Université Paris Sud

Ecole doctorale 418 :

de cancérologie

Laboratoire : Equipe oncologie moléculaire- compartimentation et dynamique

cellulaire, UMR144-CNRS, Institut Curie, Paris

Thèse de Doctorat
Science de la vie et de la santé

Par

Mélanie Mahé

Caractérisation des voies de signalisation des oncogènes

FGFR3 muté et FGFR3-TACC3 dans les carcinomes de vessie

Date de soutenance : 14/04/2015

Composition du jury :

Directeur de thèse : François Radvanyi Docteur (Institut Curie, Paris)

Rapporteurs : Serge Roche Docteur (CRBM, Montpellier)

Thierry Massfeleder Docteur (Université de Strasbourg)

Examinateurs : Phillipe Pourquier Docteur (IRBM, Montpellier)

Isabelle Bernard-Pierrot Docteur (Institut Curie, Paris)

Président : Christian Auclair Professeur (ENS Cachan)

T ABLE DES MATIERES

Chapitre I : Le cancer........................................................................................................ 1

1.1 Epidémiologie .......................................................................................................... 1

1.2 Les origines du cancer ........................................................................................... 2

1.2.1 Naissance des cellules clones cancéreuses ..................................................... 2

1.2.2 Progression de la tumeur et hétérogénéité tumorale ......................................... 5

1.3 Les Caractéristiques du cancer ............................................................................... 6

Chapitre II : Le Cancer de la vessie .................................................................................. 9

2.1 La vessie : Anatomie et fonction .............................................................................. 9

2.2 Epidémiologie .......................................................................................................... 9

2.3 Facteurs de risques ................................................................................................10

2.3.1 Tabagisme .......................................................................................................10

2.3.2 Facteurs génétiques ........................................................................................10

2.3.3 Facteurs environnementaux .............................................................................11

2.4 Classification histopathologique des tumeurs de vessie .........................................12

2.5 Origines des tumeurs de vessie .............................................................................14

2.6 Voies de progression tumorales .............................................................................17

2.6.1 Altérations moléculaires dans la voie des tumeurs papillaires ..........................18

2.6.2 Altérations moléculaires dans le pathway des CIS ...........................................20

2.7 Classification des tumeurs de vessie : tumeurs luminales et basales .....................25

Chapitre III : RTK, structure, activation, voies de signalisation et cancer..........................27

3.1 Les récepteurs à activité Tyrosine Kinase (RTK) ....................................................27

3.1.1 Structures et modes d’activation des RTK........................................................28

3.1.2 Activation des voies de signalisation par les RTKs...........................................32

3.2 RTKs et cancers .....................................................................................................34

3.2.1 voies de signalisation dérégulées dans le cancer.............................................34

3.2.2 RTK, voies de signalisations et cancer.............................................................36

3.2.3 Traitements thérapeutiques ciblant les RTKs et leurs voies de signalisations ..50
Chapitre IV : Les récepteurs FGFR : structure, activation, rôles dans le développement et
le cancer ..........................................................................................................................52

4.1 Structure et Activation ............................................................................................52

4.2 Rôles des récepteurs FGFR dans le développement osseux .................................54

4.3 Récepteurs FGFR et Cancers ...............................................................................61

4.3.1 Mutations, Surexpression et type tumoral ........................................................62

4.3.2 récepteurs FGFR et protéines de fusion .........................................................63

4.3.3 Mutations du récepteur FGFR3 et protéines de fusion .....................................65

4.3.4 Altérations du gène FGFR3 et kératoses séborrhéiques ..................................69

4.3.5 Altérations du gène FGFR3 et cancers hématologiques ..................................69

4.3.6 Altérations du gène FGFR3 et cancer de la vessie ..........................................72

Chapitre V : Traitements thérapeutiques actuels pour les tumeurs de vessie ..................75

5.1 Traitements des tumeurs n’envahissant pas le muscle ...........................................75

5.2 Thérapies pour les tumeurs de vessie envahissant le muscle (T2-T4)....................77

5.2.1 Tumeurs T2-T4 de phénotype basal-like et thérapie anti-EGFR.......................78

5.3 FGFR3 comme cible thérapeutique ........................................................................79

5.3.1 Inhibition de l’activité de FGFR3 par un inhibiteur chimique .............................79

5.3.2 Inhibition de l’activité de FGFR3 par un anticorps : le R3mAb ..........................80

Objectifs...........................................................................................................................82

Résultats..........................................................................................................................85

Chapitre I : Etude des voies de signalisation du récepteur FGFR3 muté et de la protéine de

fusion FGFR3-TACC3 dans les carcinomes de vessie .....................................................86

1.1 Introduction ............................................................................................................86

1.2 Discussion ............................................................................................................130

Chapitre II : Identification du réseau d’interaction de FGFR3 .........................................139

2.1 Introduction ..........................................................................................................139

2.2 Résultats ..............................................................................................................140

2.3 Discussion ............................................................................................................150

2.4 Méthodes .............................................................................................................152

Conclusion et perspectives ............................................................................................154

Bibliographie ..................................................................................................................161
T ABLE DES FIGURES

Figure 1 : Le cancer dans le monde en 2012, Cancer Research UK ................................. 1

Figure 2 : Naissance d’une « cellule souche cancéreuse » à partir des cellules souches,
des cellules progénétrices ou des cellules différenciées ayant acquis une mutation.
(Bjerkvig, Tysnes, Aboody, & Najbauer, 2005) .................................................................. 4
Figure 3 : Acquisitions de mutations et Hétérogénéité tumorale (Watson et al., 2013). ..... 6
Figure 4 : Les 10 caractéristiques du Cancer (Hanahan & Weinberg, 2011). .................... 7
Figure 5 : Les différentes thérapies existantes pour traiter le cancer basées sur les 10
caractéristiques du cancer (Hanahan & Weinberg, 2011) ................................................ 8
Figure 6 : Représentation anatomique de la vessie ©The McGraw Hill companies .......... 9
Figure 7 : Représentation schématique de la classification des différents stades des
tumeurs de vessie (Aubertin, 2009) .................................................................................14
Figure 8 : Les différents sous types cellulaires composant l’épithélium la vessie (Kobayashi,
Owczarek, McKiernan, & Abate-Shen, 2014) ...................................................................15
Figure 9 : origines des tumeurs papillaires, des tumeurs CIS, et des tumeurs SCC (Van
Batavia et al., 2014). ........................................................................................................16
Figure 10 : Voies de progression tumorale des carcinomes de vessie .............................17
Figure 11 : expression de PTEN et phospho-AKT dans les tumeurs de vessie (Calderaro et
al., 2014)..........................................................................................................................21
Figure 12 : Phosphorylation de RB et conséquences fonctionnelles (Mitra et al., 2006) ...22
Figure 13 : Combinaison des fréquences de mutations de FGFR3 et TP53 en fonction du
groupe stade/grade (Yann Neuzillet et al., 2012). ............................................................23
Figure 14 : Analyse en cluster de 57 tumeurs de vessie versus 5 normaux en utilisant le
niveau d’expression des gènes dans les 7 régions épigénétiquement réprimées (Vallot et
al., 2011)..........................................................................................................................24
Figure 15 : Classification des différents sous-groupes de tumeurs de vessie en fonction de
leurs altérations moléculaires, d’après les études du TCGA, de Lund et du MDA. Dans cette
figure la classification prise comme référence est celle du MDA (Choi et al., 2014). ........25
Figure 16 : Origines probable des tumeurs basales et luminales ayant envahies le muscle
et altérations moléculaires associées (Choi et al., 2014). .................................................26
Figure 17 : Les 20 sous-famille de RTKs (Lemmon & Schlessinger, 2010) ......................27
Figure 18 : Fixation du ligand et activation des RTKs : TrkA, KIT, FGFR et ErbB (Lemmon
& Schlessinger, 2010) ......................................................................................................29
Figure 19 : Dimèrisation des RTKs et activation (Lemmon & Schlessinger, 2010) ...........31
Figure 20 : Complexe multiprotéique conduisant à l’activation des voies de signalisation
activées par les RTKs ......................................................................................................33
Figure 21 : Intégration à la membrane plasmique par la PLC gamma des signaux générés
par l’activation des RTK (Lemmon & Schlessinger, 2010) ................................................34
Figure 22 : Représentation schématique des voies de signalisation dérégulées dans le
cancer (Hanahan & Weinberg, 2011) ...............................................................................35
Figure 23 : Voies de signalisation connues pour être dérégulées et impliqués dans la
progression tumorale (Vogelstein et al., 2013) .................................................................35
Figure 24 : Voies de signalisation majeures activées par les facteurs de croissance et leurs
récepteurs (Witsch, Sela, & Yarden, 2011) ......................................................................37
Figure 25 : Voies de signalisation activées par les protéines Ras (Berndt et al., 2011) ....38
Figure 26 : Modèle d’activation de PI3K (Vivanco & Sawyers, 2002). ..............................39
Figure 27 : Voies de signalisation de PI3K/AKT (Vivanco & Sawyers, 2002) ...................40
Figure 28 : Voies de signalisation activées par les MAPK suite à un stress (Wagner &
Nebreda, 2009). ...............................................................................................................42
Figure 29 : Activation de la voie de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK par les RTK (H. J.
Kim & Bar-Sagi, 2004) .....................................................................................................44
Figure 30 : Les diverse propriétés de HuR dans le développement du cancer à travers la
régulation de ses cibles (Wang et al. 2013). ....................................................................45
Figure 31 : Mécanisme de stabilisation des ARNm par HuR (Jun Wang et al., 2013). .....47
Figure 32 : Représentation des différents modes d’activation des protéines STAT (Yu &
Jove, 2004) ......................................................................................................................48
Figure 33 : Contrôle de la survie et de la croissance cellulaire par les protéines STAT (Yu
& Jove, 2004) ..................................................................................................................49
Figure 34 : Représentation des voies de signalisation oncogéniques (Lee et al., 2011) ...50
Figure 35 : Ciblage thérapeutique des voies de signalisation des RTKs dans les tumeurs
solides (Witsch et al., 2011) .............................................................................................51
Figure 36 : Structure des récepteurs FGFR (Mason, 2007)..............................................52
Figure 37 : Représentation de la structure prototypique d’un récepteur FGF (Haugsten,
Wiedlocha, Olsnes, & Wesche, 2010b). ...........................................................................53
Figure 38 : Régulation de l’ostéogénèse par les récepteurs FGFR1, 2 et 3 lors du
développement selon le mode intra-membraneux (Su et al., 2014)..................................54
Figure 39 : Représentation des principales voies activées par les récepteurs FGFR au cours
du développement squelettique dans le mode endochondral (SU ET AL., 2014). ..............55
Figure 40 : Les deux isoformes de FGFR3 : FGFR3b, FGFR3c. ......................................57
Figure 41 : Knock out de FGFR3 dans un modèle murin (Su, Xu, et al., 2010) ................57
Figure 42 : Les différentes mutations de FGFR3 dans les chondrodysplasies (Harada et al.,
2007) ...............................................................................................................................59
Figure 43 : Activation du récepteur, localisation et sévérité des différentes
chondrodysplasies (Harada et al., 2007) ..........................................................................60
Figure 44 : Activation des pathways P38 et ERK1/2 par FGFR3 et conséquences sur la
croissance et la mineralisation osseuse (Su, Sun, et al., 2010) ........................................60
Figure 45 : Structure, voies de signalisation, et dérégulations des récepteurs FGFR dans le
cancer (a N. Brooks, Kilgour, & Smith, 2012). (1 ; 2) : régulation via les FGF ligands, (3 ;4) :
Mutations et protéines de fusion, (5) : Amplification du gène codant pour le récepteur. ...62
Figure 46 : Résumé des principales altérations touchant les récepteurs FGFR dans les
cancers humains (Haugsten et al., 2010) .........................................................................63
Figure 47 : Représentation schématique des protéines de fusion impliquant les FGFR
identifiés (Y. Wu et al., 2013) ...........................................................................................64
Figure 48 : mutations de FGFR3 sur les exons 7, 10 et 15 ..............................................65
Figure 49 : Fusion génomique entre l’exon 17 de FGFR3 et l’intron 7 de TACC3 ; Dans
l’ARNm de fusion qui en résulte l’exon 16 de FGFR3 est épissé en 5’ avec l’exon 8 de
TACC3 dans le glioblastome (Singh et al., 2013) .............................................................66
Figure 50 : Correction de la séparation prématurée des chromatides sœurs par le
PD173074 (inhibiteur de FGFR3) dans les cellules exprimant la protéine FGFR3-TACC3
(Singh et al., 2013) ..........................................................................................................67
Figure 51 : La formation du produit de fusion FGFR3-TACC3 échappe à la régulation par le
mir99a. (Babic & Mischel, 2013) ......................................................................................68
Figure 52 : Translocation t(4 ;14)(p16 ;q32) retrouvée dans les MM (M Chesi, Nardini, &
Lim, 1998)........................................................................................................................69
Figure 53 : Mécanisme d’activation de RSK2 par le récepteur FGFR3 dans les Myélomes
Multiples et les leucémies (Kang et al., 2007) ..................................................................71
Figure 54 : gènes de fusion FGFR3-BAIAP2L1 et FGFR3-TACC3 dans les lignées
cellulaires humaines de tumeurs vessie (Williams et al., 2013) ........................................73
Figure 55 : Représentation schématique des voies de signalisation activées par le récepteur
FGFR3 muté dans les tumeurs de vessie (X.-R. Wu, 2005) .............................................74
Figure 56 : Représentation schématique des mécanismes d’action du BCG (Y Neuzillet &
Lebret, 2010) ...................................................................................................................76
Figure 57 : Représentation schématique des traitements thérapeutiques actuels appliqués
en fonction du stade dans le cancer de la vessie. TUR : Trans-urétral Résection ; BCG :
Bacille Calmette-Guérin. (Kobayashi, Owczarek, McKiernan, & Abate-Shen, 2014) ........77
Figure 58 : Représentation schématique de l’inhibition de l’activité oncogénique du
récepteur FGFR3 muté (formation d’un pont disulfure) avec l’anticorps R3mAb. (Hadari et
Schlessinger., 2009) ........................................................................................................81
T ABLES

Table 1 : Classification TNM des carcinomes urothéliaux (Pedrosa et al., 2014) .............12
Table 2: Classification des carcinomes de vessie par grade selon l’OMS en 1973 et 2004.
European Association of Urology .....................................................................................13
Résumé

Les tumeurs de vessie suivent deux voies de progression tumorale. La voie des carcinomes
in situ (CIS) qui progressent pour envahir la membrane basale puis le muscle, et la voie
des tumeurs papillaires de bas grade qui progressent peu mais qui récidivent fréquemment.
Environ 65% des tumeurs papillaires de bas grade présentent une mutation du gène
FGFR3 et récemment des protéines de fusion FGFR3-TACC3 ont été observées dans les
tumeurs de vessie (dans 10% des tumeurs invasives). Le rôle oncogénique du récepteur
FGFR3 muté et de FGFR3-TACC3 a été démontré in vivo et in vitro. Cependant, les voies
de signalisation du récepteur FGFR3 muté ou de FGFR3-TACC3 sont à l’heure actuelle
très peu caractérisées.

Dans ce contexte, deux approches ont été mises en place pour caractériser ces voies de
signalisation. La première s’appuie sur l’étude de la phosphorylation des protéines p38,
AKT et ERK1/2 par le récepteur FGFR3 muté (S249C) ou sauvage dans la lignée cellulaire
fibroblastique NIH3T3, et a permis d’identifier les protéines p38 et AKT comme activées par
le récepteur FGFR3 muté et nécessaire pour induire la transformation cellulaire. L’étude de
l’activation de ces deux voies de signalisation a été réalisée dans des lignées cellulaires
dérivées de tumeurs de vessie exprimant le récepteur FGFR3 muté ou FGFR3-TACC3 de
manière endogène et a montré que leur activation était dépendante de celle du récepteur
FGFR3. De plus nous avons montré que les protéines p38 et AKT sont impliquées dans le
maintien d’une boucle de rétro-contrôle positive entre FGFR3 et MYC : l’activation de
FGFR3 induit une surexpression de MYC qui en retour promeut l’expression de FGFR3. La
seconde approche est basée sur une étude visant à identifier les partenaires protéiques de
FGFR3 par spectrométrie de masse après immunoprécipitation de celui-ci qui avait été
réalisée précédemment au laboratoire. L’analyse des données a permis l’obtention d’une
liste de 60 protéines identifiées comme partenaires protéiques de FGFR3 avec une grande
confiance. La construction d’un réseau à partir de cette liste n’a pas été possible (trop peu
d’interactions existant entre ces protéines), nous avons donc développé un algorithme
(PEPPER) en collaboration avec un étudiant en bio-informatique au laboratoire, Rémy
Nicolle, pour proposer un réseau de signalisation de FGFR3.

Les deux approches mises en place au cours de cette thèse nous ont permis de mieux
caractériser les voies de signalisation du récepteur FGFR3. L’identification d’une boucle de
rétrocontrôle entre FGFR3 et MYC a permis de mieux comprendre pourquoi le récepteur
FGFR3 possède des propriétés oncogéniques, et de proposer les protéines p38 et AKT
comme cibles thérapeutiques potentielles pour traiter les tumeurs de vessie exprimant le
récepteur FGFR3 altéré. La construction du réseau de signalisation de FGFR3 via PEPPER
donne une vue d’ensemble des voies de signalisation de FGFR3 et ouvre de nouvelles
pistes à étudier.

Mots Clés
RTK, FGFR3, oncogènes, voies de signalisation, Réseau d’interaction, cancer de la vessie
Discipline
Cancérologie, Médecine, Santé
Laboratoire
Equipe oncologie moléculaire-Institut Curie-UMR144 CNRS
26 rue d’Ulm, 75248 PARIS cedex 05
Remerciements

En premier lieu je tiens à remercier mon directeur de thèse, François Radvanyi et ma co-
directrice de thèse, Isabelle Bernard-Pierrot, pour m’avoir accueillie au sein de leur
laboratoire et m’avoir fait confiance tout au long de cette thèse. Je suis heureuse d’avoir
été formée à la recherche par des chercheurs passionnés, à l’écoute, et avec lesquels j’ai
pu partager de très nombreuses idées scientifiques. Je remercie les membres de l’équipe
oncologie moléculaire, en particulier Marion pour son amitié et son soutien sans faille dans
les bons moments comme dans les moments de doute, et pour avoir pris le temps de relire
cette thèse. Je remercie Rémy pour toutes nos discussions « passionnées » à propos de
certains gènes, et pour tous les moments partagés au laboratoire, et pour sa bonne humeur
et son optimisme. Je remercie Jennifer, d’avoir accepté de me suivre dans le projet vitamine
D (pourvu que ça marche !), de m’avoir soutenue et écoutée et pour tous nos « débats »
où nous étions finalement d’accord ainsi que pour sa bonne humeur quotidienne et son
dynamisme. Je remercie chaleureusement les autres membres de l’équipe : Elodie pour sa
bonne humeur permanente, Florent pour ces très bons conseils scientifiques et les bons
moments passés au laboratoire, Alice pour son soutien, sa très bonne humeur et son aide
souvent très précieuse. Je remercie Vera (la tranquillité incarnée, ce que j’admire
sincèrement), Hélène, Daniela, Trang qui a partagé mes moments d’incompréhension
totale face à certains résultats…, Thibault, Clem, Céline pour sa bonne humeur et son
dynamisme. Je remercie Meriem (que dire…) pour sa bonne humeur (oh mince, oh zuttt !!!),
les moments de compréhension et d’incompréhension face à certains situations au
laboratoire, et pour m’avoir très souvent écouté et supporté. Je remercie Stéphanie,
Natacha, Massy, Christine et Nicolas pour tous les moments partagés au laboratoire et au
badminton. Je remercie Fatima pour sa bonne humeur quotidienne. Je remercie une
personne chaleureuse, Michèle, toujours à l’écoute dans les moments difficiles et sans qui
certains problèmes, administratifs et humains, auraient peut-être été plus difficiles à
résoudre. Je remercie tout particulièrement mes proches pour m’avoir soutenu et supporté
tout au long de mes études et plus particulièrement pendant ces trois ans et demi de thèse
et pour avoir cru en moi. C’est votre soutien qui m’a permis de comprendre que rien n’est
impossible ou insurmontable. Je remercie Simon et Alice avec qui je partage ma passion
pour les sciences depuis quelques années déjà, et qui ont toujours été là pour me soutenir,
et m’encourager dans les moments difficiles. Simon, il y en aurait beaucoup trop à écrire…
Enfin je remercie Adrien pour m’avoir soutenu et encouragé sans faille du début à la fin,
tout au long de cette thèse et pour avoir pris le temps de lire et relire cette thèse.
INTRODUCTION
C HAPITRE I : L E CANCER

1.1 E PIDEMIOLOGIE

Le cancer est une maladie qui représente un problème de santé publique majeur, à l’origine
de plus de 14 millions de nouveaux cas et de 8,2 millions de décès annuels dans le monde
(chiffres 2012, selon l’OMS) - les cancers du poumon, du sein, du côlon et de la prostate
étant les plus fréquents. La distribution mondiale de la fréquence des différents types de
cancer et des décès dus aux différents cancers est schématiquement représentée ci-
dessous (figure 1) :

F IGURE 1 : L E CANCER DANS LE MONDE EN 2012, C ANCER R ESEARCH UK

Le cercle extérieur correspond au nombre de nouveaux cas de cancers par an, il indique
la fréquence des différents cancers et individualise les cancers les plus fréquents :
cancers du poumon, du sein, du côlon et de la prostate. Le cercle intérieur correspond au
nombre de décès par an du cancer, il individualise les cancers les plus meurtriers :
cancers du poumon, du foie, de l’estomac et de la prostate.

Cinq facteurs de risque sont principalement mis en cause : un indice de masse corporelle
trop élevé, une mauvaise alimentation, peu d’activité physique, la consommation d’alcool
et de tabac. Le tabac est le principal facteur de risque causant 20% des décès par cancer
et 70 % des décès du cancer du poumon à travers le monde selon l’organisation mondiale
pour la santé (OMS). Les infections chroniques à certains virus jouent un rôle important
dans l’apparition des cancers du foie (hépatite B, HBV ; hépatite C ; HCV) et de l’utérus
(papillomavirus, HPV).

1
En France on dénombre 365 000 nouveaux cas de cancers par an selon l’INCa (Institut
National du Cancer). Malgré des progrès récents, un patient sur deux décèdera de son
cancer.

1.2 L ES ORIGINES DU CANCER

Le cancer est une maladie du soi, au cours de laquelle des cellules normales se mettent à
proliférer de manière anarchique suite à l’acquisition de mutations génétiques. Ces
mutations peuvent être des mutations dites spontanées ou des mutations qui apparaissent
suite à des « agressions » dues à certains facteurs environnementaux. Si l’organisme ne
les élimine pas ou si elles échappent à la mort cellulaire programmée (apoptose), ces
cellules vont pouvoir envahir l’organe dans lequel elles sont apparues puis l’organisme. Un
cancer peut être issu de mutations génétiques apparues dans une cellule germinale mais
aussi dans une cellule somatique ou une cellule souche.

1.2.1 N AI S SA N C E D ES C E LL U L ES C LO N E S C AN C ER E US E S

Mutations génétiques et cancer

Le cancer est généralement défini comme une maladie complexe, ou l’accumulation dans
une cellule de mutations génétiques conduit à une transformation maligne de celle-ci. La
capacité d’une seule cellule transformée à disséminer la maladie à tout l’organisme suit au
départ un processus linéaire d’acquisition de nouvelles mutations telle que la substitution
de paires de bases dans l’ADN, les insertions ou délétions de quelques paires de bases
(indels), les réarrangements chromosomiques, les gains ou les pertes du nombre de copies
d’un gène. Récemment des mutations de gènes régulant des processus épigénétiques ont
été identifiées (Watson, Takahashi, Futreal, & Chin, 2013). Outre les mutations génétiques,
des altérations purement épigénétiques sont vraisemblablement impliquées dans la
tumorigénèse.

Deux types de mutations peuvent être impliqués dans l’apparition du cancer et sa

progression : les mutations spontanées et les mutations dues à l’environnement cellulaire.
Les mutations dites spontanées ne sont pas dues à des agressions extérieures provenant
de l’environnement cellulaire. On peut citer par exemple les mutations dues à un
mésappariement des bases lors de la réplication de l’ADN. Les mutations qui ne sont pas
spontanées sont dues à l’influence de facteurs environnementaux (stress, inflammation,
irradiations telles que les UV dans le cas du mélanome…). Les mutations spontanées sont
les plus fréquemment retrouvées dans le cancer.

2
Très récemment, une étude basée sur les données statistiques du cancer a montré que la
probabilité de développer un cancer due à l’apparition de mutations spontanées est corrélée
au nombre de divisions cellulaires au sein d’un tissu et que l’apparition d’un cancer dû à ce
processus n’était pas prévisible. La probabilité de développer un cancer n’est pas la même
au sein des différents tissus et organes de l’organisme. Ainsi la probabilité de développer
un cancer du poumon est de 6,9%, de 1,08% pour le cancer de la thyroïde alors qu’il n’est
que 0,00072 % pour le cancer du cartilage du larynx. Cependant il n’était jusqu’à présent
pas possible d’en établir les causes exactes. L’étude réalisée par Tomasetti et Vogelstein
propose un élément de réponse basé sur le principe suivant : plus le renouvellement
cellulaire au sein d’un tissu est important, plus la probabilité de développer un cancer au
sein de ce tissu est grande (Tomasetti & Vogelstein, 2015). Le renouvellement des cellules
souches au sein des tissus et organes permet le maintien de l’homéostasie et a lieu plus
fréquemment dans certains d’entre eux. Plus le renouvellement de ces cellules souches est
élevé, plus le nombre de divisions cellulaire et de réplication de l’ADN (à chaque division)
est important. Ainsi, la probabilité que l’apparition d’une mutation spontanée puisse donner
naissance à une cellule « souche » cancéreuse, est corrélée au nombre de divisions
cellulaires au sein d’un tissu. Cette étude conclut que les mutations spontanées
représenteraient environ 2/3 des mutations mises en cause dans l’apparition de cancers,
tandis que les mutations dues aux facteurs environnementaux seraient responsables d’un
peu moins d’1/3 des cancers (les prédispositions génétiques ne faisant ni parties des
mutations spontanées, ni des mutations dues à l’environnement dans le cas présent).
Cependant de manière surprenante cette étude n’inclut pas plusieurs cancers fréquents
(dont les cancers du sein et de la prostate). Qu’en serait-il si cela était le cas ? De plus cette
étude indique que les mélanomes sont dus majoritairement au hasard, or clairement
l’environnement est impliqué dans l’apparition de ces tumeurs (exposition au soleil).

L’acquisition d’une mutation génétique au sein d’un type cellulaire composant un tissu
(cellule souche, cellule progénétrice, cellule différenciée), qu’elle soit spontanée ou due à
l’environnement n’est pas obligatoirement synonyme de cancer. On distingue en effet les
mutations dites « driver » des mutations dites « passengers ». Une mutation « driver » va
conférer un avantage sélectif directement ou indirectement à la cellule dans laquelle elle
apparaît. Cette mutation va être à l’origine de la dérégulation d’un processus cellulaire
particulier défini en fonction du gène au sein duquel elle est apparue, et va alors contribuer
à l’initiation de la progression tumorale. Quant aux mutations dites « passengers », ce sont
des mutations qui ne confèrent aucun avantage sélectif (Vogelstein et al., 2013).

Les mutations spontanées ou dues à l’environnement peuvent apparaître au sein d’un

organe dans les cellules souches, les cellules progénitrices ou différenciées, qui le

3
composent. La cellule ayant acquis des propriétés tumorales suite à l’acquisition d’une
mutation est alors appelée cellule souche cancéreuse. Cette cellule est à l’origine de la
maladie et initie la formation de la tumeur. La naissance d’une « cellule souche
cancéreuse » à partir de l’acquisition d’une mutation spontanée ou l’apparition d’une
mutation due à l’environnement dans un type des 3 types cellulaires définis ci-dessus et à
l’origine de l’initiation de la progression tumorale est représentée ci-dessous (figure 2) :

F IGURE 2 : N AISSANCE D ’ UNE « CELLULE SOUCHE CANCEREUSE » A PARTIR DES CELLULES

SOUCHES , DES CELLULES PROGENETRICES OU DES CELLULES DIFFERENCIEES AYANT ACQUIS

UNE MUTATION . (Bjerkvig, Tysnes, Aboody, & Najbauer, 2005)

Les « cellules souches cancéreuses » peuvent apparaître après plusieurs mutations

spontanées dans une cellule souche présente dans une « niche » de cellules souches au
sein d’un tissu. Ces mutations peuvent également apparaître dans les cellules
progénitrices ou dans des cellules différenciées. Ces cellules souches cancéreuses
peuvent aussi apparaître suite à des mutations dans ces trois types cellulaires (souches,
progénitrices, différenciées) sous l’influence de facteurs environnementaux (UV (exemple
du mélanome), irradiation, carcinogènes, tabac…). Ces cellules souches cancéreuses sont
à l’origine de l’initiation de la progression tumorale.

4
Un autre concept pourrait aussi expliquer la naissance des tumeurs non seulement à partir
d’une cellule souche ou d’une cellule différenciée ayant acquis une ou plusieurs mutations
mais à partir de la fusion de ces deux types cellulaires.

Autre mode d’acquisition de mutations : la fusion cellulaire

Au sein d’un tissu, les cellules différenciées qui le composent côtoient des « niches » ou
« réservoirs » de cellules souches. Lors du développement et de la réparation tissulaire, les
cellules souches et les cellules différenciées peuvent fusionner pour donner naissance à
de nouvelles cellules différenciées. Or si une cellule souche et une cellule différenciée ayant
acquis des mutations génétiques, l’une ou l’autre ou les deux, fusionnent, le mélange de
leur matériel génétique altéré peut donner naissance à des clones cellulaires transformés
(Bjerkvig et al., 2005).

1.2.2 P R O GR E S SI O N D E LA T U M EU R E T H ET E R O G EN EI T E T U MO R AL E

Les tumeurs peuvent fréquemment évoluer vers ce qui est nommé l’hétérogénéité tumorale.
On peut prendre l’exemple d’un tissu normal au sein duquel une cellule différenciée a
accumulé des mutations et acquis des propriétés transformées. Cette cellule devient alors
la cellule de départ qui est à l’origine de la formation de la tumeur pouvant donner naissance
à de nouveaux clones.

Dans un tissu normal, une mutation A va apparaître dans une cellule. Si cette mutation est
dite « driver » elle va permettre à la cellule de proliférer et de donner naissance à de
nouvelles cellules. Si une mutation B apparaît au sein de cette première population, il peut
alors y avoir des cellules porteuses de la mutation A, et des cellules porteuses à la fois de
la mutation A mais aussi de la mutation B. Au cours de la progression tumorale, ces cellules
qui présentent les mutations AB peuvent acquérir d’autres mutations que nous nommerons
ici C et D. On distinguera alors des cellules porteuses des mutations A, B et C ou A, B et
D. Dès lors, une tumeur peut être constituée de clones cellulaires provenant de la même
cellule de départ mais ne présentant pas exactement les mêmes mutations génétiques. Il y
aura alors des « régions » au sein d’une tumeur où l’on retrouve des altérations génétiques
différentes (figure 3).

Cependant un autre cas de figure peut avoir lieu, la cellule d’origine au sein de laquelle est
apparue la mutation A peut acquérir une mutation F. Cette seconde mutation peut conférer
à la cellule la capacité à envahir tout l’organisme sous forme de métastases. Cette mutation
F peut aussi bien apparaître dans les clones cellulaires, porteurs des mutations A et B. Mais
elle peut aussi apparaître dans les cellules porteuses des mutations A, B, C ou A, B et D
qui composent les deux « régions » de la tumeur (figure 3).

5
F IGURE 3 : ACQUISITIONS DE MUTATIONS ET H ETEROGENEITE TUMORALE (Watson et al., 2013).

L’hétérogénéité tumorale peut représenter un problème majeur pour le traitement des

cancers dans lesquels elle est présente. Si au sein d’une même tumeur une seule cible
thérapeutique est prise en compte pour le traitement, mais qu’elle n’est pas exprimée dans
la totalité des cellules composant la tumeur, cela peut aboutir à des phénomènes de
résistance au traitement et des échecs thérapeutiques. C’est pourquoi la caractérisation
des altérations moléculaires présentent au sein d’une tumeur est importante.

1.3 L ES C ARACTERISTIQUES DU C ANCER

Six caractéristiques propres aux cellules cancéreuses ont été initialement proposées
(Hanahan & Weinberg, 2000). Ces caractéristiques sont : l’indépendance vis-à-vis des
signaux prolifératifs, l’échappement aux signaux suppresseurs de croissance, la capacité à
envahir l’organe dans lequel la tumeur est apparue, puis le reste de l’organisme via les
métastases, l’induction de l’angiogenèse, la résistance à la mort cellulaire (apoptose) et
une capacité à proliférer de manière illimitée (Figure 4A). Une réflexion plus approfondie et
les récentes recherches et découvertes sur le cancer ont permis de rajouter 4 autres
caractéristiques que sont : la dérégulation des voies métaboliques (effet Warburg),
l’instabilité génomique et les mutations génétiques, l’inflammation comme facteur
promouvant la progression tumorale et enfin la capacité à échapper au système immunitaire
(figure 4B), (Hanahan & Weinberg, 2011).

6
 F IGURE 4 : L ES 10 CARACTERISTIQUES DU C ANCER (Hanahan & Weinberg, 2011).

A : Les 6 premières caractéristiques du cancer ; B : Les 4 dernières caractéristiques du

cancer ajoutées récemment suite aux dernières études et à une réflexion plus
approfondie.

La compréhension des mécanismes impliqués dans la progression tumorale a permis de

caractériser les différentes propriétés des cellules cancéreuses et ainsi de développer
différents types de drogues spécifiques à chacune de ces propriétés. A l’heure actuelle, ces
10 caractéristiques propres au développement tumoral peuvent être ciblées par un
traitement thérapeutique visant l’angiogenèse, l’inflammation, l’échappement à la mort
cellulaire ou encore au système immunitaire. Les propriétés des cellules cancéreuses
ciblées par ces différentes drogues sont représentées ci-après (figure 5) :

7
 F IGURE 5 : L ES DIFFERENTES THERAPIES EXISTANTES POUR TRAITER LE CANCER BASEES SUR
LES 10 CARACTERISTIQUES DU CANCER (Hanahan & Weinberg, 2011)

Le cancer étudié au cours de cette thèse est le cancer de la vessie. Celui-ci sera donc
détaillé ci-après selon les critères suivants : épidémiologie, facteurs de risques,
classification histopathologique, voies de progression tumorales et altérations moléculaires
connues.

8
C HAPITRE II : L E C ANCER DE LA VESSIE

2.1 L A VESSIE : A NATOMIE ET FONCTION

La vessie est un organe creux dont le rôle est de stocker et d’évacuer l’urine excrétée par
les reins. Elle se subdivise en trois couches principales : la muqueuse, la sous-muqueuse,
et le muscle. La muqueuse, est une couche de cellules qui tapisse l’intérieur de la vessie.
Elle est aussi appelée urothélium ou épithélium transitionnel. C’est cette muqueuse qui se
trouve fréquemment au contact directe de l’urine, et donc potentiellement de substances
toxiques que celle-ci peut contenir. La sous-muqueuse est une couche de tissu conjonctif
qui sépare la muqueuse et la musculeuse, dans cette seconde couche se trouve des
vaisseaux sanguins, de nerfs et des glandes. Elle est aussi appelée Lamina Propria, tissu
sous-urothéliale ou encore stroma. La musculeuse quant à elle est constituée de trois
couches de tissu musculaire, s’étendant jusqu’à l’extérieur de la sous-muqueuse. Cette
troisième couche est aussi appelée muscle lisse, musculeuse longitudinale ou encore
musculeuse externe.

F IGURE 6 : R EPRESENTATION ANATOM IQUE DE LA VESSIE ©T HE M C G RAW H ILL COMPANIES

INC .

2.2 E PIDEMIOLOGIE

Le cancer de la vessie est la 11e cause de cancer dans le monde. On dénombre environ
330 000 nouveaux cas par an, la plupart dans les pays industrialisés, notamment en
Europe et en Amérique du nord. C’est le 6e cancer en termes d’incidence. La probabilité de
développer un cancer de vessie est de 4% chez les hommes et 1,2% chez les femmes. Le
risque de développer un cancer de vessie apparaît surtout après 60 ans. L’âge moyen au
premier diagnostic est de 69 ans chez l’homme et 71 ans chez la femme. Les cancers de

9
vessie sont la cause de 130 000 décès par an, soit 3% des décès par cancer. Les décès
dû à un cancer de vessie sont 5 fois plus élevé chez l’homme que chez la femme.
L’apparition des tumeurs de vessie peut s’expliquer grâce à plusieurs facteurs de risque,
notamment le tabagisme.

En France, le cancer de vessie occupe le 5e rang en termes d’incidence juste après les
cancers du sein, les cancers colorectaux, et les cancers du poumon. On dénombre plus de
10 000 nouveaux cas par an.

2.3 F ACTEURS DE RISQUES

Trois facteurs de risques principaux ont été identifiés comme impliqués dans l’apparition et
le développement des tumeurs de vessie : le tabagisme, les facteurs génétiques (déficience
pour certaines enzymes de détoxification), et les facteurs environnementaux (présence de
certains produits dans l’eau de boisson comme le chlore ou l’arsenic, infections, expositions
professionnelles, pollution atmosphérique).

2.3.1 T A BA GI SM E
De nombreuses études épidémiologiques ont clairement montré qu’il existe un lien fort
entre le tabagisme et le risque de développer un cancer de vessie, avec un ratio dose
réponse (nombre de cigarettes par jour et nombre d’années de consommation). Le risque
de développer une tumeur de vessie est trois fois plus élevé chez les fumeurs en
comparaison aux non-fumeurs (Zeegers, Kellen, Buntinx, & van den Brandt, 2004). Au
moins 43 substances reconnues comme étant carcinogènes chez l'animal ont été
retrouvées dans le tabac (Phillips & Venitt, 2012). Cependant les mécanismes par lesquels
ces substances carcinogènes contenues dans une cigarette induisent la formation de
tumeurs de vessie ne sont pas clairement montrés.

2.3.2 F A CT E UR S G E N E T I Q U ES

On estime qu’un descendant direct d’un patient atteint d’un cancer de vessie a un risque
augmenté de 50% à 100% de développer à son tour la maladie. Il existe en effet des gènes
liés au système de détoxification, dont la déficience peut favoriser l’apparition de la maladie.
Ainsi les individus présentant une déficience en enzymes NAT1 et NAT2 ont un risque plus
élevé de développer une tumeur de vessie (faible capacité à éliminer de la vessie les
métabolites N-hydroxylés),(A. K. Badawi, Hirvonen, Bell, Lang, & Kafflubar, 1995). L’autre
facteur génétique pouvant être en cause dans le développement de tumeurs de vessie est
une délétion homozygote conduisant à une déficience pour l’activité enzymatique de la

10
GSTM1 ou GSTP1b, qui sont impliqués dans la détoxification des hydrocarbures
aromatiques polycycliques (Harries, Stubbins, Forman, Howard, & Wolf, 1997).

