TRAVAUX DIRIGES D’ENZYMOLOGIE

S4-SV
ANNEE UNIVERSITAIRE 2014/2015

TD N°1 : Vitesse initiale - L'équation de Michaelis-Menten - Paramètres

cinétiques : Vmax, KM, kcat

TD N°2 : Inhibition compétitive, non compétitive et incompétitive. Effets de

la T° et du pH

TD N°3 : Réactions enzymatiques à deux substrats et exemple d’allostérie

Responsable du Cours Magistral : Pr M. BENICHOU

Intervenants aux Travaux Dirigés : Mme M. CHEGGOUR

Mme M. SAGAR
 TD N°1 Enzymologie
Vitesse initiale - L'équation de Michaelis-Menten - Paramètres cinétiques : Vmax, KM,
kcat

Exercice N°1
Une enzyme E catalyse la réaction d'hydrolyse: A + H2O <=====> B + C
On suit la cinétique d'apparition du produit C, pour différentes concentrations en
substrat A.
Les valeurs obtenues (en µmoles de C par tube) sont présentées dans le tableau
suivant:

[S0] (mM)
Temps (min)
10 30 100 150

0 0 0 0 0

2,5 0,9 1,9 3,2 3,6

5 1,8 3,9 6,4 7,1

7,5 2,5 5,6 9,6 10,7

12,5 3,7 7,6 15,2 17,6

17,5 4,4 9,1 18,3

1. Représentez les cinétiques et déterminez la vitesse initiale de chacune d'elle.

Dans quelle condition de concentration du substrat A s'est-on placé pour suivre ces
cinétiques?
Pourquoi ne se préocupe-t-on pas de la concentration de l'eau ?

2. Tracez la courbe de saturation et commentez la.

Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme à partir de cette représentation.

3. Déterminez les paramètres cinétiques à l'aide de la représentation des double

inverses.
Expliquez la différence entre les valeurs déterminées à partir de ces deux
représentations.

4. Les réactions enzymatiques sont effectuées dans un tube contenant 1 ml de la

solution d'enzyme à une concentration initiale de 3 µM, le volume réactionnel étant
complété par 2 ml de substrat dans le tampon approprié.
Calculez les valeurs des paramètres cinétiques (exprimez la concentration en
molarité).

5. Une unité d'enzyme (U) est la quantité qui hydrolyse 1 µmole de substrat par
minute. Par ailleurs, l'activité spécifique d'une enzyme est le rapport de l'activité
maximale de l'enzyme à sa concentration (exprimée en mg/ml) dans le milieu
réactionnel. Enfin, la masse molaire de l'enzyme E est de 100.000 dalton.
Calculez l'activité spécifique en U.mg-1.

6. On considère que l'enzyme a été totalement purifiée. Calculez la valeur de la

constante catalytique (kcat) en s-1.

7. Si l'enzyme E est une enzyme dite "Michaelienne", à quelle constante du schéma

réactionnel classique pour une telle enzyme correspond cette constante ? Expliquez-en
les unités.
Retrouvez les unités de Km sur la base de celles des constantes de vitesse k1, k-1 et k2.

Exercice N°2
L'étude préliminaire de l'activité de deux enzymes (E1 et E2) vis-à-vis du même
substrat donne les résultats suivants:

[S0] (mM) 1 2 3 4 5

E1 vi (µM.min-1) 0,040 0,078 0,124 0,160 0,205

E2 vi (µM.min-1) 0,270 0,280 0, 275 0,280 0,285

Tracez la courbe vi = f([S0]). Quelles conclusions pouvez-vous en tirer ?

Exercice N°3
La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse des esters de l'acide ortho-phosphorique.
Pour suivre l'activité enzymatique, on utilise un substrat synthétique, le
paranitrophénol-phosphate (M. M. = 371 g.mol-1) qui libère du paranitrophénol (M.
M. = 139 g.mol-1) qui absorbe à 410 nm avec un coefficient d'extinction pondéral: ε1% =
1260 g-1.100 mL.cm-1.

