Biotechnologie Végétale

Master en Biotechnologies Végétales Appliquées (MaBioVA)
Module : Biotechnologie Végétale / Amélioration des Plantes)
La culture des protoplastes:

Application en biotechnologie
Pr Salama AISSAM
Centre d’Agrobiotechnologie et Bioingénierie,
Unité de Recherche labellisée CNRST (Centre AgroBiotech-URL-CNRST-05),
Faculté des Sciences et Techniques, Université Cadi Ayyad, Marrakech 40000, Maroc
Tél/ + 212 661 546 580
aissamsalama@gmail.com
s.aissam@uca.ma
Définition
Protoplaste: Cellule végétale débarrassée de sa paroi squelettique
Cellule « nue »
Méthodes et conditions d’isolement des protoplastes
L’isolement des protoplastes comprend deux étapes :
La plasmolyse et la dégradation de la paroi
Plasmolyse
Le potentiel osmotique est équilibré par la paroi *
Les agents plasmolysants les plus utilisés sont les oses alcools
(Sorbitol / Mannitol)
Dégradation mécanique
Peu efficace et non reproductible.
 Les premiers protoplastes ont été obtenus, en hachant des fragments

végétaux dans une solution hypertonique de saccharose.
 Plasmolyse des cellules puis micro-dissection sous le microscope
Dégradation enzymatique
La méthode la plus utilisée.
Technique de préparation:
Attaque (digestion) des parois des cellules végétales par des enzymes
extraites de champignons saprophytes telles que:
Pectinases, Hémicellulases et Cellulases.

Culture des protoplastes
Milieu de culture:
 Souvent MS
 Vitamines + acide aminé
 1 auxine et 1 cytokinine
(ex. 2,4 D=1 mg/L, kin = 1-2 mg/L……. )
 Saccharose ou glucose.. Rôle: trophique et osmotique,

Sucre 9 à 12% *
Culture de protoplastes
Après quelques jours
Les protoplastes réagissent et entrent en division:
a/ Callogenèse permanente c/ Embryons somatiques

b/ Callogenèse --- Des embryons
---- Des méristèmes
Division cellulaire:
Une densité minimale de 104 pro/mL pour réussir la culture.
Test de viabilité cellulaire
Les protoplastes non protégés par leur paroi sont immédiatement accessibles aux
bactéries.
On met en présence les protoplastes avec une solution de Di-Acétate de

Fluorescéine (FDA ou DAF). Ce produit lipophile pénètre rapidement dans les
cellules grâce à la perméabilité de la membrane plasmique.
Si la cellule est vivante, ses estérases coupent le FDA et libèrent dans la cellule la
fluorescéine acide fluorescente.
Celle-ci, non lipophile, ne peut sortir de la cellule qui devient fluorescente.

Viabilité des protoplastes - Sorbonne Université . http://www.snv.jussieu.fr › 6-protoplaste-viabilite
Viabilité des protoplastes - Sorbonne Université . http://www.snv.jussieu.fr › 6-protoplaste-viabilite
Intérêt
 Faire pénétrer dans la cellule des molécules diverses (ADN . . . ), ou des

organites (mitochondrie, chloroplaste . . . )
 Obtenir des fusions entre protoplastes (dédoublement du nombre de

chromosomes).
En cas de fusion entre protoplastes issus d’espèces ou de genres différents, on
obtient un « Hybride somatique »
 Possibilité d’appliquer des traitements mutagènes en vue de la recherche

de formes résistantes aux antibiotiques.
Fusion des protoplastes
Types:
Fusion membranaire, Fusion des cytoplasmes, Fusion nucléaire donc fusion des génomes
Il y a plusieurs techniques permettant la fusion de deux protoplastes de variétés

différentes (fusion intraspécifique) ou d’espèces voisines (fusion interspécifique).
Les plus connues sont: la fusion chimique et la fusion électrique

La fusion chimique
La fusion chimique est basée sur l’utilisation de substances à fort poids moléculaire qui
permettent le rapprochement des protoplastes et par la suite leur fusion.
Fusion au nitrate de sodium

