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ECHANTILLONNAGE, PREPARATION DES ECHANTILLONS

L’échantillonnage est défini dans la norme ISO 5667-1 : 2007 « Qualité de l'eau -
Échantillonnage - Partie 1 : lignes directrices pour la conception des programmes et des
techniques d'échantillonnage » comme étant :
« Le processus permettant de prélever une partie, la plus représentative, d’un milieu ou d’une
masse d’eau pour la détermination des caractéristiques diverses et variées ».

Il a pour but d’estimer les caractéristiques d’un lot de produits en effectuant des analyses sur
une partie seulement du lot.
Pour une analyse microbiologique il convient de procéder à une série d’opérations très
importantes dont dépend en grande partie la qualité du résultat :
- Le choix des échantillons, des lieux et des conditions de prélèvement.
- Le déroulement des opérations de prélèvement et l’acheminement des échantillons ver
le laboratoire d’analyse.
Le prélèvement doit être (conditions générales de prélèvement) :
- En quantité suffisante.
- Le plus homogène possible.
- Précautions d’asepsie (conditions aseptiques).
Donc un bon échantillonnage = résultats fiables.

EXEMPLE 1 : NORME D’ECHANTILLONAGE

ISO 19458 :2006(F)

Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique.

Water quality — Sampling for microbiological analysis.

Elle a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC4, Méthodes microbiologiques.

Introduction
Un échantillonnage approprié est essentiel pour fournir des échantillons représentatifs au
laboratoire d'analyse. Les modalités de l'échantillonnage dépendront de l'objectif de celui-ci,
mais aussi de la nature des échantillons. Les micro-organismes sont des organismes vivants.
De plus, lors de leur introduction dans l'eau, ils ne forment pas une solution parfaite mais une
suspension ayant son propre degré d'hétérogénéité. Les objectifs d'échantillonnage peuvent
être multiples et ceux-ci sont décrits dans la série de normes ISO 5667 (l'ISO 5667-1, l'ISO
5667-2 et l'ISO 5667-3) :
- Déterminer la conformité d'une eau à une spécification réglementaire de qualité
- Caractériser toute contamination, son niveau (moyen) et ses variations
- Identifier les sources de pollution
Le nombre ou la fréquence des échantillons variera en fonction de l'objectif du prélèvement.
1-Domaine d'application

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La présente Norme internationale fournit des conseils sur les régimes de planification du
prélèvement d'eau, sur les modes opératoires de prélèvement en vue de l'analyse
microbiologique et le transport, et sur la manipulation et la conservation des échantillons
avant le début de l'analyse. Elle porte sur les prélèvements pour recherches microbiologiques.
2-Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables à l'application du présent document.
Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la
dernière édition du document de référence s'applique (y compris les amendements).
ISO 5667-1 : Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 1: Lignes directrices pour la
conception des programmes et techniques d'échantillonnage
ISO 5667-2 : Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les
techniques d'échantillonnage
ISO 5667-3 : Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 3: Lignes directrices pour la
conservation et la manipulation des échantillons d'eau
3-Point de prélèvement
Le site de prélèvement doit présenter des caractéristiques représentatives et rendre compte de
toute variation verticale, horizontale et temporelle.
4-Technique de prélèvement
4.1 Personnel
La formation formelle, les dossiers de formation et la détermination des compétences
doivent être décrits pour tout personnel en charge des prélèvements et cette
information doit être correctement documentée.
4.2 Flacons de prélèvement
4.2.1 Généralités
4.2.2 Stérilisation des flacons
4.2.3 Neutralisation des désinfectants
4.2.4 Contrôle de la qualité des flacons de prélèvement
4.2.4.1 Essais de stérilité
4.2.4.2 Essai de présence d'agents neutralisants
4.2.4.3 Essai de toxicité résiduelle dans les flacons de prélèvement
4.3 Réactifs, appareillage et matériel
4.3.1 Réactifs
4.3.2 Appareillage et matériels
4.4 Mode opératoire de remplissage
4.4.1 Prélèvement d'eau potable à un robinet
4.4.2 Eau provenant de sources et de puits
4.4.3 Prélèvement d'eau de piscines
4.4.4 Eaux superficielles : Eaux de baignade, Mer, lacs, rivières
4.4.5 Eaux résiduaires
4.4.6 Micro-organismes liés aux surfaces
4.5 Formulaire de prélèvement
5-Transport et conservation
5.1 Transport
5.2 Délai.