2.3.3 F A CT E UR S EN V I R O N N E M EN T A U X

Eau de boisson : Il existe une corrélation entre la consommation d’eau potable désinfectée
au chlore et le risque de développer un cancer de vessie. Le contact du chlore avec la
matière organique contenu dans l’eau produit des hydrocarbures halogénés qui peuvent
jouer le rôle de carcinogènes (Boorman et al., 1999; King & Marrett, 1996).

Arsenic : L’arsenic et ces métabolites peuvent conduire à l’apparition de cancers de vessie

mais aussi de cancers du rein. L’exposition à ces substances peut avoir lieu via l’eau de
boisson comme pour le chlore, certains herbicides utilisés pour l’agriculture, ou encore lors
des traitements de certaines leucémies et lymphomes (chimiothérapie au trioxyde
d’arsenic),(Chow et al., 1997; Kitchin, 2001). Les mécanismes impliquant l’arsenic
inorganique dans l’apparition de cancer les cellules urothéliales incluent les dommages dus
à un stress oxydatif, des effets sur les mécanismes épigénétiques et des interférences avec
la réparation de l’ADN. Ces effets de l’arsenic dans la vessie sont reconnus comme
directement impliqués dans la carcinogénèse urothéliale (Saint-Jacques, Parker, Brown, &
Dummer, 2014).

Infections : L’infection par le parasite Schistosoma haematobium dans la vallée du Nil est
responsable d’une métaplasie épidermoïde de l’urothélium. Cette infection, couplée à
d’autres infections urinaires chroniques et/ou une exposition aux nitrosamines conduirait à
une plus forte fréquence d’apparition de tumeurs de vessie (A. F. Badawi, 1996; El-
Bolkainy, Mokhtar, Ghoneim, & Hussein, 1993). A l’heure actuelle les infections par des
virus dont les HPV sont suspectées d’être impliquées dans l’apparition de cancers de vessie
(TCGA, 2014) mais le lien n’a pas été clairement démontré.

Néphropathie endémique des Balkans : La néphropathie est une affection du rein, elle
est peut être glomérulaire, vasculaire, interstitielle ou tubulaire. La néphropathie endémique
des Balkans, due probablement à la présence d’acide aristolochique dans les plantes est
de type tubulo-interstielle et est associée à un risque accru de développer une tumeur
urothéliale sur l’ensemble de l’appareil urinaire (Stefanovic, Toncheva, Atanasova, &
Polenakovic, 2006).

Expositions professionnelles : le lien entre le développement de cancers de vessie et

l’exposition à des produits utilisés dans certains milieux industriels a clairement été
démontré. On distingue notamment l’exposition aux hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP) utilisés en métallurgie et sidérurgie pour la production de fer, de coke,

11
d’acier et d’aluminium, mais aussi présentes dans la cigarette, l’exposition aux amines
aromatiques présente dans l’industrie du caoutchouc des colorants, et lors de l’utilisation
de pesticides dans agriculture, et enfin l’exposition aux nitrosamines que l’on retrouve dans
la cigarette et les huiles minérales.

Pollution : Il a récemment été montré que la pollution atmosphérique pouvait jouer un rôle
dans l’apparition des tumeurs de vessie (Loomis et al., 2013).

2.4 C LASSIFICATION HISTOPATHOLOGIQU E DES TUMEURS DE V ESSI E

La classification histopathologique des tumeurs de vessie est faite grâce à deux

classifications. La première est la classification TNM (Tumor, Nodes, Metastasis)
représentée ci-dessous (table 1) qui classe les tumeurs en fonction de leur stade (pT), de
la présence ou non de ganglions lymphatiques (N), et de la présence ou non de métastases
(M).

T ABLE 1 : C LASSIFICATION TNM DES CARCINOMES UROTHELIAUX (Pedrosa et al., 2014)

12
La seconde est la classification des tumeurs par grade. Il existe deux systèmes de
classifications par grade établis par l’OMS, celui de 1973 et celui de 2004 (table 2).

1973 WHO Grading classification

urothelial papilloma
Grade 1: well differentitated
Grade 2 : moderately differenciated
Grade 3: poorly differenciated
2004 WHO Grading classification
urothelial papilloma
Papillary urothelial neoplasm of low malignant potential
Low-grade papillary urothelial carcinoma
High-grade papillary urothelial carcinoma

T ABLE 2: C LASSIFICATION DES CARCINOMES DE VESSIE PAR GRADE SELON L ’OMS EN 1973 ET
2004. E UROPEAN ASSOCIATION OF U ROLOGY

Les Tumeurs de vessie peuvent être divisées en deux groupes, en fonction de leur stade.
Ainsi on distingue les tumeurs de stade CIS, Ta ou T1 n’ayant pas envahi le muscle, et les
tumeurs de stade T2-T4 qui ont envahi le muscle. Le stade tumoral d’une tumeur de vessie
est déterminé en fonction de l’infiltration de la tumeur à travers les différentes couches de
tissu constituant la vessie. Ces stades sont décrits ci-dessous:

Tumeurs CIS et Ta : les tumeurs CIS (carcinomes in situ) sont des lésions planes
présentes à la surface de l’urothélium. Les tumeurs papillaires Ta sont elles aussi présentes
à la surface de l’urothélium mais sous forme de papilles.

Tumeurs de stade T1 : On distingue les tumeurs T1a et T1b. Les tumeurs de stade T1a
sont retrouvées présentes à la surface de l’urothélium et en partie dans la lamina propria.
Les tumeurs T1b ont quant à elles envahi la majeur partie de la lamina propria.

Tumeurs de stade T2 : On distingue les tumeurs T2a et T2b. Les tumeurs de stade T2a
ont envahi la lamina propria, la sub-muqueuse et une première couche de la musculeuse.
Les tumeurs de stade T2b ont quant à elles envahi les différentes couches de la
musculeuse (interne et externe).

Tumeurs de stade T3 et T4 : Les tumeurs de stade T3 sont infiltrées dans toutes les
couches composant la vessie. Les tumeurs de stade T4 ont envahi les organes adjacents.
Ces tumeurs sont généralement très agressives.

La progression des tumeurs de vessie à travers les différentes couches constituant la

vessie, que sont l’urothélium, la lamina propria, la sub-muqueuse et la musculeuse en
fonction de leur évolution par stade est représentée ci-après (figure 7) :

13
 F IGURE 7 : R EPRESENTATION SCHEMATIQUE DE LA CLASSIFICATION DES DIFFERENTS STADES
DES TUMEURS DE VESSIE (Aubertin, 2009)

2.5 O RIGINES DES T UMEURS DE VESSIE

L’urothélium est un épithélium composé de 3 sous-types cellulaires : les cellules

superficielles, les cellules intermédiaires et les cellules basales. Ces sous-types cellulaires
expriment différents niveaux de kératines que sont les kératines 5, 7, 8, 10 et 20. Les
cellules basales expriment un fort taux de kératine 5 (CK5), tandis que les cellules en
ombrelles (cellules superficielles) expriment de fort taux de CK7, CK8, CK18 et CK20.

C’est à partir de ce tissu épithélial que vont se former les tumeurs de vessie (cf figure 8).
Cependant jusqu’à présent l’origine exacte des différents types de tumeurs de vessie
n’avait pas été clairement montrée. On distinguait les tumeurs papillaires issues d’une
hyperplasie d’un urothélium normal, non agressives et pour lesquelles la probabilité
d’évoluer est faible, et les tumeurs CIS (carcinomes in situ) issues d’une dysplasie d’un
urothélium normal et qui sont plus agressives que les tumeurs papillaires.

14
 F IGURE 8 : L ES DIFFERENTS SOUS TYPES CELLULAIRES COM POSANT L ’ EPITHELIUM LA VESSIE
(Kobayashi, Owczarek, McKiernan, & Abate-Shen, 2014)

La kératine 5 et p63 sont des marqueurs des cellules basales et intermédiaires alors que
les kératines 7, 8, 18 et 20 ainsi que les uroplakine (URO) sont des marqueurs des cellules
en ombrelles.

Récemment il a été montré dans un modèle murin que les tumeurs papillaires de vessie
avaient pour origine les cellules luminales intermédiaires de l’urothélium, alors que les CIS
(carcinomes in situ) et les SCC (Squamous Cell Carcinoma) étaient issus des cellules CK5
basales.

Des souris ont été traitées avec un pro-carcinogène, le BBN (N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)

nitrosamine), qui est une nitrosamine semblable à celles présentes dans les cigarettes. Le
BBN ne devient un agent alkylant de l’ADN qu’après avoir été métabolisé par le foie. Il est
utilisé dans les modèles murins pour induire de manière spécifique des carcinomes
urothéliaux. En effet, le BBN n’a aucun effet sur les reins, les uretères, le tractus gastro-
intestinal et les poumons. Deux modèles murins ont été étudiés : un premier modèle murin
exprimant le gène TP53 sauvage (WT) et un second modèle murin présentant une perte
d’hétérozygotie pour le gène TP53 (TP53+/-) et traité au BBN. L’expression de TP53+/- est
sous dépendance de l’uroplakine 2, pour que la perte d’hétérozygotie soit spécifique à la
vessie. Le gène TP53, comme décrit précédemment, est un gène fréquemment altéré dans
les carcinomes urothéliaux évoluant vers des tumeurs agressives et envahissant le muscle.
Le traitement au BBN des souris TP53+/- a conduit à la formation de différentes lésions :
hyperplasies, dysplasies, carcinomes papillaires, CIS et lésions invasives. Il a été observé
jusqu’ à cinq fois plus de lésions de type carcinomes urothéliaux dans ces souris TP53+/-
en comparaison aux souris TP53 WT. De plus, les mâles TP53+/- ont développés deux fois
plus de lésions de type carcinomes urothéliaux que les femelles TP53+/-, suggérant que

15
ceux-ci ont une plus grande prédisposition à développer des carcinomes urothéliaux
comme cela a déjà était rapporté chez l’homme (Van Batavia et al., 2014). Le fait que les
mâles aient une plus grande prédisposition à développer des carcinomes urothéliaux
suggère que les récepteurs hormonaux puissent jouer un rôle dans le développement
tumoral des cancers de vessie (récepteur aux androgènes). Par la suite les marqueurs
spécifiques aux différents sous-types cellulaires composant l’urothélium ont été étudiés par
histologie dans les différentes tumeurs obtenues: CK5, 7, 8, 10 et 20, p63. Cela a permis
de montrer que les tumeurs obtenues sous traitement BBN et présentant une perte
d’hétérozygotie pour p53 étaient des tumeurs de type CIS issues de cellules K5 basales.
Les tumeurs SCC (squamous cell carcinoma) ne sont obtenues que dans le cas où
l’urothélium a subi une exposition au BBN mais sans altération de p53, et sont moins
agressives que les CIS. Quant aux tumeurs papillaires, cette étude a permis de montrer
qu’elles semblaient être issues des cellules intermédiaires (Van Batavia et al., 2014), (figure
9).

F IGURE 9 : ORIGINES DES TUMEURS PAPILLAIRES , DES TUMEURS CIS, ET DES TUMEURS SCC
(Van Batavia et al., 2014).

Les tumeurs papillaires semblent être issues des cellules intermédiaires alors que les
tumeurs CIS semblent être issues des cellules basales.

16
2.6 V OIES DE PROGRESSION TUMORALES

Deux voies de progression ont été décrites dans les cancers de vessie, la voie des tumeurs
Ta et la voie des Carcinomes in situ (CIS). Les CIS sont issus d’une dysplasie d’un
urothélium normal et forment à la surface de l’urothélium des lésions planes qui sont très
difficiles à diagnostiquer. Les tumeurs de cette voie de progression tumorale sont
généralement plus agressives que les tumeurs issues de la voie des tumeurs papillaires.
La voie des tumeurs superficielles papillaires Ta, est initiée à partir d’une hyperplasie d’un
urothélium normal. Les tumeurs de cette voie forment des lésions papillaires facilement
détectables à la surface de l’urothélium. Ces tumeurs sont généralement moins agressives
que les tumeurs de type CIS. Cependant si la tumeur évolue, passant du stade Ta au stade
T1, et envahissant de ce fait la membrane basale, la probabilité qu’elle envahisse par la
suite le muscle, est élevée. Ces deux voies de progression tumorale sont représentées ci-
après (figure 10) :

F IGURE 10 : V OIES DE PROGRESSION TUMORALE DES CARCINOMES DE VESSIE

Les tumeurs de vessie peuvent être divisées en deux voies de progression tumorale. La
première est celle des tumeurs papillaires Ta de bas grade qui forment des papilles à la
surface de l’urothelium et qui évoluent peu mais récidivent fréquemment après résection de
la tumeur. Ces tumeurs sont caractérisées par des altérations fréquentes de FGFR3. La
seconde est la voie des tumeurs CIS qui forment des lésions planes à la surface de
l’urothelium et sont plus agressives que les tumeurs papillaires. Ces tumeurs sont
notamment caractérisées par des altérations fréquentes de TP53. Les tumeurs de ces deux
voies de progression tumorale peuvent évoluer vers un envahissement de la membrane
basale puis du muscle.

17
Les tumeurs de vessie constituent une maladie présentant une forte hétérogénéité. Les
tumeurs superficielles sont caractérisées par des mutations du gène FGFR3 et des
altérations du chromosome 9. Les tumeurs de haut grade et celles ayant envahie le muscle
sont caractérisées par des mutations de TP53 et de l’aneuploïdie (López-Knowles et al.,
2006).

2.6.1 A LT E R A T I O N S M O L E CU L AI R E S D AN S L A V O I E DE S T U ME U RS P AP I L LAI R ES

Altérations génétiques du chromosome 9

L’altération moléculaire la plus fréquemment retrouvée dans les tumeurs de vessie est la
perte d’hétérozygotie du chromosome 9. Cette altération chromosomique est retrouvée
dans près de 89% des tumeurs de vessie (Wada et al., 2003). Des pertes d’hétérozygotie
sont fréquemment retrouvées à la fois sur les bras court et long du chromosome 9. Elles
touchent les régions 9p22.1, 9q22.3 et 9q32-33.1, sur lesquels on trouve les gènes
suppresseurs de tumeurs PTCH (Gorlin syndrome gene) et DBCCR1 (Wada et al., 2003),
mais aussi 9p21 sur lequel se trouve les locus des inhibiteurs de kinase cycline dépendants
CDKN2A et CKN2B, et 9q34 sur lequel se trouve le gène TSC1 (Tuberous Sclerosis 1).

Le locus CDKN2A code pour les protéines p16 et p14, et le locus CDKN2B code pour la
protéine p15 (Pasin, Josephson, Mitra, Cote, & Stein, 2008). p16, p14 et p15 étant
impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire. La perte de p16 est nécessaire pour acquérir
l’immortalisation de cellules de tumeurs de vessie en culture cellulaire (Chapman, Harnden,
Chambers, Johnston, & Knowles, 2005).

Dans la région 9q34, le gène TSC1 code pour une protéine nommée hamartin, qui interagit
avec le produit du gène TSC2 impliqué dans la voie de signalisation PI3Kinase/AKT en
promouvant la régulation négative de mTOR, protéine centrale dans le contrôle de la
synthèse protéique et de la croissance cellulaire (Pasin et al., 2008). Des mutations du gène
TSC1 ont été identifiées dans 14,5% des tumeurs de vessie (Pymar, Platt, Askham,
Morrison, & Knowles, 2008).

Les altérations chromosomiques retrouvées sur le chromosome 9 sont un changement

génétique précoce, conduisant plus fréquemment à l’apparition des tumeurs de la voie des
tumeurs papillaires, qu’à celle des carcinomes in situ (Pasin et al., 2008).

Notre équipe a montré récemment que la perte d’un allèle ou des deux allèles de CDKN2A
dans les tumeurs papillaires FGFR3 muté n’envahissant pas le muscle (Ta et T1) est
corrélée à une progression tumorale conduisant à un envahissement du muscle,
indépendamment du grade (Rebouissou el al, 2012), en comparaison aux tumeurs
papillaires FGFR3 muté qui ne présentent pas d’altérations de CDKN2A.

18
Mutations des gènes FGFR3 et RAS

Les gènes FGFR3 (Fibroblast Growth Factor Receptor 3) et RAS (GTPases de la famille
des protéines G monomériques) sont fréquemment mutés dans les tumeurs de vessie. Des
mutations activatrices du gène FGFR3 (exons 7,10 et 15) sont observées dans 60 à 70 %
des cas des tumeurs papillaires de bas grade, alors que ces mutations ne sont trouvées
que dans 10 à 20% des tumeurs envahissant le muscle.

Des mutations du gène RAS sont fréquemment observées dans les tumeurs papillaires. Un
chiffre a été avancé quant à la fréquence des mutations du gène RAS dans ces tumeurs.
Ainsi des mutations activatrices des gènes RAS, et notamment HRAS avaient été
rapportées dans 30 à 40 % des cas des tumeurs papillaires de bas grade (Mitra, Datar, &
Cote, 2006; Pasin et al., 2008). Il a été montré par la suite que les mutations du gène RAS
(HRAS,NRAS,KRAS) étaient retrouvées dans 13% des tumeurs de vessie, tout stade et
grade confondus (Jebar et al., 2005).

De manière intéressante, dans les tumeurs papillaires les mutations des gènes FGFR3 et
RAS (HRAS, KRAS et NRAS) sont mutuellement exclusives. Cependant il n’est pas
possible à l’heure actuelle d’en établir les causes exactes. Il est vraisemblable d’imaginer
que RAS puisse faire partie des voies de signalisation du récepteur FGFR3, et notamment
du récepteur FGFR3 muté dans les tumeurs papillaires de vessie, et qu’ainsi les mutations
de RAS conduisent à l’activation des mêmes cibles biologiques que celles de FGFR3. Mais
il est aussi possible que ces mutations de FGFR3 et de RAS apparaissent simplement dans
des sous-groupes de tumeurs différents, notamment compte tenu du fait que des mutations
de RAS soient retrouvées dans des tumeurs ayant envahi le muscle. Dans ce dernier cas
il n’y aurait aucun rapport entre les mutations de RAS et les mutations FGFR3, l’activation
de RAS pouvant être due à l’activation du récepteur à l’EGF (EGFR).

Altérations du gène PIK3CA

Une étude a montré que sur un panel de 87 tumeurs de vessie, tous stades et grades
confondus, 13% des tumeurs présentent une mutation activatrice du gène PIK3CA. Les
tumeurs mutées pour ce gène étaient dans la majorité des cas des néoplasmes papillaires
urothéliaux de potentiel malin incertain (PUNLMP), et des tumeurs papillaires Ta. Dans
cette étude, PIK3CA n’a été retrouvé muté dans aucun des échantillons de tumeurs
envahissant le muscle, et avec une très faible fréquence dans des tumeurs T1, suggérant
que ce type d’altération (mutations) est plus spécifique de la voie des tumeurs superficielles
papillaires. De plus les mutations de PIK3CA étaient préférentiellement retrouvées
associées aux altérations du gène FGFR3. Ainsi, 26% des tumeurs FGFR3 mutés
présentent aussi une mutation du gène PIK3CA, contre seulement 7% des tumeurs

19
présentant un récepteur FGFR3 sauvage (López-Knowles et al., 2006). Dans les tumeurs
de haut stade, haut grade les mutations de ce gène sont très peu présentes, mais on trouve
des amplifications ou des gains de PIK3CA corrélées à des pertes du gène suppresseur de
tumeur PTEN (Koksal et al., 2005).

2.6.2 A LT E R A T I O N S M O L E C U L AI R E S D AN S L E P AT H W AY D ES CIS
Altérations du gène PTEN

PTEN (Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten) est le gène
suppresseur de tumeur permettant de réguler négativement l’activation du pathway
PI3K/AKT. De nombreux cancers (gliome, sein, prostate…) présentent des altérations du
gène PTEN, généralement des mutations et des délétions homozygotes (Aveyard, Skilleter,
Habuchi, & Knowles, 1999). C’est le deuxième gène suppresseur de tumeur le plus souvent
muté dans les cancers humains après TP53 (X. Wang & Jiang, 2008).

Dans les tumeurs de vessie, l’altération du gène PTEN la plus fréquemment retrouvée est
une perte d’hétérozygotie dans la région 10q23 du chromosome 10 qui inclut PTEN. Il a été
montré sur un échantillon de 132 tumeurs, la perte allélique dans la région où se situe PTEN
est observée dans 24,5% des tumeurs envahissant le muscle (stade supérieur à pT2) et
dans 6,6% des tumeurs n’envahissant pas la muscle (pTa/pT1). Concernant les mutations
du gène PTEN, elles sont retrouvées avec une très faible fréquence, tout comme les
délétions homozygotes (Aveyard et al., 1999). Il a été montré que l’expression de PTEN
n’est pas négativement corrélée avec celle de phospho-AKT (figure 11). Une forte
expression de PTEN est observée dans les tumeurs de vessie de stade Ta en comparaison
aux échantillons « normaux ». Cette expression de PTEN diminue par la suite dans les
échantillons de tumeurs de stade T1, T2/T3/T4. Cependant on observe une augmentation
du niveau de phospho-AKT même dans les tumeurs Ta. Il y a même de façon inattendue
une légère corrélation positive entre le niveau de PTEN et le niveau de phospho-AKT
(Calderaro et al., 2014). L’étude conclut que l’activation d’AKT dans un panel de tumeurs
de vessie est indépendante du stade et du grade et des altérations moléculaires connues
dont les pertes de PTEN. Ceci peut s’expliquer par le nombre important de voies de
signalisation régulées par la protéine AKT qui est impliqué dans de nombreux processus
cellulaires.

20
 F IGURE 11 : EXPRESSION DE PTEN ET PHOSPHO -AKT DANS LES TUMEURS DE VESSIE
(C ALDERARO ET AL ., 2014)

Mutations des gènes TP53 et RB

Les altérations chromosomiques du chromosome 9q et 9p peuvent avoir plusieurs

conséquences. On trouve en effet sur ce chromosome les locus CDKN2A et B.
L’inactivation de CDKN2A par exemple a des conséquences directes sur le rôle des
protéines P53 et RB via les protéines p16 et p14 (Chapman et al., 2005). La protéine P16
peut inhiber la phosphorylation de RB ce qui conduit à un arrêt du cycle cellulaire en phase
G1. La protéine p16 a d’autres effets anti-tumoraux, puisqu’elle agit négativement sur
l’angiogenèse, l’invasion et la sénescence. Quant à la protéine p14, seconde protéine à
être transcrite à partir du locus CDKN2A, elle permet la stabilisation de P53 en empêchant
sa liaison avec MDM2. La protéine p14 est aussi capable d’interagir avec la topoisomérase
I et de promouvoir l’apoptose via le clivage de la caspase 9 (Chapman et al., 2005).

Le gène RB code pour une phosphoprotéine jouant un rôle important pour la régulation du
cycle cellulaire. La forme active de la protéine RB séquestre le facteur de transcription E2F.
La phosphorylation de RB par les CDK (Cyclines Dépendantes des Kinases) induit le
relargage d’E2F qui peut alors transcrire les gènes permettant d’induire la synthèse de
l’ADN. (Mitra et al., 2006). L’hyper-phosphorylation de RB a les mêmes conséquences que
l’inactivation de RB par des mécanismes génétiques. De plus une forte expression de RB
dans certaines tumeurs est corrélée à une hyper-phosphorylation de celle-ci, conduisant à
une perte d’expression de p16 et/ou à une surexpression de la cyclin D1, permettant ainsi
un relargage permanent d’E2F, promouvant alors la prolifération cellulaire. Ce modèle
identifié dans les tumeurs de vessie et proposé par Mitra et al, est représenté ci-après
(figure 12) :

21
 F IGURE 12 : P HOSPHORYLATION DE RB ET CONSEQUENCES FONCTIONNELLES (Mitra et al.,
2006)

Dans les tumeurs invasives, l’activation des récepteurs EGFR et ERBB2, induit l’activation
des voies RAS-MAPKinases qui transduisent le signal jusqu’au noyau ou l’activation des
complexes Cycline/CDK induit la phosphorylation de RB et le relargage de E2F (Mitra et
al., 2006).

La perte allélique fréquente dans les tumeurs de vessie de haut grade survient sur les
chromosomes 9q et 9p mais aussi sur le chromosome 17p, avec une perte d’hétérozygotie
dans 63% pour ce dernier dans les tumeurs de vessie (Olumi et al., 1990). Cependant alors
que les altérations du chromosome 9q et 9p sont observées dans un panel très large de
tumeurs, tous stade et grades confondus, celles du chromosome 17p sont observées
majoritairement dans des tumeurs de haut grade (Olumi et al., 1990). Par la suite, des
mutations du gène TP53 ont été identifiées dans les tumeurs de vessie. Ces mutations sont
caractérisées soit par la substitution d’un acide aminé soit par une délétion. De manière
intéressante, elles sont fortement associées à la perte allélique du chromosome 17, et
apparaissent beaucoup plus fréquemment dans les tumeurs invasives de haut grade
(Fujimoto et al., 1992; Sidransky et al., 1989).

Dans un premier temps il a avait été montré que les mutations touchant TP53 et FGFR3
étaient des mutations exclusives dans les tumeurs de vessie. FGFR3 étant muté dans la
voies des tumeurs pTa et TP53 étant muté dans le cas des CIS (Bakkar et al., 2003; van
Rhijn et al., 2002). Par la suite, plusieurs études avaient apporté des conclusions
contradictoires quant à l’association des mutations de FGFR3 et TP53. Plus récemment,
notre équipe a réalisé une méta-analyse de la relation entre les mutations de FGFR3 et

22
P53 dans les tumeurs de vessie. Le gène FGFR3 est retrouvé muté dans 65% des tumeurs
papillaires Ta, 33% des tumeurs pT1, 22% des tumeurs pT2-4 mais dans aucun cas de
tumeur de vessie de type CIS. Le gène TP53 est retrouvé muté dans 19% des cas de pTa,
et 52% des cas de CIS (Yann Neuzillet et al., 2012), ces résultats sont présentés ci-après
(figure 13) :

F IGURE 13 : C OMBINAISON DES FREQUENCES DE MUTATIONS DE FGFR3 ET TP53 EN FONCTION

DU GROUPE STADE / GRADE (Yann Neuzillet et al., 2012).

Phénotype MRES

Notre groupe a identifié un phénotype de répression de l’expression des gènes de 7 régions

chromosomiques contiguës dans des tumeurs présentant une signature de l’expression des
gènes de type CIS. Cette répression est due à un mécanisme épigénétique, et se traduit
par une méthylation des histones H3K9 et H3K27, ainsi qu’une hypo-acétylation de H3K9.
Ce phénotype est appelé phénotype MRES (« Multiple Regional Epigenetic Silencing »).
Sur un échantillon de 57 tumeurs, 26 présentent ce phénotype MRES, dont 25 avec une
signature de type CIS. Parmis les 31 tumeurs restantes aucune ne présente ni signature
CIS ni phénotype MRES. De plus, une seule tumeur avec un phénotype MRES arbore une
mutation de FGFR3, alors que des mutations de ce gène sont observées dans 22 des 31
tumeurs non MRES. Sur l’échantillon des 57 tumeurs analysées, 33 sont des tumeurs de
haut stade ayant envahi le muscle. Sur ces 33 tumeurs, 25 présentent un phénotype MRES
(figure 14). Cette étude a donc permis de proposer que les tumeurs présentant un
phénotype MRES dérivent des CIS, tumeurs déjà très agressives et évoluant rapidement
vers un envahissement de la membrane basale puis du muscle.

23
 F IGURE 14 : ANALYSE EN CLUSTER DE 57 TUMEURS DE VESSIE VERSUS 5 NORMAUX EN
UTILISANT LE NIVEAU D ’ EXPRESSION DES GENES DANS LES 7 REGIONS EPIGENETIQUEMENT
REPRIMEES (V ALLOT ET AL ., 2011)

Altérations épigénétiques

La récente étude menée par le TCGA, a permis l’analyse transcriptomique de 131 tumeurs
de vessie envahissant le muscle (TCGA, 2014). De nombreuses altérations déjà décrites
dans les tumeurs de vessie en sont ressorties (touchant les gènes TP53, RB, RAS,
FGFR3), ainsi que des altérations très peu décrites jusqu’à présents. Ainsi, le pathway
SWI/SNF (impliqué dans le remodelage de la chromatine) est altéré à 64% et celui de la
modification des histones est altéré à 89%. Pour ces deux pathways on observe une
inactivation des gènes impliqués. On citera notamment le gène KDM6A, aussi connu sous
le nom de UTX, qui joue le rôle de déméthylase (déméthylase de H3K27Me2 et H3K27Me3)
clé dans le code des histones et qui est fréquemment muté (mutation inactivatrice) dans les
tumeurs de vessie.

Les tumeurs de vessie peuvent être classées en fonction du stade et du grade, du type
d’altération moléculaire qu’elles présentent, mais elles peuvent aussi être classées en
différents sous-groupes grâce aux données du transcriptome. Plusieurs classifications ont
été récemment proposées. Le nombre de sous-groupes différent selon les études mais un
sous-groupe basal-like et un sous-groupe enrichi en tumeurs papillaires et/ou mutées pour
FGFR3 sont retrouvés dans pratiquement toutes les études.

24
2.7 C LASSIFICATION DES TU MEURS DE VESSIE : TUMEURS LUMINALES ET
BASALES

Ces différentes études sur la classification des tumeurs de vessie grâce aux données du
transcriptome ont été menées par les équipes: de USCF (Blaveri et al., 2005) ,Lund (Sjödahl
et al., 2012), UNC (Damrauer et al., 2014), TCGA (TCGA, 2014), MDA (Choi et al., 2014)
et notre équipe en collaboration avec l’équipe CIT3 de la ligue contre le cancer (Rebouissou
et al., 2014). Si l’on compare ces différentes études, il est possible d’observer des
recoupements entre les classifications des tumeurs de vessie. Choi et al, ont proposés une
classification en trois grandes catégories : tumeurs luminales, tumeurs p53-like, tumeurs
basales (Choi et al., 2014). L’étude du TCGA a abouti à un classement de ces tumeurs en
4 clusters. Les clusters I et II représentent les tumeurs luminales, le cluster II intègre aussi
les tumeurs dites « p53 like », tandis que les clusters III et IV représentent les tumeurs dites
basales. Ci-après sont représentées les différentes classifications établies par les études
du TCGA, UNC, Lund et du groupe de Choi, obtenues après l’analyse transcriptomique des
tumeurs de vessie :

F IGURE 15 : C LASSIFICATION DES DIFFERENTS SOUS - GROUPES DE TUMEURS DE VESSIE EN

FONCTION DE LEURS ALTERATIONS MOLECULAIRES , D ’ APRES LES ETUDES DU TCGA, DE L UND
ET DU MDA. D ANS CETTE FIGURE LA CLASSIFICATION PRISE COMME REFERENCE EST CELLE DU
MDA (Choi et al., 2014).

25
Le groupe basal-like que notre équipe a identifié (Rebouissou et al., 2014) correspond
presque exactement aux tumeurs SCC-like de l’équipe de Lund, aux tumeurs basales du
MDA et au groupe III du TCGA (résultats non publiés). Les tumeurs luminales sont
caractérisées par l’expression du récepteur FGFR3, de PPARγ, des récepteurs ERBB2 et
ERBB3, et des uroplakines, tandis que les tumeurs basales sont quant à elles caractérisées
par l’expression des kératines des cellules basales des épithéliums, du récepteur EGFR,
de STAT3 et de p63 (Choi et al., 2014).

Dans le cas des tumeurs de vessie ayant envahies le muscle (MIBC), l’origine de ces
tumeurs ainsi que les biomarqueurs qu’elles expriment (tumeurs luminales ou basales) ont
été proposés ci-après (figure 16) :

F IGURE 16 : O RIGINES PROBABLE DES TUMEURS BASALES ET LUMINALES AYANT ENVAHIES LE

MUSCLE ET ALTERATIONS MOLECULAIRES ASSOCIEES (Choi et al., 2014).

26
C HAPITRE III : RTK, STRUCTURE , ACTIVATION , VOIES DE
SIGNALISATION ET CAN CER

3.1 L ES RECEPTEURS A ACTIVITE T YROSINE K INASE (RTK)

Les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) sont une famille de molécules impliquées
dans divers processus biologiques pour lesquels ils jouent un rôle essentiel, tels que le
métabolisme, le contrôle du cycle cellulaire, la survie, la prolifération, la croissance ou
encore la motilité cellulaire. 58 RTK classés en 20 sous-familles sont présents chez
l’homme (figure 17). La topologie, le mode d’activation, ainsi que les composants clés
recrutés par les RTK pour l’activation des voies de signalisation intracellulaires sont très
conservées du nématode C.elegans à l’homme. De plus les mutations observées dans les
RTK ainsi que l’activation aberrante de leurs voies de signalisation sont liées à de
nombreuses pathologies : cancers, maladies inflammatoires, diabète, chondrodysplasies
et angiogenèse. Ces observations ont conduit au développement de molécules bloquant
ou atténuant l’activité des RTK.

F IGURE 17 : L ES 20 SOUS - FAMILLE DE RTK S (Lemmon & Schlessinger, 2010)

27
3.1.1 S T R U CT UR E S E T MO D ES D ’ A CT I V AT I O N D ES RTK
Première étape d’activation des RTKs : fixation du ligand sur le domaine
extracellulaire.

Les RTK sont des protéines transmembranaires exprimées à la surface des membranes
cellulaires, et notamment à la membrane plasmique. Ils sont constitués d’un domaine
extracellulaire de liaison au ligand, d’un domaine transmembranaire, et d’un domaine
intracellulaire à activité tyrosine kinase. En général, la fixation du ligand sur le domaine
extracellulaire, induit le rapprochement de deux monomères et conduit à l’activation du RTK
par phosphorylation du domaine tyrosine kinase. Cette activation conduit au recrutement
de divers partenaires protéiques permettant d’induire des cascades de signalisation
intracellulaires conduisant à l’activation ou à l’inhibition de divers processus cellulaires.
Cependant certains RTK sont déjà présents sous forme d’oligomères sans que le ligand ne
soit présent, c’est le cas pour les récepteurs de la sous-famille du récepteur à l’insuline qui
sont déjà présents sous forme de dimère. Dans ce cas précis, la liaison du ligand sur le
récepteur va induire un changement de conformation du dimère et stimuler son activité
tyrosine kinase (Lemmon & Schlessinger, 2010). Plusieurs études ont suggéré que le ligand
EGF se liait à des récepteurs déjà présents sous formes d’oligomères, mais la nature
précise et la taille de ces oligomères n’est pas connue.

Chaque sous-famille de RTK possède un type de ligand ou une famille de ligands qui lui
est propre. L’exemple de l’activation des récepteurs TrkA, KIT, FGFR et ErbB sera détaillé
ci-après, figure 18, et illustre deux cas de mécanistique très différentes (récepteurs TrkA et
ErbB) et deux cas intermédiaires (KIT et FGFR). Dans le cas du récepteur TrkA, la
dimèrisation du récepteur est totalement médiée par le ligand, il n’y a aucun contact entre
les deux monomères (figure 18 A). A l’opposé de cela on trouve le cas du récepteur ErbB,
où la dimèrisation est entièrement médiée par le récepteur lui-même, le ligand n’apporte
pas une contribution directe à l’interface du dimère (figure 18D). Les deux cas
intermédiaires sont ceux des récepteurs KIT et FGFR (figure 18B et 18C). Dans ces deux
cas la liaison du ligand sur chacun des monomères conduit au rapprochement de deux
monomères et de ce fait à la dimèrisation du récepteur. Certains domaines
Immunoglobulines rentrent alors en contact (domaines D4 et D5 dans le cas du récepteur
KIT et domaines D2 dans le cas des FGFR), (Lemmon & Schlessinger, 2010). De manière
intéressante c’est dans le domaine D5 du récepteur KIT que des mutations activatrices sont
retrouvées et permettent de stabiliser le récepteur dans une conformation active. Il en est
de même pour les récepteur FGFR, et notamment le récepteur FGFR3 ou la mutation d’un
acide aminé en une cystéine dans le domaine extracellulaire conduit à la formation d’un
pont disulfure et à une forme constitutivement active du récepteur.

28
 F IGURE 18 : F IXATION DU LIGAND ET ACTIVATION DES RTK S : T RK A, KIT, FGFR ET E RB B
(Lemmon & Schlessinger, 2010)

(A) : Activation du récepteur TrkA. Un dimère de facteur de croissance nerveuse (NGF :

Nerve Growth Factor, ici en rouge) se fixe sur le domaine Ig-C2 de chaque monomère du
récepteur TrkA et permet d’induire la dimèrisation et l’activation du récepteur sans aucun
contact direct entre les deux monomères (Werhman et al. 2007). (B) : Activation d’un
récepteur KIT. Un dimère de facteur « stem cell » (SCF : Stem Cell Factor, ici en rouge) se
fixe entre les domaines D2 et D3 de chaque monomère et permet d’induire la dimèrisation
du récepteur. Les domaines D4 et D5 rentrent alors en contact induisant l’activation du
récepteur (Yuzawa et al. 2007). (C) : Activation d’un récepteur FGFR. L’activation du
récepteur se fait suite à la fixation de deux molécules de ligand FGF (en rouge) sur chaque
domaine D2 de chacun des deux monomères de FGF récepteur. Une molécule d’héparine
vient se fixer en plus, permettant de consolider le rapprochement des deux monomères et
la fixation du ligand (Schlessinger, 2000). (D) : Activation d’un récepteur ErbB. L’activation
décrite ici est celle du récepteur ErbB1. La dimèrisation est entièrement médiée par le
récepteur. Le ligand qui est le facteur de croissance épidermique, (EGF : Epidermal Growth
Factor) se lie sur les domaines DI et DIII d’une seule et même molécule de ErbB, et induit
un changement de conformation du récepteur, induisant dès lors la dimèrisation du
domaine DII.