Chaque réaction est effectuée dans un volume réactionnel de 10 ml contenant 0,2 ml

d'enzyme à une concentration initiale de 10 mg/ml. On obtient les résultats suivants
(longueur du trajet optique = 1 cm):
 [S0] (mg/tube) 0 0,26 0,39 0,65 1,50 1,95 3,80

vi (U. DO.min-1) 0 0,147 0,167 0,190 0,212 0,231 0,238

Déterminez les valeurs des paramètres cinétiques de cette enzyme vis-à-vis de ce

substrat (on exprimera la concentration en molarité).

Calculez l'activité spécifique de l'enzyme avec l'unité de concentration précisée dans

l'exercice N°1.

Exercice N°4
D'une part, on a purifié une isomérase. D'autre part, on a cloné la séquence codant
cette isomérase dans un vecteur d'expression et transformé des bactéries. On a fait une
culture de ces bactéries et induit la synthèse protéique. Enfin, de l'extrait brut
bactérien obtenu, une enzyme recombinante a été purifiée que l'on appelle l'enzyme
inconnue (Einc).

On étudie la réaction d'isomérisation d'un substrat S en un produit P, en présence:

 1ère expérience: de l'isomérase seule

 2éme expérience: de l'isomérase ET de l'enzyme inconnue

Pour chaque expérience, on mesure la vitesse initiale de la réaction (exprimée en nM.s-

1) pour différentes concentrations [S0] du substrat. Les résultats sont résumés dans le
tableau suivant:

vi (nM.s-1)
[S0] (µM) 1ère expérience: 2è expérience: [Isomérase]
[Isomérase] = 10 pM = 10 pM + [Einc] = 10 pM

0,2 1,2 2,4

0,4 1,6 3,2

1 2,1 4,2

2 2,3 4,6

1. Pour chaque expérience, déterminez les paramètres cinétiques V max et KM, à partir
de la représentation graphique de votre choix.

2. Calculez la valeur de la constante catalytique de l'isomérase (kcatIso).

On a déterminé la constante catalytique de l'enzyme inconnue: kcatEinc = 15360 min-1.

3. Un seul paramètre cinétique diffère entre les 2 expériences (d'un facteur 2). Lequel
et pourquoi ?

4. En conclusion, l'enzyme inconnue dont le gène a été cloné est-elle bien l'isomérase ?

TD N°2 Enzymologie
Inhibition compétitive, non compétitive et incompétitive

Exercice N°1
On suit la cinétique d'hydrolyse de l'orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG)
par la β-galactosidase, respectivement en absence d'inhibiteur et en présence
d'orthonitrophényl-β-D-thiogalactopyranoside (ONPTG), de maltose (α-D-
glucopyranosyl-(1,4)-β-D-glucopyranose) ou de mélibiose (α-D-galactopyranosyl-(1,6)-
α-D-glucopyranose).

Voir un cours sur les oses.

Les valeurs des vitesses initiales obtenues en suivant la variation de l'absorbance à λ =

410 nm sont les suivantes :

vi (ΔA.min-1)
[S0] (M) [ONPTG] 3 10- [maltose] 0,26 [mélibiose] 0,17
Sans I 4
M M M
0 0 0 0 0
2,5 10-5 0,033 0,018 0,016 0,027

5 10-5 0,055 0,033 0,027 0,041

1 10-4 0,082 0,055 0,041 0,055

2,5 10-4 0,118 0,091 0,059 0,069

5 10-4 0,138 0,118 0,069 0,075

1 10-3 0,150 0,138 0,075 0,079

1. Déterminez Vmax, KM et kcat (en s-1) à l'aide de la représentation de votre choix.

2. Déterminez les paramètres cinétiques Vmaxapp et KMapp en présence des inhibiteurs.
Calculez les constantes KI.
3. Que suit-on à λ = 410 nm ?
4. Expliquez le type d'inhibition observé pour chacun des inhibiteurs de cet exercice.
Données: [E0] = 1,19 10-9 M - εMONP = 3300 M-1.cm-1 - l = 1 cm
Exercice N°2

