Patrick Pla

BIOLOGIE CELLULAIRE ET GENETIQUE

DU DEVELOPPEMENT

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 Patrick Pla

BIOLOGIE CELLULAIRE ET GENETIQUE

DU DEVELOPPEMENT

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 SOMMAIRE

INTRODUCTION.........................................................................................................................................................................................1
PARTIE 1 .......................................................................................................................................................................................................5
Les organismes modèles ........................................................................................................................................................................5
La drosophile ........................................................................................................................................................................................6
Caenorhabditis elegans .................................................................................................................................................................. 12
Le poisson-zèbre .............................................................................................................................................................................. 15
Le xénope ............................................................................................................................................................................................. 17
Le poulet .............................................................................................................................................................................................. 21
Les chimères caille-poulet...................................................................................................................................................... 23
Autres techniques ...................................................................................................................................................................... 24
La souris ............................................................................................................................................................................................... 26
Transgénèse chez la souris .................................................................................................................................................... 27
Technique de knock-out et CRISPR/Cas9 ....................................................................................................................... 28
Le système Cre-Lox ................................................................................................................................................................... 29
De plus en plus d'études transcriptomiques.................................................................................................................. 31
Des modèles moins classiques ................................................................................................................................................... 32
Nematostella vectensis (Cnidaires) ................................................................................................................................... 32
Platynereis dumerilii (Annélides) ...................................................................................................................................... 34
Tribolium (Insecte) ................................................................................................................................................................... 34
L’oursin (Echinoderme) .......................................................................................................................................................... 35
L’ascidie (Urocordé) ................................................................................................................................................................. 38
Et l’Humain ? ...................................................................................................................................................................................... 40
Arabidopsis thaliana........................................................................................................................................................................ 43
PARTIE 2 .................................................................................................................................................................................................... 47
Les concepts fondamentaux .............................................................................................................................................................. 47
Le destin des cellules et les réseaux de régulation génique.......................................................................................... 48
Les cas de maintien de la pluripotence ............................................................................................................................ 53
Le retour à la pluripotence : le cas des cellules iPS ..................................................................................................... 55
Les inductions embryonnaires et les gradients de morphogène ................................................................................ 58
Les cellules souches ........................................................................................................................................................................ 66
Généralités .................................................................................................................................................................................... 67
L’exemple du renouvellement de l’intestin .................................................................................................................... 68
La division asymétrique des cellules souches ............................................................................................................... 70
La régénération chez les animaux ...................................................................................................................................... 71
Cellules souches quiescentes, actives et sénescentes ................................................................................................ 73
Évolution et développement ....................................................................................................................................................... 78

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 Histoire de la biologie cellulaire et de la biologie du développement...................................................................... 83
La biologie du développement à la croisée des chemins entre la biologie cellulaire, la génétique et
l'évolution ...................................................................................................................................................................................... 83
Progrès dans la compréhension des modalités du développement embryonnaire ..................................... 87
Histoire de l'étude et de la production des cellules souches .................................................................................. 89
PARTIE 3 .................................................................................................................................................................................................... 94
Les étapes du développement .......................................................................................................................................................... 94
L’ovogenèse prépare le développement embryonnaire ................................................................................................. 95
L’ovocyte et son environnement ......................................................................................................................................... 95
Les réserves énergétiques...................................................................................................................................................... 99
Les réserves moléculaires ................................................................................................................................................... 102
Le contrôle de la progression de la méiose ................................................................................................................. 105
La fécondation ................................................................................................................................................................................ 107
La rencontre des gamètes ................................................................................................................................................... 108
Contact et fusion entre les gamètes ................................................................................................................................ 110
Conséquences de la fécondation ...................................................................................................................................... 112
La procréation médicalement assistée (PMA) ........................................................................................................... 116
Le clivage .......................................................................................................................................................................................... 118
Clivage en spirale .................................................................................................................................................................... 118
Clivage radiaire ........................................................................................................................................................................ 118
Le cas particulier de la drosophile .................................................................................................................................. 131
Le clivage chez C. elegans .................................................................................................................................................... 132
Compétition cellulaire........................................................................................................................................................... 135
La gastrulation ............................................................................................................................................................................... 137
La gastrulation chez les Amphibiens .............................................................................................................................. 137
La gastrulation chez les Amniotes ................................................................................................................................... 144
La neurulation ................................................................................................................................................................................ 156
L’organogenèse .............................................................................................................................................................................. 165
Les étapes du développement embryonnaire d'Arabidopsis thaliana et leur contrôle ................................. 171
Introduction .............................................................................................................................................................................. 171
Présentation générale des étapes .................................................................................................................................... 172
La première division asymétrique et ses conséquences ....................................................................................... 172
L'embryon au stade cœur .................................................................................................................................................... 175
Mise en place du méristème apical racinaire et quelques aspects du développement de l'appareil
racinaire ...................................................................................................................................................................................... 179
Contrôle de la taille de l'embryon et de la graine ..................................................................................................... 182
Le développement des plastes .......................................................................................................................................... 182
La vie de la graine ................................................................................................................................................................... 183
PARTIE 4 ................................................................................................................................................................................................. 186
Contrôles génétique et épigénétique du développement ................................................................................................. 186
6
 Contrôle de la transcription ..................................................................................................................................................... 187
Présentation générale ........................................................................................................................................................... 187
Aspect modulaire du contrôle de la transcription .................................................................................................... 194
Focus sur les contrôles épigénétiques ........................................................................................................................... 203
Contrôle de la traduction ........................................................................................................................................................... 210
Généralités ................................................................................................................................................................................. 210
Initiation de la traduction ................................................................................................................................................... 211
Translocation et terminaison de la traduction .......................................................................................................... 213
Contrôle de la dégradation des ARNm........................................................................................................................... 216
Contrôle de la localisation de la traduction ................................................................................................................. 217
Les microARN et l’inhibition de la traduction ............................................................................................................ 219
PARTIE 5 ................................................................................................................................................................................................. 223
Structures et processus cellulaires ............................................................................................................................................. 223
Le cytosquelette............................................................................................................................................................................. 223
Les microfilaments d’actine ............................................................................................................................................... 223
Le réseau de microtubules .................................................................................................................................................. 235
Les filaments intermédiaires ............................................................................................................................................. 243
Les matrices extracellulaires animales ............................................................................................................................... 247
Composition et mise en place des matrices extracellulaires animales ........................................................... 247
Rôle structural des matrices extracellulaires ............................................................................................................. 253
Rôle dans le transport, la signalisation et la migration des matrices extracellulaires ............................. 259
Remodelage et lyse des MEC .............................................................................................................................................. 267
Les parois des cellules végétales ............................................................................................................................................ 270
Constituants des parois des cellules végétales .......................................................................................................... 271
Dépôt de la paroi cellulaire primaire et secondaire ................................................................................................ 275
Croissance de la paroi cellulaire primaire ................................................................................................................... 276
Signalisation à partir de la paroi cellulaire .................................................................................................................. 279
Destruction de la paroi cellulaire ..................................................................................................................................... 280
Adhérences cellule-cellule ........................................................................................................................................................ 280
Les complexes d’adhérence ................................................................................................................................................ 281
Les cadhérines .......................................................................................................................................................................... 284
Autres molécules d’adhérences cellulaires ................................................................................................................. 290
Les transitions épithélio-mésenchymateuses et la migration cellulaire .............................................................. 292
Les transitions épithélio-mésenchymateuses ............................................................................................................ 292
Les migrations cellulaires ................................................................................................................................................... 299
Les cycles et les divisions cellulaires.................................................................................................................................... 309
Quiescence ou prolifération ? Entrée et progression dans la phase G1 .......................................................... 311
Réplication de l’ADN et progression en phase G2 .................................................................................................... 315
La mitose et le contrôle de ses étapes ............................................................................................................................ 317

7
 Les particularités des divisions des cellules végétales ........................................................................................... 326
Les particularités de la méiose.......................................................................................................................................... 327
La polyploïdisation ................................................................................................................................................................. 330
Les divisions asymétriques................................................................................................................................................. 331
L’apoptose ........................................................................................................................................................................................ 339
Les vésicules extracellulaires .................................................................................................................................................. 347
PARTIE 6 ................................................................................................................................................................................................. 352
Les voies de signalisation ................................................................................................................................................................ 352
Les voies de signalisation WNT .............................................................................................................................................. 353
Voie Wnt canonique ............................................................................................................................................................... 354
Voies Wnt non canoniques.................................................................................................................................................. 359
Contrôle de la sécrétion et de la diffusion des Wnt ................................................................................................. 362
Antagonistes et agonistes naturels de la voie Wnt................................................................................................... 365
La voie de signalisation Hedgehog ........................................................................................................................................ 368
Hedgehog dans la mise en place de l’axe antéro-postérieur du disque imaginal de l’aile de drosophile
......................................................................................................................................................................................................... 376
Shh, développement du cervelet et cancer .................................................................................................................. 377
La famille TGFβ et ses voies de signalisation ................................................................................................................... 378
TGF-β ............................................................................................................................................................................................ 378
BMP ............................................................................................................................................................................................... 381
Nodal ............................................................................................................................................................................................. 386
Les voies de signalisation FGF ................................................................................................................................................. 388
Implication de la signalisation FGF dans le développement précoce de la souris ..................................... 394
L’acide rétinoïque ......................................................................................................................................................................... 395
La voie de signalisation Notch ................................................................................................................................................. 399
La voie de signalisation Hippo et ses composants YAP/TAZ .................................................................................... 408
YAP et TAZ comme mécanotransducteurs .................................................................................................................. 410
YAP/TAZ dans le contrôle de la prolifération cellulaire pendant le développement ............................... 411
Rôle de YAP et TAZ dans la détermination cellulaire ............................................................................................. 413
La voie de signalisation de l’auxine et ses rôles .............................................................................................................. 414
Synthèse et transport de l’auxine .................................................................................................................................... 414
Réception de l'auxine et voies de transduction du signal ..................................................................................... 420
L'auxine et les racines secondaires ................................................................................................................................. 421
L'auxine et l'expansion de la paroi .................................................................................................................................. 423
L'auxine et la dominance apicale ..................................................................................................................................... 423
L'auxine et la croissance des fruits.................................................................................................................................. 423
PARTIE 7 ................................................................................................................................................................................................. 425
Les gènes et les cellules en action au cours du développement .................................................................................... 425
Axe antéro-postérieur chez la drosophile .......................................................................................................................... 426

8
 Bicoid et Nanos ........................................................................................................................................................................ 426
Un exemple de gène gap précoce : hunchback ........................................................................................................... 430
Des gènes gap aux gènes homéotiques.......................................................................................................................... 431
Les gènes homéotiques ........................................................................................................................................................ 435
Mise en place des axes chez les Vertébrés ......................................................................................................................... 442
Mise en évidence de l’organisateur de Spemann ...................................................................................................... 442
De la rotation corticale à l’organisateur de Spemann chez les Amphibiens ................................................. 443
Formation de l’organisateur de Spemann dans d’autres modèles que les Amphibiens .......................... 446
Action de l’organisateur de Spemann ............................................................................................................................ 447
Régionalisation le long de l’axe antéro-postérieur .................................................................................................. 453
L’axe droite-gauche ................................................................................................................................................................ 458
La formation des somites .......................................................................................................................................................... 460
Le développement des muscles striés squelettiques .................................................................................................... 467
Introduction .............................................................................................................................................................................. 467
La détermination, la prolifération et la migration des myoblastes .................................................................. 468
La fusion des myoblastes ..................................................................................................................................................... 477
Différenciation finale ............................................................................................................................................................. 480
Les cellules souches musculaires adultes : les cellules satellites ...................................................................... 484
La production de cellules musculaires striées à partir de cellules souches induites ............................... 491
Les cellules des crêtes neurales .............................................................................................................................................. 495
Développement de la bordure neurale et émergence des CCN en son sein .................................................. 498
Transition épithélio-mésenchymateuse et migration des CCN .......................................................................... 502
Multipotence et détermination des CCN ....................................................................................................................... 510
Développement d’une sélection de lignages ............................................................................................................... 512
Différenciation in vitro des cellules de crêtes neurales à partir de cellules pluripotentes humaines
......................................................................................................................................................................................................... 539
Le développement des bourgeons de membre ................................................................................................................ 541
Contrôle de la position des bourgeons de membre sur l'axe antéro-postérieur de l'animal ................ 542
L'axe proximo-distal et son contrôle .............................................................................................................................. 544
L'axe antéro-postérieur et son contrôle ....................................................................................................................... 548
Polarité dorso-ventrale du bourgeon de membre .................................................................................................... 553
Contrôle de l'apoptose interdigitale ............................................................................................................................... 554
La régénération des bourgeons de membre ............................................................................................................... 555
Aspects Evo/Dévo ................................................................................................................................................................... 557
Le développement du cortex ................................................................................................................................................... 559
Des cellules souches neurales aux neurones .............................................................................................................. 560
Aspects évo-dévo .................................................................................................................................................................... 567
Le développement des cellules gliales ........................................................................................................................... 568
Régionalisation au sein du cortex .................................................................................................................................... 570

9
 Mise en place, maintien et modifications des connexions .................................................................................... 571
La neurogénèse chez les mammifères adultes ................................................................................................................. 574
Neurogénèse adulte dans la SVZ ...................................................................................................................................... 574
Neurogénèse dans la SGZ de l'hippocampe ................................................................................................................. 577
Croissance et guidage axonal ................................................................................................................................................... 582
Rôle du cytosquelette ............................................................................................................................................................ 582
Une intégration de signaux attractifs et répulsifs..................................................................................................... 583
Traduction locale et stabilité protéique dans les cônes de croissance ........................................................... 588
Le développement des organes génitaux et des cellules germinales .................................................................... 590
Le développement des organes génitaux ..................................................................................................................... 591
Le développement des cellules germinales ................................................................................................................. 597
Hématopoïèse et développement des cellules du système immunitaire ............................................................. 615
L'hématopoïèse embryonnaire ......................................................................................................................................... 616
L'hématopoïèse post-natale ............................................................................................................................................... 619
Les cellules NK.......................................................................................................................................................................... 623
Macrophages et monocytes ................................................................................................................................................ 625
Les lymphocytes T .................................................................................................................................................................. 628
Les lymphocytes B .................................................................................................................................................................. 636
Les leucémies et les myélomes ......................................................................................................................................... 644
La métamorphose chez les Hexapodes et les Amphibiens ......................................................................................... 645
La métamorphose chez les Hexapodes .......................................................................................................................... 645
La métamorphose chez les Amphibiens ....................................................................................................................... 655
Le méristème apical caulinaire en phase végétative et lors de la formation d'une fleur.............................. 660
Généralités et maintien des cellules souches ............................................................................................................. 660
La formation des feuilles...................................................................................................................................................... 667
Induction florale et passage à la production d'une fleur ....................................................................................... 669
Partie 8 .................................................................................................................................................................................................... 683
DU DEVELOPPEMENT AUX PATHOLOGIES ............................................................................................................................ 683
Les cellules tumorales................................................................................................................................................................. 683
Un contrôle de l'intégrité du génome déficient ......................................................................................................... 683
Une résistance à la mort cellulaire .................................................................................................................................. 687
Un cycle cellulaire hors de contrôle ................................................................................................................................ 689
Des capacités migratoires exacerbées ........................................................................................................................... 694
Un métabolisme particulier ................................................................................................................................................ 697
La capacité à faire former de nouveaux vaisseaux sanguins ............................................................................... 699
La capacité à bloquer les processus immunitaires anti-tumoraux ................................................................... 700
CAHIER TECHNIQUE ......................................................................................................................................................................... 703
Les outils pour étudier l'expression et la fonction des gènes ................................................................................... 703
Le séquençage........................................................................................................................................................................... 703

10
 L'analyse GWAS ....................................................................................................................................................................... 704
L'hybridation in situ .............................................................................................................................................................. 704
RT-qPCR ...................................................................................................................................................................................... 706
RNAseq ........................................................................................................................................................................................ 708
Les gènes rapporteurs .......................................................................................................................................................... 710
Etude de la fixation des facteurs de transcription à l'ADN ................................................................................... 711
Détection des modifications épigénétiques de la chromatine ............................................................................ 714
Détection des structures chromatiniennes ................................................................................................................. 715
Etude de la traduction ........................................................................................................................................................... 715
Modifications du génotype.................................................................................................................................................. 716
Les outils bioinformatiques ................................................................................................................................................ 724
Les techniques et les outils pour la biologie cellulaire................................................................................................. 724
La culture cellulaire ............................................................................................................................................................... 724
Le fractionnement cellulaire par centrifugation différentielle ........................................................................... 726
Western-blot ............................................................................................................................................................................. 726
Immunoprécipitation ............................................................................................................................................................ 727
Le double hybride ................................................................................................................................................................... 728
Immunohistochimie/Immunocytochimie/Immunofluorescence ..................................................................... 728
Les progrès de la microscopie photonique et de l'analyse des images ........................................................... 729
Approches optogénétiques pour perturber la signalisation cellulaire ........................................................... 733
Les rapporteurs fluorescents pour la concentration calcique ............................................................................ 734
La cytométrie du flux ............................................................................................................................................................. 735
La microscopie électronique .............................................................................................................................................. 735
Les tests de migration cellulaire....................................................................................................................................... 736
Les marqueurs de prolifération ........................................................................................................................................ 737
EXERCICES ............................................................................................................................................................................................. 740
Exercices sur le contrôle de l’expression des gènes ...................................................................................................... 740
Exercices sur les matrices extracellulaires, le cytosquelette et les adhérences cellule-cellule ................. 753
Exercices sur les cycles et les divisions cellulaires ........................................................................................................ 767
Exercices sur les voies de signalisation .............................................................................................................................. 771
Exercices sur les étapes du développement, les inductions embryonnaires et la mise en place des axes de
polarité .............................................................................................................................................................................................. 782
Exercices sur le développement des muscles striés squelettiques......................................................................... 797
Exercices sur le développement des bourgeons de membre .................................................................................... 803
Exercices sur la gamétogenèse et la fécondation............................................................................................................ 805
GLOSSAIRES .......................................................................................................................................................................................... 810
Glossaire des termes scientifiques ........................................................................................................................................ 810
Glossaire des molécules les plus étudiées en biologie du développement ......................................................... 820
Glossaire des techniques et du matériel utilisés pour les expériences ................................................................. 828

11
12
 INTRODUCTION

Au cours du développement, les organismes passent d’une cellule unique, le zygote, qui a une forme
sphérique, à une structure tridimensionnelle spécifique composée de parfois plusieurs milliards de cellules,
chacune avec une localisation et une fonction précise. Les mécanismes mis en jeu dans ce qui pouvait encore
paraître comme un miracle il y a un siècle sont maintenant bien compris : ils comprennent des changements
régionalisés dans l’expression des gènes contrôlés par des modulations épigénétiques, des activités de
signalisation cellulaire, et des stimuli biomécaniques.

La biologie du développement est un formidable terrain de jeu pour la biologie cellulaire, la génétique et la
biophysique. C’est ce que je souhaite illustrer avec cet ouvrage.

Le développement embryonnaire correspond à la période où un organisme animal ou végétal passe du stade

« zygote » où il est une cellule unique à une forme tridimensionnelle spécifique et autonome. Chez les
Mammifères à placenta et particulièrement dans l’espèce humaine, une phase fœtale de croissance et de
maturation s’est ajoutée après le développement embryonnaire, avant la naissance. La limite entre embryon
et fœtus se situe à 8 semaines de développement chez l’Homme (=10 semaines d’aménorrhée, c’est-à-dire
10 semaines depuis la fin des dernières règles).

Chez certains organismes animaux, la forme qui éclot de l’œuf est très différente en termes d’organisation,
de mode et parfois de milieu de vie par rapport à l’adulte : on parle alors de larves. Celles-ci subissent une
métamorphose ce qui leur permet de devenir adulte. Dans d’autres cas moins spectaculaires, les organismes
qui naissent sont seulement sexuellement immatures et le développement de leurs gonades et de leurs
gamètes s’achève lors de la maturation sexuelle (appelée puberté chez l’Homme). L’ensemble est
accompagné de croissance. Tous ces évènements correspondent au développement post-embryonnaire.

Au-delà des étapes classiques du développement embryonnaire et post-embryonnaire, le développement

ne s’arrête jamais, y compris chez les organismes adultes. Tout comme on ne se baigne jamais dans le même
fleuve comme disait Héraclite, on ne se baigne jamais dans le même Sapiens, lui répond malicieusement
Alain Prochiantz dans une conférence que j’ai eu le plaisir d’écouter. Beaucoup de nos tissus se renouvellent
sans cesse.

Ces mécanismes doivent néanmoins être correctement régulés et leur échappement à tout contrôle peut
mener à des tumeurs. Les cellules tumorales réacquièrent souvent des propriétés embryonnaires
(dédifférenciation associée à des modifications épigénétiques, prolifération, migration) et c’est notamment
pourquoi l’étude de la biologie du développement est très liée à la cancérologie.

Ce livre est la version imprimée du site : https://bcgdevelop.fr/

Tout ce qui est présenté dans cet ouvrage se trouve sous licence Creative Commons 4.0

Il peut s’utiliser de multiples manières : pour apprendre (à différents niveaux) un concept (la notion de
morphogène ou de cellule souche par exemple) ou une série d’évènements (induction neurale ou
développement du bourgeon de membre par exemple) ou pour chercher une information précise.

Il y a 3 niveaux de lecture selon votre stade dans la connaissance du domaine :

1
 Niveau embryon : débutant Niveau têtard : déjà des Niveau mature : une bonne
dans le domaine => Lire et connaissances mais à consolider maitrise du domaine mais
comprendre tout ce qui est en => Lire et comprendre tous les souhaite approfondir un sujet
gras et analyser les figures paragraphes qui contiennent des particulier => Tout lire et tout
marquées par * mots en gras ou soulignés et analyser (notamment les figures
analyser les figures marquées marquées par ***)
par * et **

Vous trouverez à la fin 3 glossaires : un premier pour les termes scientifiques, un second pour les molécules
les plus étudiées et un dernier pour les outils et les techniques.

Les illustrations proviennent essentiellement d’articles Open Access libres de droits. Elles présentent
souvent des données expérimentales qui non seulement vous apportent une information mais aussi vous
rendent explicite la démarche expérimentale pour acquérir cette information (ce qui est tout aussi
important).

Pour certains chapitre-clés, vous trouverez des exercices d’analyse de données expérimentales qui vous
permettront d’évaluer vos compétences de réflexion et de logique ainsi que vos connaissances. Les
questions sont réparties par niveau comme pour le cours (* = embryon; ** = têtard; *** = mature) de telle
manière à ce que vous progressiez à votre rythme.

Bonne lecture et bon apprentissage !

Patrick Pla,

Maître de Conférences, HDR, Université Paris-Saclay

2
L’auteur devant la première brebis clonée, Dolly, exposée empaillée

au Museum National d’Ecosse à Edimbourg.

3
4
PARTIE 1

Les organismes modèles

*Figure 1-1. Positionnement dans un arbre phylogénétique des Bilatériens des principaux organismes
modèles (avec leurs principaux atouts pour leur étude en biologie du développement).

5
La drosophile

*Figure 1-2. Drosophila melanogaster.

Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Drosophile#/media/

Fichier:Drosophila_melanogaster_-_side_(aka).jpg

*Figure 1-3. Dimorphisme sexuel chez la

drosophile. La femelle fait 2,5 mm de
longueur. Le mâle est un peu plus court et la
partie postérieure de son corps est plus
foncée. Source :https://fr.m.wikipedia.org/wiki/Fichier:Biology_Illustration_Animals_Insects_Drosophila_melanogaster.svg

a mouche du vinaigre Drosophila melanogaster est un des modèles les plus anciens utilisés en

L
génétique du développement (et en génétique dans son ensemble). Il y a plus de 100 ans, elle a
fourni, par exemple, la preuve définitive que les gènes qui étaient auparavant des unités
héréditaires « abstraites » sont portés physiquement sur les chromosomes. Jusqu’alors, le
comportement des chromosomes avait été suivi au cours des divisions cellulaires grâce aux progrès
du microscope optique et des techniques de coloration (chromosome = corps colorés), mais leur
fonction était inconnue. Ces chromosomes sont particulièrement visibles dans le cas des
chromosomes polytènes, présents dans les glandes salivaires des larves. Ils résultent de succession
de réplications de l’ADN sans divisions cellulaires. Les bandes observables sur ces chromosomes
“géants” ont pu être corrélées avec la présence de tels ou tels caractères héritables.

6
 *Figure 1-4. Chromosomes polytènes dans les glandes salivaires de drosophile. Ces chromosomes "géants" sont issus
d'une succession de réplications de l'ADN sans division cellulaire. Les bandes correspondent à des niveaux de
condensation différents de l'ADN. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/File%3ADrosophila_polytene_chromosomes_2.jpg

L’observation très précoce de mutants chez la drosophile a aussi favorisé son choix comme modèle
génétique. De plus, l’immense majorité des espèces animales sont des insectes comme la drosophile. Il était
donc aussi logique de l’utiliser comme un modèle important en biologie animale. Cependant, son
développement n’est pas représentatif du développement de tous les insectes.

C’est un entomologiste de Harvard, Charles Woodworth qui a été le premier à élever D. melanogaster, juste
après le début du XXème siècle. La drosophile est assez petite (donc facile à élever dans un environnement
restreint) : la femelle fait 2,5 mm de long (le mâle est légèrement plus court). Elle n’a besoin que de 9 jours
pour passer d’un œuf fécondé à un adulte à 25°C. Une femelle peut produire jusqu’à 100 œufs par jour et
jusqu’à 2000 œufs durant toute sa vie. Le développement embryonnaire est très rapide et dure entre
12 et 15 heures à 25°C puis s’ensuit le développement post-embryonnaire avec 3 stades larvaires
puis un stade nymphal. La drosophile est en effet un organisme holométabole comme tous les Diptères.
La métamorphose dure 4 jours. Le cycle de vie total dure de 10 à 11 jours, ce qui permet d’avoir
rapidement des croisements génétiques sur plusieurs générations.
*Figure 1-5. Cycle de vie de la drosophile. Instar = stade
larvaire. La métamorphose a lieu au stade pupal (=pupa)
ou stade nymphal. Source : https://www.walter-
lab.com/methods

*Figure 1-6. 3ème stade larvaire de Drosophila

melanogaster vu au microscope électronique à
balayage. Vue (A) dorsale; (B) ventrale ; (C) latérale.
Abréviations : 1 à 3 = segments thoraciques ; I–VIII =
segments abdominaux (VIII = division anale) ; as =
stigmates (entrées des trachées) abdominaux; ps =
stigmates prothoraciques ; pce = pseudotête. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S146780391200076X

Les disques imaginaux sont des structures qui se mettent en place au cours du développement
embryonnaire et qui restent internalisées durant la vie larvaire. Ils donnent naissance à des

7
structures présentes chez l'adulte. Le disque imaginal de l'aile (ou alaire) est un modèle classique en
biologie du développement.
*Figure 1-7. Disques imaginaux chez la larve de
drosophile (à gauche) et indications des structures
développées à partir d'eux chez la drosophile adulte (à
droite). Les disques imaginaux sont des structures qui
se mettent en place au cours du développement
embryonnaire et qui restent internalisées durant la vie
larvaire. Redessiné d'après Fristrom et al., 1969 .

Voir cette page sur l'élevage des drosophiles avec notamment une vidéo.

Le début du développement de la drosophile est atypique avec une succession de mitoses sans
cytodiérèse, ce qui aboutit à ce que les noyaux ne soient pas dans des cellules séparées mais
partagent un même espace cytoplasmique.
*Figure 1-8. Clivage chez un embryon de drosophile.
Les noyaux sont rendus fluorescents par la présence
d'une histone fusionnée avec la GFP. Les chiffres font
référence au cycle cellulaire. Les premières divisions
se produisent dans la région centrale et il n'y a pas de
cellularisation (pas de cytodiérèse). Au 10ème cycle
cellulaire (stade à 512 noyaux, 2 heures après la
fécondation), les cellules polaires se forment dans la
partie postérieure (et donneront les cellules
germinales). Les autres noyaux et leurs "îlots
cytoplasmiques" migrent vers la périphérie de la
cellule, générant le blastoderme syncytial. Après le
cycle 13, la membrane plasmique issue de celle de
l'ovocyte se développe et pénètre entre les noyaux
pour former le blastoderme cellulaire (qui est formé
d'environ 6.000 cellules). Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/File:Drosophila_Cleavage.jpg

Cette situation permet créer des gradients de concentration de facteurs de transcription qui peuvent
diffuser d'un noyau à un autre et avoir un comportement de morphogène. D'habitude, ce sont plutôt des
protéines sécrétées qui ont cette propriété et non des facteurs de transcription. Bien que ce soit là une
propriété peu commune chez les animaux, cela a amené de grandes avancées conceptuelles.

Ensuite, l'embryon se cellularise et subit la gastrulation.

8
 *Figure 1-9. Carte des territoires présomptifs de la drosophile juste avant la gastrulation. D'après
https://doi.org/10.1016/bs.ctdb.2019.11.004

**Figure 1-10. Internalisation de l'endoderme postérieur et des cellules germinales pendant la gastrulation de la
drosophile. Vues de la région postérieure en microscopie électronique à balayage : (A) un groupe de cellules PMG qui
sont des précurseurs de l'intestin moyen postérieur, aplatit sa surface apicale (flèche), sur laquelle reposent des
cellules polaires qui sont les cellules germinales (tête de flèche), (B) La constriction apicale des cellules PMG crée un
sillon, et (C) le PMG s'invagine à l'intérieur de l'embryon, emportant avec lui les cellules germinales. D'après
https://journals.biologists.com/dev/article/112/3/775/36837/Gastrulation-in-Drosophila-the-formation-of-the

C’est l’américain Thomas Hunt Morgan, qui a commencé à utiliser D. melanogaster comme organisme
modèle pour les études de génétique et l’a popularisé au début des années 1900.
*Figure 1-11. Thomas Hunt Morgan (1866-1945). Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Thomas_Hunt_Morgan

Morgan, jusque-là, avait fait des expériences sur divers organismes marins (pycnogonides, cténophores)
dans le but de comprendre un certain nombre de processus de développement. Il comprit qu’un modèle
comme la drosophile avec ses nombreux avantages pouvait apporter un meilleur éclairage sur le
développement tout en élucidant quelques problèmes génétiques fondamentaux. Morgan et ses collègues
ont commencé à utiliser des mutants pour fournir les preuves expérimentales de la théorie
chromosomique de l’hérédité, et ils ont conçu des méthodes de cartographie génétique qui sont
encore utilisées aujourd’hui.

9
L'un des mutants les plus célèbres découvert par Morgan est le mutant white (ou w) qui produit des
drosophiles avec les yeux blancs au lieu de la couleur rouge habituelle.

*Figure 1-12. Une drosophile porteuse de la mutation

white.
Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/White_%28mutation%29#/media/File:White-
eyed_Drosophila.jpg

Par des croisements, Morgan s'est rendu compte qu'il s'agit d'une mutation récessive et que la
transmission de ce gène est liée au sexe, ce qui l'a amené à postuler qu'il se trouve sur le
chromosome X (l'analyse de ses croisements excluait qu'il puisse se trouver sur le chromosome Y).
Bien plus tard, cela a été confirmé par séquençage du génome. La protéine codée par le gène a pu être
caractérisée : elle transporte les précurseurs des pigments rouges et bruns de la couleur des yeux, la guanine
et le tryptophane, dans les yeux en développement durant le stade nymphal (métamorphose).

Pour faire un exercice (corrigé) de génétique de la drosophile, suivre ce lien.

Le génome de la drosophile, entièrement séquencé en l’an 2000, est beaucoup plus petit que celui des
vertébrés—environ 140 millions de paires de bases, contre 3.200 millions pour un Humain (plus de 20 fois
plus !). Il est réparti sur 4 chromosomes (ou paires de chromosomes si on considère la diploïdie ; il y a 3
paires de chromosomes autosomes et une paire de chromosomes sexuels). Ce génome code environ 15 600
protéines. Sa densité génique est nettement plus importante que chez l’Homme : on compte en moyenne 80
gènes par mégabase (1 million de bases) chez la drosophile contre 6 chez l’Homme. Les mutants peuvent
désormais être obtenus pour pratiquement n’importe quel gène. Relativement à chez l'Homme, les familles
multigéniques sont assez réduites chez la drosophile, ce qui facilite les analyses fonctionnelles (peu ou pas
de redondances). On dénombre plus de 160.000 génotypes différents publiés chez la drosophile (il peut y
avoir plusieurs mutations par gène) ! Les études génétiques sont aussi facilitées par le fait qu’il n’y a
pas de crossing-over chez le mâle.

La transgénèse chez la drosophile consiste à insérer une séquence d’ADN connue dans l’ADN
chromosomique en utilisant comme vecteur un élément transposable (transposon). Ce transposon
est connu sous le nom d’élément P. Les éléments P peuvent s’insérer dans n’importe quel site du génome
et peuvent aussi se transposer d’un site à un autre dans les cellules germinales, une action qui réclame la
présence d’une enzyme appelée transposase. Comme ce mécanisme est susceptible de générer de
l’instabilité génomique, on a retiré aux éléments P servant de vecteur de transgénèse le gène codant
la transposase. La transposase nécessaire à l’insertion initiale de l’élément P est fournie par un
élément P dit « helper », qui ne peut pas s’insérer dans le génome, et est donc rapidement éliminé.
Les éléments P « vecteur » et « helper » sont injectés ensemble dans la partie postérieure de l’œuf
où se forment les cellules germinales. En plus du gène à insérer, l’élément P modifié porte un gène
marqueur tel que l’allèle sauvage du gène white. Dans ce cas, l’élément P est inséré chez des mouches
homozygotes pour l’allèle mutant white- (qui ont des yeux blancs à la place des yeux rouges habituels de la
drosophile sauvage). Les yeux rouges constituant un caractère dominant sur les yeux blancs, les mouches
chez lesquelles l’élément P a été inséré et est exprimé, auront des yeux rouges et seront ainsi facilement
repérées.

Un système basé sur la spécificité de l’activité des promoteurs et utilisant la transgénèse permet de
ne faire exprimer un gène d’intérêt ou un gène rapporteur que dans les cellules où un promoteur

10
est actif. Il s’agit du système UAS-GAL4. GAL4 est un facteur de transcription activateur de la levure qui
reconnait une séquence spécifique appelée UAS (pour Upstream Activation Sequence).
*Figure 1-13. Méthode UAS-GAL4 de
contrôle de l’expression d’un transgène
chez la drosophile. Modifié de
https://en.wikipedia.org/wiki/GAL4/

UAS_system#/media/File:Gal4UAS-System.png

Chez la drosophile, des pertes et des gains-de-fonctions peuvent être obtenus grâce au système FLP-FRT.
FLP (ou flippase) est une recombinase de levure qui est capable de recombiner deux séquences FRT (pour
Flippase Recognition Target) et de déléter les séquences qui se trouvent entre deux séquences FRT. C'est
un système similaire au système Cre-Lox utilisé chez la souris.
*Figure 1-14. Exemple de gain-de-fonction avec le
système FRT-FLP. Un promoteur de fort de tubuline-
alpha1 qui est actif dans toutes les cellules est mis en
amont de la séquence du gène rapporteur yellow
flanquée de deux séquences FRT (cercle avec tête de
flèche) suivi du gène hedgehog. Sans intervention de la
recombinase FLP, le gène yellow sera transcrit mais pas
le gène hedgehog. Si on exprime FLP (par exemple sous
le contrôle d'un promoteur spécifique d'un type
cellulaire donné), le fragment entre les deux séquences
FRT est délété et les cellules n'expriment plus yellow
mais hedgehog à la place. Source : Basler et Struhl, 1994.

L’utilisation de la drosophile comme organisme modèle a été couronné par 4 prix Nobel de Médecine :
Thomas Hunt Morgan, qui a reçu le prix Nobel de physiologie ou de médecine en 1933 pour « ses
découvertes concernant le rôle joué par le chromosome dans l’hérédité ». L’élève de Morgan, Herman J
Muller, a ensuite reçu le prix en 1946 « pour la découverte de la production de mutations par irradiation
aux rayons X ». En 1995, les chercheurs sur la drosophile, Edward B Lewis, Christiane Nüsslein-Volhard et
Eric F Wieschaus ont partagé le prix « pour leurs découvertes concernant le contrôle génétique du
développement embryonnaire précoce ». Plus récemment, Jules Hoffman a partagé le prix 2011 des «
découvertes concernant l’activation de l’immunité innée » chez la drosophile.

EN DIRECT DES LABOS :

Jules Hoffman présente ses travaux de recherche : https://youtu.be/qWK5oiblR34

11
POUR ALLER PLUS LOIN :

• Site de référence sur la drosophile : http://flybase.org/

• Atlas du développement de la drosophile :

https://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm

Caenorhabditis elegans

*Figure 1-15. Adulte hermaphrodite de Caenorhabditis

elegans. La partie antérieure est en haut et la partie
postérieure en bas à gauche. L’animal fait 1 mm de
longueur. Source : https://www.sdbcore.org/

object?ObjectID=325&SubTopicID=17

En introduction, voir une vidéo sur le développement embryonnaire de C. elegans :

https://youtu.be/M2ApXHhYbaw

aenorhabditis elegans est un Nématode, donc un Ecdysozoaire (comme la drosophile). Il

C
possède une cuticule dont la mue est contrôlée par des ecdystéroïdes. Contrairement à la
drosophile, son corps n’est pas métamérisé et il a l’aspect d’un ver rond. Avec un cycle de vie
de quelques jours seulement (dont un développement embryonnaire qui ne dure que 16
heures), une capacité à survivre dans un congélateur indéfiniment en état de vie ralentie, un plan
corporel simple, une petite taille (1 mm de long) et un cycle de vie inhabituel bien adapté aux études
génétiques, il a tout d’un organisme modèle idéal.