29
Seconde étape d’activation des RTKs : modulation et activation du domaine tyrosine
kinase (intracellulaire)

L’activation du domaine tyrosine kinase varie elle aussi en fonction du type de RTK et de
sa structure, cependant il existe des types d’activation communs aux différents RTK. Par
exemple, le mode d’activation du domaine tyrosine kinase est commun aux récepteurs FGF
et aux récepteurs de la sous-famille du récepteur à l’Insuline. Dans ce premier cas de figure
l’inhibition du domaine tyrosine Kinase est apparentée à une inhibition de la boucle
d’activation entre les domaines N-ter et C-ter du domaine tyrosine kinase. Dès lors, lorsque
le ligand n’est pas fixé au domaine extracellulaire, il existe une boucle d’auto-inhibition due
au rapprochement entre les domaines N-ter et C-ter empêchant la phosphorylation du site
tyrosine. Le site actif de la kinase est alors inaccessible aux protéines partenaires du
récepteur, empêchant ainsi l’activation des cascades de signalisation. La fixation du ligand
sur le récepteur induit une dimèrisation entre deux monomères conduisant à une
phosphorylation des sites Tyrosine (Y) clés, inhibant cette boucle d’auto-inhibition et
permettant alors de relâcher la structure du domaine tyrosine kinase, dont le site actif est
alors accessible aux différents partenaires protéiques du récepteur. Les cascades de
signalisation peuvent alors être enclenchées.

Il existe deux autres cas de figures. Celui du récepteur KIT et du récepteur Tie2. Dans le
cas du récepteur KIT, l’inhibition du domaine kinase est apparentée à une inhibition
juxtamembranaire. Une région juxtamembranaire située au niveau du sous-domaine N-ter
du domaine tyrosine kinase interagit avec les différents éléments présents dans le domaine
kinase, afin de stabiliser le site actif dans une conformation particulière inactive. La
phosphorylation des sites tyrosine clés dans le domaine kinase suite à la fixation de ligand
sur le domaine extracellulaire induit alors un changement de conformation et permet au
récepteur de recruter et d’activer ces différents partenaires protéiques. Dans le cas du
récepteur Tie2, c’est le sous-domaine C-ter qui interagit avec le site actif du domaine
tyrosine kinase afin de le bloquer dans une conformation inactive (cf figure 19).

Dans le cas du récepteur à l’EGFR il existe aussi une conformation d’auto-inhibition mais
l’activation est bien différente puisque la partie C-ter d’un domaine tyrosine kinase nommé
« Activateur » vient interagir avec la partie N-ter d’un deuxième domaine tyrosine kinase,
nommé « Receveur ». Le domaine « Activateur » déstabilise alors les interactions d’auto-
inhibition présentent dans le domaine « Receveur », permettant ainsi l’activation de celui-
ci (figure 19).

30
 F IGURE 19 : D IMERISATION DES RTK S ET ACTIVATION (Lemmon & Schlessinger, 2010)

Récepteur à l’insuline, à l’IGF1 et FGF récepteurs (inhibition de la boucle

d’activation) : pour les récepteurs FGFR, le récepteur à l’insuline et le récepteur IGF1, la
boucle d’activation interagit directement avec le site actif du domaine kinase et bloque
l’accès aux protéines substrats. La phosphorylation sur certaines tyrosines clés permet de
lever cette interaction d’auto-inhibition et de relâcher le site actif de la kinase qui est alors
accessible aux protéines substrats. Récepteur KIT (inhibition juxtamembranaire) : Dans
le cas du récepteur KIT, la région juxtamembranaire (ici en rouge) interagit avec les
éléments situés dans le site actif du domaine kinase (incluant la boucle d’activation ici en
violet) afin de stabiliser le domaine kinase dans une conformation inactive. La
phosphorylation sur certaines tyrosines clés dans la région juxtamembranaire permet de
déstabiliser cette conformation inactive et permet au domaine tyrosine kinase d’être dans
une conformation active. Récepteur Tie2 (Inhibition C-terminale) : dans le cas des
récepteurs Tie1 et 2 et du récepteur MET, la queue C-terminale (ici en rouge) interagit avec
le site actif du domaine tyrosine kinase, le stabilisant ainsi dans une conformation inactive.
Récepteur EGFR : le domaine tyrosine kinase du récepteur EGFR est activé de manière
allostérique par contact direct entre le « lobe C » d’un domaine tyrosine kinase nommé
« activateur » et le « lobe N » d’un second domaine tyrosine kinase nommé « receveur ».
Dans le domaine tyrosine kinase receveur, la présence d’une loupe d’activation permet de
bloquer celui-ci dans une conformation inactive. C’est l’interaction du receveur avec
l’activateur qui va permettre de déstabiliser cette auto-inhibition.

31
Pour tous les RTK, l’activation est une activation allostérique. La dimèrisation permet une
trans-phosphorylation d’un domaine kinase d’un monomère par l’autre. Même sous forme
autoinhibé, chaque monomère possède assez d’activité kinase pour phosphoryler les sites
tyrosine « clés » du domaine kinase de l’autre monomère. C’est cette auto-activation qui va
alors permettre un changement de conformation du site actif de chaque domaine tyrosine
kinase, induire l’activation complète du récepteur, et conduire au recrutement de
partenaires protéiques via les sites dits d’ancrage tel que la protéine FRS2α pour les
récepteurs FGFR.

3.1.2 A CT I V AT I O N D E S V O I ES D E SI GN A LI S AT I O N P A R L E S RTK S
Activation des voies de signalisation des RTKs : exemple des FGF récepteurs

L’activation des récepteurs FGFR suite à leur liaison avec le ligand va permettre l’activation
du récepteur, qui va alors s’auto-phosphoryler dans un premier temps ce qui va augmenter
son activité catalytique (multipliée alors par 15 à 200 en fonction du RTK).

Dans le cas des récepteurs FGFR, l’activation du domaine tyrosine kinase conduit au
recrutement de la protéine d’ancrage : FRS2α (Fibroblast growth factor receptor substrate-
2), protéine substrat des récepteurs FGFR. Le récepteur forme un complexe protéique
avec FRS2α, en interagissant avec le domaine PTB (phospho-tyrosine binding domain) de
celle-ci (représentée en orange figure 20). Dès lors le récepteur FGFR va phosphoryler une
multitude de sites présents sur la protéine FRS2α, conduisant au recrutement des protéines
GRB2 et de SHP2. GRB2 (growth factor receptor bound protein 2) est un adaptateur
protéique contenant un domaine SH2 et deux domaine SH3 et est impliqué dans la
transduction du signal. SHP2 est une tyrosine phosphatase, qui possède deux domaines
SH2.

Les domaines SH2 et SH3 sont impliqués dans la reconnaissance de certains motifs
présents sur les protéines. Le domaine SH2 (Src Homology 2) permet la reconnaissance
de motifs contenant une tyrosine phosphorylée. Le domaine SH3 (Src Homology 3) permet
la reconnaissance de motifs riche en proline.

Le fait que les protéines GRB2 et SHP2 possèdent des domaines SH2 et SH3 va donc
permettre le recrutement de protéines contenant les motifs reconnus spécifiquement par
ces domaines. Par exemple, la protéine GRB2 va recruter via son domaine SH3 N-terminal
la protéine SOS (RAS-guanine exange factor), impliquée dans l’activation de la voie de
signalisation RAS/RAF/MEK/ERK, et la protéine GAB1 via son domaine SH3 C-terminal (la
protéine GAB1 est représentée en bleu figure 20). Le recrutement de GAB1 par GRB2 va
alors permettre de recruter la PI3Kinase (le récepteur FGFR va en plus phosphoryler GAB1

32
afin de recruter d’autres molécules SHP2 et GRB2). Le recrutement et l’activation de la
PI3Kinase par GAB1 va permettre de générer du PIP3 (phosphatidylinositol 3-phosphate)
à partir de PIP2 (phosphatidylinositol 2-phosphate) à la membrane. La production de PI3P
va permettre le recrutement à la membrane de PDK1 qui va alors activée la protéine AKT,
impliquée dans l’activation ou l’inhibition de nombreux processus cellulaires.

F IGURE 20 : C OMPLEXE MULTIPROTEIQUE CONDUISANT A L ’ ACTIVATION DES VOIES DE

SIGNALISATION ACTIVEES PAR LES RTK S

Activation de la voie de la PLCγ: formation de DAG et d’IP3

Il existe plusieurs types de Phospholipase C. La PLCγ, ou Phospholipase C-γ, est celle qui
peut être activée par les RTK, notamment les récepteurs PDGFR, NGFR, FGFR et EGFR.
Elle est composée d’un domaine PH (pleckstrin homogy), de deux domaines SH2 (un
domaine N-SH2 et un domaine C-SH2), d’un domaine SH3 et d’un domaine C-terminal :
C2 (figure 21). Le domaine SH2 N-terminal interagit avec le récepteur RTK sur un site
phospho-tyrosine particulier du domaine tyrosine kinase. Le RTK va alors phosphoryler la
PLCγ sur des résidus tyrosine situés entre les domaines SH2 et SH3 permettant ainsi de
stimuler l’activité enzymatique de la PLCγ. Les domaines C2 et PH coopèrent avec le
domaine SH2 afin d’emmener la PLCγ à la membrane. Dès lors, la PLCγ va reconnaître la
PI3Kinase activée par le récepteur RTK via les domaines PH, conduisant à l’hydrolyse de
PIP2 et à la génération d’Inositol triphosphate (IP3) et de Diacylglycérol (DAG), messagers
secondaires impliqués dans la transduction du signal. La formation de DAG va permettre
d’induire l’activation de la protéine kinase C (PKC). Contrairement au DAG qui reste ancré
à la membrane, l’IP3 est soluble et va être diffusé dans la cellule. Il va aller se fixer sur les
récepteurs à l’IP3 induisant alors l’augmentation de la concentration intracellulaire en ions

33
Ca2+ qui vont agir comme second messagers sur de nombreux processus cellulaires (figure
21).

F IGURE 21 : I NTEGRATION A LA MEMBRANE PLASMIQUE PAR LA PLC GAMMA DES SIGNAUX

GENERES PAR L ’ ACTIVATION DES RTK (Lemmon & Schlessinger, 2010)

3.2 RTK S ET CANCERS

De par leur implication dans de nombreux processus biologiques clés (prolifération,

différentiation, migration, apoptose) les RTK, lorsqu’ils sont génétiquement altérés
(amplification, mutations et protéines de fusion) ou surexprimés, peuvent être impliqués
dans la prolifération et la survie des cellules tumorales et constituent donc dans de
nombreux cancers de bonnes cibles thérapeutiques (Haugsten, et al., 2010; Knights &
Cook, 2010).

3.2.1 V O I ES D E SI GN AL I SA T I O N D E R EG U L EE S D AN S L E CAN C E R

Les très nombreuses études menées ces 30 dernières années ont permis de mieux
comprendre les altérations génétiques et moléculaires impliquées dans le cancer. D’après
Hanahan et Weinberg, les altérations moléculaires promouvant la prolifération des cellules
tumorales peuvent être regroupées en 4 grands groupes : La motilité cellulaire (cadhérines,
Apc, intégrines) ; les mécanismes impliqués dans la différenciation et la croissance
cellulaire (p16, cycline D, p21,…) ; les mécanismes impliqués dans la prolifération (RTK,
RAS, MYC) et ceux impliqués dans la viabilité (facteurs de mort et de survie cellulaires,
cytokines…). Les voies de signalisation que l’on retrouve généralement dérégulées sont
représentées ci-dessous (figure 22) :

34
F IGURE 22 : R EPRESENTATION SCHEMATIQUE DES VOIES DE SIGNALISATION DEREGULEES DANS
LE CANCER (H ANAHAN & W EINBERG , 2011)

D’après Vogelstein et al, 12 voies de signalisation sont principalement impliquées dans la

progression tumorale. Ces 12 voies sont regroupées en 3 grands groupes : la survie et la
prolifération cellulaire, la maintenance de l’intégrité du génome, et les voies impliquées
dans le « destin » cellulaire, et sont présentées ci-après (figure 23) :

F IGURE 23 : V OIES DE SIGNALISATION CONNUES POUR ETRE DEREGULEES ET IMPLIQUES DANS

LA PROGRESSION TUMORALE (Vogelstein et al., 2013)

35
3.2.2 RTK, V O I ES D E S I GN ALI S AT I O N S E T C AN C ER

Parmi ces voies de signalisations dérégulées, on distingue notamment celles impliquées

dans la survie cellulaire et la prolifération cellulaire, activées par les RTKs (cf figure 22).

La dérégulation de l’expression et/ou de l’activité des RTK peut induire un déséquilibre

dans les voies de signalisation qu’ils régulent. Certaines voies impliquées dans le
métabolisme, la survie et la prolifération peuvent alors être suractivées au détriment des
voies de contrôle de la prolifération ou de la survie, telle que la régulation de certains gènes
pro-apoptotiques ou suppresseurs de tumeurs. Parmi les protéines clés impliquées dans la
survie et la prolifération et qui peuvent être suractivées, on peut citer les protéines AKT,
RAS, ainsi que certaines protéines de la famille des MAPKinases (Mitogen-Activated-
Protein-Kinases), telles que les protéines JNK, P38 et RAF. La protéine AKT possède un
nombre important de substrats, comme les protéines BAD et GSK3β qui, lorsque
phosphorylées par AKT, sont alors inhibées. La protéine BAD joue un rôle clé dans
l’apoptose et son inhibition permet ainsi d’entraîner un échappement à la mort cellulaire.
Quant à la protéine GSK3β, son inhibition permet la stabilisation de certaines protéines qui
ne sont alors plus dégradées par le protéasome. On peut citer par exemple l’oncogène
MYC dont la stabilisation et la localisation nucléaire peuvent être dépendantes de GSK3β
(Gregory, Qi, & Hann, 2003). Une forte activation d’AKT peut permettre de promouvoir la
survie cellulaire tout en inhibant les substrats qui permettent de la contrôler. Quant à la
protéine Ras elle est impliquée dans une cascade de signalisation jouant un rôle important
dans la régulation des gènes, tels que les gènes FOS et MYC, proto-oncogènes impliqués
très fréquemment dans la progression tumorale. La voie de signalisation
RAS/RAF/MEK/ERK est aussi connue pour jouer un rôle majeur dans le contrôle de la
prolifération cellulaire. L’activation des RTK peut donc jouer un rôle clé dans la régulation
des différentes voies de signalisation. Dans une cellule normale ils orchestrent la régulation
de ces voies afin de maintenir un équilibre entre prolifération, survie et arrêt de prolifération,
différenciation ou mort cellulaire. Leurs dérégulations peuvent entraîner la perte d’équilibre
dans la régulation de ces voies, promouvant ainsi la prolifération et la survie cellulaire, et
donc promouvant l’apparition de tumeurs.

36
F IGURE 24 : V OIES DE SIGNALISATION MAJEURES ACTIVEES PAR LES FACTEURS DE CROISSANCE
ET LEURS RECEPTEURS (Witsch, Sela, & Yarden, 2011)

3.2.1.1 P R O T E I N E S RAS E T C A N C E R
Les protéines RAS (HRAS, NRAS, KRAS) sont des petites GTPases qui font parties de la
famille des protéines G monomériques impliquées dans la transduction du signal. Les
protéines RAS sont impliquées dans l’activation de nombreuses voies de signalisation,
contrôlant la transcription, le cycle cellulaire, la survie, la migration, et la prolifération
cellulaire mais aussi l’endocytose (figure 25),(Berndt, Hamilton, & Sebti, 2011). Des
mutations somatiques entraînant des gains de fonction de RAS sont fréquemment
retrouvées dans les cancers, c’est pourquoi on parle de « l’oncogène RAS » (Schubbert et
al., 2007). Les récepteurs RTK présents à la surface cellulaire recrutent et activent des
protéines qui relaient le signal. La mise en place de cette « plateforme » d’activation des
voies de signalisation peut conduire à l’activation des protéines RAS via les facteurs GEF
(guanine nucleotide-exchange factors). Les facteurs GEF possèdent une activité
catalytique permettant de convertir le complexe RAS-GDP inactif en complexe RAS-GTP
actif. La protéine RAS-GTP peut alors activer ses substrats, tels que la phosphatidyinositol
3-kinase (PI3K), ou la protéine RAF (Schubbert, Shannon, & Bollag, 2007). L’inactivation
de RAS se fait grâce aux facteurs GAP dont le rôle de dé-phosphoryler le complexe RAS-
GTP pour que RAS soit de nouveau lié au GDP et inactif.

37
 F IGURE 25 : V OIES DE SIGNALISATION ACTIVEES PAR LES PROTEINES R AS (Berndt et al.,
2011)

Les mutations de RAS sont retrouvées dans environ 30% des cancers humains. Les
différents membres de la famille des protéines RAS sont spécifiquement retrouvés mutés
dans différents types de cancers. Ainsi, les mutations de KRAS sont prévalentes dans les
cancers colorectaux, les cancers de l’endomètre, du poumon et du pancréas. Les mutations
de NRAS et KRAS sont retrouvées dans les myélomes (Schubbert et al., 2007). Dans les
cancers de vessie, on trouve dans l’ordre de fréquence de mutations HRAS, KRAS et très
peu souvent NRAS (cosmic database : catalogue of somatic mutations in cancer). Dans la
plupart des cas, les mutations du gène RAS sont des mutations somatiques faux-sens
conduisant à la substitution d’un aminoacide aux positions 12,13 et 61. La protéine RAS-
GTP devient alors résistante aux GAP (facteurs impliqués dans l’inactivation de RAS), lui
permettant ainsi de rester en permanence dans une conformation active.

3.2.1.2 L A V O I E D E S I G N A L I SA T I O N PI3K/AKT
Activation de la PI3Kinase par les RTK

L’une des voies de signalisation les plus actives dans de nombreux types de tumeurs est
la voie PI3K/AKT, à la base de cascades de signalisation promouvant la croissance
cellulaire, la prolifération, la survie et la motilité, réponses cellulaires impliquées dans la
progression tumorale (Vivanco & Sawyers, 2002).

38
La kinase PI3K (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) est composée de deux
sous unités : la sous-unité p110 et la sous-unité p85. L’activation de PI3K par les RTK a
pour but d’induire la formation de PI3P (phosphatidylinositol 3-phosphate) à partir de PI2P
(phosphatidylinositol 2-phosphate) à la membrane. Cette activation de la PI3K par les RTKs
peut se faire selon trois modes d’activations représentés figure 26.

Le RTK peut directement phosphoryler le domaine SH2 lié à la sous-unité p85 de la protéine
PI3K, ou via le recrutement et l’activation de la protéine IRS1. Ces deux cas de figure
permettent de transmettre le signal de la sous-unité 85 à la sous-unité p110 et ainsi
conduire à la formation de PI3P à partir de PI2P à la membrane. Le dernier cas de figure
permettant l’activation de PI3K et la formation de PI3P est plus complexe. Dans ce cas
précis, le RTK va recruter et phosphoryler la protéine SHC qui va alors recruter les protéines
Grb2, Gab2 et RAS. La protéine RAS va alors directement interagir avec la sous-unité P110
de PI3K afin de générer du PIP3 à la membrane, sans passer par les domaines SH2 de la
sous-unité p85.

Une fois le PI3P généré, celui-ci agit comme second messager pour activer les voies de
signalisation sous-jacentes dont la protéine AKT. La production de PI3P est contrôlée par
les protéines PTEN, SHIP1 et SHIP2. PTEN est une phosphatase dont le rôle est de
convertir le PI3P en PI2P jouant ainsi le rôle de régulateur de l’activation de la voie de
signalisation PI3K/AKT.

F IGURE 26 : M ODELE D ’ ACTIVATION DE PI3K (Vivanco & Sawyers, 2002).

39
Activation d’AKT et de ses cibles

La protéine PI3K activée induit la production de PI3P à la membrane, second messager qui
va à son tour activer les protéines PDK1 et PDK2 (3-phosphoinositide dependent protein
kinase-1/2). Les protéines PDK1 et PDK2 vont alors activer AKT. La protéine AKT est une
sérine/thréonine kinase jouant un rôle crucial pour la prolifération et la survie cellulaire dans
de nombreux cancers. Elle est capable en phosphorylant ses cibles de les activer ou de les
inhiber. On citera par exemple MDM2, qui phosphorylée et activée par AKT, inhibe le gène
suppresseur de tumeur TP53, ou encore NFKB, qui inhibe l’apoptose. A l’inverse, AKT
phosphoryle la protéine GSK3β dans le but de l’inhiber. L’inhibition de GSK3β induit alors
la stabilisation protéique de certains facteurs promouvant la tumorigénèse. Cependant la
PI3K peut directement moduler certaines fonctions cellulaires telles que la survie et le
réarrangement du cytosquelette sans passer par l’activation d’AKT, mais en activant
d’autres cibles que sont les protéines SGK, RAC1, CDC42 et PKC. L’ensemble des voies
de signalisation activées par PI3K/AKT est représenté ci-après (figure 27) :

F IGURE 27 : V OIES DE SIGNALISATION DE PI3K/AKT (Vivanco & Sawyers, 2002)

40
Régulation de l’activation de la voie de signalisation PI3K/AKT par la protéine PTEN

PTEN est considéré comme un gène suppresseur de tumeur, du fait de sa capacité à

réguler négativement l’activation de la voie de signalisation PI3K/AKT, ainsi que la
prolifération, la survie, la migration et la mort cellulaire. Dans les cancers de vessie, on
trouve dans les tumeurs papillaires des mutations activatrices de PI3KCA, responsables en
partie de la progression tumorale. Ces mutations de PIK3CA peuvent conduire à une forte
activation des voies de signalisation régulées par la protéine AKT. De plus dans les tumeurs
de vessie, la protéine PTEN est présente mais cela n’a aucune conséquence fonctionnelle
quant à l’activation de la voie PI3K/AKT suggérant que l’inactivation de PTEN dans ces
cancers est peut être due à une modification post-traductionnelle. PTEN peut subir
différentes modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l’oxydation ou
encore la nitrosation (X. Wang & Jiang, 2008). Pour conserver son activité et rester
présente au niveau cytosolique, PTEN doit être phosphorylée. Cependant ce n’est que la
déphosphorylation de certains résidus dans le domaine C-terminal de PTEN qui permet à
celle-ci d’être localisée à la membrane et de jouer son rôle de convertisseur de PI3P en
PI2P. De plus, PTEN peut se trouver dans une conformation repliée lui permettant
d’échapper à la dégradation par le protéasome. PTEN est alors stabilisé au niveau
cytosolique mais ne peut pas migrer à la membrane (X. Wang & Jiang, 2008). Il est possible
d’émettre l’hypothèse selon laquelle, dans les tumeurs de vessie, PTEN puisse être présent
dans une conformation l’empêchant d’être actif ou d’être phosphorylé sur des résidus le
bloquant au niveau cytosolique.

3.2.1.3 V O I E S D E SI G N A L I SA T I O N D E S MAPK I N A S E S
Les protéines MAPKinase (Mitogen-activated-protein Kinases) sont une famille de
protéines activées en réponse à divers stimuli, notamment les mitogènes (composé
chimique ou action promouvant la division cellulaire), les stress cellulaires (stress
thermique, osmotique, UV…), les cytokines pro-inflammatoires et les RTK.

Les protéines MAPKinases modulent de manière contexte et tissu spécifique la

prolifération, la différenciation, la survie et la migration (Wagner & Nebreda, 2009). La
cascade de signalisation activée par l’un de ces processus débute par les protéines
MAP3Ks (MAPKKK : Mitogen Activated Kinase Kinase Kinase) qui sont les premières
activées dès que l’un de ces trois signaux arrive à la membrane extracellulaire. Ces
MAP3Ks activent alors les MAP2Ks (MKK4, MKK7, MKK3 et MKK6). Les protéines MKK3
ET MKK6 vont alors phosphoryler la protéine p38, alors que les protéines MKK4 et MKK7
vont préférentiellement phosphoryler la protéine JNK. Les protéines JNK et p38 activées
vont réguler positivement ou négativement certains facteurs de transcription (Jun, MYC,

41
P53) permettant ainsi d’induire la réponse biologique nécessaire. Elles peuvent également
réguler directement certaines protéines telles que BAX ou Bcl-2 impliquées dans la mort
cellulaire induite (apoptose), mais aussi la cycline D1 impliquée dans la régulation du cycle
cellulaire. L’activation de ces voies de signalisation est représentée ci-après (figure 28) :

F IGURE 28 : V OIES DE SIGN ALISATION ACTIVEES P AR LES MAPK SUITE A UN STRESS (Wagner
& Nebreda, 2009).

La protéine JNK (C-Jun N-terminal Kinase) existe sous 3 isoformes (JNK1, 2 et 3). La
protéine P38 est présente sous 4 isoformes (α, β, δ, γ). Ce sont généralement les protéines
JNK1, JNK2 et p38 α que l’on retrouve impliquée dans le développement de nombreux
cancers.

Rôle anti-tumoral de p38

L’activation de la protéine p38 peut jouer un rôle pro-ou anti-tumorale en fonction du

contexte cellulaire. Avant de connaitre le rôle pro-tumoral de la protéine p38 dans les
tumeurs solides, celle-ci était considéré comme un potentiel suppresseur de tumeurs,
plusieurs arguments allant dans ce sens. Il a en effet été montré que p38 est capable de

42
réguler négativement la cycline D1 contrairement aux MAPKinases p42/P44 (Lavoie,
L’Allemain, Brunet, Muller, & Pouyssegur, 1996), de moduler l’expression des inhibiteurs
du cycle cellulaire (Wong et al., 2009), et d’induire l’activation des voies de signalisations
p16/Rb et p19/P53 en réponse à un stress cellulaire causant des dommages à l’ADN
(Bulavin et al., 2004; Bulavin, Amundson, & Jr, 2002). Il a été montré par la suite que p38
coopérait avec la protéine HuR (protéine stabilisatrice des ARNm) pour induire la
stabilisation de différents ARNm. C’est le cas de l’ARNm de p21. HuR se fixe sur la partie
3’UTR des ARNm qu’il stabilise. La phosphorylation de la protéine HuR par p38 induit une
activation de HuR qui peut alors faire la navette entre le noyau et le cytoplasme. HuR est
alors localisé dans le cytoplasme et stabilise l’ARNm de p21. Lors d’un stress cellulaire dû
à une irradiation causant des dommages à l’ADN, p38 module donc positivement, via HuR,
la stabilisation de l’ARNm de p21 afin d’induire un arrêt en phase G1 du cycle cellulaire et
ainsi empêche la transition entre les phases G1 et S et ce, indépendamment de p53
(Lafarga et al., 2009).

En plus de réguler l’apoptose et le cycle cellulaire, p38, et plus particulièrement p38α, est
capable d’inhiber la formation de tumeurs en jouant le rôle de senseur de stress. La
production de ROS (« Reactive Oxygen Species ») par certains oncogènes (HRAS) induit
l’activation de p38α qui va alors induire l’apoptose (Dolado et al., 2007). P38 est dans ce
cas un régulateur négatif clé pour la transformation cellulaire et la progression tumorale.

Récemment il a été montré que la régulation négative de l’activité de p38 permettait la

formation de métastases de cellules tumorales du côlon, capables alors d’envahir le tissu
pulmonaire (Urosevic et al., 2014).

Rôle pro-tumoral de p38

Plusieurs études ont montré l’importance de l’activation de la protéine p38 dans le

développement de tumeurs solides (Kennedy, Cellurale, & Davis, 2007) (Koul, Pal, & Koul,
2013). Dans le cas du sous-type du cancer du sein HER2 positif, il a été montré que p38
pouvait être impliquée dans la résistance au trastuzumab (Z. Chen & Nahta, 2014).

De plus tout comme la protéine AKT, la protéine p38 est capable de réguler l’activation de
la protéine GSK3β en la phosphorylant sur le site sérine 389 (Thornton et al., 2008),
aboutissant à la stabilisation de protéines qui auraient dues être dégradées en temps
normal par le protéasome, comme par exemple, la protéine MYC.

43
Voie de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK

La voie de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK fait elle aussi partie des voies de signalisation
des MAPKinases. Cette voie est une des voies de signalisation les plus dérégulées dans
de nombreux cancers, elle peut notamment être activée par les RTK. La protéine RAF est
une MAP3K activée par la protéine RAS, qui va activée la protéine MEK (MAP2K), qui
active in fine la MAPKinase ERK. La protéine ERK activée est alors transloquée dans le
noyau où elle va activée de nombreux facteurs de transcription promouvant ainsi la
prolifération et la survie cellulaire. L’activation de cette cascade de signalisation est
représentée ci-après (figure 29) :

F IGURE 29 : ACTIVATION DE LA VOIE DE SIGNALISATION RAS/RAF/MEK/ERK PAR LES RTK

(H. J. Kim & Bar-Sagi, 2004)

On citera l’exemple du récepteur EGFR dont la surexpression dans de nombreux cancers

peut conduire à l’activation de cette voie de signalisation, qui aboutit à la production de
TGFα aboutissant ainsi à une boucle de rétrocontrôle autocrine dont le rôle est essentiel à
la progression tumorale (Roberts & Der, 2007).

Des mutations de RAF sont retrouvées dans les cancers humains et notamment dans le
cas du mélanome où BRAF est mutée dans 70% des cas. Ces mutations des premiers
effecteurs de la cascade de signalisation que sont les protéines RAS et RAF conduit à une
très forte activation des protéines MEK1/2 et ERK1/2.

44
3.2.1.4 L A P R O T E I N E H U R
Structure et rôle

La protéine HuR, aussi appelée ELAVL1 (Embryonic Lethal Abnormal Vision Like 1) fait
partie de la famille des protéines ELAV, famille de protéines se liant aux ARN messagers
(ARNm). Cette famille de protéines a initialement été identifiée comme impliquée dans le
développement neuronale chez la drosophile. On distingue 4 protéines dans cette famille:
HuB, HuC et HuD qui sont exclusivement exprimées dans le tissu neuronal et HuR qui est
exprimée dans de nombreux tissus et types cellulaires. Ces protéines de la famille ELAV
font elles-mêmes parties de la grande famille des protéines RBPs (RNA Binding Protein),
dans laquelle on trouve les protéines HNRNP. La protéine HuR est impliquée dans la
stabilisation et la transcription de nombreux ARNm, dans de nombreux types cellulaires.
HuR se fixe sur la partie non traduite des ARNm, que sont les parties 3’-UTR et 5’-UTR
des ARNm, qui contiennent les domaines AU-rich Element (AREs). De nombreux ARNm
de facteurs pro-oncogéniques font parties des cibles de HuR tels que des ARNm de proto-
oncogènes, de facteurs de croissance ou encore des cytokines. Dans de nombreux cancers
humains l’expression de HuR est retrouvée altérée (colon, sein, ovaires…). HuR est la
première RBP pour laquelle il a été montré qu’elle pouvait jouer un rôle critique dans la
progression tumorale, en tant qu’oncogène mais aussi comme suppresseur de tumeur, en
fonction des cibles qu’elle régule, et de manière contexte spécifique (voir figure 30 ci-après).
HuR est à l’heure actuelle considérée comme une nouvelle cible thérapeutique prometteuse
ainsi qu’un potentiel bon marqueur pour le suivi de la réponse au traitement (Wang et
al.2013).

F IGURE 30 : L ES DIVERSE PROPRIETES DE H U R DANS LE DEVELOPPEMENT DU CANCER A

TRAVERS LA REGULATION DE SES CIBLES (W ANG ET AL . 2013).

45
Mécanismes de régulation des ARNm

La protéine HuR est composée de 3 motifs RRM (RNA Recognition Motif) et d’une
séquence HNS. Ces motifs RRM permettent à la protéine HuR de se lier à ces cibles, tandis
que sa séquence HNS lui permet de faire la navette entre le noyau et le cytoplasme. HuR
reconnaît et se fixe sur les éléments riche en adénylate/uridylate des parties UTR de
l’ARNm cible, on parle alors de (AU) ou (U)-rich element (ARE) qui sont reconnus par les
domaines RRM de HuR. Les motifs ARE présents sur les ARNm conduisent à une
dégradation rapide de ceux-ci, la fixation de HuR sur ces ARNm induit leur stabilisation.
C’est pourquoi la régulation des ARE-mRNA via les protéines RBP est un mécanisme
important dans les cellules de mammifères.

HuR après avoir été transcrit et traduit est importé dans le noyau via la protéine importine
1. Une fois dans le noyau HuR se fixe sur ses ARNm cible. En réponse à certains stimulis
cellulaires, HuR fait la navette du noyau vers le cytoplasme où il va stabiliser l’ARNm qu’il
fixe dans le cytoplasme en le protégeant d’une dégradation par les éxonucléases, et va
promouvoir la transcription de cet ARNm. HuR se détache lui-même de l’ARNm qu’il a
stabilisé et retourne dans le noyau pour aller fixer de nouveau ses ARNm cibles. Lorsque
la protéine HuR est active sa localisation est répartie entre le noyau et le cytoplasme.
Cependant si la protéine HuR peut induire la stabilisation de certains ARNm, elle peut aussi
coopérer avec certains micro-ARN pour induire leur dégradation. Certains miRNA ont le
même site de fixation sur un mRNA donné que la protéine HuR. Certains miRNA peuvent
antagoniser l’effet stabilisateur de HuR, en entrant en compétition avec la protéine. La
stabilisation ou la dégradation des ARNm dépend alors de la force avec laquelle HuR se lie
à l’ARNm et des micro-ARN qui ciblent de manière spécifique l’ARNm auquel HuR est lié.
D’autres protéines peuvent être impliquées dans la stabilisation des ARNm en plus de HuR,
ces protéines font parties de la grande famille des RBP et appartiennent à la sous-famille
des hnRNP (heterogenous Nuclear Ribo Nucleo Proteins). Cette famille de RBP n’a était
identifiée que récemment. Les protéines hnRNP se lient aux pré-ARNm et peuvent
coopérer avec HuR pour la stabilisation de certains ARNm. De plus, certaines hnRNP,
notamment les protéines HNRNPA1, B1 et K voient leur expression fortement dérégulée
(surexpression) dans certains cancers. Ces mécanismes sont représentés ci-dessous
(figure 31) :

46
 F IGURE 31 : M ECANISME DE STABILIS ATION DES ARN M PAR H U R (Jun W ang et al., 2013).

HuR est importé dans le noyau grâce à la protéine importine 1. La protéine HuR se lie aux
ARNm cibles possédant un domaine ARE en 3’-UTR (partie non traduite des ARNm). Une
fois que HuR s’est lié à l’ARNm cible, il induit un shuttle nucléo-cytoplasmique de cet ARNm,
il protège alors l’ARN auquel il est lié afin de la dégradation par des exonucléases et
promeut sa traduction. D’autres protéines peuvent se lier à ces mêmes ARNm, ce sont les
protéines hnRNP représentées ici en rouge, avec lesquelles HuR peut coopérer pour
stabiliser les ARNm. HuR peut aussi coopérer ou rentrer en compétition avec certains
micro-ARN qui ciblent spécifiquement certains ARNm. La liaison des micro-ARN sur leurs
ARNm cibles conduit généralement à la dégradation de ceux-ci. On peut citer l’exemple du
recrutement de LET-7C et RISC par HuR pour réguler négativement l’ARNm de MYC, par
liaison sur la partie 3’-UTR de l’ARNm de MYC (H. H. Kim et al., 2009).

Il est intéressant de préciser ici que de nombreux stress cellulaires induisent une
accumulation cytoplasmique de HuR (UV, LPS, composés chimiques, cytokines,
infections…) et de corréler cela au fait que HuR coopère avec la protéine de réponse au
stress p38 pour stabiliser certains ARNm.

47
3.2.1.5 V O I E S D E SI G N A L I SA T I O N D E S P R O T E I N E S STAT
La famille des protéines STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) allant
de STAT1 à STAT6 est composée de sept membres (dont 2 isoformes pour STAT5 :
STAT5a et STAT5b). Contrairement aux voies de signalisation présentées précédemment,
ces protéines n’induisent pas l’activation d’une cascade de signalisation mais relaient le
signal directement, en le captant à la membrane (RTK, récepteurs aux cytokines) et le
transportent jusque dans le noyau où elles jouent leur rôle de facteurs de transcription. Les
protéines STAT peuvent être activées de trois manières différentes : soit par les récepteurs
aux cytokines (plus précisément par le récepteur à l’interféron ou celui à l’interleukine 6),
soit par les RTK, ou directement par les protéines SRC ou ABL. Bien qu’ils aient fixés leurs
ligands, la plupart des récepteurs aux cytokines ne possèdent pas d’activité tyrosine kinase
intrinsèque, contrairement aux récepteurs RTK, et ont donc besoin de recruter les protéines
kinases JAK et SRC pour être phosphorylés et activés. L’activation du récepteur va alors
permettre le recrutement des protéines STAT (Yu & Jove, 2004),(figure 32).

F IGURE 32 : R EPRESENTATION DES DIFFERENTS MODES D ’ ACTIVATION DES PROTEINES STAT

(Yu & Jove, 2004)

Dans différents types de cancers humains, les protéines STAT peuvent être en permanence
activées, et plus particulièrement les protéines STAT3 et STAT5. Pour cela trois
mécanismes peuvent être en cause. Le premier consiste en une activation constitutive des
récepteurs aux cytokines due à une expression paracrine ou autocrine de leurs ligands, tels
que l’IL6. Le second résulte d’une forte activation, voir d’une activation constitutive de
certains RTK tels que l’EGFR ou le PDGFR qui possèdent une activité tyrosine kinase
intrinsèque (Yu & Jove, 2004). Dans certains cas, suite à des altérations génétiques, les
protéines STAT peuvent être directement activées par les kinases ABL ou SRC (dans ce

48
cas-là, ABL et SRC sont constitutivement activées). Le meilleur exemple est celui de la
protéine de fusion BCR-ABL retrouvée dans les leucémies myéloïdes chroniques.

Les protéines STAT sont un véritable point de convergence pour de nombreuses voies de
signalisation impliquées dans l’oncogenèse. Elles contrôlent la survie et la prolifération
cellulaire mais aussi en partie l’angiogenèse et l’échappement au système immunitaire
(figure 33). C’est pourquoi une activation aberrante des protéines STAT promeut la
formation de tumeurs.

F IGURE 33 : C ONTROLE DE LA SURVIE ET DE LA CROISSANCE CELLULAIRE PAR LES PROTEINES

STAT (Yu & Jove, 2004)

3.2.1.6 V O I E S D E SI G N A L I SA T I O N A C T I V E E S D A N S L E C A N C E R
Dans les cellules de mammifères, suite à un stimuli cellulaire (cytokines inflammatoires,
RTK, stress cellulaire) les voies Ras/Raf/MEK/ERK, JNK, p38, PI3K/AKT/mTOR peuvent
être activées pour moduler une réponse cellulaire adaptée. La dérégulation de ces voies
de signalisation à travers une activation permanente ou leur inhibition (exemple de la
protéine p38) peut conduire à l’apparition de cellules tumorales capables d’échapper à la
mort cellulaire et au système immunitaire. Il est important de préciser que les tumeurs RAS
mutées sont généralement très agressives du fait que RAS est capable d’activer les voies
RAF, PI3K, p38 et JNK. Un résumé des voies de signalisation généralement impliquées
dans la progression tumorale est représenté ci-après (figure 34), (Lee, Bode, & Dong,
2011). Cependant bien que ces voies de signalisation soient plutôt bien caractérisées, leur
recoupement (inhibition de l’une qui induit une sur-activation de l’autre) pour moduler les
mêmes cibles et la même réponse cellulaire, leur inhibition ou leur activation de manières
tissus et contextes spécifique restent à élucider dans de nombreux cancers. C’est le cas
dans les tumeurs de vessie qui expriment le récepteur muté ou les protéines de fusion
FGFR3-TACC3 et FGFR3-BAIAP2L1, où les voies de signalisation activées par le

49
récepteur restent à identifier. Ces voies de signalisation dérégulées dans le cancer et
activées par divers stimulis dont les RTK sont représentées ci-après (figure 34) :

F IGURE 34 : R EPRESENTATION DES VOIES DE SIGNALISATION ONCOGENIQUES (Lee et al.,

2011)

L’identification des voies de signalisation activées par les RTK dans le cancer a permis
d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques autres que les récepteurs eux-mêmes.

