TP N°2 : Microbiologie Alimentaire

Contrôle d’une conserve : Concentré de tomates

Les conserves
Ils sont des denrées alimentaires d’origine animale ou végétale, périssable, mais dont la
conservation est assurée par l’emploi combiné :
➢ D’un conditionnement dans un récipient étanche aux liquides et aux gaz pour toute
température < 55 °C.
➢ D’un traitement par la chaleur qui vise :
De détruire ou d’inhiber totalement les enzymes qui pourraient agir sur le produit
De détruire ou d’inhiber totalement les micro-organismes ou leurs toxines.
Ainsi traitées, les conserves sont des denrées pouvant se conserver longtemps puisqu’il n’y a
aucun élément susceptible de les altérer.
Elles doivent rester stables pendant au moins 8 jours à 37°C et même 8jours à 55 °C pour les
conserves destinées aux pays chaud.

Techniques de prélèvement et de préparations des échantillons.

a)-Prélèvement et Préparation
La solution mère est préparée dans des conditions aseptiques à partir d’un échantillon de 25g de
produit (tomates concentrées) et homogénéisée avec 225ml d’eau peptonée.
-1
La solution mère est considée comme la 10 (Guiraud et Galzy 1955).
b)-Préparation des dilutions décimales
-1
✓ Les dilutions sont effectuées en cascades à partir de la solution mère 10 .
-1 -5
Elles sont en fonction de la nature du produit et varient entre10 et 10 afin de faciliter le
dénombrement

Les méthodes d’analyses microbiologiques

La flore mésophile totale
- A partir de la dilution mère et les dilutions décimales, porter aseptiquement 1ml dans une
boite de pétri vide et stérile.
- Couler 20ml de la gélose P.C.A fondu puis refroidie.
- Mélanger l’inoculum au milieu en faisant les mouvements circulaires.
-Incubation: 30°Cpendant 72 heures.
Recherche et dénombrement des coliformes
Le coliforme est une entérobactérie fermentant le lactoseà30°C avec production de gaz.
Les coliformes thermo tolérants (fécaux) qui fermentent le lactose à44 °C.
Les coliformes sont recherchés dans les aliments car ils sont de bons marqueurs de l'hygiène
fécaux.

1
La recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux
•Test de présomption: (recherche des coliformes totaux)
Le milieu utilisé: le BCPL ou le BLBVB

A partir de chaque dilution décimale on porte aseptiquement 1ml dans les tubes de BCP Le
tonincubeà37°C pendant (18 à 24) heures. Cette méthode est dite présomptive.
Test de confirmation: (recherche des coliformes fécaux)

2
Recherche des streptocoques fécaux (F. Streptococcaceae)
Ils sont des témoins de contamination fécale assez résistant y compris dans les milieux salés
(GAUJOUS, 1995). Ils peuvent aussi se multiplier dans les milieux présentant des pH allant
jusqu'à 9.6, on peut par conséquent les utiliser comme indicateurs d'organismes pathogènes
qui ont une résistance similaire au pH élevé (PNUE/OMS, 1977).
Principe de la méthode
Leur recherche se fait sur le milieu Rothe doublement concentré répartie dans des tubes à
essai à raison de 9 ml.
1ml de chaque dilution décimale est ensemencé dans le milieu Rothe (3 tubes par dilution)
puis incuber à température de 37°C pendant 48h. Le test est noté positif quand il y a
apparition d’un trouble microbien dans le milieu Rothe.
Tests de confirmation
Si le test de présomption est positif, un repiquage sur milieu Litsky est effectué.
L’incubation des tubes est réalisée à 37°C pendant 24h, le test positif se traduit par
l’apparition d’une pastille violette au fond du tube.
Lecture
Trouble homogène est une pastille violette ; il y a au moins présence d’un streptocoque fécale.
Recherche des clostridium sulfito-reducteur
Principe
Les clostridium sont des bactéries sporulées sulfito-réducteurs fermentent le lactose avec
production de gaz. Leur recherche se base sur la croissance sur un milieu sélectif muni
De sodium et d’alun de fer, qu’il est réalisé sur la gélose VF.
Les clostridium réduisent les sulfites de sodium en sulfites de fer.
Les milieux utilisés:
•milieu de Wilson Blair
•gélose VF solide sulfitée et alun fer
•En milieu liquide en utilisant le milieu RCM. L’emploi des géloses TSN, SPS et surtout TSC
plus sélectives et plut sensibles est à conseiller: elles rendent inutiles l’étape de chauffage et
sont plus spécifiques de Clostridium perfringens.

3
Test (+)

*Salmonelles (F. enterobacteriacées).

Elles sont des bâtonnets mobiles, Gram (-), aérobies et facultativement anaérobies.
Elles fermentent le glucose, le maltose et le mannitol, avec production de gaz, elles réduisent
le sulfite en sulfure et decarboxylent la lysine.

4
La gélose Hektoen est un milieu d'isolement des Salmonelles et des Shigelles.
L'identification d'entérobactéries pathogènes repose sur la non utilisation des glucides
présents dans le milieu.

5
Staphylocoques aureus

6
 Recherche et dénombrement des levures et des moisissures
Principe
Le milieu sélectif utilisé doit renfermer une substance inhibant le développement des
bactéries. Ce milieu est la gélose glucosé à l’oxytétracycline (OGA).
Technique:
On étale 0.1ml de la suspension mère et des dilutions décimales de produit à analyser sur la
surface de la boite de pétri contenant le milieu sélectif (OGA); et l’incubation se fait à
25°Cpendant 5 jours.
Résultats
Les moisissures se présentent en colonies ayant un aspect velouté
Les levures se présentent en colonies semblables à celles des bactéries mais plus brillantes et
rondes.
Recherche de toxines
Il s’agit surtout de la recherche de la toxine botulinique et la toxine staphylococcique.