*Figure 1-16. Cycle de vie de Caenorhabditis elegans. Dans des conditions normales de laboratoire, C. elegans passe
par quatre stades larvaires (L1 à L4) en environ 35h, et les larves L4 muent en adultes, qui survivent pendant environ
trois semaines. Dans des conditions défavorables (faible nourriture ou surpeuplement), les larves L1 peuvent suivre
une voie alternative dauer dans laquelle elles sont capables de vivre pendant quelques mois et poursuivent un cycle
de vie normal lorsque les conditions favorables sont revenues. Source : https://www.mdpi.com/2073-
4409/10/8/1966
12
C. elegans est hermaphrodite, produisant des spermatozoïdes au stade larvaire L4 puis ensuite des ovocytes.
Il peut exister quelques mâles dans les populations, qui sont XO (alors que les hermaphrodites sont XX).

Son principal atout est son nombre restreint et précis de cellules. L’adulte de C. elegans comporte
exactement 959 cellules somatiques (et un nombre variable d’ovules et de spermatozoïdes). Parmi ces
959 cellules, il y a 302 neurones et 56 cellules gliales. C’est un degré inhabituel de précision quantitative
pour le nombre de cellules d’un animal et permet une traçabilité des lignages et une reproductibilité
des observations très importante. Cela est dû à la succession de divisions stéréotypées, au
positionnement des cellules, à l’orientation des divisions et des attributions des destinées cellulaires. Une
description minutieusement détaillée de la séquence des événements menant aux différents lignages
cellulaires et à toutes les cellules différenciées est disponible.

*Figure 1-17. Schéma des premières divisons cellulaires de C. elegans et correspondance avec les lignages cellulaires.
La première division du zygote (P0) en une cellule AB et une cellule P1 est un modèle pour comprendre les divisions
asymétriques. D'autres divisions bien sûr se succèdent pas la suite. Source :
https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/msb.20145857

**Figure 1-18. La première division cellulaire chez Caenorhabditis elegans. La première mitose est précédée d'un
pseudo-clivage pendant lequel il y a des flux de cytoplasme mettant en place la polarité de l'embryon et une
constriction au niveau du futur plan de clivage. A la fin de la mitose, la cytodiérèse produit une grosse cellule AB (à
gauche) et une petite cellule P1 (à droite). Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26177-z

L’ensemble du lignage embryonnaire de C. elegans est disponible sur ce lien :

https://www.wormatlas.org/images/embryoniclineage.jpg

Son connectome, c’est-à-dire l’ensemble des connections des neurones de son système nerveux (7.600
synapses), a été étudié depuis 1986 et est entièrement connu depuis 2019.

Des méthodes de traitement d’images se développent pour pouvoir encore mieux suivre les cellules une par
une de C. elegans, notamment dans la période tardive du développement embryonnaire et lors du
développement larvaire où les muscles de l’animal sont actifs et où il se plie et se replie sur lui-même. Voir
par exemple cette vidéo où on “déplie” virtuellement un embryon de C. elegans pour mieux apprécier
l’organisation de ses neurones (Christensen et al., 2021).

La découverte du premier effecteur animal de l’apoptose, Ced-3, a été réalisée chez Caenorhabditis
elegans en 1986 (Ellis et Horvitz, 1986, lien vers une version commentée de cet article). Cet organisme
modèle se prêtait bien à ce genre d’étude car on connaît très précisément le nombre de ses cellules à tout
stade de développement et donc une apoptose diminuée chez un mutant ne pouvait pas passer inaperçue.
13
 *Figure 1-19. Absence de mort cellulaire chez le mutant ced-
3 de C. elegans. (a) Vue en microscope à contraste
interférentiel d’une larve nouvellement éclose. Les flèches
indiquent des cellules mourantes. (b) Chez une larve mutante
ced-3 au même stade, on n’observe pas ces cellules. Les
pointes de flèches indiquent plusieurs des noyaux qui
peuvent être vus dans les deux animaux pour montrer que
l’on observe la même région, au même stade. Barre d’échelle
= 10 µm.

Source : https://els-jbsprodcdn.jbs.elsevierhealth.com/pb/

assets/raw/journals/research/cell/

libraries/annotatedclassics/ACEllis.pdf

L'un des tout premier miRNA caractérisé, Let-7 (abréviation de lethal-7), a été découvert chez C. elegans
(Reinhardt et al., 2000). Il inhibe l'expression de la protéine Ras et chez les Mammifères, il joue in rôle
important pour éviter certains cancers.

Le génome de C. elegans de 130 millions de paires de bases a été le premier génome séquencé chez
un animal (1998). Il code environ 21.000 protéines, et de nombreux mutants et autres outils sont
disponibles pour l’analyse fonctionnelle des gènes. Bien que le ver ait un plan corporel très différent du
nôtre, la conservation des mécanismes biologiques a suffi à ce que ce ver soit un modèle pour de nombreux
processus de développement et de biologie cellulaire qui se produisent dans le corps humain (divisions
asymétriques, apoptose…).

C. elegans est hermaphrodite, produisant des spermatozoïdes au stade larvaire L4 puis ensuite des ovocytes.
Il peut exister quelques mâles dans les populations, qui sont XO (alors que les hermaphrodites sont XX).

En laboratoire, on cultive C. elegans sur des plaques d’agar ensemencées avec Escherichia coli comme source
de nourriture.

POUR ALLER PLUS LOIN :

Site de référence sur Caenorhabditis elegans : https://wormbase.org//#012-34-5

14
Le poisson-zèbre

*Figure 1-20. Un poisson-zèbre. Cet adulte fait 2,5 cm

de long.
Source :

https://fr.wikipedia.org/wiki/Poisson-z%C3%A8bre#/media/Fichier:Zebrafisch.jpg

e poisson zèbre ou Danio rerio appartient à la famille des Cyprinidés et il vit dans les eaux douces de

L
l’Inde et du Bangladesh. Il est prisé des aquariophiles… et des chercheurs en biologie du
développement !

Son utilisation en recherche a été popularisé dans les années 1970 par Georges Streisinger de l’Université
d’Oregon (Etats-Unis). Le poisson-zèbre est omnivore et vit 5 ans environ en laboratoire. Son cycle de vie
est de 90 jours donc on peut avoir une nouvelle génération tous les 3 mois. Son génome a été entièrement
séquencé en 2009. Il fait 1,4 milliards de paires de bases et il y a 26.000 gènes. Le poisson-zèbre est un
outil génétique puissant et près de 30.000 allèles sont connus et répertoriés par le ZIRC (Zebrafish
International Research Center). Le poisson-zèbre a souvent 2 gènes orthologues pour chaque gène humain
à cause d'une duplication générale du génome chez les Téléostéens.

On peut faire facilement des lignées transgéniques chez le poisson zèbre. De très nombreuses lignées
rapportrices existent comme par exemple une lignée qui exprime GFP sous le contrôle des éléments de
réponse à la signalisation Wnt où se fixent LEF/TCF et que vient rejoindre la β-caténine lorsque la voie Wnt
est activée (Shimizu et al., 2012).

Son développement embryonnaire est très rapide et en 24h, une grande partie des étapes du
développement ont été franchies.

15
 *Figure 1-21. Stades du développement du
poisson-zèbre.
Source :

https://en.wikipedia.org/wiki/Zebrafish#/

media/File:Zebrafish_Developmental_Stages.tiff

Voir la vidéo sur la formation des somites chez le poisson-zèbre : https://youtu.be/RMCVdhK85mc

**Figure 1-22. Carte des territoires présomptifs du

poisson zèbre à la fin du clivage. L'embryon en tant que
tel se développe sous la forme d'un dôme posé sur le
vitellus. CNS = système nerveux central; PPE =
ectoderme pré-placodal; NC = crêtes neurales; yolk =
vitellus.
Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4562868/#!po=0.260417

16
 *Figure 1-23. Mésoderme à la fin de la gastrulation chez le poisson zèbre.
Hybridation in situ fluorescente avec des sondes qui reconnaissent l’ARNm de
tbxta (ou brachyury), un marqueur du mésoderme chordal et l’ARNm de tbx16,
un marqueur du mésoderme paraxial.
Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26486-3

Le poisson zèbre a le potentiel de régénérer complètement plusieurs organes adultes et embryonnaires,

notamment le cœur (régénération possible de 20% de cet organe), les nageoires et de nombreux
composants du système nerveux comme la rétine, ce qui peut en faire un modèle intéressant de thérapie
régénérative : il s'agirait d'activer les mêmes mécanismes chez les Mammifères (et notamment les
humains).

*Figure 1-24. Résumé des avantages du poisson-zèbre comme modèle expérimental. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcvm.2019.00107/full

POUR ALLER PLUS LOIN :

Le développement post-embryonnaire du poisson zèbre

Zebrafish International Ressource Center

Reportage sur le poisson-zèbre

Le xénope
es grenouilles ont été utilisées depuis longtemps pour étudier les premières étapes du développement

L
embryonnaire chez les vertébrés, car leurs ovocytes sont gros (1 à 2 mm de diamètre),
nombreux (500 à 800 pour la ponte d’une femelle de xénope), faciles à manipuler et fécondés à
l’extérieur de l’animal. Ainsi le développement de l’embryon précoce est facilement suivi. Leur

17
développement est rapide et sa progression peut être modulée par la température selon les besoins de
l’expérimentateur (en évitant des changements trop violents cependant, notamment lors de la gastrulation
car cela peut amener à des malformations). Le xénope se prête particulièrement bien à une approche de
criblage rapide et efficace de gènes candidats ou de traitements pharmacologiques.
*Figure 1-25. Xénope femelle en train de pondre. On
observe les ovocytes qui sont en train de sortir du
cloaque.

Vous pouvez découvrir le cycle du développement du xénope sur ce schéma interactif.

Des dessins d'observation de l'ensemble des stades de développement du xénope sont disponibles sur ce
lien.

Le xénope est un modèle où on peut très facilement voir les mouvements de la gastrulation. Vous
pouvez regarder cette vidéo de sa gastrulation et de sa neurulation. Voir la vidéo :
https://youtu.be/qisrNX3QjUg
*Figure 1-26. Un exemple de marquage de
territoire chez l’embryon de xénope pour établir
une carte des territoires présomptifs ou suivre les
mouvements de la gastrulation.
Photo : Caroline Borday et Odile Bronchain, Travaux Pratiques à
l’Université Paris-Saclay

Deux espèces de Xenopus sont utilisées dans la recherche sur le développement : X. laevis et X.
tropicalis. Chaque espèce offre des avantages spécifiques. Xenopus laevis produit de gros embryons qui sont
excellents pour la microchirurgie embryonnaire, l’analyse de la surexpression des gènes, les études
biochimiques. Il continue d’être un organisme modèle important, même s’il est peu adapté à l’analyse
génétique à cause de son allotétraploïdie.

18
De son côté, Xenopus tropicalis est un organisme diploïde qui facilite les études de perte de fonction.
Les ovocytes et les embryons de Xenopus tropicalis sont cependant plus petits que ceux de Xenopus laevis.
Le génome des xénopes a une conservation importante avec l’Homme. Celui de Xenopus tropicalis contient
des orthologues pour environ 79 % des gènes identifiés dans les maladies humaines. De plus, son génome
a un degré élevé de synténie avec le génome humain, contenant de longues régions équivalentes avec des
gènes positionnés dans un ordre conservé.

L’expression des gènes dans les embryons de xénope peut être facilement manipulée à l’aide de
microinjections d’ARNm et d’oligonucléotides morpholino antisens (MO) pour un gain ou une perte
de fonction, respectivement.
*Figure 1-27. Embryons de xénope au stade 32 cellules,
prêts à être injectés. Ils sont déposés dans un faible
volume de tampon sur un grillage en nylon pour les
stabiliser lors de l'injection. Le tampon contient du Ficoll
qui est un gros polysaccharide qui densifie le milieu et
évite que du contenu cytoplasmique ne se déverse à
l'extérieur lorsqu'on retire l'aiguille de l'embryon après
l'injection. Source : compte Twitter @ailencervino
Pour voir une vidéo d’injection, voir
https://youtu.be/us2WHFBnhNk

Les morpholino antisens (MO) sont conçus pour cibler soit le site de départ de la traduction (le codon
d’intiation AUG), soit un site d’épissage du transcrit primaire de l’ARNm cible.

19
 *Figure 1-28. Morpholino lié à une séquence d’ARN.
Un morpholino (MO) est normalement plus long et
fait 25 bases. Source : https://www.sdbcore.org/

object?ObjectID=268&SubTopicID=20

*Figure 1-29. Exemple d'utilisation de morpholino (MO).

Un morpholino (MO) antisens inhibant l'expression de
Pax3 est injecté dans un blastomère d'un embryon de
xénope au stade 2 cellules. On injecte également l'ARNm
qui code la β-galactosidase. On laisse se développer
l'embryon jusqu'au stade désiré (ici neurula), on le fixe, on
révèle l'activité de la β-galactosidase avec du RedGal
(points rouges) pour savoir de quel côté de l'embryon se
trouvent les cellules issues du blastomère injecté puis on le
traite en hybridation in situ avec une sonde reconnaissant
l'ARNm du gène Ak3 (marquage bleu). On constate que
l'expression du gène Ak3 est diminuée du côté injecté par
le MO anti-Pax3, montrant que (directement ou
indirectement) Pax3 est nécessaire à la bonne expression
de ce gène. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160613006568

Un autre avantage majeur de l’utilisation de Xenopus pour étudier le développement est la capacité de
générer des animaux transgéniques. L’incorporation d’ADN exogène dans le génome d’un zygote a été
développée chez Xenopus tropicalis et Xenopus laevis à la fin des années 1990. Lorsqu’il correspond à un
rapporteur fluorescent comme la GFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique, l’expression d’un
transgène peut être surveillée au fil du temps dans un embryon vivant en développement. Des lignées
rapportrices, par exemple de l’activité d’une voie de signalisation, peuvent être étudiées. Une activation
transgénique inductible peut en plus fournir une expression spatio-temporelle contrôlée.

En plus des méthodes perte- et gain-de-fonction efficaces et peu coûteuses, Xenopus présente des avantages
pour l’analyse comparative des structures. En effet, l’injection d’une seule cellule de l’embryon à deux
cellules peut cibler le côté gauche ou droit de l’embryon. En utilisant des traceurs fluorescents (GFP) ou
enzymatiques (β-galactosidase), on peut facilement détecter le côté injecté de l’embryon et le comparer au
côté non injecté. De telles manipulations sont très utiles car elles fournissent un contrôle interne chez le
même animal pour chaque expérience. En plus de l’injection au stade 2 cellules, les embryons de xénope ont
une carte du destin cellulaire bien définie pour chaque système organique. Cela permet des injections
ciblées, où l’expression des gènes peut être modifiée dans des organes ou des tissus spécifiques.

20
Les embryons de xénope et notamment de Xenopus laevis qui sont plus gros se prêtent très bien à
des expériences de microchirurgie embryonnaire. Fait important, parce que les premiers stades de
clivage sont holoblastiques (par opposition aux clivages méroblastiques chez les embryons de poule ou de
poisson zèbre), le vitellus (réserves énergétiques) est distribué à toutes les cellules, de sorte que les explants
ne nécessitent aucune nutrition supplémentaire car ils peuvent survivre en utilisant les nutriments stockés
dans les cellules. Le tissu disséqué se développe et se différencie dans une simple solution saline. Le xénope
est aussi utile pour produire des cultures cellulaires de cellules pluripotentes : les cellules de la calotte (ou
coiffe) animale, prélevées sur des blastulas. Sans intervention, ces cellules finissent par se développer en
petits organoïdes épidermiques. Mais en présence de différents ligands et avec des combinaisons
d’expression de gènes (induites par des injections d’ARNm dans l’embryon précoce au préalable), ces
cellules peuvent aussi donner des tissus neuraux, des cellules de crêtes neurales, des cellules
mésodermiques ou endodermiques.

EN DIRECT DES LABOS :

Un exemple de laboratoire utilisant le xénope : https://youtu.be/1xCOAx9ljWQ

POUR ALLER PLUS LOIN :

• Site de référence : Xenbase

Le poulet
La poule est un modèle accessible et ancien de la biologie du développement. Aristote (384-322 avant JC)
avait brièvement décrit son développement. Marcello Malpighi (1628-1694) a publié le premier compte
rendu microscopique de son développement en 1672.

*Figure 1-30. Dessins d’embryons de poule de Malpighi.

C’est dans un embryon de poule que l’embryologiste russe Pander a décrit pour la première fois les trois
feuillets (ectoderme, mésoderme et endoderme) au début du XIXème siècle.

La maturité sexuelle de la poule est atteinte 17 semaines après l’éclosion. Bien que les voies génitales et les
ovaires se forment des deux côtés au cours du développement embryonnaire, ceux de droite dégénèrent ne
laissant qu’un appareil reproducteur complet à gauche.

La poule domestique réalise une ponte par jour presque tout au long de l’année, un processus issu de la
sélection artificielle par l’Homme au cours de sa domestication. Les oiseaux sauvages ne pourraient se payer
le luxe de perdre ainsi chaque jour des réserves précieuses alors qu’il n’y aura pas de fécondation dans la
majorité des cas !

Les premières phases du développement de la poule sont relativement inaccessibles car elles ont
lieu avant la ponte durant le trajet de l’embryon dans les voies génitales femelles alors que les

21
enveloppes de l’œuf se déposent autour de lui (blanc d’œuf, membranes coquillères et coquille
calcaire). Lorsque l’œuf est pondu, 24 heures après la fécondation, l’embryon commence sa
gastrulation.

**Figure 1-31. Développement interne de l'embryon de poule avant la ponte. L'appareil génital de la poule est
représenté (partie antérieure à gauche, partie postérieure à droite) avec le nom de ses différents segments. Les
ovocytes (appelés ici F1) sont ovulés puis fécondés par les spermatozoïdes du coq dans l'infundibulum. Ensuite, le
zygote descend les voies génitales et les différentes couches et enveloppes de l'œuf se déposent autour de lui, tandis
qu'il réalise son clivage. Les temps indiqués en haut sont ceux de la durée pendant laquelle l'embryon reste dans la
portion donnée de l'appareil génital (la durée la plus longue est de 20h lors de la dernière phase, celle de la formation
et du dépôt de la coquille calcaire). Les temps indiqués en bas correspondent au temps à partir de la fécondation. Les
stades indiqués sont ceux définis par Eyal-Giladi et Kochav. Lorsque l'œuf est pondu, 24-25h après la fécondation, il
entame sa gastrulation. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/145/6/dev157453/48860/The-transcriptome-of-early-chicken-embryos-reveals

*Figure 1-32. Observation d'un embryon de poule après

3 jours d'incubation dans l'œuf après injection d'encre
de Chine sous l'embryon. Pour faciliter l'observation de
l'embryon qui est naturellement peu visible car quasi-
transparent sur le fond jaune du vitellus, on peut injecter
de l'encre de Chine sous l'embryon grâce à une seringue.
Ici, on peut observer les vésicules céphaliques, le cœur
(bien rouge) qui forme un tube enroulé qui parait à
l'extérieur du corps de l'embryon. Dans la partie
postérieure, en bas, on voit le tube neural (trait vertical
blanc) bordé de chaque côté par des somites (cubes
blancs). L'embryon est naturellement "tordu" dans l'œuf
: la partie antérieure est en vue latérale droite, tandis que
la partie postérieure est en vue dorsale.

22
 *Figure 1-33. Dessin d'observation légendé d'un
embryon de poulet de 3 jours d'incubation.

Les chimères caille-poulet

Pour faire des suivis de lignages chez l’embryon de poulet, on peut utiliser la technique de greffe
caille-poulet mise au point par Nicole Le Douarin en 1968.
*Figure 1-34. Nicole Le Douarin (1930-).
Source : https://embryo.asu.edu/pages/nicole-marthe-le-douarin-
1930

Les deux espèces, très proches, ont des développements similaires. On greffe généralement des
tissus de caille (donneur) sur un embryon de poulet (receveur), ce qui engendre des chimères
parfaitement viables. On peut ensuite suivre le devenir des cellules greffées grâce à un
immunomarquage avec un anticorps anti-QCPN (Quail but not Chicken PeriNuclear) qui reconnaît
un épitope spécifique de caille. La figure 1-35 présente un exemple d’utilisation.

*Figure 1-35a. On prélève un somite chez un embryon

de caille de 2 jours et on le greffe sur un embryon de
poulet du même stade à la place du somite
correspondant. Il en résulte un embryon chimère caille-
poulet.

23
 *Figure 1-35b. Coupe transversale d’un embryon chimère caille-poulet, 5 jours après la greffe de somite de caille
réalisée selon le protocole présenté sur la figure 1-35a. La coupe a été immunomarquée à l’aide d’un anticorps anti-
QCPN. Ce dernier a ensuite été révélé avec un anticorps secondaire couplé à une enzyme qui donne une coloration
brune en présence de son substrat. La vertèbre visible sur la coupe a été colorée au bleu d’alcian (un colorant qui
marque les tissus cartilagineux). L’image de gauche correspond à la partie centrale de la coupe transversale. Celle de
droite est un agrandissement de la périphérie de la coupe pour voir la peau. Photo : Patrick Pla, Université Paris-
Saclay.

Autres techniques
L'embryon de poulet est un mauvais modèle génétique mais on peut réaliser des électroporations
in ovo de vecteurs d'expression ou de siARN injectés au préalable dans la lumière du tube neural.
Les cellules de la moitié (par exemple la moitié droite) du tube neural sont transfectées et les
cellules de l'autre côté servent de témoin.

*Figure 1-36. Exemple de résultats d'électroporation dans le tube neural d'un embryon de poulet. Deux plasmides
ont été électroporés après injection dans la lumière du tube digestif : un plasmide permettant d'exprimer la protéine
chimérique H2B-RFP pour marquer les noyaux de toutes les cellules électroporées en rouge (H2B est une histone)
et un autre plasmide permettant d'exprimer la GFP dans les cellules qui répondent à la voie de signalisation BMP
(BRE-tk-GFP). On constate qu'un seul côté du tube neural est électroporé (l'ADN étant attiré par l'électrode (+), il ne
se déplace et ne pénètre dans les cellules du tube neural que d'un côté). Les cellules où la voie BMP est activée se
trouvent à l'extrémité dorsale du tube neural et certaines sont sorties de ce tube et ont commencé à migrer (cellules
de crêtes neurales). Source : https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/dneu.22099

Dans l'œuf, l'embryon produit des prolongements, appelés annexes embryonnaires qui lui
permettent d'assurer ses fonctions vitales (alimentation, respiration, excrétion...) et d'éviter la
dessiccation.
24
 *Figure 1-37. Les annexes embryonnaires de la poule. La vésicule vitelline est formée d'endoderme et de mésoderme
(splanchnopleure) extraembryonnaires et est vascularisée. Elle permet à l'embryon de récupérer les réserves du
vitellus. La cavité amniotique est bordée de l'amnios (ectoderme + mésoderme (somatopleure) extra-
embryonnaires). Elle reconstitue un environnement liquide autour de l'embryon, diminue les adhérences aux tissus
voisins et permet d'absorber les éventuels chocs. L'allantoïde est formée d'endoderme et de mésoderme
(splanchnopleure) extraembryonnaires. Elle sert de rein d'accumulation (excrétion d'acide urique) et s'accole au
chorion et se vascularise pour former l'allanto-chorion contre la coquille poreuse qui permet la respiration.

Les annexes embryonnaires du poulet peuvent également servir, par exemple dans le test de la membrane
chorioallantoïdienne utilisé en cancérologie pour tester le caractère métastatique de cellules tumorales.

**Figure 1-38. Test de la membrane chorio-allantoïdienne. Des cellules (le plus souvent tumorales, représentées en
vert) sont déposées à la surface de la membrane chorio-allantoïdienne (CAM), une annexe embryonnaire richement
vascularisée, plaquée contre la coquille et qui assure l'approvisionnement en O2. Si les cellules tumorales produisent
des métastases, elles vont pénétrer dans les vaisseaux sanguins et envahir de la membrane chorio-allantoïdienne
éloignée du site du dépôt des cellules et aussi des tissus de l'embryon, notamment le foie (liver) et les poumons
(lungs). Source : https://www.mdpi.com/2072-6694/11/10/1499/htm

POUR ALLER PLUS LOIN :

Un site où on peut explorer avec des coupes sérielles divers stades de développement de l’embryon de
poule : http://www.tulane.edu/~embryo/33hrchick/33hrChick.htm
25
Atlas de profils de patrons d'expression de gènes chez l'embryon de poule

La souris

*Figure 1-39. Dissection d'une femelle gestante où on

observe 16 embryons implantés dans les cornes
utérines (remarquez l'abondante vascularisation liée à
l'importance des échanges foeto-maternels au niveau
du placenta). Photo : Hélène Vincent-Schneider
(Préparation à l'Agrégation SVTU, Université Paris-
Saclay)

a souris domestique (Mus musculus) est un excellent modèle mammifère pour étudier une

L
grande variété de caractères et de maladies, notamment ceux impliqués dans le
développement. Néanmoins, il ne faut pas oublier que le dernier ancêtre commun entre la souris et
l'Homme a vécu il y a environ 75 millions d'années, ce qui implique que ce qui est découvert chez la
souris ne s'appliquera pas forcément à l'Homme.

L’introduction de la souris comme modèle en génétique date du début du XX ème siècle, à la même époque
que pour la drosophile. Dans une série d’articles de 1902 à 1905, Lucien Cuénot a utilisé des souris pour
démontrer les lois de Mendel pour la première fois chez les mammifères. À peu près à la même période,
William E Castle, un pionnier de l’utilisation de la drosophile pour étudier la génétique, a également
commencé à étudier l’hérédité en utilisant comme phénotype la couleur du pelage chez la souris. Abbie
Lathrop, institutrice à la retraite à Granby (Massachusetts, États-Unis) avait commencé quelques années
plus tôt à élever des souris comme animaux de compagnie, en utilisant des souris achetées à d’autres
amateurs et à sélectionner des couleurs de pelage particulières.

Pour faire un exercice de génétique (corrigé) sur la couleur du pelage de la souris, suivre ce lien.

Le laboratoire de Castle ainsi que d’autres ont lancé des programmes de recherche axés sur la génétique de
la souris et ont rapidement réalisé la nécessité de créer des souches consanguines. En 1909, la première
souche consanguine, DBA, a été créée et l’ère de la génétique de la souris moderne a commencé. Depuis lors,
des centaines de souches consanguines ont été développées.

En 1929, CC Little a fondé le Roscoe B Jackson Memorial Laboratory, qui possède désormais le plus grand
choix de lignées de souris au monde (plus de 8000 !) Parmi les autres fournisseurs importants figurent
Charles River Laboratories, Harlan Laboratories et Taconic Farms, Inc., entre autres. Des lignées d'origine
"naturelles" sont à la disposition des chercheurs mais aussi et surtout des lignées générées par différentes
techniques de transgénèse et de mutations dirigées (voir plus loin).

La souris est un excellent modèle pour étudier les étapes précoces du développement (clivage) et
les étapes post-gastrulation.

26
 *Figure 1-40. Clivage chez la souris et
détermination des premiers lignages. A
E3,5, l’ensemble épiblaste/endoderme
primitif s’appelle la masse cellulaire
interne.
D’après https://www.nature.com/articles/ncomms6667

Pour la période juste après l'implantation correspondant à la gastrulation, les embryons ont une
taille et une topologie qui les rend difficiles à étudier dans l'utérus. Des techniques récentes de
culture d'embryons in vitro ont permis de faire se développer des embryons de souris jusqu'à 11
jours après fécondation soit jusqu'à l'organogenèse ! (Aguilera-Castrejon et al., 2021).

Voir la vidéo : https://youtu.be/aLFD2Yund5g

Transgénèse chez la souris

Par traitement hormonal, on fait superovuler des souris femelles puis on les accouple avec un mâle. Les
zygotes sont rapidement récupérés dans les voies génitales puis incubés in vitro. L’ADN d’intérêt, souvent
un gène sous le contrôle d’un promoteur spécifique est injecté dans le pronucléus mâle. Puis on
sélectionne les embryons qui ont poursuivi correctement leur développement et on les injecte dans l’utérus
d’une femelle pseudo-gestante (la copulation provoque des stimuli mécaniques nécessaires au bon
développement de l’utérus pour la gestation alors la femelle est préalablement accouplée avec un mâle
vasectomisé). Les souriceaux nés doivent ensuite être sélectionnés pour la présence et l’expression
du transgène. En effet, l’insertion du transgène dans le génome ne réussit pas à chaque fois et le
transgène peut aussi très bien s’être inséré dans de l’hétérochromatine silencieuse. On effectue une
RT-PCR ou alors un test qui permet de révéler l’expression d’un gène rapporteur s’il est présent dans le
transgène (par exemple, coloration X-gal si on a mis le gène de la β-galactosidase). De toute manière, il faut
toujours étudier plusieurs lignées transgéniques car l’ADN exogène s’insérant n’importe où au hasard
dans le génome, il faut vérifier que le phénotype observé n’est pas provoqué par la mutation créée
au point d’insertion mais bien par l’information du transgène lui-même.

La figure 1-41 présente un exemple d’application.

27
 *Figure 1-41. Conséquence de la délétion d’un silencer
sur l’expression d’un gène rapporteur. Le gène
rapporteur LacZ a été mis sous le contrôle de séquences
régulatrices du gène codant L1-CAM, une protéine
d’adhérence importante pour la croissance des axones.
La construction incorporée dans la lignée transgénique
en I est la même que celle en D à l’exception de la délétion
d’une séquence d’une trentaine de paires de bases
appelée NRSE. Les embryons de souris ont été sacrifiés à
E11,5, fixés et colorés dans du X-gal. On observe qu’en
absence de NRSE, LacZ est nettement plus exprimé
signant la présence d’un silencer dans NRSE. bw = paroi
du corps; cg = ganglions crâniens ; cm = mésenchyme
céphalique ; de = ectoderme dorsal ; drg = ganglions de
la racine dorsale ; sc = chaîne nerveuse sympathique ; t =
télencéphale ; tg = ganglion trijumeau.

Barre d’échelle = 1 mm. Source :

https://rupress.org/jcb/article-
pdf/138/6/1343/1273097/32824.pdf

Technique de knock-out et CRISPR/Cas9

*Figure 1-42. Introduction des mutations

knock-out ou knock-in dans des souris. La
mutation par recombinaison homologue
est réalisée dans des cellules ES
(embryonnaires souches) pluripotentes.
Ces cellules sont injectées dans la masse
cellulaire interne de blastocyste sauvage et
l'embryon chimérique ainsi généré est
transféré dans une mère porteuse. On
obtient des souriceaux chimériques et
certains d'entre eux ont leur lignée
germinale formée à partir des cellules
mutées (descendantes des cellules ES
injectées dans les blastocystes). On croise
ces souris avec des souris normales. A la
génération suivante, la moitié des souris
aura toutes leurs cellules hétérozygotes
pour la mutation. On croise alors ces souris
entre elles et un quart de leur descendance
sera homozygote pour la mutation
introduite. D'après
https://www.genome.gov/about-genomics/fact-
sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet

28
 **Figure 1-43. Comparaison de la technique classique du knock-out/knock-in et de la technique CRISPR/Cas9 pour
introduire une mutation chez la souris. a) Génération d’allèles knock-out et knock-in à l’aide de la technologie des
cellules souches embryonnaires (ES) chez la souris. Un clonage est nécessaire pour insérer dans un vecteur
plasmidique la construction qui va remplacer le locus endogène. Ces vecteurs contiennent une cassette de sélection
positive et négative. Le plasmide est ensuite électroporé dans les cellules ES puis il y a une sélection. Après
vérification de la bonne insertion de la séquence, les cellules sont injectées dans un blastocyste, qui est ensuite
transféré dans une femelle pseudogestante. Les descendants chimériques sont génotypés pour s’assurer que la
construction attendue est correctement insérée dans le génome par recombinaison homologue. Les souris chimères
devront se reproduire avec une souris sauvage pour produire des souris hétérozygotes qui, croisées entre elles,
permettront de donner les mutants homozygotes. b) Génération d’allèles complexes à l’aide d’une édition améliorée
du génome via la technologie d’administration d’acide nucléique dans l’oviducte (i-GONAD). Un ou deux ARN guide
(sgRNA) sont conçus pour soit perturber un exon critique (knockout), soit supprimer un exon entier pour le
remplacer par une séquence au choix (knockin). Les sgRNA sont synthétisés, ou transcrits in vitro, puis complexés
avec le tracrRNA puis la protéine Cas9 pour former un complexe ribonucléoprotéique (RNP). Les RNP sont
électroporés in situ dans l’oviducte d’une femelle gravide avec un long ADN simple brin qui servira de matrice à la
réparation (ssODN). Les descendances sont génotypées pour vérifier l’édition réussie du gène d’intérêt. La deuxième
procédure est nettement moins couteuse et nettement moins longue.

Source : https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-018-1409-1

Le système Cre-Lox
Les knock-out abolissent la fonctionnalité d'un gène depuis le début de son expression. Or parfois un gène
peut avoir plusieurs fonctions successives à différents moments du développement. S'il a un rôle vital à une
phase précoce du développement, un knock-out ne permettra pas de connaître sa fonction à des phases
tardives. Le système Cre-Lox a permis de franchir cet obstacle en rendant possible une délétion d'un gène
contrôlée spatio-temporellement au cours du développement.

La recombinase Cre est une endonucléase du bactériophage P1 qui est capable d'exciser de l'ADN toutes
séquences entre deux sites de quelques nucléotides appelés LoxP (plus précisément, les séquences LoxP
sont constituées de 2 séquences inversées de 13 paires de bases séparées par 8 paires de bases). Ainsi, on
peut créer une souris transgénique exprimant la Cre sous certaines conditions :

• sous le contrôle d'un promoteur spécifique dont on connait l'activité spatio-temporelle

• activable par une injection de tamoxifène (analogue des œstrogènes) pour une forme de la Cre liée
au domaine de fixation du ligand du récepteur aux œstrogènes. Pour le développement
embryonnaire, le tamoxifène peut être injecté dans la mère et traverse le placenta pour activer la
Cre dans l'embryon

• On peut combiner les deux approches précédentes.

29
On doit ensuite croiser la souris transgénique exprimant Cre de manière contrôlée avec une souris knock-
in où les allèles endogènes ont été remplacés par des allèles flanqués de 2 séquences LoxP (on dit que l'allèle
a été floxé). Le gène sera délété uniquement lorsque la Cre sera présente et fonctionnelle.

**Figure 1-44. Système Cre-Lox. Ici, l'activation de la Cre par un promoteur spécifique provoque la délétion d'un gène
mais permet l'expression de la eGFP (une forme de la GFP à la fluorescence renforcée). En effet, dans la souris knock-
in en haut à droite, la eGFP ne peut être exprimée car il y a un codon STOP entre le gène ciblé et elle. Grâce à l'action
de la Cre dans les cellules où elle est exprimée dans les souris F1, non seulement le gène cible mais aussi ce codon
STOP est éliminé. Cette méthode permet de repérer par fluorescence les cellules où le gène cible a été délété et de
suivre leur devenir. Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Cre-
Lox_recombination#/media/File:CreLoxP_experiment.png

Le système Cre-Lox peut aussi être utilisé pour faire du suivi de lignage cellulaire. L’activation d’un
promoteur donné dirige l’expression de la Cre qui va permettre la délétion d’une séquence générant un
codon STOP qui empêche la production d’une protéine rapportrice fonctionnelle. Toutes les cellules qui ont
activé le promoteur et aussi ses descendantes vont alors exprimer la protéine rapportrice. Cela est valable
y compris pour les cellules où l’activité du promoteur se sera éteinte car la délétion de la séquence générant
un codon STOP est définitive et donc une expression transitoire de la Cre suffit.

30
 **Figure 1-45. Suivi de lignage cellulaire chez la souris
grâce au système Cre-Lox. Le gène codant la recombinase
Cre est sous le contrôle d'un promoteur spécifique qui
restreint l'expression de Cre à un lignage particulier.
Quand Cre est présente, elle permet la délétion d'une
séquence entre deux sites LoxP générant un codon STOP.
La protéine rapportrice GFP peut alors être exprimée. La
cellule où la délétion a eu lieu et toutes ses descendantes
expriment la GFP (même si le promoteur qui a
initialement permis l'expression de Cre s'éteint entre
temps car la délétion est définitive).

De plus en plus d'études transcriptomiques

Le développement chez la souris, comme dans d'autres modèles, est de plus en plus étudié à l'échelle
transcriptomique et cellulaire par scRNAseq (analyse transcriptomique sur cellules isolées). Des lignages
basés sur la compilation de plusieurs études à différents stades ont pu être établis (Qiu et al., 2022).

