility. Furthermore, we tried in the present study to
evaluate the ability of this legume crop to induce the endosymbiotic association with root nodulating bacteria
(Rhizobia) group and to estimate the symbiotic effectiveness of native Rhizobium strains on number of nodule
and morphological properties of dry bean under field conditions. We compare between six varieties of common
bean, tolerant and sensitive to phosphorus deficiency (variety 115, 147, 104, 83, 34 and 29), observe and
evaluate their nodulation potential.
MATERIALS AND METHODS
Description of experimental zones

The experimental sites location are indicated in table1.Oulahaça (Beni-Saf in Ain Temouchent), is an
area of 10 Hektars and belong to a private farmer. The soil is dark and the ancient culture was carotts. The
climate is semiarid with cold moist winters and hot dry summers.
The second zone is situated in Tissemsilt. The soil is light brown rich in fine elements and covered with grass.
The third one is situated in Sidi Bel Abbes in the experimental station INRAA (Institut National de Recherche
Agronomique). The soil is use for legumes culture; it is light brown and left fallow.
Table 1. GPS data experimental sites
Latitude 35° 14’ 35’’ N

Oulhaça
Longitude 01° 26’ 83’’ E
(Beni-Saf Ain Témouchent
Altitude 150 m
Latitude 50°35’48’’ N
Tissemsilt Longitude 01°49’28’’ E
Altitude 840 m
Latitude 35° 10’ 35’’ N
Sidi Bel Abbes Longitude 00° 38’ 52’’ W
Altitude 490 m
3
Figyre 1. Geographic localization of culture zones
Oulhaça (Beni-Saf Ain Témouchent) 1 ; Tissemsilt 2 ; Sidi Bel Abbes 3.
632
Soil sampling
The soil samples were collected from the field at 20 cm of depth.
Physicochemical analyses
Soil particle size analysis was obtained using Robinson pipette.The pH and electrical conductivity (EC)
were estimated in soil water extract using a glass electrode pH meter and an EC meter in 1:5 soil water
suspension. The available P was measured using acid extraction method (Duchaufour, 1959). Thus the organic
matter of the soil, carbon and CaCO3 were also determined.
Quantification of the number of total indigenous microbial flora

The number of total indigenous microbial flora in the experimental soil samples was determined by
serial dilution. 0,1 ml aliquot of each dilution was spreading on solid nutritive medium then incubated at 28°C
during 24 h. The results were expressed as CFU number after counting the colonies number (30 and 300).
Climate data
The climate data could give lot of information about relation between climatic conditions and cultures
development. Oulhaça area is situated in moist bioclimatic stage referring to Emberger climagram based on the
five last years. This region show a dry period from April to October with annual minimal precipitation of 1,78mm,
annual maximal temperature of 26,93°C, a moist period from October to April with maximal annual precipitation
55,50mm and minimal annual temperature 13,03°C.
Tissemsilt area show a moist period from October to May with annuel maximal average precipitation of
47 mm and annual minimal temperature of 5.92 C°. The dry period is from May to October with annual minimal
precipitation of 4.8 mm and annual maximal temperature of 26.35 C°.
The dry period in Sidi Bel Abbes is from March to half November and the moist period is from half
November to the end of February. This area is characterized by maximal precipitation of 58.5 mm in November
and minimal of 2.8 mm in July. The dry period seems took 8 months. The annual average temperature is 26.72
C° in July and 9.21C° in January.
Field experimentation
Tested cultivars
Comparatives test were made on six varieties of bean Phaseolus vulgaris contrasting in efficacity of the
use of phosphorus (EUP) for their nitrogen symbiotic fixation (FSN): 115, 147, 104, 83, 34 and 29, these
cultivars were identified from a hybrid of BAT 477 and DOR 304 cultivars. The molecular and physiological
characterization of these genotypes and their ecological interest are studied by the CIAT program (International
Center of Tropical Agricultures, Colombia). The varieties are black, tolerant 115; beige, sensitive 147; brown,
tolerant 104; beige, sensitive 83; black, tolerant 34; beige, sensitive 29. All seeds were gracefully furnished by
the INRA laboratory SupAgro UMR 1222 Eco and Soils.
Test Protocol
As defined by the Groupe Coopératif de Recherche sur les Légumineuses dans le Bassin
Méditerranéen FABAMED, seedling was done by putting 12 seeds per line. The distance between two seeds
was about 10 cm when the depth seedling was 3 cm. Plants were usually irrigated and trials were conducted in
natural conditions. The plot was prepared for seedling and weeding was hand operated.
Observation and notation

During the vegetative plant cycle, main stages developments were noted and agrochemical state was
periodically following. All plants were carefully unearthed at flowering stage to look for nodules on roots. Shoots
height and leaf colors were noted. The number and size of nodules were determined after a gently wash of
roots with water.
RESULTS AND DISCUSSION
Soil physical and chemical analyses

The physical analyses of the experimental soils showed differences in texture (table 2). The soil 1 is
moderately alkali and non saline. This soil showed an important quantity of organic matter (Org. Mat) and
5,23% of organic carbon content. Total CaCO3 was 0,8 % and phosphorus was 0,100 mg/l ( counted in P2O5).
633
Table 2. Physical and chemical soils result analyses