Centrifugation

Broyat dans un diluant

7
 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

INTRODUCTION
La relation entre les aliments; les mico-organismes et l’homme est une longue histoire.
Les aliments ne sont pas souvent une valeur nutritive pour le consommateur mais ils
constituent souvent des milieux de culture idéaux pour la croissance microbienne.
Les micro-organismes peuvent affecter la qualité des aliments pendant toutes les phases de la
manipulation, depuis le producteur jusqu’au consommateur final.
Une croissance microbienne entraine soit la conservation, soit la détérioration de la nourriture,
selon les micro-organismes impliqués et les conditions de la conservation.
1. La croissance des micro-organismes dans les aliments.
Parce qu’ils nous fournissent les éléments nutritifs, les aliments sont aussi d’excellents
milieux pour la croissance des micro-organismes. Cette croissance est contrôlée par des
facteurs liés à l’aliment lui même, ou facteurs intrinsèques, et aussi par d’autres, liés à
l’environnement ou l’aliment est conservé, ce sont les facteurs extrinsèques (voir fig.1).
Les facteurs intrinsèques ou associés aux aliments, comprennent le pH, l’humidité, l’activité
de l’eau, le potentiel oxydo-réduction, la structure physique de l’aliment, les éléments nutritifs
disponibles et la présence possible d’agents antimicrobiens naturels.
Les facteurs extrinsèques ou environnementaux concernent la température, l’humidité
relative, les gaz (CO2, O2), les types et les quantités de micro-organismes présents dans
l’aliment.
 fig1. Facteurs intrinsèques et extrinsèques.

«Des facteurs intrinsèques et extrinsèques peuvent influencer la croissance microbienne

dans les aliments.
La communauté microbienne et les aliments subissent des modifications qui succèdent dans le
temps ».

1.1. Les facteurs intrinsèques

1.1.1. La composition de l’aliment
La composition de l’aliment est un facteur intrinsèque crucial qui influence la croissance
microbienne.
Si un aliment consiste essentiellement en glucides, sa détérioration ne produira pas beaucoup
d’odeurs.
Des aliments comme les pains, les confitures et certains fruits, gâtent d’abord sous l’action de
mycètes.
Au contraire, lorsque l’aliment contient de grandes quantités de protéines et/ou de graisses
(par exemple la viande ou le beurre), sa détérioration peut s’accompagner par de toutes variété
d’odeurs infectes.
Cette protéolyse et la dégradation anaérobie des protéines qui donnent des composés aminés
nauséabonds qui s’appellent la putréfaction. Une source importante d’odeur est l’amine
organique, appelée cadavérine.
La dégradation des graisses ruine tout autant la nourriture.
Par exemple, la production à partir des lipides, d’acides gras à courtes chaines le beurre rance
et désagréable.
1.1.2. Le pH
Le pH d’un aliment est aussi critique, car un pH faible favorise le développent des levures et
des moisissures. Les bactéries prédominent au cours du processus de détérioration et de
putréfaction des aliments neutre ou alcalin comme les viandes.
Comme le résume le tableau N°1 différents types de détérioration peuvent se produire selon le
substrat principal.
1.1.3. L’eau
L’eau et sa disponibilité affectent la capacité qu’ont les micro-organismes de coloniser les
aliments.
En séchant simplement un aliment, on arrive à contrôler ou éviter la détérioration.
On peut rendre l’eau moins disponible, même si elle présente, en ajoutant des solutés comme
le sucre et le sel.
Les micro-organismes sont pour la plupart déshydratés par les conditions hypertoniques et ne
se multiplient pas si on ajoute des grandes quantités de sel ou du sucre aux aliments.
Des micro-organismes osmophiles ou xérophiles peuvent avarier la nourriture même dans ces
conditions hostiles.
Les micro-organismes osmophiles se développent mieux dans ou sur des milieux dont la
pression osmotique est élevée, alors que les micro-organismes xérophiles préfèrent un
environnement où aw est faible et peuvent ne pas se développer si aw est élevée.
 Tab.N°1: Différence dans le processus de détérioration en fonction des caractéristiques
des aliments