***Figure 1-46. Lignages de la souris entre E3,5 et E13,5 déduits des études de transcriptomiques sur cellules isolées
(scRNAseq). Source : https://www.nature.com/articles/s41588-022-01018-x

POUR ALLER PLUS LOIN :

31
 • The Jackson Laboratory et ses plus de 8000 lignées de souris : https://www.jax.org/jax-mice-and-
services

• Atlas des stades de l’embryogenèse de la souris :

https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html

Des modèles moins classiques

es modèles “classiques” (drosophile, poulet, xénope, souris…) ont été choisis pour des raisons

L
historiques et pratiques mais il faut parfois se garder de généraliser ce qui a été découvert chez
eux. Par exemple, la mise en place de l’axe antéro-postérieur de la drosophile est un cas très
particulier parmi les Insectes. La compréhension de la diversité du vivant et la mise en pratique
d’approches évo-dévo (lien entre la biologie du développement et l’évolution des organismes)
nécessite une diversité d’organismes à étudier. En voici quelques-uns et c’est bien entendu une liste non
exhaustive.

Nematostella vectensis (Cnidaires)

*Figure 1-47. Nematostella vectensis ou anémone étoilée.

C’est une espèce originaire de la côte est des Etats-Unis
mais elle s’est aussi implantée au sud de l’Angleterre.
L'animal mesure 1 à 6 cm et présente 12 à 16 tentacules
autour de la cavité orale. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Nematostella_vectensis#/

media/Fichier:Nematostella_vectensis.JPG

*Figure 1-48. Développement de Nematostella vectensis. L'étoile marque la région orale. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-018-04184-x

Les Cnidaires sont des organismes à deux feuillets embryonnaires (pas de mésoderme) et à symétrie
radiaire (mais avec une symétrie bilatérale résiduelle chez des Anthozoaires comme les anémones de mer
et Nematostella).

32
 *Figure 1-49. Place des Cnidaires dans la phylogénie et phylogénie interne des Cnidaires. Nematostella vectensis est
un Anthozoaire donc il n'a pas de stade méduse. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/131/10/2463/42408/Investigating-the-origins-of-triploblasty

Ils sont surtout étudiés pour la mise en place de leur axe de polarité oral-aboral qui présente des similitudes
avec l’axe antéro-postérieur des Bilatériens (notamment l’expression des gènes orthologues aux gènes Hox
mais pas seulement) et pour leur capacité de régénération. Les Cnidaires expriment aussi Brachyury qui est
un marqueur important du mésoderme chez les Bilatériens alors même que chez les Cnidaires, il n’y a pas
de mésoderme. Chez Nematostella vectensis, il marque la région orale.
*Figure 1-50. Mise en place de l’axe oral-aboral au cours
de la gastrulation de Nematostella vectensis (24 h après
la fécondation). Hybridation in situ permettant de suivre
l’expression de Brachyury (Bra), Wnt2 et Six3/6. Les
astérisques indiquent le blastopore. Barre d’échelle :
100 µm.

Source : https://www.nature.com/articles/s41467-
021-24346-8

***Figure 1-51. La comparaison du réseau de régulation génique de mise en place de l’axe principal chez l’oursin (en
haut) et Nematostella (en bas) montre des similitudes claires. Œuf non fécondé avec ARNm maternel Fz5/8 et SoxB1
(futurs marqueurs antérieurs/aboraux) et protéine Dishevelled (Dsh) maternelle localisée au pôle où débutera la
gastrulation. Lors de l’activation de la signalisation β-caténine dans l’embryon, d’abord dans le domaine
endomésodermique puis dans l’ectoderme postérieur/oral, l’expression de Fz5/8 et SoxB1 est supprimée, et les
marqueurs antérieurs/aboraux (notamment les gènes zygotiques Six3/6 et FoxQ2) deviennent progressivement
confinés d’un côté de l’axe. L’axe devient régionalisé par des facteurs de transcription mutuellement répressifs. Le «
T » gris de Nematostella indique des interactions répressives, pour lesquelles les facteurs de transcription candidats
33
 ne sont pas connus. Les triangles avec un β désignent la direction du gradient de signalisation de la β-caténine. Source
: https://www.nature.com/articles/s41467-021-24346-8

Le séquençage complet de cette espèce a été réalisée en 2007 (Putnam et al., 2007).

Platynereis dumerilii (Annélides)

*Figure 1-52. Larve métatrochophore de Platynereis

dumerilii en train de réaliser sa métamorphose. Des
segments sont ajoutés progressivement par l'arrière
permettant à l'animal d'être métamérisé. Le segment 0 et
le pygidium ne sont pas des métamères, car pas de
cavités cœlomiques à l'intérieur. Source :
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.08.21.260984v2.full

Platynereis dumerilii est un Annélide Polychète qui vit à proximité des côtes dans les mers et océans
tempérés et tropicaux. L'adulte est long de 2 à 4 cm (les mâles sont plus courts). Son développement
embryonnaire dure 24 heures (avec notamment une phase de clivage de type spiral) et aboutit à la
production d'une larve trochophore qui commence sa métamorphose 48 heures après la fécondation.

Voir les stades de développement de Platynereis.

Cet animal est devenu le modèle principal d'Annélide étudié. En tant qu'organisme segmenté en métamères
comme les Arthropodes et les Vertébrés, son étude présente de nombreux intérêts pour comprendre
l'origine de la métamérie chez les Bilatériens. Son étude permet ainsi de mieux reconstituer les
caractéristiques d'Urbilateria, l'ancêtre commun de tous les Bilatériens. Platynereis est aussi étudié pour
ses capacités importantes de régénération.

Tribolium (Insecte)
Il s’agit du ver de farine, un insecte dit ravageur, de la famille des Coléoptères et dont la larve peut s’attaquer
à des stocks de farine.
*Figure 1-53. Tribolium confusum en vue dorsale.

Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Tribolium_confusum#/

media/Fichier:Tribolium.confusum.jpg

Tribolium constitue un excellent modèle alternatif d’insecte à la drosophile. Son génome a été séquencé en
2008 (Tribolium Genome Sequencing Consortium, 2008). Le développement des segments de Tribolium se
fait par croissance postérieure et non pas directement sur toute la longueur du corps comme chez la
drosophile qui constitue plutôt une exception parmi les Insectes. Ainsi, certains processus de
développement de Tribolium sont plus représentatifs et comparables à ceux des mammifères (Schroder et

34
al., 2008). Les gènes ancestraux impliqués dans la communication entre les cellules et exprimés dans la zone
de croissance pour l’extension de l’axe antéro-postérieur lors du développement font de Tribolium une
espèce idéale pour étudier l’évolution du développement, notamment la spécification des segments (Von
Dassow et al., 2000).
*Figure 1-54. Comparaison entre la mise en place de l’axe
antéro-postérieur entre la drosophile et Tribolium.

D’après https://www.sdbcore.org/object?ObjectID=318

Il n’y a pas de bicoid chez Tribolium. La région antérieure est spécifiée à la place par une interaction
synergique entre hunchback et orthodenticle (Schröder, 2003).

Voir aussi : https://planet-vie.ens.fr/thematiques/manipulations-en-svt/le-petit-ver-de-farine-tribolium-

castaneum-elevage-et-utilisations

L’oursin (Echinoderme)
Les Echinodermes tels que les oursins ou les étoiles de mer sont des Deutérostomiens (le blastopore
donne l'anus, la bouche se forme secondairement) et sont donc plus proches évolutivement des
Vertébrés que les Arthropodes.

Plusieurs espèces d’oursins sont étudiées en laboratoire : Strongylocentrotus purpuratus (l’oursin pourpre)
qui vit sur les côtes américaines et Paracentrotus lividus qui vit en Mer Méditerranée.
*Figure 1-55. Paracentrotus lividus.

Photo : Frédéric Ducarme.

Source :

https://fr.wikipedia.org/wiki/Paracentrotus_lividus#/

media/Fichier:Paracentrotus_lividus_Banyuls_2.jpg

35
 *Figure 1-56a. Cycle de Strongylocentrotus purpuratus.

Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2020.627259/full

Figure 1-56b. A : vue latérale. B : vue du pôle végétatif d’une gastrula. On voit au centre, coupé transversalement,
l’endoderme en train de s’invaginer. C : vue latérale d’une larve pluteus. Source :
https://elifesciences.org/articles/04664

L’oursin est un modèle très classique pour étudier la fécondation.

Vidéo (sans son) sur la réalisation de la fécondation de l'oursin en laboratoire :

https://www.youtube.com/watch?v=dTMcOp_rn8o

L’oursin présente un certain nombre de différences avec la fécondation des Mammifères. Par exemple, la
méiose est terminée au moment de l’entrée du spermatozoïde, donc il y a un véritable stade ovule alors que
chez les Mammifères, ce stade n’existe pas en réalité (la fécondation concerne un ovocyte bloqué en
métaphase II). Également, après la réaction acrosomale, des microfilaments d’actine se polymérisent dans
le spermatozoïde pour former la protubérance acrosomiale chez l’oursin, ce qui n’a pas lieu chez les
Mammifères. Signalons que l'ovocyte (et l'ovule) de l'oursin est oligolécithe. Il possède un peu de
réserves énergétiques (en contraste avec l'ovocyte des Mammifères (en dehors des Monotrèmes)
qui n'ont quasiment aucune réserve énergétique (ovocyte alécithe)).

C’est également un bon modèle pour étudier la détermination (et la non-détermination) cellulaire. En 1892,
Hans Driesch a montré qu’en séparant les 4 premiers blastomères de l’oursin, on pouvait obtenir 4 larves,
plus petites qu’habituellement, mais assez bien formées. Cela démontrait la totipotence de ces cellules et
aussi les capacités de régulation importantes des embryons à ce stade.

36
 *Figure 1-57. Expérience de Driesch montrant la
totipotence des premiers blastomères de l'oursin. Cette
expérience (aussi faite par Sven Hörstadius) a permis de
montrer que le développement de type mosaïque
comme chez l'ascidie où le destin des différentes cellules
est pré-déterminé n'était pas une généralité. Source

Les expériences de Boveri sur des embryons d’oursins en 1901 ont montré que les modèles de
développement pouvaient être déterminés par des gradients opposés.

Le génome de Strongylocentrotus purpuratus a été entièrement séquencé : il est quatre fois plus compact
(800 millions de pb) que celui de l’Homme pour environ un même nombre de gènes (33.491 gènes) (Sea
Urchin Sequencing Consortium, 2006).

L’oursin est bien adapté à l’étude des réseaux de régulation génique.

***Figure 1-58. Réseaux de régulation géniques pour la mise en place de l’axe dorso-ventral de l’oursin.

Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2016.00016/full

37
 ***Figure 1-59. Spécification des feuillets et de certains lignages lors du développement précoce de l’oursin. Le temps
de développement est décrit en heures post-fécondation selon le taux de développement de l’oursin violet, S.
purpuratus. (A) Schéma de la lignée cellulaire de l’endomésoderme de l’oursin. (B) Schéma de nucléarisation de la β-
caténine, le vert foncé indique une concentration élevée, le vert clair une concentration faible. (C) Profils d’expression
spatio-temporels des gènes de contrôle de l’endoderme. (D) Modèle de réseau de régulation génique endodermique
partiel décrivant le commutateur Tcf/βcaténine-Tcf/Groucho et les interactions régulatrices au sein des gènes
endodermiques. (E) Expression spatio-temporelle du ligand Delta. (F) Expression spatio-temporelle des gènes
mésodermiques non squelettiques. (G) Modèle de réseau de régulation génique de la triple boucle de rétroaction
positive que la réception de Delta active dans les cellules non squelettiques.

Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2016.00016/full

POUR ALLER PLUS LOIN :

• Site de référence sur l’oursin : http://legacy.echinobase.org/Echinobase/

• Pour réaliser des fécondations in vitro d’oursin : https://planet-

vie.ens.fr/thematiques/animaux/fecondation-vitro-chez-l-oursin

L’ascidie (Urocordé)
On peine à voir dans une ascidie adulte un organisme qui est plus proche de nous qu'un Insecte par exemple
et Cuvier avait rangé l'ascidie parmi les Mollusques. Mais l'observation de la larve par Alexandre
Kowalevsky (1840-1901) a révélé la présence d'une chorde, d'un tube neural dorsal qui nous permet de
classer l'ascidie parmi les cordés épineuriens.

38
 **Figure 1-60. Larve, métamorphose et adulte de l’ascidie Ciona intestinalis.

Trois espèces d’ascidies assez proches ont été étudiées pour leur développement : Ciona intestinalis, Styela
partita et Phallusia mammillata.

Pour voir une vidéo du développement d’une ascidie, suivre ce lien :

https://www.sdbcore.org/object?ObjectID=335&SubTopicID=15

L’étude des ascidies a historiquement permis de comprendre le rôle du cytoplasme dans la détermination
cellulaire. En 1905, Edward Conklin a observé que le cytoplasme coloré en jaune de Styela partita était
toujours, au cours des divisions cellulaires, hérité par les cellules dont les descendantes allaient donner des
cellules musculaires. Si on retire les cellules qui héritent de ce cytoplasme (les blastomères B4.1) alors il n’y
a plus de cellules musculaires. Si du cytoplasme jaune est transféré dans une cellule qui ne donne
habituellement pas de muscle alors sa destinée change et elle donne du tissu musculaire. On a depuis
compris le déterminisme moléculaire des propriétés de ce cytoplasme : il contient des ARNm qui permettent
de synthétiser la protéine macho qui engage les cellules dans le lignage musculaire (Nishida et Sawada,
2001). Il s’agit d’un exemple classique de déterminisme de lignage autonome, par héritage de
cytoplasme au cours des divisions cellulaires sans besoin d’induction en provenance des cellules
voisines.

En raison de sa carte des territoires présomptifs précise très précoce avec un petit nombre de cellules,
l’embryon d’ascidie est un système idéal pour élucider les mécanismes liés au positionnement des cellules
au cours de la morphogenèse d’une blastula de chordés. Étant donné que les embryons d’ascidies présentent
un modèle de clivage invariant sans migration cellulaire ni mort cellulaire jusqu’au moment de la
gastrulation, l’orientation du plan de division cellulaire est déterminante (Dumollard et al., 2017). Tous les
blastomères ont un destin spécifié dans la blastula à 64 cellules et la plupart des divisions cellulaires au
stade de 32 cellules sont des divisions asymétriques avec des destinées différentes pour chacune des
cellules-filles (Lemaire et al., 2008).

39
 ***Figure 1-61. Détermination par l’activité
nucléaire de la β-caténine de différents lignages
dans l’embryon d’ascidie aux stades 16 et 32
cellules. Une ligne pointillée verte sépare
l’ectoderme du mésendoderme et une ligne
pointillée brune sépare les lignées A- (A4.1) et a-
(a4.2) de Lignées B- (B4.1) et b- (b4.2). Les cellules
NN (précurseurs neuraux et de la chorde) et E
(précurseurs de l’endoderme) sont respectivement
indiquées en rouge et en bleu. Au-dessous des
dessins d’embryons se trouve une représentation
schématique des deux séries de décisions binaires
de destin induites par l’activité nucléaire de la β-
caténine (nβ-caténine) qui séparent d’une part les
lignées mésendodermiques des lignées
ectodermiques au stade de 16 cellules et, d’autre
part, les lignées mésodermes (NN) de l’endoderme
(E) au stade 32 cellules.

Source : https://elifesciences.org/articles/14692

***Figure 1-62. Patrons d’expressions géniques dans un

embryon de Ciona intestinalis au stade 32 cellules. (A)
Schémas d’un embryon de 32 cellules de Ciona
intestinalis. Notez la symétrie bilatérale. La légende des
couleurs est spécifiée en haut du tableau de B. (B)
L’expression spécifique des gènes dans certaines cellules
est marquée en bleu. Les gènes des 7 premières lignes
sont des gènes à effets maternels.

Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abf8210

L'ascidie se prête particulièrement bien à des analyses en scRNAseq (analyse transcriptomique en cellule
unique) pour comprendre la spécification des destins cellulaires (Winkley et al., 2021).

Et l’Humain ?
Pour des raisons évidentes d’éthique, l’étude du développement humain a été toujours bien plus compliqué
que l’étude de celui des animaux et des plantes. Les avortements (spontanés ou non) ont toujours été une
importante source d’observation.

Cependant, les premières étapes pré-implantatoires ont pu être étudiées précisément depuis la mise au
point de la fécondation in vitro à la fin des années 1970 (Niakan et al., 2012). Pour le reste, le modèle souris
a longtemps été la référence pour le développement des mammifères mais il existe de grandes différences

40
entre le développement des rongeurs et des primates, notamment la topologie générale de l’embryon au
stade de la gastrulation.

Vidéo sur les 2 premières semaines du développement embryonnaire humain :

https://youtu.be/9AX1XwKCYQE

*Figure 1-63. Le début du développement humain (les jours depuis la fécondation sont précisés). D’après
https://www.nature.com/articles/s41467-021-25853-4

Les cellules souches pluripotentes que ce soient les cellules embryonnaires souches (ES) issues des
blastocytes ou les cellules induites iPS sont maintenant une grande ressource pour connaître les
étapes du développement embryonnaire humain et pouvoir expérimenter sur ces étapes. La
topologie en 2D de la culture cellulaire classique a laissé la place à des cultures en 3D menant à la
formation d’organoïdes qui présentent des similitudes importantes avec les mêmes organes dans
les embryons.
**Figure 1-64. Modélisation 2D et 3D de tissus, d'organes
voire de systèmes physiologiques avec les dérivés des
cellules iPS. Les iPSC présentent la capacité de s'auto-
renouveler et de se différencier en différents types de
cellules (par exemple, en cardiomyocytes, en neurones ou
en hépatocytes selon les protocoles utilisés). Les cellules
dérivées d'iPSC spécifiques au patient sont largement
utilisées pour étudier diverses maladies humaines à
l'aide de cultures monocouches 2D, mais cette approche
ne peut pas récapituler l'architecture tissulaire complexe
et les fonctions des organes observées in vivo. Divers
systèmes 3D ont été développés pour modéliser les
maladies humaines dans des conditions qui imitent plus
étroitement l'environnement physiologique, notamment
les organoïdes et les cultures dans des systèmes
microfluidiques ("puce cellulaire"). À l'avenir, la
convergence de ces systèmes 3D et la liaison de plusieurs
organes avec une vascularisation artificielle permettront
de modéliser les processus dynamiques temporels dans
le corps vivant et la pathogenèse de la maladie, ajoutant
une quatrième dimension. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/5/dev156166/48659/Modeling-
human-diseases-with-induced-pluripotent

Des blastocystes issues de cellules pluripotentes humaines (ES ou iPS) avec une bonne organisation
tridimensionnelle ont pu être obtenus avec divers protocoles (Luijkx et al., 2022).

41
 ***Figure 1-65. Analyse transcriptomique des gènes
marqueurs de diverses lignées des blastocystes
obtenues à partir de cellules ES humaines cultivées en 2D
(dans un milieu qui empêche leur différenciation) et
dans des agrégats multicellulaires en 3D au bout de 4, 5
et 6 jours dans le milieu de différenciation. TE =
trophectoderme; Epi = épiblaste; Hypo = endoderme
primitif (ou hypoblaste). Notez que les expressions de
Nanog et Pou5f1 (=Oct4) ne changent pas dans l’épiblaste
qui reste pluripotent comme les cellules ES.
Source :

https://www.nature.com/articles/s41467-021-25853-4

Également, Warmflash et al., 2014 ont rapporté que les cellules ES humaines cultivées dans des micro-
disques recouverts de matrice extracellulaire (ECM) et stimulées avec BMP4, se différencient de manière
reproductible en anneaux cellulaires organisés radialement, exprimant des marqueurs d’ectoderme,
mésoderme, endoderme et de trophectoderme, disposés à partir du centre vers la périphérie. Les cellules
mésendodermiques dans ces cultures présentent des caractéristiques de transitions épithélio-
mésenchymateuses. Des gastruloïdes humains ont pu être obtenus et permettre l’étude des voies de
signalisation BMP, Nodal et Wnt durant une période de développement jusqu’alors inaccessible (Yoney et
al., 2018; Chhabra et al. 2019).

**Figure 1-66. Gastruloïdes humains traités avec différents ligands. SB veut dire SB431542, un inhibiteur de Smad2
et Smad3 qui sont impliqués dans les voies de signalisation de l’activine et de Nodal. Les immunofluorescences
permettent d’observer l’expression de BRA (marqueur mésodermique), CDX2 (tissu extra-embryonnaire), SOX2
(marqueur ectodermique), SOX17 (marqueur endodermique). Le DAPI marque l’ADN (les noyaux).

Source : https://elifesciences.org/articles/38279

POUR ALLER PLUS LOIN :

Site d’embryologie humaine :

https://www.embryology.ch/francais/iperiodembry/planmodperiod.html

42
Arabidopsis thaliana

*Figure 1-67. Inflorescence d’Arabidopsis thaliana.

Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Arabidopsis_thaliana#/media/Fichier:Arabidopsis_thaliana_2019-04-27_2242.jpg

Arabidopsis thaliana est devenu depuis les années 1990, le modèle principal d’étude du
développement et la génétique des plantes (son utilisation en tant que modèle a été initiée par le
botaniste allemand Friedrich Laibach en 1907). C’est un paradoxe car cette plante n’a aucune valeur
agricole mais elle possède de nombreux avantages.

Arabidopsis thaliana est une Brassicacée annuelle qui a une distribution étendue à travers toute l’Europe et
l’Amérique du Nord et une bonne partie de l’Asie. Son nom commun est l’arabette des dames ou arabette de
Thalius.

Sa petite taille permet de cultiver de très nombreux plants sur une surface restreinte.

Son cycle de vie dure seulement 6 semaines. Un plant peut produire jusqu’à 5000 graines, ce qui permet
de faire de la génétique sur une vaste population.

Les fleurs apparaissent environ 3 à 4 semaines après la germination. Chaque fleur possède 4 sépales
et 4 pétales, disposés en croix (d’où l’ancien nom de Crucifère à la famille des Brassicacées), avec un
décalage de 45° entre les sépales et les pétales. Plus à l’intérieur, on trouve 6 étamines et 2 carpelles
qui contiennent des ovules.
*Figure 1-68a. Vue apicale d'une fleur d'Arabidopsis. On
distingue bien notamment la disposition des étamines
par rapport aux pétales. Les sépales ne sont pas bien
visibles (à part à droite). Source :
https://www.mdpi.com/1422-0067/18/6/1303/htm

43
 *Figure 1-68b. Diagramme floral d’Arabidopsis thaliana.
Source : http://acces.ens-lyon.fr/acces/thematiques/dyna/dossiers-
thematiques/morphogenese-vegetale/morphogenese-florale

Les gamètes sont formés dans des organismes particuliers appelés gamétophytes. Le gamétophyte
mâle est le grain de pollen et le gamétophyte femelle est le sac embryonnaire qui ne sort pas de
l'ovule.
*Figure 1-69a. Anthère d'une étamine d'Arabidopsis
thaliana remplie de grains de pollen. Une anthère est la
partie terminale d'une étamine où se développent et sont
stockés les grains de pollen (qui sont les gamétophytes
mâles). Les produits de gènes comme RTG (pour Raring-
to-go) maintiennent les grains de pollen en vie ralentie.
A maturation, les anthères s'ouvrent par déhiscence ce
qui libère les grains de pollen et permet la pollinisation.
Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Arabidopsis_thaliana#/media/Fichier:Tolmukapea.jpg

*Figure 1-69b. Grain de pollen d'Arabidopsis observé au

microscope électronique à balayage. On observe la
texture superficielle de la paroi protectrice avec la
couche lacunaire d'exine (claire sur les images). L'exine
est composée de sporopollénine lipidique et de
glycoprotéines. Source : https://www.mdpi.com/1422-
0067/18/6/1303/htm

44
 *Figure 1-70. Pistil disséqué d’Arabidopsis thaliana permettant de voir les ovules. A droite, on peut voir la trajectoire
des tubes polliniques (en orange) depuis les grains de pollen posés sur le stigmate (partie supérieure du pistil) jusque
dans les ovules. Source : compte Twitter de @NickDesnoyer

On peut réaliser des auto-fécondations chez ce qui facilite les études génétiques par l’obtention simple de
mutants homozygotes.

Entre la pollinisation et la fécondation, les tubes polliniques se développent de manière invasive

dans le pistil et permettent aux deux spermatozoïdes de pénétrer dans le sac embryonnaire intégré
dans l'ovule. Le sac embryonnaire est composé de deux synergides, une oosphère (=gamète), une
cellule centrale à 2 noyaux haploïdes et trois cellules antipodales. Les tissus femelles, notamment
les ovules, émettent des signaux pour guider les tubes polliniques dans le sac embryonnaire. Les
synergides sécrètent de petites molécules sous l'induction non cellulaire autonome des cellules centrales
pour attirer les tubes polliniques. Les signaux peptidiques sont perçus par les récepteurs à activité kinase
exprimées dans les tubes polliniques, puis transduites vers des machineries de croissance intracellulaire
telles que de petites GTPases et le cytosquelette, qui sont régulées par un gradient de Ca 2+ (Krichevsky et
al., 2007; Steinhorst et al., 2013).

Il y a une double fécondation : un spermatozoïde féconde l'oosphère ce qui donne le zygote qui
donne l'embryon et un autre spermatozoïde (provenant du même grain de pollen que le précédent)
féconde la cellule centrale ce qui est à l'origine de l'albumen, tissu de réserve triploïde (car la cellule
centrale contenait deux noyaux haploïdes).

Après la fécondation, le début du développement embryonnaire d’Arabidopsis comprend une

succession de divisions très reproductibles, ce qui permet de déceler facilement la survenue de toutes
différences chez les mutants. Des cartes des territoires présomptifs sont disponibles permettant de
connaître le destin des différentes cellules.

L’ovule met 2 semaines à se transformer en graine.

Voir la vidéo sur la germination d’Arabidopsis : https://youtu.be/zICRjcGoPHM

Des tissus ou des cellules particulières d’A. thaliana peut être particulièrement étudiés et devenir en eux-
mêmes des modèles. Citons les trichomes. Ce sont des cellules épidermiques uniques que l’on trouve sur les
feuilles en rosette et sur la tige. Le développement des trichomes est principalement étudié sur les feuilles
en rosette, où ils sont espacés régulièrement. Les trichomes en différenciation subissent typiquement
quatre cycles d’endoréduplication et forment trois ou quatre branches. La recherche systématique de
mutants de trichomes a révélé un grand nombre de mutants interférant avec divers processus de
développement tels que la formation de motifs, la régulation du cycle cellulaire et la morphogenèse
cellulaire.

45
 *Figure 1-71. Les facteurs de transcriptions GL1 et GL3 sont nécessaires à la formation des trichomes sur les feuilles
en rosette d'A. thaliana. Des plants mutants perte-de-fonction pour les gènes codant les facteurs de transcription GL1
ou GL3 aboutissent à des feuilles en rosette sans trichome (à gauche). Des expériences de complémentation
permettent de retrouver le phénotype sauvage en réexprimant GL1 ou GL3 grâce à la transgénèse (à droite). Barre
d'échelle = 1 mm.
Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000396

Le génome assez compact d'Arabidopsis thaliana (135 millions de pb répartis sur 5 chromosomes, ce
qui est très petit pour un Angiosperme) a été entièrement séquencé en l'an 2000. Il possède 29.000 gènes
ce qui est du même ordre de grandeur que le génome de la souris ou de l'humain. Il y a 225 gènes par
mégabases chez Arabidopsis contre 7 chez Homo sapiens.

On peut assez facilement créer des plants transgéniques en infectant des cellules avec une forme
génétiquement modifiée de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Les chercheurs peuvent aussi
utiliser le fait que le génome d'Agrobacterium s'insère au hasard dans le génome et ils peuvent étudier les
conséquences phénotypiques de ces mutations insertionnelles qui peuvent casser une séquence codante ou
régulatrice d'un gène.

Malgré sa domination claire dans les publications de génétique et de biologie cellulaire du développement
des plantes, il est clair qu'Arabidopsis ne constitue qu'un modèle particulier. Certains phénomènes ne
peuvent être étudiés chez elle comme la formation du bois ou des feuilles composées. Cela dit, les
chercheurs ont réussi à produire un équivalent de bois (du xylème secondaire) chez Arabidopsis en lui
ajoutant des poids, indiquant que le poids porté par la tige déclenche le développement des tissus
secondaires et que ce programme était toujours activable chez Arabidopsis (Ko et al., 2004).

POUR ALLER PLUS LOIN :

Article de rétrospective de 50 années de recherche sur Arabidopsis.

46
PARTIE 2

Les concepts fondamentaux

47
Le destin des cellules et les réseaux de régulation génique

e zygote donne, par définition, naissance à l’ensemble des cellules d’un embryon (et même dans

L
certains cas à ses annexes embryonnaires). Il est considéré comme totipotent. Au fur et à
mesure que les étapes du développement se déroulent, les cellules sont progressivement
déterminées : même isolées de l’embryon ou déplacées dans l’embryon, elles finissent par
donner les mêmes cellules différenciées que si on les avait laissées à leur place. Un programme
génétique menant à la différenciation a été sélectionné de manière irréversible.

Les cellules embryonnaires passent donc par une étape pluripotente (capables de donner tous les
types cellulaires appartenant aux 3 feuillets sauf quelques types) puis multipotente (capables de
donner un grand nombre de types cellulaires restreints à un ou deux feuillets) avant de voir leurs
potentialités se restreindre encore plus. Une représentation visuelle de ce processus est apportée
par le paysage de Waddington, dans lequel la trajectoire de différenciation d’une cellule est conçue
comme une boule roulant dans un paysage de vallées en bifurcation (Waddington, 1957). Dans cette
représentation, le paysage est façonné par les réseaux de régulation génétique avec les vallées
représentant les destins cellulaires. Les signaux de développement attribuent l’identité cellulaire
en déterminant la vallée dans laquelle une cellule pénètre.
*Figure 2-1. Diagramme de Waddington. Le paysage
épigénétique de Waddington est une métaphore de
la façon dont la régulation génique module le
développement. Waddington nous demande
d’imaginer un certain nombre de billes dévalant une
colline. Les billes parcourent les rainures sur la
pente et s’immobilisent aux points les plus bas :
l’état de différenciation final. Ces points
représentent le destin final des cellules, c’est-à-dire
les types de tissus.

Comment cette restriction progressive du destin des cellules est-elle contrôlée ?

*Figure 2-2. Clonage d’un amphibien réalisé par John Gurdon en 1962. Le noyau d’une cellule intestinale différenciée
est transféré dans l’ovocyte dont on a éliminé le matériel génétique au préalable. La grenouille donneuse de noyau
et la grenouille donneuse d’ovocyte provenaient de deux souches différentes (l’une avec 1 nucléole par noyau, l’autre
avec 2 nucléoles par noyau), ce qui a permis de vérifier que toutes les cellules des clones obtenus avaient du matériel

48
 génétique provenant de la grenouille donneuse du noyau. Source : https://www.univ-
rennes1.fr/actualites/27062017/conference-de-sir-john-gurdon-prix-nobel-de-physiologie-ou-medecine-2012

Comme le démontre l’expérience de clonage de John Gurdon réalisée en 1962 (Prix Nobel en 2012),
le développement embryonnaire et la différenciation cellulaire n’entraînent pas de pertes
quantitatives d’information génétique. En effet, l’ADN d’une cellule différenciée donnée peut diriger
le développement de centaines de types cellulaires différents. Cela ne se fait pas sans difficultés : la
plupart des clones ne se développent pas complètement (moins de 2% sont arrivés à l’âge adulte) mais
l’important est que cela est possible.

Des équivalents de cette expérience de clonage ont été réalisés chez les Mammifères, d’abord chez
la brebis en 1996 (brebis Dolly, seule survivante parmi les 434 essais de clonage réalisé par l’écossais Ian
Wilmut) puis chez la souris en 1997. En 2003, une mule qui est un animal stérile a été cloné (Woods et al.,
2003).

Même le noyau d’une cellule différenciée, remis dans un contexte adéquat (ici l’ovocyte) peut donc
se révéler être totipotent. Au cours du développement embryonnaire, tout dépend donc de la
manière dont les gènes sont exprimés. Le destin des cellules dépend ainsi de la cascade de
régulations géniques qui démarre quelquefois avant même la fécondation (au cours de l’ovogenèse
pour les gènes dits à effet maternel) et qui se poursuit tout au long du développement.

**Figure 2-3. Différenciation des programmes génétiques des cellules au cours de l’embryogenèse du poisson zèbre.
Des transcriptomes de cellules uniques ont été générés à partir d’embryons de poisson zèbre à 12 stades de
développement (dont six sont illustrés en bas). Les trajectoires transcriptionnelles qui décrivent la spécification du
destin de 25 types de cellules ont été reconstruites à partir des données. La spécification moléculaire est visualisée
dans un espace dans lequel chaque cellule est représentée par un point (coloré par stade de développement), allant
des cellules pluripotentes (en bas au centre) vers 25 types cellulaires distincts. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/science.aar3131#Fa

Les embryons sont caractérisés par des schémas de différenciation cellulaire remarquablement organisés
et reproductibles. Pour exemple, on peut observer les limites nettes de l’expression des gènes dans de
nombreux tissus en développement. Les devenirs cellulaires sont déterminés par des réseaux de régulation
de gènes (RRG), coordonnés dans l’espace par des signaux sécrétés (Davidson, 2010).

49
 **Figure 2-4. Un exemple de réseau de régulation génique (ici les gènes en aval de Pax3 et Zic1 qui spécifient les
cellules de crêtes neurales). Les traits pleins indiquent les régulations directes prouvées; les pointillés indiquent les
régulations directes supposées mais non prouvées. Notez les rétroactions (par exemple : l’expression de Gbx2 activée
par Pax3 qui agit sur la transcription de Pax3 et l’augmente) ou les voies parallèles redondantes (par exemple : Pax3
qui active l’expression de Snail2 et de Tfap2e et Tfap2e qui active aussi l’expression de Snail2).

Source : Pla et Monsoro-Burq, 2018

Il s’agit de comprendre comment la précision des destins cellulaires est obtenue malgré le « bruit de fond »
biologique et les fluctuations stochastiques de la régulation de l’expression des gènes (Raser et O’Shea,
2005). Ces fluctuations peuvent d'ailleurs être nécessaires pour la mise en place de la répartition de certains
types cellulaires au sein d'un tissu (Meyer et al., 2017).

Une vision moderne consiste à utiliser la théorie des systèmes dynamiques et à considérer les vallées de
Waddington comme des états attracteurs du RRG (Enver et al., 2009; Balázsi et al., 2011). De ce point de
vue, les cellules peuvent être chassées d’une vallée vers un attracteur adjacent, produisant ainsi un
changement d’identité, non seulement par des signaux de développement mais également par les
fluctuations naturelles de l’expression génétique. Ces fluctuations sont ensuite stabilisées, ce qui scelle le
destin des cellules.

Comment les fluctuations sont-elles tamponnées dans les populations de cellules en développement pour
garantir que les signaux de développement génèrent des patrons d’expression génique précis et
reproductibles ? Pour les gènes individuels, l’activité des éléments régulateurs redondants, l’architecture
tridimensionnelle du génome, la présence d’allèles multiples ont été proposés pour amortir les fluctuations
et augmenter le robustesse de l’expression des gènes (Frankel et al., 2010; Lagha et al., 2012; Little et al.,
2013; Tsai et al., 2019). Au niveau du tissu, les mécanismes de régulation de la forme, de la pente ou de la
variation des gradients des morphogènes ont été explorés et leurs effets sur la précision de l’expression des
gènes détaillés (Sokolowski et al., 2012; Zagorski et al., 2017). Plusieurs mécanismes, parmi lesquels
l’adhérence différentielle, les barrières mécaniques et la signalisation juxtacrine, ont été proposés pour
corriger les anomalies et améliorer la précision, une fois la structuration tissulaire initiée (Dahmann et al.,
2011; Addison et al., 2018).

Dans les premières étapes de l’auto-organisation, il est nécessaire d’établir une asymétrie et, par
conséquent, une rupture initiale de la symétrie de la population est requise. La rupture de symétrie
peut être induite par des fluctuations aléatoires de l’expression des gènes ou par des facteurs
externes qui induisent une population hétérogène. Chez le xénope, la rupture de la symétrie est
provoquée par la localisation de l’entrée du spermatozoïde. Le centriole qu’il apporte réorganise le
cytosquelette ce qui provoque la rotation corticale. Des déterminants dits “dorsaux” (ARNm et
protéines) se retrouvent d’un côté de l’embryon et absents de l’autre. La cascade de régulation
génique déclenchée par ces déterminants sera différente de celle déclenchée de l’autre côté, le futur
côté ventral.

50
Dans les embryons de mammifères, la symétrie est rompue lors de la ségrégation de la première
lignée, au cours de laquelle le trophectoderme et la masse cellulaire interne (MCI) sont établis. La
signalisation Yap1 est importante dans ce contexte : elle est active dans les cellules externes de l’embryon,
en initiant la transcription de Cdx2 nécessaire à la formation du trophectoderme (Anani et al., 2014 ; Maître
et al., 2016).
**Figure 2-5. YAP et la voie Notch dans le contrôle
des décisions de devenir cellulaire : la
détermination du trophectoderme et de la masse
cellulaire interne chez la souris (A, A’)
Représentation schématique d’un blastocyste de
souris. Les cellules du trophectoderme (TE) sont
représentées en orange et les cellules de la masse
cellulaire interne (MCI) en bleu. (A’) Grossissement
de la région encadrée en (A). RBPJ (voie Notch) et
YAP-TEAD se lient à l’enhancer de Cdx2 et
déterminent le destin du trophectoderme (Rayon et
al., 2014 ; Watanabe et al., 2017 ; Menchero et al.,
2019).
https://www.frontiersin.org/articles

/10.3389/fcell.2021.711531/full

**Figure 2-6. Séquence du TEE (TrophEctoderm

Enhancer) qui contrôle l'expression de Cdx2 dans le
trophectoderme. Il se trouve 5,6 kb en amont du site
de début de la transcription du gène Cdx2. Les sites
de fixation de (YAP-)Tead et (Notch-)Rbpj sont
indiqués. Source :
https://www.nature.com/articles/srep46135

La voie Hippo, qui comprend Yap1, est importante dans l’adhésion et la polarité cellulaires et est activée par
mécanotransduction. La position périphérique des cellules du trophectoderme provoque sans doute des
tensions mécaniques à l’origine de l’activation de Yap1.