Soils pH CE m/S total CaCO3 actif CaCO3 Carbon Org. Mat Texture
Sand 40 %
Soil 01 8.22 0.05 0.8 % - 5.23% 10 % Loam 40 %
Clay 20 %
Sand 50 %
Soil 02 7.31 0.15 21% 3.37% 1.23% 2.46 % Loam 38%
Clay 12 %
Sand 28 %
Soil 03 8.85 0.2 13.2 % 6% 1.05 % 2.1 % Loam 45 %
Clay 27 %
Soil 01: Oulhaça, Soil 02: Tissemsilt , Soil 03: Sidi Bel Abbes
The physicochemical parameters allow appreciation of soil natural fertility, to explain the yield
deficiency and to orient choice of cultures (Soltner, 2005). The results show that the soil 1 is loam in texture
and in general, the root system of leguminous like common bean is weak and situated not very deep in soil.
Roots development depends also of some conditions like pH (Baize, 1988; Soltner, 1992). Common
bean growth optimally until pH 8 (Hansen, 1994). Salt stress is one of the most important factors limiting
production of leguminous particularly when nitrogen nutrition depends on symbiotic fixation. Based on the
physical results, the Oulhaça study area seems to be a good site for leguminous culture.
Soil 2 is sandy-loam and soil 3 is silty clay. Both soils are poor in carbon content and organic matter
which indicate low microbial activities (Robert, 1996) in comparison with Oulhaça soil. Organic matter recorded
there, showed that the soil is of good quality. Structurally, when carbon is present, soil is more stable (Robert,
1996) for agricultural and environmental functions.
According to Baize standards (1988), the presence of CaCO3 limited the number of nodules. In the
temperate zones of West Algeria, cations are not uptake under hard evaporation compound to less
precipitation.
Phosphorus is very important to plants at young stages and it resulted in significant difference for all
morphological parameters. Its quantity may be not sufficient because Oulhaça soil is naturally devoid, or its
reserves were gradually exhausted by successive cultures. Phosphorus deficiency affect the growth of bean
plants, it reduces shoot growth to the detriment of root growth giving less and little nodules (Ribet and Drevon
1996). Limiting nodulation recorded in this study can be attributed to phosphorus deficiency wich increase
nitrogen content in soil as reported by Jebara et al. (2005). This result underlines the essential role of
phosphorus to Phaseolus vulgaris –Rhizobium symbiosis, an interesting way to produce common bean in poor
lands (Zaman et al., 2004).
Olivera et al. (2004) showed the impact of phosphorus nutrition on plant growth, symbiotic nitrogen
fixation, ammonium assimilation carbohydrate and amino-acid accumulation as well as nitrogen, phosphorus
and ATP content in tissues in common bean (Phaseolus vulgaris) plants. Braschi et al. (2003) reported that
different rates of organic matter addition increased extractable phosphorus at different soil-moisture regimes by
inhibiting phosphorus insolubilization,
Total bacterial flora

The count of total flora in the experimental soils indicated that the population of native microorganisms
3 3 3
is more important in Oulhaça (162x 10 CFU/g) than Tissemsilt (116x 10 CFU/g) and Sidi Bel Abbes (50x 10
CFU/g). Soil fertility favors all microbial activities where BNL strains must be able to compete efficiently with the
other microorganisms and resist to antagonists (Hoang and Diem, 1993). The abundance of microorganisms
can be in relation with organic matter and in accordance to Thomas and Mbina (2007), principal conditional
factors of microbial number and diversity include soil composition, pH, moist and depth which allow also finding
correlation between the presences or not of BNL. In another way, this is due largely to the non-culturability of
most microbial cells and also to problems of extracting microorganisms from soil. The effects of climate on soil
development are largely due to temperature and precipitation which vary considerably across climatic zones.
The climate changes in Oulhaça, both temperature and precipitation, may influence the abundance of some
microbial groups and potential increase in microbial biomass resulting on change of vegetation and
consequently on soil biological properties.
Field observation
The vegetative cycle showed sprouting after more than a week. Flowering was recorded one month
later. Our field observation showed that the varieties grow very well in Oulhaça soil after 7 to 10 days of
germination of seeds. Measured parameters are given in table. 3.
634
Table 3. Plant growth characteristics of varieties in field (Oulhaça)

Num. of
Bean Emergence Shoot length Leaves Leaves Nodules
germinated Leaves color Nodules size (mm)
variety (days) (cm) lengh (cm) width (cm) number
seeds
147 7 10 14.5 6.8 5.6 Green 11 1-4
115 8 9 16.2 8.7 6.2 Green 11 2–3
104 8 9 14.5 8.8 6.8 Green 35 1- 2
83 8 11 14.6 8.5 6.6 Green 2 1
34 10 9 18 8.9 6.2 Green 8 1–3
29 8 10 17 8.2 6.3 Green 9 1–3
Table 3 . Plant growth characteristics of varieties in field (Tissemsilt)

Num. of
Bean Emergence Shoot length Leaves Leaves Nodules Nodules size
germinated Leaves color
variety (days) (cm) lengh (cm) width (cm) number (mm)
seeds
147 9 10 15.5 7.7 6.3 Light green 21 1
115 10 9 14.2 8.2 7 Light green 14 1 – 1.5
104 7 109 16.2 9 7.2 Light green 5 1
83 11 11 16.7 8.5 7.6 Light green 2 1.5
34 8 11 15 9.8 6 Light green 31 1
29 11 10 16.3 7.3 6.2 Light green 3 1
Table 4. Plant growth characteristics of varieties in field (Sidi Bel Abbes)