1.1.4. Le potentiel redox

Le potentiel d’oxydo-réduction d’un aliment influence aussi la détérioration. Après cuisson,
les dérivés carnés particulièrement les bouillons, ont souvent des potentiels d’oxydo-réduction
faibles.
1.1.5. La structure physique d’un aliment
Elle affecte également le déroulement et l’étendue de la composition. Broyer et mélanger des
aliments, non seulement, augmentent la surface de la nourriture et altèrent la structure
cellulaire, mais dispersent aussi les germes contaminant partout dans la nourriture.
Ceci provoque une détérioration rapide si ces aliments sont mal conservés. Les légumes et les
fruits ont des épidermes (pelures) qui les protègent d’une altération.
Les micro-organismes du pourrissement ont souvent des enzymes spécialisées qui les aident
affaiblir et à pénétrer les pelures protectrices, surtout lorsque les fruits et les légumes ont été
blessés.
1.1.6. Des substances antimicrobiennes naturelles
De nombreux aliments contiennent des substances antimicrobiennes naturelles, parmi
lesquelles des inhibiteurs chimiques complexes et des enzymes.
Les coumarines présentes dans les fruits et les légumes montrent une activité antimicrobienne.
Le lait de vache et les œufs contiennent également des substances antimicrobiennes.
Les œufs sont riches en lysozymes, une enzyme lytique pour les parois des bactéries Gram
positives contaminantes.
Les herbes et les épices contiennent souvent des substances antimicrobiennes importantes, les
mycètes y sont généralement plus sensibles que la plupart des bactéries. Il y a des composés
aldéhydiques et phénoliques dans la cannelle, la moutarde et l’origan, ce sont les inhibiteurs
de la croissance microbienne.
Les thés vert et noir non fermentés, ont aussi des propriétés antimicrobiennes bien étudiées, à
cause de leurs contenus en polyphénols, qui diminuent apparemment lors de la fermentation.
Ces thés sont actifs contre les bactéries, les virus et les mycètes et peuvent avoir des
propriétés anticancéreuses.
1.2. Les facteurs extrinsèques
1.2.1. La température et l’humidité relative
Elles sont des facteurs extrinsèques importants dans l’avarie d’un aliment. Les microbes se
développent plus rapidement dans une humidité relative élevée, même à basse température
(Particulièrement lorsque les réfrigérateurs n’ont pas de dégivrage).
Quand des aliments secs sont mis à l’humidité, ils absorbent l’eau en surface, ce qui permet
finalement une croissance microbienne.
1.2.2. L’atmosphère
L’atmosphère, dans laquelle la nourriture est conservées est également importante. C’est
particulièrement vrai pour des aliments emballés sous plastique, car beaucoup de films
plastiques permettent une diffusion de l’oxygène qui favorise la croissance de micro-
organismes superficiels. Un excès de CO2 peut réduire le pH de la solution, inhibant ainsi le
développement microbien.
L'aflatoxine est une mycotoxine produite par des champignons proliférant sur des graines
conservées en atmosphère chaude et humide. Elle est nuisible aussi bien chez l'homme que
chez l'animal, et possède un pouvoir cancérigène élevé. Elle fut découverte en 1960 en
Angleterre.
Les aflatoxines sont de puissants cancérigènes du foie.
On peut séparer les principaux types d’aflatoxines et leurs dérivés par chromatographie.
Outre leur importance dans les céréales, les aflatoxines ont aussi été observées dans la bière,
le cacao, les raisins et la farine de soja.
Les phycotoxines (toxine provenant d’une algue) contaminent les poissons et affectent ainsi la
santé des animaux marins situes plus haut dans la chaine alimentaire. Elles peuvent aussi
contaminer les coquillages qui sont ensuite consommés par l’homme.
Parmi les principales maladies humaines dues aux phycotoxines, citons les empoisonnements,
diarrhéiques et neurotoxiques dues aux coquillages.
Ces phycotoxines complexes pour la plupart thermostables, sont connus pour leurs effets
périphériques sur le système neurologique, effet qui apparaissent souvent moins d’une heure
après l’ingestion.
2. Le contrôle de la détérioration des aliments
Aux premiers temps de l’agriculture, lorsque la dépendance vis-à-vis de la chasse et de la
cueillette, la conservation des surplus de nourriture devint un besoin essentiel à la survie.
L’emploi de sel comme agent préservateur de la viande et la fabrication de fromage et de laits
caillés furent introduits dans la civilisation du Proche Orient dès 3000 avant J.C.
La production de vins et la conservation de poisson et de la viande par fumaison étaient aussi
répandues à cette époque.
En dépit d’une longue tradition d’efforts pour empêcher la détérioration de la nourriture, ce
n’est qu’au XIXe siècle que la détérioration microbienne fut étudiée avec rigueur.
Louis Pasteur jeta les fondements de la microbiologie alimentaire de l’ère moderne en 1857,
lorsqu’il montra que les micro-organismes étaient la cause du lait avarié.
Le travail de Pasteur dans les années 1860 prouva qu’on pouvait utiliser la chaleur pour
empêcher la détérioration des vins et des bières.
Différentes méthodes permettent de conserver les aliments (tableau N°2). Il est vital
d’éliminer ou de réduire les populations de micro-organismes pathogènes. La contamination
se produit souvent après l’ouverture d’un paquet ou d’une boite et avant que la nourriture soit
servie.
Ces circonstances sont une excellente occasion de développement et de transmission des
pathogènes, si des précautions ne sont pas prises.
2.1. L’élimination des micro-organismes
Les micro-organismes de l’eau, de la bière, du vin, des jus, des boissons non alcoolisées et
d’autres liquides peuvent être éliminés par filtration.
Cette technique réduit fortement ou élimine complètement les populations bactériennes.
Des préfiltres et une centrifugation permettent souvent d’augmenter la durée et l’efficacité
d’un filtre.
Les boissons qui sont filtrées plutôt que pasteurisées préservenet mieux le gout et l’arome du
produit origine.
Tableau N°2: méthodes de base de la conservation des aliments

2.1.1. Les basses températures

La réfrigération à 5°C retarde le développement microbien, bien qu’au cours d’un stackage
prolongé, des psychrophiles et des psychrotrophes finissent par se multiplier et par induire
une altération.
On a observé une croissance microbienne lente à des températures inférieures à -10°C,
particulièrement dans des jus de fruits concentrés, des glaces et certains fruits.
Congélation
Maintient la température au cœur de la denrée jusqu’à -18°C. Ce qui ralentit ou stoppe
l'activité microbienne et enzymatique. La congélation permet donc la conservation des
aliments à plus long terme que la réfrigération. Généralement on considère que les
températures d’inhibition des bactéries est de -8°C, pour les levures -10°C et -12°C pour les
moisissures.
Le froid réduit le nombre de certains micro-organismes qui y sont très sensibles, mais il ne
diminue pas les populations microbiennes totales.
2.1.2. Les températures élevées
Le contrôle des populations microbiennes dans les aliments, au moyen de températures
élevées, peut limiter significativement la transmission de maladies et le pourrissement.
La nourriture en boite est chauffée dans divers types d’autoclaves, à environ 115°C, pendant
25 à plus de 100 minutes.
Le temps et la température exacts dépendent de la nature de l’aliment.
Parfois, la mise en conserve ne tue pas tous les micro-organismes, mais seulement ceux qui
pourraient avarier les aliments (les bactéries restantes sont incapables de se développer à
cause de l’acidité de l’aliment, par exemple).
Après le chauffage, les boites sont refroidies aussi rapidement que possible, habituellement
avec de l’eau froide. Cependant, la qualité et l’efficacité ne sont pas toujours assurées lors du
traitement domestique des aliments, particulièrement avec des produits moins acides
(pH > 4.6), comme les haricots verts ou les viandes
-La pasteurisation
Elle implique un chauffage des aliments à une température qui tue les micro-organismes
pathogènes et réduit nettement la quantité des organismes qui avarient les aliments.
Au cours de la pasteurisation conventionnelle à basse température (LTH: low temperature
holding) du lait, des bières et des jus de fruits, on maintient le liquide à 62.8°C pendant 30’.
Les produits peuvent également être traités à 71°C pendant 15’’ pour une pasteurisation
rapide à haute température dite HTST (high temperature short time)
-La tyndallisation
Il s’agit d’un traitement thermique équivalent à des pasteurisations répétitives séparées par
des passages à des températures voisines de 30 à 40°C de l’ordre de 10 à 24 h. seules les
formes végétatives sont inactivées tandis qu’au cours des incubations à 30-40°C pendant 10 à
24 h successives à la pasteurisation, la plupart des spores thermo-résistantes sont à même de
germer en formant des cellules végétatives qui sont alors inactives par la pasteurisation
suivante.
-L’ébullition
Ce traitement couramment pratiqué peut être considéré comme une “super pasteurisation”.
Il ne détruit pas les formes sporulées et il est souvent constaté que dans ces conditions, la
germination des spores est favorisée au cours du refroidissement.
-La stérilisation
L’élimination tous les microorganismes pathogènes
Les couples temps/température permettant de stériliser les produits alimentaires ou autres
varient entre 10 min à 115°C et 30 min à 121°C.
2.1.3. Lyophilisation 
C’est un procédé qui consiste à retirer l’eau d’un aliment liquide, pâteux ou solide, à l’aide de
la surgélation puis une évaporation sous vide de la glace sans la faire fondre.
Le principe de base est que lorsqu’on réchauffe de l’eau à l’état solide à très basse pression,
l’eau se sublime (elle passe directement de l’état solide à l’état gazeux).
À la fin du cycle, le produit ne contient plus que 1 % à 5 % d’eau, ce qui est extrêmement
faible.
2.1.4. La conservation par les substances chimiques
Les substances chimiques comprennent des acides organiques simples, les sulfites, l’oxyde
d’éthylène comme gaz stérilisant, le nitrite de sodium et le formiate d’éthyles.
Ces agents chimiques affectent les micro-organismes en désorganisant un facteur cellulaire
essentiel
Par exemple, ils peuvent endommager la membrane plasmique ou dénaturer diverses
protéines de la cellule.
Il y a encore d’autres composés qui interfèrent avec le fonctionnement des acides nucléiques,
inhibant ainsi la reproduction de la cellule.
L’efficacité de nombreux additifs chimiques dépend du pH de l’aliment.
Le propionate de sodium, par exemple, est plus efficace aux pH faibles, où il existe
principalement sous forme non dissociée, il peut être intégré par les lipides des micro-
organismes.
Les pains, avec leur pH bas, contiennent souvent du propionate de sodium comme additifs.
On utilise ces conservateurs chimiques avec des produits de céréales, de lait, de légumes et de
fruits.
Le nitrite de sodium est un composé chimique important utilisé pour conserver jambons,
saucisses, lards et autres viandes, en inhibant la croissance de Clostridium botulinum et
germination et germination de ses spores.
On se protège ainsi du botulisme et réduit la vitesse de la détérioration. En plus de maintenir
la viande plus saine, le nitrite se décompose en acide nitrique qui réagit avec les pigments à
hème, ce qui permet de garder la couleur rouge de la viande.
Un problème posé actuellement par le nitrite vient de ce qu’il peut réagir avec des amines et
former des nitrosamines cancérogènes.
Le nitrite est ajouté en très faibles quantités et il se peut qu’on arrive à supprimer
complètement son usage.