Suivant la spécification de la masse cellulaire interne (MCI), une autre subdivision se produit en son
sein : en épiblaste et endoderme primitif.

Etudions comment se passe la répartition entre ces deux destinées dans la MCI. A E3,25 jours de
développement, toutes les cellules de la MCI expriment uniformément les facteurs de transcriptions
épiblastiques Sox2, Oct4 et Nanog, ainsi que le facteur de transcription qui sera crucial pour le
développement de l’endoderme primitif GATA6 (Dietrich et Hiiragi, 2007 ; Plusa et al., 2008). A E3.5 jours
de développement, la MCI perd son uniformité et commence à présenter une distribution poivre-et-sel de
cellules exprimant soit Nanog soit GATA6. A E4.5 jours, les deux lignées sont établies, spécifiées. Les cellules
de l’endoderme primitif se séparent pour former une couche épithéliale entourant l’épiblaste pluripotent.
Les cellules exprimant GATA6, et ensuite ses cibles Sox17 et GATA4, activent un réseau transcriptionnel
favorisant l’engagement dans le lignage de l’endoderme primitif (Artus et al., 2011 ; Bessonnard et al., 2014
; Koutsourakis et al., 1999 ; Morrisey et al., 1998; Schrode et al., 2014). Cependant, ces précurseurs peuvent
encore changer et devenir des cellules épiblastiques si le ratio des cellules épiblaste/endoderme primitif
est affecté (Saiz et al., 2020; Yamanaka et al., 2010), indiquant que les cellules à ce stade ont un encore un
comportement plastique et pas complètement engagé. Cette adaptabilité est perdue dans le blastocyste
tardif (E5) suggérant que les destins de l’endoderme primitif et de l’épiblaste sont irréversiblement engagés
à ce stade (Grabarek et al., 2012; Yamanaka et al., 2010).

Pour caractériser l’état plastique des cellules de la MCI bipotentes, des cellules ES portant un transgène
GATA6 inductible (les cellules ES n’expriment pas naturellement GATA6) ont été caractérisées. Dans un
premier temps, GATA6 ne réprime pas l’expression de Nanog. Au cours de cette étape de coexpression,
51
GATA6 lie des éléments de régulation (CRE) dans les promoteurs et les enhancers des gènes typiques de
l’endoderme primitif et fonctionne comme un facteur de transcription pionnier pour les rendre accessibles
pour une activation transcriptionnelle plus forte ultérieurement. Simultanément, GATA6 se lie à une
fraction étonnamment grande des promoteurs contrôlant les gènes typiquement épiblastiques, conduisant
à une co-occupation avec les facteurs de transcription de pluripotence, Nanog et Sox2. Dans un deuxième
temps, si on oriente les cellules vers un destin d’endoderme primitif, GATA6 provoque l’éviction de Nanog
et Sox2. Cet exemple montre comment la détermination des cellules se fait progressivement avec les
mécanismes moléculaires associés.

Qu’est-ce qui provoque la relative irréversibilité d’une différenciation ? Les analyses épigénomiques de
la différenciation dans les différents lignages à partir des cellules pluripotentes (ES ou iPS) mettent
en évidence un programme dans lequel des facteurs de transcription spécifiques à la lignée sont
induits puis renforcés avec en parallèle une répression de l’expression des gènes de pluripotence
(Gifford et al., 2013, Suelves et al., 2016). La structuration des RRG permet une progression dans la
détermination vers la différenciation avec différentes modalités.

*Figure 2-7. Différentes organisations hiérarchiques des réseaux de régulation génique lors de la progression vers la
différenciation. Un "gène maître" dans la détermination d'un lignage peut soit induire une cascade avec une
succession d'activation de gènes (C), soit lui-même activer plusieurs gènes (B). Une combinaison des deux cas
précédents est fréquente et permet un renforcement tout en assurant une progression du programme génétique (A).
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/132/12/2685/42910/The-circuitry-of-a-master-switch-
Myod-and-the

La détermination des destins cellulaires dépend d'une intégration de voies de signalisation pour activer
l'expression de gènes clés. Par exemple, lors de la détermination de cellules pluripotentes iPS ou ES en
précurseurs méso-endodermiques, il faut d'abord faire agir la voie Wnt (processus de « priming ») et
ensuite la voie activine/Nodal pour obtenir le rendement le plus élevé d’activation de l’expression du gène
EOMES (Yoney et al., 2022).

**Figure 2-8. Combinaison d'action de deux voies de signalisation pour déterminer des cellules pluripotentes en
précurseurs méso-endodermiques. Des cellules ES pluripotentes humaines sont soumises à divers protocoles dans
le but de les déterminer en précurseurs méso-endodermiques (ME). L'activine (équivalent de Nodal) qui active
Smad2/3 n'est pas suffisante pour activer le gène de détermination EOMES. La voie Wnt qui active la β-caténine
active faiblement l'expression d'EOMES. EOMES stimule également sa propre transcription. Pour activer au
52
 maximum l'expression d'EOMES, il faut activer la voie Wnt et ensuite la voie activine/Nodal (avec une période où les
voies sont activées ensemble ou successivement (ACT later)). EOMES avec Smad2/3 active ensuite les gènes
spécifiques des cellules méso-endodermiques, ce que ne peut pas faire Smad2/3 seul ou la voie Wnt avec EOMES.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/149/20/dev200335/275944/Mechanisms-underlying-WNT-
mediated-priming-of

Les mécanismes proposés (Feldman et al., 2006; Nicetto et Zaret, 2019) comprennent la méthylation de
l’ADN et des méthylations répressives des histones telles que H3K27me3 et H3K9me3. Ces modifications
répriment la transcription et sont autoentretenus, offrant un moyen de faire taire de façon
permanente la transcription des gènes exprimés en cas de pluripotence ou dans un autre lignage, y
compris en l’absence des signaux inducteurs initiaux de la détermination et de la différenciation.
Les marques épigénétiques permettent ainsi d'établir une mémoire du destin cellulaire.

*Figure 2-9. Modifications des profils de méthylation répressive sur l’ADN et les histones au cours de la
différenciation.

D’après https://academic.oup.com/bfg/article/15/6/443/2555346

Les cas de maintien de la pluripotence

La pluripotence est un état dans lequel les cellules peuvent s’auto-renouveler et rester
indifférenciées, conservant la capacité de donner naissance à des dérivés de n’importe quel feuillet
embryonnaire. Cet état cellulaire est maintenu non seulement par un défaut d’expression des
facteurs de détermination et de différenciation, mais aussi par un réseau de régulation génétique
complexe qui est étroitement contrôlé par un ensemble de facteurs de transcription : Nanog, Oct4
et Sox2 (Navarro et al., 2012; Rodda et al., 2005; Teo et al., 2011; Trott et Martinez Arias, 2013). Ces trois
facteurs de transcription sont impliqués dans l’établissement et le maintien de la pluripotence, non
seulement dans les cellules lors du clivage mais aussi dans les cellules souches embryonnaires (ES) ou les
cellules iPS en culture (Chambers et Tomlinson, 2009). Ce RRG régule la pluripotence en réprimant les gènes
impliqués dans la différenciation et en activant d’autres gènes importants pour la pluripotence (Navarro et
al., 2012; Thomson et al., 2011).

Oct4, qui est connu également sous le nom de POU5F1, est un facteur de transcription à homéodomaine de
type POU. Il est exprimé dans les cellules totipotentes ou pluripotentes au cours du développement et aussi
dans les cellules germinales qui ont la capacité de participer à la génération suivante (donc virtuellement
totipotentes à condition que la fécondation se réalise). La présence de Oct4 est essentielle pour le maintien
des capacités pluri- ou totipotentes des cellules qui l'expriment (Stadtfeld et al., 2008). Par exemple, la

53
perte de l'expression de Oct4 dans les cellules ES provoque la perte de leur pluripotence et aboutit
à leur différenciation en trophectoderme (Niwa et al., 2000).
*Figure 2-10. Expression de Oct4 (ou POU5F1) pendant
le cycle de vie de la souris. Les cellules et tissus
exprimant Oct4 sont marqués en vert. Oct4 est exprimé
dans les ovocytes sous forme de transcrit maternel et de
protéine. L’expression zygotique d’Oct4 est activée avant
le stade 8 cellules et est abondante et uniforme dans
toutes les cellules de l’embryon tout au long du stade
morula. Cependant, comme les cellules externes de
l’embryon se différencient en trophectoderme (TE),
l’expression d’Oct4 est limitée aux cellules de la masse
cellulaire interne (ICM) dans le blastocyste. Après
implantation, l’expression d’Oct4 est maintenue dans
l’épiblaste. Enfin, l’expression d’Oct4 se limite aux
cellules germinales primordiales (PGC), qui sont d’abord
spécifiées dans le mésoderme extra-embryonnaire à la
base du bourgeon allantoïdien pendant la gastrulation.
Les PGC donnent naissance à des gamètes qui, après la
fécondation, se développent en un nouvel organisme de
la prochaine génération. Source :
https://cellregeneration.springeropen.com/

articles/10.1186/2045-9769-3-7

Sox2 contient un domaine HMG qui se lie au petit sillon de la double hélice d'ADN, tandis que Oct4 abrite un
domaine POU qui interagit avec le grand sillon de l'ADN, permettant la formation de complexes ternaires
Sox2-Oct4-ADN avec la paire de facteurs de transcription se liant à des motifs adjacents sur la séquence
d'ADN et aussi se liant entre eux (Reményi et al., 2003; Williams et al., 2004). Des expériences
d'immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage (ChIP-seq) ont révélé que Sox2 et Oct4
occupent côte à côte des éléments régulateurs d'un grand nombre de gènes cibles et peuvent réguler leur
expression de manière concertée (Li et al., 2019). Parmi ces cibles se trouve Nanog.
**Figure 2-11. Oct4 et Sox2 se fixent sur les séquences
régulatrices de la transcription de Nanog dans les
cellules ES pluripotentes (mais pas lors de leur
différenciation). Expériences de ChIP
(immunoprécipitation de la chromatine) avec un
anticorps reconnaissant Oct4 (à gauche) ou Sox2 (à
droite). Les séquences sur lesquelles se sont fixés ces
facteurs de transcription sont ensuite soumis à une PCR
avec les amorces qui amplifient les amplicons présentés
qui se trouvent autour du site de démarrage de la
transcription de Nanog (site de démarrage de la
transcription = +1). Fold enrichment veut dire
l’enrichissement de la séquence dans la fraction
immunoprécipitée par rapport à la chromatine totale. La
chromatine a été extraite de cellules ES non différenciées
(0D RA) ou soumises à un traitement à l’acide rétinoïque
de 3 jours (3D RA) ou de 6 jours (6D RA), qui provoque
leur différenciation. On constate que Oct4 et Sox2 se sont
fixés dans la région correspondant à l’amplicon 2 et cette
fixation diminue lorsque les cellules ES se différencient.
Source : https://www.jbc.org/article/S0021-
9258(20)65622-8/fulltext#relatedArticles

L’abaissement des niveaux d’expression de Nanog dans les cellules ES déclenche la différenciation
et sa surexpression est suffisante pour maintenir les cellules dans un état pluripotent indépendant
54
du LIF, une cytokine de la famille de l’interleukine-6 qui est ajouté habituellement dans le milieu de
culture des cellules ES pour empêcher leur différenciation (Chambers et al., 2007).

La pluripotence des cellules dépend aussi de la traduction. En effet, plusieurs facteurs impliqués dans la
maturation de la petite sous-unité ribosomique 40S sont préférentiellement exprimés dans les cellules
souches pluripotentes par rapport à leur descendance différenciée et soutiennent la traduction de facteurs
de transcription clés de la pluripotence tels que NANOG (You et al., 2015).

Pour tester la pluripotence de cellules souches, on peut les greffer sur des souris immunodéprimées (pour
ne pas que la greffe soit rejetée). Les signaux qui maintiennent leur pluripotence sont levés et on obtient
des tératomes contenants chacun de multiples lignages cellulaires. Également, on peut mettre les cellules
en culture dans un milieu sans additifs maintenant leur état indéterminé et sans substrat auquel elles
peuvent s'attacher : il se forme alors des agrégats appelés corps embryonnaires et où des cellules de
différents lignages sont déterminées puis différenciées.

*Figure 2-12. Diversité des tissus trouvés dans des tératomes. La greffe de cellules ES (et aussi iPS, voir plus loin)
dans une souris receveuse (immunodéprimée) provoque une levée brutale des signaux maintenant la pluripotence.
Les cellules se différencient alors de manière anarchique en une multitude de types cellulaires. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.667246/full

Signalons que Oct4 peut avoir un rôle plus ambigu : lors de la première étape de la sortie de l'état de
pluripotence, il agit en concertation avec le facteur de transcription Otx2 et contribue à activer des gènes
cibles qui font sortir les cellules de leur état naïf (Yang et al., 2014).

Le retour à la pluripotence : le cas des cellules iPS

Les cellules souches pluripotentes induites iPS sont générées à partir de cellules différenciées. Cela
implique de remonter au sommet dans le diagramme de Waddington. Le fait que mis dans un
environnement favorable, un génome de cellules différenciées puisse fonctionner dans une cellule redevenu
pluripotente était d’une certaine manière prédit par les expériences de clonage de John Gurdon vus plus
haut. Il n’est donc pas étonnant que le Prix Nobel de Médecine de 2012 a été attribué conjointement à John
Gurdon et à Shinya Yamanaka qui a mis au point la technique pour obtenir des cellules iPS.

Les cellules iPS sont obtenues en faisant surexprimer une combinaison de facteurs de transcription
: Oct4, Sox2 que nous avons déjà évoqués et aussi Klf4 et c-Myc. Les vecteurs d'expression de ces gènes
sont introduits dans les cellules par des rétrovirus (la méthode la plus utilisée mais qui pose problème en
thérapie cellulaire à cause de l'intégration des transgènes dans le génome), des adénovirus ou des épisomes
(Wang et al., 2019). Voir une vidéo sur la présentation des cellules iPS : https://youtu.be/gh-
ckXhm_co

55
 *Figure 2-13. Reconfiguration de la chromatine
lors de la reprogrammation des cellules
différenciées en cellules souches pluripotentes
induites (iPS). Les transgènes OSKM (pour Oct4,
Sox2, Klf4 et c-Myc) sont transfectés dans des
cellules différenciées et initient une série
complexe de programmes génétiques, incluant la
suppression du programme de différenciation
dans la phase précoce de reprogrammation et
l’activation du programme pluripotent dans la
phase tardive. Des vagues transitoires
d’expression de programmes géniques se
produisent entre les deux états cellulaires. La
chromatine est remodelée tout au long du
processus de reprogrammation, et en particulier
au niveau des loci des gènes de différenciation et
de détermination et des loci des gènes de
pluripotence qui ouvrent ou ferment la
chromatine et perdent ou gagnent de la
méthylation sur les histones. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/

10.3389/fcell.2021.637309/full

Trois de ces quatre facteurs (Oct4, Sox2 et Klf4) sont considérés comme des facteurs de transcription
pionniers, c’est-à-dire qu’ils peuvent se fixer sur des séquences cibles sur de l’ADN même au sein d’un
nucléosome et sont capables d’outrepasser une forme répressive de la chromatine (Soufi et al., 2015). La
fixation de ces trois facteurs facilite la fixation de c-Myc qui peut alors agir.
*Figure 2-14. Relations et fonctions des facteurs
de pluripotence ainsi que de c-Myc. Pour agir sur
la transcription et activer/maintenir la
prolifération, c-Myc doit former un hétérodimère
avec la protéine Max (non mentionnée sur la
figure).

Les profils épigénétiques changent avec un profil de méthylation et d’acétylation qui ouvre la chromatine
(Krishnakumar et al., 2013). Il y a un effacement de la “mémoire épigénétique” de la cellule différenciée. Cet
effacement n’est toutefois pas complet comme le montre les variabilités entre lignées de cellules iPS
provenant du même patient donc indépendante du génotype.

Lors de l’établissement des cellules iPS, il est clair que l’intérêt n’est pas tant de remonter le diagramme de
Waddington que de pouvoir le redescendre ensuite et de générer un type cellulaire différent de celui des

56
cellules qui ont été prélevées initialement. Il existe maintenant de très nombreux protocoles qui permettent
d’activer les RRG souhaités pour aboutir aux cellules différenciées d’intérêt.

L'un des premiers effets de l'application des protocoles de différenciation aux cellules iPS est bien
entendu l'extinction de l'expression des gènes du réseau de régulation génique de la pluripotence
comme OCT4 ou NANOG.

*Figure 2-15. Diminution de l'expression du facteur de pluripotence OCT4 lors de la différenciation des cellules iPS.
Des cellules iPS humaines ont été soumises à un protocole de différenciation en tissu neural. A différents jours du
protocole, les cellules sont fixées puis traitées en immunofluorescence avec des anticorps anti-OCT4 ou anti-PAX6
(PAX6 est un marqueur de tissu neural). Les cellules sont aussi traitées au DAPI (révèle les noyaux). Une étude par
RT-qPCR est aussi réalisée en parallèle. Source : https://www.nature.com/articles/nbt.1529

Le potentiel thérapeutique des iPS est ainsi important.

*Figure 2-16. Utilité des cellules iPS pour la recherche et pour la thérapie cellulaire.

Source : Thèse de Xavier Nissan, i-stem, 2010

En 2014, une équipe japonaise avait publié un article retentissant dans Nature concernant
l'obtention de cellules souches pluripotentes appelées STAPS (pour Stimulus-Triggered Acquisition
of Pluripotency). L'article décrivait qu'on pouvait obtenir ces cellules à partir de lymphocytes
extraits de la rate en les soumettant simplement à une solution acide à pH5,7 pendant 25 minutes.
Plusieurs laboratoires ont essayé de reproduire ces résultats, sans succès. Il s'est avéré qu'il
s'agissait d'une fraude commise par une post-doctorante, première auteur de l'article qui a été
rétracté. Les images des cellules exprimant des marqueurs de pluripotence provenaient en fait
d'une autre expérience avec des cellules obtenues de manière plus classique.

57
EN DIRECT DES LABOS :

Un exemple d’utilisation et de différenciation des cellules iPS :

https://youtu.be/NS10uCGNhas

OUTILS :

Un logiciel gratuit pour créer des représentations de réseaux de régulation génique :

http://www.biotapestry.org/

Les inductions embryonnaires et les gradients de morphogène

Comment et quand les cellules d’un organisme en développement savent ce qu’elles sont (identité)
et où elles se trouvent (information de position), sont des questions les plus fondamentales en
biologie du développement. Chez les organismes pluricellulaires, chaque cellule a une structure
particulière associée à une fonction spécifique et occupe une position précise. Les cellules doivent
donc interpréter les signaux positionnels qui les orientent vers leur destin. La structure des espèces
a varié au cours de l’évolution et celle-ci a la possibilité d’agir à la fois sur les «signaux» et sur la machinerie
qui exécute «l’interprétation» de ces signaux.

L’idée que les cellules adoptent des destins différents en détectant la présence ou l’absence de produits
chimiques, appelés facteurs déterminants du destin ou «déterminants» remonte au début du XXème siècle.
Cependant, l’expérience qui a permis de cimenter l’idée qu’une population de cellules peut contrôler
le destin d’autres cellules est celle de Spemann et Mangold en 1924. La transplantation de la lèvre
dorsale du blastopore d’un embryon d’amphibien sur la région ventrale d’un autre embryon induit
la formation d’un nouveau tube neural et de nouvelles structures mésodermiques dorsales. Les
cellules du greffon n’ont que marginalement participé à ces nouvelles structures : il s’agit bien d’une
instruction envoyée par un groupe de cellules à un autre groupe de cellules qui a changé sa destinée.
C’est une induction embryonnaire.

Les expériences de Boveri sur des embryons d'oursins en 1901 ont montré que les modèles de
développement pourraient être déterminés par des gradients opposés, tandis que des expériences de
régénération sur des planaires en 1904 postulaient l'existence de "substances formatrices'' qui influencent
le plan de développement de l'embryon. En 1952, Alan Turing a postulé que des concentrations de
produits chimiques spécifiques, appelés "morphogènes'', pourraient instruire le destin des cellules
et donc l'organogenèse dans un organisme en développement.

58
 **Figure 2-17. Alan Turing (à 16 ans) (1912-1954)

Après avoir déchiffré le code de la machine allemande Enigma

au cours de la seconde guerre mondiale, Turing s'est intéressé à
en 1952 aux équations de réaction-diffusion, puis a élaboré un
modèle biomathématique de la morphogenèse, applicable aux
animaux ou aux végétaux. Il fait paraître un article à ce sujet,
«The Chemical Basis of Morphogenesis» (Philosophical
Transactions of the Royal Society, août 1952). Vous pouvez lire
cet article ici :

https://www.dna.caltech.edu/courses/

cs191/paperscs191/turing.pdf

Dans les années 1990, des expériences de chimie confirment expérimentalement les modèles théoriques de
Turing.

La prochaine étape épistémologique était l’inclusion de l’espace et la notion selon laquelle les gradients de
produits chimiques conduisent à la structuration du développement et à la différenciation cellulaire. Le
moment-clé associé à cette idée est constitué par un événement de rupture de la symétrie initiale,
souvent déclenché par des facteurs asymétriquement localisés ou orientés (et ce sont souvent les
microtubules et leur polarité +/- qui sont les déclencheurs). Par exemple, les morphogènes sont
produits dans des cellules qui sont situées dans des régions spatialement restreintes et ils diffusent
le long d’un axe d’un embryon ou d’un tissu, établissant ainsi un gradient. Il s’agit de communication
paracrine, qui est le mode de communication intercellulaire principal dans les embryons précoces
(les systèmes circulatoires et nerveux n’étant pas encore formés). En 1969, Lewis Wolpert a postulé
que les cellules pouvaient déterminer leur destin en interprétant les concentrations locales de ces
profils gradués, et il a inventé la notion abstraite selon laquelle ces profils contiennent des
«informations de position». C’est ce qui a mené à son célèbre modèle du «drapeau français».

*Figure 2-18. Gradient de morphogène et destinée des cellules : le modèle du drapeau français. D’après
https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wdev.271

Ici, des groupes adjacents de cellules sont délimités par un seuil de concentration, qui définit une
limite. La détermination du destin dans ce modèle est due à l’interprétation par les cellules de la
concentration du morphogène. L’information est donc contenue dans la valeur de la concentration
à une position donnée, et dans la cascade moléculaire qui transforme cette valeur en réponse
59
cellulaire. Ainsi, les concentrations de morphogène de deux gradients orthogonaux agissent comme des
coordonnées de position, définissant une carte de destin spatial bidimensionnelle comme pour les
longitudes et les latitudes. Les cellules individuelles mesurent et interprètent la concentration locale de
morphogène et déterminent le choix de destin approprié pour cette position.

Également, il arrive souvent que deux gradients de morphogènes s'opposent le long d'un même axe
permettant de raffiner la différenciation des destins le long de cet axe. Citons par exemple, les
gradients opposés de SHH et de BMP le long de l'axe dorso-ventral du tube neural.

*Figure 2-19. Gradients opposés de SHH et BMP le long de l'axe dorso-ventral du tube neural. SHH et BMP établissent
des gradients anti-parallèles dans le tube neural en développement pour spécifier plusieurs domaines de destin de
progéniteurs neuraux dorsaux (D), intermédiaires (I) et ventraux (V). Les concentrations de ligands des deux voies
de signalisation contrôlent les activités de leurs effecteurs intracellulaires canoniques, Gli et pSmad, qui sont ensuite
décodés par un réseau de régulation génique. Différentes combinaisons de concentrations de BMP et de SHH
conduisent à des destins cellulaires distincts. Différents destins de progéniteurs dorsaux sont indiqués par
différentes nuances de rouge, et différents destins de progéniteurs ventraux sont indiqués par différentes nuances
de bleu. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/12/dev170977/19447/Communication-codes-
in-developmental-signaling

En 1989, soit 20 ans après le modèle de Wolpert, la première molécule de morphogène a finalement été
découverte, la protéine Bicoid dans l’embryon de drosophile qui présentait toutes les caractéristiques
du concept de Wolpert (Driever et Nüsslein-Volhard, 1988). Cette découverte a été immédiatement
suivie par la démonstration qu’un ligand de la famille des TGF, l’activine, détermine les destins
différentiels des cellules en fonction des seuils de concentration (Green et al., 1992). Par la suite, de
nombreux autres morphogènes porteurs d’information de position ont été découverts.
*Figure 2-20. Induction par l’activine de
différents gènes selon sa concentration
dans des calottes animales d’embryon de
xénope. Des calottes animales isolées
d’embryons de xénope sont soumis à des
différentes concentrations d’activine.
L’expression des gènes a été étudiée par
une méthode appelée RNAse protection
assay (qui est obsolète aujourd’hui). Une
analyse par RT-PCR donnerait aujourd’hui
des résultats identiques. Des ARN extraits
d’embryons entiers (à droite) servent de
témoins positifs. Epidermal keratin
marque l’épiderme ; Xhox3 s’appelle
désormais Evx1 est nécessaire pour le
développement postérieur de l’embryon;
XlHbox6 s’appelle désormais HoxA9 et est
impliqué dans le développement de la
région postérieure; l’actine musculaire

60
 marque le mésoderme musculaire;
Brachyury est un marqueur de
mésoderme ; Goosecoid est un marqueur
de mésoderme dorsal. L’actine et EF1-a
sont utilisés comme contrôles. Source.

Les morphogènes sont donc des molécules distribuées de manière graduée qui fournissent des
indices de position pour la spécification du destin cellulaire au cours du développement (Rogers et
Schier, 2011). En général, les morphogènes sont des protéines excrétées, produites à partir de
sources localisées et qui diffusent dans l’espace extracellulaire vers les cellules voisines. Signalons
que l'acide rétinoïque (c'est un dérivé de la vitamine A) n'est pas une protéine mais agit souvent comme un
morphogène.

*Figure 2-21. Modélisation d'un gradient de morphogène et de la réponse à ce gradient in vitro. Des cellules appelées
productrices de morphogènes (senders, cellules bleues) sont transfectées avec un vecteur d'expression leur
permettant de produire Sonic Hedgehog (Shh) de manière inductible par le tamoxifène (4-OHT). Des cellules
appelées réceptrices (receivers) sont transfectées avec un vecteur d'expression leur permettant d'exprimer un gène
rapporteur (la mCitrine, fluorescence jaune) sous le contrôle de séquences régulatrices activées par Gli, la famille de
facteur de transcription dont l'activité stimulatrice de la transcription est activée en réponse à la réception de Shh.
Les deux populations de cellules sont mélangées selon un ratio de 1/2000, et on suit la fluorescence de la mCitrine
au cours du temps. Source : https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1174-6

Une fois que les gradients sont formés, les cellules réceptrices interprètent leur position respective dans le
tissu en détectant la concentration de morphogènes. En réponse, les cellules activent différents ensembles
de gènes cibles, initiant ainsi des processus de détermination et définissant finalement le destin des cellules.
Chez les embryons de drosophile, deux morphogènes, dorsal (Dl) et bicoid (Bcd), contrôlent la mise
en place de deux axes corporels: respectivement dorso-ventral et antéro-postérieur. Ces
morphogènes spécifiques sont inhabituels car ce sont des facteurs de transcription et ils agissent
directement dans les noyaux avant la cellularisation de l’embryon de drosophile; par conséquent, les
réponses de leurs gènes cibles ne reposent pas sur de vastes cascades de signalisation intracellulaire, mais
sur une action directe de ces morphogènes. Ils constituent ainsi un modèle d’étude de choix pour
comprendre le couplage morphogène-régulation transcriptionnelle.

L’un des principaux problèmes étudiés en ce qui concerne les morphogènes est le mécanisme par lequel
leurs diverses concentrations sont traduites en expressions géniques différentielles. L’un des premiers
modèles a proposé que les différences dans les domaines d’expression spatiale des gènes cibles sont
directement liées à la concentration de morphogène (Wolpert, 1969). Dans ce modèle, la transcription du
gène cible est initiée uniquement lorsque la concentration de morphogène est au-dessus d’un certain seuil,
61
alors que la transcription n’est pas initiée dans les domaines où la concentration de morphogène est
présente en dessous. De cette manière, les gradients de morphogènes régulent la spécification dans un
groupe de cellules en contrôlant de manière différentielle l’expression génique.

Ce modèle est enrichi en considérant l’importance du temps, à la fois le moment de commencement de

l’exposition aux morphogènes et sa durée (Rogers et Schier, 2011; Sagner et Briscoe, 2017). L’expression
du gène cible influencée par l’apport de morphogène dépend aussi de l’état d’expression génique
des cellules réceptrices. Les réponses à un morphogène donné différeront entre les cellules
réceptrices avec différents programmes d’expression génique pré-existants. On dira de ces cellules
qu’elles ont des compétences différentes à répondre au morphogène. Par exemple, lors de la
régionalisation dorsale-ventrale des embryons de poisson zèbre en gastrulation, le sort des cellules est
spécifié de manière progressive dans le temps en raison des changements dans la sensibilité des tissus
cibles au ligand BMP. La signalisation BMP pendant la gastrulation précoce active la mise en place des
domaines ventrolatéraux antérieurs, tandis que plus tard, le même signal favorise la mise en place des
domaines ventrolatéraux postérieurs (Tucker et al., 2008). Dans un autre exemple, le développement de
l’œil est dépendant de l’expression de Pax6. Des expansions latérales du tube neural appelées vésicules
optiques induisent l’ectoderme en surface à donner le cristallin. Or Pax6 est exprimé dans les deux tissus.
Des expériences de recombinaison ont été réalisées entre vésicules optiques et ectoderme de surface
provenant soit d’une souris sauvage, soit d’une souris Pax6-/-.

**Figure 2-22. Expériences de recombinaison de tissus avec des génotypes différents pour tester quel tissu a besoin
de la fonction de Pax6 lors de l’induction du cristallin.

Ces résultats montrent que pour qu’il y ait induction du cristallin, il faut que le tissu cible de l’induction,
l’ectoderme de surface exprime Pax6 et que l’expression de Pax6 n’est pas indispensable dans le tissu
inducteur. Cela veut dire que Pax6 contrôle la compétence de l’ectoderme de surface à recevoir les signaux
en provenance des vésicules optiques.

Au cœur de la notion de morphogène, se trouve le concept de gradient. Trois modalités générales de

formation de gradient ont émergé: le transport actif, la diffusion libre et la diffusion régulée, dans lesquelles
des molécules de liaison extracellulaire (les composants de la matrice extracellulaire par exemple)
interagissent avec le ligand pour modifier sa distribution finale (Müller et al., 2013).

Il existe au moins deux mécanismes de transport actif: le transport basé sur les vésicules, notamment la
transcytose et les migrasomes, dans lequel les ligands morphogènes naviguent à travers les tissus via des
cycles répétés d’endo- et d’exocytose médiée par les récepteurs (González- Gaitán et Jäckle, 1999; Greco et
al., 2001; Kicheva et al., 2007; Restrepo et al., 2014) et le transport médié par les cytonèmes, dans lequel de
vastes réseaux de filopodes mis en place par les microfilaments d’actine agissent comme des conduits
directs pour la transmission du morphogène aux cellules cibles (Ramírez-Weber et Kornberg, 1999). Il est
également apparu que les cellules réceptrices peuvent envoyer des cytonèmes à la rencontre des cytonèmes
qui sécrète le morphogène. C’est le cas lors de la mise en place de la polarité antéro-postérieure de l’aile de
la drosophile qui dépend de Hedgehog (Gonzalez-Menendez et al., 2017). Ici, le mécanisme dominant
d’action à distance n’est plus la diffusion du morphogène dans l’espace intercellulaire mais bien le transport
dans les cytonèmes.

62
 **Figure 2-23. Interactions entre les cytonèmes produits
par les cellules qui secrètent le morphogène Hedgehog
(Hh) et ceux produits par les cellules qui reçoivent le
signal le long de l’axe antéro-postérieur de l’aile de la
drosophile. La couleur verte correspond aux sites
spécifiques pour la réception de Hh le long des
cytonèmes chevauchants.

Source :https://elifesciences.org/articles/24045

**Figure 2-24. Transport de vésicules avec des ligands ou

des récepteurs dans les cytonèmes. C'est la myosine-10
qui transporte les vésicules le long des microfilaments
d'actine dans les cytonèmes. Source :
https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-
022-04148-x

Pour la diffusion régulée et la diffusion libre, il est utile de faire la distinction entre la diffusion régulée par
des facteurs immobiles, tels que les récepteurs et co-récepteurs, ainsi que les composants de la matrice
extracellulaire et d’autres interactants mobiles avec les morphogènes qui ont un impact sur sa plage et sa
vitesse de diffusion. La simulation de modèles mathématiques réaction-diffusion des étapes de transport et
de réaction des molécules est de plus en plus utilisée pour mieux comprendre les mécanismes et les
contributions relatives des facteurs mobiles et immobiles sur la formation des gradients, ce qui aurait
beaucoup plu à Alan Turing.

Prenons l’exemple du gradient de BMP qui a une importance considérable pour la mise en place de l’axe
dorso-ventral chez les animaux. Le principal régulateur de BMP est la protéine Chordine qui est produite à
l’extrémité opposé de l’axe par rapport à la zone de production de BMP. Chordine se lie à BMP dans l’espace
intercellulaire et l’empêche d’accéder à son récepteur. Dans le « modèle de navette », Chordine est très
mobile et se lie avec une forte affinité à un dimère de ligand BMP peu diffusif et ainsi Chordine facilite la
retour de BMP vers sa zone de production (Ben-Zvi et al., 2014). La métalloprotéase conservée Tolloid clive
Chordine, libérant le ligand BMP qui peut se lier à son récepteur. Le gradient d’action de BMP est ainsi plus
étroit et avec une pente plus raide. Signalons que Noggin et Follistatine, fonctionnent de manière similaire
à Chordine en se liant directement aux ligands BMP (Little et Mullins, 2006). Cependant, ils ne sont pas
clivés par le traitement Tolloid et fonctionnent principalement pour bloquer la signalisation BMP dans
l’organisateur dorsal (Dal-Pra et al., 2006; Khokha et al., 2005).

63
 ***Figure 2-25. Contribution du navettage par Sog/Chordine au gradient du morphogène Dpp/BMP. (A) Vue en
coupe transversale de l’embryon de drosophile représentant la navette Sog pour Dpp (l’orthologue de BMP chez la
drosophile). (B) Vue latérale d’un embryon de vertébré représentant Chordine (Chd) faisant la navette de BMP en
direction de la région ventrale. (C) Contre-gradient : Chd diffuse ventralement pour former un contre-gradient
réprimant le BMP. (D) Navette: BMP lié à Chd est transporté ventralement, où il est libéré par clivage Tolloid. (E)
Transcriptionnel : BMP reste là où il est produit, reflétant le gradient d’expression bmp. (F) Source-puits : BMP
diffuse de sa source de production ventrale à un puits de Chd dorsal. Source :
https://elifesciences.org/articles/22199

Contrairement au xénope ou à la drosophile qui fonctionnent avec le modèle précédent, la formation d’un
gradient de BMP dans l’embryon de poisson zèbre se produit par le biais d’un mécanisme «source-puits».
Dans ce modèle, une Chordine exprimée dorsalement et à diffusion restreinte agit en liant et en séquestrant
les ligands BMP dorsalement, fournissant les conditions d’un flux net de ligands BMP vers le « puits »
Chordine et loin de la source BMP (Reversade et De Robertis, 2005; Zinski et al., 2017).

Des gradients de morphogène peuvent être également renforcés en créant un passage étroit pour le ligand.
C’est le cas pour BMP lors de sa participation à l’induction du mésoderme dans l’épiblaste de souris. Il est
secrété par l’ectoderme extraembryonnaire dans le liquide extracellulaire qui se trouve dans la cavité pré-
amniotique. Ses récepteurs se trouvent sur le côté basolatéral de l’épithélium épiblastique. Les ligands BMP
ne peuvent passer la barrière épithéliale qu’à la frontière entre l’ectoderme extraembryonnaire et
l’épiblaste car il n’y a pas de jonctions serrées à cet endroit. Cela a pour conséquence de concentrer le ligand
BMP sur les récepteurs des cellules de l’épiblaste près de cette frontière et de renforcer le gradient
inducteur (Zhang et al., 2019).