Num. of
Bean Emergence Shoot length Leaves Leaves Nodules Nodules size
germinated Leaves color
variety (days) (cm) lengh (cm) width (cm) number (mm)
seeds
147 12 9 13.4 7.5 6.5 Green 00 -
115 8 9 20.2 8.3 6.3 Green 00 -
104 8 9 26 7.6 4.7 Green 00 -
83 12 10 17.4 8.5 6.6 Light green 00 -
34 10 9 14.5 7.5 5 Green 00 -
29 11 10 19 9.2 6.5 Light green 00 -
Because of climatic changes these last years, the temperature influence highly the vegetative plant
stages and as cited by Kolef (1974), common bean seeds do not germinate under to +10°C and the best
germination is observed between 31,8° C and 33°C ; the limited temperature of germination is 48°C witch
situate Oulhaça in a good position for culture of bean. Bean flowering begins 30 to 60 days after seedling
according to varieties, soil and climatic conditions (Kolef, 1974), the variety 104 is most adapted on this type of
soil under dry period and little water. Similar result was given by Boulbaba et al. (2009) and by Purcell et al.
(1997) on two cultivars of soy bean.
Nodulation survey
In the three experimental stations, nodules survey shows significant variations at each site and for each
variety. Nodules showed significant difference between bean varieties in Ohlhaça. The highest average nodule
number was recorded by the variety 104 of common bean plants (fig.2) which developed 35 nodules following
by variety 115 and 147 respectively, while in the same soil and under the same conditions, variety 83 recorded
the lower number of nodules with 02 nodules.
A B C
Figure 2 .Nodule aspect of bean variety 104 cultivated in Oulhaça soil
A: Growth of plant B: Root system C: Nodules
635
Our results suggest the presence of an indigenous rhizobial population because of their capacity to
infect and nodulate roots bean of all colored varieties cultivated in this soil which seems very interesting. The
difference in nodules number can be explained by different environmental factors (Boulbaba et al., 2009) or by
difference of potential in nitrogen symbiotic fixation of native partners BNL.
Poor nodulation in our study might indicate the poor plant growth in field. Generally, less nodules
produced low grain yields while good nodulation increases N-fixation, growth and yield (Fomeg-As, 2004). It
depends in crop rotation system used by the farmers to enhance soil fertility.
Nodulation is totally absent in varieties grown in the resort of Sidi Bel Abbes, the plants are treated with
nitrogen fertilizers, they have resulted in an increase in aboveground biomass and decreased nodulation
(Boulbaba et al . 2009), which explains the total lack of symbiosis Rhizobium-Phaseolus vulgaris. The type of
soil can also cause such results, as has been suggested by Jebara et al. (2005) who found that edaphic factors
significantly affect the number, nodule biomass and absorption of nitrogen. As cited before, the region of Sidi
Bel Abbes receive very little rainfall and the soil is poor in nutrients. These unfavorable conditions prevent the
development of microbial flora in the soil essential for growth and plant nutrition (Hatimi, 2001).
Yield reduction can be improved through inoculation of adaptable effective rhizobia which improve
nodulation and yield referring to Lupwayi and Mkandawire (1996) and Aynababa et al. (2001). Therefore, field
inoculation trail, survey on environmental factors responsible for poor nodulation and count on number of
indigenous rhizobial populations are recommended for further exploitation of BNF. Yield instability in culture of
leguminous in Algeria in general and in Ain Temouchent in particular is due in part to biotic and abiotic
constraints such as moisture, variation of temperature and soil deficiency especially in phosphorus. Our
experiences showed nodular variability between bean genotypes tested and in order to select Phaseolus
vulgaris-Rhizobium-soil-climate association, variety 104 present the best growth and nodulation that why
tolerance of variety 104 to phosphorus deficiency makes it a tool to detect area for bean culture in reference
land like Ain Temouchent.
Future works should focus on native population, effect of climatic changes on symbiosis and nodulation
and finally selection of more bean cultivars for the use of available P and N supply to identify rhizobial strains
that are capable of establishing symbioses with different grain legumes, examine their contribution to dry matter
yield, biological nitrogen fixation and compare the effect of soil type on the grain legumes response to
inoculation.
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637
Valorisation de la thèse
Cette étude a fait l’objet de plusieurs participations scientifiques:
Dakar 2004: AABNF Congrès International
Anaba 2005: Colloque Euro-Mediterraneen
Tiaret 2005: Forum National
Oran 2007: Bio Tec World
Oran 2018: AABNF Congrès International
Article 2015: Ijacs

