Leçon 1.

LES TECHNIQUES D'ETUDE DE LA CELLULE VIVANTE

I. LES TECHNIQUES DE PRELEVEMENT DE CELLULES

Activité 1.
Dans le milieu médical, les prélèvements sont effectués en clinique, à l'hôpital ou dans des cabinets privés
de médecin spécialiste. Ils sont réalisés par des chirurgiens. On distingue plusieurs techniques de
prélèvement de cellules (matériel biologique) parmi lesquelles : le recueil d’un liquide pour faire un
frottis, le grattage, coupure d’un fragment et la biopsie.
Tâches :
Définir puis décrire ces techniques de prélèvement de cellules à partir de ressources documentaires ou
internet.

II. LA COLORATION DES PRELEVEMENTS

Activité 2.
Les objets biologiques coupés et examinés par transparence offrent très peu de contraste, donc de
visibilité, et aucun détail ne peut être perçu. Il faut renforcer le contraste de couleur des différents organites
cellulaires. Différentes techniques sont utilisées : Coloration de Feulgen, Coloration de Brachet et
différents types de colorants : vital, fixateur ou létal
La réaction de Feulgen et celle de Brachet spécifiques de la localisation d'ADN. Le prétraitement par la
désoxyribonucléase (ADNase) et la ribonucléase (ARNase) permet de distinguer les sites d'ADN et d'ARN
par élimination sélective de l'un des acides nucléiques.

Observation au
microscope :
cellules des
racines à noyau
violet

Expérience 1 : Test de Feulgen

Expérience 2 : Test de Brachet

Tâches : Décrire les techniques de coloration (principe, but et conclusion) et les différents types de
colorants de cellules à partir des expériences ci-dessus.
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III. LA SEPARATION DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
1. Séparation par centrifugation
Activité 3a.
Afin d'analyser la structure ou la composition d’une cellule, on
peut séparer les sous-fractions cellulaires en faisant varier la
vitesse de rotation et le temps de rotation à l’aide d’une
centrifuge (document 1). Pour ce faire, on prépare des
échantillons dans le but de faire éclater les cellules. En règle
générale, on pratique un broyage mécanique des tissus, c'est
l'homogénéisation des tissus. On peut aussi procéder, par lyse
osmotique ou par vibration par ultrasons, en rompant les
membranes plasmiques cellulaires, tout en préservant les
autres biomembranes des Organites.
Le développement de centrifugeuses à haute vitesse, ou
ultracentrifugeuses, imposant des accélérations supérieures à
20 000 fois la pesanteur terrestre (20 000 g) a permis le
fractionnement subcellulaire. L'accélération centrifuge est
exprimée en multiples de l'accélération de pesanteur terrestre
notée g. La vitesse de sédimentation des particules dépend
ainsi de leur taille, de leur forme (globulaire ou allongée) et de
leur densité ou vitesse de rotation (nombre de tours par mn).
c'est la méthode de référence pour séparer les organites Document 1. Centrifugeuse
subcellulaires purifiés (noyaux, mitochondries, microsomes,
ribosomes, etc ).
Le document 2 indique un processus de centrifugation de constituants cellulaires.
Tâches :
1. Rappeler le but de la centrifugation.
2. Rappeler la technique de préparation des échantillons (homogénat).
3. Rappeler brièvement le principe de la séparation par centrifugation (texte).
4. Identifier les différents constituants cellulaires isolés et préciser les accélérations auxquelles ils sont
soumis document 2.

Document 2. Isolement d’organites cellulaire par centrifugation différentielle

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 2. Séparation par chromatographie :
Activité 3b. Extraction et séparation des pigments
Il est alors possible de séparer les différents pigments de la solution brute. Une méthode simple,
essentiellement qualitative, peut être réalisée par une chromatographie sur papier Whatman.
La feuille est broyée dans de l'alcool absolu ou de l'acétone. Les pigments solubles dans les solvants
organiques sont extraits. Après filtration pour éliminer les débris cellulaires, on obtient une solution brute de
pigments. On dépose une goutte de pigments bruts sur une feuille de papier. On place la feuille de papier
dans un récipient hermétique renfermant un solvant approprié. Le solvant monte le long de la feuille par
capillarité en entraînant les pigments de manière différentielle selon leur affinité avec le solvant mais aussi
selon leur taille (poids). On parle de migration.

Document 3a. Extraction des pigments bruts Document 3b. Chromatographie sur papier
Tâches :
1. Identifier cette technique et préciser son but.
2. Rappeler brièvement le principe de la chromatographie.
3. Identifier les différents pigments isolés de la feuille.