64
***Figure 2-26. Un passage à travers un épithélium et la localisation basolatérale des récepteurs facilite la formation
d’un gradient de signalisation robuste dans l’embryon de souris précoce. a) Schéma d’un embryon de souris pré-
gastrulation, avec l’épiblaste (blanc) et l’ectoderme extra-embryonnaire (ExE, gris clair) enfermant ensemble la
cavité pré-amniotique. Les membranes apicales des cellules épiblastiques font face à la cavité pré-amniotique tandis
que les membranes basolatérales font face à l’espace interstitiel. b) Les cellules ExE sécrètent des ligands BMP4 à
partir de leurs membranes apicales, tandis que les cellules épiblastiques ont des récepteurs BMP (rouges) sur leurs
membranes basolatérales. Les ligands ne peuvent pas diffuser au-delà des jonctions serrées entre les cellules (noir).
Les trajectoires simulées des ligands montrent que les ligands diffusent depuis le bord de l’épiblaste (flèche noire) à
travers l’espace interstitiel où il n’y a pas de jonctions serrées et peuvent accéder et se lier aux récepteurs
basolatéraux. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-019-12533-7

Les motifs tissulaires, tels que les taches ou les rayures sur la peau, sont établis pendant le
développement et maintenus tout au long de la vie adulte. Dans un tissu à motifs, les cellules
reçoivent des signaux et acquièrent des identités en fonction de leur position. Différentes
approches existent pour expliquer ces phénomènes. Premièrement, le système de structuration
de Turing (Turing, 1952) propose la présence de cellules sources sécrétant des activateurs et des
inhibiteurs avec différents coefficients de diffusion. En sécrétant des activateurs locaux et des
inhibiteurs à longue portée, les tissus s’organisent selon un schéma dit de Turing. La peau du
poisson zèbre se caractérise par une alternance de rayures dorées et argentées. Au cours du
développement, les cellules pigmentées appelées mélanophores et xanthophores s’organisent
selon un modèle de type Turing en ayant deux effets opposés l’un sur l’autre en fonction de la
distance (Nakamasu et al., 2009). L’inhibition se produit localement, tandis que l’activation se
produit sur une longue distance.

65
 Un autre mécanisme qui peut créer des motifs est l’inhibition latérale. Un exemple bien étudié est
l’inhibition latérale de Notch entre les cellules du neuroectoderme de la drosophile (Kunisch et al.,
1994). Cette structuration est basée sur l’interaction du récepteur Notch et du ligand membranaire
Delta sur les cellules voisines. La signalisation Notch réprime la capacité d’une cellule à devenir un
neurone mais aussi à exprimer Delta, qui ne peut donc pas activer Notch dans les cellules voisines.
Un modèle stable de type poivre-et-sel d’identité cellulaire apparaît dans le neuroectoderme, où les
cellules pauvres en signalisation Notch (participent à la formation des neurones) sont entourées de
cellules riches en signalisation Notch (ne participent pas à la formation des neurones).

Les gradients de morphogènes activent des réseaux de régulation géniques de manière régionalisée.
Ensuite, ces combinaisons de facteurs de transcription peuvent maintenir l’identité régionale même
si le gradient a disparu. Des adhérences spécifiques peuvent se mettre en place à l’intérieur d’une même
région et exclure un mélange des lignages par la suite. C’est ce que l’on observe par exemple lors de la
régionalisation du rhombencéphale en rhombomères.
**Figure 2-27. D’un gradient d’acide rétinoïque à
l’identité des rhombomères. (A) Activation par un
gradient d’acide rétinoïque (AR) du réseau de régulation
génique utilisé dans le cerveau postérieur lors de la
spécification des rhombomères r2-6. Puis un deuxième
morphogène, le facteur de croissance des fibroblastes
(FGF) diffuse et contrôle l’expression des gènes en aval.
(B) Schéma décrivant r2-6 et les identités distinctes des
rhombomères le tri cellulaire sélectif. Les cellules dans
r3 et r5 (bleu) expriment krox20 et les cellules dans r4
(rouge) expriment hoxb1a, tandis que les niveaux de
krox20 et hoxb1a sont faibles dans r2 et r6. Les cellules
de r6 (violet) ont une forte expression de vhnf1. Les
cellules ayant la même identité segmentaire s’attirent et
les cellules ayant des identités différentes se repoussent.
Les données proviennent du poisson-zèbre mais sont
généralisables à l’ensemble des Vertébrés. Source :
https://journals.plos.org/ploscompbiol/

article?id=10.1371/journal.pcbi.1009077

Les cellules souches

*Figure 2-28. Peau produite in vitro destinée à être
greffée sur un grand brûlé. Cette peau a pu être produite
grâce à des cellules souches. Les grands brûlés ne
peuvent réparer spontanément leur peau endommagée
car les cellules souches à la base de leur épiderme ont été
détruites. On prélève une petite partie de leur peau saine
et on l'expand en culture avant de greffer cette nouvelle
peau sur les parties brulées. En fonctionnement
physiologique normal, les cellules souches de l'épiderme
permettent le renouvellement progressif de l'épiderme
en 21 à 28 jours Source :
https://www.eurostemcell.org/fr/cellules-souches-de-
la-peau-ou-se-trouvent-elles-et-que-peuvent-elles-faire

66
Généralités

ar définition, les cellules souches sont des cellules capables d’auto-renouvellement lors des

P
divisions cellulaires. C’est-à-dire que lors d’une mitose au moins l’une des deux cellules filles
conserve des propriétés de cellules souches. L’autre cellule peut être :

• soit une deuxième cellule souche (la division est alors dite symétrique et a permis
d’augmenter le pool de cellules souches)

• soit une cellule qui va perdre les caractères de cellules souches (la division est alors dite
asymétrique). Cette cellule peut continuer à proliférer et ses descendantes pourront se
différencier.

*Figure 2-29. Différents cas de figure de divisions cellulaires impliquant des cellules souches.

L’équilibre entre ces deux modalités est crucial pour le bon développement d’un organisme mais
aussi pour l’homéostasie (le renouvellement normal des cellules) ou la régénération lors de
blessures ou de pathologies. Il est aussi possible qu’il y ait une division symétrique qui aboutisse à
ce que les deux cellules-filles perdent leur caractère de cellule souche. Dans ce cas, cela provoque
l’épuisement du pool de cellules souches, qui est une des composantes du vieillissement des
organismes. Cela a bien été prouvé dans le cas des cellules souches mélanocytaires qui finissent par se
différencier au cours du vieillissement ce qui provoque le blanchiment des poils et des cheveux car le
renouvellement des mélanocytes ne peut plus se faire (Inomata et al., 2009). Chez les végétaux, on peut
par exemple observer l'épuisement des cellules souches dans le méristème apical caulinaire à la fin
de la formation de la fleur.

Attention à ne pas confondre la notion de cellule souche et de pluripotence. Il existe des cellules
souches « monopotentes » capables de ne générer des cellules que d’un seul type cellulaire (les cellules
satellites des muscles striés squelettiques en sont un exemple).

Les cellules souches sont bien entendu très nombreuses dans les embryons. Au fur et à mesure que
le développement se déroule, une part de plus en plus importante de cellules va être déterminée
puis se différencier. Les cellules souches deviennent minoritaires, cantonnées à ce que l’on appelle
une niche, c’est-à-dire dans un environnement propice au maintien de leur caractères particuliers
(par exemple au fond des cryptes de Lieberkühn pour les cellules souches de l’épithélium intestinal,
reconnaissables à leur expression du récepteur Lgr5). Les éléments importants de cet
environnement sont constitués par la matrice extracellulaire, la présence de molécules de
signalisation, l'adhérence avec les cellules voisines et quelque fois le niveau d’oxygénation (un
milieu hypoxique protège du stress oxydatif). Les cellules souches permettent de renouveler les
cellules qui n’ont qu’une durée de vie limitée (kératinocytes de la peau, entérocytes de l’intestin,
cellules sanguines…). Dans le cas des cellules sanguines, 100 milliards de cellules doivent être
67
remplacées chaque jour chez l'Homme ! Les cellules souches permettent une régénération qui est
essentielle pour l’homéostasie tissulaire.

L’exemple du renouvellement de l’intestin

L'intestin grêle peut être subdivisé en deux compartiments : les villosités, qui contiennent des
cellules différenciées et les cryptes, où résident les cellules souches. Le renouvellement de l'épithélium
doit se faire régulièrement car il est agressé par le contenu de la lumière intestinale (substances toxiques
dans l'alimentation, toxines produites par les bactéries...). En période d'homéostasie, le temps de
renouvellement des villosités est de 5 jours.

Un pool de cellules souches hautement prolifératives est présent et doit donner en permanence des
cellules qui se différencient pour maintenir l'intégrité de la barrière épithéliale intestinale (Barker
et al., 2007). Le récepteur Lgr5 marque ces cellules souches adultes. Ces cellules se trouvent au fond
des cryptes remplies de mucus, relativement à l'abri des molécules génotoxiques qui pourraient provenir
de la nourriture. Elles sont au nombre de 4 à 6 dans chaque crypte de l'intestin grêles chez la souris
(Freeman, 2008). Ces cellules souches sont entourées des cellules de Paneth et de cellules
mésenchymateuses sous-épithéliales appelées cellules stromales péricryptiques. Si on élimine soit les
cellules de Paneth, soit les cellules stromales, les cellules Lgr5+ perdent leurs caractères de cellules souches
(Sato et al., 2011), montrant que les cellules de Paneth et les cellules stromales sont essentielles pour le
maintien de la niche. Ces cellules environnantes fournissent des facteurs de niche pour le maintien des
cellules souches. Les signaux Wnt, le facteur de croissance épidermique (EGF) et des ligands de Notch sont
fournis par les cellules de Paneth, tandis que Wnt, EGF, R-Spondine et deux antagonistes des BMP appelés
Gremlin et Noggin sont fournis par les cellules stromales péricryptiques.

*Figure 2-30. Dynamique de renouvellement de l'épithélium intestinal. L'épithélium intestinal est reconstitué tous
les 5 jours à partir des cellules souches intestinales Lgr5+ dans la base de la crypte. Une partie des descendants de
ces cellules se différencient à mesure qu'elles remontent l'axe de la crypte et des villosités. Elles finissent par se
détacher dans la lumière intestinale et par mourir par anoikis (apoptose due à un détachement de la matrice
extracellulaire). Les cellules de Paneth sont localisées entre les cellules souches intestinales, et elles sont importantes
pour maintenir la niches des cellules souches. Juste au-dessus de cette zone, souvent en position "+4", se trouvent
des cellules à cycle lent ou quiescentes, résistantes aux agressions, qui expriment les marqueurs Bmi1, Hopx, mTert
et Lrig1. Ce sont des cellules souches "de réserve". Plus haut, dans la zone TAZ (pour Transit-Amplifying Zone) se
trouvent les précurseurs de cellules matures en prolifération exprimant Atoh1 (ou Math1) et Hopx, qui donnent
naissance à différentes lignées de cellules épithéliales. Les cellules qui perdent l'expression de Atoh1/Math1
deviennent des entérocytes. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.583919/full

68
Lgr5 est une protéine intéressante. Son gène a été identifié initialement comme une cible de la voie Wnt
dans les cellules souches intestinales. C’est une protéine à 7 domaines transmembranaires de la famille des
rhodopsines. Le fait que ce soit un récepteur de la R-spondine qui est une protéine connue pour
potentialiser la signalisation Wnt montre qu’une boucle de rétroaction positive est à l’œuvre dans les
cellules souches de l’intestin (de Lau et al., 2014). Cette signalisation Wnt est indispensable pour que les
cellules Lgr5+ maintiennent leurs propriétés de cellules souches.
*Figure 2-31. Activité Wnt dans une crypte intestinale de
souris. Le gène rapporteur LacZ a été mis sous le contrôle
d'un promoteur activé par la voie de signalisation Wnt.
On constate que l'activité Wnt est concentrée au fond des
cryptes, là où se trouvent les cellules souches. La flèche
indique une cellule en mitose, sans doute un précurseur
intestinal (pas dans la zone des cellules souches). Barre
d'échelle = 20 µm.
Source : https://journals.asm.org/doi/10.1128/MCB.01034-07

**Figure 2-32. Régulation de la disponibilité des récepteurs Wnt sur les cellules souches intestinales. (A) Lors de la
liaison de Wnt au complexe récepteur Frizzled (Fz)/LRP, quelque 100 gènes cibles de Wnt sont activés, y compris
Lgr5. Deux autres gènes cibles de Wnt, Rnf43 et Znrf3, codent des ligases E3 transmembranaires contenant un
domaine RING cytoplasmique. Elles servent de composants d’une boucle de rétroaction négative : (B) En effet,
l’interaction enzymatique du domaine RING associé à Rnf43/Znrf3 avec le complexe Fz/LRP conduit à une
polyubiquitination des boucles intracellulaires du domaine 7TM de Fz. (C) L’endocytose résultante de Fz/Lrp inhibe
la signalisation Wnt. On ne sait pas si Rnf43/Znrf3 sont endocytosés avec le complexe récepteur Wnt ou se séparent
après leur action. Lorsque la R-spondine est présente (D), elle est recrutée par Lgr5 ou son homologue, Lgr4 (E). Cela
permet ensuite à la R-spondine d’interagir avec Rnf43/Znrf3 (E), entraînant la clairance membranaire de ce dernier
(F). En conséquence, les complexes récepteurs Wnt/Fz/Lrp persistent sur la membrane plasmique, améliorant la
force et la durée du signal Wnt. Source : http://genesdev.cshlp.org/content/28/4/305.full.html

La niche des cellules souches est de taille restreinte et ne peut contenir qu’un certain nombre de cellules
souches Lgr5+. Par conséquent, une compétition entre les cellules souches se produit dans laquelle les
cellules qui sont poussées hors de la niche perdent leurs caractères de cellules souches et se différencient

69
en plusieurs types cellulaires de l’épithélium intestinal (Corominas-Murtra et al., 2020; Snippert et al.,
2010). La voie de signalisation BMP est responsable de la perte des propriétés de cellules souches (Qi et al.,
2017). Les cellules ne sont plus protégées de l’influence des BMP par Gremlin et Noggin comme c’était le
cas avant lorsqu’elles se trouvaient à côté des cellules mésenchymateuses qui les produisent. Ici,
l’homéostasie est obtenue par régulation sur la population de cellules souches via des facteurs externes au
lieu de réguler la symétrie de division dans les cellules souches individuelles.

Le même scénario se reproduit pour les cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire chez les
Mammifères. BMP est produit par les cellules endothéliales dans la région basale alors que les cellules de
l'épendyme dans la région apicale produisent Gremlin et Noggin. BMP pousse les cellules à perdre leur
caractère de cellules souches et à devenir des cellules gliales. La niche des cellules souches neurales se
trouve accolée aux cellules de l'épendyme donc elles sont protégées de l'influence de BMP par Gremlin et
Noggin qui sont sécrétés localement (Lim et al., 2000). Cependant, si une cellule fille quitte la région apicale
et se rapproche des cellules endothéliales de la région basale, elle subit l'influence des BMP et sera
déterminée en cellule gliale.

La division asymétrique des cellules souches

Nous l'avons vu en introduction, la division asymétrique des cellules souches est un paramètre
essentiel pour leur maintien tout en assurant la production de cellules qui vont pouvoir se
différencier. Une division asymétrique implique de répartir les composants cellulaires de manière
inégale ce qui met en jeu des protéines dont le rôle est d'établir la polarité cellulaire. Cette polarité
doit être étroitement couplée avec le plan de division mitotique.
*Figure 2-33. Contrôle de l'identité des cellules lors de la
division asymétrique des cellules souches neurales de la
drosophile. Les cellules souches neurales ou neuroblastes de
la drosophile se divisent par division asymétrique. Pour
répartir les composants cellulaires de manière inégale, ces
cellules utilisent un croissant apical composé du complexe
Par3/aPKC (marqué en rouge) pour établir la polarité
cellulaire. Lorsque le neuroblaste entre en mitose, le
croissant apical recrute des protéines supplémentaires qui
orientent correctement le fuseau mitotique et répartissent de
manière différentielle les composants de la voie de
signalisation Notch, de sorte qu'à la fin de la mitose, la cellule
conservant le croissant apical reste une cellule souche et
l'autre devient un précurseur qui va se différencier après
quelques divisions (GMC = Ganglion Mother Cell). Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3537149/

Dans certains cas (épiderme, cellules satellites musculaires...), le maintien du contact avec la lame basale
est un élément essentiel du maintien des caractères de cellules souches lors des divisions asymétriques. Si
la mitose aboutit à générer une cellule qui n'est plus en contact avec la lame basale, elle perd ses propriétés
de cellule souche. Elle ne se trouve plus dans la "niche" qui permet de maintenir ces propriétés.

*Figure 2-34. Divisions symétriques et asymétriques des cellules souches de l'épiderme. Les cellules basales de
l'épiderme qui sont des cellules souches sont polarisées par des jonctions adhérentes intercellulaires (marquées en

70
 rose) et des jonctions avec la lame basale, notamment les hémidesmosomes qui contiennent des intégrines et aussi
des récepteurs à des facteurs de croissance (jonctions marquées en bleu). La polarité de la cellule permet de localiser
un croissant apical, qui sert de plate-forme pour recruter une partie des composants qui orientent le fuseau mitotique
que le neuroblastes de la drosophile (voir plus haut). Après des divisions perpendiculaires à la lame basale, une
cellule-fille hérite de manière disproportionnée des intégrines et des récepteurs des facteurs de croissance associés,
et reste en contact avec la lame basale et à proximité des sources de facteurs de croissance. Cette cellule persiste en
tant que cellule souche basale, tandis que la cellule fille au-dessus d'elle ne reçoit plus de signaux de la lame basale
et moins de facteurs de croissance et hérite de manière différentielle de la signalisation Notch. Certaines cellules
souches (à droite) se divisent de manière symétrique avec les deux cellules-filles qui restent en contact avec la lame
basale. Cela permet d'augmenter le pool de cellules souches. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3537149/

Une division asymétrique peut aussi provoquer la sortie d'une cellule souche de sa niche, indépendamment
de la lame basale. Par exemple, les cellules souches germinales dans le germarium de drosophile sont en
contact avec les cellules de la coiffe qui leur envoient des signaux (Dpp et Hedgehog) qui maintiennent leurs
caractères de cellules souches, en inhibant l'expression du gène Bam (Casanueva et al., 2004). Ces cellules
souches se divisent de manière asymétrique : une des 2 cellules-fille perd le contact avec les cellules de la
coiffe et se retrouve trop éloignée des sources de Dpp et Hedgehog et active l'expression du gène Bam qui
provoque sa différenciation.

La régénération chez les animaux

Lorsqu’ils sont confrontés à une blessure ou à une maladie, les animaux peuvent réparer ou même
remplacer les tissus endommagés. Ce processus de régénération est observé dans toutes les espèces
animales, mais il y a de très grandes variabilités selon les différents phyla concernant l’étendue des
dommages « réparables ».

Tous ces processus sont souvent alimentés par des cellules souches résidentes dans les tissus
(Sánchez Alvarado et Tsonis, 2006; Tanaka et Reddien, 2011). En réponse à une blessure, les cellules
souches accélèrent la production de types spécifiques de cellules différenciées pour réparer les
tissus endommagés. Par exemple, chez les mammifères adultes, les lésions de l’intestin, de la peau
ou des poumons incitent les cellules souches à augmenter les taux de prolifération et à produire en
grand nombre des cellules qui vont se différencier (Buczacki et al., 2013; Stabler et Morrisey, 2017;
Tumbar. et al., 2004). Cela indique que les blessures peuvent modifier le comportement des cellules souches
pour favoriser la réparation, mais la façon dont ces changements contribuent à la régénération est encore
un vaste domaine à explorer.

L’étude de la régénération fait appel souvent à des modèles plus originaux que d’autres études de
développement car les modèles « classiques » (drosophile, souris…) ont des capacités de régénération
relativement faibles. Chez l’axolotl ou la salamandre (Amphibien Urodèle), on étudie la régénération
de la patte après section. On observe une prolifération des cellules souches formant un blastème
dans lequel des progéniteurs se mettent en place et produisent une nouvelle patte avec l’ensemble
de ses types cellulaires (muscles, ostéocytes, épiderme…). Les cellules souches dans ce cas
proviennent de la dédifférenciation de cellules dans le moignon restant. D'autres exemples similaires
existent chez le poisson-zèbre où la rétine peut être régénérée à partir de la dédifférenciation des cellules
gliales de Müller et le ventricule du cœur peut être régénéré à partir de la dédifférenciation des
cardiomyocytes.

Prenons comme autre exemple la planaire d’eau douce Schmidtea mediterranea. C’est un organisme modèle
idéal car sa capacité de régénération est pratiquement illimitée et dépend d’une population abondante de
cellules souches appelées néoblastes (Adler et Sánchez Alvarado, 2015). Définie par l’expression de la
protéine de la famille argonaute, piwi-1 qui est capable de se lier à de courtes molécules d’ARN (Reddien et
al., 2005), la population de cellules souches de la planaire est constituée de cellules totipotentes capables
de reconstituer l’animal entier (Wagner et al., 2011) et aussi de cellules souches spécifiques de certains
organes (Scimone et al., 2014 ; van Wolfswinkel et al., 2014 ; Zeng et al., 2018).

Dans des conditions homéostatiques, le facteur de transcription de la famille Forkhead FoxA est exprimé
dans le pharynx et un sous-ensemble de cellules souches qui y résident. L’amputation du pharynx déclenche

71
une augmentation des cellules souches FoxA+, démontrant que la blessure élargit le pool de cellules souches
spécifiques du pharynx.
**Figure 2-35. Progéniteurs de divers lignées cellulaires
pour la régénération des organes chez la planaire. (A)
Plusieurs progéniteurs spécialisés pour de nombreux
tissus sont produits au cours de l’homéostasie, dérivés
de cellules souches pluripotentes. (B) Modification de la
distribution des marqueurs de progéniteurs spécifiques
aux organes après les amputations (surlignés en rose ou
en violet). L’amputation de la tête stimule la production
de nouveaux photorécepteurs, initiée par l’activation de
l’expression d’ovo dans les cellules souches. La déplétion
d’ovo provoque une incapacité très spécifique à
régénérer les photorécepteurs, tandis que d’autres tissus
se régénèrent normalement, suggérant qu’ovo
fonctionne comme un gène sélecteur pour conduire à la
formation de photorécepteurs. Un cas similaire concerne
le gène FoxA et le pharynx. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4628888/

Au cours d’une vie normale sans blessure particulière (phase d’homéostasie), les cellules souches de la
planaire reconstituent les organes par une prolifération constante qui entraîne le renouvellement cellulaire.
En cas de blessure, une augmentation générale de la division des cellules souches se produit en quelques
heures, ainsi que de vastes changements transcriptionnels (Gaviño et al., 2013 ; Wenemoser et al., 2012).

***Figure 2-36. Exemple de gène induit après une blessure et qui est nécessaire à la régénération. fst est un gène qui
code l’orthologue chez la planaire de la follistatine, un inhibiteur de ligands de la famille des TGFbeta tels que
l’activine.

(A) Les animaux traités avec un ARNi (ARN interférence) inhibant la production de Fst n’ont pas formé de blastèmes
de régénération après amputation (gauche, pointes de flèche, n > 100) et n’ont pas régénéré un cerveau tel qu’évalué
par hybridation in situ avec une sonde d’ARN reconnaissant l’ARNm codant la choline-acétyltransférase (chat, milieu,
pointe de flèche, n = 9/ 9). (B) Les animaux fst(ARNi) n’ont pas formé de blastèmes 8 jours après l’excision d’un coin
de tissu latéral (tête de flèche, n = 14/14). (C) Les animaux fst(ARNi) n’ont présenté aucun phénotype en l’absence
d’amputation (à droite, n = 30/30, 123 jours après traitement ARNi). Cela montre bien que Fst n’est pas
indispensable pour l’homéostasie (maintien des tissus) mais seulement pour la régénération (D) Les animaux
72
 fst(ARNi) produisaient encore de nouveaux neurones 20 jours après avoir échoué à se régénérer (n = 8/8 ; les cellules
qui sont SMEDWI protein+ et chat+ sont des neurones nouvellement différenciés [Wagner et al., 2011]), démontrant
un renouvellement tissulaire continu dans les vieux tissus. Barre d’échelle 10 µm. (E) fst est exprimé de façon
clairsemée dans tout l’animal intact et au pôle antérieur. Après l’amputation de la tête et de la queue, une expression
fst robuste se produit sur les sites de plaies antérieures et postérieures, avec un pic d’expression 12 heures après
l’amputation. Barres d’échelle = 100 µm pour la gauche de (A), (B) et (C) ; 200 µm pour la droite de (A) et (E). Région
antérieure vers le haut. Source : https://elifesciences.org/articles/00247

Activée par la blessure, la kinase ERK contribue à bon nombre de ces changements transcriptionnels induits
par les blessures, en plus de réguler la prolifération, la différenciation et la survie des cellules souches
(Owlarn et al., 2017; Shiroor et al., 2020). L’augmentation de l’activité de ERK dans les cellules souches
après une blessure leur permet même de mieux survivre à des radiations. Ce genre d’étude peut permettre
de comprendre comment certaines cellules souches tumorales peuvent survivre à une radiothérapie.
***Figure 2-37. L’activation de ERK dans les cellules
souches après une blessure améliore leur survie
après une irradiation. De faibles doses de
rayonnement éliminent la majorité des cellules
souches de la planaire. Une blessure produite dans
une fenêtre de temps définie entourant l’irradiation
aboutit à une meilleure survie des cellules souches.
L’inhibition pharmacologique de la kinase ERK
empêche la persistance des cellules souches après
une blessure et une irradiation. Source :
https://www.cell.com/current-
biology/fulltext/S0960-9822(20)30424-3

Cellules souches quiescentes, actives et sénescentes

Revenons à des considérations générales. Au cours du vieillissement ou de certaines maladies, le
nombre et / ou l’activité des cellules souches adultes diminue, empêchant le remplacement des
cellules âgées (ou défectueuses). Cela contribue à la baisse des performances fonctionnelles (Schultz
et Sinclair, 2016; Tümpel et Rudolph, 2019). Ce déclin des cellules souches est dû à la fois à des
mécanismes intrinsèques et à des changements dans les signaux extrinsèques de l’environnement
des cellules souches (niche). Les cellules souches peuvent alors entrer en sénescence (G0
irréversible) ou mourir.

Les cellules souches adultes dans différents tissus présentent diverses stratégies pour assurer leur maintien
tout au long de la vie de l’organisme (Mohammad et al., 2019).

L’une de ces stratégies consiste à rester dans un état non prolifératif, appelé quiescence, qui protège
l’ADN des cellules des mutations acquises au cours des cycles successifs de division cellulaire (Walter
et al., 2015). Les cellules quiescentes sont sorties du cycle cellulaire mais cet état est réversible.

73
 **Figure 2-38. Différents états des cellules souches et propriétés des cellules souches adultes quiescentes. Les
cellules des eucaryotes unicellulaires et multicellulaires peuvent répondre à certains signaux environnementaux en
arrêtant le cycle cellulaire et en entrant dans un état de quiescence réversible. Les cellules quiescentes ne se divisent
pas, mais peuvent réintégrer le cycle cellulaire et reprendre la prolifération si elles sont exposées à certains signaux
de l’environnement. Les cellules quiescentes chez les mammifères et notamment les humains comprennent les
cellules souches adultes. Les propriétés des cellules quiescentes par rapport aux cellules souches actives sont
présentées (hausse et baisse des paramètres avec les flèches de couleurs). Un déclin lié à l’âge de la capacité des
cellules souches adultes à équilibrer le maintien de la quiescence et la prolifération régulée a été impliqué dans de
nombreuses maladies associées au vieillissement. Source : https://www.mdpi.com/1422-0067/20/9/2158

Le métabolisme des cellules quiescentes est faible. Très souvent, l’élimination des mitochondries par
l’autophagie (mitophagie) est responsable de la diminution du métabolisme et est importante pour
maintenir la quiescence (Ho et al., 2017 ; Zhang et al., 2018). La perte de mitophagie dans les cellules
souches hématopoïétiques (HSC) entraîne une augmentation du nombre de mitochondries, une activité
métabolique globale plus élevée et une réentrée aberrante dans le cycle cellulaire (Ho et al., 2017).

Les cellules souches adultes quiescentes sont trouvées dans de nombreux tissus, mais la proportion de ces
cellules est plus grande dans les tissus à faible renouvellement, tels que le muscle strié squelettique ou
l’hippocampe dans le cerveau, par rapport aux tissus à renouvellement rapide, comme la peau ou l’intestin.
Le sang est un « tissu » à taux de renouvellement élevé qui échappe à cette généralisation : les cellules
souches hématopoïétiques (HSC) restent pour la plupart quiescentes et donnent naissance à des
progéniteurs multipotents pour soutenir la production de cellules sanguines (Nakamura-Ishizu et al., 2014;
Pinho et Frenette, 2019). La niche dans laquelle se trouvent les HSC et les paramètres qui la constituent font
partie des sujets les plus étudiés en biologie des cellules souches.

74
 ***Figure 2-39. Constituants cellulaires et moléculaires de la niche des cellules souches hématopoïétiques.

Divers types de cellules ont été impliqués dans la régulation de l’activité des cellules souches hématopoïétiques
(HSC), notamment les cellules souches mésenchymateuses périvasculaires (CSM), les cellules endothéliales, les
ostéoblastes, les cellules adipocytaires, les nerfs du système nerveux sympathique (SNS), les cellules de Schwann
non myélinisantes, les macrophages, les mégacaryocytes et les lymphocytes T régulateurs (Treg). Le schéma illustre
comment les cellules de niche de la moelle osseuse (BM) contribuent à la régulation des HSC indirectement ou
directement en synthétisant des facteurs de niche sous la forme de molécules liées aux cellules ou sécrétées. La
couleur des rayons radiaux indique l’activité HSC qui est affectée. Un astérisque* indique les molécules impliquées
dans la régénération de la moelle osseuse après ablation. Les caractères gras indiquent les molécules pour lesquelles
il existe des données fonctionnelles utilisant des preuves génétiques spécifiques aux cellules. SCF, facteur de cellules
souches; CXCL12, ligand CXC-chimiokine 12; CXCL4, ligand de chimiokine CXC 4; FGF1, facteur de croissance des
fibroblastes 1; TGFβ, facteur de croissance transformant-β; DARC, récepteur d’antigène duffy pour les chimiokines ;
GP130, glycoprotéine 130; VCAM1, molécule d’adhésion cellulaire vasculaire 1; IL-10, interleukine-10. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6483843/

Les premières cellules souches hématopoïétiques (HSC) ne se forment pas dans la moelle osseuse
mais dans une annexe extraembryonnaire : la vésicule vitelline. Une deuxième génération de HSC
nait dans la paroi de l'aorte de l'embryon et gagne via la circulation sanguine le foie où ces cellules
permettent la production des cellules sanguines de l'embryon puis du fœtus (Boulais et Frenette,
2015). Lorsque les os se développent, de nouvelles HSC circulantes dans le sang s'installent dans la
moelle osseuse dans ce qui va constituer leur niche pour le restant de leur vie. Les HSC y sont
attirées par la chimiokine CXCL12 (ou SDF-1) produite par les ostéoblastes et les cellules stromales
de la moelle osseuse, dont le récepteur est CXCR4 à la surface des HSC (Asri et al., 2016).

La quiescence est essentielle pour le maintien à long terme des cellules souches adultes et des fonctions
tissulaires. Cependant, une quiescence excessive peut conduire à la génération de trop peu de cellules
prolifératives pour faire face aux besoins homéostatiques des tissus (Cheung et Rando, 2013). En revanche,
une quiescence insuffisante peut conduire à la formation de tumeurs ou, lorsque l’activation des cellules
souches n’est pas liée à l’auto-renouvellement, à l’épuisement de la réserve de cellules souches. Les cellules
souches quiescentes existent également dans de nombreux types de cancer, et elles contribuent à la capacité

75
des tumeurs à échapper à la radiothérapie et à la chimiothérapie. La quiescence contribue ainsi à la capacité
de certaines tumeurs à se développer à nouveau après le traitement.

Bien que la quiescence ait longtemps été considérée comme un état inactif, des études récentes ont montré
qu’elle est activement régulée et modulée par des signaux intrinsèques et extrinsèques. De plus, certaines
études récentes commencent à faire la lumière sur les mécanismes moléculaires permettant aux cellules
souches adultes quiescentes d’être réactivées. Les modèles les plus étudiés sont les cellules souches
hématopoïétiques (HSC), les cellules souches neurales (NSC) et les cellules souches musculaires. Ces études
ont montré qu'il existe différents sous-états de quiescence des cellules souches selon le degré de facilité à
les faire rentrer dans le cycle cellulaire et logiquement, des protéines impliqués dans le contrôle du cycle
cellulaire jouent un rôle dans ces différents états : par exemple, les cellules souches hématopoïétiques (HSC)
en quiescence profonde n'expriment pas CDK6, contrairement aux HSC capables de se remettre à proliférer
plus rapidement lors d'une stimulation mitogène. L'expression forcée de CDK6 dans les HSC à quiescence
profonde raccourcit leur temps de sortie de quiescence (Laurenti et al., 2015).

L’état d’une population de cellules souches peut être contrôlé par la signalisation Notch. Par exemple, dans
la zone ventriculaire télencéphalique du poisson zèbre adulte, les cellules souches neurales oscillent entre
un état de quiescence et un état actif qui va mener au recrutement de progéniteurs neuraux et ce sont les
niveaux de la lente oscillation de l’activité Notch qui dirige ce changement d’état (Chapoton et al., 2010)

De plus, ce sont les progéniteurs en division (c’est-à-dire les cellules recrutées qui ont perdu leur caractère
de cellules souches et qui, après prolifération, vont se différencier en neurones) qui sont la source de ligands
pour Notch, imposant une quiescence transitoire aux cellules souches voisines. C’est un mécanisme d’auto-
régulation : quand il y a trop de progéniteurs, ils activent un signal dans les cellules souches pour les
remettre dans un état de quiescence et pour produire moins de progéniteurs. Cela permet de maintenir
un équilibre entre population de cellules quiescentes et population de cellules prolifératives.
**Figure 2-40. L’inhibition de l’activité Notch déclenche
un passage des cellules souches d’un état quiescent à un
état prolifératif. Les poissons-zèbres traités avec le
solvant (a, c, f, g) et les poissons traités avec 40 µM de
DAPT (b, d, h, i), un inhibiteur de la γ-sécrétase, qui
empêche donc le clivage de Notch et sa signalisation, ont
été comparés. a, b, vue d’ensemble sur une coupe
transversale télencéphalique, d’un poisson-zèbre
gfap:GFP (GFAP est exprimé dans la glie radiaire, c’est-à-
dire dans les cellules souches neurales) et coloré par
immunofluorescence contre PCNA (rouge), un marqueur
de prolifération. On relève la densité accrue de cellules
PCNA-positives le long de la zone ventriculaire chez les
poissons traités par DAPT. c, d, zone ventriculaire
télencéphalique dorsale de gfap : GFP, contrôle (c) ou
poisson traité au DAPT (d), révélant une augmentation
des cellules de l’état prolifératif (PCNA, rouge ; GFP, vert)
au sein de la population de cellules positives pour la
GFAP. Source :
https://www.jneurosci.org/content/30/23/7961

Autre exemple, cette fois-ci sur la régulation de la sénescence. Bmi1, un répresseur de la transcription de la
famille Polycomb, est nécessaire pour des divisions cellulaires d’auto-renouvellement des cellules souches
hématopïétiques (HSC) adultes ainsi que des cellules souches neurales du système nerveux central et
périphérique adulte. En absence de Bmi1, l’auto-renouvellement des cellules souches neurales est réduit et
conduit à leur épuisement postnatal in vivo, mais la prolifération et la survie des cellules progénitrices
engagées (qui ne sont plus des cellules souches) est normale.

En l'absence de Bmi1, les gènes p16Ink4a et p19Arf codés par le même locus Cdkn2a sont anormalement
exprimés. Le maintien des capacités d’autorenouvellement par Bmi1 est médiée en partie par la
76
suppression de la voie de sénescence dépendante de p16Ink4a et nécessite une voie pRB intacte. Pour preuve,
dans les cellules souches neurales, une carence en p16 Ink4a restaure partiellement la capacité des cellules
souches déficientes en Bmi1 à s'auto-renouveler. p16Ink4a agit sur la sénescence en empêchant la liaison de
Cdk4/6 à la cycline D, inhibant l'activité kinase. Cela se traduit par une pRB hypophosphorylée, qui se lie
ensuite à E2F et inhibe la transcription médiée par E2F, conduisant à l'arrêt du cycle cellulaire et à la
sénescence.

Signalons que les cellules embryonnaires souches (ES) cultivées à partir de la masse cellulaire interne des
blastocystes et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) ne sont pas du tout quiescentes et
prolifèrent de manière active in vitro.