Résumé:
Le haricot est une légumineuse cultivée avec de l'engrais azoté apporté en très grande quantité. Ceci constitue
une source de pollution en nitrate de la nappe phréatique, par suite du lessivage des sols dans la zone de culture.
Une des alternatives à l'utilisation de ces engrais azotés serait l’exploitation de la symbiose Phaseolus vulgaris
–Rhizobium.
Les prospections effectuées sur le terrain ont révélé que les rendements à la récolte restent insuffisants dans la
plupart des zones étudiées principalement à vocation agricole (Mostaganem, Ain Temouchent) ce qui poussent
les agriculteurs à délaisser peu à peu cette culture nécessaire à la fixation biologique de l’azote, alors qu’elle
était utilisée en rotation dans les systèmes céréaliers depuis très longtemps dans l’Ouest Algérien.
L’analyse physicochimique des sols prélevés a montré qu’ils sont légèrement alcalins à alcalins, le CaCO3
limite le nombre de nodules sur les sols ainsi que la salinité qui s’oppose à l’installation d’une symbiose
racinaire. Les sols montrent une carence importante en P, facteur limitant de l’établissement de la symbiose.
Le travail a débuté par une série de piégeages au laboratoire, sur les échantillons de sols récupérés des zones
prospectées dans les wilayas : Mostaganem, Oran, Ain Temouchent, Sidi Bel Abbes et Tissemsilt. Les plantes
du haricot cultivées sur le sol T4 présente le meilleur taux de nodulation (moyenne de 27 nodule/plante). Le sol
est pauvre en calcaire est adéquat en phosphore (2,275 mg/l) pour l’installation de la symbiose. L’absence totale
des nodules dans les sols (M1, T1, T2, OR1, OS2) est due essentiellement aux concentrations basses en
phosphore conjugué à la salinité pour le sol OS2 ce qui constitue une contrainte majeur pour la nodulation.
Dans une seconde étape, est effectuée une caractérisation phénotypique partielle des souches isolées à partir des
nodules collectés in natura et après piégeage. 30 isolats ont été purifiés, cryoconservés et analysés
phénotypiquement. L’analyse phénotypique a montré qu’il s’agit de bactéries cocobacilles Gram négatif, qui
n’absorbent pas le rouge Congo et leur croissance est rapide (après 72h d’incubation sur YEM au BBT). Le test
de nodulation a montré que dans 66% des cas, les souches renodulent la plante hôte P. vulgaris (variétés locale
blanche et variétés colorées) ce qui confirme leur appartenance aux BNL.
Toutes les souches présentent une bonne croissance à pH allant de 6 à 9. Les souches sont mésophiles et
présentent une bonne croissance en absence de NaCl. 5% de la totalité des souches tolèrent jusqu’à 3% de NaCl.
Le métabolisme des sucres a révélé la présence de groupes distincts de l’ensemble des souches testées sur neuf
sucres. L’étude est complétée par la recherche de l’antibiorésistance des souches envers les antibiotiques.
Aucune souche ne solubilise le phosphore sur milieu PVK.
La diversité des souches est mise en évidence par la technique RFLP après amplification par PCR. Le
dendrogramme obtenu montre qu’il y bien une différence intrinsèque au niveau souches.
Afin de sélectionner une combinaison Phaseolus vulgaris- Rhizobium la plus performante pour la FSN (pouvoir
d’infectivité et efficience important), les cultivars (la variété locale blanche et les variétés introduites colorées
RILs) sont testés aux champs, sur des sols agricoles à Mostaganem, Ain Témouchent, Oran, Sidi Bel Abbes et