3.2.3 T R AI T E M EN T S T H ER AP E UT I Q U ES CI B L AN T L E S RTK S E T L E UR S V O I E S D E
SI G N A LI SA T I O N S

A l’heure actuelle il existe principalement deux types de traitements thérapeutiques pour

cibler les RTK dans les tumeurs humaines. Le premier repose sur l’utilisation d’anticorps
ciblant les RTK et permettant d’induire la mort cellulaire. On peut citer l’exemple du
trastuzumab ciblant spécifiquement la protéine HER2 (ERBB2), utilisé notamment dans un
sous type du cancer du sein. Le second type de traitement repose sur l’utilisation de
drogues ciblant soit l’activité du domaine kinase du récepteur ciblé, soit les protéines
impliquées dans les voies de signalisation activées par le récepteur. La compréhension des
voies de signalisation activées par les RTK dans les différents types de cancers a en effet
permis de développer des inhibiteurs ciblant spécifiquement différentes protéines clés
jouant le rôle d’oncogènes et promouvant la prolifération et la survie cellulaire, situés à
différents niveaux dans les voies de signalisation, allant des protéines juste en aval du
récepteur, jusqu’aux protéines impliquées dans la modification de l’expression des gènes
par mécanismes épigénétiques, tels que les HDAC (figure 35).

50
 F IGURE 35 : C IBLAGE THERAPEUTIQUE DES VOIES DE SIGNALISATION DES RTK S DANS LES
TUMEURS SOLIDES (Witsch et al., 2011)

Le sujet de cette thèse a porté sur l’étude d’un RTK en particulier, le récepteur FGFR3. Ce
récepteur fait partie de la famille des récepteurs FGFR. Le rôle des FGF récepteurs et plus
particulièrement de FGFR3 seront présentés dans un premier temps dans le cadre du
développement osseux puis dans le cadre du cancer.

51
C HAPITRE IV : L ES
RECEPTEURS FGFR : STRUCTURE ,
ACTIVATION , ROLES DANS LE DEVELO PPEMENT ET LE CANCER

La famille des récepteurs FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor) est constituée de 4
membres : FGFR1 à 4. Les récepteurs FGFR sont impliqués dans divers processus
biologiques au cours du développement embryonnaire mais aussi à l’âge adulte, tels que
la prolifération cellulaire, la croissance, la survie, la différenciation et la migration.

4.1 S TRUCTURE ET A CTIVATION

Structure

Un récepteur FGFR est constitué de trois domaines : un domaine extracellulaire,

comprenant un peptide signal au niveau N-terminale, 3 domaines immunoglobulines (Ig I,
II et III), une acide box, un domaine transmembranaire, et un domaine intracellulaire
correspondant au domaine tyrosine kinase (figure 36). Cependant, l’épissage alternatif des
transcrits des gènes codant pour les 4 membres de la famille des récepteurs FGFR permet
d’obtenir une variété d’isoformes des récepteurs FGFR1 à 4. Ces épissages alternatifs
permettent de synthétiser des récepteurs FGFR solubles ou secrétés, des récepteurs avec
un domaine terminal COOH tronqué, des récepteurs avec deux ou trois domaines
Immunoglobulines (Ig). Il existe de plus un épissage alternatif possible dans la seconde
moitié du troisième domaine immunoglobuline permettant d’obtenir les isoformes Ig IIIb ou
IIIc du récepteur. Cependant ce dernier type d’épissage alternatif n’est retrouvé que pour
les FGFR1, 2 et 3. Ces épissages alternatifs vont donc permettre d’obtenir un panel de
récepteurs FGFR pour lesquels le ligand FGF (Fibroblast Growth Factor) ne sera pas le
même.

F IGURE 36 : S TRUCTURE DES RECEPTEURS FGFR (Mason, 2007)

52
Activation

L’activation des récepteurs FGFR se fait après fixation d’une molécule de ligand FGF sur
le domaine immunoglobuline III d’un monomère FGFR, additionné d’une molécule d’
Heparine Sulfate Proteoglycane (HSGP). L’activation du récepteur se fait après
dimérisation entre deux monomères liés chacun à une molécule de FGF et une molécule
de HSPG selon le modèle 2 :2 :2 FGF-FGFR-HSPG, formant un complexe ternaire. Cette
dimérisation permet ainsi d’induire la phosphorylation des différents résidus tyrosine
présents sur le domaine tyrosine kinase et la partie C-terminale. Le récepteur FGFR activé
peut alors recruter la protéine FRS2α qui sert de protéine d’ancrage aux autres partenaires
protéiques du récepteur. Pour cela le récepteur phosphoryle FRS2α qui peut alors recruter
GRB2 et induire sa phosphorylation, GRB2 peut à son tour recruter d’autres protéines et
induire leurs phosphorylations (figure 37).

F IGURE 37 : R EPRESENTATION DE LA STRUCTURE PROTOTYPIQUE D ’ UN RECEPTEUR FGF

(Haugsten, W iedlocha, Olsnes, & Wesche, 2010b) .

A : Représentation schématique d’un RTK sous forme monomérique, et principaux

domaines. B : Représentation de la dimérisation d’un Récepteur FGFR après liaison au
ligand FGFR à l’héparine, et activation des voies de signalisations. (Haugsten et al., 2010)

53
4.2 R OLES DES RECEPTEURS FGFR DANS LE DEVELOPPEMEN T OSSEUX

Le développement osseux se fait selon deux modes : le premier est le mode intra-
membraneux qui consiste en la formation d’ostéoblastes à partir de cellules
mésenchymateuse progénitrices et qui est impliqué dans le développement des os plats
(exemple du crâne). Le second est le mode endochondral ou intra-cartilagineux qui consiste
en la différenciation de cellules mésenchymateuses en chondrocytes constituant une base
de cartilage aboutissant à la formation des os longs et des vertèbres. Les récepteurs FGFR
et les facteurs de croissance fibroblastiques (FGF) qui se lient à eux jouent un rôle essentiel
dans le développement osseux, mais aussi dans la maintenance de l’homéostasie osseuse
chez l’adulte. Les mutations activatrices des récepteurs FGFR1-3 sont impliquées dans de
nombreux syndromes osseux (Su, Jin, & Chen, 2014).

Les récepteurs FGFR1-3 (mais pas le FGFR4) et les FGF avec lesquels ils interagissent
sont impliqués dans le développement squelettique via ces deux modes, qui seront décrits
ci-après.

Implication des récepteurs FGFR1, 2, 3 dans la régulation de l’ostéogénèse (mode

intra-membraneux)

Les récepteurs FGFR1, 2 et 3 sont impliqués dans la différenciation des ostéoblastes,

depuis la différenciation des cellules mésenchymateuses en pré-ostéoblastes, puis la
différenciation de ces derniers en ostéoblastes, mais aussi dans la minéralisation osseuse
(figure 38). Le rôle des récepteurs FGFR1 et FGFR2 sont bien connus au cours de ce
développement alors que celui du récepteur FGFR3 reste très controversé, différentes
études ne menant pas aux mêmes conclusions.

F IGURE 38 : R EGULATION DE L ’ OSTEOGENESE PAR LES RECEPTEURS FGFR1, 2 ET 3 LORS DU

DEVELOPPEMENT SELON LE MODE INTRA - MEMBRANEUX (Su et al., 2014)

54
Implication des FGFR dans la régulation du développement des os long (mode
endochondral)

Les différentes études menées sur le rôle des récepteurs FGFR1, 2 et 3 dans le
développement des os long ont permis d’identifier les voies de signalisation activées par
ces derniers en vue de réguler la prolifération et la différenciation des chondrocytes. Les
voies principalement impliquées dans la régulation de ces deux processus sont les voies
Ras/Raf/MEK/ERK, STAT1/p21, et la voie PI3K/AKT. L’activation de la protéine STAT1 va
permettre de contrôler la prolifération des chondrocytes via l’activation de la protéine p21,
l’activation de PI3K/AKT est impliquée dans l’induction de l’apoptose après différenciation
des chondrocytes, quant à la voie RAS/RAF/MEK/ERK, elle est impliquée dans la régulation
de la différenciation des chondrocytes (figure 39). D’autres protéines sont activées par les
FGFR dans le développement des os longs mais ces mécanismes ne sont pas encore bien
connus. Parmi ces protéines on trouve la protéine PLCγ responsable de l’activation de la
protéine PKC, ainsi que la protéine Shc.

Figure 39 : Représentation des principales voies activées par les récepteurs FGFR au cours du
développement squelettique dans le mode endochondral (SU ET AL., 2014).

Le récepteur FGFR3 active la voie STAT1/P21 pour inhiber la prolifération des

chondrocytes, la voie RAS/RAF/MEK/ERK pour inhiber la différenciation des chondrocytes
et la voie PI3K/AKT pour induire (réguler) l’apoptose des chondrocytes différenciés.

55
FGFR3 : épissage alternatif, isoformes et expression tissulaire

Le gène FGFR3 est situé sur le chromosome 4, à la position 4p16. 19 exons codent pour
le transcrit FGFR3. Les rôles que joue le récepteur FGFR3 dans l’homéostasie sont à
l’heure actuelle peu connus. Il a cependant été montré qu’il est fortement exprimé au cours
du développement du système nerveux central. Il est aussi exprimé dans les précurseurs
de chondrocytes (cellules formant le cartilage) et joue un rôle important dans le contrôle de
la croissance des os. Contrairement aux récepteurs FGFR1 et 2 pour lesquels l’expression
est plus vaste au cours de l’organogénèse, celle de FGFR3 reste limitée, tout comme celle
de FGFR4 (Peters, Werner, Chen, & Williams, 1992). Il avait été montré récemment que
FGFR3 jouait aussi un rôle dans le développement de l’organe de Corti, organe de la
perception auditive (Szarama et al., 2012). De plus il existe plusieurs isoformes du
récepteur FGFR3, qui sont tissus dépendantes.

Un épissage alternatif au niveau des exons 8 et 9, codant pour le troisième domaine

immunoglobuline de la partie extracellulaire du récepteur, où l’on trouve le site de liaison
au ligand, permet d’obtenir deux isoformes : FGFR3b et FGFR3c. Ces deux isoformes sont
ligands-et-tissus spécifiques (on retrouve par exemple la forme FGFR3b exprimée dans les
cellules épithéliales et la forme FGFR3c dans les cellules de l’os), leurs homologies de
séquence sont de 100 % pour la globalité du récepteur, ainsi que dans la première moitié
du troisième domaine immunoglobuline, sauf au niveau du site d’épissage alternatif, où seul
le domaine de liaison au ligand diffère. On ne retrouve alors que 32% d’homologie de
séquence entre les deux isoformes (figure40).

56
 F IGURE 40 : L ES DEUX ISOFORMES DE FGFR3 : FGFR3 B , FGFR3 C .

La forme FGFR3b est exprimée dans les cellules épithéliales, la forme FGFR3c dans les
cellules de l’os. Leur homologie de séquence est de 100 % sauf au niveau du site
d’épissage alternatif où il n’y a alors plus que 32% d’homologie (entouré en rouge), c’est
alors le domaine de liaison au ligand qui diffère entre les deux isoformes.

Mutations activatrices de FGFR3 et syndromes squelettiques

La forme exprimée dans les chondrocytes suite à l’épissage alternatif du transcrit, est la
forme FGFR3c. Il a clairement été établi grâce à différentes études que le gène FGFR3
joue un rôle important dans l’arrêt de la croissance des os, conduisant au nanisme. Chez
la souris un Knock out de FGFR3 induit la formation d’os plus long comparé à un modèle
où l’expression de FGFR3 est normale (figure 41), (Su, Sun, et al., 2010).

F IGURE 41 : K NOCK OUT DE FGFR3 DANS UN MODELE MURIN (Su, Xu, et al., 2010)

Le Knock out de FGFR3 dans un modèle murin conduit à la formation d’os plus long en
comparaison à l’expression dans ce même modèle du récepteur FGFR3 sauvage, montrant
ainsi que FGFR3 contrôle la croissance et le développement osseux.

57
De plus, dans les cellules germinales, les mutations activatrices de FGFR3 sont la cause
de différentes maladies squelettiques. Ces altérations du gène FGFR3 sont notamment
observées dans les différentes formes de chondrodysplasie et de craniosténose, et plus
rarement dans une des formes de la maladie de Crouzon.

Dysplasies squelettiques humaines

Les dysplasies squelettiques sont des maladies de l’os se traduisant par différentes formes
de nanisme, résultant dans la plupart des cas d’une mutation du gène FGFR3 dans les
cellules germinales. Les différentes mutations de FGFR3 retrouvées dans les
chondrodysplasies sont représentées ci-après (figure 42). Elles peuvent toucher le domaine
extracellulaire du récepteur, le domaine transmembranaire, ainsi que le domaine tyrosine
kinase. Les mutations retrouvées dans les hypochondroplasies sont réparties entre le
domaine extracellulaire et le domaine tyrosine kinase du récepteur. Celles retrouvées dans
l’ACH (achondroplasie) ne sont qu’au nombre de trois (deux dans le domaine
transmembranaire qui sont caractéristiques de l’ACH et une dans le domaine
extracellulaire). En ce qui concerne les TDI (nanisme thanatophore de type I), on trouve
des mutations dans le domaine extracellulaire et le domaine tyrosine kinase. De manière
surprenante, la plupart des mutations retrouvées dans les TDI, sont des mutations d’un
acide aminé en une cystéine. Cette mutation conduit à la formation d’un pont disulfure et à
une dimèrisation constitutive du récepteur. En ce qui concerne les TDII et le SADDAN, c’est
le même acide aminé qui est muté mais la mutation retrouvée n’est pas la même (mutation
K650 E dans le cas des TDII (nanisme thanatophore de type II) et mutation K650 M dans
le cas du SADDAN (Serve achondroplasia with developmental delay and acanthosis
nigricans). Cette dérégulation de l’activation du récepteur est due soit à une mutation d’un
acide aminé en une cystéine conduisant à la formation d’un pont disulfure, et à la
dimèrisation constitutive du récepteur qui peut dès lors activer son domaine tyrosine kinase,
soit à l’activation directe du domaine kinase (mutations K650E et K650M).Les différentes
mutations du récepteur FGFR3 retrouvées dans les chondroplasies conduisent à une
activation aberrante de l’activité kinase du récepteur induisant un arrêt de la croissance
des os.

58
 F IGURE 42 : L ES DIFFERENTES MUTATIONS DE FGFR3 DANS LES CHONDRODYSPLASIES
(Harada et al., 2007)

Plusieurs études ont montré le rôle que jouent les mutations du gène FGFR3 dans
l’apparition des différentes chondrodysplasies, notamment l’ACH et les dysplasies
thanatophore de type I et II. Le récepteur FGFR3 muté induit à la fois la différenciation
précoce des chondrocytes, mais aussi une mort cellulaire par apoptose des cellules
progénitrices. Ces effets sont dus à la surexpression des protéines STAT1 et STAT5 ainsi
que les inhibiteurs du cycle cellulaire p16 et p21Cip1 résultant de l’activité du récepteur
FGFR3 muté, dans les cas d’ACH mais aussi de dysplasie thanatophore de type 1 et 2 (C.
Li, Chen, Iwata, Kitagawa, & Fu, 1999),(Lageai-Mallet et al., 2004, Li C et al., 1999). Il a de
plus été montré que c’est le recrutement et l’activation de la PCLγ par FGFR3 qui conduit
au recrutement de STAT1, permettant d’induire l’apoptose cellulaire des cellules
progénétrices des chondrocytes (Harada et al., 2007). Cette étude a de plus permis de
montrer que la localisation du récepteur FGFR3 muté entre le cytoplasme et le réticulum
endoplasmique joue un rôle crucial dans la sévérité des différentes formes de
chondrodysplasies (figure 43).

59
 F IGURE 43 : ACTIVATION DU RECEPTEUR , LOCALISATION ET SEVERITE DES DIFFERENTES
CHONDRODYSPLASIES (Harada et al., 2007)

Le taux de phosphorylation de FGFR3 ainsi que sa localisation cellulaire dans les cellules
de l’os sont étroitement liés à la sévérité de la chondrodysplasie. Ainsi un récepteur FGFR3
constitutivement activé et localisé dans le réticulum endoplasmique donne lieu à des TDII
et au syndrome SADDAN, formes de chondrodysplasies plus sévères que l’ACH.

En plus de la surexpression des protéines STAT1 et 5 et des protéines du cycle cellulaire,

les protéines P38 et ERK1/2 jouent elles aussi un rôle dans l’ACH. Une étude réalisée dans
un modèle murin a permis de montrer que dans le cas de la mutation activatrice G369C de
FGFR3 (correspond à la mutation G380R chez l’homme), les protéines MAPKinase P38 et
ERK1/2 étaient activées. L’activation de P38 par FGFR3 induit la différenciation
ostéogénique des cellules mésenchymateuses progénitrices, tandis que l’activation de la
voie ERK1/2 par FGFR3 inhibe la minéralisation osseuse (figure 44), (Su, Sun, et al., 2010).

F IGURE 44 : ACTIVATION DES PATHW AYS P38 ET ERK1/2 PAR FGFR3 ET CONSEQUENCES SUR
LA CROISSANCE ET LA MINERALISATION OSSEUSE (Su, Sun, et al., 2010)

60
Récemment, une étude a montré qu’un traitement aux statines permettait de restaurer
totalement le phénotype en empêchant la dégradation du cartilage (Yamashita et al., 2014).
Les résultats obtenus dans cette étude montrent que ce traitement pourrait être envisagé
pour traiter les nourrissons et les jeunes enfants atteints d’ACH.

4.3 R ECEPTEURS FGFR ET C ANCERS

Les récepteurs FGFR sont retrouvés comme étant impliqués dans de nombreux cancers
sous différentes formes : surexprimés, mutés ou sous forme de protéine de fusion. Lorsque
l’activation du récepteur n’est pas altérée c’est uniquement la liaison du ligand FGF qui
entraîne la dimèrisation et l’activation du récepteur. La phosphorylation du récepteur dans
son domaine tyrosine kinase permet l’activation de certaines voies de signalisation. Les
voies de signalisation connues pour être activées par les récepteurs FGFR sont les voies
de la PLCγ, la voie PI3K/AKT, la voie RAS/RAF ainsi que les protéines STAT. L’activation
de ces voies par les récepteurs FGFR va permettre la régulation de nombreux processus
cellulaires. Dans un contexte normal ces voies de signalisation vont être contrôlées grâce
à des régulateurs négatifs, tels que les protéines de la famille sprouty (SPRY) impliquées
dans la régulation de l’activation de nombreux RTK, dont les récepteurs FGFR. Le second
facteur de régulation négative est la protéine MPK3 (Mitogen-Activated-Protein-3) qui
module négativement l’activation d’ERK (figure 45 A).

Dans le cadre du cancer plusieurs types d’altérations peuvent induire une activation non
contrôlée des FGF récepteurs. Ces altérations sont :

 Implication du ligand FGF : L’activation des récepteurs FGFR peut être dérégulée
via les ligands FGF. La cellule peut se mettre à produire de fortes concentrations
de ligand FGF, ce qui peut induire une sur-activation de l’activité kinase du
récepteur FGFR et des voies de signalisation sous-jacentes. Une variation de
l’épissage de l’ARNm du récepteur FGFR exprimé peut entrainer une modification
du type de ligand que le FGFR fixe habituellement pour être activé (Figure 45 B (1)
et (2)).
 Implication des mutations ou apparition de protéines de fusion : des mutations du
récepteur FGFR peuvent entraîner une dimèrisation constitutive de celui-ci, ou une
activation permanente du domaine tyrosine kinase. Des protéines de fusion ont été
observées dans différents types de cancer pour les 4 récepteurs FGFR (FGFR1-
4). Les protéines de fusion (fusion avec une région promotrice ou avec un facteur
de transcription, ou avec un gène permettant un dimèrisation constitutive, exemple

61
 du produit de fusion FGFR3-TACC3), tout comme les mutations peuvent conduire
à une surexpression du récepteur (figure 45 B (3) et (4)).
 Amplification du récepteur : l’amplification du gène codant pour un récepteur FGFR
entraîne généralement une surexpression de celui-ci et une activation aberrante
des voies de signalisation qu’il active (figure 40 B (5)).
 Un autre mécanisme peut être impliqué dans la dérégulation de l’activation des
voies de signalisation par les récepteurs FGFR, c’est la régulation négative du
fonctionnement des régulateurs négatifs décrits précédemment que sont les
protéines SPRY et MPK3.

F IGURE 45 : S TRUCTURE , VOIES DE SIGNALISATION , ET DEREGULATIONS DES RECEPTEURS

FGFR DANS LE CANCER (a N. Brooks, Kilgour, & Smith, 2012). (1 ; 2) : REGULATION VIA LES
FGF LIGANDS , (3 ;4) : M UTATIONS ET PROTEINES DE FUSION , (5) : AMPLIFICATION DU GENE
CODANT POUR LE RECEPTEUR .

4.3.1 M UT AT I O N S , S U R E XP R ES SI O N ET T YP E T U MO R A L

Le plus souvent, les altérations qui touchent les récepteurs FGFR sont la surexpression
pouvant être due à une amplification du gène ou à une régulation transcriptionnelle
dérégulée, ou l’acquisition de mutations activatrices, conduisant dans la plupart des cas à
une dimèrisation constitutive du récepteur, alors activé en permanence, et n’ayant plus

62
besoin de fixer son ligand. Cependant, dans le cas d’une surexpression comme d’une
mutation d’un FGF récepteur, ces altérations ne sont pas obligatoirement « drivers » pour
l’apparition de tumeurs et peuvent jouer un rôle « passengers », bien qu’il y ait souvent une
corrélation entre la dérégulation d’un récepteur FGFR et la progression de certaines
tumeurs. Les tumeurs dans lesquelles on retrouve des mutations et des surexpressions de
ces récepteurs FGFR sont diverses (figure 46).

F IGURE 46 : R ESUME DES PRINCIPALES ALTERATIONS TOUCHANT LES RECEPTEURS FGFR DANS
LES CANCERS HUMAINS (Haugsten et al., 2010b)

Jusqu’à très récemment les protéines de fusion impliquant les FGFR n’avaient pas été
identifiées dans les désordres myélodysplasiques (MPD).

4.3.2 R E CE P T E UR S FGFR ET P R O T EI N E S D E F USI O N

Les protéines de fusion impliquant les FGFR ont été retrouvées très récemment dans
plusieurs cancers. Dans la majorité des cas l’apparition de ces protéines de fusion conférent
des propriétés oncogèniques au récepteur, bien que ce type d’altération semble plus rare
que les surexpressions ou les mutations (leurs fréquences d’apparition n’est pas encore
bien connue). Pour le récepteur FGFR2, 7 protéines de fusions ont été retrouvées dans
différents cancers mais avec une très faible fréquence, elles sont de plus toutes différentes.
Deux protéines de fusion ont été identifées pour le gène FGFR3 (mais la protéine de fusion
FGFR3-TACC3 apparaît beaucoup plus fréquemment et sous 3 formes différentes). Dans
le cas des protéines de fusion FGFR2 ou FGFR3, la fusion se situe en aval du domaine
tyrosine kinase. Cependant pour le gène FGFR1, deux protéines de fusion ont été
identifiées, avec une faible fréquence, mais contrairement au deux autres récepteurs FGFR

63
la fusion a lieu au niveau du domaine N-terminal. Ces protéines de fusion sont représentées
ci-après figure 47 :

Figure 47 : Représentation schématique des protéines de fusion impliquant les FGFR

identifiés (Y. Wu et al., 2013)

64
4.3.3 M UT AT I O N S DU R E C EP T EU R FGFR3 ET P RO T EI N E S D E FU SI O N

Mutations

Les mutations du gène FGFR3 ont été identifiées sur 3 exons : les exons 7, 10 et 15. Les
mutations du récepteur FGFR3 touchent le domaine extracellulaire (mutations dans l’exon
7), le domaine transmembranaire (mutations dans l’exon 10), et le domaine tyrosine kinase
(intracellulaire, mutations dans l’exon 15) (figure 48). Toutes ces mutations conduisent à
une activation aberrante du récepteur. Les mutations d’un acide aminé en une cystéine
présentes dans le domaine extracellulaire ou juxtamembranaire conduisent à une
dimèrisation constitutive du récepteur, qui n’a dès lors plus besoin de fixer son ligand pour
être activé. Les mutations retrouvées dans le domaine tyrosine kinase (TK), peuvent
conduire à une dimèrisation via la partie intracellulaire (mutation d’un acide aminé en une
méthionine à l’instar de la cystéine, permettant d’induire la formation d’un pont disulfure),
elles peuvent aussi conduire à une phosphorylation aberrante du domaine kinase.

F IGURE 48 : MUTATIONS DE FGFR3 SUR LES EXONS 7, 10 ET 15

Les mutations du récepteur FGFR3 ont été retrouvées dans différentes tumeurs : tumeurs
bénignes de la peau (kératoses séborrhéiques), cancer de la vessie, cancer du col de
l’utérus et quelques cas de myélomes multiples où la translocation t (4 ; 14) est présente.

65
La protéine de fusion FGFR3-TACC3

Le second type d’altération du récepteur FGFR3 consiste en la formation d’un gène de

fusion. Bien que ce type d’altération ait déjà été décrit pour les récepteurs FGFR 1 et 2, il
n’a été décrit pour la première fois que très récemment pour le récepteur FGFR3. La
protéine de fusion FGFR3-TACC3 a été identifiée pour la première fois dans le glioblastome
(Singh et al., 2013). Cette protéine de fusion est due à un remaniement chromosomique
sur le chromosome 4p16 entre les gènes FGFR3 et TACC3 (figure 49).

F IGURE 49 : F USION GENOMIQUE ENTRE L ’ EXON 17 DE FGFR3 ET L ’ INTRON 7 DE TACC3 ;

D ANS L ’ARN M DE FUSION QUI EN RESULTE L ’ EXON 16 DE FGFR3 EST EPISSE EN 5’ AVEC
L ’ EXON 8 DE TACC3 DANS LE GLIOBLASTOME (Singh et al., 2013)

Pour le récepteur FGFR3, deux types de gènes de fusion sont retrouvés. Les premiers
correspondant à une fusion entre les gènes FGFR3 et TACC3, fusions les plus
fréquemment observées. Le second transcrit de fusion est dû à la fusion entre les gènes
FGFR3 et BAIAP2L1 et a été retrouvé dans plusieurs cas de tumeur de vessie. Les fusions
entre les gènes FGFR3 et TACC3 ont été décrites dans le cancer de la vessie, dans le
cancer de la cavité buccale, dans le cancer du cou, du poumon et dans le glioblastome.
Quel que soit le gène de fusion, FGFR3 est conservé du domaine extracellulaire (Ig)
jusqu’au second domaine tyrosine kinase (TK). Le domaine de TACC3 fusionné avec
FGFR3 est le domaine C-terminal, appelé domaine « coiled-coil », codant pour une
structure hélicoïdale et permettant ainsi la formation d’une double hélice entre deux
monomères du récepteur. Il en est de même pour le gène de fusion FGFR3-BAIAP2L1,
dont le domaine BAR (dans la partie BAIP2L1 de la protéine de fusion) code aussi pour une
structure hélicoïdale.

Que le récepteur soit muté ou qu’il soit sous la forme d’une protéine de fusion, il acquière
alors des propriétés oncogéniques de par son activation permanente. Il a été montré dans

66
le cas du glioblastome que la protéine de fusion FGFR3-TACC3 induit une hyper-
prolifération des cellules tumorales, et une aneuploïdie. Cette aneuploïdie est corrigée
lorsque les cellules sont traitées avec un inhibiteur de l’activité kinase du récepteur FGFR3
(voir figure 50).

F IGURE 50 : C ORRECTION DE LA SEPARATION PREMATUREE DES CHROMATI DES SŒURS PAR LE

PD173074 ( INHIBITEUR DE FGFR3) DANS LES CELLULES EXPRIMANT LA PROTEINE FGFR3-
TACC3 (Singh et al., 2013)

L’ARNm de FGFR3 peut être régulé par le micro ARN mir99a. La fixation de ce mir99a sur
l’ARNm de FGFR3 induit sa dégradation. Or dans le cas du produit de fusion FGFR3-
TACC3, la partie de l’ARNm de FGFR3 normalement reconnue par mir99a est remplacée
par celle codant pour le domaine coiled-coil de TACC3 présent dans le produit de fusion.
De ce fait, l’ARNm FGFR3-TACC3 ne peut pas être dégradé. Il en résulte une augmentation
de l’expression de FGFR3-TACC3, corrélée à une augmentation de l’activation de ses
cibles, notamment les protéines ERK et STAT3, promouvant ainsi la prolifération cellulaire
(Babic & Mischel, 2013; Parker et al., 2013) ; (figure 51).

67
 F IGURE 51 : L A FORMATION DU PRODUIT DE FUSION FGFR3-TACC3 ECHAPPE A LA
REGULATION PAR LE MIR 99 A. (Babic & Mischel, 2013)

Le produit de fusion FGFR3-TACC3 échappe à la régulation par le mir99a du fait que la

partie de l’ARNm FGFR3 normalement reconnue par le mir99a n’est pas présente dans ce
produit de fusion, conduisant à une surexpression du produit FGFR3-TACC3 qui active
alors les protéines ERK et STAT3 promouvant ainsi la progression tumorale.

68
4.3.4 A LT E R A T I O N S D U G EN E FGFR3 ET K E R AT O SE S S E BO RR H EI Q U E S

Les kératoses séborrhéiques, ou verrues séborrhéiques, sont des tumeurs épithéliales

bénignes se présentant sous la forme de lésions cutanées bourgeonnantes. Ces tumeurs
bénignes sont fréquentes chez l’homme âgé.

Il a été montré dans un modèle murin (Logié, Dunois-Lardé, Rosty, Levrel, Blanche, Ribeiro,
Gasc, Jorcano, Werner, Sastre-Garau, et al., 2005) que l’expression du gène FGFR3 muté
(S249C) sous dépendance du promoteur à la kératine 5 (K5), et activé dans l’épiderme,
conduit à la formation de lésions de l’épiderme (tumeurs bénignes de la peau) semblable
aux kératoses séborrhéiques retrouvées chez l’homme. De plus, l’analyse de 62 tumeurs
bénignes de la peau a permis d’identifier des points de mutations de FGFR3, au niveau des
exons 7,10 et 15, dans 39 % des cas. De façon frappante, les mutations de FGFR3
retrouvées dans ces échantillons tumoraux sont les mêmes que celles impliquées dans les
différentes formes de chondrodysplasies (ACH, TDI et II, SADDAN) et les tumeurs de
vessie.

4.3.5 A LT E R A T I O N S D U G EN E FGFR3 ET CA N C ER S H E M AT O LO G I Q U E S

Myélomes Multiples

Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne due à la prolifération anormale de
plasmocytes monoclonaux dans la moelle osseuse. Dans environ 15 à 20% des myélomes
multiples (patients et lignées cellulaires), on trouve une translocation t(4 ; 14)(p16 ;q32).
Cette translocation se caractérise par une dérégulation de l’expression de 2 gènes : FGFR3
et MMSET (Myélome Multiple SET).

F IGURE 52 : T RANSLOCATION T (4 ;14)( P 16 ; Q 32) RETROUVEE DANS LES MM (M Chesi, Nardini,

& Lim, 1998)

69
Cette translocation cause une surexpression du gène FGFR3, qui dans certains cas
contient en plus une mutation activatrice. Certaines de ces mutations (K560E, K560M, et
Y373C) sont retrouvées dans les cas de dysplasie thanatophore de type II (TDII), d’autres
sont exclusivement retrouvées dans les Myélomes Multiples (Marta Chesi, Kuehl, &
Bergsagel, 1997). Dans 40 % des cas de Myélomes Multiples on trouve des mutations
activatrices des gènes NRAS et KRAS. De manière intéressante, comme pour le cancer
de la vessie, les altérations de RAS et FGFR3 dans le myélome multiple seraient
exclusives. Soit FGFR3 est surexprimé, soit RAS est muté. La surexpression du récepteur
FGFR3 conduit à l’activation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK (Marta Chesi et
al., 2001).

La protéine TEL-FGFR3

Dans les lymphomes à cellules T périphériques (PTCL), on trouve la translocation t(4 ;

12)(p16 ;q32). Cette translocation est parfois retrouvée associée à la protéine de fusion
TEL-FGFR3 (Yagasaki et al., 2001). Plusieurs fusions entre le gène ETV6/TEL et les gènes
de récepteurs ou des protéines à activité tyrosine kinase (PDGFRβ, JAK, ABL, ABL2,
TRKC) ont été identifiées dans les cancers hématologiques. Ces protéines de fusion
possèdent une activité tyrosine kinase constitutive due à l’activation du domaine HLH
(« Helix Loop Helix ») de ETV6 (Yagasaki et al., 2001). Les lymphomes arborant la protéine
TEL-FGFR3 peuvent évoluer en leucémie myéloïde aïgue (AML) à travers l’activation de la
voie PI3K/AKT par la protéine TEL-FGFR3 (Maeda, Yagasaki, Ishikawa, Takahashi, &
Bessho, 2005).

Mécanisme d’activation de la protéine ERK par le récepteur FGFR3 surexprimé ou

muté dans les myélomes multiples ou par la protéine TEL-FGFR3

Il a été montré récemment que le récepteur FGFR3 surexprimé ou muté dans le cas des
Myélomes Multiples et la protéine de fusion TEL-FGFR3, induisaient l’activation de la voie
de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK et le recrutement de la protéine RSK2
(sérine/thréonine kinase inhibitrice des caspases) de la même manière. FGFR3 va dans un
premier temps phosphoryler la protéine RSK2 sur le site tyrosine Y529, conduisant au
recrutement de la protéine RSK2 inactive (Kang et al., 2007). En parallèle, FGFR3 active
la voie RAS/RAF/MEK. La protéine ERK lié à RSK2 va alors être activée par la MPA2Kinase
MEK. ERK va alors phosphoryler RSK2 sur plusieurs sites dont la sérine 386 induisant
l’activation de RSK2. Il en résulte une activation d’ERK (qui va jouer son rôle de facteur de
transcription dans le noyau) et de RSK2, promouvant la prolifération et la survie cellulaire
(figure 53). L’identification de ce mécanisme a permis d’identifier la protéine RSK2 comme

70
une cible nouvelle cible thérapeutique dans les leucémies arborant la protéine de fusion
TEL-FGFR3 et les myélomes multiples présentant la translocation (t4 ;14).

F IGURE 53 : M ECANISME D ’ ACTIVATION DE RSK2 PAR LE RECEPTEUR FGFR3 DANS LES

M YELOMES M ULTIPLES ET LES LEUCEMIES (Kang et al., 2007)

Le récepteur FGFR3 muté ou surexprimé dans les myélomes multiples et la protéine TEL-
FGFR3 induisent l’activation de la voie RAS/RAF/MEK/ERK et recrute la protéine RSK2 de
la même manière. FGFR3 va dans un premier temps phosphoryler la protéine RSK2 sur le
site tyrosine Y529, conduisant au recrutement de la protéine RSK2 inactive. En parallèle,
FGFR3 active la voie RAS/RAF/MEK. La protéine ERK lié à RSK2 va alors être activée par
la MPA2Kinase MEK. ERK va alors phosphoryler RSK2 sur plusieurs sites dont la sérine
386 induisant l’activation de RSK2. Il en résulte une activation d’ERK (qui va jouer son rôle
de facteur de transcription dans le noyau) et de RSK2, promouvant la prolifération et la
survie cellulaire

71
4.3.6 A LT E R A T I O N S D U G EN E FGFR3 ET C AN C ER D E L A V ES S I E

Des mutations de FGFR3 ont été identifiées dans le myélome multiple et les tumeurs
bénignes de la peau (kératoses), mais aussi dans les tumeurs de vessie et du col de l’utérus
(Cappellen, 1999). Les mutations alors identifiées étaient les suivantes: R248C, S249C,
G372C et K562E. La mutation la plus fréquemment retrouvée est la mutation S249C. De
manière surprenante, ces mutations sont identiques à celles retrouvées dans les cas de
chondrodysplasie, par exemple les mutations G372C et K562E de la forme FGFR3b
exprimée dans les cellules épithéliales correspondant aux mutations G370C et K560E de
la forme FGFR3c exprimée dans l’os (décalage de deux acides aminés dû à l’épissage
alternatif entre les formes FGFR3b et FGFR3c). Le gène FGFR3 est 20 fois plus exprimé
que les autres FGF récepteurs dans l’urothélium (Darren C Tomlinson, L’Hôte, Kennedy,
Pitt, & Knowles, 2005). Dans les cancers de vessie, environ 75% des tumeurs papillaires
Ta présentent une mutation du gène FGFR3. Les deux mutations les plus fréquemment
retrouvées sont les mutations S249C et Y375C (20%). Sur un panel de 77 échantillons de
tumeurs de vessie humaines, 31 présentent une mutation du gène FGFR3, dont 22
correspondant à la mutation S249C. Ces mutations résident pour la plupart dans des
tumeurs papillaires Ta (bas stade) peu agressives, et beaucoup moins dans les carcinomes
urothéliaux de haut grade. Par la suite, les propriétés oncogéniques du récepteur FGFR3
muté (mutations Y375C et S249C) dans les tumeurs de vessie ont été démontrés in vitro
et in vivo (Bernard-Pierrot et al., 2006; D C Tomlinson, Hurst, & Knowles, 2007).

Les voies de signalisation du récepteur FGFR3 muté ont par la suite été étudiées dans
deux types cellulaires de vessie (Martino, Hôte, Kennedy, Tomlinson, & Knowles, 2009). Le
premier type cellulaire étudié est la lignée TERT-NHUC, cellules normales humaines de
vessie immortalisées par la télomérase et transfectées avec une des trois formes suivantes
de FGFR3 muté : S249C, Y375C et K562E. Il apparait dans les cellules TERT-NHUC que
le récepteur FGFR3 muté phosphoryle de manière ligand indépendante les protéines
FRS2α et ERK 1/2 mais pas les protéines AKT et SRC. De plus les formes FGFR3 S249C
et Y375C phosphorylent la PLCγ, ce qui n’est pas le cas lorsque les cellules TERT-NHUC
expriment la mutation FGFR3 K562E. Lorsque le récepteur muté est exprimé dans le
modèle cellulaire fibroblastique NIH3-T3, les protéines AKT et Src sont retrouvées
phosphorylées. De plus dans ce cas-là, le récepteur FGFR3 K562E induit la
phosphorylation de la PLCγ. Ces observations semblent montrer que l’activation de
certaines voies de signalisation par le récepteur FGFR3 muté est type cellulaire et contexte
dépendant. Cette étude a de plus permis de mettre en évidence que les effets du récepteur
FGFR3 muté sur la prolifération et la transformation cellulaire sont dépendantes du type de
mutation et du type cellulaire dans lesquels elles sont exprimées.