L'étude préliminaire de l'activité d'une enzyme en absence et en présence d'un

inhibiteur donne les résultats suivants :

[S0] (mM) 1 2 4 7 10
-1
vi (µM.min )
31 33 34,5 36 37
sans I
vi (µM.min-1)
19 21 22,5 24 25
avec I

1. Tracez les courbes de saturation. Quelles conclusions pouvez-vous en tirer ?

2 . Dans le cas d'un inhibiteur incompétitif, dans quelle partie de la courbe de
saturation (en d'autres termes, pour quelle gamme de concentrations de substrat), cet
inhibiteur est-il le plus efficace ?
Exercice N°3

On dispose d'une molécule M dont on veut préciser le rôle dans une réaction catalysée
par une enzyme : Substrat + M ------> produit(s)

On mesure la vitesse initiale de cette réaction (exprimée en nM.min-1) pour différentes

concentrations de S, en présence ou non de la molécule M (à la concentration indiquée
dans le tableau suivant).

[molécule M] (mM)
[S0] (µM)
0 1 2,84

1 3,8 2,7 1,7

2 6 4,2 2,6

5 9 6,2 4,1
10 10,5 7,7 4,8

D'après les résultats de ce tableau, déterminez si la molécule M est :

- un second substrat : dans ce cas, tracez les graphes primaires, déterminez les
paramètres cinétiques auxquels vous avez accès et précisez le type de mécanisme
réactionnel.
- un inhibiteur : dans ce cas, déterminez le type d'inhibition et calculez la valeur de la
constante KI.
Exercice N°4

Une enzyme catalyse l'isomérisation d'une double liaison d'un acide gras insaturé en
C16.
On étudie la réaction catalysée par cette enzyme, en absence et en présence d'un
inhibiteur I.
On suit la réaction enzymatique en mesurant la variation d'absorbance dûe à
l'apparition du produit.
Pour différentes concentrations en substrat, on obtient les vitesses initiales suivantes
(U.A. = unité d'absorbance) :

vi (U.A.h-1) [I] =
[C16]0 (mM) vi (U.A.h-1)
55 µM
0,8 0,5 0,8

1,2 0,7 1,1

1,9 1,1 1,5

2,4 1,2 1,7

3,4 1,5 2,0

5,8 2,0 2,6

8,7 2,4 2,9

1. Déterminez les paramètres cinétiques (Vmax, KM et kcat) et les paramètres

cinétiques en présence de l'inhibiteur, par une méthode graphique de votre
choix.
Les concentrations doivent être exprimées en molarité.
2. Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition KI.
Données : [E]0 = 9 µM - εMproduit = 17000 M-1.cm-1 - l = 1 cm

TD N°3 Enzymologie
- Réactions enzymatiques à deux substrats

Exercice N°1
Une enzyme catalyse une réaction selon un mécanisme ordonné.
On mesure la vitesse initiale de la réaction pour différentes concentrations de l'un des
substrats (X) en maintenant fixe la concentration de l'autre substrat (Y), et
inversement.
Les résultats, exprimés en µM.min-1, sont les suivants :

[Y] (µM)
[X] (mM)
3 5 10
 0,33 0,017 0,025 0,039

0,67 0,024 0,033 0,038

5 0,034 0,047 0,061

1. En n'utilisant que les deux représentations primaires, déterminer les

paramètres cinétiques auxquels vous avez accès.
2. En déduire l'ordre de fixation des substrats. Quel paramètre cinétique n'est
pas déterminé ?