Tissemsilt avec l’aide des agriculteurs (cas des exploitants privés) et de personnels qualifiés (cas des stations
d’essais : ITCMI, INRA, CFPA). Les essais ont été conduits sur RILs contrastantes par rapport à UEP (115,
147, 124, 104, 83, 34, 29) grâce au dispositif expérimental élaboré par FABAMED (INRA, Montpellier).
Les différents types de sols, montrent que la taille des populations natives est variable. Des différences
significatives sont observées entre le sol de Mostaganem et celui d’El Malah suivient des autres sols.
Une germination totale est enregistrée chez les deux variétés 83 et 147 cultivées sur le sol de Sidi Bel Abbes par
contre l’absence de nodulation est totale sur ce sol (SB). Une bonne production nodulaire est enregistrée sur les
sols de Mostaganem et Ain Témouchent.
Les 05 variétés ont le même comportement en développement végétatif et rendement, l’absence du stress salin
améliore la croissance de la variété locale blanche. Dans la station HB, la variété locale est la plus sensible au
stress salin contrairement aux variétés colorées. Dans le sol de Mostaganem, les 05 variétés cultivées présentent
les mêmes rendements à la récolte.
Mots clés: légumineuses alimentaires – nodules racinaires – fixation biologique d’azote – diversité- symbiose
Phaseolus vulgaris-Rhizobium.
Abstarct :
The common bean is a legume cultivated in addition with high input chemical fertilizers witch pollutes water
with nitrate in agricultural areas. One of the most important alternatives is the exploitation of P. vulgaris-
Rhizobium symbiosis.
The surveys carried out in the field have revealed that the yields at harvest remain insufficient in most areas
studied mainly to agriculture (Mostaganem, Ain Témouchent) which push farmers to abandon gradually this
culture with biological fixation nitrogen, while it was used in cereal rotation system for a long time in Western
Algeria.
The physicochemical analysis of the sols sampled, showed that they are slightly alkaline to alkaline; CaCO3
limits nodules number as well as the salinity that opposes installing root symbiosis in HB soil. Soils show a
significant deficiency in phosphorus as limiting factor for the symbiosis establishment.
The work began with a series of entrapment in the laboratory on soil sampled collected from areas surveyed in
the provinces: Mostaganem, Oran, Ain Témouchent, Sidi Bel Abbès and Tissemsilt. Plant bean grown on soil
T4, has the best rate of nodulation
The soil is poor in calcite and adequate in phosphorus for installation of symbiosis. The total absence of nodules
in the soil (M1, T1, T2, OR1, OS2) is mainly due to low concentration of P combining salinity for soil OS2
which constitutes a major constraint for nodulation .
In a second time, is performed a partial phenotypic characterization of strains isolated from nodules collected in
natura and after trapping. 30 isolates were purified, cryo-preserved and phenotipically analyzed. Phenotypic
analysis showed that these are Gram negative bacteria cocobacilles which do not absorbed Congo red and
growth is fast (after 72h of incubation on the YEM BBT). The nodulation test showed that in 66% of cases,
strains renodulate the plant host P. vulgaris (local white and colored varieties) which confirm their belonging to
the BNL.
All strains showed good growth within a pH range of from 6 to 9. The growth of the strains at different