Dernier point : le problème des télomères. Le raccourcissement progressif des extrémités des
chromosomes, appelées télomères, est observée dans les cellules en culture et in vivo, et constitue une
caractéristique établie du vieillissement qui est souvent appelée « horloge des télomères » (Harley et al.,
1992). L'érosion des télomères se produit à cause des mécanismes de la réplication et du besoin d'une
amorce pour l'ADN polymérase. Elle se produit dans les cellules qui manquent d'activité suffisante d'une
enzyme appelée télomérase, dont le noyau catalytique est composé d'une transcriptase inverse (TERT) et
d'un composant ARN intégral (TR) qui compensent la perte des séquences télomériques dues à la
réplication. Sans télomérase, une baisse inexorable des séquences télomériques conduit finalement à ce que
l'on appelle le décapage des télomères. Ce décapage provoque une réponse aux dommages à l'ADN qui
entraîne une perte et/ou des réarrangements de matériel génétique et la mort (Lazzerini-Denchi et Sfeir,
2016; Muraki et al., 2012). Les cellules souches actives qui peuvent être amenées à se répliquer un grand
nombre de fois au cours de la vie d'un individu courent évidemment le risque de tels phénomènes. Les
cellules souches conservent une expression de TERT contrairement aux autres cellules mais cela ne peut
pas complètement compenser le raccourcissement des télomères ce qui peut être une des causes du
vieillissement et de la diminution de l'efficacité du renouvellement des cellules avec l'âge (Baerlocher et al.,
2007; Lansdorp, 2008). Par exemple, de nombreuses déficiences du maintien du nombre de cellules
sanguines au cours du vieillissement (anémie aplasique par exemple) sont liées à des mutations dans les
gènes codant les télomérases ou des composants stabilisants des télomères (Calado et Young, 2008).

Le vieillissement peut aussi provenir de défauts non pas dans les cellules souches elles-mêmes mais dans
leur niche comme le montrent les expériences de greffes de cellules souches âgées dans des niches "jeunes"
et où elles reprennent une activité importante (Ge et al., 2020).

**Figure 2-41. Le microenvironnement tissulaire contrôle le comportement "jeune" ou "âgé" des cellules souches des
follicules pileux. (A) Schémas illustrant le protocole expérimental où une petite zone de peau est retirée de la peau
du dos de la souris nue receveuse et greffée avec des cellules souches des follicules pileux (HFSCs) d'un donneur
jeune ou âgé mélangés à des cellules dermiques de souris nouveaux-nés ou de souris âgées. Les photos en B
présentent les résultats. Les cellules souches âgées peuvent reformer des poils lorsqu'elles sont associées à des
cellules dermiques jeunes et les cellules souches jeunes ne peuvent plus former des poils lorsque leur niche est
contrôlée par des cellules dermiques âgées. Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1901720117

EN DIRECT DES LABOS :

77
Vidéo sur un laboratoire qui travaille sur les cellules souches : https://youtu.be/3DluwcurAls

Évolution et développement

*Figure 2-42. Fossile d'Haikouella lanceolatus, l'un des

premiers Cordés vivant il y a 518 millions d'années au
Cambrien. Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Haikouella#/media/File:Haikouella_lanceolata_China.jpg

L'extraordinaire diversité des organismes y compris dans un même phylum (les Mammifères
Euthériens de la chauve-souris à la baleine en passant par le pangolin) prend son origine dans le
développement embryonnaire (et post-embryonnaire pour des espèces qui se métamorphosent).
Cela tient aux propriétés des réseaux de régulation génique : ils présentent des degrés de liberté
importants laissant la place à des innovations mutationnelles tout en restant robuste ce qui permet
d'assurer la survie des "monstres prometteurs" qui seront sélectionnés dans un environnement
adéquat.

Etudions un exemple : l'épinoche de mer Gasterosteus aculeatus possède des nageoires pelviennes
transformées en épines qui lui permettent de se protéger contre des prédateurs mais chez les populations
d'épinoche d'eau douce ces nageoires pelviennes ont disparu (contre-sélection car pas de prédateurs et des
parasites peuvent s'accrocher à ces nageoires). Il a été démontré qu'une des séquences régulatrices de
l'expression du gène Pitx1 qui contrôle le développement des nageoires pelviennes a été délété chez la
forme d'eau douce mais que les autres séquences régulatrices qui permettent à Pitx1 d'être exprimé dans
d'autres tissus où il a un rôle primordial (thymus, fosses olfactives...) sont intacts. On voit donc qu'au cours
de l'évolution, la modularité des séquences régulatrices d'un gène permettent de faire disparaître
son expression d'une région de l'embryon (avec des conséquences importantes (disparition des
nageoires pelviennes)) sans affecter son expression dans d'autres régions qui restent inchangées.

Les mutations peuvent ainsi concerner les séquences codantes ou les séquences régulatrices, voire
même la topographie de la chromatine comme cela a été mis en évidence en comparant le génome de
l'Homme et de la souris (Gibertson et al., 2022).

78
 *Figure 2-43. Une translocation peut aboutir à un
changement de domaine topologique d'association
(TAD) de la chromatine. Ce changement s'accompagne
alors d'un changement dans la régulation de l'expression
des gènes. Ici, l'expression du gène 3 humain se retrouve
sous le contrôle d'enhancers qui n'ont pas d'effets sur
elle chez la souris. Source : https://www.cell.com/cell-
reports/fulltext/S2211-1247(22)00533-2

Les mutations sélectionnées peuvent modifier un réseau de régulation génique ou peuvent être plus
subtiles telles des modifications quantitatives de l'expression des gènes. Par exemple, la diversité de
la taille des becs des pinsons de Darwin des îles Galapagos dépend du niveau d'expression de BMP4. La
manipulation du niveau d'activité de la voie BMP4 chez l'embryon de poulet aboutit à des modifications
morphologiques du bec cohérentes avec ce modèle (plus BMP4 est exprimé, plus le bec est gros) (Abzhanov
et al., 2004). Le niveau d'expression de la calmoduline est également impliqué dans le contrôle de la
longueur du bec (Abzhanov et al., 2006).

*Figure 2-44. Expression de BMP4 et de la calmoduline et évolution de la diversité des becs des pinsons de Darwin.
Le niveau d'expression de BMP4 lors de la formation du bec contrôle son épaisseur et sa hauteur (width, depth)
tandis que le niveau d'expression de la calmoduline contrôle sa longueur (length). Lors de la diversification des
pinsons sur les îles Galapagos, ce sont des mutations dans les séquences régulatrices de ces gènes qui ont été
différentiellement sélectionnées selon la nourriture disponible. Source :
https://www.researchgate.net/publication/6900786_Abzhanov_A_Kuo_WP_Hartman_C_Grant_BR_Grant_PR_Tabin_CJ_The_calmodulin_pathway_and_evolution_of_elongated_beak_morphology_in_Darwin%27
s_finches_Nature_442_563-567

Le rythme de déroulement du programme génétique du développement peut aussi être un paramètre

affecté au cours de l'évolution. Par exemple, la comparaison de la formation des somites chez l'embryon de
poulet et chez l'embryon de python montre que le rythme de l'horloge interne du mésoderme présomitique
79
est quatre fois plus rapide chez le python, expliquant le nombre très élevé de somites (et donc de vertèbres)
produits (Gomez et al., 2008). Autre exemple, en comparant la formation de l'aile de la caille, du poulet et
du dindon, on se rend compte que le temps d'action de l'acide rétinoïque qui stimule le développement des
régions proximales est différent et corrélé à la taille de l'aile. La manipulation du temps d'exposition des
cellules du bourgeon de membre à l'acide rétinoïque suffit à transformer la morphologie d'une aile de caille
en celle approchant une aile de poulet et de même entre une aile de poulet et une aile de dindon (Stainton
et Towers, 2022).
*Figure 2-45 La taille différente des ailes est
provoquée par des durées différentes d'exposition des
cellules à l'acide rétinoïque. La durée brève de l'action
de l'acide rétinoïque dans le bourgeon de l'aile de la
caille permet de passer rapidement à l'étape suivante,
avec un développement de structures plus distales.
Une durée plus longue (chez le poulet et surtout chez
la dinde) maintient plus longtemps le développement
de structures proximales et le passage à des structures
distales est plus lent.
Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124721018039

Il n'y a pas seulement des modifications d'expression des gènes Hox qui aboutissent à des modifications de
l'organisation des animaux. La séquence est également importante. Par exemple, Ubx chez les Hexapodes
possède une succession d'une dizaine d'alanines dans sa partie C-terminale, derrière l’homéodomaine, qui
lui permet de réprimer l'expression de Distal-less dans l'abdomen et ainsi d'inhiber la formation de pattes.
Chez les autres Arthropodes, Ubx ne possède pas cette succession d'alanines et Distal-less n'est pas reprimé
(Ronshaugen et al., 2002). Ainsi, les Crustacés par exemple ont des (petites) pattes au niveau de l'abdomen.
La séquence poly-alanine est une innovation évolutive partagée chez tous les Hexapodes (synapomorphie)
qui a changé leur plan d'organisation par rapport au dernier ancêtre commun des Arthropodes.

Dans le même ordre d'idée, des mutations de Hoxa11 propres aux Mammifères à placenta (excluant les
Monotrèmes) lui permettent de se fixer sur un enhancer régulant la transcription du gène codant la
prolactine dans l'épithélium utérin (Lynch et al., 2008). Cette production de prolactine est nécessaire à
l'implantation de l'embryon et la nouvelle fonction de Hoxa11 a été clairement un préalable nécessaire à
l'évolution de la gestation intra-utérine chez les Mammifères.

Cependant, il existe des limites à la modularité lorsque la pléiotropie devient trop importante. Par exemple,
tous les Mammifères ont 7 vertèbres cervicales (même la girafe). Le nombre de vertèbres cervicales est
déterminé par les gènes Hox. Or chez les Mammifères, les gènes Hox interviennent également dans la
régulation de la prolifération. Il existe une corrélation forte entre des anomalies du nombre de vertèbres
cervicales et le déclenchement de tumeurs précoces chez l'enfant. Il existe très probablement une contre-
sélection importante de la variation du nombre de vertèbres cervicales, car cela implique une mutation des
gènes Hox qui provoque aussi des cancers (Gallis, 2002).

Malgré tout, des homologies profondes

Malgré des différences morphologiques très importantes, l'ensemble des Bilatériens et même
parfois des Eumétazoaires (Bilatériens + Cnidaires) partagent un certain nombre de réseaux de
régulation géniques qui signe leur parenté malgré des centaines de millions d'années d'évolution
divergentes. Par exemple, dans tout le règne animal, le développement des organes

80
photorécepteurs est dépendant du facteur de transcription Pax6 (qui s'appelle Eyeless chez la
drosophile).

*Figure 2-46. Des mutations perte-de-fonction de PAX6 et de ses orthologues aboutissent à des yeux malformés ou
absents.
Source : https://journals.plos.org/plosbiology/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pbio.1000247

L'expression du Pax6 de souris par transgénèse dans la drosophile (ou même l'expression de Pax6 du
calmar) aboutit à la formation d'un œil ectopique, mais un œil composé de drosophile, pas un œil de souris
ou de calmar ! Cela veut dire que le facteur de transcription Pax6 "donne l'ordre" de former un œil mais la
manière de répondre à cet ordre (c'est-à-dire les gènes activés en aval) dépend de l'organisme.
*Figure 2-47. Œil ectopique induit dans l'aile de la
drosophile par l'expression de l'orthologue de Pax6 du
calmar. Il s'agit d'un œil composé très différent de l'œil à
chambre du calmar.
Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC20103/

Signalons tout de même qu'en aval de Pax6, le tout début de la cascade menant à la formation d'un œil est
aussi conservé avec l'activation de l'expression de sine oculis (Six chez les Vertébrés), de eyes absent (Eya1-
4 chez les Vertébrés) et de dachshund (Dach chez les Vertébrés).

De manière surprenante, Pax6 et Eyeless jouent aussi un rôle essentiel dans la différenciation des cellules
productrices d'insuline, dans les cellules β des îlots de Langerhans du pancréas pour Pax6 chez les Vertébrés
et dans un groupe de neurones du cerveau pour Eyeless chez la drosophile. Ces deux ensembles de cellules
productrices d'insuline (ou de DILP qui sont ses orthologues chez la drosophile) n'ont rien à voir
81
embryologiquement entre eux mais le module "Pax6 contrôle les gènes codant l'insuline" a été conservé
(Clements et al., 2008).

La parenté entre tous les Eumétazoaires est évidente lorsque l'on compare les gènes Hox qui jouent
également un rôle chez les Cnidaires pour la régionalisation le long de l'axe oral-aboral. Ce ne sont
pas seulement des gènes homologues qui sont utilisés mais on retrouve aussi la règle de colinéarité entre
la position des gènes dans le génome et leur expression spatiale et temporelle dans l'embryon.

*Figure 2-48. Gènes Hox et axe principal (oral-aboral (Cnidaires) et antéro-postérieur (Bilatériens)). a) Les
Bilatériens sont classiquement définis par un axe antéro-postérieur perpendiculaire à l'axe ventral-dorsal. Les
Cnidaires sont les taxons frères des Bilatériens et sont la seule lignée basale à avoir un groupe diversifié de gènes
Hox. b) L'ancêtre commun de la lignée des Deutérostomiens avait probablement un groupe Hox composé de 14 à 15
gènes Hox, étroitement associés au gène à homéoboîte Eve18. c) Les données provenant de l'Insecte Tribolium
castaneum, suggèrent que l'ancêtre des Protostomiens avait également un groupe Hox intact composé d'au moins 10
gènes Hox liés en complexe. d) L'ancêtre des Cnidaires possédait à la fois des gènes Hox de classe antérieure (Hox1
et Hox2) et central/postérieur (Hox9–13). e) Le complexe Hox du Cnidaire Anthozoaire Nematostella vectensis
possède des gènes Hox phylogénétiquement antérieurs (NvAx6, NvAx6a, NvAx7 et NvAx8) et central/postérieur
(NvAx1 et NvAx1a). Représentation de l'expression des Hox le long de l'axe oral-aboral d'un Cnidaire et de l'axe
antéro-postérieur des Invertébrés et des Vertébrés. Les gènes Hox antérieur (NvAx6) et central/postérieur (NvAx1)
de Nematostella sont exprimés le long de l'axe oral-aboral pendant le développement larvaire. Les régions
d'expression Hox antérieure, centrale et postérieure sont désignées par des nuances de rouge, vert et bleu,
respectivement. L'astérisque indique le site de formation de la bouche. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-018-04184-x

Les homologies profondes sont présentes également à des stades très précoces du développement lors de
la mise en place des axes en amont des gènes Hox entre les Cnidaires et les Deutérostomiens (Voir Figure 1-
51) (Lebedeva et al., 2021).

Il y a aussi de fortes conservations en ce qui concerne l'axe dorso-ventral. Chordine des Vertébrés
ou son orthologue Sog chez la drosophile participent à l'induction neurale en s'opposant à l'action
de BMP4 des Vertébrés ou son orthologue Dpp chez la drosophile. La seule différence est une
inversion dorso-ventrale : le système nerveux central est dorsal chez les Vertébrés et ventral chez
les Arthropodes (à l'exception des ganglions cérébroïdes). Les patrons d'expression des différents
gènes cités au-dessus sont inversés mais leur fonction demeure. On peut aussi émettre l'hypothèse que
cette inversion n'est qu'apparente et que c'est plutôt la bouche, qui sert de référence pour désigner le côté
dorsal, qui a changé de côté.

La conservation des mécanismes au cours du développement se retrouve aussi dans les voies de
signalisation qui forment des "boîtes à outils" très proches entre des phyla pourtant éloignés : voies
Wnt, Hedgehog, Notch, Dpp/BMP comme nous l'avons vu, ...
82
En relation avec les stades de développement, il a été observé que le milieu du développement
(correspondant à la fin de la gastrulation et à la neurulation) est très conservé dans les différents phyla
animaux avec des réseaux de régulation géniques assez similaires (Liu et al., 2020) et quelque fois des
morphologies très semblables (chez les Vertébrés par exemple où on parle de stade phylotypique).

*Figure 2-49. Stades phylotypiques observés par Ernst

Haeckel (1868). Mêmes si les ressemblances sur les
dessins de Haeckel sont un peu forcées, il n'en reste pas
moins une similarité frappante au cours de la
neurulation/début d'organogenèse entre des espèces
de vertébrés aussi différentes que des Téléostéens, des
Amphibiens, des Chéloniens (tortues), des oiseaux et
des Mammifères (ici, porc, vache, lapin et humain).

Il peut y avoir plusieurs origines à ce phénomène :

• toute modification dans cette période pourrait être très délétère car c'est la période où les
différents signaux inducteurs sont le plus interdépendants.

• la sélection naturelle pourrait jouer plutôt au début et à la fin du développement à cause de

l'adaptation aux différentes conditions du milieu.

La comparaison du transcriptome entre des embryons de drosophile à différents stades a montré que la
robustesse des patrons d'expression face aux mutations est plus importante en milieu de développement
(Liu et al., 2020).

POUR ALLER PLUS LOIN

Vidéo de la leçon inaugurale de Denis Duboule au Collège de France sur « Évolution des génomes et
développement » : https://www.youtube.com/watch?v=6sFQg1dNjik

Histoire de la biologie cellulaire et de la biologie du développement

La biologie du développement est une discipline très ancienne dont on trouve les premières traces
dans l'Antiquité avec Aristote (384-322 av. JC). Il observe le développement d'embryons de poulet à
différents stades. Il classe les animaux en ovipares, vivipares et ovovivipares.

La biologie du développement à la croisée des chemins entre la biologie cellulaire, la génétique et l'évolution

L'idée dominante de l'Antiquité d'Aristote à la Renaissance est celle de la génération spontanée : les
petits organismes naissent continument à partir de matière inanimée. William Harvey pose en 1651
les bases de la réfutation de la génération spontanée avec son "Ex ovo omnia" (tout provient d'un œuf). C'est
dans ce contexte qu'a lieu le débat entre préformation (des embryons pré-formés emboités comme
des poupées russes à travers les générations) et épigenèse (formation d'un nouvel embryon à
chaque génération). Le principal propagateur de la préformation est Nicolaas Hartsoeker (1656-1725) :
"Chacun des animaux mâles (les spermatozoïdes) renferme une infinité d'autres embryons".

83
 *Figure 2-50. Homonculus que Nicolaas Hartsoeker
(1656-1725), partisan de la théorie de la préformation a
cru voir dans un spermatozoïde. Extrait de Essai de
dioptrique (1694).

Des données expérimentales mal interprétées vont dans le sens de la préformation : Charles Bonnet (1720-
1793) isole une femelle puceron et elle est capable de donner une progéniture. Il en conclut que la
préformation existe mais il ne peut se douter que c'est en fait de la parthénogenèse qui a eu lieu. La
préformation commencera à être réfutée par Pierre-Louis Moreau de Maupertuis (1698-1759) qui ne
comprend pas comme elle peut rendre compte des croisements humains inter-ethniques qui donnent des
métisses. Il propose alors que les embryons se forment par le mélange d'une semence maternelle et d'une
semence paternelle. Caspar Friedrich Wolff (1734-1794), à partir de ses observations d'embryons de
poulet, va poursuivre la réfutation de la préformation et renforcer la notion d'épigenèse. Dans son sillage,
Christian Heinrich Pander (1794-1865) énonce la théorie des feuillets embryonnaires (les tissus des
animaux se forment à partir de 3 feuillets : ectoderme, mésoderme et endoderme) et qui est toujours utilisée
aujourd'hui.

Dans son traité de 1892, Das Keimplasma: eine Theorie der Vererbung (Le plasma germinatif: une théorie de
l'hérédité), August Weismann a proposé que l'information ne circule que du plasma germinatif vers le soma
et non l'inverse. Ainsi, alors que le soma (corps) vieillit et finit par mourir, les cellules germinales sont en
quelque sorte épargnées des effets ruineux du vieillissement, conduisant à l'immortalité théorique d'une
espèce.

Quant à la théorie de la génération spontanée, elle ne sera définitivement réfutée pour tous les êtres
vivants, y compris les "microbes" qu'au XIXème siècle par Louis Pasteur avec son expérience avec des
ballons en col de cygne.
*Figure 2-51. Ballon en col de cygne utilisé par Pasteur
pour réfuter la théorie de la génération spontanée. Le
liquide dans le ballon, stérilisé au préalable par
chauffage, ne contient à nouveau des germes que si le col
à droite est raccourci Cela montre que les nouveaux
germes proviennent de germes préexistants amenés par
l'air et non pas produits par génération spontanée dans
le liquide. Source : https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/63/Coldecygne.svg/1280px-
Coldecygne.svg.png

Les progrès techniques vont amener progressivement des changements conceptuels avec le
développement des premiers microscopes et l'observation des premières cellules (Robert Hooke en
1665 et Antoine Von Leeuwenhoek en 1675), ce qui n’empêche pas des théories erronées (comme la
préformation que nous avons vu plus haut) de perdurer encore un moment.

84
 *Figure 2-52. Dessin par Anton von Leeuwenhoek (1632-
1723) de spermatozoïdes de lapin et de chien. Grâce à ses
travaux pionniers d'observations avec un microscope
rudimentaire, von Leeuwenhoek a été le premier humain
à observer des spermatozoïdes. Source :
https://lensonleeuwenhoek.net/

Voir une page interactive qui explore l'histoire de la théorie cellulaire

Une fois la théorie cellulaire acceptée (grâce à la synthèse réalisée par le botaniste Schleiden et le
zoologiste Schwann en 1838) et la contribution des processus cellulaires bien observée dans les
embryons (avec Wilhelm His par exemple qui observe la migration des cellules de crêtes neurales
en 1868), la biologie du développement se retrouve à répondre à deux questions : la question
quantitative (comment produire un nombre de cellules suffisant ?) et la question qualitative
(comment produire des cellules différentes au bon endroit ?). Ces deux questions doivent avoir des
mécanismes coordonnés dans l'embryon bien entendu.

La question de nos origines en tant qu'individu (ontogenèse) est aussi liée à la question de nos
origines dans un sens plus large (l'origine de notre espèce et ses parentés avec les autres espèces,
la phylogenèse). Ces deux questions ont des relations différentes avec la notion de temps : le
développement embryonnaire revient de manière cyclique à chaque nouvelle génération de manière quasi-
identique alors que l'évolution est un processus historique sur une échelle de temps plus grande et avec une
dimension linéaire, non cyclique. Autant le développement embryonnaire est facilement accessible à
l'expérimentation car il est assez prévisible même sur un grand nombre d'embryons de différentes
générations, autant l'évolution se prête difficilement à des expériences dans sa dimension historique (il
faudrait remonter dans le temps et changer des paramètres). Ernst Haeckel (1834-1919) a tenté néanmoins
de relier les deux temporalités selon la formule "L'ontogenèse récapitule la phylogenèse" mais il s'agit d'une
généralisation excessive du fait que certaines espèces partagent des stades embryonnaires très proches
(comme le stade phylotypique à la fin de la neurulation/début organogenèse chez les Vertébrés) (voir
Figure 2-49).

Charles Darwin publie L'origine des espèces en 1859. Il s'appuie sur le transformisme mis en avant
une cinquantaine d'années plus tôt par Lamarck mais avec un autre mécanisme : la sélection
naturelle. Des variations des caractères apparaissent au hasard et les plus avantageux pour la survie
et la reproduction sont logiquement plus transmis à la descendance.

Darwin ne comprend pas l'origine des variations et les mécanismes de leur transmission d'une
génération à l'autre. Pour lui, les cellules reproductrices sont constituées de "gemmules" issues de toutes
les parties du corps (théorie de la pangenèse). La distinction cellules germinales/cellules somatiques n'est
absolument pas connue de Darwin. Il s'intéresse cependant à la règle de Von Baer qui stipule que les
structures les plus communément partagées parmi les groupes d'animaux se forment plus tôt au
cours du développement que les structures partagées par un groupe plus restreint. Darwin y voit un
argument pour un ancêtre commun entre différentes espèces. Mais l'embryologie est absente du reste de
son raisonnement. C'est Thomas Huxley en 1893 qui remet en selle l'embryologie dans le cadre de la théorie
darwinienne en rappelant l'importance de la construction des plans d'organisation, ce qu'il nomme
épigenèse.

L'étude du développement va cependant se trouver détaché de l'étude de l'évolution pendant une grande
partie du XXème siècle. Le développement concerne un individu que l'on peut perturber expérimentalement
(greffes ou ablations de Hans Spemann par exemple) alors que l'évolution concerne des populations dont
85
on n'a généralement qu'une vision historique et rétrospective (bien que quelques expériences peuvent être
tentées pour des espèces avec des temps de génération faibles comme la drosophile). Cependant, le petit-
fils de Thomas Huxley, Julian Huxley (et par ailleurs le frère d'Aldous Huxley qui a écrit "Le Meilleur des
Mondes") précise en 1942 qu'il est indispensable de comprendre le rôle des gènes dans le
développement pour comprendre l'évolution.

La biologie du développement se retrouve aussi longtemps détachée de la génétique qui ne s'attache dans
un premier temps qu'à étudier des caractères observables de manière simple chez l'adulte. Cependant, des
concepts émergent des études purement génétiques qui vont ensuite être très utiles aux biologistes du
développement comme la notion de gènes liés aux chromosomes sexuels (Thomas Morgan sur la drosophile
dans les années 1910) et la notion de pléiotropie (décrite pour la première fois par Ludwig Plate en 1910 :
elle qualifie un gène dont la mutation peut avoir des effets phénotypiques sur plusieurs organes ou tissus.
On sait maintenant que de très nombreux gènes du développement sont pléiotropes) .Plus tard, au détour
de la discussion sur comment des changements spectaculaires de plans d'organisation ont pu avoir lieu
alors que la théorie darwinienne classique présente une évolution graduelle et lente ("Natural selection can
never take a leap but must advance by the shortest and slowest steps", écrit Darwin en 1859), le chercheur
Richard Goldschmidt en 1940 dans son ouvrage Les bases matérielles de l'évolution développe l'idée
que de macromutations dans des gènes de contrôle du développement et il développe le terme de
"monstre prometteur", c'est-à-dire un mutant avec un phénotype anormal marqué mais qui pourrait
être sélectionné dans un certain environnement et être ainsi à la base d'un "saut" dans l'évolution
ou macro-évolution. La théorie des équilibres ponctués de Gould et Eldredge dans les années 1970
indiquant que l'évolution procède alternativement de périodes de changements brusques puis de stabilité
des espèces fait la synthèse entre macro- et microévolution.

Ce n'est qu'avec l'avènement des techniques de biologie moléculaire et les clonages des premiers gènes du
développement comme les gènes Hox (Ed Lewis en 1978, Gehring en 1984) que la génétique moléculaire
du développement et l'"évo-devo" vont prendre leur essor à partir de la fin des années 1980. C'est le début
d'une période de multiplicité des approches et de la fusion de concepts qui avaient jusqu'à cette époque été
étudiés séparément.

Pendant des décennies, le déchiffrement de la fonction des gènes était basé sur la génétique directe :
l'identification des phénotypes chez des mutants apparus au hasard ou générés par des agents
mutagènes venait en premier, puis chaque phénotype d'intérêt était lié à une mutation et à un locus
spécifiques. La puissance de cette approche a été clairement démontrée par les travaux de Christiane
Nüsslein-Volhard et Eric Wieschaus en 1978 qui ont disséqué les bases de la mise en place des axes de
polarité de la drosophile à travers un criblage génétique avancé. Ce criblage a identifié et caractérisé 600
mutants, dont les mutations ont été cartographiées sur 120 gènes, dont beaucoup sont parmi les gènes les
plus étudiés en biologie du développement encore actuellement (Wieschaus et Nüsslein-Volhard, 2016).

Une approche de génétique inverse a commencé à émerger dans les années 1980 et a bénéficié des
approches de modifications directes et contrôlées du génome ou de l'expression des gènes :
invalidation de gènes par recombinaison homologue (knock-out), remplacement d'un allèle par un
autre (pas forcément complètement non fonctionnel) (knock-in puis CRISPR-Cas9), morpholinos,
siARN...

Les progrès de la génomique (séquençage entier des génomes des organismes modèles tels que C. elegans,
la drosophile, la souris) et aussi de la transcriptomique (puces à ADN, RNAseq, et étude transcriptomique
de cellules uniques) vont amener un changement d'échelle à partir des années 2000 : on ne raisonne plus
gène par gène mais par de larges ensembles de gènes sur des éléments de plus en plus précis (embryons
entiers, tissus puis chaque cellule d'un tissu). Les modifications épigénétiques (état de la chromatine) seront
aussi étudiées de manière de plus en plus fine.

On se rend compte également avec le séquençage du génome humain du nombre relativement faible de
gènes chez l'Homme par rapport à des organismes dits "simples" comme le nématode C. elegans (23.000
gènes chez l'Homme pour des dizaines de milliards de cellules et 15.000 gènes chez C. elegans pour environ
un millier de cellules). Cela renforce l'idée que la complexification des processus géniques (formation
de différentes isoformes, épissages alternatifs...) et des réseaux de régulation génique
86

De plus, plus de 20 ans après la publication du génome humain, jusqu'à un tiers des gènes humains
restent mal caractérisés, et nous savons peu de choses sur leur importance physiologique (Stoeger et
(modifications épigénétiques de la chromatine, contrôle de la traduction...) jouent un rôle essentiel
au cours du développement et que le nombre "brut" de gènes n'est pas le paramètre le plus pertinent pour
comprendre la génétique du développement.

A cela s'ajoute les progrès de l'étude de la conformation de la chromatine (initiée sur des modèles restreints
comme les puffs des chromosomes polytènes des insectes mais généralisée ensuite à partir du début des
années 2000 par les techniques de capture de conformation chromosomique (3C, Hi-C) et
d'immunoprécipitation de la chromatine) qui a permis de mieux comprendre les modifications
épigénétiques qui sont fondamentaux pour le contrôle de l'expression des gènes.

Des chercheurs comme Eric Davidson (voir cette biographie) ont popularisé le concept de réseau de
régulation génique qui permet une vue intégrée de la détermination et de la différenciation des
types cellulaires et qui met en évidence que c'est une combinaison de facteurs qui sous-tend ces
processus. Cela permet une modularité qui permet à l'évolution de créer des "monstres prometteurs" mais
certains éléments du réseau ("kernel" ou composant fondamental) résistent à la variation par contrainte
interne.

Progrès dans la compréhension des modalités du développement embryonnaire

Dans les modalités du développement, la discussion a beaucoup tourné de la fin du XIX ème siècle jusqu'à la
fin du XXème siècle sur l'opposition entre le développement mosaïque et le développement à régulation. Sur
la base des premières observations sur divers modèles, le développement était généralement considéré
comme mosaïque avec des cellules qui très tôt ne peuvent changer de destinée. C'était par exemple les
conclusions de Wilhelm Roux (1850-1924) à la suite de la dissociation de deux blastomères de grenouille
avec un clou brûlé qui avait observé un développement partiel de chaque blastomère. Laurent Chabry
(1855-1894) est arrivé à la même conclusion avec l'étude des ascidies.
*Figure 2-53. Expériences de Chabry chez l'ascidie
Cynthia. (A) La destruction, au stade deux cellules, du
blastomère gauche entraîne la formation d’un hémi-
embryon droit. (B) La destruction, au stade quatre cellules,
des deux blastomères ventraux, conduit à la formation des
structures dorsales comme le chordomésoderme et le
neurectoderme ; la destruction, au stade quatre cellules, des
deux blastomères dorsaux conduit à l’apparition des
formations mésodermiques et endodermiques, mais pas à
celle de neurectoderme. Source :
https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2022/02/msc200555/msc200555.html

Le premier à avoir mis en évidence un développement à régulation est Hans Driesch, un biologiste allemand
(1867-1941).
*Figure 2-54. Expérience de Hans Driesch sur un
embryon d'oursin à 2 cellules mettant en évidence la
régulation. https://fr.m.wikipedia.org/wiki/Fichier:D%C3%A9veloppement_%C3%A0_r%C3%A9gulation_d%27Hans_Driesch.png

87
Cette expérience a permis de montrer qu'une cellule embryonnaire était capable de compenser la
perte d'une cellule voisine, d'où le terme de régulation. Driesch est allé plus loin et a même réussi à
séparer les 4 premiers blastomères d'un embryon d'oursin : chacun de ces blastomères isolé a
donné une larve (à peu près) normale mais plus petite. Cela démontrait la totipotence de ces cellules
et aussi les capacités de régulation importantes des embryons à ce stade.
*Figure 2-55. Expérience de Driesch montrant la
totipotence des premiers blastomères de l'oursin. Les 4
cellules d'un embryon d'oursin au stade 4 cellules ont
été séparées. On obtient des larves d'oursin plus petites
qu'à partir d'un embryon normal (à gauche) mais elles
contiennent tous les types cellulaires habituels. Cette
expérience (aussi faite par Sven Hörstadius) a permis de
montrer que le développement de type mosaïque
comme chez l'ascidie où le destin des différentes cellules
est pré-déterminé n'était pas une généralité.

La vision actuelle est qu'aucun développement n'est entièrement mosaïque ou entièrement régulé
mais que chaque développement est un cocktail de chacun des deux processus avec différentes
proportions selon les modèles et les stades de développement.

L'idée que les cellules adoptent des destins différents en détectant la présence ou l'absence de produits
chimiques, appelés facteurs déterminants du destin ou «déterminants» remonte au début du XX ème siècle.
Cependant, l’expérience qui a permis de cimenter l’idée qu’une population de cellules peut contrôler
le destin d’autres cellules est celle de Spemann et Mangold en 1924. La transplantation de la lèvre
dorsale du blastopore d’un embryon d’amphibien sur la région ventrale d’un autre embryon induit
la formation d’un nouveau tube neural et de nouvelles structures mésodermiques dorsales. Les
cellules du greffon n’ont que marginalement participées à ces nouvelles structures : il s’agit bien
d’une instruction envoyée par un groupe de cellules à un autre groupe de cellules qui a changé sa
destinée. C’est une induction embryonnaire.

88
 *Figure 2-56. Expérience de Spemann et Mangold (1924)

Conrad H. Waddington a élargi la notion d'inducteur aux Oiseaux et aux Mammifères par ses greffes de
l'extrémité antérieure de la ligne primitive d'embryons de poulet, de canard et de lapin dans des embryons
de poulet précoce et a observé une duplication de l'axe antéropostérieur de l'hôte.

Les expériences de Boveri sur des embryons d'oursins en 1901 ont montré que les modèles de
développement pourraient être déterminés par des gradients opposés, tandis que des expériences de
régénération sur des planaires en 1904 postulaient l'existence de "substances formatrices'' qui influencent
le plan de développement de l'embryon. En 1952, Alan Turing a postulé que des concentrations de
produits chimiques spécifiques, appelés "morphogènes'', pourraient instruire le destin des cellules
et donc l'organogenèse dans un organisme en développement. Dans les années 1990, des expériences de
chimie confirment expérimentalement les modèles théoriques de Turing.

Histoire de l'étude et de la production des cellules souches

La notion de cellules souches est venu des études sur la régénération, quelque fois spectaculaire
comme dans le cas suivant une amputation chez les hydres ou les planaires ou les membres de
certains amphibiens (axolotl, salamandre) mais aussi dans le cas plus discret mais significatif du
renouvellement cellulaire quotidien dans la plupart de nos organes et tissus.

En 1948, Charles Leblond, Catherine Stevens et Rita Bogoroch ont réalisé la première expérience de traçage
de lignée, en marquant par pulse-chase les cellules mitotiques avec de la thymidine tritiée ( 3H). Ils ont
démontré que, dans l'intestin grêle, les cellules marquées pendant la phase pulsée de l'expérience étaient
d'abord repérées dans les cryptes et, pendant la période de chasse, étaient déplacées dans les villosités.
Cette découverte importante, associée à l'identification de Leblond et Stevens (1948) selon laquelle les
pointes des villosités étaient des zones d'extrusion cellulaire, a mené à l'idée que l'axe crypte-villosités est
un tapis roulant continu de cellules, avec la production active de cellules due à la ces mitoses …équilibrées
par une perte cellulaire équivalente, afin de maintenir l'état d'équilibre des tissus. Des études sur la peau et
les lymphocytes utilisant le marquage 3H-thymidine ont tiré des conclusions similaires sur le
renouvellement cellulaire. McCulloch, Till et leurs collègues démontrent l'existence de cellules souches
hématopoïétiques adultes en 1961.

Voir cette vidéo sur l découverte des cellules souches hématopoïétiques https://youtu.be/NAlhldAdT7A

89
Ainsi, l'existence généralisée du renouvellement cellulaire dans de nombreux organes matures a été
rapidement montrée et la notion de cellule souche capable de soutenir ce renouvellement sur le long terme
a été mis en évidence.

Les cellules ES (embryonnaires souches) ont été dérivées pour la première fois en 1981 en cultivant
la masse cellulaire interne des blastocystes de souris (Evans et Kaufman, 1981 ; Martin, 1981).
*Figure 2-57. Mise en culture de cellules embryonnaires
souches (ES) à partir de blastocystes de Mammifères.
D'après
https://journals.physiology.org/doi/full/10.1152/physrev.00054.200
3

*Figure 2-58. Martin Evans, de l'Université de Cardiff

(Royaume-Uni), co-découvreur des méthodes de
cultures des cellules ES. Il a reçu (avec d'autres
collègues) le Prix Nobel de Médecine en 2007 pour ses
travaux sur la mise au point de la technique du knock-out
où les cellules ES sont utilisées. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Embryonic_stem_cell#/media/File:Martin_Evans_Nobel_Prize.jpg

Leur milieu de culture a été basé initialement sur celui des cellules ECC (ou cellules de carcinomes
embryonnaires) issues de tumeurs testiculaires qui formaient des tératocarcinomes où des dérivés des trois
feuillets embryonnaires pouvaient être décelés et qui avaient été caractérisés lors de leur apparition
spontanée chez des souris de la lignée 129 dans les années 1960.