2.1.5. Les radiations

Les radiations ionisantes et non ionisantes ont une histoire intéressante en relation avec la
conservation des aliments.
Les radiations UV permettent le contrôle des micro-organismes à la surface des équipements
de laboratoire et de traitement des aliments, mais ne pénètrent pas dans la nourriture.
La méthode principale de stérilisation des aliments par les radiations est les irradiations avec
gamma, par une source de cobalt 60.
Ces radiations électromagnétiques ont un excellent pouvoir de pénétration ; elles doivent être
appliquées sur des aliments humides, car à partir de l’eau des cellules microbiennes, elles
produisent des peroxydes, qui oxydent les constituants cellulaires sensibles. Ce procédé
s’appelle la radappertisation (Nicolas Appert).
Elle prolonge la durée de conservation des fruits de mer, des fruits et des légumes. On utilise
ordinairement 4.5 à 5.6 méga rads pour stériliser des produits carnés.
Deinococcus radiodurans est l’une des bactéries les plus intéressantes parmi celles qui
résistent aux radiations. Cette bactérie a une paroi cellulaire de structure complexe et se
développe en formant des tétrades.
Elle a également la capacité extraordinaire de supporter de fortes doses de radiations, mais
son mécanisme de résistance n’est pas encore compris.
2.1.6. L’inhibition par les produits microbiens
Les bactériocines sont une famille de peptides ou protéines synthétisées naturellement par
certaines bactéries.
Une bactériocine consiste généralement en un composé protéique de 20 à 60 acides aminés.
Les bactériocines ne sont pas des antibiotiques mais elles possèdent des propriétés
antibiotiques :
elles peuvent être bactériocides, c'est-à-dire éliminer certains micro-organismes.
elles peuvent être bactériostatiques, c'est-à-dire inhiber la croissance de certains micro-
organismes.
L’utilisation de bactériocines pour la conservation des aliments suscite de plus en plus
d’intérêt.
Les bactériocines sont des protéines bactéricides, actives contre des bactéries étroitement
apparentées à l’organisme producteur.
Elles se fixent à des sites cellulaires spécifiques et affectent l’intégrité et la fonction de la
membrane cellulaire.
Le seul produit approuvé pour le moment est la nisine.
C’est une petite protéine hydrophobe qui est produite par certaines souches de streptococcus
lactis. La nisine n’est pas toxique pour l’homme et touche principalement les bactéries Gram-
positives, surtout Streptococcus faecalis.
On peut l’utiliser tout particulièrement dans les aliments pauvres en acides, pour améliorer
l’inactivation de Clostridium botulinum lors de la mise en boite, ou pour inhiber la
germination de toute spore survivante
Les bactériocines agissent en dissipant la force proton motrice des bactéries sensibles; ces
composés ont une grande variété de noms, selon l’organisme qui les produit.
Les bactériocines forment des pores hydrophiles dans la bactérie sensible, ce qui permet aux
molécules de faible poids moléculaire de s’échapper.
La membrane est ainsi rendue perméable à certains composés tels les ions, les molécules
d'adénosine-tri-phosphate, ... Cela est généralement létal pour la bactérie-cible. Elles sont
généralement thermorésistantes et supportent de grands écarts de pH (2 à 10) mais sont
sensibles à l'action de la plupart des protéases.
Tableau N°2: Groupes principaux de composés chimiques utilisés pour la conservation
des aliment
3. Les micro-organismes en tant qu’aliments et adjuvants alimentaires
Outre un rôle dans la fermentation en tant qu’agents de transformation physiques et
biologiques, les micro-organismes peuvent eux-mêmes servir d’aliments.
On a utilisé une variété de bactéries, de levures et d’autres mycètes comme sources d’aliments
pour les animaux et les hommes.
Les champignons blancs Agaricus bisporus sont un des mycètes importants comme denrée
alimentaire.
Les micro-organismes peuvent être utilisés directement comme nourriture ou comme
suppléments à d’autres aliments. On parle alors des de protéine d’origine unicellulaire.
La cyanobactérie Spirulina est un des suppléments alimentaires microbiens les plus
populaires.
Elle est vendue dans les magasins d’alimentation diététique, sous forme de gâteau sec ou en
poudre.
On utilise actuellement des micro-organismes comme Lactobacillus et Bifidobacterium dans
le domaine, en développement rapide, des probiotiques.
Ceux-ci consistent en l’addition de micro-organismes à la nourriture, afin qu’à la valeur
nutritive de base, s’ajoutent des avantages pour la santé (adjuvants diététiques microbiens)
On emploie les probiotiques avec succès dans les élevages de volailles. On nourrissant des
poulets avec une souche de Bacillus subtilis, on a obtenu une meilleure conversion des
aliments et une meilleure prise de poids.
On a aussi noté une réduction des coliformes. Il a été suggéré que ces probiotiques
diminuaient le besoin en antibiotiques pour la production des volailles et concentrations en
pathogènes des poulaillers.
On peut contrôler Salmonella en pulvérisant sur des poussins d’un jour, 29 bactéries, isolées
du caecum du poulet.
En se lissant les plumes, les poulets ingèrent le mélange bactérien.
4. Dangers Biologiques des Aliments.
Les relations entre nutrition et maladies infectieuses sont soit directes en cas d'infection ou
d'intoxication alimentaire par un agent infectieux, soit indirectes en raison de l'effet
immunodépresseur de la dénutrition qui favorise les surinfections.
Les principales bactéries responsables de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) sont
les salmonelles, le Clostridium perfringens , le staphylocoque doré , et plus rarement
Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Yersinia enterocolitica,
Shigellas, Bacillus cereus…
Les principales causes des TIA sont en relation avec
Les aliments : rupture de la chaîne du froid, aliments souillés avant leur préparation,
conservation dans des locaux insalubres, traitement par la chaleur insuffisant.
Le personnel : porteurs de germes non contrôlés, non respect des règles d’hygiène (lavage des
mains, port de gants…).
4.1. Quelques définitions
Toxi-Infection: ingestion massive de bactéries et de toxines dans l'aliment.
Intoxination: ingestion de toxine bactérienne (la bactérie pouvant être tuée).
Infection: ingestion de bactéries (ou virus) qui se multiplient in vivo
Toxi-infections alimentaires collectives (TIAC)
La TIAC est définie comme la survenue d'au moins deux cas similaires d'une
symptomatologie dont on peut rapporter la cause à une même origine alimentaire.
4.2. Principales flores et germes de contaminations des aliments
4.2.1. Clostridium botulinum
Le Clostridium botulinum est le germe responsable du botulisme suite à une intoxication ou
une toxi-infection.
Ce germe est capable de produire des neurotoxines à action paralysante.
Le botulisme peut résulter de l’ingestion des toxines botuliques préformées dans l’aliment; il
s’agit ainsi d’une intoxication ou d’une intoxination.
Il peut résulter de l’ingestion des toxines préformées dans l’aliment au même temps que des
bactéries et des spores.
Ou ingestion uniquement des bactéries et spores; en effet dans ces deux cas les bactéries et les
spores avalées vont s’implanter au niveau des intestins et produire des toxines, on parle de
toxi-infection alimentaire
Remarque : C. Botulinum est un consortium d’espèces et non une espèce bien défini, c’est un
bacille, Gram +, sporulé, anaérobie strict, se développe à PH voisin de 7 et non à PH < 4.5.
La spore a une thermo-résistance élevée.
Elle résiste 3 à 5 heures au chauffage à 100ºC
Vu sa grande toxicité, il peut être éliminer dans les produits alimentaires conservés par
stérilisation [au moins 15 minutes à 120ºC pour la détruire (ce qui est fondamental dans
l'industrie des conserves alimentaires)]..