Exercice N°2
La phospholipase A2 catalyse l'hydrolyse de l'acide gras estérifié en position 2 des 1-2-
diacylphosphoglycérides en présence d'ion calcium.
On mesure les vitesses initiales d'hydrolyse de la dibutyryl-lécithine (DBL), à
différentes concentrations de ce substrat et de calcium.
La réaction est suivie en titrant l'acide libéré par la soude et les résultats, en µmoles
d'acide libéré.min-1.mg-1 de phospholipase, sont les suivants :

[Ca2+] x 106 (M)

[DBL] (mM)
25 50 100 200

11,4 0,60 0,83 1,00 1,15

22,7 1,07 1,40 1,70 1,85

34 1,45 1,85 2,15 2,35

45,4 1,75 2,20 2,50 2,70

1. Déterminer le mécanisme et les paramètres cinétiques de cette réaction.

2. On étudie l'effet de l'acide butyrique (analogue de la DBL) et du baryum
(analogue du calcium).
L'acide butyrique se comporte comme un inhibiteur compétitif de la DBL et
comme un inhibiteur un-compétitif du calcium. Le baryum se comporte comme
un inhibiteur compétitif du calcium et de la DBL. Ces résultats sont-ils en
accord avec le précédent ?

Exercice N°3
On étudie le mécanisme catalytique de la glycogène phosphorylase en mesurant les
vitesses initiales de la réaction pour différentes concentrations des 2 substrats (le
glycogène et le phosphate).
Les résultats, en µmoles de glucose 1-phosphate.min-1.mg-1 glycogène phosphorylase,
sont les suivants :

[phosphate] x [glycogène] (mg.mL-1)

 103(M) 3,2 8 16 24 48

6 12 18 21 23 25

15 24 35,5 43 46 49

30 35,5 53 64 68,5 74

45 43 64 77 82 88

60 47,5 71 85 91,5 98,5

Écrire la réaction catalysée.

Déterminer le mécanisme et les paramètres cinétiques de cette réaction.

Exercice N°4
Une protéine kinase catalyse la réaction 1 : protéine substrat (inactive) + ATP -------
> protéine substrat phosphorylée + ADP)
La protéine substrat phosphorylée catalyse à son tour la réaction 2 : lipide Cn:0 +
malonyl-CoA -------> lipide Cn+2:0
Le mécanisme de la réaction 2 est ordonné.

On mesure la vitesse initiale de la réaction 2 pour différentes concentrations des 2

substrats lipide Cn:0 et malonyl-CoA.
Les résultats, exprimés en µM.min-1, sont les suivants :

lipide Cn:0 [malonyl-CoA] (µM)

(mM) 0,33 0,67 5
3 0,017 0,024 0,034
5 0,025 0,033 0,047
10 0,039 0,038 0,061

1. Déterminer les paramètres cinétiques auxquels on a accès en n'utilisant que les

deux représentations primaires.
2. Déterminer l'ordre de fixation des substrats.
3. De quel paramètre cinétique ne détermine-t-on pas la valeur ?

Exercice N°5
La galactose-1-phosphate uridyltransférase catalyse la réaction : UDP-glucose +
galactose-1-phosphate <=====> UDP-galactose + glucose-1-phosphate
Le mécanisme de la réaction 2 est ordonné.

On mesure la vitesse initiale de la réaction pour différentes concentrations des 2

substrats UDP-glucose et galactose-1-phosphate.
Les résultats, exprimés en µM.min-1.mg-1, sont les suivants :

[UDP- [galactose-1-phosphate] (10-3 M)

glucose] (10-
3 0,06 0,12 0,25 0,50
M)
0,05 0,034 0,048 0,061 0,069
0,10 0,041 0,063 0,087 0,105
0,20 0,046 0,075 0,111 0,143
0,50 0,050 0,085 0,133 0,182

1. Déterminer le mécanisme et les paramètres cinétiques de cette réaction.

On étudie l'effet inhibiteur des produits de cette réaction, c'est-à-dire l'inhibition par
le glucose-1-P (figures A et B, ci-dessous) et l'inhibition par l'UDP-galactose (figures C
et D, ci-dessous).
2. Les résultats sont-ils en accord avec le mécanisme déterminé ?
3. Quelle information supplémentaire apportent-ils ?
4. Proposer un schéma réactionnel compatible avec ces résultats

Figure
s ci-
contre
:
inhibit
ion
par le
glucos
e-1-P.
Figure
s ci-
contre
:
inhibit
ion
par
l'UDP
-
galact
ose.