III. UTILISATION DE TRACEURS RADIOACTIFS : Autoradiographie

Activité 4. Explication du principe et de la méthode de traçage radioactif.
Les radio-isotopes sont des éléments naturels ou artificiels instables qui se distinguent des éléments stables
par un rapport protons/neutrons déséquilibré ; ceci conduit à une désintégration spontanée de leurs noyaux
accompagnée d’émissions de particules ou de radiations : c’est la radioactivité et le tracé ainsi obtenu est
appelé autoradiographie.
Les éléments sont détectés grâce à des compteurs dits « à scintillation ». La sensibilité extrême de cette
détection, très supérieure à toutes les méthodes chimiques, fait de cette technique un outil unique pour
l’étude de très nombreux processus biologiques. Ils sont employés sous forme de molécules minérales
radioactifs (ions : Na+, K+, NH4+, CO2) ou organiques (acides aminés, nucléotides, sucres…, comportant
un ou plusieurs atomes de 14C, 3H,… radioactifs).
Les molécules radiomarquées n’étant pas distinguées des molécules normales par les enzymes et donc par
les cellules. Elles sont assimilées, métabolisées de la même façon et enfin incorporées dans leur matière.
Elles agissent comme des molécules « espions » facilement détectables par les capteurs à scintillation
même à très faible concentration.

Tâches :
1. A travers la lecture de ce texte, dire sur quoi se base la méthode du traçage radioactif.
2. Décrire brièvement la méthode.
3. Définir la notion de traceur radioactif.

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 IV. UTILISATION DES MICROSCOPES POUR OBSERVER DES PREPARATIONS
1. Préparation microscopique :

Activité 5 : Méthodologie de la préparation microscopique

Tâche : Décrire la méthodologie pour réaliser une préparation microscopique.

2. Description du microscope optique:

Activité 6a : les éléments du microscope optique

Figure 2 : Principe de fonctionnement

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 3. Principe de fonctionnement des microscopes
Activité 6b.
La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des
structures biologiques. On distingue en principe deux types de microscopes : optique et
électronique.
Le microscope optique ou photonique sert à agrandir des objets invisibles à l’œil nu. Il
est constitué de deux systèmes de lentilles en verre qui jouent le rôle de loupe (25 à 1500
fois). L'objectif, constitué de plusieurs lentilles élémentaires, donne de l’objet une image
réelle agrandie. Les lentilles du microscope sont conçues pour que l'image réelle formée par
l'objectif se situe au foyer de l'oculaire. Ce dernier au travers duquel on observe à l’infini une
image virtuelle agrandie, joue le rôle de loupe. Ce microscope reçoit les photons de la
lumière à partir du miroir pour éclairer la préparation. Les préparations coupées doivent
avoir une épaisseur moyenne de 5 à 15µm et peuvent être maintenues en vie et observées en
entier. Son pouvoir séparateur est environ 0,2mm=200nanomètres (nm).
Le microscope électronique : C’est un microscope de grande taille dont le faisceau
lumineux est remplacé par un faisceau d’électrons et dont les « lentilles » (condensateur,
objectif et oculaire) sont de nature électrostatique ou électromagnétique. L’image est
recueillie sur un écran fluorescent (observation directe) ou, mieux, sur une plaque
photographique. Il permet d’agrandir l’image de 1500 à 200 000 fois exceptionnellement
500 000 fois avec un pouvoir séparateur de
0,2nm (conditions optimales) soit 2 Angström.
Les préparations coupées à l’ultra
microtome doivent avoir une épaisseur
moyenne de 0,05 µm (très petite) avec
absence d’une vue d’ensemble et sont non
vivables. Le microscope électronique nous
permet de voir l’ultrastructure avec
découpage détaillé d’organite. On atteint
très souvent le niveau moléculaire ce qui a
permis de progrès énormes en cytologie.
Il existe deux types de microscope
électronique. Le microscope électronique par
transmission qui nécessite des coupes
d’organe extrémement fin et le microscope
électronique à balayage qui permet de faire
des observation de la surface des objets. Pas
besoins de coupe.
Tâches :
1. Faites une description du microscope optique en se référant de la figue 1.
2. Décrire le principe de fonctionnement du microscope optique (Figure 2 et texte) et électronique.
3. Le microscope optique permet de décrire la structure et microscope électronique l’ultrastructure ;
justifier ces propos à partir du texte.
4. Faites une comparaison des deux types de microscopes en indiquant les caractéristiques, les
avantages et les inconvénients de chaque type de microscope.

5. ECHELLE ET GROSSISSEMENT :
Activité 7. Calcul de la taille d’un objet vu au microscope
Un objet observé mesure 1 cm sous le microscope avec l'objectif x40 et l'oculaire x10. Taille
d'un objet vu au microscope est calculer par la formule suivante :
Taille réelle Taille observée
Echelle = Taille réelle =
Taille sur la photo Grandissement

Exercice d’application :
Tâches :
1. Que signifie taille réelle d’un objet.
M. SARR / Lycée Mixte de Ngane Saer / IA de Kaolack 2. Calculer le grossissement de l’image
3. En déduire la taille réelle de l’image