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Du prélèvement jusqu'au traitement de l'échantillon, il faut tout mettre en œuvre pour

stabiliser qualitativement et quantitativement la flore présente au moment du prélèvement.
Les conditions idéales pour tendre vers cet objectif sont d'avoir un transport rapide avec
température adaptée et un contenant stérile.
Pour les produits alimentaires les échantillons sont amenés au laboratoire dans leur emballage
d’origine s’il s’agit de produits finis ou dans des flacons ou récipients stériles s’il s’agit de
produits en vrac ou de “prélèvements”. Il faut parfois disposer de matériels permettant le
prélèvement d’aliments dans des emballages solides (poinçons, ouvre-boîtes) ou encore de
matériels indispensables au prélèvement d’aliments Solides.
Les analyses s'effectuent toujours sur des suspensions. Pour les aliments solides, une fraction
représentative de l'échantillon est prélevée, pesée, broyée et diluée dans un diluant stérile
permettant d'obtenir une solution mère. Le diluant utilisé assure la survie de tous les micro-
organismes. Pour réaliser une analyse quantitative, on réalise ensuite des dilutions décimales
successives de la solution mère dans le diluant.

EXEMPLE 2 : NORME DE PREPARATION DES ECHANTILLONS

ISO 6887-1 :1999(F)

Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des

dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 1 : Règles générales pour la
préparation de la suspension mère et des dilutions décimales.

Microbiology of food and animal feeding stuffs-Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination- Part1: General rules for the
preparation of the initial suspension and decimal dilutions.

Le présent document a été préparé par l’ISO/TC34 « Produits agricoles alimentaires »

en collaboration avec le CEN/TC275 « Analyse des produits alimentaires-méthodes
horizontales ».

Ce document est la première partie d’un ensemble de normes spécifiant les règles de
préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue des
examens microbiologiques, réalisés en aérobiose, des produits destinés à la consommation
humaine ou animale.
1-Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 6887 définit des règles générales pour la préparation de la
suspension mère et des dilutions décimales réalisées en aérobiose, en vue des examens
microbiologiques des produits destinés à la consommation humaine ou à l’alimentation
animale.
La présente partie de l’ISO 6887 est applicable dans le cas général, à l’exception des produits
visés dans l’ISO 6887-2.

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2-Références normatives
Le document normatif suivant contient des dispositions qui par suite de la référence qui y est
faite, constituent des dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 6887.
ISO 7218, Microbiologie des aliments-Règles générales pour les examens microbiologiques.
3-Termes et définitions
Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 6887, les termes suivants s’appliquent.
3.1-Suspension mère (première dilution) : suspension, solution ou émulsion obtenue après
qu’une quantité pesée ou mesurée du produit à analyser (ou de l’échantillon pour essai
préparé à partir de ce produit) a été mélangée avec une quantité neuf fois égale de diluant, en
laissant se déposer les particules grossières, s’il y en a.
3.2-Dilution décimales suivantes : suspensions ou solutions obtenus en mélangeant un
volume mesuré de la suspension mère (3.1) avec un volume neuf fois égale de diluant et en
répétant cette opération sur les dilutions suivantes, jusqu’à obtention d’une gamme de
dilutions décimales appropriées pour l’inoculation des milieux de cultures.
3.3-Norme spécifique : norme internationale ou document de directives décrivant l’analyse
d’un produit déterminé (ou d’un groupe de produits) en vue de la recherche ou du
dénombrement d’un micro-organisme déterminé (ou d’un groupe de micro-organismes).
4-Principe
Préparation de la solution mère (3.1), de façon à obtenir une répartition aussi uniforme que
possible des micro-organismes contenus dans la prise d’essai.
Préparation, si nécessaire, de dilutions décimales (3.2) en vue de réduire le nombre de micro-
organismes par unité de volume pour permettre, après incubation, d’observer leur éventuel
développement (cas des tubes) ou d’effectuer le dénombrement des colonies (cas des boites),
comme précisé dans chaque norme spécifique.
5-Diluants
5.1-Composants de base
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recommandé d’utiliser, pour la
préparation du diluant, des composants de base déshydratés ou une préparation complète
déshydratée. Les instructions du fabricant doivent être suivies scrupuleusement.
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique reconnue et appropriée pour
l’analyse microbiologique.
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée ou de qualité équivalente (voir l’ISO 7218).
5.2-Diluants d’emploi général
5.2.1-Solution de peptone-sel : Composition et préparation.
5.2.1-Eau peptonée tamponée : Composition et préparation.
5.3-Diluants pour des besoins particuliers : voir la norme spécifique du produit concerné.
5.4-Répartition et stérilisation du diluant
Repartir le diluant dans des fioles de capacité appropriée et/ou dans des tubes à essai.
Boucher les tubes ou les fioles.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 min.
6-Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui
suit.