Symptômes
 La maladie apparait 2 à 24 heures.
 Paralysée oculaire et vision double.
 Sècheresse de la bouche.
 Constipation et souvent rétention d’urée.
 Trouble de la déglutition et de l’élocution
 Dans les cas graves, la paralysée des muscles respiratoires et troubles de conscience
peu vent apparaitre
Aliments en cause
•conserves faites « maison » de
– légumes divers peu acides,
– champignons
– viandes, pâtés
• poisson en boite
• poisson fermenté, fumé, salé
• viandes fumées: jambon, poulet, saucisses
4.2.2. Staphylococcus aureus
S. aureus est un commensal de la peau et des muqueuses de l’homme et des animaux (rhino-
pharynx, intestin). On le trouve sur la muqueuse nasale d’un tiers environ des sujets normaux.
Eliminé dans le milieu extérieur, cette bactérie peut survivre longtemps dans
l’environnement.
Germe pyogène par excellence, S. aureus est le microbe de la suppuration.
C'est une bactérie gram +, Catalase +, anaérobie facultative et elle est également mésophile,
ayant une température optimale de croissance à 37 °C.
S. aureus est l'une des rares bactéries présentant une résistance à l'action du lysozyme.
Ceci contribue fortement à sa persistance et sa capacité à coloniser la peau et les muqueuses
que ce soit chez l'homme ou l'animal.
4.2.2.1. La fréquence et la gravité des infections à staphylocoques sont liées à trois
principaux facteurs
1. Le caractère ubiquitaire du germe,
2. L'abaissement des défenses locales et générales des malades soumis à des soins intensifs,
des interventions chirurgicales graves, etc.,
3. La fréquente résistance aux antibiotiques du staphylocoque, notamment du staphylocoque
hospitalier.
4.2.2.2. Intoxications alimentaires staphylococciques
Par la diversité et la quantité de ses gènes de virulence, S. aureus est l'une des causes majeures
des intoxications alimentaires. Cette bactérie peut croître dans plusieurs aliments dont le lait,
la crème, le beurre, les salades, le fromage, le jambon ainsi que dans les saucisses.
La présence de cette bactérie dans les différents types d'aliments est, entre autres, le résultat
d'une mauvaise manipulation de ceux-ci durant le processus de fabrication, de stockage, de
transport et de distribution.
C'est à partir d'une concentration de 105 UFC/g d'aliment que certaines souches de S. aureus
peuvent produire une concentration significative d'entérotoxines.
Les symptômes
- des nausées,
- des vomissements,
- des diarrhées,
- des crampes abdominales,
- des maux de tête,
- des crampes musculaires,
- des variations de la pression artérielle et même dans de très rares cas, la mort de la personne
par entérotoxicose.
Les symptômes apparaissent 1 à 6 heures après l'ingestion d'à peine 100 nanogrammes
d'entérotoxines
4.2.3. Salmonella
Ce sont des bactéries entero-invasives, l’endotoxine n’est libérée qu’après la lyse de la
bactérie d’où les salmonelles ne font pas partie des bactéries toxinogènes.
Bien qu’il existe plus de 2 500 sérotypes de Salmonella, en raison de la pathophysiologie et
du tableau clinique, on distingue souvent 2 groupes :
1) les sérotypes typhi et paratyphi;
2) tous les autres sérotypes.
Ces nombreux sérotypes ont été individualisés en fonction de leur variabilité antigénique, et
appelés par le nom de la ville où ils ont été isolés pour la première fois.
La sallmonellose se manifeste essentiellement par deux aspects:
- Les fièvres thyphoides et parathyphoides.
- Les gasto-enterites.
- Généralement les signes pathologiques n’apparaissent que s’il y a ingestion des
quantités importantes de salmonelles 106 germes.
- Les toxi-infections alimentaires sont dues S. typhimurium et S. enteritidis
Même si l’iléon est la cible privilégiée des infections par les salmonelles, les colites aiguës
sont assez fréquentes.
La plupart des cas relèvent d’une origine alimentaire. Les volailles, les viandes de boucherie,
les oeufs et les produits laitiers, ou les fruits de mer sont souvent incriminés.
Parmi les vecteurs animaux, les tortues domestiques seraient à l’origine d’environ 15 % des
salmonelloses de l’enfant.
D’un point de vue clinique, les symptômes apparaissent le plus souvent entre 6 et 24 heures
après le repas infectant.
Les premiers signes sont digestifs avec des nausées et des vomissements. Les douleurs
abdominales et la diarrhée apparaissent rapidement, associées ou non à une hyperthermie.
Le syndrome dysentérique signe généralement l’atteinte colique. Des signes extradigestifs
comme des céphalées, ou des myalgies peuvent être observés.
Généralement, l’épisode est spontanément résolutif en 3 à 7 jours, et si une hyperthermie est
constatée, elle ne du repas plus de 48 heures. La persistance de la diarrhée au-delà de 10 jours
doit faire envisager un autre diagnostic.
La mortalité des gastro-entérites à salmonelles est faible, et sur les 13 000 cas de gastro-
entérites à Salmonella enteritidis rapportés en 1991 aux Etats-Unis, une cinquantaine de décès
seulement ont été rapportés.
En revanche, les bactériémies sont fréquentes chez les sujets âgés ou immunodéprimés, chez
les malades porteurs d’une pathologie inflammatoire du tube digestif, ou chez les sujets
dénutris.
La majorité des gastro-entérites à salmonelles survient chez de jeunes enfants âgés de moins
de 10 ans.
Dans cette tranche d’âge, les formes cliniques sont parfois sévères, et le risque d’atteinte
méningée est élevé.
L’excrétion de salmonelles persiste souvent pendant 4 à 5 semaines après la gastro-entérite,
durée qui varie en fonction du sérotype bactérien.
Si le portage intestinal varie en fonction des différents sérovars, plusieurs travaux ont montré
un allongement de la durée du portage intestinal par l’administration de traitements
antibiotiques.
Finalement, les gastro-entérites à salmonelles restent des affections bénignes, même si la
mortalité de ces infections n’est pas nulle (0,4 %).