72
Récemment, deux gènes de fusion, FGFR3-TACC3 et FGFR3-BAIP2L1 (Williams, Hurst,
& Knowles, 2013) ont été identifiés dans des échantillons de tumeurs et dans des lignées
cellulaires de tumeurs de vessie (RT112, RT4, SW780), (figure 54). Les propriétés
oncogéniques de ces protéines de fusion ont été démontrées in vitro et in vivo dans le
modèle cellulaire NIH3T3, mais aussi dans des xénogreffes de deux lignées cellulaires
dérivées de tumeurs de vessie humaines arborant ces protéines de fusion (Williams et al.,
2013; Y. Wu et al., 2013).

F IGURE 54 : GENES DE FUSION FGFR3-BAIAP2L1 ET FGFR3-TACC3 DANS LES LIGNEES

CELLULAIRES HUMAINES DE TUMEURS VESSIE (Williams et al., 2013)

Deux gènes de fusion FGFR3-TACC3 différents ont été identifiés dans les tumeurs de
vessie et dans les lignées cellulaires RT112 (exprime la forme la plus courte de FGFR3-
TACC3) et RT4 (exprime la forme la plus longue de FGFR3-TACC3). Le gène de fusion
FGFR3-BAIAP2L1 a été identifié dans la lignée cellulaire SW780.

Cependant les voies de signalisation activées par le récepteur FGFR3 muté ou le récepteur
FGFR3-TACC3 dans les cancers de vessie restent à l’heure actuelle peu caractérisées.
L’ensemble des voies de signalisation connues pour être activées par le récepteur FGFR3
muté dans les tumeurs de vessie est représenté ci-après (figure 55) :

73
 F IGURE 55 : R EPRESENTATION SCHEMATIQUE DES VOIES DE SIGNALISATION ACTIVEES PAR LE
RECEPTEUR FGFR3 MUTE DANS LES TUMEURS DE VESSIE (X.-R. W U , 2005)

Les différentes mutations du récepteur FGFR3 (représentées ici en rouge par une étoile)
qu’elles soient présentent dans le domaine extracellulaire, le domaine intra-membranaire
ou le domaine tyrosine kinase conduisent à une activation aberrante du récepteur. Le
récepteur FGFR3 muté active les voies RAS/RAF/MEK/ERK, la voie de protéines STAT et
la voie de la PI3K/AKT.

74
C HAPITRE V : T RAITEMENTS THERAPEUTIQUES ACTUELS POUR
LES TUMEURS DE VESSI E

A l’heure actuelle, le cancer de la vessie reste l’un des cancers les plus couteux à traiter,
du fait du nombre d’interventions qui peuvent être nécessaires. Comme décrit
précédemment on distingue deux voies de progression tumorale, celles des tumeurs
papillaires, celles des tumeurs CIS. Les CIS sont rarement détectés à l’état isolé. De plus
les tumeurs qui présentent une signature de type CIS sont plus agressives que les tumeurs
papillaires, et évoluent plus rapidement vers un envahissement de la membrane basale et
du muscle.

Les thérapies utilisées actuellement pour traiter les tumeurs de vessie peuvent être divisées
en deux groupes en fonction de si la tumeur a envahie le muscle ou non. L’efficacité des
traitements pour les cancers de vessie dépend fortement du stade et du grade de la tumeur
ainsi que des facteurs de risque associés.

5.1 T RAITEMENTS DES TUMEU RS N ’ ENVAHISSANT PAS LE M USCLE

Parmi les tumeurs n’ayant pas envahi le muscle on distingue les tumeurs de type CIS, les
tumeurs papillaires de stade Ta et les tumeurs de stade T1.

Concernant les tumeurs papillaires, les cliniciens distinguent 3 sous-groupes : les tumeurs
de bas grade, les tumeurs de grade intermédiaire et les tumeurs de haut grade. Les tumeurs
papillaires de bas stade/bas grade ont environ 5% de risque d’évoluer vers un
envahissement de la membrane basale et du muscle, alors que les tumeurs de bas stade
mais de haut grade ont 30% de risque d’évoluer. Le principal traitement appliqué pour les
tumeurs n’ayant pas envahies le muscle est une résection de la tumeur (TUR), qui consiste
en un « grattage » de celle–ci. Cependant, après ablation chirurgicale de la tumeur, plus de
50 % des tumeurs de vessie récidivent au moins 1 fois. En effet, la résection tumorale de
ces tumeurs ne suffit pas, du fait de la récidive des tumeurs de vessie. Ce « grattage »
peut-être couplé à une chimiothérapie ou à un traitement au BCG (Bacille Calmet et Guérin)
afin d’essayer de prévenir cette récidive. La thérapie au BCG permet en effet d’activer le
système immunitaire dans le but que celui-ci élimine les cellules tumorales.

Le BCG (bacille de Calmet et Guérin), est une mycobactérie qui adhère au mucus vésical
puis à l’urothélium. Le BCG une fois dans l’urothélium, a un effet cytotoxique via la
production de monoxyde d’azote (NO). Il va de plus activer l’immunité innée et être
phagocyté par des cellules présentatrices d’antigènes (macrophages, cellules

75
dendritiques). Ces cellules présentatrices d’antigènes vont alors présenter les produits de
dégradation du BCG au lymphocytes T helper, permettant ainsi d’activer une réponse
immunitaire spécifique, accompagnée par une production de cytokines. Ces cytokines
orientent la réponse immunitaire vers une réponse de Th1, centrée sur l’activation, la
migration et l’activation de cellules immunitaires cytotoxiques (CD8, lymphocytes Natural
Killer, macrophages). (Neuzillet et al., 2010). La réaction immunitaire qui se produit grâce
à un thérapie BCG est représentée ci-après (figure 56) :

F IGURE 56 : R EPRESENTATION SCHEMATIQUE DES MECANISMES D ’ ACTION DU BCG (Y Neuzillet

& Lebret, 2010)

Cependant, si le traitement au BCG échoue et que la tumeur évolue, une cystectomie peut
alors être envisagée (ablation de la vessie) couplée ou non à une chimiothérapie néo-
adjuvante. La chimiothérapie peut cependant être envisagée seule.

76
5.2 T HERAPIES POU R LES TU MEURS DE VESSIE ENVAHISSANT LE MUSCLE
(T2-T4)

Les tumeurs de vessie de stade T2-T4 ayant envahis le muscle sont des tumeurs très
agressives. Les seuls traitements existants à l’heure actuelle sont lourds et invasifs. Le
premier, qui est aussi le principal traitement envisagé dans ce cas est une cystectomie
(résection totale de la vessie) couplée ou non à une chimiothérapie néo adjuvante. Les
patients qui ont subi une cystectomie ont une survie moyenne de 5 ans. Cependant s’il y a
présence de métastase la cystectomie n’est plus envisagée. Dans ce cas-là le seul
traitement qui prévaut est une chimiothérapie lourde composée des agents chimio-
thérapeutiques suivants: le méthotrexate, la vinblastine, l’adriamycine et le cisplatine
(appelé traitement MVAC) ou alors un couplage cisplatine et gemcitabine (appelé traitement
GC). Malheureusement, ces traitements en plus d’être lourds, n’ont que peu d’impact
bénéfique, et la survie des patient n’est alors que de 12 à 15 mois.

F IGURE 57 : R EPRESENTATION SCHEMATIQUE DES TRAITEMENTS THERAPEUTIQUES ACTUELS

APPLIQUES EN FONCTION DU STADE DANS LE C ANCER DE LA VESSIE . TUR : T RANS - URETRAL
R ESECTION ; BCG : B ACILLE C ALMETTE -G UERIN . (Kobayashi, Owczarek, McKiernan, &
Abate-Shen, 2014)

La caractérisation des altérations moléculaires de ces tumeurs a permis le développement

d’inhibiteurs chimiques ciblant spécifiquement certaines de ces altérations. Plusieurs
molécules sont à l’heure actuelle en phase d’essais cliniques. C’est le cas notamment des
molécules inhibant l’activité des récepteurs FGF. L’étude récente du TCGA a par exemple

77
montré que 17% des tumeurs ayant envahi le muscle présentent des mutations activatrices
du récepteur FGFR3 (Carneiro et al., 2014; The Cancer Genome Atlas, 2014), confirmant
ce que notre équipe avait déjà montré (de l’ordre de 13% des tumeurs). Si l’on prend en
plus en considération la très forte proportion de tumeurs papillaires qui présentent des
altérations de ce gène, il est clairement important de développer des médicaments ciblant
ce récepteur.

La description faite ici des traitements existants pour les cancers de vessie, montre bien
qu’il est réellement important de mieux caractériser ces tumeurs, leurs altérations
moléculaires et les voies de signalisation intracellulaires qui leurs sont associées afin de
découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques, en plus des altérations moléculaires déjà
décrites. Ceci dans le but d’ouvrir la voie à de nouveaux traitements thérapeutiques et de
cibler peut être deux altérations moléculaires plutôt qu’une seule afin d’avoir un impact le
plus important possible sur la progression tumorale.

5.2.1 T U M EU R S T2-T4 D E P H EN O T YP E BA S AL - LI K E ET T H E R AP I E AN T I -EGFR

Une étude menée récemment au laboratoire, a permis d’identifier le récepteur EGFR

comme une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour les tumeurs de stade T2-T4
ayant envahi le muscle et présentant un phénotype basal-like.

Des thérapies anti-EGFR ont déjà été testées en clinique mais sans succès. Ceci peut
s’expliquer par le fait qu’au moment où ces essais cliniques ont été réalisés le phénotype
basal-like des tumeurs de vessie ayant envahi le muscle n’était pas connu.

L’étude menée au laboratoire a montré que les tumeurs ayant un phénotype basal-like
présentent une forte activation du pathway de l’ EGFR, liée à des gains du récepteur ou à
une boucle d’activation autocrine de celui-ci (Rebouissou et al., 2014). Cette étude a permis
également d’identifier des modèles précliniques pour ces tumeurs : des lignées cellulaires
cultivées in vitro ou in vivo sous forme de xénogreffes et un modèle murin chimio-induit par
un nitrosamine, le BBN (N-butyl-N-(4-hydroxybutylnitorsamine)). Ces modèles ont permis
de valider l’implication de l’EGFR dans la transformation cellulaire des tumeurs basal-like.
Les lignées cellulaires de tumeur de vessie humaines présentant un phénotype basal
étaient pour la plupart EGFR dépendantes, elles répondaient à une thérapie anti-EGFR in
vitro mais aussi in vivo. Des xénogreffes réalisées dans un modèle murin à partir de 4
lignées cellulaires de type basal-like et de 2 lignées cellulaires ne présentant pas un
phénotype basal-like ont permis de montrer que 3 des 4 xénogreffes des lignées cellulaires
basal-like répondent à un traitement à l’erlotinib (petite molécule qui cible le récepteur à
l’EGFR). La seule xénogreffe ne répondant pas à l’inhibiteur était issue de lignée cellulaire
BFTC 905 qui présente une mutation activatrice de NRAS. Les deux xénogreffes issues

78
des lignées non basales like sont quant à elles insensibles à l’inhibiteur. Les tumeurs chez
la souris induites par le BBN étaient de type basal-like et étaient également sensibles à
l’erlotinib. Cependant il reste un point critique pour réaliser un essai clinique, celui de
distinguer parmi les tumeurs ayant envahi le muscle, celles ayant un phénotype basal-like.
Pour cela il pourrait être envisagé de réaliser un marquage des kératines 5 et 6 (fortement
exprimé dans ces tumeurs) et de FOXA1 (peu voir pas exprimé dans ce sous-type tumoral),
sur coupe de tumeurs de patients (Rebouissou et al., 2014).

L’identification de la dépendance des tumeurs ayant envahies le muscle de type basal-like

pour le récepteur à l’EGFR non mutées pour RAS dans les modèles précliniques, permet
donc de proposer une nouvelle thérapie basée sur un traitement à l’erlotinib pour ces
tumeurs. Un tel traitement est déjà utilisé en clinique pour traiter les tumeurs du côlon ne
présentant pas de mutations de KRAS et pour certaines tumeurs du poumon NSCLC (Non-
Small Cell Lung Carcinoma).

5.3 FGFR3 COMME CIBLE THERAPEU TIQUE

L’inhibition de l’activité du récepteur FGFR3 peut être abordée de deux manières

différentes : l’utilisation d’inhibiteurs chimiques, et celles d’anticorps comme le R3mAb.

5.3.1 I N HI BI T I O N D E L ’ A CT I V I T E D E FGFR3 P AR UN I N HI BI T E U R C HI MI Q UE

Plusieurs inhibiteurs chimiques ont été développés dans le but de cibler la famille des FGF
récepteurs. On citera notamment le AZ4547 (Astra Zeneca), le BGJ398 (Novartis) qui
inhibent préférentiellement les récepteurs FGFR1, 2 et 3 et dont l’effet est nettement moins
important sur le récepteur FGFR4, et le LY2874455 qui est pan-FGFR (Eli lily), et le
Dovitinib. Il a été montré que ces quatre molécules présentent un effet anti-tumoral dans
différents modèles murins présentant différentes altérations de ces FGF récepteurs. ( a N.
Brooks, Kilgour, & Smith, 2012b). Ces inhibiteurs sont à l’heure actuelle en phase I d’essai
clinique sur différents types de cancers, excepté le Dovitinib, qui est en phase II.

Le NVP-BGJ398 est aussi appelé composé 1h. Cette molécule présente l’avantage
d’inhiber de manière spécifique les récepteurs FGFR1, 2 et 3 (IC50 de l’ordre de 1nM et
5nM pour FGFR3 K560E), en comparaison à d’autres protéines kinases (IC50 supérieure
à 10 µM). L’utilisation de cet inhibiteur sur une xénogreffe chez la souris de la lignée RT112
qui exprime à la fois le récepteur sauvage et la protéine FGFR3-TACC3 a permis de montrer
que cet inhibiteur pouvait être un nouvel agent thérapeutique (Guagnano et al., 2011). Cet
inhibiteur permettrait donc de traiter les tumeurs arborant la protéine de fusion FGFR3-
TACC3.

79
Par la suite, la prédiction de la réponse à cette drogue dans un large panel de lignées
cellulaires de différentes tumeurs humaines présentant des altérations de FGFR1, 2 et 3
mais aussi de nombreux autres gènes dérégulés dans les cancers a été réalisée
(Guagnano et al., 2012). Cette étude semble montrer que cet inhibiteur pourrait être utilisé
en clinique pour un ciblage spécifique des tumeurs arborant des altérations d’un FGF
récepteur, et notamment les récepteurs FGFR1 et 2.

Cependant les FGF sont impliqués dans l’homéostasie des voies du phosphate et de la
vitamine D. Le développement préclinique de ces inhibiteurs anti-FGFR est compliqué par
une hyperphosphatémie conduisant à la calcification des tissues, au blocage du relargage
du FGF23 par l’os qui ne peut plus agir dans le rein ( Brooks et al., 2012; Brown et al.,
2005).

5.3.2 I N HI BI T I O N D E L ’ A CT I V I T E D E FGFR3 P AR UN AN T I CO RP S : LE R3 M A B
L’anticorps R3mAb a été développé pour cibler le récepteur FGFR3 dans les tumeurs de
vessie et les myélomes multiples. Cet anticorps cible à la fois le récepteur FGFR3 muté
mais aussi le récepteur FGFR3 sauvage, en empêchant sa dimèrisation. Cet anticorps cible
les domaines D2 et D3 extracellulaire du récepteur FGFR3, domaines sur lesquels se fixe
le FGF ligand et l’héparine pour induire la dimèrisation et l’activation du récepteur. Dans le
cas où le récepteur présente une mutation d’un acide aminé en cystéine par exemple,
l’anticorps R3 mAb permet d’inhiber la formation du pont disulfure entre deux monomères
du récepteur FGFR3 présentant les mutations R248C ou S249C (Qing et al., 2009). Le
récepteur FGFR3 est présent sous forme monomérique lorsqu’il se trouve dans le
Réticulum Endoplasmique (RE) ou dans d’autres compartiments cellulaires. La dimèrisation
et la formation du pont disulfure entre les deux cystéines, entre les domaines D2 et D3 a
lieu lorsque le récepteur se trouve à la membrane plasmique. La dimèrisation due à la
formation du pont disulfure permet une activation constitutive du récepteur, et de ces voies
de signalisation (figure 58), (Hadari et Schlessinger., 2009). De manière intéressante Qing
et al, ont montré que l’utilisation de cet anticorps sur la lignée cellulaire RT112 avait un
impact significatif sur la prolifération cellulaire, or le récepteur FGFR3-TACC3 n’avait pas
encore était identifié, l’effet observé étant donc imputé à une inhibition de la dimèrisation et
de l’activation du récepteur FGFR3 sauvage. Il est donc possible que cet anticorps dans la
lignée cellulaire RT112 ait un impact à la fois sur l’activation du récepteur sauvage et du
récepteur FGFR3-TACC3.

80
F IGURE 58 : R EPRESENTATION SCHEMATIQUE DE L ’ INHIBITION DE L ’ ACTIVITE ONCOGENIQUE DU
RECEPTEUR FGFR3 MUTE ( FORMATION D ’ UN PONT DISULFURE ) AVEC L ’ ANTICORPS R3 M AB .
(H ADARI ET S CHLESSINGER ., 2009)

L’anticorps R3mAb se lie aux domaines extracellulaires D2 et D3 bloquant ainsi la

dimèrisation du récepteur FGFR3 et empêchant ainsi son activation.

81
OBJECTIFS

82
L’objectif de l’équipe Oncologie Moléculaire est d’identifier et caractériser de nouveaux
gènes impliqués dans la progression tumorale des carcinomes, en se focalisant plus
particulièrement sur les carcinomes vésicaux, les carcinomes mammaires, et le
rétinoblastome. Pour cela deux approches sont utilisées. Une approche gènes candidats
ou famille de gènes comme potentiellement impliqués dans la progression tumorale,
comme les récepteurs à activité tyrosine kinase, et une approche globale qui tire parti des
données de la biologie à grande échelle (données du transcriptomique, données de
méthylation, identifications des altérations présentent dans les tumeurs, spectrométrie de
masse).

Notre équipe a été la première à identifier des mutations activatrices du récepteur FGFR3
dans 50% des carcinomes de vessie (Cappellen et al., 1999 ; Billerey et al., 2001) puis
dans 40 % des verrues séborrhéiques (tumeur bénigne très fréquente de la peau) (Logié et
al., 2005). Elle a également été la première a démontré les propriétés oncogéniques du
récepteur FGFR3 activé par mutation dans une lignée cellulaire humaine dérivée d’un
carcinome de vessie (Bernard-Pierrot et al. 2006). Récemment notre équipe a montré que
le récepteur EGFR constitue une cible thérapeutique pour le sous-groupe basal-like de
tumeurs de vessie ayant envahi le muscle (Rebouissou et al., 2014).

De plus, dans les carcinomes vésicaux, le récepteur FGFR3 est très fréquemment muté.
Récemment les protéines de fusion FGFR3-TACC3 et FGFR3-BAIAP2L1 ont été
observées dans les tumeurs de vessie (TCGA, 2014; Williams et al., 2013). Les propriétés
oncogéniques du récepteur altéré (mutation ou protéine de fusion) ont été mises en
évidence, cependant les voies de signalisation qui lui sont associées sont actuellement très
peu caractérisées. Cette thèse avait donc pour principal objectif d’identifier les voies de
signalisation du récepteur FGFR3 altéré (muté ou FGFR3-TACC3) dans les carcinomes
vésicaux, afin d’expliquer les propriétés oncogéniques du récepteur FGFR3. L’identification
de nouveaux partenaires protéiques de FGFR3 indispensables à la progression tumorale,
à travers la compréhension des mécanismes cellulaires mis en place par le récepteur altéré,
permettrait de plus d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Afin d’identifier ces voies de signalisation, deux approches seront mises en place : une
première approche visant à caractériser les cascades de phosphorylation activées par le
récepteur FGFR3 altéré et une seconde approche visant à caractérisant le réseau
d’interaction (interactome) de FGFR3. Pour chacune de ces deux approches, nous
pourrons tirer parti de résultats préalablement obtenu au laboratoire.

83
 Etude des cascades de phosphorylation activées par le récepteur FGFR3
altéré : Cette approche a pour but d’identifier les voies de signalisation activées par
le récepteur FGFR3 altéré à travers l’étude de la phosphorylation de certaines
protéines clés impliquées dans ces voies de signalisation. Nous avons pu tirer parti
dans un premier temps d’une étude réalisée au laboratoire dont le but était d’étudier
l’activation de voies de signalisation p38/ERK/AKT/STAT par le récepteur FGFR3
muté. La phosphorylation de ces protéines a été étudiée par western blotting dans
le modèle cellulaire fibroblastique NIH3T3 exprimant le récepteur FGFR3 muté ou
sauvage et stimulé ou non avec le ligand FGF1. Dans cette étude, les protéines p38
et AKT ressortent comme spécifiquement activées par le récepteur FGFR3 muté.
Les résultats observés dans cette étude pourront donc servir de base à l’étude des
voies de signalisation activées par le récepteur FGFR3 altéré (muté ou FGFR3-
TACC3) dans un modèle épithélial de lignées cellulaires dérivées de tumeurs de
vessie exprimant de manière endogène le récepteur FGFR3.

 Etude de l’interactome de FGFR3 : Cette approche devait permettre à travers la

construction du réseau de FGFR3 d’avoir une vue à plus large échelle du réseau de
signalisation de FGFR3 qu’avec la première approche. Pour cela l’étude menée au
cours de cette thèse a tiré parti des résultats obtenus dans étude précédemment
réalisée au laboratoire dont le but était de caractériser les voies de signalisation du
récepteur FGFR3 muté et FGFR3 sauvage dans un modèle épithélial de lignée
dérivée de tumeur de vessie. Cette étude avait permis d’obtenir une première liste
de 110 partenaires protéiques du récepteur FGFR3. Nous avons construit le réseau
d’interaction de FGFR3 à partir de cette liste et des bases de données d’interactions
protéiques dans le but d’identifier les voies de signalisation de FGFR3 pouvant
expliquer les propriétés oncogéniques du récepteur.

84
RESULTATS

85
C HAPITRE I : E TUDE DES VOIES DE SIGNALISATION DU RECEPTEUR
FGFR3 MUTE ET DE LA PROTEINE DE FUSION FGFR3-TACC3
DANS LES CARCINOMES DE VESSIE

1.1 I NTRODUCTION

Les récepteurs FGFR sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires, notamment
la prolifération, la survie, la migration et l’apoptose (voir introduction chapitre III). Le
récepteur FGFR3 est retrouvé activé dans différentes tumeurs et dans les verrues
séborrhéiques (tumeurs bénignes de la peau). Cette activation est due dans la plupart des
cas à des mutations activatrices, et plus rarement à des translocations aboutissant à
l’expression de protéines de fusion telles que FGFR3-TACC3 et FGFR3-BAIAP2L1. Les
altérations génétiques de FGFR3 sont un évènement majeur au cours de la carcinogénèse
vésicale, le récepteur étant altéré dans 65% des tumeurs n’envahissant pas le muscle et
15-20% des tumeurs envahissant le muscle. Les altérations sont très majoritairement des
mutations activatrices mais les protéines de fusion FGFR3-TACC3 et FGFR3-BAIP2L1 ont
également été récemment décrites dans respectivement 10% et 1% des tumeurs invasives.
Les propriétés oncogéniques du récepteur FGFR3 altéré (muté ou protéine de fusion) ont
été clairement mise en évidences in vitro et in vivo mais les voies de signalisation associées
au récepteur altéré sont actuellement peu caractérisées. L’étude menée au cours de cette
thèse avait donc pour objectif de mieux caractériser ces voies de signalisation dans les
carcinomes de vessie.

Nous avons, dans un premier temps, tiré parti des cellules NIH-3T3 transformées suite à
l’expression de FGFR3 muté (S249C) et des cellules NIH-3T3 non transformées exprimant
le récepteur FGFR3 sauvage que nous avons précédemment développées (Bernard-
Pierrot 2006). Nous avons cherché à identifier des voies de signalisation activées
spécifiquement par le récepteur muté qui permettraient d’expliquer les différences d’activité
transformante observées avec les deux types de récepteurs (muté et sauvage). Les cellules
exprimant le récepteur (muté ou sauvage) ont été stimulées ou non avec le ligand FGF1,
puis la phosphorylation des protéines p38, AKT et ERK dans ces différentes conditions a
été étudiée. Ces voies de signalisation sont classiquement activées par les récepteurs à
activité tyrosine kinase et en particulier par les récepteurs FGF (voir introduction chapitre
III). Le récepteur FGFR3 muté (S249C) active, indépendamment d’une stimulation par
FGF1, les protéines p38 et AKT tandis que le récepteur FGFR3 sauvage active AKT
uniquement lorsqu’il est stimulé par son ligand FGF1 et n’active ERK dans aucune des
conditions testées. Nous avons ensuite montré que l’inhibition de p38 et AKT inhibe la
croissance en agar mou des cellules NIH3T3 exprimant le récepteur FGFR3 muté,

86
suggérant que l’activation des protéines p38 et AKT est critique pour la transformation des
cellules fibroblastiques NIH3T3, induite par le récepteur FGFR3 muté.

Nous avons ensuite cherché à savoir si ces deux voies de signalisation étaient également
impliquées dans la croissance et la transformation cellulaire de cellules épithéliales de
vessie induites par le récepteur FGFR3 muté ou transloqué. L’activation des protéines p38
et AKT a donc été étudiée dans deux lignées cellulaires dérivées de tumeurs de vessie
exprimant de manière endogène le récepteur FGFR3 constitutivement activé : les lignées
RT112 et MGH-U3 qui expriment respectivement le récepteur FGFR3-TACC3 et le
récepteur FGFR3 muté (Y375C). Les protéines p38 et AKT sont activées par FGFR3 dans
ces deux modèles cellulaires et leur inhibition ou leur déplétion à l’aide de siRNA dans le
cas de P38 (MAPK14) est critique pour la prolifération cellulaire et la formation de colonies
en agar mou. Nous avons ensuite cherché à comprendre par quels mécanismes l’activation
de ces deux voies aboutissait à la prolifération et à la transformation des cellules
urothéliales. Nous avons identifié grâce à l’utilisation de puces à ADN, les gènes régulés
par FGFR3 lorsque celui-ci est exprimé dans le modèle fibroblastique NIH3T3 ou lorsqu’il
est déplété (SiRNA) dans le modèle cellulaire MGH-U3. L’analyse de ces gènes à l’aide du
logiciel GATHER (Gene Annotation Tool to Help Explain Relationship) et des données de
la base de donnée TRANSFAC a permis de mettre en évidence un enrichissement en
gènes cibles des facteurs de transcription MAX/MYC dans les deux cas (expression de
FGFR3 dans les NIH3T3 ou déplétion dans les MGH-U3) suggérant une activation de MYC
par FGFR3. De manière intéressante, l’expression de l’ARNm de MYC est régulée par
FGFR3 suggérant que FGFR3 induit une up-regulation de MYC conduisant à une
augmentation de l’expression de ces gènes cibles, ce qui pourrait expliquer les propriétés
oncogéniques de FGFR3. Nous nous sommes donc focalisés sur l’étude de la régulation
de MYC par les protéines p38 et AKT, afin de déterminer si ces deux voies de signalisation
pouvaient être impliquées. La protéine p38 peut être impliquée dans la régulation de
certains ARNm en coopérant avec la protéine HuR (impliquée dans la régulation post-
transcriptionnelle des ARNm), (Dean, Sully, Clark, & Saklatvala, 2004; Lafarga et al., 2009;
J. Wang et al., 2013). La protéine AKT peut stabiliser la protéine MYC en inhibant la
protéine GSK3β (AKT phosphoryle GSK3β sur la sérine 9), empêchant ainsi la dégradation
de MYC par le protéasome (Domínguez-Cáceres et al., 2004). La protéine p38 pourrait
donc être impliquée dans la régulation de l’ARNm de MYC, tandis qu’AKT serait impliquée
dans la stabilisation protéique de MYC. L’étude de la régulation de l’ARNm de MYC a donc
été étudiée dans un premier temps.

Dans les lignées cellulaires RT112 et MGH-U3 la déplétion de FGFR3 ou de p38 induit une
perte de l’ARNm de MYC validant l’implication de p38 dans la régulation du niveau d’ARNm

87
de MYC. Le rôle de la protéine HuR dans cette régulation du niveau de l’ARNm de MYC a
ensuite été étudié. Nous avons montré que la déplétion de HuR par SiRNA conduisait à
une diminution du niveau de l’ARNm de MYC ainsi que de la protéine. L’implication de HuR
a été confortée par l’étude de sa localisation subcellulaire après la déplétion ou de
l’inhibition de FGFR3 ou de p38 dans la lignée cellulaire RT112. Dans les cellules non
traitées HuR est majoritairement localisé dans le noyau, mais est aussi observé dans le
cytoplasme. Après inhibition de FGFR3 ou de p38, HuR est très majoritairement localisé
dans le cytoplasme et presque plus dans le noyau, suggérant que FGFR3 et p38 sont
impliqués dans le shuttle nucléo-cytoplasmique de HuR à l’origine de la stabilisation des
ARNm par HuR. La déplétion de FGFR3 et P38 ayant un impact négatif sur la régulation
de l’ARNm de MYC, la conséquence sur l’expression de la protéine MYC a également été
étudié. De manière intéressante, la déplétion de FGFR3 (SiRNA) conduit à une perte totale
de la protéine MYC alors qu’une perte de 50-60% de l’ARNm avait été observée suggérant
une régulation du niveau de la protéine MYC par FGFR3. Cette régulation ne semble pas
être dépendante de P38 puisque sa déplétion induit une diminution de 50% du niveau
d’ARNm et de la protéine MYC. Nous avons ensuite évalué le rôle de l’activation de la voie
de signalisation AKT/GSK3β dans ce processus de régulation de protéine MYC par
FGFR3. Nous avons tout d’abord montré que la régulation de la protéine MYC par FGFR3
est due à une protection contre la dégradation par le protéasome. En effet, nous avons
montré que l’inhibition de FGFR3 seule conduisait à une perte totale de la protéine MYC,
tandis que l’inhibition de FGFR3 couplée à l’inhibition du protéasome n’avait aucun impact
sur la stabilité de la protéine MYC. L’impact de l’inhibition de FGFR3 sur la phosphorylation
d’AKT et de la protéine GSK3β (ser9) a ensuite été étudié. L’inhibition de FGFR3 conduit
à une perte totale de la phosphorylation d’AKT et de la phosphorylation de GSK3β (qui n’est
dès lors plus inhibée), et à une perte totale de MYC. De plus, l’inhibition d’AKT induit bien
une perte de phospho-GSK3β (ser9) et de MYC, tandis que l’inhibition de p38 n’a aucun
impact sur la phosphorylation d’AKT, de GSK3β (ser9), et sur la protéine MYC. De manière
intéressante, l’inhibition d’AKT n’a pas d’impact sur la localisation de HuR, mais induit une
boucle de rétro-contrôle aboutissant à l’augmentation de la phosphorylation de p38 et de
la quantité d’ARNm de MYC, montrant ainsi que p38 est impliqué dans la régulation de
l’ARNm de MYC tandis qu’AKT est impliqué dans la stabilisation de la protéine MYC. De
manière surprenante, les analyses pas western-blot ont montré que la déplétion par siRNA
de P38, AKT ou MYC ainsi que l’inhibition de FGFR3 induisait une perte d’expression de la
protéine FGFR3 suggérant l’existence d’une boucle de rétrocontrôle positive FGFR3/MYC.

L’ensemble de ces données a donc permis de montrer que FGFR3 induit une augmentation
de l’ARNm de MYC, via l’activation de P38 et le recrutement de HuR, protéine impliquée

88
dans la stabilisation des ARNm, ainsi qu’une stabilisation de la protéine MYC, via
l’activation d’AKT et l’inhibition de GSK3β limitant la dégradation de la protéine MYC par le
protéasome. Cette augmentation de l’expression de MYC induit l’expression de ces gènes
cible ainsi que celle de FGFR3 et promeut la prolifération et la transformation cellulaire.

Enfin, pour déterminer si cette boucle mise en évidence dans des lignées cellulaire dérivée
de tumeurs de vessie pouvait exister dans les tumeurs de vessie, nous avons étudié la
phosphorylation de p38 et AKT par RPPA (Reverse Protein Phase Assay) en fonction du
statut mutationnel de FGFR3, dans les tumeurs de vessie n’envahissant pas le muscle
(NMIB) et dans les tumeurs infiltrant le muscle (MIBC). P38 est significativement plus
fortement phosphorylée dans les tumeurs NMIBC et MIBC arborant le récepteur FGFR3
muté, tandis que la phosphorylation d’AKT est la même dans les tumeurs NMIBC et MIBC
et est indépendante du statut mutationnel de FGFR3.

89
 (Article en préparation)

A FGFR3/MYC positive feedback loop relies on P38 and AKT activation and
contributes to transformation of bladder cancer cells expressing mutated
FGFR3 or FGFR3-TACC3.

Mélanie Mahe1,2, Hélène Neyret-Khan1,2, Remy Nicolle1,2, Marion Dorland-Galliot1,2,

Claude C. Abbou3,4,5, Agnès Laplanche6, Simone Benhamou6, Thierry Lebret7,8,
Yves Allory3,4,9 , Celio Pouponnot ,François Radvanyi1,2,, and Isabelle Bernard-
Pierrot1,2,#

90
A FGFR3/MYC positive feedback loop relies on P38 and AKT activation and
contributes to transformation of bladder cancer cells expressing mutated
FGFR3 or FGFR3-TACC3.

Mélanie Mahe1,2, Hélène Neyret-Khan1,2, Remy Nicolle1,2, Marion Dorland-Galliot1,2,

Claude C. Abbou3,4,5, Agnès Laplanche6, Simone Benhamou6, Thierry Lebret7,8,
Yves Allory3,4,9 , Celio Pouponnot ,François Radvanyi1,2,, and Isabelle Bernard-
Pierrot1,2,#

1CNRS, UMR 144, Institut Curie, 75248 cedex 05, Paris, France
2Institut Curie, Centre de Recherche, 75248 cedex 05, Paris, France
3Current address:
3INSERM U841, 4Université Paris 12, Faculté de Médecine, 5AP-HP Groupe Henri
Mondor-Albert Chenevier, Service d’urologie.
6CNRS FRE 2939, Génomes et Cancers, Institut Gustave Roussy, 94800 Villejuif,
France
7 Hôpital Foch, Service d’urologie, 92150 Suresnes, France
8Faculté de médecine Paris-Ile-de-France-Ouest, UVSQ, France
9AP-HP Groupe Henri Mondor-Albert Chenevier, Département de Pathologie 94000
Créteil, France

Running title: critical role of P38 and AKT in bladder cancer harboring FGFR3
alteration

Abbreviations: fibroblast growth factor receptor (FGFR), fibroblast growth factor

(FGF), newborn calf serum (NCS), fetal calf serum (SVF), phosphotyrosine (PY),
reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

91
ABSTRACT

FGFR3 is frequently activated, sometimes through creation of a fusion-gene but

mostly through mutations, in bladder carcinomas where it is necessary for urothelial
cell proliferation. Signaling pathways activated by altered-receptor in bladder tumors
remain poorly characterized. Here we described a novel positive feedback loop
whereby FGFR3 induces MYC up-regulation which in turn induces the transcription
of FGFR3 and promotes cell growth. FGFR3 activates P38 that stabilizes MYC
mRNA by recruiting Human antigen R protein (HuR) in the nucleus and AKT that
stabilizes MYC protein through Glycogen synthase kinase 3 (GSK3 inhibition
which prevents proteasome-mediated degradation of MYC. Importantly, AKT and
P38 are phosphorylated in human bladder tumors harboring FGFR3 mutations and
could be potential therapeutic target to disrupt this oncogenic loop.

Graphical Abstract:

92
Introduction

FGFR3 belongs to a family of structurally related tyrosine kinase receptors (FGFR1-

4). These receptors regulate various physiological processes, including
proliferation, differentiation, migration and apoptosis. The FGFR family (FGFR1-4)
has received a strong interest as these receptors are frequently involved by various
mechanisms in genetic disorders and cancer and they are potential therapeutic
targets (Haugsten et al., 2010a; Itoh & Ornitz, 2004; Knights & Cook, 2010; Turner
et al., 2010). FGFR3 is frequently activated by somatic mutations in bladder
carcinomas (about 50 % of cases) (Billerey et al., 2001; Cappellen, 1999), in benign
epidermal tumors, such as seborrheic keratosis (40% to 85% of cases) (Hafner et
al., 2006; Logié, et al., 2005) and epidermal nevi (Hafner et al., 2006; Hernández et
al., 2007) and much more rarely in cervix cancer (R. Wu et al., 2000), multiple
myeloma (Onwuazor et al., 2003) and lung squamous carcinomas (Majewski et al.,
2013). Involvement of FGFR3 in gene fusions with different partners (FGFR3-
TACC3 or FGFR3-BAIAP2L1) have also been reported in bladder cancer (about 10
% of the cases) (TCGA, 2014; Williams et al., 2013) and more rarely in
glioblastomas, IDH wild type gliomas, lung carcinomas, head and neck squamous
cell carcinomas and nasopharyngeal carcinomas (Majewski et al., 2013; Nakanishi
et al., 2015; Singh et al., 2013; Y. Wu et al., 2013b; Yuan et al., 2014). These genetic
evidences of the involvement of altered FGFR3 in bladder cancer have further been
supported by functional studies. Indeed, FGFR3 fusion proteins display in vitro
oncogenic activity when introduced in NIH-3T3 cells (FGFR3-TACC3 and FGFR3-
BAIAP2L1) (Williams et al., 2013) or in Rat2 cells (FGFR3-BAIAP2L1),(Nakanishi et
al., 2015) and in vivo pharmacologic inhibition of FGFR3 inhibits growth of
xenografts of two bladder derived cell lines harboring these FGFR3 fusion proteins
(Y. Wu et al., 2013b). Furthermore, mutated-FGFR3 expression induces the
proliferation and transformation of NIH-3T3 cells in vitro whereas the in vitro
inhibition of mutated FGFR3 blocks the proliferation and transformation of bladder
tumor-derived cell lines (Bernard-Pierrot et al., 2006; D C Tomlinson et al., 2007).
The same activating mutations of FGFR3 identified in somatic tumor tissues have
also been identified in the germline. These germline mutations have multiple
consequences but, surprisingly, the main clinical feature is an inhibition of bone
growth, leading to various forms of chondrodysplasia (Ornitz, 2005).The

93
transduction pathways mediating the inhibitory effects of activated FGFR3 on bone
growth are relatively well characterized and this effects are mediated partly by p38
activation (Raucci et al., 2004). By contrast, the signaling pathways associated with
the tumorigenic properties of mutated-FGFR3 and FGFR3 fusion proteins remain
largely unknown in particular in the context of bladder cancer. In this study, we
therefore aimed to characterize altered-FGFR3 signaling pathways involved in
bladder cancer cell growth/transformation. We pointed out P38 and AKT as two
signaling pathways activated by FGFR3-S249C and involved in FGFR3-S249C
induced NIH-3T3 cells transformation. We further focused on these two signaling
pathways and demonstrated that they were also activated by FGFR3-Y375C and
FGFR3-TACC3 in MGH-U3 and RT112 bladder tumor derived cell lines
respectively. Both pathways were critical for FGFR3-induced bladder cancer cell
proliferation and transformation. They induced MYC up-regulation that contributed
to FGFR3 oncogenic activity and promote in turn FGFR3 expression. p38 activation
through recruitment of HuR lead to MYC mRNA up-regulation/stabilization whereas
AKT activation prevented MYC proteosomal degradation through phosphorylation
and inhibition of GSK3β (ser 9). We finally showed, studying 129 human bladder
tumors, that p38 phosphorylation was increased in tumors expressing mutated-
FGFR3 and that AKT was phosphorylated in all tumors suggesting that as FGFR3
inhibitors, P38 and AKT inhibitors could be used as treatment to disrupt this
FGFR3/MYC oncogenic loop in bladder tumors harboring FGFR3 alterations.