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Appareils pour stérilisation en chaleur sèche (four) et en chaleur humide (autoclave),

appareillage pour homogénéisation, agitateur mécanique, fioles, tubes à essai, pipettes
graduées à écoulement total, pH-mètre, balance.
7-Echantillonnage
Effecteur l’échantillonnage conformément à la norme spécifique du produit concerné. S’il n’y
a pas de norme spécifique disponible, il est recommandé que les parties concernées se mettent
d’accord à ce sujet.
8-Préparation des échantillons pour l’essai : voir la norme spécifique du produit concerné.
9-Mode opératoire
9.1-Prise d’essai et suspension mère (première dilution) : peser une masse mg, ou mesurer
un volume Vml (au minimum 10g ou 10ml, sauf spécifications contraire) représentatifs de
l’échantillon pour essai. Ajouter une quantité de diluant égale à 9xmg ou 9xVml.
La température du diluant doit être proche de la température ambiante, sauf produits
particuliers.
Homogénéiser le mélange suivant les recommandations de l’ISO 7218.
Si nécessaire, laisser les grosses particules se déposer durant 15 min au maximum.
Dans le cas de dénombrement des spores, un chauffage de la suspension mère (par exemple
pendant 10min à 80°C) doit être pratiqué immédiatement après sa préparation, suivi d’un
refroidissement rapide.
N.B. dans certains cas il est possible d’utiliser un volume inférieur ou supérieur, il convient
alors d’en tenir compte dans la suite des opérations et/ou dans l’expression des résultats.
9.2-Dilutions décimales suivantes : transvaser à l’aide d’une pipette stérile 1ml de la
suspension mère dans un tube contenant 9ml de diluant stérile à la température appropriée.
Pour une précision optimale ne pas introduire la pipette dans la suspension mère de plus de
1cm. Eviter tout contact entre la pipette contenant l’inoculum et le diluant stérile.
Mélanger soigneusement pendant 5s à 10s, pour obtenir la dilution 10-2. Répéter ces
opérations en utilisant à chaque dilution une nouvelle pipette stérile afin d’obtenir les
dilutions 10-3, 10-4, etc.
9.3-Durée des opérations : le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation de la
suspension mère et le moment où l’inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne doit
pas dépasser 45min, en limitant à 30min le temps séparant la préparation de la suspension
mère (9.1) du début de la préparation des dilutions décimales suivantes, sauf indications
particulières mentionnées dans la norme internationale spécifique.
N.B. si la température ambiante du laboratoire est trop élevée, il convient de réduire ces deux
durées maximales.

EXEMPLE 3 : NORME POUR LE DENOMBREMENT DES COLIFORMES

ISO 9308-1 : 2014

Qualité de l’eau - Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries Coliformes - Partie 1:
Méthode par filtration sur membrane pour les eaux à faible teneur en bactéries

Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 1: Membrane
filtration method for waters with low bacterial background flora.

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Comité technique : ISO/TC 147/SC 4 Méthodes microbiologiques

Cette norme comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau-
Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes :
- Partie 1 : Méthode par filtration sur membrane pour les eaux à faible teneur en
bactéries
- Partie 2 : Méthode du nombre le plus probable
- Partie 3 : Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour la recherche et le
dénombrement des E. coli dans les eaux de surface et les eaux résiduaires

Introduction
La présence et l’étendue de la pollution fécale est un facteur important dans l’évaluation de la
qualité de l’eau ainsi que du risque infectieux représenté pour la santé humaine. L’examen
d’échantillons d’eau pour y rechercher des Escherichia coli (E. coli), normalement présents
dans les intestins de l’homme et des animaux homéothermes, fournit une indication sur ce
type de pollution. Les résultats de l’examen des bactéries coliformes peuvent s’avérer plus
difficiles à interpréter en raison du fait que certains coliformes vivent également dans le sol et
dans les eaux douces de surface, et ne sont donc pas toujours d’origine intestinale. La
présence de bactéries coliformes peut donc, bien que ce ne soit pas la preuve d’une
contamination d’origine fécale, indiquer une défaillance du traitement, du stockage ou de la
distribution de l’eau.

1- Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 9308 spécifie une méthode de dénombrement des Escherichia coli
(E. coli) et des bactéries coliformes. La méthode consiste en une filtration sur membrane,
suivie d’une mise en culture dans une gélose chromogène et d’un calcul du nombre des
organismes cibles présents dans l’échantillon. La gélose de différenciation étant peu sélective,
la flore bactérienne générale peut perturber la fiabilité du dénombrement des E. coli et des
bactéries coliformes, par exemple, dans certaines eaux de surface ou certaines eaux de puits
peu profonds. Cette méthode ne convient pas à ces types d’eau.

2- Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives
indispensables à l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition
citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence
s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696 : Eau pour laboratoire à usage analytique - Spécification et méthodes d’essai.
ISO 7704 : Qualité de l’eau - Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour des analyses
microbiologiques.
ISO 8199 : Qualité de l’eau - Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-
organismes sur milieu de culture.
ISO 11133 : Microbiologie des aliments et de l’eau - Préparation, production, stockage et
essais de performance des milieux de culture.