La capacité des cellules ES à contribuer aux chimères, à coloniser la lignée germinale et à engendrer une
progéniture saine a été démontrée en 1984 (Bradley et al., 1984), établissant qu'elles sont non transformées
et génétiquement normales (bien qu'il y ait une tendance à l'aneuploïdie au fur et à mesure des passages).
Cette découverte a permis d'introduire des modifications génétiques ciblées chez la souris en mettant en
90
œuvre une recombinaison homologue dans les cellules ES (méthode du knock-out). Ce n'est toutefois que
dans les années 1990 que la technologie est devenue relativement routinière.

Les conditions de culture originales pour les cellules ES comprenaient une co-culture avec une couche
nourricière de fibroblastes embryonnaires arrêtés en mitose et un milieu contenant du sérum de veau fœtal
(FCS) sélectionné (Robertson, 1987).
*Figure 2-59. Colonie de cellules ES en entourées de
fibroblastes nourriciers. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Embryonic_stem_cell#/media/File:Humanstemcell.JPG

Ce système efficace mais complexe (co-culture, variabilité de la qualité des cellules nourricières et du sérum,
sérum extrait d’animaux donc potentiellement problématique pour les cultures dans un but
thérapeutique...) a été simplifié avec la découverte qu'une contribution majeure de la couche nourricière
est de fournir le facteur LIF (pour Leukemia Inhibitory Factor) (Smith et al., 1988; Williams et al., 1988).
L'ajout de LIF augmente la robustesse des cultures de cellules ES par rapport à la co-culture avec des
fibroblastes et cela reste un système largement utilisé. Les conditions ont encore été améliorées pour avoir
une meilleure homogénéité dans les cultures lorsque les cellules ES ont été maintenues dans un milieu
défini dans lequel la voie de signalisation Erk1/2 est bloquée et la glycogène synthase kinase 3 (GSK3) est
partiellement inhibée (Wray et al., 2010 ; Ying et al., 2008). Sous cette double inhibition, connue sous le nom
de 2i, les cellules ES présentent une similitude de transcriptome avec l'épiblaste préimplantatoire (Boroviak
et al., 2014).

Les cellules ES humaines ont été isolées et cultivées pour la première fois en 1998. Leur utilisation en
thérapie génique a été freinée par la nécessité de produire un nouvel embryon humain (éventuellement par
clonage thérapeutique) pour pouvoir les produire à partir des blastocystes.

Les cellules souches pluripotentes induites iPS, elles, sont générées à partir de cellules différenciées
en leur faisant exprimer 4 facteurs de transcription : Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc.

Voir une vidéo de présentation des cellules iPS : https://youtu.be/gh-ckXhm_co

La production de cellules iPS a été mise au point par Shinya Yamanaka en 2007 et lui valut le Prix
Nobel de Médecine en 2012. Le fait que mis dans un environnement favorable, un génome de cellules
différenciées puisse fonctionner dans une cellule redevenu pluripotente permet d'avoir une source
"inépuisable" et facile d'accès, sans restrictions éthiques, pour produire des cellules souches
pluripotentes humaines.

Voir la Figure 2-16 sur l’utilité thérapeutique des cellules iPS.

La dédifférenciation et la remise en prolifération des cellules pour produire des cellules iPS reposent en
partie sur l'ajout d'un vecteur d'expression avec l'oncogène c-Myc mais des recherches ont abouti à pouvoir
l'éviter. La reprogrammation est aussi possible sans intégration génomique des transgènes (utilisation
d'épisomes ou apport direct de protéines), ce qui évite d'altérer le patrimoine génétique des patients.

Signalons qu'il existe des moyens de produire des cellules différenciées sans passer par des cellules souches
telles que les cellules ES ou iPS. Une reprogrammation causée par l'expression forcée de facteurs de

91
détermination a pu convertir des fibroblastes de peau en neurones, cardiomyocytes ou en cellules
hématopoïétiques (phénomène de transdifférenciation) (Xu et al., 2020).

92
93
PARTIE 3

Les étapes du développement

94
L’ovogenèse prépare le développement embryonnaire

*Figure 3-1. Ovocytes en maturation dans les sacs

ovariens d’une grenouille femelle disséquée. Notez
l’oviducte très contourné visible à droite (celui de gauche
est caché par les ovocytes). Photo : Patrick Pla sur une
dissection faite par les étudiants de la Préparation à
l’Agrégation SVTU de l’Université Paris-Saclay

ors de la fécondation, le spermatozoïde n’apporte qu’un noyau, un centriole et quelques

L
mitochondries (celles-ci sont ensuite impitoyablement détruites). Le cytoplasme du zygote est
donc en immense majorité hérité de l’ovocyte. La quantité et la qualité des réserves
énergétiques et des réserves moléculaires (ARN, protéines…) dans l’ovocyte a une influence
considérable sur le développement embryonnaire, notamment sur la mise en place des axes de
polarité.

L’ovocyte et son environnement

> Chez la drosophile

Une femelle drosophile a deux ovaires composés d’environ 18 ovarioles, chacun pouvant être
considéré comme une chaîne de production d’œufs.
*Figure 3-2. Ovaires de drosophile composés d'ovarioles
(B). En A, on voit l'espace occupé par l'appareil génital
dans l'abdomen de la drosophile femelle. Source :
https://www.mdpi.com/2073-4409/10/6/1454/htm

Vidéo d'une dissection d'ovaires de drosophile (en anglais) : https://youtu.be/T94be2i5qb4

Le germarium, qui contient des cellules souches somatiques et germinales, se trouve à l’extrémité
antérieure de l’ovariole. Il y a 2 à 3 cellules souches germinales par ovariole qui sont maintenues
dans une niche particulière près des cellules de la coiffe qui leur envoient des signaux qui inhibent
leur différenciation (en inhibant l'expression du gène Bam) (Song et al., 2004). Les ovocytes et les
cellules qui les entourent maturent au fur et à mesure qu’ils descendent l’ovariole, atteignant la partie
postérieure avec des ovocytes compétents pour la fécondation. L’ovogenèse dure environ une semaine
(Bastock et Saint Johnston, 2008).

95
 **Figure 3-3. Ovariole de drosophile. Le germarium est le tissu le plus antérieur de l’ovaire de la drosophile où les
ovocytes se développent à partir de cellules issues des cellules souches germinales. Les cellules folliculaires se
développent quant à elles à partir de cellules souches folliculaires situées dans une région plus postérieure (Région
2a). L’assemblage se fait d’avant en arrière (de gauche à droite). Les cellules de la coiffe et les cellules
accompagnatrices constituent la niche des cellules souches germinales, fournissant un support physique et des
signaux chimiques aux cellules souches germinales (orange). Les cellules de la coiffe produisent notamment Dpp
(Decapentaplegic, l'orthologue des BMP) et Hedgehog qui sont cruciaux pour le maintien des cellules souches
germinales. Les cellules souches germinales se divisent de manière asymétrique pour produire une cellule fille qui
quitte la niche des cellules souches et se différencie en un cystoblaste. Le cystoblaste entre dans la zone de
différenciation où il se divise quatre fois avec une cytokinèse incomplète pour former un cyste germinal composé de
16 cystocytes reliés par des ponts cytoplasmiques et un organite cytosquelettique appelé fusome (représenté par
des structures ramifiées rouges dans les cystocytes). Tous ces événements ont lieu dans la région 1, la plus
antérieure. Dans la région 2a, l’ovocyte se développe davantage, et à la frontière entre les régions 2a et 2b, le cyste à
16 cellules passe à côté des cellules souches folliculaires, qui donnent naissance aux cellules accompagnatrices, aux
cellules précurseurs du follicule et aux cellules polaires. Les cellules folliculaires encapsulent le cyste de la lignée
germinale pour former follicule de stade 1 qui bourgeonne à l’extrémité postérieure du germarium dans la région 3.
Un follicule de stade 1 se compose de 15 cellules nourricières interconnectées et d’un ovocyte, entourés par les
cellules folliculaires. D’après https://www.mdpi.com/2073-4425/9/3/127

L’ovocyte est entouré par 15 cellules germinales appelées cellules nourricières (avec qui il garde
contact par des ponts cytoplasmiques) et par des cellules folliculaires qui appartiennent à la lignée
somatique et qui forment une couche épithéliale autour de l’ensemble des 16 cellules germinales.
L’ovocyte s’attache à des cellules folliculaires par des interactions médiées par la E-cadhérine.

Voir une vidéo sur le développement des ovocytes de drosophile : https://youtu.be/0gf5f2diUW8

Le développement des cellules germinales et des cellules folliculaires est interdépendant. L’ovocyte,
qui est en position postérieure dans le germarium, induit via la voie Gurken/Torpedo (orthologue à EGFR
des Vertébrés) les cellules folliculaires terminales adjacentes à adopter un destin postérieur plutôt
qu’antérieur (González-Reyes et St. Johnston 1995 ; Roth et al. 1995). Ces cellules folliculaires
postérieures signalent ensuite à l’ovocyte de polariser les microtubules le long d’un axe qui sera
l’axe antéro-postérieur du futur embryon (pôle (-) du côté antérieur, pôle (+) du côté postérieur).
Cette réorganisation nécessite l’activité de la PKA au pôle postérieur de l’ovocyte qui est activée par des
signaux en provenance des cellules folliculaires postérieures (Lane et Kalderon, 1994). Toutes ces étapes
très précoces sont donc déterminantes pour le développement du futur embryon.

96
 *Figure 3-4. La PKA est nécessaire à l’orientation des
microtubules dans l’ovocyte de drosophile. La protéine
kinésine fusionnée à la GFP est utilisée ici comme sonde
pour connaître l’orientation du réseau de microtubules
(elle se déplace vers le pôle + des microtubules). En (A),
la kinésine-GFP s’accumule du côté postérieur de
l’ovocyte, montrant que les pôles + des microtubules
sont concentrés de ce côté. En (B), dans des ovocytes
mutants dépourvus d’activité PKA, la kinésine-GFP est
nettement plus diffuse. L’actine cortical de l’ovocyte et
des cellules nourricières est colorée en rouge avec de la
phalloïdine-rhodamine. Source :
http://genesdev.cshlp.org/content/8/24/2986.full.pdf+html

Un peu plus tôt, les cellules germinales exprimaient Delta à leur surface. Les cellules folliculaires
exprimaient Notch et avaient ainsi activé la voie de signalisation correspondante (Roth, 2001, Lopez-Schier
et St Johnston, 2001). Si on empêche cette interaction Delta-Notch, les cellules folliculaires ne sont pas assez
différenciées et ne répondent pas correctement au signal inducteur Gurken. Il s’ensuit que les cellules
folliculaires postérieures ne sont pas bien induites et qu’elles ne peuvent pas envoyer en retour le bon signal
pour polariser l’ovocyte. L’axe antéro-postérieur de l’embryon est par la suite très affecté.

**Figure 3-5. Les cellules folliculaires dépourvues d’activité Notch ne se différencient pas lors de l’ovogenèse chez la
drosophile (A) La lignée transgénique utilisée présente l’expression d’un gène rapporteur (ici en blanc) dans toutes
les cellules folliculaires immatures. On constate qu’au cours du développement (de gauche à droite), les cellules
folliculaires deviennent matures et n’expriment plus le gène rapporteur, notamment au stade 10 de l’ovogenèse. (B)
Expression de Fasciclin III (FasIII) (rouge), exprimé habituellement dans les cellules folliculaires non différenciées
et du gène rapporteur d’immaturité (bleu) dans des cellules folliculaires de stade 10 contenant un clone de cellules
mutantes perte-de-fonction Notch. Le clone de cellules est reconnaissable car il n’exprime plus la GFP (vert). (C)
montre l’expression du gène rapporteur d’immaturité seule (blanc). On observe bien l’autonomie cellulaire de
l’action de Notch car seules les cellules du clone n’exprimant plus Notch sont affectées. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC312703/

97
 > Chez les Mammifères

A partir de la puberté, régulièrement, une cohorte de follicules primordiaux se réveille et se

développe pour passer au stade de follicule primaire puis secondaire puis de De Graaf.

*Figure 3-6. Développement des follicules de Mammifères. Les ovocytes sont d'abord entourés par une seule couche
de cellules folliculaires puis par plusieurs couches à partir du stade follicule secondaire formant la granulosa. Autour,
à partir des cellules stromales ovariennes se forment les cellules de la thèque (qui se subdivisent en cellules de la
thèque externe et de la thèque interne). Lorsque les couches des cellules de la granulosa deviennent abondantes
(plus de 6), une cavité remplie de liquide se forme, l'antrum.

Source : https ://www.mdpi.com/2073-4409/10/9/2292/htm

*Figure 3-7. Ovocyte au sein d’un follicule de De Graaf chez le cobaye. On distingue clairement l’antrum rempli de
liquide qui s’est contracté en séchant, l’ovocyte avec ses chromosomes de prophase de méiose I et les cellules de la
corona radiata qui l’entourent. La zone pellucide est l’espace entre les deux cellules. Notez les fines protrusions qui
relient ovocyte et cellules de la corona radiata. Ce sont des projections cytoplasmiques transzonales. Photo : Patrick
Pla à partir de la collection d’histologie de la Préparation à l’Agrégation SVTU de l’Université Paris-Saclay.

Chez la femme, tout ce processus prend 190 jours avant d'arriver au cycle final où l'un des follicules de cette
cohorte devient dominant et sera celui dont l'ovocyte sera ovulé (attention tout le processus dure bien plus
longtemps que les 14 jours de la phase folliculaire comme on peut l'imaginer en regardant certains schémas
trop simplifiés !). Les autres follicules entrent en atrésie et dégénèrent. Les premiers stades de cette
maturation sont indépendants de la FSH produite par l'adénohypophyse mais à partir du stade follicule
secondaire, les cellules de la granulosa expriment des récepteurs à la FSH et se mettent à produire des
œstrogènes qui sont indispensables à la maturation des cellules folliculaires et de l'ovocyte.

98
Durant l’ovogénèse des mammifères, l’ovocyte synthétise une matrice extracellulaire qui va
notamment interagir avec les spermatozoïdes lors de la fécondation : la zone pellucide. Elle est
composée de glycoprotéines nommées ZP1 à ZP4.
*Figure 3-8. Suivi de l’épaississement de la zone
pellucide (ZP) au cours de l’ovogenèse de la souris. Les
ovocytes de souris grandissent d’environ 12 µm (ovocyte
immature) à 80 µm de diamètre (ovocyte complètement
développé) en 2 à 3 semaines. La ZP finit par avoir un peu
plus de 6 micromètres d’épaisseur.
Source :

https://www-sciencedirect.com.insb.bib.cnrs.fr/science/article/pii/

S0070215318300036

Malgré l’épaississement de la zone pellucide, l’ovocyte garde contact avec les cellules environnantes de la
corona radiata par des projections cytoplasmiques transzonales. Les cellules communiquent par des
jonctions gap impliquant la connexine 37. Les ovocytes ne peuvent pas métaboliser le glucose et les cellules
environnantes lui envoient du pyruvate et du lactate (Su et al., 2009). La présence de ces jonctions gap est
diminuée au moment de l’ovulation et de la reprise de la méiose (qui était bloquée en prophase I). Cela
permet de découpler les taux d’AMPc et de GMPc dans les deux types de cellules (baisse chez l’ovocyte,
maintien chez les cellules environnantes), ce qui est nécessaire pour la reprise de la méiose (Okudaira et al.,
2017, Thuratum et Sroyraya, 2017). Avant l’ovulation, l’ovocyte sécrète BMP-15 qui est nécessaire à la
survie des cellules folliculaires (Hussein et al., 2015). Un nombre suffisant et une bonne santé des cellules
de la corona radiata sont en retour nécessaire pour avoir des ovocytes qui ont de bons succès de
fécondation.

Suivant le pic de LH qui provoque l’ovulation, les cellules de la corona radiata sécrètent de l’acide
hyaluronique dans la matrice extracellulaire ce qui favorise l’ovulation (Zuo et Kimata, 2001).

La coopération existe donc bel et bien entre l’ovocyte et ses cellules somatiques environnantes chez
les Mammifères tout comme chez la drosophile. Cependant, la mise en place des axes de l’embryon
se fait bien plus tard et d’une autre manière chez les Mammifères.

Les réserves énergétiques

> Chez les Vertébrés

Au cours de l’ovogénèse, il y a accumulation de réserves énergétiques dans l’ovocyte sous forme de

vitellus. Elles se présentent en agrégats appelées plaquettes vitellines. Ce sont des réserves
protéiques et surtout lipidiques (à poids égal les lipides permettent de stocker plus d’énergie que
les glucides). Elles ne sont pas synthétisées dans l’ovocyte mais, chez les Vertébrés, elles sont
synthétisées dans le foie sous le contrôle des œstrogènes (hormones sexuelles femelles) dont la
production dépend de l’axe hypothalamo-hypophysaire.

99
 *Figure 3-9. Contrôle hormonal de la production de
vitellogénine chez les Vertébrés.

Les réserves sont acheminées vers l’ovaire par voie sanguine, notamment sous la forme d’une
grande phosphoglycolipoprotéine appellée vitellogénine (470 kDa). Celle-ci est reconnue par un
récepteur de la famille des récepteurs aux VLDL (Very Low Density Lipoprotein) à la membrane plasmique
des ovocytes et le tout est internalisé par endocytose. Les endosomes fusionnent ensuite avec les lysosomes
où la vitellogénine est clivée en différents fragments : phosvitine et lipovitelline. Les plaquettes vitellines
sont en fait dérivées des lysosomes et sont donc entourées par une membrane et contiennent la cathépsine
D (une enzyme caractéristique des lysosomes).

Les composants majeurs du vitellus chez la poule sont :

• Les lipovitellines (a et b) : des lipoprotéines

• La phosvitine : une phosphoprotéine qui fixe le fer (réserve de fer)

• Les LDL (Low Density Lipoprotein)

• Les livetines dont certaines sont apparentées aux globulines sanguines

Les ovocytes sont classés selon la quantité de vitellus accumulée au cours de l’ovogénèse. Les
ovocytes télolécithes (tels ceux des Sauropsidés ou des Téléostéens) ont des quantités très
importantes de réserves qui s’accumulent progressivement dans l’ovocyte. Par exemple chez la poule,
la croissance de l’ovocyte se déroule en 3 phases : 1) une phase dite « précoce » qui peut durer jusqu’à
plusieurs années, 2) une phase de croissance lente de quelques mois, où s’accumulent des couches de
vitellus dites « blanches », qui contiennent plus de protéines, et des couches dites « jaunes », comprenant
plus de lipides, et enfin 3) une phase de croissance rapide, où sont transférées de grandes quantités de
vitellus « jaune », 6 à 11 jours avant l’ovulation.

Les ovocytes télolécithes ont tellement de réserves que le vitellus empêche les divisions cellulaires.
Ainsi, après la fécondation, seule une partie du volume de l’ovocyte se cellularise, le vitellus restant en
dehors de l’embryon. L’embryon récupère les nutriments grâce à une annexe embryonnaire : la vésicule
vitelline. Elle est formée d’endoderme qui sécrète des enzymes qui digèrent le vitellus et de mésoderme qui
forme des vaisseaux sanguins capables de ramener les nutriments vers l’embryon.

Les ovocytes hétérolécithes (tels ceux des Amphibiens) ont suffisamment de réserves pour assurer
tout le développement de l’embryon mais pas assez pour gêner les divisions cellulaires après la
fécondation. Le vitellus se retrouve dans les cellules qui l’utilisent directement. Il n’y a pas besoin
d’annexes embryonnaires. L’autre caractéristique d’un ovocyte hétérolécithe est la répartition
inégale des réserves en vitellus. Dans l’ovocyte des amphibiens, le vitellus s’accumule autour du pôle
végétatif. 75% du vitellus se retrouve ainsi dans l’hémisphère végétatif. Une pigmentation
superficielle du cytoplasme (granules de mélanine) se répartit autour du pôle animal, dans ce qui
forme l’hémisphère animal. On a donc un premier axe pôle animal-pôle végétatif.

100
 **Figure 3-10. Cellules de la lignée germinale dans un
ovaire de xénope. Différents stades de développement
coexistent, notamment les stades notés de I à VI
d'accumulation de vitellus (à partir surtout du stade III)
et de réserves moléculaires (ARNm dès le stade I, ARNr
aux stades III à IV). Notez la pigmentation dans
l'hémisphère animal qui se met en place
progressivement. D'après https://www.mdpi.com/2073-
4409/9/5/1150

Chez les amphibiens, deux phases d’accumulation de vitellus se succèdent :

1. la phase de petit accroissement ou prévitellogénèse qui dure de 2 à 3 ans

2. la phase de vitellogénèse proprement dite qui dure 3 mois et voit l’essentiel de

l’accroissement du volume de l’ovocyte

*Figure 3-11. Prévitellogénèse et vitellogénèse chez la grenouille. Une grenouille met 3 ans après sa métamorphose
pour devenir sexuellement mature et avoir des ovocytes prêts à être fécondés. Ensuite, elle peut se reproduire tous
les ans car chaque année une nouvelle cohorte d’ovocytes entame la pré-vitellogénèse et la vitellogénèse. D’après
Patten et Carlson, Foundations of Embryology (1958), McGrawHill

Les ovocytes alécithes tels que ceux des Mammifères (sauf les Monotrèmes tel l'ornithorynque)
n’ont pas de réserves. Le gène codant la vitellogénine n'est présent chez les Métathériens
(Marsupiaux) et les Euthériens qu'à l'état vestigial de pseudogène. Avant son implantation dans la
paroi de l’utérus, l’embryon vit libre dans la lumière des voies génitales femelles. Il est nourri par
les sécrétions des glandes utérines qui se sont développées sous le contrôle de la progestérone
produite au cours de la phase lutéinique du cycle ovarien (par le corps jaune).

> Chez la drosophile

Au cours de la vitellogenèse des insectes, le précurseur des protéines du vitellus, la vitellogénine (Vg), est
principalement synthétisé dans le corps adipeux et sécrété dans l’hémolymphe. À l’aide de la circulation de
l’hémolymphe, Vg est transporté vers l’épithélium folliculaire qu’il traverse à travers des espaces
intercellulaires et atteint la membrane ovocytaire, où a lieu une endocytose médiée par le récepteur Vg
(VgR, classés dans la famille des récepteurs des lipoprotéines de basse densité (LDLR)) (Wu et al., 2021).
En plus de transporter Vg pour l’absorption des ovocytes, signalons que VgR s’avère servir de cheval de

101
Troie pour la transmission verticale des microbes pathogènes et des symbiotes Wolbachia. Lors de
l’internalisation de Vg médiée par VgR, le complexe Vg/VgR sur la membrane de l’ovocyte se regroupe dans
des fosses recouvertes de clathrine et s’invagine dans le cytoplasme. Le complexe se pince ensuite pour
former des vésicules intracellulaires. Vg et VgR sont dissociés par acidification dépendante de l’ATP après
avoir été transportés dans l’endosome. Par la suite, VgR retourne à la membrane de l’ovocyte, tandis que Vg
est cristallisé et stocké sous forme de plaquette vitelline.

L’hormone juvénile (JH), une hormone sesquiterpénoïde produite dans les corps allates (ou corpora allata),
stimule la vitellogenèse et le développement des ovocytes chez diverses espèces d’insectes. L’action
moléculaire de JH repose sur son complexe de récepteurs intracellulaires comprenant deux facteurs de
transcription bHLH-PAS, Methoprene-tolerant (Met) et Taiman (Tai).

Les réserves moléculaires

La transcription est inhibée au cours des premières divisions du développement embryonnaire.
Ainsi, le succès du développement précoce dépend de réserves moléculaires dans l’ovocyte. Elles
comprennent des ARN (ARNm mais aussi ARNt et ARNr) et des protéines. Par exemple, dans un ovocyte
de Xénope, il y a l’équivalent en histones pour 10.000 noyaux de cellules ordinaires. On peut inclure dans
cette catégorie les mitochondries qui se divisent abondamment au cours de l’ovogénèse (il y a dans l’ovocyte
d’une grenouille un nombre de mitochondries habituellement trouvé au total dans 100.000 cellules
larvaires).

Chez les amphibiens, les gènes qui codent les précurseurs des ARN ribosomiques sont présents en 500
copies dans l’organisateur nucléolaire. Au stade pachytène de la méiose I, ces gènes sont activement
répliqués (alors que l’on n’est pas dans la phase S du cycle où la réplication a habituellement lieu !) et
environ 2000 copies sont produites. Elles forment des ADN circulaires extrachromosomiques ce qui va
génère des milliers de nucléoles qui se répartissent à la périphérie du noyau. Celui-ci se dilate au stade
diplotène et prend le nom de vésicule germinative. Cette amplification sélective permet de produire de très
grande quantité d’ARNr qui sont incorporés dans les ribosomes et permettent d’assurer la traduction
durant tout le développement précoce de l’amphibien. Les ribosomes se concentrent autour du noyau
créant un gradient ribonucléoprotéique qui est opposé au gradient vitellin.

L’activité transcriptionnelle est intense au cours de la vitellogénèse. Or l’ovocyte est bloqué en

prophase I de méiose et donc les chromosomes sont déjà condensés. Les zones activement
transcrites (marquées par de l’uracile tritiée par exemple) sont cependant décondensées formant
des boucles : les chromosomes ainsi structurés sont appelés chromosomes en écouvillon. Ils ont été
observés pour la première fois par Flemming en 1882 mais il a fallu attendre plusieurs décennies avant de
comprendre leur fonction.

*Figure 3-12. Schéma d’une paire de chromosomes homologues en écouvillon. Divers types de structures
chromatiniennes sont indiqués.

Source : https://www.mdpi.com/2311-553X/6/1/1/pdf

102
Les ARNm n’existent pas seuls dans le cytoplasme ; ils se lient à un certain nombre de protéines pour former
des complexes ribonucléoprotéiques. Les protéines de liaison à l’ARN (RBP) et les moteurs moléculaires
assurent le transport des ARNm le long du réseau de microtubules de l’ovocyte, ce qui entraîne une
distribution asymétrique des ARN. En effet, les microtubules sont des structures polarisées et orientées
de manière non aléatoire dans l’ovocyte (voir un exemple précis plus loin). Les RBP sont aussi capables de
réguler la stabilité et la traduction des ARNm, ce qui a une importance considérable au début du
développement embryonnaire où la transcription est inhibée.

De manière importante, la localisation des molécules d’ARNm et des protéines dans le cytoplasme de
l’ovocyte a un rôle fondamental pour l’acquisition des axes de polarité de l’embryon. Par exemple,
chez la drosophile, l’axe antéro-postérieur est déterminé par la localisation dépendante des
microtubules des ARNm bicoid (bcd) et oskar (osk) respectivement aux pôles antérieur et postérieur
de l’ovocyte. L’ARNm bcd n’est pas traduit pendant l’ovogenèse et n’est traduit que lorsque l’œuf
fécondé, fournissant une source locale de protéine Bcd, qui diffuse pour former un gradient de
morphogène qui modèle la moitié antérieure de l’embryon. En revanche, l’ARNm osk est traduit
lorsqu’il atteint la partie postérieure de l’ovocyte pour produire des isoformes longues et courtes
de la protéine Oskar. La forme longue d’Oskar ancre son propre ARNm, tandis que la forme courte
d’Oskar agrège les granules polaires, conduisant au recrutement postérieur des déterminants de la
lignée germinale et du déterminant abdominal, l’ARNm nanos.

*Figure 3-13. Localisation des ARNm de bicoid et d'oskar dans l'ovocyte de la drosophile. L'ovocyte est entouré par
les cellules folliculaires formant un épithélium et les cellules nourricières. Les ARNm sont détectés par hybridation
in situ avec des sondes spécifiques. La tête de la flèche noire indique le noyau de l'ovocyte. Source : Roth et al., 1995.

Initialement, les ARNm bcd et osk sont transcrits dans les cellules nourricières associées à l’ovocyte et sont
ensuite transportés par la dynéine le long des microtubules à travers des ponts cytoplasmiques vers
l’ovocyte.

La localisation de l'ARNm osk à la partie postérieure de l'ovocyte nécessite la protéine motrice se

déplaçant vers l’extrémité positive des microtubules, la Kinésine-1, les microtubules de l'ovocyte
étant en majorité orientés le pôle positif vers la future région postérieure de l'embryon.

103
 **Figure 3-14. La localisation de l’ARNm d’oskar dépend d’un domaine de liaison particulier de la chaîne lourde de
la kinésine (Khc) (A) Schéma des constructions transgéniques Khc-FL (longueur complète) et Khc délété pour un
domaine de liaison particulier appelé “cargo alternatif”, KhcΔ855-911. Ces constructions sont résistantes au ARNi
Khc utilisées dans cette étude pour inhiber l’expression de la protéine endogène pour que seulement les formes
transgéniques de Khc s’expriment (cette résistance est nécessaire sinon l’ARNi inhiberait non seulement l’expression
de Khc endogène mais aussi transgénique). Les étoiles roses indiquent des mutations ponctuelles silencieuses dans
la région ciblée par khc-ARNi. (B) La suppression du domaine de Khc conduit à une mauvaise localisation de l’ARNm
d’oskar. (Panneaux supérieurs du milieu et de droite) Les variantes Khc-FL et KhcΔ855-911 marquées avec mKate2
(une protéine fluorescente qui sert de rapporteur) ont été exprimées dans des ovocytes traitées avec ARNi Khc. Les
variantes de Khc et ARNi Khc ont été exprimées dans la lignée germinale, qui comprend les cellules nourricières et
l’ovocyte (voir schéma en haut à gauche). (Panneaux du bas) L’ARNm d’oskar a été visualisé par une technique
d’hybridation in situ à molécule unique (sm)FISH. Barre d’échelle, 25 µm. (C) Taux d’éclosion des œufs de mouches
exprimant les transgènes Khc-FL ou KhcΔ855–911 dans un arrière-plan Khc-ARNi. On voit bien que la mutation est
léthale. Attention, on ne peut pas déduire de cette expérience que c’est le domaine Khc855-911 qui interagit
directement avec l’ARNm d’oskar. Source : http://genesdev.cshlp.org.insb.bib.cnrs.fr/content/35/13-14/976.long

La localisation de l’ARNm bcd dépend en revanche de la protéine motrice se déplaçant vers le pôle
opposé, l’extrémité négative des microtubules, la dynéine. La protéine Staufen reconnait un motif
particulier dans le 3’UTR de l’ARNm de bicoid et fait la liaison de cet ARNm avec la dynéine
(Ferrandon et al., 1994).

Chez les amphibiens, certains ARNm sont également concentrés dans des régions bien précises de
l’ovocyte. Cela peut se faire en plusieurs phases : par exemple, les ARNm de Xwnt11 et Vg1 sont
d’abord répartis dans tout le cytoplasme puis ils sont transportés vers le pôle végétatif le long des
microtubules. Les séquences 3’UTR de Vg1 sont nécessaires et suffisantes pour expliquer la
localisation de cet ARNm puisque si on enlève ce 3’UTR les ARNm Vg1 restent répartis uniformément
dans le cytoplasme et si on ajoute ce 3’UTR sur un ARNm contrôle comme celui de la beta-globine,
cet ARNm se retrouve concentré autour du pôle végétatif alors que ce n’est pas du tout sa position
habituelle. La protéine qui interagit avec le 3’UTR de l’ARNm de Vg1 et l’arrime à un complexe avec la
dynéine et les microtubules s’appelle Vera (Deshler et al., 1997). Elle fait partie d’un complexe dans lequel
on trouve un orthologue de Staufen (une protéine impliquée dans la localisation des ARNm dans l’ovocyte
de drosophile) (Yoon et Mowry, 2004).

104
 *Figure 3-15. Staufen est nécessaire pour la localisation
spécifique de l’ARNm de Vg1 au cours de l’ovogenèse du
xénope. La région 3’UTR de l’ARNm de Vg1 marqué avec
un fluorophore rouge est suivi dans un ovocyte de stade
III-IV de xénope après sa co-injection à un stade précédent
avec un ARNm contrôle (WT) ou un ARNm codant une
forme dominant-négative (DN) de Staufen (inhibe Staufen
endogène). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/131/13/3035/42104/Xenopus-Staufen-
is-a-component-of-a

Une fois arrivé à destination près du pôle végétatif, l’ARNm est accroché aux microfilaments d’actine et se
retrouve dans un complexe avec un ARN non traduit (Xlsirt) qui stabilise sa localisation (Kloc et Etkin,
1994).

Le transport de l'ARNm de Xwnt11 ou de l'ARNm de Xcat-2 qui est un composant du plasme germinal (qui
va donner les cellules germinales) vers le pôle végétatif emprunte un autre mécanisme et est couplé au
mouvement des mitochondries (Zhou et King, 1996). Cette voie de localisation est parfois appelée voie
METRO. La localisation de Xcat-2 avec les mitochondries (dans ce qui est désigné par "nuage
mitochondrial") dépend d'une séquence de 250 nucléotides dans le 3'UTR de cet ARNm.

L’organisme maternel accumule aussi dans les ovocytes des éléments pour protéger les futurs embryons.
Par exemple, chez la drosophile, des piARN sont déposés avec pour fonction de protéger le génome des
embryons contre le déplacement des transposons. Ces déplacements peuvent menacer l’intégrité du
génome ce qui serait fâcheux lors du développement précoce, particulièrement si cela touche la lignée
germinale (Luo et al., 2020). Le principal mécanisme de défense contre les transposons est la voie des ARN
interagissant avec Piwi (piARN). Les piARN sont longs de 23 à 30 nucléotides et complémentaires des ARN
dérivés des transposons. Ils dirigent les protéines Piwi associées vers les transposons actifs. Chez la
drosophile, la répression guidée par Piwi provoque le clivage de l’ARNm cytoplasmique par Aubergine
(Aub), Argonaute-3 (Ago3) et Piwi et induit la répression co-transcriptionnelle par formation
d’hétérochromatine. En plus des piARN, toutes les protéines composantes de cette voie sont déposées par
la mère dans l’ovocyte. La déplétion de Piwi d’origine maternelle aboutit à une augmentation de l’activité
des transposons dans l’embryon précoce (Fabry et al., 2021).

Le contrôle de la progression de la méiose

En tant que gamète, l'ovocyte prêt à être fécondé est une cellule haploïde qui a subi la méiose
quoique de manière incomplète et intermittente. En effet, les ovocytes dans l'ovaire sont bloqués en
prophase I de méiose et ce sont les hormones qui déclenchent l'ovulation qui débloquent la méiose
grâce à l'activation d'un complexe jusqu'à un nouvel arrêt en métaphase II. C'est la fécondation qui
permet de surmonter ce nouveau blocage et de terminer la méiose.

Des expériences ont permis de mettre en évidence deux activités dans les cellules : l'activité MPF
(Maturation Promoting Factor) et l'activité CSF (CytoStatic Factor).

105
 *Figure 3-16. Caractérisation de l'activité MPF et CSF. On prélève le cytoplasme d'un ovocyte qui vient d'être ovulé
et on l'injecte dans un ovocyte immature dans l'ovaire (noyau en bleu). On déclenche alors la méiose. C'est la
caractérisation de l'activité MPF (ou Maturation Promoting Factor). Si on injecte ce cytoplasme dans une cellule d'un
embryon au stade 2 cellules, cette cellule est bloquée en métaphase de mitose. C'est la caractérisation de l'activité
CSF (ou CytoStatique Factor). Notez que les activités MPF et CSF peuvent agir tant sur la méiose que la mitose.
Source : https://journals.biologists.com/jcs/article/119/7/1213/29509/Cytostatic-factor-an-activity-that-puts-
the-cell

Les molécules associées ont été identifiées : l'activité MPF est celle du complexe cycline B-Cdk1
tandis que l'activité CSF est celle de la kinase Mos ainsi que celle de Cdk2. Ces kinases inhibent le
complexe APC/C qui est indispensable pour que les cellules quittent la métaphase (voir le chapitre
sur le contrôle du cycle cellulaire).

LA CARTE MENTALE :

LES MOTS CROISES POUR REVISER :

106
La fécondation

*Figure 3-17. Zygote humain issu de la fécondation entre

un ovocyte et un spermatozoïde. On observe les deux
pronuclei (noyaux) mâles et femelles. Le zygote est
entouré par la membrane de fécondation qui provient de
la zone pellucide modifiée pour éviter la polyspermie. En
bas, légèrement à gauche, on observe les deux globules
polaires issus de la terminaison de la méiose. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Zygote#/media/Fichier:Zygote1.jpg

otre corps a un temps de vie limité mais la reproduction permet à l’espèce de se perpétuer. Ce sont

N
les cellules de la lignée germinale (les gamètes) qui réalisent la reproduction sexuée. La
fécondation correspond à la rencontre entre le gamète mâle (spermatozoïde) et le gamète
femelle (ovocyte). Il s’agit de deux cellules très différentes : l’une est très mobile, l’autre l’est
peu et son cytoplasme formera le cytoplasme du zygote issu de la fusion des deux cellules. Pour
souligner cette différence, on parle d’anisogamie. Des mécanismes de reconnaissance et d’activation
mutuelle permettent à ces cellules d’interagir, de fusionner et de mettre en commun leur matériel
107
génétique. Les gamètes sont des cellules haploïdes ; leur fusion permet de rétablir la diploïdie
habituelle des animaux.

Des dysfonctionnements dans la reproduction touchent 1 couple sur 10 en France et des solutions
thérapeutiques d’assistance médicale à la procréation se sont développées à partir du début des années
1980s.