Results
FGFR3-S249C-induced NIH-3T3 cell transformation is p38 MAP Kinase and
AKT activation-dependent.
To better understand pathways related to mutated-FGFR3 oncogenic activity, we
first took advantage of transformed-NIH-3T3 cells expressing FGFR3-S249 and
non- transformed NIH-3T3 cells expressing wild-type FGFR3 that we previously
developed (Bernard-Pierrot et al., 2006). We analyzed by western-blot and
compared activation of some candidate pathways known to be activated by tyrosine
kinase receptors and in particular FGFRs (P38, AKT, ERK1/2 (Maher, 1999;
Powers, McLeskey, & Wellstein, 2000) in NIH-3T3 cells expressing FGFR3-S249C
(S249C1.1 and S249C1.2), in FGF1-stimulated clones expressing the wild-type
receptor (R3b1.1 and R3b1.3) and in control cells (Neo1.5 and Neo2.1) (Fig. 1A).

94
Both clones expressing FGFR3-S249C (S249C1.1 and S249C1.2) and FGF1-
stimulated clones expressing the wild-type receptor (R3b1.1 and R3b1.3) were able
to phosphorylate AKT and ERK1/2 (p42/p44) but strong phosphorylation of p38 was
observed only in clones expressing the mutant receptor (Fig. 1A) suggesting a
critical role of this pathway in FGFR3-induced cell transformation. Inhibition of P38
phosphorylation in FGFR3-S249C expressing cells by a FGFR tyrosine kinase
inhibitor (SU5402) confirmed that p38 activation did directly depend on FGFR3-
S249C activation (Fig. 1B).
To assess the functional significance of FGFR3-S249C-induced p38, AKT and
ERK1/2 phosphorylation in cell transformation, we evaluated the effect of one of
their respective inhibitor (SB203580 for P38, PD98059 for ERK1/2 and LY294002
for PI3kinase) on anchorage-independent growth of FGFR3-S249C expressing
NIH-3T3 cells (clone S249C1.2). Inhibition of both PI3 kinase (AKT pathway) and
P38 MAP kinase inhibited significantly their ability to form colonies on soft agar as
well as FGFR inhibitor (SU5402) whereas ERK1/2 inhibition had only limited effect
(Fig. 1C). Taken together these results highlighted the critical role of both PI3 Kinase
and P38 MAP kinase pathway in FGFR3-S249C induced cell transformation in NIH-
3T3 cells.

Both P38 MAP Kinase and AKT activation are critical for constitutively-
activated FGFR3 to induce human epithelial bladder tumor cells proliferation
and transformation.
We then further investigated whether this critical role of p38 and AKT
phosphorylation in mutated-FGFR3 -induced cell transformation was also relevant
in epithelial bladder cancer cells. We made use of MGH-U3 and RT112 cell lines,
which were derived from a human bladder tumor and endogenously expressed
respectively a mutated activated form of FGFR3 (FGFR3-Y375C) and FGFR3-
TACC3 fusion protein, the growth and transformation of these cell lines being
dependent on activated-FGFR3 activity (Bernard-Pierrot et al., 2006; Gómez-román
et al., 2005; Qing et al., 2009; Y. Wu et al., 2013b). Immunoblotting analysis (Fig.
2A) showed in both cell lines a constitutive p38 and AKT phosphorylation,
dependent on mutated FGFR3 expression. Indeed, p38 and AKT phosphorylation
was abolished by the decrease of FGFR3 expression observed following treatment
with siRNA targeting FGFR3, a similar effect being obtained with two different

95
siRNAs in each cell lines (Fig.2A). Since FGFR3 is constitutively expressed and
activated in MGH-U3 (mutated FGFR3) and RT112 (FGFR3-TACC3 fusion protein)
cells, p38 and AKT activation by FGFR3 could be direct or an indirect effect of
FGFR3 expression in these cells. Interestingly, regarding P38 activation by FGFR3
which was striking, we further demonstrated that p38 was co-immuno-precipitated
together with FGFR3 in these two cell lines (Supplementary Fig.1A) and that this
interaction between FGFR3 and p38 required FGFR3 phosphorylation since it was
inhibited by PD173074, a FGFR inhibitor (Supplementary Fig.1B). Taken together
those results clearly demonstrated that activated-FGFR3 directly induced p38 and
AKT activation in bladder tumor cells. We then demonstrated that these FGFR3-
induced p38 and AKT activations were required for cell growth and transformation.
Indeed, inhibition of p38 or PI3 Kinase, using respectively SB203580 and LY294002
kinase inhibitors, decreased MGH-U3 and RT112 cell viability as efficiently as
FGFR3 inhibition using PD173074 (Fig. 2B). Role of P38 in FGFR3-induced cell
growth was further confirmed using two siRNA targeting p38α isoform (MAPK14)
(Figure 2C, left panel). MAPK14 is the mostly express isoform in MGH-U3 and
RT112 as assessed by Affymetrix U133 plus 2.0 DNA chip data analysis (data not
shown) and confirmed by the decrease by 90% of P38 expression following P38α
SiRNA transfection (Fig.2C, right panel). Furthermore, inhibition of p38 or PI3K, or
p38 siRNAs inhibited the colony formation on soft agar of MGH-U3 cells (as
efficiently as PD173074 or FGFR3 (siRNA)) (Fig.2D). Hence, our data clearly
pointed out the critical role of P38 and AKT in FGFR3-induced bladder cancer cell
growth and transformation.

Up-regulation of MYC by FGFR3 promotes bladder cancer cell growth.

To further decipher molecular mechanisms by which activated-FGFR3 contributes

to bladder cancer cells growth and transformation and try to understand role of P38
and AKT in this process, we analyzed genes regulated by FGFR3 expression. Gene
expression pattern in MGH-U3 cells treated or not with three different FGFR3
siRNAs were analyzed using Affymetrix U133 2.0 DNA array. 1506 significantly
differentially expressed genes after FGFR3 depletion were identified (see methods)
(Supplementary table 1). 583 genes regulated by FGFR3 expression in NIH-3T3
cells were also identified comparing gene expression pattern of two control clones

96
(neo1.5 and neo2.1) and two FGFR3-S249C-expressing clones (S249C1.1 and
S249C1.2) using U74Av2 Affymetrix DNA microarrays (see methods)
(supplementary table 2). Analysis of these two lists of FGFR3-regulated genes using
GATHER software (Gene Annotation Tool to Help Explains Relationships)
(http://gather.genome.duke.edu/) and TRANSFAC data base revealed in both cases
enrichment for E2F and MYC/MAX target genes. Furthermore, FGFR3 knock-down
in MGH-U3 cells induced MYC mRNA down-regulation (supplementary Table 1 and
Fig.3A) whereas FGFR3 expression induced MYC mRNA up-regulation in NIH-3T3
cells (supplementary Table 2). Real time RT-QPCR analysis confirmed that FGFR3
siRNA reduced MYC mRNA expression level by approximatively 40% and 70% in
MGH-U3 and RT112 cells respectively (Fig.3A). We further showed that FGFR3
siRNAs reduced dramatically (by 95%) MYC protein expression level as MYC siRNA
in both MGH-U3 and RT112 cells (Fig.3B). Taken together those results suggested
that FGFR3 leads to both MYC mRNA up-regulation and MYC protein stabilization
that induces MYC target genes expression that could account for its oncogenic
properties. We next validated using MYC siRNA that MYC down-regulation
contributes to MGH-U3 cell growth inhibition induced by FGFR3 siRNA. Both MYC
and FGFR3 siRNAs reduced by 50% cell viability and no additional or synergistic
effect between FGFR3 and MYC siRNAs was observed (Fig.3C).

Because we observed down-regulation (mRNA and protein) after FGFR3 knock-

down and that p38 and AKT, that we showed being activated by FGFR3, could
respectively induced MYC mRNA stabilization or transcriptional up-regulation (S.
Chen et al., 2005; Frank & Miranti, 2013) and MYC protein stabilization (Tsai et al.,
2012), we investigated their involvement in these processes in MGH-U3 and RT112
cells.

FGFR3-induced increase of MYC mRNA level is P38-dependent and involves

HuR.
We first demonstrated that P38 depletion, as FGFR3 depletion, decreased by
approximatively 40% and 60% MYC mRNA level in MGH-U3 and RT112 cells
respectively (Fig.3A). However, in case of P38 depletion, decrease of MYC protein
level was more correlated with that of MYC mRNA expression suggesting that P38
was only involved in MYC mRNA level regulation and not in MYC protein
stabilization (Fig.3B).

97
This FGFR3-induced and P38-dependent increase of MYC mRNA level could be
due to a transcriptional regulation but also to a post-transcriptional regulation of
MYC mRNA level by P38. Indeed, MYC mRNA contains A+U-rich Elements (ARE)
in its 3’-untranslate region (UTR), (C. Y. Chen & Shyu, 1995) that can interact with
ARE-binding proteins called AU-BPs such as HuR or AUF1 that can either stabilize
mRNA or favor mRNA degradation (Lafon et al., 1998; Weidensdorfer et al., 2009).
Furthermore, P38 is known to be involved in mRNA stabilization by phosphorylating
AU-BPs (Frank & Miranti, 2013; Knapinska et al., 2011) and in particular HuR (Dean
et al., 2004; Lafarga et al., 2009). So, we then examined involvement of HuR in
FGFR3-driven increase of MYC mRNA. In RT112 cells, HuR depletion with two
different siRNAs decreased by approximatively 30-40% both MYC mRNA level (Fig.
4A) and MYC protein level (Fig. 4B). Same ranges of decreased were observed
after p38 depletion (Fig. 3A and Fig.3B) suggesting that P38-induced up-regulation
of MYC mRNA could be, at least partially, mediated by HuR that would stabilize
MYC mRNA. Involvement of HuR in this FGFR3/P38-induced regulation of MYC
mRNA level was reinforced by studying its subcellular localization. Indeed, HuR
shuttles from nucleus to cytoplasm and its role in mRNA stabilization has been
related to its subcellular localization (Fan & Steitz, 1998; Jun Wang et al., 2013).
Immuno-labeling anti-HuR in RT112 cells showed that HuR subcellular localization
was affected by both FGFR3 and P38 depletion using siRNA or inhibition using
kinase inhibitor (SB203580 for P38, PD174004 for FGFR) (Fig. 4C). In control cells,
HuR was mostly localized in nucleus and also in cytoplasm whereas after FGFR3
or P38 loss of function, HuR was no longer observed in the nucleus suggesting that
P38 activation by FGFR3 favors HuR nuclear import (Fig. 4C). As control, we
showed that PI3Kinase inhibitor (LY294002) did not altered HuR localization
(Supplementary Fig.2A). Taken together, these data suggest that up-regulation of
MYC mRNA induced by FGFR3 and dependent of P38 activation is mainly due to a
post-transcriptional regulation of MYC mRNA level involving HuR.

FGFR3 prevents proteasome-mediated MYC protein degradation through

AKT-mediated GSK3β inhibition.
Interestingly, western-blot analysis showed that FGFR3 siRNAs induced a loss of
MYC protein expression in a much more extent than that of MYC mRNA in both

98
RT112 and MGH-U3 cells (Fig.3A and 3B) suggesting that FGFR3 could, in addition
to regulate MYC mRNA level, regulate MYC protein stability. This discrepancy was
not observed using P38inhibitor suggesting that P38 activation by FGFR3 was not
involved in this process (Fig.3A and 3B). Because MYC protein is degraded through
proteasome-mediated proteolysis, MGH-U3 and RT112 cells were treated with a
FGFR inhibitor (PD173074) alone or in combination with the proteasome inhibitor
(MG132) (fig 5A). Western-blot analysis showed that, in both cell line, FGFR3
inhibition decreased MYC protein expression, MG132 up-regulated MYC
expression and MG132 totally inhibited MYC down-regulation induced by FGFR3
inhibition (Fig.5A). These data demonstrated that FGFR3 reduces proteasome-
mediated MYC protein degradation and therefore stabilizes MYC protein. 
Proteasome-mediated MYC protein degradation is induced by MYC
phosphorylation at Thr58 that is enhanced by glycogen synthase kinase 3 (GSK3β)
(Kotliarova et al., 2009). GSK3β is inhibited by phosphorylation and in particular by
phosphorylation at ser9 by AKT (Domínguez-Cáceres et al., 2004). We therefore
examined whether GSK3β phosphorylation at ser9 was modulated through AKT
activation by FGFR3 to prevent proteasome-mediated MYC protein degradation. As
shown in Figure 5B, FGFR3 inhibition using PD173074 decreased AKT
phosphorylation at Ser473, GSK3β phosphorylation at ser9 and MYC protein level
in both RT112 and MGH-U3 cells expressing respectively constitutively-activated
FGFR3, FGFR3-TACC3 and FGFR3-Y375C. We then investigated involvement
AKT in FGFR3-induced regulation of GSK3β phosphorylation. In both RT112 and
MGHU-3 cells, PI3-kinase inhibitor (LY294002) down-regulated GSK3β
phosphorylation at ser9 and MYC protein level (Fig.5C). Taken together, these data
suggest that FGFR3 stabilize MYC protein by up-regulating AKT phosphorylation
which in turn up-regulates GSK3β phosphorylation at ser9 which prevents
proteosomal-mediated MYC degradation. Interestingly, we also showed that AKT
inhibition induced a feedback increased of p38 up-phosphorylation that we
demonstrated above to induce MYC RNA stability (Supplementary Fig.2B).
FGFR3-driven MYC up-regulation induces a feedback up-regulation of FGFR3
expression.
Surprisingly, our immunoblotting analysis (Fig.3B) showed in RT112 and MGH-3
cells, that in addition to down-regulate MYC expression level, P38 and MYC siRNAs
also dramatically decreased FGFR3 expression level suggesting that FGFR3

99
activation could up-regulate MYC expression level that would in turn increase
FGFR3 expression. Decreased expression of FGFR3 observed following
transfection with MYC#1 siRNA (Fig.3B) was first further confirmed in RT112 and
MGH-U3 cell using MYC#2 siRNA that decreased FGFR3 expression and
consecutively P38-phosphorylation (Fig.6A). We then demonstrated that in these
both cell lines, FGFR3 inhibition using PD173074 abolished FGFR3 expression
(Fig.6B). We further investigated this FGFR3 positive feedback loop in two other
bladder cancer derived cell lines expressing constitutively activated FGFR3:
UMU14 (FGFR3-S249C) and RT4 (FGFR3-TACC3, longer that FGFR3-TACC3
expressed in RT112) (Williams et al., 2013) (Fig.6B). In both cell lines, FGFR3
inhibition lead to a loss of FGFR3 expression suggesting that FGFR3/MYC positive
feedback loop that we highlighted here is relevant whatever FGFR3 alteration is.
We demonstrated a critical role of P38 and AKT to maintain this FGFR3/MYC
positive feedback loop in bladder tumor derived cell lines expressing constitutively
activated-FGFR3. We so finally investigated, studying P38 and AKT
phosphorylation, whether this loop could be of relevance in human bladder tumors
expressing activated-FGFR3.

P38 and AKT are phosphorylated in human bladder tumors presenting

mutation of FGFR3.
Reverse phase protein array (RPPA) analysis of a panel of 57 NMIBC (Non-Invasive
Bladder Carcinoma) and 72 MIBC (Muscle Invasive Bladder Carcinoma) showed
that p38 was significantly more phosphorylated in NMIC and MIBC that expressed
mutated FGFR3 in comparison to other tumors (Fig.7A) while it was not the case for
AKT (Fig.7B). However, AKT was phosphorylated in all FGFR3 mutated tumors
(Fig.7B). Taken together, these data suggest that FGFR3/MYC loop relying on P38
and AKT activation by FGFR3 could take place in human bladder tumors with
genetic alteration of FGFR3 and that in consequence AKT and P38 could be
potential therapeutic target to treat these tumors.
Discussion
Genetic alterations of FGFR3 (mutations or translocation) are one of the most
common frequent event in bladder carcinoma affecting approximatively 70% of
NMIBC and 15% of MIBC. These alterations induce a constitutive activation of
FGFR3 and activated-FGFR3 displays oncogenic properties (Bernard-Pierrot et al.,

100
2006; D C Tomlinson et al., 2007; Williams et al., 2013). In this study, we further
characterized mechanisms involved in activated-FGFR3 oncogenic activities. We
demonstrated in bladder cancer derived cell lines that mutated FGFR3 (FGFR3-
Y375C) and the fusion protein, FGFR3-TACC3, induce an up-regulation of MYC
oncoprotein and that MYC induces cell proliferation. We showed that FGFR3-driven
MYC up-regulation was due to both an increase of MYC mRNA level and MYC
protein stabilization. In one hand, FGFR3 induces MYC protein stabilization by
activating AKT that in turn phosphorylates GSK3β at ser9 that prevents MYC protein
degradation by proteasome. In the other hand, FGFR3 increases MYC mRNA level
by activating P38MAP Kinase that regulates nucleo –cytoplasmic shuttle of HuR
protein which stabilizes MYC mRNA. We also pointed-out that FGFR3-driven MYC
up-regulation promotes in turn FGFR3 expression. Based on these data, we drew
out a model for this new FGFR3/MYC positive feedback loop involved in bladder
tumor cells proliferation (see graphical abstract). Interestingly, study of P38 and AKT
phosphorylation in human bladder tumor samples harboring FGFR3 genomic
alterations suggested that this loop identified in tumor derived cell lines could take
place in tumors.
We so demonstrated here that FGFR3 activation induces MYC over-expression that
in turn induces FGFR3 expression. Such a FGFR3 positive feed-back loop, could
explain FGFR3 overexpression that we previously observed in FGFR3-mutated
human bladder tumors as compared to non-mutated tumors and normal samples
(Bernard-Pierrot et al., 2006). We highlighted molecular mechanisms by which
FGFR3-activation lead to MYC up-regulation but we did not explore how MYC over-
expression induced FGFR3 expression assessed by western-blot. We did not
measured FGFR3 mRNA level following FGFR3 inhibition or MYC depletion but
given known activities of MYC, it is tempting to speculate that MYC is involved in
FGFR3 mRNA level regulation rather than in FGFR3 protein stabilization. MYC, as
a
transcription factor, could directly bind FGFR3 promoter. Analysis of MYC Chip-seq
data from the project ENCODE did not allow us to point out MYC binding to FGFR3
promoter. However, no bladder cell lines were analyzed within this project and MYC
potential binding site exist on FGFR3 promoter so that this hypothesis worth being
tested in bladder cancer cells. MYC could also induce a post-transcriptional
regulation of FGFR3 mRNA by regulating miRNA. Indeed, FGFR3 mRNA has been

101
shown to be regulated by mir-99a and mir-100 (Blick et al., 2013; Catto et al., 2010)
and MYC has been involved in regulation of miRNA expression and in particular
MYC induces down regulation of mir99 and mir100 (Chang et al., 2008). In RT112
cells, we demonstrated that MYC regulates expression of both FGFR3 and FGFR3-
TACC3 protein. FGFR3-TACC3 mRNA, lacking FGFR3 3’-untranslated region (3’-
UTR) but presenting TACC3 3’UTR, has recently been demonstrated to escape mir-
99 regulation in glioblastomas (Parker et al., 2013). Hence, in RT112 cells, it is
unlikely that FGFR3 mRNA level is regulated by miR even if we could not rule out
regulation by a miRNA that could bind both FGFR3 and TACC3 3’UTR.
We demonstrated in this study that both p38 and AKT activation were critical for
FGFR3 to induce bladder cancer cell proliferation and transformation. Their critical
role was linked to their ability to induce MYC up-regulation through stabilizing
respectively MYC mRNA and MYC protein. The role of AKT for cancer progression
(Vivanco & Sawyers, 2002) is well known and established including for bladder
cancer (Calderaro et al., 2014; Carneiro et al., 2014) but the role of p38 is
controversial. It was initially thought that p38 inhibited tumor progression by inducing
cell apoptosis. It is now clearly established that p38 can be activated by tyrosine
kinase receptor (PDGF receptor, VEGF receptor, EGF receptor, FGFR1) (Frey,
Golovin, & Polk, 2004; He, Ding, & Li, 2003; Maher, 1999; Matsumoto et al., 1999;
Rousseau, Houle, Landry, & Huot, 1997) to act also as a positive regulator of tumor
progression, mediating motility and invasion, suppressing apoptosis and stimulating
the epithelial-to-mesenchymal transition in various cell types (Bates & Mercurio,
2003; Behren et al., 2010; Chatzinikolaou et al., 2010; Elenitoba-Johnson et al.,
2003; Frey et al., 2004; Matsumoto et al., 1999; Nishihara, Hwang, Kizaka-Kondoh,
Eckmann, & Insel, 2004). A direct involvement of p38 in transformation (the
characteristic change in morphology and anchorage-independent growth) has also
been reported in several cell lines (He et al., 2003; Tadlock & Patel, 2001; Turkson
et al., 1999). This finding that p38 actually favored tumor progression in some
cancers was interpreted as reflecting a modification to the cancer cell that diverted
p38 function from a negative to a positive effect on tumor progression. In this
context, p38 has generally been reported to favor tumor cell mobility and
invasion(Wagner & Nebreda, 2009b). We show here that p38 may even upregulate
cell proliferation, having positive effects on cell growth by up-regulating MYC mRNA
level. Activated FGFR3-induced activation of p38 in bladder tumors may therefore

102
contribute to malignant behavior and the inhibition of this activation may be of
therapeutic value, as reported for pancreatic and breast carcinomas (Dreissigacker
et al., 2006). RRPA datas showing a significant increase of p38 activation in NMIBC
and MIBC expressing mutated FGFR3, suggest that mutated-FGFR3 expressing
tumors could be more sensitive to P38 inhibitors than the others. AKT being
activated in all bladder tumors, AKT inhibitor could also be treatment in particular
for NMIBC and MIBC expressing mutated FGFR3 mutations or FGFR3-TACC3. For
Disrupting FGFR3/MYC oncogenic loop in altered-FGFR3 expressing bladder
tumors by inhibiting AKT and/or P38 is of great potential interest, since p38 and AKT
inhibitors have already been developed and are currently clinical trials (Y. Wu et al.,
2013). Moreover, a study has shown that bladder cancer cell line RT112 may
bypass their dependence for FGFR3 signaling by switch to ERBB2/3 receptors (J
Wang et al., 2014). Our study proposes here another alternative therapy to treat
FGFR3 dependant tumors. Furthermore several others cancers express FGFR3-
TACC3 fusion protein as glioblastoma (Singh et al., 2013), Nasopharyngeal
Carcinoma (Yuan et al., 2014) and lung adenocarcinoma (Capelletti et al., 2014). It
could be interesting to show if this FGFR3/MYC feedback loop is true in these others
types of human cancers expressing FGFR3-TACC3. If that was the case, this
therapy could be extended to other cancer types.

103
Figure 1(Figure legend page 103)

104
Figure 1: P38 MAP Kinase and PI3 Kinase pathways are critical for FGFR3-S249C to
induce NIH-3T3 cells transformation.
(A) NIH-3T3 control cells (Neo1.5, Neo2.3), FGFR3-S249C-expressing cells (S249C1.1,
S249C1.2) and wild-type FGFR3-expressing cells (R3b1.1, R3b1.3) were serum starved for
24h and stimulated for 10 min, where indicated, with 20ng/ml FGF1 in the presence of
50µg/ml heparin. Western blot analysis of 50 µg of whole cell lysate protein using the
following specific antibodies: anti-phospho-p38 (Pp38), anti-p38, anti-phospho-Akt (PAkt),
anti-Akt, anti-phospho-p42/p44 (ERK1/2) (Pp42/p44) and anti-p42/p44 antibodies. (B)
FGFR3-S249C-expressing cells (S249C1.2) were treated, where indicated, for 2 hours with
30 µM SU5402 (FGFRs inhibitor). 50 µg of whole cell lysate protein were immunoblotted
with anti-phospho-p38 (Pp38) and anti-p38 antibodies. (C) Soft agar assay of FGFR3-
S249C-expressing cells (S249C1.2) in the presence or absence of inhibitors. SU5402,
PD98059, LY294002 and SB203580 are specific respectively for FGFRs, ERK1/2, PI3
kinase and p38 activation. Data are the means of two independent experiments carried out
in triplicate and the standard errors are indicated. Results were compared using unpaired
Student’s t-test, *, p<0.05; **, 0.001<p<0.005; ***, 0.0001<p<0.001; ****,p<0.0001

105
Figure 2 (Figure legend page 105)

106
Figure 2: P38 and AKT activation depends on FGFR3 expression and are critical for
constitutively-activated FGFR3 expressing Human epithelial bladder tumor cells
proliferation and transformation.
(A) FGFR3 knockdown inhibits p38 and AKT activation in MGH-U3 and RT112 human
bladder tumor cells that expressed activated-FGFR3, respectively FGFR3-Y375C and
FGFR3-TACC3. Lysates (10 µg of protein) of cells transfected with control siRNA (Ctr) or
with siRNA targeting FGFR3 (72 h after transfection) were subjected to immunoblotting with
anti-phospho-p38 (Pp38), anti-p38, anti-phospho-AKT, AKT and anti-FGFR3 antibodies.
FGFR3 siRNAs decreased FGFR3 protein levels by 80 to 90 % in MGH-U3 and in RT112
cells. siRNA #1 and #2 could inhibit mutated or wild-type FGFR3 gene expression whereas
siRNAs #3 and #4 also allowed to inhibit FGFR3-TACC3 fusion gene expression and were
therefore used with RT112 cells (see methods). (B)FGFR3 inhibition using 0,5 µM
PD173074 (FGFR inhibitor) for two hours decreased AKT and P38 phosphorylation as
assessed by western-blot. (C) P38 and PI3K inhibition decreases cell viability of MGH-U3
and RT112 cells that expressed respectively mutated FGFR3-S249C and FGFR3-TACC3
fusion protein. MTT incorporation was evaluated 72 hours after treatment with PD173074
(FGFR inhibitor) or SB203580 (p38 inhibitor) or LY294002 (PI3 Kinase inhibitor). (D)
Transfection with p38 or FGFR3 siRNA had same effect on MGHG-U3 and RT112 cell
viability than P38 and FGFR3 inhibition using kinase inhibitors (fig.2C) (left panel). p38
expression was decreased by at least 90% 72h after p38 (MAPK14) siRNA treatment (right
panel). Lysates (10µg) of p38 siRNA-transfected cells were immunoblotted with anti-p38 or
anti-tubulin antibodies. (E) The inhibition or depletion of p38 or FGFR3 or the inhibition of
AKT inhibited the anchorage-independent growth of MGH-U3 cells by 70 to 80%. Colonies
with diameters greater than 50 µm were counted 14 days after seeding in the presence or
absence of the FGFR inhibitor PD173074 or the p38 inhibitor SB203580 or following
transfection with siRNA. The results presented are the means of two independent
experiments carried out in triplicate; the standard errors are indicated. Results were
compared using unpaired Student’s t-test, *, p<0.05; **, 0.001<p<0.005; ***,
0.0001<p<0.001; ****,p<0.0001

107
Figure 3

108
Figure 3: up-regulation of MYC mRNA by FGFR3 depends on P38 activation and
promotes bladder cancer cell growth.
(A) FGFR3 and P38 depletion using siRNA lead to a downregulation of MYC mRNA in
MGH-U3 and RT112 human bladder tumors cells that expressed activated-FGFR3,
respectively FGFR3-Y375C and FGFR3-TACC3 (72h after transfection). MYC mRNA level
was quantified by RT-QPCR as describe in materials and methods. (B) FGFR3 and p38
siRNAs decreased MYC protein level in MGH-U3 and RT112 cells. MYC siRNA was used
as control. Lysates (10 µg of protein) of cells transfected with control siRNA (Ctr) or with
siRNAs targeting FGFR3, p38 or MYC (72 h after transfection) were subjected to
immunoblotting with anti-FGFR3, P38, MYC and anti-Tubulin antibodies. (C) Effect of MYC,
P38 and FGFR3 down-regulation using 20 nM of each siRNA on MGH-U3 cell viability was
assessed 72 hours post transfection by MTT assay.

109
Figure 4: HuR is involves in P38-induced MYC mRNA up-regulation in RT112 cells.
(A-B). HuR knockdown in RT112 cells using two different siRNA decrease MYC RNA level
as assessed by RT-QPCR (A) and MYC protein level as assessed by western-blot (B). 72
hours post transfection with control siRNA (Ctr) or with siRNA targeting HuR, RNA were
extracted and MYC RNA level assessed by RT-QPCR as described in methods and cell
lysates (10µg) were subjected to immunoblotting with anti-MYC, anti-HuR, anti-FGFR3 and
anti-Tubulin antibodies. (C) FGFR3 or p38 were depleted using SiRNA (72h) or inhibited
respectively with PD173074 (0.5 µM) or SB203580 (2 µM) for 2h in RT112 cells.
Immunofluorescence analysis of subcellular localization of HuR in cells was performed with
anti-HuR antibody.

110
Figure 5: FGFR3 prevents proteasome-mediated MYC protein degradation through
AKT-mediated GSK3β inhibition.
(A)RT112 and MGH-U3 cells were treated for three hours with FGFR inhibitor (0,5 µM
PD173074) or proteasome inhibitor (10µM MG132), alone or in combination. MYC
expression was analyzed by immunoblot. (B-C) RT112 and MGH-U3 cells were treated for
three hours with a FGFR inhibitor (0,5 µM PD173074) (B) or a PI3kinase inhibitor (20µM
LY294002). Lysates (10 µg of protein) were subjected to immunoblotting with anti-phospho-
FGFR3, anti-MY, phospho-AKT (Ser 473), Phospho GSK3B (ser 9) and anti-Tubulin
antibodies.

111
Figure 6: A FGFR3/MYC positive feedback loop regulates FGFR3 expression level.
(A)RT112 and MGH-U3 cells were transfected with MYC siRNA#1 or MYC siRNA#2 for 72
hours followed by protein extraction. MYC, FGFR3 and phospho-P38 level were analyzed
by immunoblotting. (B) RT112, MGH-U3, UMUC14 and RT4 cells were treated for 72 hours
with FGFR inhibitor (0,5 µM PD173074). Lysates (10 µg of protein) were subjected to
immunoblotting with anti-FGFR3 and anti-MYC antibodies. Anti-tubulin was used as a
loading control.

112
Figure 7: P38 and AKT are phosphorylated in human bladder tumors presenting
FGFR3 mutation.
(A-B) Phosphorylation level of P38 (A) and AKT (B) was assessed by reverse phase protein
array (RPPA) in 57 NMIBC (Non-Invasive Bladder Carcinoma) and 72 MIBC (Muscle
Invasive Bladder Carcinoma) as described in method section. 29 NMIC and 9 MIBC
presented FGFR3 mutation. Comparisons between mutated and non-mutated tumors were
performed using Wilcoxon rank sum test.

113
Supplementary Figure 1: P38 is part of FGFR3 signaling complex
(A) FGFR3 and p38 co-immunoprecipitates in MGH-U3 and RT112 cells. Total cell lysates
(1 mg) were incubated with protein G-coupled FGFR3 antibody (directed toward the extra-
cellular domain of FGFR3) or control IgG. Protein immunoprecipated were subjected to
immunoblotting with the same anti-FGFR3 antibody or with anti-p38 antibody. (B) P38-
FGFR3 interaction requires FGFR3 phosphorylation. MGH-U3 cells were treated 1 hour
with 0.2 µM PD173074 (a FGFR inhibitor) and total cell lysates (1mg) were incubated with
protein G-coupled FGFR3 antibody. Protein immunoprecipated were subjected to
immunoblotting with anti-FGFR3 or anti-p38 antibodies.

114
Supplementary Figure 2: AKT inhibition does not modify HuR subcellular localization
but up-regulates P38 phosphorylation.
(A)HuR localization was assessed in RT112 cells after two hours of treatment with PI3K
inhibitor (LY294002) by immunocytolabeling using anti-HuR antibodies. (B) PI3 kinase
inhibition using 20 µM LY294002 for two hours decreased AKT phosphorylation and
increase P38 phosphorylation as assessed by western-blot in RT112 and MGH-U3 cells.

115
Materiels and Methods
Cell culture and transfection
Transfected NIH-3T3 cells expressing the wild-type FGFR3b isoform (clones
R3b1.1, R3b1.3) or expressing the mutated FGFR3b-S249C receptor (clones
S249C1.1, S249C 1.2) or those transfected with the control pcDNAI-Neo plasmid
(clones Neo1.5, Neo 2.1) were established previously {Bernard-Pierrot, 2005 #97}
and cultured in DMEM with 10% newborn calf serum, 2 mM glutamine, 100 u/ml
penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 400 µg/ml G418. Human bladder derived cell
lines RT112, RT4 and UMUC14 were obtained from DKFZ (Heidelberg, Germany).
MGH-U3 cells were kindly provided by Dr. Paco Real. MGH-U3 and UMUC14 cells
were cultured in DMEM/F12, RT112 and RT4 in RPMI. Medium were complemented
with 10% fetal calf serum (FCS). Cells were kept at 37 °C, under an atmosphere
containing 5% CO2. The identity of cell lines used was checked by analyzing the
genomic alterations with comparative genomic hybridization arrays [and FGFR3 and
TP53 mutations with the SNaPshot technique (for FGFR3) or classical sequencing
for TP53.

For siRNA transfection, MGH-U3 and RT112 cells were used to seed 6-well or 24-
well plates at 250 000 cells/ well for MGH-U3 cells and 200 000 cells/ well for RT112
cells. Cells were transfected with 20 nM in the presence of lipofectamine RNAi Max
reagent (Invitrogen), according to the manufacturer’s protocol. siRNAs were
purchased from Ambion and Qiagen. For the control siRNA we used a Qiagen
control (Luciferase GL2 SiRNA, #1022070).

Sequences of siRNA used are listed above:

Control SiRNA: 5’-CGUACGCGGAAUACUUCG-3’ (sens strand)

5’-UCGAAGUAUUCCGCGUAC-3’ (antisens strand)

FGFR3#1: 5’-GCUUUACCUUUUAUGCAA-3’ (sens strand)

5’-UUGCAUAAAAGGUAAAGGC-3’ (antisens strand)

FGFR3#2: 5’-GGGAAGCCGUGAAUUCAGU-3’ (sens strand)

5’-ACUGAAUUCACGGUUCCC-3’ (antisens strand)

FGFR3#3: 5’-CCGUAGCCGUGAAGAUGC-3’ (sens strand)

116
 5’-AGCAUCUUCACGGCUACGG-3’ (sens antistrand)

FGFR3 #4: 5’-CCUGCGUCGUGGAGAACA-3’ (sens strand)

5’-UUGUUCUCCACGACGCAGG-3’(sens antistrand)

P38#2: 5’-GGUCUCUGGAGGAAUUCAA-3’ (sens strand)

5’-UUGAAUUCCUCCGAGACC-3’ (antisens strand)

P38#4: 5’-CUGCGGUUACUUAAACAUA-3’ (sens strand)

5’-UAUGUUUAAGUAACCGCAG-3’ (antisens strand)

MYC #1: 5’-UCCCGGAGUUGGAAAACAATT-3’ (sens strand)

5’-UUGUUUUCCAACUCCGGGATC-3’ (antisens strand)

MYC #2: 5’-CGGUGCAGCCGUAUUUCUATT-3’ (sens strand)

5’-UAGAAAUACGGCUGCACCGAG-3’ (antisens strand)

HuR#1: 5’-ACUUAUUCGGGAUAAAGUA-3’ (sens strand)

5’-UACUUUAUCCCGAAUAAGU-3’ (antisens strand)

HuR#2: 5’-CAGUUUCAAUGGUCAUAAATT-3’ (sens strand)

5’-UUUAUGACCAUUGAAACUGGT-3’ (antisens strand)

Cell viability was assessed by MTT assay (0,5 mg/mL), 72 h after transfection, in
24-well plates. Cell lysates were also prepared 72 h after transfection, in six-well
plates.

Kinase inhibitors.

The inhibitors LY294002, PD98059, SB203580, SU5402, PD173074 were

purchased from Calbiochem (Merck Eurolab, Fontenay Sous Bois, France).
Concerning FGFR inbitors, we initially used SU5402 and once available we moved
on PD173074 which was more potent, (IC50 of 10-20 µM and 25 nM, respectively)

Immunoblotting

NIH-3T3, MGH-U3 and RT112 cells were resuspended in lysis buffer (50 mM Tris-
HCl (pH 7.5) 250 mM NaCl, 1% triton X100, Proteases and phosphatases inhibitors

117
(Roche)) and the resulting lysates were clarified by centrifugation. The protein
concentration of the supernatants was determined with the Biorad Bradford Protein
Assay Kit (BioRad). Proteins (10 µg or 50 µg) were resolved by SDS-PAGE in 10 %
polyacrylamide gels, electrotransferred to biorad nitrocellulose membrane and
analyzed with antibodies against p38 and the phosphorylated form of p38 (cell
signaling technology # 9212 and # 4511), AKT and the phosphorylated form of AKT
(Ser413) (cell signaling technologies # 2920 and # 4060), GSK3B (ser9) ( cell
signaling Technology # 5558), MYC (cell signaling Technology # 9402), Tubulin
(Sigma Aldrich #T6199) or extra-cellular domain of FGFR3 (abcam, ab 133644).
Lyophilized proteins extracted from human bladder tumors by the cesium chloride
procedure were solubilized in 1 x Laemmli sample buffer and boiled for 10 min.
Protein concentrations were determined with the Biorad Bradford Protein Assay Kit
(BioRad). Proteins (50 µg) were analyzed similarly by SDS-PAGE, as described
above, using antibodies against p38 and phosphorylated p38. Protein loading was
checked by Amido Black 10B staining of the membrane after electro-transfer.