4.2.4. Listéria monocytogènes

Les bactéries du genre Listeria sont des petits bacilles à Gram positif, à extrémités arrondies,
asporulés, mobiles à 20-25ºC. immobile à 37ºC, L.monocytogenes est aérobie-anaérobie
facultatif.
Il pousse bien sur milieux usuels à des températures allant de +4º à 45ºC et des pH de 5,6 à
9,6.
Il existe 7 espèces, mais seule l'espèce
L.monocytogenes joue un rôle en pathologie humaine.
4.2.4.1. Habitat
Les Listeria sont des germes ubiquitaires que l'on trouve dans le sol, sur les plantes et dans les
eaux (saprophytes). Elles sont très résistantes au milieu extérieur (plusieurs années à + 4 ºC).
Elles sont aussi des hôtes des êtres vivants (portage intestinal asymptomatique de Listeria
chez les animaux et l'homme).
Ce sont enfin des bactéries des aliments : Listeria est fréquente dans les produits laitiers, lait
cru ou fromage (croute). La pasteurisation correctement réalisée détruit les Listeria.
On la trouve aussi dans les produits carnés, dans les produits de la mer, dans les légumes.
C'est une bactérie psychrophile se développant à des températures > 4 ºC, ce qui pose des
problèmes pour la conservation prolongée des aliments.
4.2.4.2. Facteurs de virulence et physiopathologie.
La survenue d'une infection à L.monocytogenes dépend de plusieurs facteurs : virulence
particulière de certaines souches, contamination par un inoculum massif, état immunitaire de
l'hôte.
Compte-tenu du mode de contamination alimentaire de l'homme, le site principal d'entrée de
la bactérie est l'intestin.
C'est une protéine de surface de 80 kD qui déclenche l'adhésion et la pénétration dans la
cellule en induisant la phagocytose.
Les bactéries se multiplient dans le cytoplasme des macrophages et des cellules épithéliales
grâce à leur facteur de virulence, la listérolysine O (les mutants sans listérolysine ne sont pas
pathogènes) qui est active à pH acide, dans le phagolysosome.
La membrane du phagolysosome est lysée, ce qui permet la libération dans le cytoplasme
cellulaire où Listeria se multiplie. Le mouvement intracellulaire et le passage de cellule à
cellule de L.monocytogenes requièrent la polymérisation de l'actine qui est induite par une
protéine bactérienne de surface et une phospholipase.
Par voie sanguine et lymphatique, les bactéries atteignent le foie et la rate. Au niveau du foie,
elles sont phagocytées par les cellules de Kuppfer et 90 % de l'inoculum est détruit. Les
bactéries survivantes infectent les hépatocytes.
La lyse des hépatocytes libère les bactéries qui peuvent y être phagocytées par les
polynucléaires neutrophiles ou les macrophages.
Certains macrophages permettent la multiplication de L.monocytogenes alors que d'autres sont
listéricides.
La suite du processus infectieux dépend de l'état immunitaire de l'hôte : si toutes les bactéries
n'ont pas été détruites, les survivants peuvent alors atteindre par voie sanguine le cerveau ou
le placenta
4.2.4.3. Pouvoir pathogène
L.monocytogenes est une bactérie opportuniste responsable par diffusion hématogène de trois
types d'infections chez l'homme :
— Listeriose de l'adulte et de l'enfant : méningites, méningo-encéphalites, encéphalites,
septicémie.
La grande majorité de ces infections se produisent chez des malades porteurs de tares
viscérales
(cirrhose, cancers, etc…).
La listériose de l'adulte atteint essentiellement les personnes âgées et immunodéprimées.
— Listériose de la femme enceinte : infection bénigne pour la femme, se traduisant souvent
par une simple fièvre mais grave pour le fœtus, pouvant provoquer un avortement, la mort in
utero ou l'accouchement prématuré.
— Listériose néonatale : septicémie, méningite secondaires à la contamination dans les jours
qui précèdent l'accouchement ou au moment de l'accouchement.
4.2.5. Escherichia coli
Escherichia coli (colibacille) est une entérobactérie mobile capable de fermenter le lactose et
de
produire de l'indole.
Habitat
E. coli est un commensal du tube digestif de l'homme et de nombreux animaux.
Il représente à lui seul la plus grande partie de la flore bactérienne aérobie de l'intestin (espèce
aérobie dominante) à raison de 108 par gramme de fèces (flore totale : 1011 à 1012 bactéries par
gramme).