temperatures showed that the majority grows at mesophilic temperature between 25°C and 35°C.
All strains showed good growth in the absence of NaCl. 5% of all strains tolerate up to 3% NaCl. Sugar
metabolism revealed the presence of distinctive group of all strains tested on nine sugars. The study is
complemented by the research of antimicrobial resistance strains by exposing them to different antibiotics. No
strain solubilized phosphorus.
Strain diversity is demonstrated by the RFLP after PCR amplification. The dendrogram obtained shows that
although an intrinsic difference at strain level.
To select a combination P. vulgaris –R. highest performance for NSF (infectivity and higher efficiency),
cultivars (local white and colored introduced varieties RILs) are tested in the field, to agricultural soils in
Mostaganem, Ain Témouchent, Oran, Sidi Bel Abbès and Tissemsilt, with the farmers help (case of private
operators) and qualified staff (case of testing stations: ITCMI, INRA, CFPA). The tests were conducted on RILs
contrasting in EUP (115, 147, 124, 104, 83, 34, 29) with the experimental protocol of FABAMED, INRA
Montpellier
Different types of soils showed that the size of native populations varies. Significant differences were observed
between the soil of Mostaganem and El Malah followed by the other soils.
A total germination is recorded in both 83 and 147 varieties grown on the soil of SB against the absence of
nodulation total on this soil. Good production nodular recorded on the M4 and T8 soils.
On the M4 soil, the 5 varieties have the same behavior in crop development and yield, lack of salt stress
improves the growth of the local white variety. HB1 in the station, the local variety is most sensitive to salt
stress unlike the colored varieties. In the soil M4 in Mostaganem the 5 cultivated varieties have the same yield
at harvest.
Keys words: grain legumes- root nodulation- biological nitrogen fixation- diversity- P. vulgaris- Rhizobium
symbiosis.
‫ﻣﻠﺧص‪:‬‬
‫ﺗﻌﺗﺑر اﻟﻔﺎﺻوﻟﯾﺎء ﻣن اﻟﺑﻘوﻟﯾﺎت اﻟﺗﻲ ﺗزرع ﺑﺈﺿﺎﻓﺔ اﻷﺳﻣدة اﻟﻛﯾﻣﺎوﯾﺔ ﺑﻧﺳب ﻋﺎﻟﯾﺔ ﻣﻣﺎ ﯾؤدي إﻟﻰ ﺗﻠوث اﻟﻣﯾﺎه ﻓﻲ اﻟﻣﻧﺎطق‬
‫اﻟﻣﺟﺎورة‪ ،‬ﻟذﻟك ﻓﺈن ﻣن ﺑﯾن اﻟﺣﻠول اﻟﻣﻘﺗرﺣﺔ ﻟﻠﺗﺧﻔﯾف ﻣن اﺳﺗﻌﻣﺎل اﻷﺳﻣدة ھﻲ ﺗوظﯾف اﻟﺗﻌﺎﯾش ﺑﯾن ‪Phaseolus vulgaris-‬‬
‫‪rhizobia‬‬
‫ﺑﯾّﻧت اﻻﺳﺗطﻼﻋﺎت ﻋﺑر اﻟﺣﻘول أن اﻟﻣردود ﻻ ﯾزال ﻣﻧﺧﻔﺿﺎ ﻓﻲ اﻟﻌدﯾد ﻣن اﻟﻣﻧﺎطق اﻟزراﻋﯾﺔ )ﻣﺳﺗﻐﺎﻧم ـ ﻋﯾن ﺗﻣوﺷﻧت(ﻣﺎ ﯾدﻓﻊ‬
‫اﻟﻣزارﻋﯾن إﻟﻰ ﺗرك ھذه اﻟزراﻋﺔ ﺷﯾﺋﺎ ﻓﺷﯾﺋﺎ ﻣﻊ أﻧﮭﺎ ﻋﺎﻟﯾﺔ اﻟﺗﺛﺑﯾت اﻟﺑﯾوﻟوﺟﻲ ﻟﻶزوت‪ ،‬وﻣﻊ أﻧﮭﺎ ﺗﺳﺗﺧدم ﻣﻧذ اﻟﻘدم ﻣﻊ زراﻋﺔ‬
‫اﻟﺣﺑوب ﺑطرﯾﻘﺔ اﻟدوران‪.‬‬
‫ﺑﯾّﻧت اﻟﺗﺣﺎﻟﯾل اﻟﻔﯾزﯾﺎﺋﯾﺔ واﻟﻛﯾﻣﯾﺎﺋﯾﺔ ﻟﻸﺗرﺑﺔ اﻟﻣﻧﺗﻘﺎت ﺑﺄﻧﮭﺎ ﻗﺎﻋدﯾﺔ وأن ‪ CaCo3‬ﯾﺣ ّد ﻣن ﻋدد اﻟﻌﻘد ﻛﻣﺎ أن اﻟﻣﻠوﺣﺔ ﺗﻣﻧﻊ اﻟﺗﻌﺎﯾش‬
‫اﻟﺟذري ﻟﻧﺑﺎت اﻟﻔﺎﺻوﻟﯾﺎء وأن ھذه اﻟﺗرﺑﺔ ﻗﻠﯾﻠﺔ اﻟﻔوﺳﻔور )‪ (P‬اﻟذي ﯾﺻﺑﺢ ﻋﺎﻣل ﻣﺣدد ﻟﻠﺗﻌﺎﯾش‪.‬‬
‫ﺑدأت اﻟدراﺳﺔ ﻓﻲ اﻟﻣﺧﺑر ﺑﺣﺻر اﻟزﯾروﺑﯾﺎ ﻋﻠﻰ ﻋﯾﻧ ﺎت اﻷﺗرﺑﺔ اﻟﺗﻲ أﺣﺿرت ﻣن اﻟﻣﻧﺎطق اﻟﻣﺳﺗطﻠﻌﺔ ﻓﻲ وﻻﯾﺎت ﻣﺳﺗﻐﺎﻧم‪،‬‬
‫وھران‪ ،‬ﻋﯾن ﺗﻣوﺷﻧت‪ ،‬ﺳﯾدي ﺑﻠﻌﺑﺎس وﺗﯾﺳﻣﺳﯾﻠت‪ ،‬أﯾن ﺑﯾﻧت اﻟﻧﺑﺎﺗﺎت اﻟﻣزروﻋﺔ ﻋﻠﻰ ﺗرﺑﺔ ‪ T4‬أﻋﻠﻰ ﻧﺳﺑﺔ ﻟﻠﻌﻘد )ﺑﻣﻌدل ‪27‬‬
‫ﻋﻘدة‪/‬ﻧﺑﺗﺔ(‪ ،‬ھذا اﻟﺗراب ﻓﻘﯾر ﻓﻲ اﻟﻛﻠس وﻣﻘﺑول ﻓﻲ اﻟﻔوﺳﻔور )‪ 2,275‬ﻣﻠﻎ‪/‬ل( ﻣن أﺟل ﺣدوث اﻟﺗﻌﺎﯾش‪ ،‬ﯾﻌود اﻟﻐﯾﺎب اﻟﺗﺎم ﻟﻠﻌﻘد‬
‫ﻋﻠﻰ أﺗرﺑﺔ )‪ ((OS2, OR1, T2, T1, M1‬إﻟﻰ اﻟﻧﺳب اﻟﻣﻧﺧﻔﺿﺔ ﻟﻠﻔوﺳﻔور إﺿﺎﻓﺔ إﻟﻰ اﻟﻣﻠوﺣﺔ ﻟﺗراب ‪ OS2‬اﻟﺗﻲ ﺗﻣﺛل رادع‬
‫ﻟﻠﻌﻘد‪.‬‬
‫ﻣن ﺟﮭﺔ أﺧرى‪ ،‬ﺗﻣت دراﺳﺔ اﻟوﺻف اﻟﻣظﮭرى ﻟﻠﺳﻼﻻت اﻟﻣﻧزوﻋﺔ ﻣن اﻟﻌﻘد اﻟﺟذرﯾﺔ ‪ in natura‬وﺑﻌد اﻟﺣﺻر ﺗم اﻟﺣﺻول‬
‫ﻋﻠﻰ ‪ 30‬ﺳﻼﻟﺔ ﻧﻘﯾﺔ وﻣﺣﻔوظﺔ واﻟﺗﻲ أظﮭرت أﻧﮭﺎ ﻋﺻوﯾﺎت ﺻﻐﯾرة ﺳﺎﻟﺑﺔ اﻟﺟرام‪ ،‬ﻻ ﺗﻣﺗص أﺣﻣر اﻟﻛوﻧﻐو وذات ﻧﻣو ﺳرﯾﻊ‪،‬‬