L’addition de NaNO3 à la solution enzymatique:
Fusion des proto chez les céréales.
Ce taux est faible 0- 5% (pb de toxicité)
Fusion par forte concentration en ions Ca2+ à pH élevé (=10)

Fréquence : 25% si présence de CaCl2 à t° =37° C en incubation
Fusion au polyéthylène glycol (PEG)

La méthode chimique la plus utilisée, la plus efficace chez un grand nombre d’espèces,
donne un taux de fusion élevé
Cette substance non ionisée provoque l’accolement des protoplastes en neutralisant

les charges négatives conduisant ainsi au contact membranaire.
La dilution de cette substance induit des perturbations au niveau moléculaire provoquant
ainsi la fusion des protoplastes.
La fusion électrique (Eléctrofusion)
Les protoplastes sont soumis à un champ électrique induit par un courant

sinusoïdal créé entre 2 électrodes non symétriques.
Après l’accolement des protoplastes, la fusion est obtenue par l’envoi

d’impulsions de courant continu pendant quelques microsecondes
Méthodes de fusion des protoplastes / Le monde en imagesmonde.ccdmd.qc.ca
Exemple de sélection basés sur la capacité de régénération in vitro
Croisement entre Datura inoxia X Datura discolor

Datura inoxia mutants albinos capables de régénérer des bourgeons albinos
Datura discolor vert mais incapable de régénérer
Résultat:
Régénération de plantes vertes donc il s’agit d’hybrides somatiques
Problématiques de la technique de la culture des protoplastes
 Limitation de la régénération à partir des proto à seulement quelques familles
telles que les Solanacées
 Instabilité chromosomique observée dans la plupart des plantes hybrides:
Les plantes aneuploïdes * récupérées sont normalement incapables de

propagation sexuelle
Les principaux buts de la Biotechnologie Végétale:
 La multiplication massive par production commerciale de plantes saines ou

hybrides
 La création de nouveaux génotypes par:

- Sélection de variants somaclonaux présentant des caractères de résistance
aux stress biotiques ou abiotiques.
- Fusion de protoplastes
- Transformation génétique
 La production massive de molécules à forte valeur ajoutée (métabolites

secondaires) par utilisation de la culture cellulaire.

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La culture des protoplastes:

Protoplaste: Cellule végétale débarrassée de sa paroi squelettique

L’isolement des protoplastes comprend deux étapes :

La plasmolyse et la dégradation de la paroi

Le potentiel osmotique est équilibré par la paroi *

Peu efficace et non reproductible.

 Les premiers protoplastes ont été obtenus, en hachant des fragments

 Plasmolyse des cellules puis micro-dissection sous le microscope

La méthode la plus utilisée.

Pectinases, Hémicellulases et Cellulases.

 Vitamines + acide aminé

 Saccharose ou glucose.. Rôle: trophique et osmotique,

a/ Callogenèse permanente c/ Embryons somatiques

On met en présence les protoplastes avec une solution de Di-Acétate de

Celle-ci, non lipophile, ne peut sortir de la cellule qui devient fluorescente.

 Faire pénétrer dans la cellule des molécules diverses (ADN . . . ), ou des

 Obtenir des fusions entre protoplastes (dédoublement du nombre de

 Possibilité d’appliquer des traitements mutagènes en vue de la recherche

Il y a plusieurs techniques permettant la fusion de deux protoplastes de variétés

Les plus connues sont: la fusion chimique et la fusion électrique

Fusion au nitrate de sodium

Fusion par forte concentration en ions Ca2+ à pH élevé (=10)

Fusion au polyéthylène glycol (PEG)

Cette substance non ionisée provoque l’accolement des protoplastes en neutralisant

Les protoplastes sont soumis à un champ électrique induit par un courant

Après l’accolement des protoplastes, la fusion est obtenue par l’envoi

Croisement entre Datura inoxia X Datura discolor

 Instabilité chromosomique observée dans la plupart des plantes hybrides:

Les plantes aneuploïdes * récupérées sont normalement incapables de

 La multiplication massive par production commerciale de plantes saines ou

 La création de nouveaux génotypes par:

 La production massive de molécules à forte valeur ajoutée (métabolites

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