Immunoprecipitation.

MGH-U3 and RT112 cells were resuspended in lysis buffer (50 mM Hepes (pH 7.5),
250 mM NaCl, 1% triton X-100, cocktail of phosphatase and protease inhibitors
(Roche) and the resulting lysates were clarified by centrifugation. The protein
concentration of the supernatants was determined with the Biorad Bradford Protein
Assay Kit (BioRad). 500 µg of protein was incubated over-night with 50 µl Protein
G-agarose beads coupled to anti-FGFR3 antibodies (sigma Aldrich , F0425 and
abcam ). Beads were rinsed two times with lysis buffer, one time with 50 mM Hepes
containing 250 Mm Nacl and once with Hepes 50 mM . Immunoprecipitated proteins
were eluted with laemmlli buffer, resolved in a 4-12% acrylamide SDS-PAGE
electrotransferred to biorad nitrocellulose membrane and analyzed with antibodies
against p38 (Cell Signaling Technology) or FGFR3 (abcam) as described above.

Soft agar assay

MGH-U3 cells (20,000), untransfected or transfected with siRNA, were used to seed
12-well plates containing MEM supplemented with 10% FCS and 1% agar, in
triplicate. Cells were cultured in the presence or absence of inhibitors in the agar
and culture medium, as appropriate. The medium was changed weekly. The plates

118
were incubated for 14 days and colonies larger than 50 µm in diameter — when
viewed under a phase-contrast microscope equipped with a measuring grid — were
counted.
RNA extraction from cell lines

RNA was isolated from cell lines with RNeasy Mini kits (Qiagen).

DNA array

To identify gene regulated after FGFR3 depletion in MGH-U3 cells, we analyzed 0.2
µg of total RNA of control and siRNA treated cells with the Affymetrix human exon
1.0 ST DNA array, as previously described (biton et al., 2014).LIMMA was used to
identify genes differentially expressed between FGFR3 siRNA-treated (3 different
siRNA) and Lipofectamine-treated cells (3 replicates) from the MGH-U3 cell line.
The p-values were adjusted for multiple testing by BH FDR methods. Genes with a
FDR below 5% were considered to be differentially expressed.

To compare gene expression pattern in two control clones (neo1.5 and neo2.1) and
in two FGFR3-S249C-expressing clones (S249C1.1 and S249C1.2), we used
Affymetrix® U74Av2 microarrays. Each clone was analysed on three replicate chips
A detailed protocol for RNA amplification, cDNA probe labelling and hybridisation is
available from http://affymetrix.com. Array were normalized using RMA algorithm
and affymetrix annotation were used. For each gene, we considered the mean
expression level in the two control clones (3 replicates each) and the mean
expression level in each of the two FGFR3-S249C clones (3 replicates per clone).
Genes with different patterns of expression in the FGFR3-S249C-expressing and
control clones were identified by calculating the log2 fold change for each gene and
retaining only genes displaying a significant over- or under-expression in both
FGFR3-S249C clones compared to the mean expression of the two control clones.
With a cut-off point of a log2 fold change of at least 1.5, we identified 139 probe sets
corresponding to 113 genes displaying differential expression between the two
FGFR3-S249C-expressing clones and the control clones (supplementary table 2).

Real-time reverse transcription-quantitative PCR

Reverse transcription was performed with 1 µg of total RNA, with the High-Capacity
cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems), and MYC and TBP were

119
amplified by PCR in a Roche real-time thermal cycler using Roche taqman master
mix (Roche) and respectively assay on demand Hs00153408_m1 and 4326322E
(encompassing primers and taqman probe) purchased from Applied (Life
technologies).

Anti-HUR immunocyto-labeling
Cells were plated in 6 wells plate (200 000 cells/well). The next day, cells were
treated with SB203580 (P38 inhibitor) at a concentration of 2 µM during 1h or with
PD173074 (FGFR inhibitor) at a concentration of 0.5 µM during 2 hours. After
treatment, wells were rinced three times with ice cold PBS. Cells were fixed on
coverslips with 4% PFA at 4°C, during 45 min in moist chamber. Cells were
permeabilized using triton 5% during 5 min. Coverslips were incubated in blocking
buffer (PSBT tween 0.1%, 0.3 M glycine, 5% BSA) for 1h. Coverslips were incubated
at 4°C overnight with primary antibody (HuR antibody, 19F12 clone, genetex) diluate
in PBS (1/50e). Next day, coverslips were washed three times using ice cold PBS
for 5 min each, and incubate with secondary antibody (mouse Alexa fluor 488,
1/50e) during 1h at room temperature in dark. Coverslips were washed three times
in cold PBS for 5 min each.
Coverslips were mounted with mountain medium containing DAPI (Prolong gold
Antifad Mountant with DAPI, life technologies). Cells were observed using
epifluorescence microscope.

Human bladder samples

We used protein extracted from 129 human bladder tumors (59 non muscle-invasive
and 70 muscle invasive tumors) for western-blot analysis. The flash-frozen tumor
samples were stored at -80 °C immediately after transurethral resection or
cystectomy. All tumor samples contained more than 80% tumor cells, as assessed
by the hematoxylin and eosin (H&E) staining of histological sections adjacent to the
samples used for transcriptome analyses. All subjects provided informed consent
and the study was approved by the institutional review boards of the Henri Mondor,
Foch and Institut Gustave Roussy Hospitals. Proteins were extracted by from the
surgical samples by cesium chloride density centrifugation as previously described
(Calderaro et al., 2014).

120
Mutation analysis
FGFR3 mutations were studied with the SNaPshot technique {van Oers, 2005 #19}.
Reverse phase protein array (RPPA)
RPPA was performed and analyzed as previously described (Calderaro et al.,
2014). Briefly, samples were deposited onto nitrocellulose covered slides (Schott
Nexterion NC-C, Jena, Germany) using a dedicated arrayer (2470 Arrayer, Aushon
Biosystems, Billerica, MA, USA). Four serial dilutions, ranging from 1500 to 187
µg/ml, and four technical replicates per dilution were deposited for each sample.
Arrays were revealed with specific anti-phospho-AKT (Ser473) (#4058) and anti-
phosphoP38 (# 4511) antibodies (Cell Signaling Technology, Ozyme, France) or
without primary antibody (negative control), using Autostainer Plus (Dako, Trappes,
France). Briefly, slides were incubated with avidin, biotin and peroxydase blocking
reagents (Dako, Trappes, France) before saturation with TBS containing 0.1%
Tween-20 and 5% BSA (TBST-BSA). Slides were then probed overnight at 4°C with
primary antibodies diluted in TBST-BSA. After washes with TBST, arrays were
probed with horseradish peroxidase-coupled secondary antibodies (Jackson
ImmunoResearch Laboratories, Newmarket, UK) diluted in TBST-BSA for 1 h at RT.
To amplify the signal, slides were incubated with Bio-Rad Amplification Reagent for
15 min at RT. The arrays were washed with TBST, probed with Alexa647-
Streptavidin (Molecular Probes) diluted in TBST-BSA for 1 hour at RT and washed
again in TBST. For staining of total protein, arrays were incubated 15 min in 7%
acetic acid and 10% methanol, rinsed twice in water, incubated 10 min in Sypro
Ruby (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) and rinsed again. The processed slides
were dried by centrifugation and scanned using a GenePix 4000B microarray
scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, USA). Spot intensity was determined with
MicroVigene software (VigeneTech Inc, Carlisle, USA), corrected for background
signal without antibody and normalized to Sypro Ruby signal. Antibodies used in
RPPA have been previously tested by Western-Blotting to assess their specificity
for the protein of interest within 18 tumor lysates and presented a Pearson
correlation coefficient between RPPA and Western blotting of 0.84 for p-AKT
(Calderaro et al.2014) and 0.86 for p-P38 (data not shown).

Statistical analysis

121
All functional experiments were carried out twice or three times, in triplicate. Data
were analyzed as means ± SD. The control siRNA group or control DMSO treated
group was used as the reference. Results were evaluated using Student's t-test.
RPPA signals in FGFR3-mutated tumors and in tumors without FGFR3 mutation
were compared using Wilcoxon rank sum test. Genes modulated after FGFR3
expression in NIH-3T3 cells and after FGFR3 depletion in MGH-U3 cells were
identified as described above in DNA array section.

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129
1.2 D ISCUSSION

Cette étude a permis de mettre en évidence le rôle critique de l’activation des protéines p38
et AKT par le récepteur FGFR3 altéré pour la prolifération et la transformation cellulaire de
cellules dérivées de tumeurs de vessie. Nous avons montré que l’activation de ces deux
voies par FGFR3 induisait une surexpression de la protéine MYC. L’activation de p38 induit
une stabilisation de l’ARNm de MYC tandis que l’activation d’AKT conduit à la stabilisation
de la protéine MYC en empêchant sa dégradation par le protéasome.

Dans cette étude nous avons utilisé un inhibiteur de la PI3Kinase, le LY294002 pour inhiber
la phosphorylation d’AKT et étudier son rôle. Nous avons ainsi montré que comme
classiquement décrit pour les récepteurs à activité tyrosine kinase, FGFR3 active AKT via
l’activation de la PI3Kinase. Cependant le mécanisme d’activation de p38 par FGFR3 n’a
pas été déterminé. Plusieurs hypothèses peuvent être émises aux vues de la littérature et
du réseau d’interaction de FGFR3 (chapitre II des résultats). P38 pourrait être activée par
une des voies canoniques décrites dans la littérature impliquant les protéines TAK1,
MEKK1 et MEKK3 ou p38 pourrait être activée par une voie non canonique impliquant les
protéines CDC37 et HSP90 (Ota, Zhang, Ping, Han, & Wang, 2010) (voir figure 1). La
protéine TAK1 (MAP3K7) a été identifiée comme partenaire protéique de FGFR3 lors des
analyses par de spectrométrie de masse des protéines co-immunopécipitées avec FGFR3
dans la lignée RT112. L’utilisation de l’algorithme PEPPER a permis de proposer des
interactions avec les protéines TAK1 et avec les protéines MEKK1 et MEKK3. Les protéines
TAK1 et MEKK3 pouvant activer la protéine p38α de manière canonique via les
MAP2Kinases MKK3/MKK6, la protéine MEKK1 peut, elle, conduire à l’activation de p38α
via l’activation de la MAP2Kinase MKK4 (figure 1A). D’autre part, nous avons également
mis en évidence l’existence d’un complexe CDC37/HSP90 interagissant avec FGFR3 (voir
chapitre II des résultats) qui pourrait réguler l’activation de p38.

Nous avons commencé à tester ces différentes hypothèses de mode d’activation de p38
par FGFR3.

Nous nous sommes d’abord focalisés sur l’étude de l’activation de p38 par la voie
canonique TAK1/MKK3/MKK6, en étudiant l’impact de la déplétion de TAK1 grâce à
l’utilisation de SiRNA sur l’activation de p38 dans les lignées cellulaires RT112 et MGH-U3.
Nous avons montré par western blot que la perte d’expression de TAK1 n’a aucun impact
sur la phosphorylation de p38 et conduit à l’activation des MAP2Kinases MKK3/MKK6 dans
la lignée cellulaire RT112 (figure 2A). De plus dans cette lignée RT112, l’inhibition de
FGFR3 grâce à l’utilisation d’un inhibiteur de l’activité kinase des FGFR (PD173074) induit
une inhibition de la phosphorylation de p38 (Figure 2B). Ces résultats suggèrent que p38

130
n’est pas activé par la voie TAK1/MKK3/MKK6 car dans cette lignée cellulaire MKK3/6 n’est
de base pas activé.

F IGURE 1 : M ODELES D ’ ACTIVATION DE P 38 Α PAR FGFR3 PROPOSES AU COURS DE CETTE

THESE .

(A) Activation de p38α par une voie canonique. P38 peut être activée par la voie
TAK1/MKK3/6, la voie MEKK3/MKK3/6 ou encore la voie MEKK1/MKK4. (B) Activation de
p38 par la voie non canonique CDC37/HSP90.

131
 A RT112 MGH-U3

TAK1 SiRNA :
TAK1

P-P38

P-MKK3/6

B RT112
PD173074 : TO T3H T6H T9H

P-FGFR3

FGFR3

P-p38

p38

P-MKK3/6

F IGURE 2: E TUDE DE L ’ ACTIVATION DE P38 PAR FGFR3 DANS LES LIGNEES CELLULAIRES
RT112 ET MGH-U3.

(A) La déplétion de TAK1 n’a aucun effet sur la phosphorylation de p38. Les cellules RT112
et MGH-U3 ont été transfectées avec les SiRNA TAK1#1 Et TAK1#2. L’extraction protéique
a été réalisée 72h après la transfection et la phosphorylation des protéines P38 et MKK3/6
a été étudiée par western blot. (B) L’inhibition de FGFR3 induit une inhibition de phospho-
p38 et conduit à l’activation de MKK3/6. Les cellules RT112 ont été traitées à différents
temps (0, 3h, 6h et 9h) avec un inhibiteur des FGFR, le PD173074. La phosphorylation de
FGFR3, P38 et MKK3/6 ont été étudiés par western blotting.

Nous n’avons pas encore exploré les deux hypothèses émises pour expliquer l’activation
de p38 par FGFR3 (voir figure 1). L’implication de la voie canonique MEKK1/MKK4 pourra
être testée grâce à l’utilisation de SiRNA ou d’inhibiteurs de ces enzymes. L’implication de
la voie non canonique CDC37/HSP90 pourra être étudiée grâce à l’utilisation de SiRNA, en
inhibant HSP90 (traitement au 17AAG) ou en bloquant l’interaction entre CDC37 et HSP90
(Withaférine A),(figure 1B).

132
Quel que soit le mécanisme par lequel FGFR3 active la protéine p38α cela conduit à la
stabilisation de l’ARNm et de la protéine MYC. La protéine HuR, quand elle est active voit
sa localisation subcellulaire répartie entre le noyau et le cytoplasme. Nous avons montré
dans la lignée cellulaire RT112 que dans les cellules non traitées HuR était majoritairement
présente dans le noyau, mais était aussi localisée dans le cytoplasme. Nous nous sommes
donc par la suite focalisés sur l’étude de l’implication de HuR dans la stabilisation de l’ARNm
de MYC. La déplétion de HuR par SiRNA conduit à une perte de l’ARNm de MYC, bien
qu’elle soit moins importante que celle observée suite à la déplétion des protéines FGFR3
et p38. De plus la déplétion de HuR par SiRNA conduit à une perte partielle de la protéine
MYC, suggérant que HuR est aussi impliquée dans la traduction de l’ARNm de MYC en
protéine. Cependant la déplétion de FGFR3 ou de p38 par SiRNA conduit à une perte de
l’ARNm de MYC beaucoup plus importante que lorsque c’est HuR qui est déplétée. Ces
résultats suggèrent que HuR n’est peut-être pas la seule protéine recrutée par FGFR3 à
être impliquée dans la stabilisation de l’ARNm de MYC. Les protéines HNRNPU et
HNRNPH2 ont été identifiées comme partenaires protéiques de FGFR3 par spectrométrie
de masse (résultats chapitre II). Ces protéines se lient aux pré-ARNm dans le noyau et
appartiennent à la famille des hnRNP (heterogenous-Ribo-Nuclear-Protein). Les protéines
hnRNP peuvent coopérer avec HuR pour stabiliser les ARNm, et la protéine HNRNPU est
décrite comme pouvant être impliquée dans la stabilisation de l’ARNm de MYC
(Weidensdorfer, Stöhr, Baude, Lederer, Kohn, et al., 2009). L’étude de l’implication de la
protéine HNRNPU est actuellement en cours au laboratoire. Dans le but de mieux
comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation de l’ARNm de MYC, Il serait
intéressant d’étudier l’impact de la déplétion simultanée de HuR et HNRNPU afin de voir
s’il y a un effet additif sur la perte de l’ARNm de MYC.

Au cours de cette étude nous avons également montré que cette sur-expression de MYC
induite par l’expression de FGFR3 activé de manière constitutive (mutation activatrice ou
protéine de fusion) induisait en retour une surexpression de FGFR3. Cependant le
mécanisme par lequel MYC régule le niveau d’expression de FGFR3 reste inconnu. Deux
hypothèses peuvent être avancées aux vues de l’implication connue de MYC dans la
régulation transcriptionnelle directe de gènes codant et non-codant et des modes de
régulation connues du niveau d’expression de FGFR3. Premièrement, l’inhibition de MYC
conduit à la dégradation post-transcriptionnelle du transcrit FGFR3 par un micro-ARN dont
MYC régulerait directement la transcription. Il a en effet déjà était décrit que le niveau
d’ARNm de FGFR3 était régulé négativement par des micro-ARN tels que mir-99a mir-100
ou LET-7 (Blick et al., 2013; Catto et al., 2010) et que MYC peut être impliquée dans la
régulation de nombreux micro-ARN, dont les micro-ARN mir99, mir100 et LET-7 (Chang et

133
al., 2008). Cependant il a été montré dans le cas du glioblastome que le micro-ARN mir-
99a qui se fixait en 3’-UTR de l’ARNm de FGFR3 afin d’induire sa dégradation ne se lie pas
à la partie 3’-UTR de TACC3 présent sur l’ARNm du produit de fusion FGFR3-TACC3 et
qu’ainsi il échappe à cette régulation (Parker et al., 2013). Dans notre étude, dans la lignée
cellulaire RT112, la perte d’expression de MYC induit une perte d’expression de FGFR3 et
de FGFR3-TACC3. Le gène de fusion exprimé dans la lignée RT112 est le même que celui
retrouvé dans le glioblastome, il n’est donc pas possible que la perte de FGFR3 observée
soit due à une régulation par le micro-ARN, mir 99a. Il est donc possible que la perte de
MYC conduise à une régulation positive de l’expression de certains micro-ARN, dont
certains pouvant être impliqués dans la régulation du transcrit de FGFR3. Toutefois nous
ne pouvons pas exclure que le niveau des ARNm de FGFR3 et FGFR3-TACC3 puisse être
régulé par un micro-ARN capable de se fixer à la fois sur les 3’-UTR de FGFR3 et de
FGFR3-TACC3. Cela pourrait être vérifié en mesurant le taux d’ARNm de TACC3 après la
déplétion de MYC par SiRNA.

La seconde hypothèse qui peut être avancée est que MYC se fixe directement sur le
promoteur de FGFR3 pour induire sa transcription. En effet, il existe des sites prédits dans
le promoteur de FGFR3 pour la fixation de MYC permettant d’envisager cette hypothèse
d’activation transcriptionnelle directe de FGFR3 par MYC. Nous avons dans un premier
temps analysé les données publiques de Chip-seq (Base N-code) concernant la fixation de
MYC sur le promoteur de FGFR3 mais sans résultat. Cependant aucune expérience n’a été
réalisée dans un système cellulaire exprimant fortement FGFR3. Le fait que cette
information ne soit pas connue peut s’expliquer par le fait que FGFR3 est exprimé dans
très peu de tissus (seulement la vessie et la peau) et donc que les expériences de Chip-
seq qui auraient pu mettre cela en évidence n’ont pas été réalisées. Une étude est
actuellement en cours au laboratoire pour déterminer via la méthode de Chip-QPCR si MYC
se fixe sur le promoteur de FGFR3 dans les lignées cellulaires RT112 et MGH-U3.

Nous avons donc montré dans cette étude l’existence d’une boucle de rétrocontrôle positive
entre le récepteur FGFR3 muté ou le récepteur FGFR3-TACC3 et MYC. Une autre protéine
de fusion a été identifiée dans les tumeurs de vessie-la protéine FGFR3-BAIAP2L1, qui n’a
pas était étudiée dans cette étude car elle n’avait été initialement identifiée que dans une
seule lignée cellulaire dérivée d’une tumeur de vessie alors que la protéine FGFR3-TACC3
avait été observée avec une plus grande fréquence dans les tumeurs de vessie.
Récemment il a été montré que la protéine de fusion FGFR3-BAIAP2L1 et également dans
le cancer du poumon (Nakanishi et al., 2015). Il serait donc intéressant de réaliser la même
étude dans la lignée cellulaire SW780 exprimant la protéine de fusion FGFR3-BAIAP2L1
de manière endogène, afin de déterminer si cette boucle de rétro-contrôle entre le récepteur

134
FGFR3 et MYC existe aussi dans ce cas. Il serait intéressant de voir si c’est également le
cas dans d’autres types de cancer exprimant le récepteur FGFR3 muté ou les protéines de
fusion FGFR3-TACC3 et FGFR3-BAIP2L1, et notamment dans le cancer du poumon, du
glioblastome et dans les myélomes multiples où il a déjà été montré que le récepteur
FGFR3 sauvage et MYC lorsqu’ils sont conjointement exprimé (surexpression de FGFR3)
coopèrent pour induire la formation de lymphomes matures (Zingone et al., 2010).

La lignée cellulaire RT112 exprime à la fois la forme FGFR3-TACC3 et la forme sauvage

du récepteur. Si dans les myélomes multiples le récepteur FGFR3 sauvage coopère avec
MYC il est aussi possible que cela soit le cas dans les tumeurs de vessie. La déplétion de
MYC par SiRNA dans la lignée RT112 conduit à une perte de FGFR3-TACC3 mais aussi
de FGFR3, montrant ainsi que MYC régule les deux transcrits (FGFR3 et FGFR3-TACC3).
Dans cette étude, les SiRNA utilisés (Si3 et 4) ciblent les deux formes du récepteur : FGFR3
et FGFR3-TACC3. Nous avons donc dans un premier temps étudié l’interaction entre les
récepteurs FGFR3 sauvage et FGFR3-TACC3. Les deux formes du récepteur ayant le
même poids moléculaire, nous avons réalisé une immunoprécipitation du récepteur
sauvage et révélée par western blot l’interaction avec la partie C-ter ou la partie N-ter de
TACC3 pour montrer que les deux formes du récepteur interagissent spécifiquement
ensemble. En effet, Le fait que le récepteur FGFR3 sauvage interagisse avec la partie C-
ter de TACC3 mais pas avec la partie N-ter de TACC3, ce qui montre que le récepteur
sauvage interagit avec la protéine FGFR3-TACC3 mais pas avec la protéine TACC3
endogène (figure 3). Nous avons validé cette interaction en réalisant une
immunoprecipitation de la partie C-ter de TACC3 et révélé par western blot son interaction
avec le récepteur FGFR3 sauvage.

F IGURE 3 : I NTERACTION ENTRE LES RECEPTEURS FGFR3 SAUVAGE ET FGFR3-TACC3 DANS

LA LIGNEE CELLULAIRE RT112.

135
Les deux formes du récepteur (FGFR3 sauvage et FGFR3-TACC3) interagissent ensemble
dans cette lignée cellulaire, suggérant que le récepteur FGFR3-TACC3 recrute et active le
récepteur sauvage. Nous avons donc par la suite étudié le rôle du récepteur sauvage pour
la prolifération cellulaire. Deux nouveaux SiRNA (SI 7 et 8) ont été utilisés pour dépléter
spécifiquement la forme sauvage du récepteur, les SiRNA 1 et 2 utilisés au cours de la
première étude dans la lignée cellulaire MGH-U3 n’induisant pas une perte d’expression
suffisante du récepteur FGFR3 sauvage dans la lignée cellulaire RT112. La déplétion du
récepteur sauvage conduit à une inhibition de la prolifération cellulaire d’environ 25% à 35
%, en comparaison à une inhibition de la prolifération cellulaire de 75-80% lorsque les deux
formes (sauvage et altéré) sont deplétées (figure 4). Ces résultats suggèrent que le
récepteur FGFR3 sauvage possède des propriétés oncogéniques dans le contexte où il est
exprimé conjointement avec la protéine de fusion FGFR3-TACC3.

F IGURE 4 : E TUDE DE L ’ IMPACT DE LA DEPLETION DU RECEPTEUR FGFR3 SAUVAGE SUR LA

PROLIFERATION CELLULAIRE DANS LA LIGNEE CELLULAIRE RT112.

(a) La déplétion du récepteur sauvage impact sur la prolifération cellulaire. Le récepteur

FGFR3 sauvage a été déplété avec les SiRNA 7 et 8. Les SiRNA 3 et 4 ciblent à la fois la
forme FGFR3-TACC3 et la forme FGFR3 sauvage. La prolifération cellulaire a été mesuré
par un test MTT, 72h après transfection. (b) Validation de la déplétion de FGFR3 par les
SiRNA 7 et 8 dans les lignées MGH-U3 et RT112. Les cellules MGH-U3 et RT112 ont été
transfectées avec les SiRNA 7 et 8. Le lysat protéique a été extrait 72h après la transfection.
La déplétion de FGFR3 dans les lignées cellulaires MGH-U3 et RT112 a été étudiée par
western blotting.

Ces résultats permettent de proposer un modèle selon lequel, le récepteur FGFR3-TACC3

interagit avec le récepteur FGFR3 sauvage pour le phosphoryler et l’activer, selon un

136
modèle FGFR3 WT/FGFR3-TACC3 1 :2 ou FGFR3 WT/FGFR3-TACC3 2 :2. L’activation
permanente du récepteur FGFR3-TACC3 conduit à une activation aberrante du récepteur
FGFR3 sauvage (figure 64). Il serait donc intéressant d’étudier l’impact de la déplétion du
récepteur FGFR3 sauvage sur l’activation des protéines p38 et AKT mais aussi sur la
stabilisation de la protéine MYC.

F IGURE 5 : R EPRESENTATION SCHEMATIQUE DU RECRUTEMENT ET DE L ’ ACTIVATION DU

RECEPTEUR FGFR3 SAUVAGE PAR LE RECEPTEUR FGFR3-TACC3 ET AMPLIFICATION DE
L ’ ACTIVATION DES VOIES DE SIGNALISATION DES PROTEINES P 38 ET AKT

Les mutations de RAS et de FGFR3 sont mutuellement exclusives dans les tumeurs de
vessie. L’hypothèse la plus souvent avancée pour expliquer cette observation est
l’appartenance de RAS aux voies de signalisation de FGFR3, suggérant que l’activation de
RAS muté ou de FGFR3 muté dans les carcinomes de vessie a les mêmes conséquences.
Cependant cette hypothèse n’a jamais clairement été démontrée. Dans le glioblastome
RAS est impliqué dans la stabilisation de la protéine NMYC via l’activation de deux voies
de signalisation. La voie PI3K/AKT et la voie RAF/MEK/ERK. L’activation de la voie
PI3K/AKT conduit à l’inhibition de la protéine GSK3β (AKT phosphoryle GSK3β sur la ser9).
La protéine GSK3β étant inactive, elle ne peut plus promouvoir la dégradation par le
protéasome de la protéine MYC qui est alors stabilisée. L’activation de la voie
RAF/MEK/ERK conduit, elle aussi, à une stabilisation de la protéine MYC en induisant
l’allongement du temps de demi-vie de MYC, en phosphorylant MYC sur la sérine 62 (figure
6). De manière intéressante, la voie PI3K/AKT conduisant à l’inhibition de GSK3β et
empêchant la dégradation par le protéasome de la protéine MYC, est aussi activée par le
récepteur FGFR3 altéré dans les tumeurs de vessie. Concernant la voie RAF/MEK/ERK,
l’étude réalisée dans les NIH3T3 a montré que les protéines ERK1/2 n’étaient pas

137
différentiellement activées lorsque les cellules expriment le récepteur sauvage ou le
récepteur muté, indépendamment d’une stimulation au ligand FGF1. Cependant l’activation
de ERK1/2 n’a pas été réalisée dans les lignées cellulaires RT112 et MGH-U3, il n’est donc
pas possible d’affirmer dans le cas présent que cette voie n’est pas impliquée dans la
boucle FGFR3/MYC. Dans cette étude, nous avons par contre montré l’implication d’une
autre voie MAPKinase, celle de la protéine p38 qui est impliquée dans la stabilisation de
l’ARNm de MYC.

F IGURE 6: S TABILISATION DE LA PROTEINE MYC VIA L ’ ACTIVATION DES VOIES DE

SIGNALISATION PI3K/AKT ET RAK/MEK/ERK PAR RAS (Bachirredy, Bendapudi, & Felsher,
2005; Yaari et al., 2005)

Afin de savoir si les mutations de RAS et de FGFR3 conduisent à l’activation des mêmes
voies de signalisation, il serait intéressant de réaliser la même étude que celle effectuée au
cours de cette thèse mais dans une lignée RAS mutée, qui ne présente pas d’altération du
gène FGFR3. Ainsi cette étude pourrait être réalisée dans la lignée cellulaire T24 qui répond
à ces critères. Nous avons déjà montré dans cette même lignée cellulaire que p38 est
phosphorylé et que l’inhibition de p38 (traitement au SB203580) a un impact négatif sur la
prolifération et la transformation cellulaire. Cependant l’étude de la phosphorylation d’AKT
n’a pas été réalisée.

138
C HAPITRE II : I DENTIFICATION DU RES EAU D ’ INTERACTION DE
FGFR3

2.1 I NTRODUCTION

L’étude des voies de signalisation du récepteur FGFR3 muté ou FGFR3-TACC3 réalisée

au cours de cette thèse a permis de mettre en évidence l’implication des protéines p38 et
AKT dans le maintien d’une boucle de rétrocontrôle entre FGFR3 et MYC, permettant
d’expliquer en partie les propriétés oncogéniques du récepteur FGFR3 muté ou FGFR3-
TACC3 dans les carcinomes de vessie. Cependant de nombreuses voies de signalisation
activées par le récepteur FGFR3 restaient à caractériser. C’est pourquoi, nous avons
décidé de mettre en place une seconde stratégie visant à identifier l’interactome de FGFR3.
Pour cela nous avons tiré parti d’une étude de protéomique précédemment réalisée au
laboratoire.

Cette étude avait pour but d’identifier les partenaires protéiques de FGFR3 par
spectrométrie de masse (Aubertin, 2009). Le récepteur FGFR3 sous forme sauvage, muté
S249C ou muté Y375C, portant un flag-tag avait été transfécté dans la lignée cellulaire
RT112. Cette lignée a été choisie car c’est une lignée cellulaire dérivée d’une tumeur de
vessie exprimant uniquement le récepteur FGFR3 sauvage (il n’était pas connu que cette
lignée exprimait aussi le récepteur FGFR3-TACC3). La surexpression par transfection du
récepteur sauvage ou muté dans cette lignée avait pour but de permettre
d’immunoprécipiter les partenaires protéiques du récepteur dans des quantités suffisantes
pour pouvoir les identifier correctement lors de l’analyse par spectrométrie de masse. Une
immunoprécipitation à l’aide d’un anticorps anti-flag a été réalisée pour chaque condition
(S249C, Y375C, sauvage), suivi d’une élution des protéines interagissant avec le récepteur
à l’aide d’un peptide flag puis d’une analyse par spectrométrie de masse (LC MS/MS)
permettant ainsi d’identifier des partenaires protéiques du récepteur FGFR3 muté ou
sauvage. Le récepteur FGFR3 sauvage non flagé a servi de contrôle (figure 1). Les
expériences de spectrométrie de masse réalisées à partir du récepteur sauvage ont été
réalisées 3 fois, celles réalisées à partir du récepteur FGFR3 muté (S249C ou Y375C) ont
été réalisées 8 fois (4 fois pour le récepteur FGFR S249C et 4 fois pour le récepteur FGFR3
Y375C). Certaines interactions (interactions moins fortes ou de courte durée, pouvant être
éventuellement dépendantes de l’état des cellules) étant difficiles à mettre en évidence, il
était donc nécessaire de multiplier les expériences afin d’optimiser la reproductibilité des
résultats. Les interactions impliquant les protéines Rab par exemple, impliquées dans le
trafic cellulaire sont connues pour être transitoires. Après analyse par spectrométrie de
masse des protéines co-immunoprécipitées avec le récepteur FGFR3, une liste de 1904

139
protéines candidates a été obtenue. Pour identifier les partenaires protéiques de FGFR3
plusieurs filtres ont été appliqués. Les protéines identifiées par spectrométrie de masse
avec un ou plusieurs peptides dans les expériences contrôles ont été éliminées ainsi que
celles identifiées avec moins de trois peptides (pour augmenter la stringence). Une liste
finale de 110 partenaires protéiques a ainsi été établie.

F IGURE 1: M ETHODE D ’ IDENTIFICATION DES P ARTENAIRES PROTEIQUE DE FGFR3 SAUVAGE ET

MUTE PAR IMMUNOPRECIPITATION ET ANALYSE MS/MS

Le récepteur FGFR3 sauvage ou muté (S249C ou Y375C) portant un flag tag a été
transféctée dans la lignée cellulaire RT112. Par la suite une Immunoprecipitation du Flag-
Tag a été réalisée. Le contrôle utilisé est le récepteur FGFR3 non flagé. Les protéines
immunoprécipitées ont été identifiées par LC MS/MS. Une première liste de 110 partenaires
protéiques de FGFR3 a ainsi pu être établie (Thèse J.Aubertin, 2009).

2.2 R ESULTATS

Construction du réseau d’interaction de FGFR3

Pour étudier le réseau d’interaction du récepteur FGFR3 deux approches pouvaient être
initialement envisagées: l’étude une à une des protéines de cette liste de 110 protéines, en
commençant par les protéines pouvant expliquer les propriétés oncogéniques du récepteur
ou la construction d’un réseau d’interaction de FGFR3 manuellement à partir de cette liste

140
en l’enrichissant grâce aux bases de données d’interactions protéiques. Dans le but
d’identifier l’interactome de FGFR3 nous nous sommes focalisés sur la seconde approche.
Notre approche manuelle initiale ne permettait pas d’étudier l’ensemble des 110 protéines,
les partenaires protéiques de FGFR3 ont donc été sélectionnés en fonction de leur
« score », c’est-à-dire le nombre de fois où l’on retrouve chaque protéine dans les
différentes expériences d’immunoprécipitation (11 au total). Nous avons considéré les
protéines qui ont un score supérieur ou égal à 4/11 permettant ainsi de sélectionner 26
protéines partenaires de FGFR3. Ces 26 partenaires protéiques avaient été
immunoprécipités aussi bien avec le récepteur muté qu’avec le récepteur sauvage, et donc
n’étaient pas spécifique de l’une des formes du récepteur. A partir de cette liste de 26
partenaires, grâce à des bases de données d’interactions protéiques et des données de la
littérature nous avons pu rajouter des protéines putatives et faire le lien entre les 26
protéines sélectionnées proposer un réseau impliquant FGFR3. Ce réseau comprend 13
des 26 protéines sélectionnées et 15 protéines putatives. Pour faire le lien entre deux
protéines partenaires de FGFR3, deux protéines putatives au maximum ont été rajoutées
afin de limiter le risque d’introduire de « fausses » interactions (figure 2). Au sein du réseau
ainsi obtenu se dégage plusieurs sous-réseaux qui correspondent de manière intéressante
à certaines voies de signalisation. C’est le cas notamment du sous-réseau
NCOR1/PPARγ/COX1/ACSL5 impliqué dans le métabolisme lipidique et l’inflammation (les
protéines identifiées au cours de l’expérience initiale d’immunoprecipitation sont
soulignées). Le sous-réseau USP7/GMPS/TP53/MDM2 est impliqué dans la réparation des
dommages à l’ADN et l’apoptose, et sur lequel nous reviendrons plus en détails par la suite.
Parmi les sous-réseaux d’intérêt on trouve le sous-réseau CDC37/HSP90AA1 pour lequel
il a récemment été montré qu’il était impliqué dans la stabilisation du récepteur FGFR3. En
effet, l’inhibition de CDC37 comme de HSP90AA1 conduit à une dégradation rapide du
récepteur (Laederich, Degnin, Lunstrum, Holden, & Horton, 2011). Le fait que nous
retrouvions via cette méthode des données déjà existantes valide notre approche.

141
 F IGURE 2: R ESEAU D ’ INTERACTION PROTEIQUE DU RECEPTEUR FGFR3 CONSTRUIT
MANUELLEMENT A PARTIR DE LA LISTE DES 110 PARTENAIRES PROTEIQUES IDENTIFIES
INITIALEMENT ET DES BASES DE DONNEES D ’ INTERACTIONS PROTEIQUES .

Les protéines en rouges sont celles identifiées par spectrométrie de masse et faisant partie
de la liste des 26 partenaires protéiques de FGFR3 sélectionnées, elles sont au nombre de
13 dans le réseau. Les protéines en bleu sont des protéines putatives qui font le lien entre
les différentes protéines partenaires de FGFR3. Les flèches indiquent les interactions
connues. La protéine p38 a été rajoutée au réseau car l’étude présentée précédemment
dans cette thèse a permis de l’identifier comme partenaire protéique de FGFR3. Il en va de
même pour l’ARNm de MYC pour lequel nous avons démontré qu’il est régulé par le
pathway FGFR3/P38/HuR.

Nécessité d’utiliser une méthode automatique pour construire le réseau de FGFR3

La construction d’un réseau d’interaction semble donc être une bonne approche pour
identifier le réseau d’interaction du récepteur FGFR3. En effet, l’approche manuelle
développée ici a conduit à l’identification d’un sous-réseau connu et de certains sous-
réseaux permettant de caractériser des voies de signalisation activées par le récepteur
FGFR3. Cependant cette approche est limitée. En effet, nous avons été obligé de
sélectionner 26 protéines parmi une liste de 110 partenaires protéiques passant donc à
coté de nombreuses interactions qui pourraient permettre d’identifier d’autres sous-réseaux
clés pour la compréhension des mécanismes pro-tumoraux régulés par FGFR3. De plus,
pour construire ce réseau, les protéines et leurs interactions sont étudiées une à une dans
les bases d’interactions protéiques (String, Embl) ce qui représente donc très rapidement

142
une limitation « humaine » à plusieurs niveaux (temps pour analyser ces interactions
connues, choix parfois orienté de certaines protéines putatives). La construction manuelle
de ce réseau ne peut donc pas être aussi exhaustive que si elle avait été réalisée de
manière automatique. C’est donc pour ces raisons que nous avons entrepris de construire
ce réseau via une méthode bio-informatique. Nous avons d’abord de nouveau analysé les
données obtenues par spectrométrie de masse via la base de données Uniprot dont les
identifiants correspondant à une protéine donnée sont ceux repris par les bases de données
d’interaction protéique, ce qui devait permettre par la suite de pouvoir aisément interroger
les bases de données d’interaction protéique sans que se pose le problème de non
reconnaissance du nom d’un gène dans ces bases. A partir de la nouvelle liste de
partenaires protéique de FGFR3 ainsi obtenue nous avons sélectionné les protéines pour
lesquelles on estime avec une grande confiance qu’elles sont des partenaires protéiques
de FGFR3. Ainsi, seul les protéines identifiées avec au moins 3 peptides par expérience et
aucun peptide dans l’expérience contrôle dans au moins 2 expériences
d’immunoprécipitation (IP-MS) ont été sélectionnées. Nous avons choisi la limite basse de
3 peptides pour sélectionner les protéines afin de s’assurer de « l’identité » des protéines
sélectionnées et le fait que 3 peptides soient retrouvés dans au moins 2 expériences permet
de s’assurer que les protéines sélectionnées comme partenaire de FGFR3 ne sont pas des
faux-positifs. Suite à l’application de ces filtres nous avons ainsi obtenu une liste finale de
60 partenaires protéiques de FGFR3. Les interactions protéiques entre les protéines de
cette liste ont été analysées par la suite dans la base de données d’interactions protéiques
HIPPIE. Cependant le nombre d’interactions directes retrouvé par cette analyse entre ces
60 protéines est faible (figure 3), seulement 20 interactions en ressortent, dont deux
interactions connues pour FGFR3, les interactions FGFR3-SLC25A6 et FGFR3-CDC37.
Cette liste des 60 protéines identifiées avec une grande confiance comme partenaire
protéique de FGFR3 n’étant pas suffisante pour construire le réseau d’interaction de
FGFR3, un algorithme a été développé pour résoudre ce problème en proposant comme
solution d’étendre le réseau en introduisant des protéines putatives.