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ISO 19458 : Qualité de l’eau - Échantillonnage pour analyse microbiologique.

3- Termes et définitions
3.1- bactéries coliformes : membres de la famille des Entérobactéries qui expriment la β-D-
galactosidase
3.2- Escherichia coli, E. coli : membre de la famille des Entérobactéries qui exprime la β-D-
galactosidase et la β-D-glucuronidase

4- Principe
Filtration d’une prise d’essai de l’échantillon sur une membrane filtrante, qui retient les
organismes, et placement de la membrane filtrante dans une boîte de gélose chromogène
coliforme. Incubation de la membrane filtrante à (36 ± 2) °C pendant (21 ± 3) h.
Comptage des colonies positives pour la β-D-galactosidase (couleur rose à rouge) en tant que
bactéries coliformes présomptives qui ne sont pas des E. coli. Pour éviter les résultats faux-
positifs, provoqués par les bactéries positives à l’oxydase, par exemple Aeromonas spp, les
colonies présomptives doivent être confirmées par une réaction négative à l’oxydase.
Comptage des colonies positives pour la β-D-galactosidase et la β-D-glucuronidase (couleur
bleu foncé à violet) en tant qu’E.coli. Les bactéries coliformes totales sont la somme des
colonies négatives à l’oxydase de couleur rose à rouge et de toutes les colonies de couleur
bleu foncé à violet.

5- Appareillage et verrerie
Matériel de laboratoire de microbiologie habituel, et en particulier :

5.1-Appareil adapté pour la stérilisation à la vapeur (autoclave), conformément aux

instructions de l’ISO 8199.
5.2- Incubateur, contrôlé par thermostat à (36 ± 2) °C.
5.3- pH-mètre, avec une exactitude de ± 0,1 unité entre 20 °C et 25 °C.
5.4- Appareil de filtration sur membrane.
5.5-Membranes filtrantes, composées d’esters de cellulose ou d’autres matériaux appropriés,
généralement d’environ 47 mm ou 50 mm de diamètre, présentant des caractéristiques de
filtration équivalentes à une porosité nominale de 0,45 μm, munies, de préférence, avec un
quadrillage.
5.6- Pinces désinfectées, pour la manipulation des membranes filtrantes.

6- Milieux de culture et réactifs

Pour la préparation des milieux de culture et des réactifs, voir l’ISO 8199 et l’ISO 11133.
Utiliser des ingrédients de qualité homogène et des produits chimiques de qualité analytique
reconnue ; suivre les instructions données dans l’Annexe B. Il est également possible
d’utiliser des milieux et réactifs disponibles dans le commerce, respectant les compositions
données dans l’Annexe B ; dans ce cas, suivre scrupuleusement les instructions du fabricant.
Pour la préparation des milieux de culture, utiliser de l’eau distillée ou dé-ionisée, exempte de
substances susceptibles d’inhiber la croissance bactérienne dans les conditions de l’essai et
conforme à l’ISO 3696.

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7- Échantillonnage
Prélever les échantillons et les livrer au laboratoire conformément à l’ISO 19458.

8- Mode opératoire
8.1- Préparation de l’échantillon
8.2- Filtration
8.3- Incubation et différenciation
9- Expression des résultats
À partir du nombre de colonies confirmées dénombrées sur la membrane filtrante (8.3),
calculer le nombre d’E.coli et de bactéries coliformes présentes dans 100 ml de l’échantillon
(ou d’un autre volume filtré) conformément à l’ISO 8199. Le dénombrement des bactéries
coliformes est la somme de toutes les colonies négatives à l’oxydase de couleur rose à rouge
et de toutes les colonies de couleur bleu foncé à violet. Les E. coli sont toutes les colonies de
couleur bleu foncé à violet.

10- Rapport d’essai

Le rapport d’essai doit contenir au moins les informations suivantes :
a)-la méthode d’essai utilisée faisant référence à la présente partie de l’ISO 9308 (ISO
9308-1 :2014) ;
b)- toutes les informations nécessaires à l’identification complète de l’échantillon ;
c)-les résultats exprimés conformément à l’Article 9 ;
d)-tout phénomène particulier observé au cours de l’analyse et toute opération non
spécifiée dans la présente partie de l’ISO 9308 ayant pu influer sur les résultats.

11- Assurance qualité

11.1 Généralités
Le laboratoire doit être doté d’un système de contrôle de la qualité clairement défini
garantissant que l’appareillage, les réactifs et les techniques sont adaptés à l’essai.
L’utilisation de contrôles positifs, de contrôles négatifs et de blancs fait partie de l’essai.
11.2-Essais de performance de la gélose chromogène pour bactéries coliformes (CCA)
11.3-Essais de performance de l’essai de recherche de l’oxydase.