Pouvoir pathogène
Les colibacilles, hôtes normaux de l'intestin, ne provoquent normalement pas de maladie.
Cependant ils possèdent un potentiel pathogène qu'ils expriment dans certaines circonstances
(pathogènes opportunistes).
Certaines souches de colibacilles ont un pouvoir entéropathogène intrinsèque par acquisition
de gènes de pathogénicité, Quatre types sont pathogènes pour l'homme:
a. Par sécrétion d'entérotoxine (ETEC), ils peuvent provoquer des diarrhées aiguës,
« cholera-like ».
La sécrétion d'entérotoxine est codée par un plasmide.
La toxine est le plus souvent une toxine thermolabile ou LT (très voisine de celle du vibrion
cholérique), mais parfois thermostable.
Les plasmides en cause portent aussi des gènes responsables de la production de pili ou
fimbriae (adhésines) qui permettent l'attachement des E.coli à la muqueuse intestinale.
Les ETEC sont une des causes les plus fréquentes des diarrhées de l'enfant dans les pays en
voie de développement.
b. Par fixation sur la surface des cellules de la muqueuse, abrasion de la bordure en brosse des
villosités intestinales et production de cytotoxines (EHEC), les EHEC provoquent une
diarrhée aiguë, puis hémorragique sans pus ni fièvre.
Le sérotype 0157 : H7 est le plus fréquent.
Les EHEC hébergent un plasmide codant pour une adhésine.
Les EHEC se propagent sous forme épidémique à partir d'aliments contaminés (« maladie du
hamburger ») et provoquent jusqu'à plusieurs centaines ou milliers de cas à la fois.
Ils peuvent aussi provoquer une complication redoutable : le syndrome hémolytique et
urémique (SHU), dans 5 à 10 % des cas.
c. Par invasion de la muqueuse colique, certains colibacilles (EIEC:  Entero-Invasif)
provoquent des diarrhées aiguës.
La virulence des EIEC est liée à la présence d'un plasmide très proche de celui connu chez
Shigella.
d. Enfin, certaines souches d'E.coli sont associées à des diarrhées et sont clairement
entéropathogènes
(EPEC) grâce à des propriétés d'adhésion particulières.
Elles ne sont ni secrétrices d'entérotoxine, ni entéro-invasives.
Elles forment des pili, codés par des plasmides, qui forment des « faisceaux » qui se fixent
sur les villosités des entérocytes.
Les villosités sont progressivement détruites
(« attachement-effacement »).
Aliments:
Infection par l'eau contaminée par des selles : La Turista (ou diarrhée des voyageurs).
Légumes mal lavés ou lavés à l’eau contaminée, glaces faites à l’eau contaminée, fromages.
 TPN°1 : microbiologie alimentaire :

Analyse de la qualité microbiologique du lait écrémé en poudre

Lait en poudre
Les essais de dessiccation de lait entier, demi-écrémé ou écrémé entrepris dans la seconde
moitié du XIXe s. avaient donné des produits insatisfaisants à la réhydratation. C'est au début
du XXe s. que l'on mit au point des procédés aptes à un usage industriel, dont les plus
importants restent aujourd'hui encore l'atomisation et le séchage sur cylindres chauffants, qui
réduisent la teneur en eau du lait de 88% à 2-4% (Tableau 1).
Selon la loi sur les aliments du Canada, les poudres de lait sont des produits
résultants de l’enlèvement partiel de l’eau du lait. On répartit les poudres en trois groupes :
La poudre de lait entier, la poudre de lait partiellement écrémé et la poudre de lait écrémé
Tableau 1: Composition des laits en poudre (% m/m) (FAO, 2010)

Appareillage et verrerie

Matériel courant du laboratoire microbiologique et notamment :

Etuve réglable à la température d’incubation, Boites de Pétri, Pipette de 1ml de capacité,

Tubes à essai

Préparation de l’échantillon

- Préparation de dilution au 1/10 (reconstitution de la poudre).Réchauffer un flacon contenant

90 ml de diluant à 47 °C au bain-marie.
- Peser 10 g de lait en poudre dans un récipient en verre stérilisé en procédant de façon
aseptique.
- Introduire la poudre dans le flacon de dilution contenant le diluant à 47°C.
- Pour dissoudre la poudre, la mouiller en faisant tourner lentement puis en secouant
doucement le flacon pendant 10 secondes environ, 25 fois avec un mouvement d’une
amplitude de 30 cm environ.
- Remettre le flacon au bain-marie et le maintenir pendant 5 minutes en agitant de temps à
autre le contenu.
- Le volume final du lait reconstitué est d’environ 97,5 ml et non de 100 ml, mais cet écart est
négligeable.
Préparation des dilutions au 1/100 et plus.
- A l’aide d’une pipette stérile transférer 10 ml de lait reconstitué dans 90 ml de diluant stérile
en veillant à ne pas enfoncer l’extrémité de la pipette de plus d’un centimètre au-dessous de la
surface. On obtient ainsi la dilution au 1/100.
- Mélanger en agitant 25 fois avec un mouvement d’une amplitude de 50 cm environ.
- On peut poursuivre les dilutions décimales en utilisant chaque fois une nouvelle pipette pour
passe d’une dilution à l’autre.