143
F IGURE 3: I NTERACTIONS PREDITES PAR LA BASE D ’ INTERACTIONS PROTEIQUES HIPPIE ENTRE
FGFR3 ET LES 60 PROTEINES IDENTIFIEES COMME PARTENAIRES PROTEIQUES DE FGFR3 AVEC
UNE GRANDE CONFIANCE .

Cet algorithme est l’algorithme PEPPER, co-développé par un étudiant en bio-informatique

au laboratoire (Rémy Nicolle) (Winterhalter et al., 2014). PEPPER (Protein complex
Expansion using Protein-Protein IntERaction) est une application de Cytoscape créée pour
identifier des réseaux protéiques denses à partir d’expériences d’immunoprécipitation (liste
de partenaires protéiques identifiés par spectrométrie de masse) et des réseaux
d’interactions protéiques déjà connus (PPI network). C’est le seul algorithme disponible
actuellement qui permet d’intégrer des interactions déjà connues à des expériences de
spectrométrie de masse. Généralement les interactions protéiques sont étudiées soient à
partir de réseaux d’interactions déjà connus, soit à partir de très grands jeux de données
obtenus par IP-MS. PEPPER connecte des sous-réseaux entre eux grâce à une
optimisation prenant en compte deux paramètres qui chacun pris séparément conduisent
à deux solutions optimales différentes (optimisation multi-objective) :

 La couverture : la solution finale doit contenir le maximum de protéines possibles

identifiées par spectrométrie masse.
 La densité : Les protéines doivent être le plus connecté possible dans une solution
en se basant sur les interactions connus dans un protéome large.

Le fonctionnement du module d’extension PEPPER est présenté ci-après (figure 4) :

144
 F IGURE 4 : R EPRESENTATION DU MODULE D ’ EXTENSION ( PLUG - IN ) PEPPER (Winterhalter et
al., 2014).

(A) Données issues des expériences de spectrométrie de masse et des interactions

protéiques humaines connues (PPI network). (B) Analyse de l’ensemble de ces données
dans l’algorithme PEPPER. Optimisation multiobjectif via les fonctions de couverture et de
densité. Construction de la solution finale (réseau) se faisant grâce à la connexion sous-
réseaux identifiées à partir des données des expériences de spectrométrie de masse et
d’interactions protéiques déjà identifiées dans un protéome large. (C) Solution finale :
réseau d’interaction obtenu après analyse des données par PEPPER. La protéine
représentée ici en violet (WDR92) est celle dont on veut déterminer le réseau d’interaction,
les protéines représentées en vert sont celles identifiées comme partenaires protéique de
la protéine violette par MS/MS. Les protéines représentées en rouge et orange sont celles
rajoutées par PEPPER. Les deux protéines en rouge sont les protéines prédites avec une
haute pertinence comme faisant partie du réseau de WDR92.

C’est donc à partir de cette méthode (figure 4) que le réseau de signalisation de FGFR3 a
été construit. De manière intéressante, parmi les nouvelles protéines ajoutées au réseau
de FGFR3 par PEPPER on retrouve des protéines identifiées dans les différentes
expériences de spectrométrie de masse comme des faux négatifs, éliminés suite à
l’application des filtres (protéines identifiées avec moins de 3 peptides par expérience, ou
1 peptide dans l’expérience contrôle). Ainsi le réseau obtenu grâce à l’algorithme PEPPER
comprend 136 protéines dont 57 des 60 protéines « grande confiance », reliées entre elles
par 1738 interactions (figure 5). De manière intéressante, 38 des 79 protéines putatives
rajoutées par PEPPER sont des protéines identifiées par spectrométrie de masse comme
partenaires protéique de FGFR3, dans les expériences d’immunoprécipitations. Les
données de Gene Ontology (qui permettent de regrouper les protéines par rapport à une
fonction cellulaire donnée) et des données du projet Achille (projet visant à par un screen
ShRNA à identifier les protéines codées par des gènes identifiés comme essentiels pour la
viabilité cellulaire, RT112 faisant partie des lignées cellulaires utilisées pour ce projet) ont
permis de montrer la pertinence de ce réseau.

145
 MAPK et RTK

Transport cellulaire

Autres fonctions
Cytosquelette

Processus post-transcriptionnels

Remodelage de la chromatine Facteurs de transcription

F IGURE 5 : R ESEAU DE S IGNALISATION DE FGFR3 ( OBTENU AVEC PEPPER)

Réseau d’interaction protéique prédit des voies de signalisation du récepteur FGFR3. Les
protéines ont été regroupées par fonction cellulaire. Les nœuds ont été établis en fonction
de leur identification par spectrométrie de masse et colorés en fonction de leur impact sur
la survie cellulaire (données du projet AChille du Broad Institute, ShRNA dans la lignée
cellulaire RT112), en utilisant un gradient allant du rouge au bleu. Rouge: protéines
identifies avec une haute confiance comme ayant un impact sur la survie cellulaire; Bleu :
basse confiance ; Gris : pas de données. Les protéines représentées sous forme de
carrées ont été identifiés avec une haute confiance comme partenaires protéiques de
FGFR3, avec au moins 3 peptides uniques retrouvés dans au moins deux expériences et
aucun dans les expériences contrôles. Les hexagones sont les protéines identifiées avec
moins de 3 peptides par expérience et aucun peptide dans les expériences contrôle. Quant
aux octogones, ils diffèrent des hexagones de par le fait que des peptides ont été retrouvés
dans les expériences contrôles. Finalement les protéines rondes sont celles pour
lesquelles aucun peptide n’a été retrouvé dans les expériences après immunoprecipitation
de FGFR3 et analyse par MS/MS.

146
Etude du sous-réseau FGFR3/USP7/TP53

La construction du réseau de signalisation de FGFR3 via l’algorithme PEPPER permet de

visualiser un nombre important de voies de signalisation potentiellement régulées par le
récepteur FGFR3 altéré. De manière intéressante l’activation de certaines de ces voies
aboutit au recrutement de facteurs de transcription, dont le facteur MYC, rejoignant ainsi
les résultats obtenus lors de la première étude réalisée au cours de cette thèse. Parmi ces
facteurs de transcription on trouve de manière surprenante la protéine TP53, qui dans ce
réseau interagit avec la protéine USP7. Nous nous sommes donc focalisés sur l’étude du
sous-réseau FGFR3/USP7/TP53 afin d’examiner si cette participation putative de TP53
dans le réseau d’interaction de FGFR3 était compatible avec les données de la littérature
et avec nos propres données.

La protéine USP7, aussi appelée HAUSP, est une déubiquitinylase impliquée dans la
stabilisation de TP53 et de MDM2 (C. Brooks, Li, Hu, Shi, & Gu, 2013). USP7 est activée
par la protéine GMPS (Faesen et al., 2011), qui n’apparaît pas dans le réseau de
signalisation de FGFR3 mais que nous avons initialement identifiée comme partenaire
protéique de FGFR3 par spectrométrie de masse dans les expériences
d’immunoprécipitations. La protéine MDM2 peut ubiquitinyler TP53 pour induire la
dégradation protéasomale de cette dernière (Fang, Jensen, Ludwig, Vousden, &
Weissman, 2000). MDM2 est de plus capable de s’auto-ubiquitinyler pour être envoyé vers
le protéasome, USP7 peut inhiber cette ubiquitinylation conduisant à la stabilisation de
MDM2 et indirectement la dégradation protéasomale de TP53 (Cummins & Vogelstein,
2004). USP7 peut dé-ubiquitinyler TP53 lorsque la protéine est présente dans le
cytoplasme sous forme mono-ubiquitinylée afin d’induire son import nucléaire où elle sera
dégradée par le protéasome via la protéine MDM2 (Dai & Gu, 2010). Plusieurs études ont
effectivement montré que la déplétion ou l’inhibition d’USP7 conduisait à la stabilisation de
TP53. Dans ce cas USP7 agit donc comme un oncogène en déstabilisant TP53. Cependant
il a été montré qu’USP7 peut induire la stabilisation de TP53 même lorsque MDM2 est
présent en forte concentration en déubiquitinylant TP53 conduisant ainsi à un arrêt de
croissance cellulaire. Dans ce cas USP7 joue le rôle de suppresseur de tumeur (M. Li et
al., 2002). Il est donc difficile à partir de ces résultats opposés d’émettre une hypothèse
quant au rôle de suppresseur de tumeur ou d’oncogène que pourrait jouer UPS7 dans le
contexte des voies de signalisation activées par FGFR3.

Afin de mieux connaître l’implication possible de ce sous-réseau d’interactions nous avons

dans un premier temps étudié par immunoprécipitation les interactions entre FGFR3 et les
protéines TP53, USP7 et GMPS. Ces immunoprécipitations ont été réalisées dans les

147
lignées cellulaires MGH-U3 (FGFR3 Y375C) et RT112 (FGFR3-TACC3) qui expriment le
récepteur FGFR3 altéré de manière endogène. L’interaction de FGFR3 avec les protéines
TP53, USP7 et GMPS après immunoprécipitation de FGFR3 a été révélée par western blot.
Les interactions entre FGFR3 avec USP7 et FGFR3 et GMPS ont ainsi été validées dans
les lignées cellulaires MGH-U3 et RT112. Cependant FGFR3 n’interagit pas avec TP53. Le
gène TP53 n’est pas muté dans les lignées MGH-U3 et RT112 et il est clairement exprimé
(figure 6). On ne sait cependant pas si P53 est sous forme active ou inactive et si FGFR3
régule son activité.

F IGURE 6 : V ALIDATION DU SOUS - RESEAU DE P53 DANS LES LIGNEES CELLULAIRES MGH-U3
ET RT112

Le récepteur FGFR3 muté et le récepteur FGFR3-TACC3 interagissent spécifiquement

avec les protéines UPS7 et GMPS mais pas avec la protéine TP53. Da manière surprenante
la protéine TP53 est bien présente dans les deux lignées cellulaires, mais il n’est pas
possible de dire si ça présence est totale ou partielle (due à une dégradation).

L’analyse de l’impact de la déplétion de FGFR3 (SiRNA), dans la lignée MGH-U3, sur le

transcriptome (obtenu en utilisant les puces à ADN U133 plus) a été réalisée avec le logiciel
DAVID dans le but d’identifier les voies de signalisation régulées par le récepteur FGFR3.
Cette analyse montre que le pathway de TP53 ressort comme étant activé après la
déplétion de FGFR3, suggérant que l’activation du récepteur FGFR3 altéré conduit à
l’inhibition du pathway de TP53. Les voies de signalisation régulées par TP53 qui sont

148
modulées suite à la déplétion de FGFR3 sont notamment : le cycle cellulaire, l’apoptose et
la réparation des dommages à l’ADN (figure 7).

F IGURE 7 : I MPACT DE LA DEPLETION DE FGFR3 SUR LE PATHWAY DE P 53 DANS LA LIGNEE

CELLULAIRE MGH-U3 ET ANALYSE DANS DAVID.

La déplétion par SiRNA de FGFR3 et l’analyse des conséquences sur les voies de
signalisation en utilisant le logiciel DAVID montrent que le pathway de P53 est dans ce cas
activé, on observe notamment une régulation négative des cyclines CDK4, CDK2 et de la
cycline E via p21, mais aussi de CDC2 et de la cycline B due à une augmentation de
l’expression de GADD45. Cette régulation positive de GADD45 est aussi impliquée dans la
réparation des dommages à l’ADN. On observe de plus une régulation positive d’IGFBP3
impliqué dans l’activation de l’apoptose et de l’inhibition du pathway IGF1/mTOR et du gène
TSF1 impliqué dans l’inhibition de l’angiogenèse et de la formation de métastases. Ces
observations semblent montrer que FGFR3 régule négativement l’activation de ces voies
anti-tumorales.

Nous avons donc voulu savoir par la suite s’il existait un lien entre TP53 et le récepteur
FGFR3 muté dans les tumeurs de vessie. Nous disposions pour cela d’une analyse

149
transcriptomique des échantillons de tumeurs de vessie réalisée au laboratoire. Il en ressort
que le gène TP53 est plus fortement exprimé dans les échantillons FGFR3 mutés, aux
tumeurs non mutées FGFR3 (figure 8).

500
p < 0 .0 0 0 1

400
e x p r e s s io n P 5 3

300

200

100

0
m u té n o n m u té

F IGURE 8 : EXPRESSION DE TP53 EN FONCTION DU STATUT MUTATIONNEL DE FGFR3 DANS LES

ECHANTILLONS DE TUMEURS DE VESSIE ( PUCE EXON )

2.3 D ISCUSSION

Le but de cette étude était de construire l’interactome de FGFR3. Pour cela nous avons tiré
parti d’une étude précédemment réalisée au laboratoire qui avait permis d’identifier les
partenaires protéiques du récepteur FGFR3 sauvage et FGFR3 muté (S249C et Y375C)
dans un modèle cellulaire de tumeur de vessie, la lignée RT112. Après analyse des
données de spectrométrie de masse, une première liste de 110 partenaires protéiques avait
été obtenue. Etonnement, cette liste était commune au récepteur sauvage et au récepteur
muté (quel que soit la mutation : Y375C ou S249C). Nous pensions donc que nous n’avions
pas réussi à mettre en évidence de différence entre les voies de signalisation du récepteur
muté et celles du récepteur sauvage. Par la suite la mise en évidence de la présence du
récepteur FGFR3-TACC3 dans la lignée cellulaire RT112 a permis d’apporter un élément
de réponse à cette observation. Nous avons en effet montré dans la première étude réalisée
au cours de cette thèse que les récepteurs sauvage et FGFR3-TACC3 interagissent. Il est
donc probable que le récepteur sauvage portant un flag-tag interagisse avec le récepteur
FGFR3-TACC3, et que les protéines co-immunoprécipitées avec le récepteur FGFR3
sauvage flag-tagué soient en réalité celles recrutées par le complexe FGFR3-

150
TACC3/FGFR3 sauvage flag-tag. Ceci expliquerait que la liste des 110 partenaires
protéiques soit strictement la même entre le récepteur sauvage et le récepteur muté. Il sera
donc nécessaire de refaire ces expériences de spectrométrie de masse dans une lignée
cellulaire n’exprimant pas le récepteur FGFR3 altéré.

Nous avons cependant pu tirer parti de cette liste de 110 partenaires protéiques en
construisant manuellement un premier réseau d’interaction protéique dans le but de mieux
caractériser les voies de signalisation activées par le récepteur. Nous avons ainsi pu
identifier des sous-réseaux dont le réseau CDC37/HSP90AA1 validé par une autre étude,
indiquant que la stratégie mise en place semblait pouvoir répondre à l’objectif fixé.
Cependant la méthode visant à construire un réseau de manière manuel étant limitée pour
les raisons décrites précédemment nous avons décidé de construire ce réseau de manière
automatique. Dans un premier temps nous avons ré-analysé la liste des protéines
identifiées par spectrométrie de masse via Uniprot. Par la suite l’application de filtres (au
moins 3 peptides dans 2 expériences d’immunoprécipitations et aucun dans le contrôle) a
permis de sélectionner 60 protéines que nous considérons comme identifiées en tant que
partenaire protéique de FGFR3 avec une grande confiance. Afin de construire le réseau de
FGFR3 à partir de cette liste de 60 protéines, celle-ci a été analysée dans la base
d’interactions protéiques HIPPIE. Cependant seulement 20 interactions en sont ressorties
montrant que cette liste n’était pas suffisante pour construire le réseau de signalisation de
FGFR3. C’est pourquoi cette liste a été étendue grâce à l’algorithme PEPPER, développé
spécifiquement pour répondre à ce problème. Le réseau obtenu nous a permis d’identifier
des sous-réseaux d’interactions activées par le récepteur FGFR3. De manière intéressante
certains de ces sous-réseaux d’interactions aboutissent à des processus post-
transcriptionnels, des processus de remodelage de la chromatine et au recrutement de
certains facteurs de transcription. Parmi ces facteurs de transcription se trouve la protéine
TP53, qui interagit avec la protéine USP7 au sein du réseau de FGFR3. Nous avons voulu
comprendre quel était le lien entre FGFR3 et TP53, c’est pourquoi nous nous sommes
focalisés sur l’étude du sous-réseau TP53/USP7, la protéine USP7 étant impliquée dans la
régulation de la stabilisation de TP53. Nous avons pu montrer dans les lignées cellulaires
MGH-U3 et RT112 que le récepteur FGFR3 interagissait avec USP7 et avec la protéine
GMPS (initialement identifiée dans la liste des 110 partenaires protéiques de FGFR3). De
plus nous avons tiré parti des données obtenus suite à la déplétion de FGFR3 par SiRNA
dans la lignée cellulaire MGH-U3. L’analyse de l’impact de la déplétion de FGFR3 sur
l’activation ou l’inhibition des voies de signalisation montre que le pathway de TP53 ressort
significativement dérégulé. Par la suite l’étude de l’expression de TP53 en fonction du statut
mutationnel de FGFR3 dans les tumeurs de vessie a montré que les tumeurs FGFR3

151
mutées surexpriment TP53. Il est important de préciser ici que dans la plupart des
échantillons arborant une mutation de FGFR3, le gène TP53 n’est pas muté. De plus
d’après la classification des tumeurs de vessie établie par Choi et al (2014), qui classe les
tumeurs de vessie en tumeurs luminales, tumeurs basales et tumeurs P53-like (activation
de TP53 dans ce sous-groupe), les tumeurs FGFR3 muté se classent parmi les tumeurs
luminales et non pas parmi les tumeurs P53-like confortant l’analyse des résultats observés
dans cette étude qui montre que FGFR3 induit l’inhibition du pathway de P53.
Généralement, les altérations du gène TP53 (mutations) conduisant à l’inactivation des
voies de signalisation qu’elle régule sont associées à la voie des carcinomes in situ (CIS)
et des tumeurs agressives envahissant le muscle. Or il semblerait qu’un autre mécanisme,
différent de celui retrouvé dans les tumeurs de type CIS, existe dans les tumeurs papillaires
de vessie exprimant le récepteur FGFR3 muté. Cependant il existe une explication pour
cette forte expression : FGFR3 est retrouvé muté beaucoup plus fréquemment dans les
tumeurs papillaires de bas stade que dans les tumeurs envahissant le muscle. Or les
tumeurs envahissant le muscle présentent fréquemment une perte d’hétérozygotie de
TP53. Cette perte d’une copie de gène pourrait aussi expliquer cette différence
d’expression de TP53 entre les tumeurs mutées et non mutées.

2.4 M ETHODES

Co-Immunoprecipitation de FGFR3 et de ces partenaires protéiques :

L’isoforme FGFR3b a été taguée avec l’épitope suivant : DYKDDDDK (FLAGTM)-

séquence. Le FLAG-FGFR3 a été inséré dans un vecteur pIRES puro 3 sous le contrôle
d’un promoteur CMV. Les formes FGFR3 mutées S249C et Y375C ont été obtenues par
mutagénèse dirigée. Les immunoprécipitations ont été réalisées avec un anticorps anti-flag
couplé à des billes d’agaroses. L’élution a été réalisée à l’aide de peptides FLAG. La
migration a été réalisée sur gel d’acrylamide. A chaque peptide présent sur le gel, la bande
d’intérêt a été découpée puis digérée, les peptides extraits et analysés par LC-MS/MS.
L’analyse des spectres des peptides analysés par MS/MS a été réalisée en utilisant le
système MASCOT (Matrix Science) et alignés sur la database Uniprot. Au total 2014
protéines ont été identifiées parmi lesquelles 921 protéines “contaminantes”, soit 1093
protéines au final. Une première liste de 110 partenaires protéiques de FGFR3 a été établie
par J.Aubertin (thèse 2009). Par la suite seules les protéines identifiées avec au moins 3
peptides uniques dans au moins deux expériences et aucun peptide dans les expériences
contrôles ont été sélectionnées. Il en a résulté une liste de 60 partenaires protéiques de
FGFR3. Cette seconde liste a été établie par R.Nicolle (thèse 2015).

152
Immunoprécipitations et western blot :

Le protocole utilisé est le même que celui décrit au paragraphe 4.2. Les anticorps utilisés
pour réalisés l’immunoprecipitation sont les anticorps anti FGFR3 (Sigma Aldrich) dans la
lignée MGH-U3 et anti-FGFR3 total (Abcam) dans la lignée RT112. Les anticorps utilisés
pour le western blot sont : anticorps anti-FGFR3 (Abcam), anticorps anti-TP53 D0-1
(ab80645), anticorps anti-UPS7 (ab109109), anticorps anti GMPS (Abcam).

Déplétion de FGFR3 par SiRNA et analyse sur puce :

FGFR3 a été déplété par SiRNA dans la lignée cellulaire MGH-U3. Le résultat a été a été
analysé sur puce affymetrix, et analysé dans DAVID.

Logiciel PEPPER

Ce logiciel est décrit dans Winterhalter et al., 2014

153
CONCLUSION ET
PERSPECTIVES

154
Les deux études menées au cours de cette thèse, avaient pour objectif de caractériser les
voies de signalisation du récepteur FGFR3 selon deux approches : la première visait à
identifier les voies de signalisation activées par le récepteur FGFR3, la seconde à définir le
réseau d’interaction de FGFR3.

La première approche basée une étude ciblée de cascades de phosphorylation activées

par le récepteur FGFR3 altéré a permis de caractériser une partie des voies de signalisation
du récepteur FGFR3 altéré et de mieux comprendre pourquoi celui-ci possède des
propriétés oncogéniques. Nous avons tiré parti dans un premier temps d’une étude réalisée
dans la lignée cellulaire fibroblastique NIH3T3 dont le but était d’identifier les voies de
signalisation (étude de la phosphorylation de ERK1/2, p38, AKT) spécifiquement activées
par le récepteur FGFR3 muté (S249C) en comparaison au récepteur sauvage, suite à
stimulation ou non avec le ligand FGF1. Les résultats obtenus montraient que les voies p38
et AKT étaient spécifiquement activées par le récepteur FGFR3 muté, et que l’inhibition de
ces protéines conduisait à une inhibition de la capacité des cellules NIH3T3 exprimant le
récepteur FGFR3 muté à former de nouveaux clones en agar mou. Nous nous sommes
donc focalisés sur l’activation des protéines p38 et AKT dans des lignées cellulaires
dérivées de tumeurs de vessie (cellules épithéliales) exprimant le récepteur FGFR3 muté
ou le récepteur transloqué FGFR3-TACC3. Cette étude a montré que l’activation de ces
deux voies de signalisation était critique pour la prolifération cellulaire, et qu’elles étaient
impliquées dans le maintien d’une boucle de rétrocontrôle entre FGFR3 et MYC (l’activation
permanente de FGFR3 conduit à la surexpression de MYC qui en retour promeut la
stabilisation de FGFR3). La mise en évidence de cette boucle FGFR3/MYC a permis de
mieux comprendre les propriétés oncogéniques du récepteur FGFR3, grâce à la
caractérisation d’une partie des voies de signalisation activées par le récepteur FGFR3
altéré. Par la suite, l’étude de la phosphorylation de p38 et AKT en fonction du statut
mutationnel de FGFR3 dans les tumeurs n’ayant pas envahi le muscle (NMIBC) et les
tumeurs ayant envahi le muscle (MIBC) FGFR3 muté ou non a montré que la
phosphorylation de p38 était plus importante dans les tumeurs FGFR3 mutées, tandis que
la phosphorylation d’AKT était la même dans les tumeurs NMIBC et MIBC et n’était pas liée
au statut mutationnel de FGFR3. L’ensemble de ces observations nous a permis de
proposer les protéines p38 et AKT comme de potentielles cibles thérapeutiques pour traiter
les tumeurs de vessie exprimant le récepteur FGFR3 altéré (muté ou FGFR3-TACC3).
Actuellement des inhibiteurs de p38 sont en phase III d’essai clinique. Environ 40% des
tumeurs de vessie arborent une activation de la voie PI3K/AKT/mTOR. A l’heure actuelle le
traitement pour inhiber la voie PI3K/AKT/mTOR est envisagé chez les patients présentant
une altération des protéines de la voie PI3K/AKT, ou des gènes TSC1 et TSC2. Dans le

155
cas des patients présentant une altération du gène TSC1, un traitement chimio-
thérapeutique à base d’everolimus (inhibiteur de mTOR) permet d’allonger
significativement l’espérance de vie de ces patients, montrant que la caractérisation des
altérations moléculaires est importante pour proposer le traitement le plus adapté (Houédé
& Pourquier, 2015). Nous avons montré dans notre étude que FGFR3 active la voie
PI3K/AKT dans le but de protéger MYC d’une dégradation par le protéasome. Les patients
dont la tumeur présente une altération du gène FGFR3 (mutation ou FGFR3-TACC3)
pourraient donc être traités avec des inhibiteurs de la PI3Kinase ou des inhibiteurs d’AKT.
Cependant il serait intéressant d’étudier l’effet de l’inhibition de FGFR3 sur la
phosphorylation des protéines mTORC1 et mTORC2, afin de savoir si un traitement à
l’everolimus peut aussi être envisagé pour traiter les patients qui ont une tumeur de vessie
présentant une altération du gène FGFR3.

Il serait cependant intéressant de tenter de généraliser nos résultats dans d’autres modèles,
notamment un modèle exprimant la protéine FGFR3-BAIP2L1 et un modèle exprimant le
gène RAS muté. La protéine de fusion FGFR3-BAIAP2L1 avait été identifiée initialement
avec une fréquence beaucoup moins importante que la protéine FGFR3-TACC3 (FGFR3-
BAIAP2L1 avait été retrouvée seulement dans une lignée cellulaire dérivée d’une tumeur
de vessie, la lignée SW780). Cependant cette protéine de fusion a été observée récemment
dans des tumeurs de vessie et des tumeurs du poumon (Nakanishi et al., 2015). Il serait
donc intéressant de voir si cette boucle de rétrocontrôle FGFR3/MYC est aussi retrouvée
dans ce cas. Cette étude pourra être réalisée dans la lignée cellulaire SW780 qui exprime
cette protéine de fusion de manière endogène. Les mutations de FGFR3 et de RAS sont
exclusives dans les tumeurs de vessie, l’hypothèse fréquemment avancée pour expliquer
cette observation est que la protéine RAS fait partie des voies de signalisation de FGFR3.
Il serait donc intéressant de refaire cette même étude dans la lignée cellulaire T24, qui
exprime le gène RAS muté. Nous avons déjà montré dans cette lignée cellulaire que la
protéine p38 est activée et que l’inhibition de RAS conduit à l’inhibition de l’activation de
p38. Il est donc tentant de penser que dans ce modèle cellulaire le mécanisme est
semblable à celui identifié dans les lignées cellulaires exprimant le récepteur FGFR3 altéré.
Pour vérifier cette hypothèse l’étude de l’activation d’AKT dans ce modèle cellulaire avant
et après inhibition de RAS, serait envisagée dans un premier temps, afin de voir si AKT fait
aussi parti des voies de signalisation activées par RAS muté. Par la suite l’étude de l’impact
de l’inhibition de RAS sur la protéine MYC pourra être réalisée, afin de voir si l’activation de
RAS muté est responsable d’une stabilisation de MYC. En fonction des résultats observés,
il serait alors possible d’expliquer la cause des mutations exclusives de RAS et de FGFR3
dans les tumeurs de vessie. Enfin, il pourrait être intéressant d’étudier ce mécanisme dans

156
d’autres cancers, notamment le glioblastome et le cancer du poumon, dans lesquels la
protéine de fusion FGFR3-TACC3 a aussi était observée. Il serait en effet surprenant que
la boucle de rétrocontrôle identifiée dans les tumeurs de vessie soit aussi retrouvée dans
d’autres types de cancers exprimant le récepteur FGFR3-TACC3. Cette étude pourrait être
réalisée dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs du poumon et du glioblastome
exprimant le récepteur FGFR3-TACC3. Si cette boucle de rétrocontrôle existe aussi dans
ces types de cancer et si les voies permettant de la maintenir sont les mêmes que celles
identifiées dans le cancer de la vessie, les protéines p38 et AKT pourrait alors être
envisagées comme cibles thérapeutiques dans les différents cancers exprimant le
récepteur FGFR3-TACC3.

La seconde approche mise en place avait pour but de définir l’interactome de FGFR3. Nous
avons tiré parti d’une étude réalisée au laboratoire dont l’objectif était d’identifier les
partenaires protéiques du récepteur FGFR3 muté ou sauvage par spectrométrie de masse.
Une liste de 110 partenaires protéiques de FGFR3 avait ainsi était obtenue à partir de 8
expériences d’immunoprécipitations pour le récepteur muté (4 expériences pour FGFR3
S249C/ 4 expériences pour FGFR3 Y375C) et 3 expériences d’immunoprécipitations pour
le récepteur FGFR3 sauvage. A partir de cette liste et des bases d’interactions protéiques
nous avons construit le réseau d’interaction de FGFR3 de manière manuelle. Cependant
cette méthode présentait de nombreuses limitations et ne permettait pas de construire le
réseau de FGFR3 de manière aussi exhaustive que s’il avait été construit de manière
automatique. Dans un premier temps les données de spectrométrie de masse ont de
nouveaux été analysées via la base Uniprot. Nous avons par la suite sélectionnés les
protéines identifiées avec au moins 3 peptides par expérience et aucun peptide dans
l’expérience contrôle, et ce, dans au moins deux expériences. Une liste de 60 protéines a
ainsi été obtenue, et analysée dans la base d’interaction protéique HIPPIE. Cependant les
60 protéines étaient très peu connectées entre elles c’est pourquoi afin d’étendre le réseau,
l’algorithme PEPPER a été développé. Le réseau d’interaction de FGFR3 a ainsi été
obtenu. Un réseau ainsi construit permet de voir que FGFR3 recrute des protéines
impliquées dans les voies MAPKinase, ce qui a permis de faire le lien avec la première
étude afin d’identifier les protéines impliquées dans l’activation de P38α, mais aussi certains
facteurs post-transcriptionels dont la protéine HNRNPU, décrite pour être impliquée dans
la stabilisation de l’ARNm de MYC (Weidensdorfer, Stöhr, Baude, Lederer, Kohn, et al.,
2009). Nous avons montré que la déplétion de HNRNPU par SiRNA conduit à une
diminution de la quantité d’ARNm de MYC dans la lignée RT112, apportant ainsi des
éléments de réponse permettant de consolider le mécanisme proposé pour la régulation de
l’ARNm de MYC par FGFR3 et P38 dans la première étude. Il sera donc intéressant par la

157
suite d’étudier l’impact sur l’ARNm de MYC d’une déplétion simultanée de HuR et
HNRNPU. Les allers-retours qui ont ainsi pu être effectués entre la première et la deuxième
étude, ont montrés qu’il est nécessaire pour identifier de manière plus complète les voies
de signalisation du récepteur FGFR3, d’étudier en parallèle les voies de signalisation
activées par le récepteur et d’identifier son réseau d’interaction (interactome).

La construction du réseau de FGFR3 a permis de mettre en évidence de nombreuses

interactions qui pourraient expliquer les propriétés oncogéniques du récepteur. Il serait
donc intéressant dans un premier temps de valider ces interactions puis de tester leur
importance fonctionnelle. Nous avons commencé au cours de cette thèse à étudier le sous-
réseau P53/USP7, et avons validé l’interaction entre la protéine USP7 et FGFR3 et montré
que TP53 et FGFR3 n’interagissent pas ensemble. Cependant la protéine TP53 n’est pas
dégradée dans les lignées cellulaires RT112 et MGH-U3. Nous formulons ici l’hypothèse
selon laquelle la protéine TP53 est présente sous forme mono-ubiquitinilée ou multi-
ubiquitinilée, ce qui lui permet d’être dans un état stable et de ne pas être dégradée par le
protéasome (c’est le cas lorsque TP53 est poly-ubiquitinilée). Une étude réalisée en
parallèle au laboratoire a permis de montrer que la déplétion de FGFR3 dans la lignée
cellulaire MGH-U3 avait un impact positif sur l’activation de certaines cibles de TP53. Les
différentes études visant à caractériser le rôle de la protéine USP7 ont montré que celle-ci
pouvait avoir un rôle d’oncogène ou de suppresseur de tumeur. Dans le cas présent il n’est
pas possible pour l’instant de savoir quel rôle joue USP7 (oncogène ou suppresseur de
tumeur). Le récepteur FGFR3 interagit-il avec la protéine USP7 pour l’activer ou au
contraire la séquestrer. Afin d’étudier le rôle de la protéine USP7 au sein du réseau de
FGFR3, il serait intéressant dans un premier temps d’étudier la localisation cellulaire de
USP7 et de TP53 et le taux d’ubiquitinilation de TP53 dans les lignées cellulaires RT112
ou MGH-U3 traitées ou non avec l’inhibiteur de FGFR3 ou de USP7.

Nous avons construit le réseau de FGFR3 à partir d’une liste de protéines identifiées
comme partenaires protéiques de FGFR3 dans un système artificiel, construit dans de la
lignée cellulaire RT112, exprimant le récepteur sauvage ou le récepteur muté (S249C ou
Y375C) portant un flag tag. Au moment où ces expériences ont été réalisées, le récepteur
FGFR3-TACC3 n’avait pas encore été identifié, et nous pensions que la lignée cellulaire
RT112 exprimait uniquement le récepteur FGFR3 sauvage. Les expériences de
spectrométrie de masse réalisées à partir de ce système artificiel montraient de plus que
les partenaires protéiques du récepteur FGFR3 muté (S249C/Y375C) tagué étaient
identiques à ceux du récepteur FGFR3 sauvage tagué. Or il a été montré récemment que
lignée cellulaire RT112 exprime à la fois le récepteur sauvage et le récepteur FGFR3-
TACC3, et nous avons de plus montré que les deux formes du récepteur interagissent

158
ensemble, et que dans ce contexte le récepteur sauvage possède des propriétés
oncogéniques. Le réseau de signalisation de FGFR3 obtenu au cours de cette thèse dans
la lignée cellulaire RT112 correspond donc au réseau d’interaction du récepteur sauvage
et du récepteur FGFR3-TACC3 et non pas du récepteur FGFR3 sauvage seul, ce qui peut
expliquer que les partenaires protéiques du récepteur FGFR3 sauvage et du récepteur
muté soient les mêmes, et que cette étude n’ait pas permis de mettre en évidence les
différences entre le récepteur altéré ou le récepteur sauvage, contrairement à ce qui était
attendu.

Il serait intéressant par la suite d’identifier le phospho-protéome et l’interactome de chaque

forme altérée du récepteur FGFR3 (S249C, Y375C, FGFR3-TACC3, FGFR3-BAIAP2L1) et
du récepteur FGFR3 sauvage, dans le but de définir à la fois les cascades de
phosphorylations activées par FGFR3 et les partenaires d’interactions recrutés par le
récepteur FGFR3. En effet l’identification de l’interactome de FGFR3 bien qu’apportant de
nombreuses informations ne permet pas de définir les voies de signalisation activées par
le récepteur, d’où l’intérêt de réaliser une étude phospho-protéomique. Le phospho-
protéome et le protéome en présence de chaque récepteur FGFR3 (sauvage, muté ou
protéine de fusion) pourra être déterminé via la technique SILAC (Stable Isotypic Labelling
by Amino acids in Cell culture) qui présente l’avantage d’être quantitative et dont l’analyse
permettra dans un premier temps de voir s’il existe des différences notables entre les
différents protéomes des différentes formes altéré du récepteur FGFR3. De plus cette
technique pourra être utilisée afin de caractériser les différences entre les voies de
signalisation activées par le récepteur FGFR3 sauvage et le récepteurs FGFR3 altéré
(FGFR3 muté ou FGFR3-TACC3), suite à une stimulation ou non des cellules exprimant le
récepteur sauvage ou le récepteur altéré avec le ligand FGF1, permettant ainsi de mettre
en évidence les réelles différences existantes entre les voies de signalisation activées par
le récepteur sauvage et celles activées par le récepteur FGFR3 altéré. Cette technique
pourra aussi être utilisée pour caractériser la réponse à un traitement anti-FGFR3
(traitement au PD173074) afin d’identifier les voies de signalisation affectées par ce
traitement.

Cependant le choix de la lignée cellulaire dans laquelle ces expériences pourront être
réalisées pose problème. Il aurait pu être envisagé de réaliser ces expériences dans des
systèmes cellulaires exprimant chacun une altération de FGFR3 de manière endogène
(MGH-U3 : Y375C ; UMUC14 : S249C ; RT112 : FGFR3-TACC3 ; SW780 : FGFR3-
BAIP2L1) mais les différences de fond génétique entre les différentes lignées cellulaires
aurait posé problème pour comparer les résultats par la suite. La surexpression de chaque
forme du récepteur dans la lignée cellulaire RT112 ne peut pas être envisagée puisque le

159
récepteur sauvage et le récepteur FGFR3-TACC3 sont exprimés conjointement. La lignée
TERT-NHUC qui est une lignée de cellules de vessies normales immortalisées aurait pu
parfaitement convenir mais il a clairement été montré que l’expression du récepteur FGFR3
muté (S249C ou Y375C) dans cette lignée cellulaire ne conduit pas à l’activation des
protéines AKT et SRC, alors que nous avons montré au cours de cette thèse dans des
lignées cellulaires exprimant le récepteur FGFR3 altéré de manière endogène qu’AKT est
activée. Une autre solution peut cependant être envisagée mais elle impose de travailler
dans un modèle cellulaire fibroblastique et non épithélial, le modèle NIH3T3.

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