‫ﻛﻣﺎ ﺑﯾّن اﻻﺧﺗﺑﺎر اﻟﻌﻘدي ﺑﺄن اﻟﺳﻼﻻت ﺗﺣدث اﻟﻌﻘد اﻟﺟذرﯾﺔ ﻓﻲ ‪ %66‬ﻣن اﻟﺣﺎﻻت )اﻟﻧوع اﻟﻣﺣﻠﻲ واﻟﻧوع اﻟﻣﻠون ﻟﻧﺑﺎت‬
‫اﻟﻔﺎﺻوﻟﯾﺎء( ﻣﻣﺎ ﯾؤﻛد اﻧﺗﻣﺎءھﺎ ﻟﺑﻛﺗﯾرﯾﺎ ‪BNL‬‬
‫أظﮭرت ﻛل اﻟﺳﻼﻻت ﻧﻣو ﺟﯾد ﻋﻧد ‪ 6 PH‬إﻟﻰ ‪ ، 9‬اﻟﺳﻼﻻت ذات ﻧﻣو ﺟﯾد ﻋﻧد درﺟﺔ ﺣرارة ﻣﻌﺗدﻟﺔ وﻓﻲ ﻏﯾﺎب اﻟﻣﻠوﺣﺔ‪%5 ،‬‬
‫ﻣن اﻟﺳﻼﻻت ﺗﺣﺗﻣل ‪ %3‬ﻣن ‪ NaCl‬أﻣﺎ اﻷﯾض اﻟﺳﻛري ﻓﻘد أظﮭر وﺟود ﻣﺟﻣوﻋﺎت ﻣﺗﻣﯾزة ﻟﻠﺳﻼﻻت ﻋﻧد ﺗﻌرﯾﺿﮭﺎ ﻟﺗﺳﻊ‬
‫ﺳﻛرﯾﺎت ﻛﻣﺎ ﺗم اﺧﺗﺑﺎر اﻟﺳﻼ ﻻت ﻓﻲ وﺟود اﻟﻣﺿﺎدات اﻟﺣﯾوﯾﺔ‪ ،‬ﻛل اﻟﺳﻼﻻت ﻟﯾﺳت ﻣﺣﻠﻠﺔ ﻟﻠﻔوﺳﻔور اﻟﻐﯾر ﻋﺿوي ﻋﻠﻰ وﺳط‬
‫‪ ،PVK‬أظﮭرت طرﯾﻘﺔ ‪ PCR-RFLP‬اﺧﺗﻼف ﺑﯾن اﻟﺳﻼﻻت اﻟﻣﻌزوﻟﺔ‪.‬‬
‫ﻣن أﺟل اﻗﺗﻧﺎء أﻓﺿل ﻗرﯾن ‪ P.vulgaris-rhizobia‬ﻣن ﻧﺎﺣﯾﺔ ﺗﺛﺑﯾت اﻵزوت‪ ،‬ﺗم اﺧﺗﺑﺎر اﻟﻔﺻﺎﺋل )اﻟﺑﯾﺿﺎء واﻟﻣﻠوﻧﺔ( ﻓﻲ ﺣﻘول‬
‫زراﻋﯾﺔ ﻓﻲ ﻣﻧطﻘﺔ ﻣﺳﺗﻐﺎﻧم‪ ،‬ﻋﯾن ﺗﻣوﺷﻧت‪ ،‬وھران‪ ،‬ﺳﯾدي ﺑﻠﻌﺑﺎس وﺗﯾﺳﻣﺳﯾﻠت‪ ،‬ﺑﺈﻋﺎﻧﺔ ﻣن ﻣزارﻋﯾن ﺧواص وإطﺎرات ﻛﻔؤ‪ ،‬ﺗم‬
‫اﺧﺗﯾﺎر اﻷﻧواع اﻟﻣﻠوﻧﺔ اﻟﺗﺎﻟﯾﺔ ‪ 34 ،83 ،104 ،124 ،147 ،115‬و ‪ 29‬وﻓﻘﺎ ﻟﻠطرﯾﻘﺔ اﻟﺗﺟرﯾﺑﯾﺔ اﻟﻣﻘﺗرﺣﺔ ﻣن ‪FABAMED‬‬
‫)‪ ،INRA‬ﻣوﻧﺗﺑوﻟﯾﯾﮫ(‪.‬‬
‫أظﮭرت ﻋﯾﻧﺎت اﻷﺗرﺑﺔ أن ﻋدد اﻷﺣﯾﺎء اﻟدﻗﯾﻘﺔ ﻣﺧﺗﻠف ﺣﺳب ﻧوﻋﯾﺔ اﻟﺗرﺑﺔ‪ ،‬ﻟوﺣظ اﺧﺗﺑﺎر ﻣﺣﺳوس ﻓﻲ ﺗرﺑﺔ ﻣﺳﺗﻐﺎﻧم واﻟﻣﺎﻟﺢ‬
‫ﻣﺗﺑوﻋﺎ ﺑﺎﻟﻌﯾﻧﺎت اﻷﺧرى‪.‬‬
‫ﻛﺎن اﻹﻧﺗﺎش ﻛﻠﯾﺎ ﻋﻧد ‪ 83‬و ‪ 147‬ﻟﻧﺑﺎت اﻟﻔﺎﺻوﻟﯾﺎء اﻟﻣﻠون ﻓﻲ ﺗرﺑﺔ ﺳﯾدي ﺑﻠﻌﺑﺎس ﻣﻘﺎرﻧﺔ ﺑﺎﻟﻐﯾﺎب اﻟﺗﺎم ﻟﻠﻌﻘد ﻋﻠﻰ ھذه اﻟﺗرﺑﺔ‪،‬‬
‫ﺳﺟﻠت ﻧﺳب ﻋﻘدﯾﺔ ﺟدر ﯾﺔ ﻓﻲ ﺗرﺑﺔ ﻣﺳﺗﻐﺎﻧم وﻋﯾن ﺗﻣوﺷﻧت‪ ،‬أظﮭرت ﻛل أﻧواع ﻧﺑﺎت اﻟﻔﺎﺻوﻟﯾﺎء ﺗطورا ﺟﯾدا وﻣردودا ﻣﺗﻣﺎﺛﻼ‪،‬‬
‫ﻛﻣﺎ أن ﻏﯾﺎب اﻟﻣﻠوﺣﺔ ﯾ ﺣﺳن ﻣن ﺗطور اﻟﻧوع اﻟﻣﺣﻠﻲ اﻷﺑﯾض‪ ،‬ﻓﻲ ﺗرﺑﺔ ‪ ،HB‬أظﮭر اﻟﻧوع اﻟﻣﺣﻠﻲ ﺗﺄﺛرا واﺿﺣﺎ ﺑﺎﻟﻣﻠوﺣﺔ ﺑﻌﻛس‬
‫اﻷﻧواع اﻟﻣﻠوﻧﺔ‪ ،‬أﻣﺎ ﻓﻲ ﺗرﺑﺔ ﻣﺳﺗﻐﺎﻧم ﻓﻘد أظﮭرت اﻷﻧواع اﻟﺧﻣﺳﺔ ﻣردودا ﻣﺗﻘﺎرﺑﺎ ﻋﻧد اﻟﻘطف‪.‬‬
‫اﻟﻛﻠﻣﺎت اﻟﻣﻔﺗﺎﺣﯾﺔ‪ .‬اﻟﺑﻘوﻟﯾﺎت‪ -.‬اﻟﻌﻘد اﻟﺟدرﯾﺔ – اﻟﺗﺛﺑﯾت اﻟﺣﯾوي ﻟﻼزت – ﺗﻌدد – ﺗﻌﺎﯾش ‪ -‬ﻓﺎﺻوﻟﯾﺎ ‪ -‬رﯾزوﺑﯾﺎ‬
Résumé
L’analyse physicochimique des sols prélevés a montré qu’ils sont légèrement alcalins à alcalins, le CaCO 3
limite le nombre de nodules ainsi que la salinité. Les sols montrent une carence en P. Les plantes du haricot
cultivées sur le sol T4 présente la meilleure nodulation. Lesol est pauvre en calcaire est adéquat en
phosphore. L’absence des nodules dans les sols (M1, T1, T2, OR1, OS2) est due essentiellement aux
concentrations basses en phosphore et à la salinité. Trente isolats sont analysés phénotypiquement. C’est es
des coccobacilles Gram négatif, qui n’absorbent pas le rouge Congo et leur croissance est rapide. Dans
66% des cas, les souches renodulent la plante hôte P. vulgaris (variétés locale blanche et variétés colorées)
ce qui confirme leur appartenance aux BNL. Toutes les souches présentent une bonne croissance à pH 6 à
9. Elles sont mésophiles et présentent une bonne croissance en absence de NaCl. 5% des souches tolèrent
jusqu’à 3% de NaCl. Le métabolisme des sucres a révélé la présence de groupes distincts sur neuf sucres.
L’étude est complétée par la recherche de l’antibiorésistance des souches. Aucune souche ne solubilise le
phosphore sur milieu PVK. La diversité des souches est mise en évidence par PCR-RFLP. La variété locale
et les RILs sont testés aux champs à Mostaganem, Ain Témouchent, Oran, Sidi Bel Abbes et Tissemsilt
avec l’aide des agriculteurs et de personnels qualifiés. Les différents types de sols montrent que la taille des
populations natives est variable entre le sol de Mostaganem et celui d’El Malah suivis des autres sols.
Mots clés:
Légumineuses alimentaires; Nodules racinaires; Fixation biologique d’azote; Diversité; Symbiose;
Phaseolusvulgaris; Rhizobium; RFLP; Climat; Rendement.