Ensemencement des boîtes de Pétri (ensemencement en profondeur).

- Préparer au moins deux boîtes à partir de chaque dilution choisie de façon à obtenir au
moins deux boîtes comprenant de 20 à 300 colonies.
Normalement il suffit de choisir deux dilutions parmi les dilutions au 1/10, au 1/100 ou au
1/1000, mais si l’on prévoit une énumération très élevée, il faudra procéder à d’autres
dilutions.
- Utiliser une nouvelle pipette stérile de 1 ml pour ensemencer 1 ml de chaque dilution dans
les boîtes de Pétri.
I- Dénombrement de la flore totale mésophile aérobies
Ensemencement en profondeur, d’un volume du lait ou produit laitier dans un milieu solide
défini, coulé dans des boites pendant 24 h à 30°C. Comptage des colonies des micro-
organismes présents dans les boites et calcul du nombre de micro-organismes présents dans
une quantité déterminée du produit.

Milieu de culture et diluant :

PCA (ou GN), eau peptone ou Solution de Ringer au quart.

Mode opératoire
Répartition de la gélose dans les boîtes de Pétri
- Faire bouillir le milieu et le refroidir aussi vite que possible à une température de 45 à 47 °C.
- Verser dans chaque boîte 10 à 12 ml du milieu fondu, refroidir à une température de 45 à 47
°C.
- A l’aide d’une pipette stérile, transformer dans chaque boite de Pétri, 1 ml de chaque
solution (chaque tube).
- Laisser reposer les boîtes jusqu’à la solidification du milieu, les retourner et les placer dans
l’étuve. Le temps qui s’écoule entre la préparation des dilutions, et la répartition de la gélose
dans les boîtes ne doit pas dépasser 15 minutes.
Les piles de boîtes ne doivent pas se toucher, ni être en contact avec les parois ou la partie
supérieure de l’étuve.
Incubation
Après solidification, les incuber à 30°C pendant 24 heures à l’étuve.
Comptage des colonies
Les colonies doivent être comptées dans les 4 heures qui suivent la fin de la période
d’incubation pour faciliter la numération. Il est recommandé d’utiliser un appareil de
comptage lumineux muni d’une loupe et d’un compteur-enregistreur.
Ne tenir compte, pour exprimer les résultats, que des boîtes dans lesquelles se sont
développées de 20 à 300 colonies
Expression des résultats
Exprimé en UFC/ml, le nombre N des mico-organismes aérobies mésophiles présents, selon
la formule suivante : N=n*D /P
Ou n : nombre moyenne des colonies formées dans les boites de pétri
D : facteur de dilution
P : prise d’essai (ml).
II. Recherche et dénombrement des coliformes totaux et thermotolérants.

Aux fins de la présente méthode la dénomination « coliforme » s’applique aux bactéries en

forme de bacilles Gram négatives, aérobies et facultativement anaérobies, non sporulées
fermentant le lactose avec formation de gaz et d’acide.
Principe : on ensemence une quantité de lait dans une série de tubes contenant un milieu de
culture liquide sélectif, muni chacun d’une cloche de Durham pour mettre une évidence la
production du gaz carbonique, on incube ensuite, à 37°C pendant 48 heures. A partir des tubes
positifs, on ensemence 3 à 5 goutes dans le milieu de schumbert (milieu contenant le
tryptophane) et on incube à 44°C, cela pour permettre en évidence la présence des coliformes
thermotolérants.
Milieu de culture : bouillon lactosé bilié au vert brillant (BLBVB) ou bouillon lactosé au
pourpre de bromocrésol (BCPL).

Diluant : solution peptone ou solution singer au quart.

Mode opératoire
Préparer les tubes contenant 9ml du milieu BCPL et muni chacun d’une cloche de Dugham à
raison de 3 tubes par dilution.
A partir de chaque dilution, porter aseptiquement 1ml dans les 3 tubes correspondant le milieu
BCPL.
Mélanger la suspension bactérienne et incuber à 37°C pendant 24 à 48h.
A partir des tubes positifs, on ensemence 3 à 5 goutes dans le milieu de schumbert (milieu
contenant le tryptophane) et on incube à 44°C, cela pour permettre en évidence la présence
des coliformes thermotolérants.
Lecture et dénombrement
Le résultat positif est traduit par un dégagement du gaz carbonique (dont le volume est
supérieur à 1/10 de la hauteur de la cloche) ainsi que l’apparition d’un trouble bactérien
accompagné d’un virage du milieu vert au jaune. L’estimation des coliformes totaux
s’effectue en se référant à la table de Mac Gardy.

- Recherche et dénombrement des coliformes fécaux ; recherche de l’E-coli :

A partir des tubes positifs de l’étape précédente, repiquer à l’aide d’une pipette Pasteur
stérile, 3 à 5 goutes dans le milieu de Schembert (contenant du tryptophane), muni de cloche
du Durham.

Incuber à 44°C pendant 24h.

Lecture et dénombrement
Le résultat positif est traduit par un dégagement du gaz carbonique dans la cloche et la
formation d’un anneau rouge en surface après l’addition de 1ml du réactif de Kovacs.
Pour le dénombrement des coliformes fécaux on fait appel à la table de Mac Grady.
III- recherche et dénombrement des streptocoques
Principe de la méthode
Leur recherche se fait sur le milieu Rothe doublement concentré répartie dans des tubes à
essai à raison de 9 ml.
1ml de chaque dilution décimale est ensemencé dans le milieu Rothe (3 tubes par dilution)
puis incuber à température de 37°C pendant 48h. Le test est noté positif quand il y a
apparition d’un trouble microbien dans le milieu Rothe.
Testes de confirmation
Si le test de présomption est positif, un repiquage sur milieu Litsky est effectué.

L’incubation des tubes est réalisée à 37°C pendant 24h, le test positif se traduit par
l’apparition d’une pastille violette au fond du tube.
Lecture
Trouble homogène est une pastille violette ; il y a au moins présence d’un streptocoque fécale.