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Faculté des Sciences de la Département de

Nature et de la Vie Biotechnologie

Mme BOUCHENTOUF Leila

Rôle et importance des légumineuses alimentaires dans la fixation biologique d’azote.

Devant le jury composé de :

Année universitaire 2017/2018

La réalisation de cette thèse fut une occasion merveilleuse de rencontre et

d’échanges avec de nombreuses personnes. Je ne saurais pas les citer

bienveillance, a apporté une contribution positive à sa finalisation. Mes

dettes de reconnaissance sont, de ce point de vue, énormes à leur égard.

Je remercie Monsieur BEKKI A.E.K., Professeur à l’Université Oran 1

remarques successives et professionnelles ont permis d’améliorer les

différentes versions de ce travail. Je lui suis reconnaissante pour la

confiance qu’il m’a accordée.

A Madame Fyad-Lamèche F.Z., Professeur à l’Université d’Oran 1 Ahmed

Ben Bella qui a bien voulu présidé ce jury.

A Monsieur Abdelwahed D., Professeur à l’Université Abou Bakr Belkaid,

de Tlemcen qui a accepté d’examiner ce travail.

A Monsieur Dellal A., Professeur à l’université Ibn Khaldoun, Tiaret,

d’avoir bien voulu juger ce travail.

A Monsieur Hassani A., Professeur à l’Université Ibn Khaldoun, Tiaret,

d’avoir accepté d’expertiser ce travail.

A Monsieur Kihal M., Professeur à l’Université d’Oran 1 Ahmed Ben

Bella, de me faire l’honneur d’évaluer ce travail.

Mes sincères remerciements s’adressent à toute l’équipe du laboratoire

LBRAP, collègues et étudiants ayant contribué à cette thèse.

Sénégal, sous l’égide du Professeur Samba Sylla, pour m’avoir accueilli

pour la réalisation de la partie moléculaire, qu’ils trouvent ici l’expression

Ma reconnaissance s’exprime également à l’égard de Monsieur Abdi

Mohammed (Sidi Lakhdar, Mostaganem), de Monsieur Benni Abdelnour

(Ain Témouchent), de Monsieur Atif (Directeur de la station ITCMI Hassi

Bounif, Oran), de Monsieur Labdi (Directeur de INRA, Sidi Bel Abbes), de

Monsieur le Directeur du CFPA (Tissemsilt) et de tous les agriculteurs qui

ont permis les essais aux champs. A M. Ghomri B.E.

Je tiens à remercier le professeur Jean-Jacques Drevon pour m'avoir

accueilli au sein de UMR 1222 à INRA Montpellier, pour une expérience

très bénéfique dans le cadre de l’échange scientifique.

Grand merci à tous mes collègues du département de Biotechnologie pour

leur soutient moral et leur encouragements. Trouver ici l’expression de

ma reconnaissance et mon pur dévouement.

Mes remerciements les plus profonds et sincères s’adressent à Mme

A Mme Staali, M. HASSAINE et M. Dahane

BNL : Bactéries nodulant les légumineuses

ATP: Adénosine Triphosphate.

CIAT: Centre International d'Agriculture Tropicale.

EAPR : Efficacité d’acquisition du P par les racines.

EUN: Efficacité d’utilisation de l’azote.

EUP: Efficacité d’utilisation du phosphore.

EUSR : Efficacité d’utilisation de la symbiose rhizobienne.

FAO : Organisation des nations unies pour l’alimentation et l’agriculture.

FSN: Fixation symbiotique de l'azote.

YEM : yeast extract mannitol

RILs : Recombinant inbred lines

qx/ ha : quintaux/ hectare

PCR : Polymerase Chain Reaction

RFLP : Restriction fragment lenght polymorphisme

PGPR :Plante Growth Promoting Rhizobacteria

2.3.7. Dosage du carbone total et de la matière organique…….………………………………..……. 51

2.13.9. Conservation des nodules.…………………………………………………………………..... 73

3.1. Résultats des analyses physico-chimiques des sols…...……………………………………………... 75