La rencontre des gamètes

La fécondation est externe chez les anoures tels que le xénope, avec néanmoins un accouplement
qui s’appelle un amplexus. Le mâle maintient la femelle avec ses membres antérieurs et émet ses
spermatozoïdes en même temps que les ovocytes sont émis du cloaque de la femelle. Cela permet de
concentrer sur un espace limité et dans le temps la présence des gamètes mâles et femelles, ce qui
optimise les rencontres entre les deux et limite les pertes.

Les spermatozoïdes entrent en contact avec la gangue gélatineuse qui entoure la masse des ovocytes et cette
interaction est nécessaire au bon déroulement de la fécondation.

Chez les Mammifères, après l’éjaculation, les spermatozoïdes passent le col de l’utérus en traversant
la glaire cervicale dont le passage est facilité autour de la période d’ovulation sous le contrôle du pic
d’œstrogènes (mailles plus larges, pH moins acide). Chez l’Homme, seuls 2 millions de
spermatozoïdes sur les 60 millions éjaculés traversent cette barrière. L’observation des modifications
de la glaire cervicale au cours du cycle sexuel féminin est à la base d'une méthode de contraception (la
méthode de Billings).

*Figure 3-18. Schéma d’un spermatozoïde humain.

La tête fait environ 5 µm et le flagelle fait 50 µm.

(vous pouvez voir le détail de sa structure à la figure 5-23).
Source : https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e0/Complete_diagram_of_a_human_spermatozoa_fr.svg

La nage flagellaire n’est pas le paramètre principal qui explique le déplacement des spermatozoïdes (on
trouve des spermatozoïdes dans l’oviducte 30 min après éjaculation, ce qui est trop court pour que ce soit
la seule mobilité flagellaire qui soit impliquée). Ce sont les contractions vaginales et utérines (contrôlées
par les muscles lisses) qui les amènent vers l’oviducte. Ces contractions sont sous le contrôle de l’ocytocine

108
dont la sécrétion est stimulée par l’accouplement. Les contractions utérines sont facilitées par les
œstrogènes dont la concentration sanguine est maximale autour de la période de l’ovulation.

Un spermatozoïde éjaculé ne pourra pas directement féconder un ovocyte. Des modifications

induites par les voies génitales femelles (utérus et surtout oviducte) doivent avoir lieu. C’est la
capacitation. Les propriétés membranaires sont alors modifiées : perte de cholestérol membranaire,
concentration à l’avant de l’acrosome des radeaux lipidiques membranaires importants pour la fécondation.
Il y a hyperactivation de la nage liée à une entrée de Ca 2+ dans le cytoplasme qui aboutit à la phosphorylation
et à l’activation des dynéines flagellaires. Les microfilaments d'actine sont réorganisés ce qui est essentiel
pour la future réaction acrosomiale (Schiavi-Ehrenhaus et al., 2022). Des récepteurs spermatiques sont
démasqués (perte des glycosides de surface ajoutés dans l'épididyme qui bloquent les récepteurs aux
protéines de la zone pellucide de l'ovocyte). Tous ces phénomènes sont post-traductionnels car il n’y a plus
de transcription, ni de traduction dans les spermatozoïdes matures.

***Figure 3-19. Voies de signalisation et flux ioniques impliqués dans la capacitation du spermatozoïde humain. L'élimination du
cholestérol de la membrane plasmique des spermatozoïdes vers les accepteurs présents dans l'utérus et les trompes de Fallope,
tels que l'albumine, entraîne une modification biophysique de la membrane plasmique. De plus, les spermatozoïdes sont exposés à
une concentration plus élevée de HCO3- au moment de l'éjaculation et pendant leur transit dans l'appareil reproducteur féminin. Le
transport de ce HCO3- à travers les cotransporteurs NBC active ADCY10, une adénylate cyclase, provoquant une augmentation de la
concentration d'AMPc, conduisant à l'activation de la PKA. La phosphorylation par PKA est essentielle pour l'activité du
transporteur CFTR, et avec d'autres cotransporteurs Cl−/HCO3- (SLC A3/6/8), elle conduit à une augmentation encore plus grande
de HCO3- dans le cytosol. D'autres sources possibles de HCO3- peuvent être liées à l'action des anhydrases carboniques.
Parallèlement, HCO3- provoque augmentation du pH intracellulaire des spermatozoïdes. Cette alcalinisation du cytosol est
également favorisée par l'efflux de protons à travers les canaux Hv1. L'alcalinisation et certains stéroïdes présents dans l'appareil
reproducteur féminin comme la progestérone activent les canaux CatSper et produisent une augmentation importante de [Ca 2+]
intracellulaire. Via une chaine d'enzymes, cela va provoquer une phosphorylation des moteurs dans le flagelle qui stimule la nage.
Les niveaux de [Ca2+] intracellulaires sont également régulés par l'action d'échangeurs et de pompes comme le NCX et le PMCA.
L'activation des voies AMPc/PKA conduit également à une hyperpolarisation de la membrane plasmique. Na+/K+ ATPase, Na+/K+
ATPase de pompe; SLO1 et 3, canaux K+ spécifiques du sperme 1 et 3 ; ENaC, canaux Na+ épithéliaux ; CFTR, canal de conductance
transmembranaire de la mucoviscidose ; SLC26, porteur de soluté 26 ; Hv1, canaux H+ voltage-dépendants ; BSA, albumine de
sérum bovin; CHO, cholestérol; CA, anhydrase carbonique; PYK2/FER, tyrosine kinase 2 riche en proline; ADCY10, adénylylcyclase
soluble atypique 10; EPAC, protéine d'échange activée par l'AMPc ; CaM, calmoduline; CatSper, canal Ca 2+ spécifique du sperme ;
NCX, échangeur Na+/Ca2+; ATPase Ca2+ de la membrane plasmatique PMCA ; PG, progestérone; ABDH2, protéine 2 contenant le
domaine hydrolase α/β ; 2-AG, 2-arachidonoylglycérol; AA, acide arachidonique; G, glycérol. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2018.00072/full

C’est au sein de l’oviducte que la nage flagellaire devient cruciale. Les spermatozoïdes ont besoin de
mécanismes de navigation pour nager dans la bonne direction. Ces mécanismes de navigation reposent
sur des signaux biochimiques et biophysiques externes (Tung et al., 2015). Les spermatozoïdes sont guidés
109
par un gradient de température (thermocline de 2°C) le long de l’oviducte (de l’entrée à la région appelée
ampoule où a lieu la fécondation). Les spermatozoïdes capacités sont très sensibles aux variations de
température et ils sont capables de détecter un gradient de 0,014°C par millimètre ! Sur la membrane
plasmique du spermatozoïde, un canal calcique activable par la progestérone appelé CatSper stimule la nage
flagellaire. Sachant que les cellules de la corona radiata entourant l’ovocyte sécrètent de la progestérone,
cela permet d’expliquer la chémoattraction des spermatozoïdes.

Voir cette vidéo sur le rôle de CatSper dans la motilité du flagelle : https://bcgdevelop.fr/la-
fecondation/#catsper

Les cellules entourant l’ovocyte sécrètent également la protéine CRISP1 qui se lie aussi à CatSper (Ernesto
et al., 2015). Il modulerait la nage des spermatozoïdes à proximité du l’ovocyte et des cellules environnantes
pour la rendre plus efficace. Seuls 200 spermatozoïdes environ finiront par atteindre l’ovocyte. Par
ailleurs, les spermatozoïdes peuvent survivre jusqu’à 6 jours dans les voies génitales femelles (Wilcox et al.,
1995).

Contact et fusion entre les gamètes

La grande majorité des données classiques sur la fécondation des Mammifères a été obtenue in vitro. Or in
vivo, des souris knock-out pour des acteurs jugés essentiels pour la fécondation in vitro se sont révélées
être fertiles, ce qui a amené à corriger les modèles classiques.

Chez les Mammifères, la zone pellucide est une matrice glycoprotéique qui entoure les ovocytes et a
une épaisseur moyenne de 17 micromètres. Elle est essentielle pour la fécondation (plus précisément
pour la reconnaissance des gamètes et pour la prévention de la polyspermie), et pour la protection
des embryons précoces avant l’implantation. La zone pellucide est composée essentiellement de 3 à
4 glycoprotéines appelées ZP1 à ZP4. Chaque protéine ZP est un polypeptide qui est glycosylé de manière
hétérogène avec des oligosaccharides liés à l’asparagine (N-) et à la sérine/thréonine (O-) qui, dans certains
cas, sont sialylés et sulfatés. Chez certains mammifères, tels que le chat, la vache, le chien et le porc, ZP1
n’est pas présent et sa fonction est complètement remplacée par ZP4. Chez la souris, ZP4 n’est pas présent
puisqu’il est codé par un pseudogène qui n’est pas exprimé lors de l’ovogenèse (Goudet et al., 2008). ZP1 et
ZP4 proviennent de la duplication récente d’un gène ancestral et cela est suivi des vicissitudes habituelles
dans ce cas avec de possibles transformations en pseudogènes ou délétion par redondance fonctionnelle
(Smith et al., 2005). ZP2 est assez apparenté à ZP1 et ZP4. Par contre, ZP3 est évolutivement assez éloigné
des 3 autres (Goudet et al., 2008).

Chez la souris, le knock-out ciblé soit du gène codant ZP2 soit du gène codant ZP3 empêche le
développement d’une zone pellucide, conduisant à la stérilité. Des cas de stérilité dans une famille ont été
reliés à une mutation dans ZP1 qui aboutit à une protéine aberrante qui reste dans le cytoplasme. Bien que
normale, la protéine ZP3 qui s’associe à ZP1 reste également dans le cytoplasme et n’est pas secrétée (Huang
et al., 2014), mettant en évidence la dépendance de ZP3 vis-à-vis de ZP1 pour sa localisation finale.

ZP2 et ZP3 semblent être les glycoprotéines sur lesquelles s’attache le spermatozoïde lors de son arrivée
dans la zone pellucide. La comparaison des séquences de ZP3 de différentes espèces de mammifères révèle
un degré élevé de divergence dans son domaine d’interaction avec le spermatozoïde par rapport à d’autres
régions de la protéine. Cette divergence est attribuée à une sélection darwinienne positive et assure sans
doute une importante spécificité d’espèce lors de la fécondation (Williams et al., 2005). Lorsqu’on essaie de
féconder des ovocytes de souris avec des spermatozoïdes humains, cela échoue mais lorsque ces ovocytes
de souris expriment ZP2 humain alors cela réussit, montrant aussi l’importance du ZP2 dans les
reconnaissances spécifiques des espèces (Baibakov et al., 2012).

La réaction acrosomiale est une exocytose dépendant du Ca2+ qui permet au spermatozoïde
d’excréter le contenu de son acrosome. Dans les modèles classiques, elle était dépendante de l’interaction
avec la zone pellucide. Il semble cependant que la réaction acrosomiale puisse avoir lieu avant,
indépendamment de la zone pellucide.

110
 *Figure 3-20. Observation d’une réaction acrosomiale
en temps réel. Un spermatozoïde est immobilisé sur de
la poly-L-lysine et incubé avec de l’agglutinine du pois
(Pisa sativum) couplé au fluorophore FITC (PSA-FITC).
Cette molécule se fixe sur des protéines exposées à la
surface du spermatozoïde exclusivement après la
réaction acrosomiale. La réaction acrosomiale est
activée à t=Os par une molécule qui active Rab3A (voir
plus loin dans le texte). Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)44442-
4/fulltext

Cette réaction libère des enzymes notamment la hyaluronidase qui permet au spermatozoïde de se frayer
un chemin à travers la corona radiata et la zone pellucide. Une autre enzyme libérée par la réaction
acrosomiale, l'acrosine, joue un rôle plus controversé. Son inhibition par des anticorps chez le lapin et sa
mutation perte-de-fonction chez le hamster par Crispr-Cas9 diminuent l'efficacité de la fécondation par les
spermatozoïdes par ralentissement de la traversée de la zone pellucide mais des spermatozoïdes de souris
ou de rats déficients en acrosine la traversent correctement (Hirose et al., 2020). Elle joue sans doute un
rôle qui est compensable par une autre enzyme chez certaines espèces.

La réaction acrosomiale permet aussi de placer à la surface du spermatozoïde la protéine IZUMO qui sera
importante pour la fusion avec l’ovocyte.

Des réactions acrosomiales trop précoces peuvent aboutir à de l’infertilité (Tesarik et Mendoza, 1995). Son
déclenchement est donc étroitement régulé. Un pic de concentration d’AMPcyclique active la PKA (protéine
kinase A) qui déclenche une cascade de signalisation aboutissant à l’activation de petites GTPases Rap1 et
Rab3A qui remodèlent le cytosquelette et le trafic membranaire ce qui aboutit à la réaction acrosomiale
(Pelletan et al., 2015).

La fusion des membranes plasmiques des 2 gamètes est initiée par l’interaction de IZUMO sur la
membrane plasmique du spermatozoïde et de JUNO sur celle de l’ovocyte (Bianchi et al., 2014; Aydin
et al., 2016).
*Figure 3-21. Interaction Izumo/Juno nécessaire à la
fusion des gamètes chez les Mammifères. Izumo est une
protéine transmembranaire du spermatozoïde et Juno
est une protéine ancrée à la membrane de l'ovocyte par
un GPI (glycosylphosphatidylinositol).

Les souris mâles déficientes en Izumo (mais pas les souris femelles) sont stériles car le sperme dépourvu
d’Izumo ne peut pas fusionner avec les ovules. La zone pellucide des ovocytes Juno−/− est pénétrée in vivo
par des spermatozoïdes de type sauvage, mais ceux-ci ne fusionnent pas avec l’ovocyte muté. Si on revient
à la situation normale, après la fusion du spermatozoïde avec l’ovocyte, Juno est éliminé de la membrane
plasmique ce qui constitue un mécanisme de blocage de la polyspermie (Bianchi et al., 2014).

111
 *Figure 3-22. Juno devient rapidement indétectable de la surface cellulaire après la fécondation. Juno (fluorescence
vert) est exprimé sur les ovocytes ovulés en métaphase II, mais est à peine détectable à la télophase II qui résulte du
déblocage de la méiose par la fécondation et Juno devient indétectable sur les zygotes au stade pronucléaire. La flèche
et l’astérisque indiquent les sites d’extrusion du premier et du deuxième globule polaire. Les chromosomes ne sont
pas dans le plan focal. Source : https://www.nature.com/articles/nature13203

Depuis récemment, on sait que des mitochondries de la pièce intermédiaire du spermatozoïde passent dans
le cytoplasme de l’ovocyte mais elles sont éliminées par autophagie. La transmission uniquement
maternelle des mitochondries est ainsi préservée. Les mitochondries ont leur propre génome (avec
13 gènes codant des protéines mitochondriales et 24 gènes codant des ARN non codant chez l'humain) et
les mutations de ce génome qui peuvent causer diverses maladies métaboliques (voir Russell et al.,
2020) sont uniquement transmises par la mère (héritage maternel cytoplasmique).

Conséquences de la fécondation
Chez les amphibiens, l’arrivée du spermatozoïde se fait toujours par l’hémisphère animal. Elle
entraîne un blocage de la polyspermie rapide sous la forme d’une dépolarisation membranaire. Une
augmentation de la concentration du Ca 2+ cytoplasmique provoque l’exocytose des granules
corticaux.

Voir la vidéo : *Observation d’une vague d’augmentation de la concentration calcique après la fécondation
chez le xénope. L’ovocyte avait été injecté au préalable avec un fluorophore dont la fluorescence dépend de
la concentration en Ca2+ : https://youtu.be/Cgrv1kLL6Uc

Les mucopolysaccharides des granules corticaux provoquent un appel d’eau dont l’afflux génère un espace
entre la membrane plasmique et l’enveloppe vitelline, l’espace périvitellin : le zygote n’est plus relié à la
gangue et à cause de la densité importante en vitellus du côté végétatif, il se tourne le pôle végétatif vers le
bas et le pôle animal vers le haut (alors qu’auparavant son orientation était aléatoire). C’est la rotation
d’équilibration qui a lieu habituellement 30 min après la fécondation. Lors de fécondations in vitro dans
les laboratoires, c’est un bon indicateur que la fécondation a bien marché.

Les granules corticaux contiennent aussi des enzymes qui modifient la composition de la membrane
vitelline et la transforme en membrane de fécondation (ou chorion). Le blocage de la polyspermie est
donc d’abord ionique (dépolarisation), physique (espace périvitellin) et biochimique (composition
de la membrane de fécondation).

Il existe une deuxième rotation qui a lieu 1h30 environ après la fécondation : la rotation de la couche
superficielle du cytoplasme d’un angle de 30° environ vers son point d’entrée. C’est la rotation
corticale. Les granules de mélanine sont entraînés par le cytoplasme mais certains restent en place
formant un croissant gris. Ce croissant gris marque la future région dorsale de l’embryon.

*Figure 3-23. Mise en évidence de la rotation

corticale par le déplacement de billes fluorescentes
injectées dans le cortex au pôle végétatif. Des billes
fluorescentes ont été injectées dans le cortex
cytoplasmique au pôle végétatif d'ovocytes de
xénope juste après la fécondation mais avant la
rotation corticale (A). 1h30 après la fécondation,
on observe que des billes ont été entraînées sur
une distance jusqu'à 600 µm vers un des côtés par
rapport au pôle végétatif (B). C'est la rotation
corticale qui ne concerne donc pas que les
pigments autour du pôle animal mais l'ensemble
du cortex cytoplasmique. La flèche blanche désigne
le cortex au pôle végétatif. Barre d'échelle = 200
µm. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.94.4.1224

112
 *Figure 3-24. Rotation corticale à la suite de la fécondation chez les Amphibiens. La calotte pigmentaire de
l’hémisphère animal bascule vers le point d’entrée du spermatozoïde laissant à l’opposé de celui-ci des traînées de
pigment cortical qui prennent la forme d’un croissant d’où le terme de croissant gris (CG). Après cet événement, la
future région dorsale de l’embryon apparaîtra du côté le plus clair du zygote. D: face dorsale, PA: Pôle Animal, PV:
Pôle Végétatif, V: face ventrale. Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/xenope1/xenope2.htm

Si on irradie la région végétative de l’ovocyte avec des UV, on perturbe la réaction corticale et on
obtient des embryons tronqués, sans région dorsale et sans tête. Ceci est expliqué par le fait que lors
de la rotation corticale, certaines molécules (protéines et ARNm) importants pour la formation de
la région dorsale sont entraînées du pôle végétatif vers le côté du croissant gris. Un deuxième axe
(dorso-ventral) est ainsi formé, perpendiculaire à l’axe pôle animal-pôle végétatif qui avait été mis
en place pendant l’ovogenèse. L’axe dorso-ventral n’est pas clairement séparé de l’axe antéro-postérieur
de l’animal à ces stades précoces.

La rotation corticale dépend du réseau de microtubules. Après la fécondation, sous le contrôle du

centriole amené par le spermatozoïde, des faisceaux de microtubules s’assemblent sous le cytoplasme
cortical. Dans l’hémisphère végétatif, ces faisceaux sont parallèles.

*Figure 3-25. Faisceaux orientés de microtubules observés par immunofluorescence anti-tubuline. Les zygotes
sauvages (A et A') ou mutants (B et B' qui ne réaliseront pas de rotation corticale) sont observés 60 minutes après la
fécondation par le pôle végétatif. A' et B' sont des agrandissements de A et B. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/149/17/dev200552/276567/Maternal-Wnt11b-regulates-cortical-rotation-during

L’irradiation aux UV précédemment citée créé des liaisons covalentes entre le GTP et la tubuline et perturbe
cette organisation. Un traitement à la colchicine ou au nocodazole perturbe aussi la formation des
microtubules et inhibe la rotation corticale. On peut suivre les déplacements liés à la rotation corticale grâce
à des microbilles fluorescentes.

Lors de la fécondation chez les Mammifères, l’entrée du spermatozoïde provoque une

dépolarisation membranaire et une succession de pics de concentration en Ca2+ cytoplasmiques (qui
activent la protéine kinase dépendante de la calmoduline CaMKII (Knott et al., 2006)). Ces hausses de
concentration calcique dépendent de PLC-ζ (PLC-zeta), une phospholipase C apportée par le spermatozoïde
qui clive PI(4,5)P2 et permet de produire IP3 (inositol-triphosphate) qui active le sortie du Ca2+ du
réticulum endoplasmique vers le cytosol (Wakai et al., 2011).

113
 **Figure 3-26. Signalisation calcique à la suite de la fusion du spermatozoïde lors de la fécondation. Lors de la fusion,
le sperme délivre la phospholipase C (PLC) ζ, qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) en
inositol 1,4,5-trisphospahte (IP3) et diacyl glycérol (DAG). IP3 se lie à son récepteur, IP3R1, provoquant la libération
de Ca2+ hors du réticulum endoplasmique (ER). Après la libération de Ca2+, les niveaux basaux de [Ca2+]intracellulaire
sont régulés par l'action combinée de la Ca2+-ATPase du réticulum endoplasmique (SERCA), de la pompe à Ca 2+ de la
membrane plasmique (PMCA), de l'échangeur Na/Ca2+ et des mitochondries. Des canaux de Ca 2+ de stockage (SOC)
sont proposés pour assurer la médiation de l'influx de Ca2+ nécessaire pour remplir à nouveau le RE et maintenir les
oscillations. Les lignes brisées correspondent à une action de rétroaction de Ca 2+ sur IP3R1. Source :
https://cshperspectives.cshlp.org/content/3/4/a006767.long

Une très forte concentration en Ca2+ cause la fermeture des canaux Ca2+ du réticulum endoplasmique et un
repompage se fait d’où la forme en pic de ce signal. Plusieurs pics se succèdent. Ces pics calciques
provoquent l’exocytose des granules corticaux et le déblocage de la méiose (dans ce dernier cas par
stimulation de la dégradation du CSF (CytoStatic Factor). La méiose se termine avec l’expulsion du
deuxième globule polaire.

*Figure 3-27. La fécondation provoque l’exocytose des granules corticaux via la libération d’ions Ca 2+ du réticulum
endoplasmique (RE). Des flux calciques provenant de l’extérieur peuvent aussi intervenir dans un second temps.

Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.704867/full

114
Seuls 4 pics calciques sont nécessaires pour déclencher l’exocytose des granules corticaux mais il en faut au
moins 8 pour faire redémarrer la méiose (Ozil et al., 2005). Les enzymes dans les granules corticaux clivent
les protéines ZP de la zone pellucide. Par exemple, la protéase ovastacine clive ZP2 qui perd sa capacité à
interagir avec les spermatozoïdes. On observe aussi des mouvements cytoplasmiques rythmés qui
dépendent de l’interaction actine-myosine et des pics de concentrations en Ca 2+. Le blocage de ces
mouvements cytoplasmiques aboutit à des développements anormaux mais leur fonction précise n’est pas
encore claire (Ajduk et al., 2011).
***Figure 3-28. Des flux cytoplasmiques rythmés sont
corrélés à des pics de Ca2+ cytoplasmique juste après la
fécondation dans le zygote de la souris. Préalablement à la
fécondation, les ovocytes sont chargés avec du FuraRed qui
est un fluorochrome dont l'intensité dépend de la
concentration en Ca2+ (ordonnées à droite). Source :

https://www.nature.com/articles/ncomms1424

Le matériel génétique paternel et maternel se trouvent dans des noyaux séparés appelés pronucléi
(pluriel de pronucléus).
*Figure 3-29. Zygote humain 17 heures après
fécondation. On observe les 2 pronoyaux ou pronucléi.
Notez les 2 globules polaires entre la membrane
plasmique et la membrane de fécondation (ex-zone
pellucide) indiquant que la deuxième division de la
méiose est terminée. Source : Thèse de Chloé Baron, Université
de Montpellier (2021)

Dans le pronucléus mâle, les protamines sont remplacées par des histones maternelles sous la direction de
la protéine Hira (Loppin et al., 2005). Chaque pronucléus fait réplication à part (8h après la fécondation
chez la souris) et ce n’est que lors de la métaphase de la première mitose que les chromosomes
maternels et paternels se retrouvent côte à côte. Ainsi, les premiers noyaux vraiment diploïdes sont
ceux de l’embryon au stade 2 cellules.

*Figure 3-30. Première division mitotique chez un embryon de souris. Notez les pronucléi (rouge)
séparés sur la première image. La chromatine est marquée par la protéine fusion H2B-RFP (rouge) et les
faisceaux de microtubules par Tubuline-GFP (vert).
Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)00556-3

115
 Les particularités de la fécondation chez la drosophile. La drosophile présente quelques
différences notables avec les fécondations décrites ici. L’activation de l’ovocyte a lieu lors
de l’ovulation, avant même que l’arrivée des spermatozoïdes. Des canaux calciques
s’ouvrent et les concentrations en Ca2+ augmentent dans le cytoplasme, indépendamment
du spermatozoïde. Celui-ci ne peut féconder qu’une région bien précise de l’ovule, celle
qui se trouve sous le micropyle qui est un tunnel creusé dans la paroi de l’œuf (chorion).
Elle correspond à la future région dorsale antérieure. Le micropyle ne peut être traversé
que par un spermatozoïde à la fois, ce qui limite les risques de polyspermie. Il n’y a pas
d’exocytose de granules corticaux.

La procréation médicalement assistée (PMA)

L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) définit l’infertilité par l’absence de grossesse après au
moins un an de rapports sexuels réguliers non protégés chez les couples en âge de procréer. Elle
affecte entre 9% et 15% des couples selon les études (Boivin et al., 2007).

La PMA apporte une réponse à la stérilité ou à l’infertilité et représentait 3,4% des naissances en
France en 2018 (contre 2,6% en 2009). Plusieurs millions de personnes sont nés dans le monde grâce à
la PMA depuis la mise au point de la fécondation in vitro en 1978.

Selon le type d’infertilité, il y a plusieurs options de traitement : thérapie médicamenteuse (induction de

l’ovulation), insémination intra-utérine, fécondation in vitro (FIV) et transfert embryonnaire (FIVETE),
injection intracytoplasmique de spermatozoïde (ICSI).

L'insémination intra-utérine est la plus pratiquée dans le monde. Elle consiste à déposer une préparation
enrichie en spermatozoïdes mobiles directement dans la cavité utérine et elle est prescrite en cas
d'infertilité masculine avec des spermatozoïdes avec un taux de mobilité normal ou subnormal.
*Figure 3-31. Différences entre PMA et
développement normal. Au cours de la PMA avec
FIV ou ICSI, la maturation de multiples ovocytes
est réalisée grâce à de fortes stimulations
hormonales et de multiples ovocytes sont prélevés
dans l'ovaire alors que naturellement seul un
ovocyte est ovulé. La fécondation et le début du
développement embryonnaire se font dans un
milieu artificiel (avec un pH, un taux
d'oxygénation, une osmolalité... contrôlés) et les
embryons sont transférés dans l'utérus au stade
blastocyste avant le stade normal de
l'implantation tandis que la fécondation et
l'embryogenèse "naturelles" se déroulent dans
l'organisme maternel avec des échanges de
signaux. Des modifications épigénétiques peuvent
résulter des modifications qu'apporte la PMA par
rapport à la procréation naturelle et ont pu être
liées à une plus grande susceptibilité à certaines
pathologies. Source :
https://www.mdpi.com/2077-
0383/11/8/2151/htm

La première naissance d’un enfant issu du FIV a eu lieu en 1978 (Louise Brown en Angleterre). En France,
cela est arrivé avec Amandine en 1982. La procédure est la suivante : une stimulation hormonale ovarienne
et un suivi du développement des follicules par échographie. Les ovocytes sont prélevés quelques heures
avant l’ovulation puis mis en présence des spermatozoïdes préparés. Les embryons obtenus sont cultivés
in vitro pendant 2 à 6 jours afin d’évaluer leur bon développement par leur morphologie. Des embryons
ainsi sélectionnés sont transférés dans l'utérus maternel (le taux de succès de l'implantation et d'une
116
grossesse par embryon est de 20 à 30% (de Mouzon et al., 2012). Les embryons surnuméraires et qui ont
eu une bonne morphologie peuvent être congelés pour stockage.

Pour l’ICSI, on charge dans une micropipette un spermatozoïde dont on casse le flagelle et on l’injecte dans
le cytoplasme ovocytaire. La première ICSI a été réalisée en Belgique en 1992. Les indications de cette
technique sont de graves défauts de mobilité des spermatozoïdes, des anomalies de la zone pellucide, des
anomalies des capacités fusiogènes des membranes plasmiques des gamètes et des anomalies de
l’exocytose des granules corticaux (pouvant mener à la polyspermie).
*Figure 3-32. Réalisation d’une ICSI.

Source :

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Icsi.JPG

LA CARTE MENTALE

DES MOTS CROISES POUR REVISER

117
EN DIRECT DES LABOS

Présentation d’une équipe de recherche qui travaille sur la fécondation : https://youtu.be/vlNPb1X3cPA

Le clivage

Il s’agit de la première étape du développement embryonnaire où le zygote puis l’embryon subit des
mitoses successives, ce qui divise le cytoplasme issu de l’ovocyte. C’est durant cette période que les
cellules germinales (qui forment les gamètes) sont séparées des cellules somatiques, qui sont
spécifiées en trois feuillets : ectoderme, mésoderme et endoderme.

Clivage en spirale
Le clivage en spirale est caractérisé par une rotation de 45° du fuseau mitotique par rapport à l’axe animal-
végétatif dans la transition du stade quatre à huit cellules.
**Figure 3-33. Passage du stade 4 cellules à 8 cellules au
cours du clivage d’un Spiralia. Source.

Cette rotation persiste dans les divisions ultérieures, avec à chaque fois une alternance de sens, soit dextre
soit senestre. Finalement, cela se traduit par des cellules situées au pôle animal de l’embryon affichant un
arrangement compact en forme de spirale, d’où le nom de ce type de clivage.

Le clivage en spirale est présent chez au moins huit grands groupes d’animaux, incluant les Annélides, les
Mollusques et les Plathelminthes (Hejnol, 2010; Henry, 2014). Souvent considéré à tort comme le modèle
de clivage typique des Protostomiens, le clivage en spirale est plutôt spécifique et probablement une
synapomorphie (caractère dérivé partagé exclusif) des Spiralia. Les Spiralia sont un groupe
morphologiquement et écologiquement diversifié comprenant environ 10% des espèces animales connues
(Brusca et al., 2016).

La domination de systèmes modèles de Protostomiens qui n’ont pas de clivage en spirale tels l’insecte
Drosophila melanogaster ou le nématode Caenorhabditis elegans, tous deux appartenant aux Ecdysozoaires
(donc hors des Spiralia), a causé un retard dans l’étude du clivage en spirale.

Clivage radiaire
> Chez les Amphibiens

Voir la vidéo : https://www.youtube.com/shorts/fUpc93T12bk

Chez les amphibiens, le zygote subit une série de mitoses très rapides qui vont le rendre
pluricellulaire. L’ensemble du volume de l’ovocyte est cellularisé : on parle de clivage total ou
holoblastique. Le premier plan de clivage est méridien et correspond à l’axe pôle animal/pôle
végétatif. Le zygote est divisé en deux cellules de taille similaire, appelées blastomères. Le second
plan de division est également méridien mais perpendiculaire au premier.

118
 *Figure 3-34. Les 3 premières divisions cellulaires d'un embryon de grenouille. Le pôle animal est en haut et le pôle
végétatif en bas. Notez que les sillons de division sont ralentis dans l'hémisphère végétatif riche en vitellus. D'après
Patten et Carlson, Foundations of Biology, 1958

Bien que similaires en apparence, ces blastomères ne sont pas identiques. Hans Spemann a montré
en 1903 que si on sépare les blastomères, seuls ceux qui ont hérité du croissant gris (une région
partiellement pigmentée générée par la rotation corticale à la suite de la fécondation) donne des
embryons normaux tandis que les autres donnent des structures sans axes définis. Le troisième plan
de division est perpendiculaire aux deux précédents, parallèle à l’”équateur” mais légèrement décalé dans
l’hémisphère animal. Les cellules générées n’ont plus les mêmes tailles avec 4 cellules plus petites (appelées
micromères) autour du pôle animal et 4 cellules plus grosses (appelées macromères) du côté du pôle
végétatif. Puis de nouveaux clivages permettent d’arriver au stade 16 cellules, le stade morula.

Avec de nouvelles divisions, on arrive au stade blastula. Les macromères autour du pôle végétatif
sont toujours plus gros (car plus riches en vitellus) que les micromères autour de pôle animal. La
blastula se creuse d’une cavité remplie de liquide, le blastocœle.

*Figure 3-35. Blastula d’Amphibien. Les cellules appelées blastomères sont divisées en deux catégories : les
micromères autour du pôle animal et les macromères autour du pôle végétatif.

Nieuwkoop a montré en 1969 qu’une blastula d’Amphibien pouvait être divisée en 3 régions :

• Les cellules de la calotte animale autour du pôle animal qui, isolées du reste des cellules,
donnent de l’épiderme cilié.

• Les cellules de la zone marginale qui, isolées du reste des cellules, donnent du mésoderme

• Les cellules autour du pôle végétatif qui, isolées du reste des cellules, donnent de
l’endoderme.

Pendant et à l’issue du clivage, on peut marquer spécifiquement des cellules de l’embryon, laisser la
suite du développement se dérouler et observer en quoi ces cellules marquées se développeront
plus tard. On établit ainsi une carte des territoires présomptifs. Pour ce faire, on réalise des injections
de marqueurs cytoplasmiques fluorescents comme la fluorescéine ou la rhodamine couplée au dextran. Le
dextran est un polymère glucidique non dégradable dans le cytoplasme et trop gros pour passer d’une

119
cellule à l’autre ou traverser la membrane plasmique. Il est donc un bon outil pour le suivi du lignage des
cellules.
*Figure 3-36. Carte des territoires présomptifs du
xénope juste avant le début de la gastrulation.

Si on constate un décalage entre le devenir des cellules cultivées isolément et la carte des territoires
présomptifs (où les cellules marquées et suivies restent à leur place habituelle dans l’embryon) cela
veut dire que les cellules ne sont pas encore déterminées. Par exemple, tout un côté (dorsal) de la
calotte animale donne le système nerveux dans les cartes des territoires présomptifs alors que la
calotte animale prélevée à différents stades du clivage et cultivée isolée ne donne que de l’épiderme.
Cela veut dire qu’au stade où la calotte animale a été prélevée, les signaux inducteurs du système
nerveux en provenance de l’extérieur de la calotte animale n’avaient pas encore été reçus.

*Figure 3-37. Différence entre établissement de la carte des territoires présomptifs et test de détermination. Ici, le
territoire n’est pas déterminé. Il le sera lorsque le test de détermination donnera le même résultat que la carte des
territoires présomptifs.

La détermination du mésoderme a lieu pendant la période de clivage :

120
 *Figure 3-38. Expérience de Nieuwkoop. Une calotte animale isolée donne de l’épiderme cilié. Mais mis en contact
avec les macromères de l’hémisphère végétatif (qui, isolément donnent de l’épiderme), elle donne du mésoderme.
Le mésoderme est dorsal si on a pris des macromères provenant de la partie dorsale de l’hémisphère végétatif (du
même côté que le croissant gris). Source : https://ressources.unisciel.fr/biodudev/co/grain_5_6_1.html

Des expériences de recombinaisons telles que celles effectuées par Nieuwkoop ont montré que le
mésoderme est induit à partir de l’ectoderme à partir de signaux provenant de l’endoderme. On
parle d’induction du mésoderme. Ces signaux sont déjà polarisés puisque de l’endoderme dorsal
induit du mésoderme dorsal, et de l’endoderme ventral induit du mésoderme ventral. On connait
maintenant la signalisation impliquée. Il s’agit de la signalisation Nodal de la famille des ligands
TGF (ligands Xnr chez le xénope).

L’expression de ces ligands Xnr est activée par VegT, un facteur de transcription dont les ARNm ont
été stockés au pôle végétatif lors de l’ovogenèse mais qui n’ont pas été déplacés lors de la rotation
corticale. VegT active l’expression de Sox17 qui détermine les cellules de l’hémisphère végétatif en
endoderme et il active aussi l’expression des Xnr qui diffusent et induisent le mésoderme dans les
cellules sus-jacentes (Skirkanich et al., 2011). Ces gènes sont induits avant même l’activation plus générale
de la transcription lors de la MBT (voir plus loin).
*Figure 3-39. Détermination de l’endoderme et
induction du mésoderme lors du clivage chez le xénope.
Eomes est un gène exprimé précocement dans le
mésoderme et dont l’expression est induite par la
signalisation activée par Xnr.

Chez les amphibiens, les premières divisions sont très rapides (toutes les 30-35 minutes à 25°C), ce
qui est exceptionnel pour une cellule eucaryote : c’est une vitesse qui n’a rien à envier à la
prolifération des bactéries ! Le cycle cellulaire est fortement modifié avec une succession de phase
S et de phase M, sans phases G1, ni G2. Cela ne laisse absolument pas de temps à une quelconque
transcription de se faire.

Lors de la fécondation chez le xénope, le taux de synthèse des protéines augmente fortement et pendant le
clivage, un grand nombre de nouvelles protéines sont synthétisées, comme l’ont montré des études de
protéomique. Toutes ces protéines sont synthétisées par traduction d’ARNm maternels préformés. Il y a
très peu de nouveaux ARN (ARNm, ARNr et ARNt) synthétisés jusqu’au 12ème cycle cellulaire, où
l’embryon est composé de 4096 cellules (=212 cellules). A cette étape qui s’appelle la transition mi-
121
blastuléenne (MBT), le cycle cellulaire ralentit permettant à une phase G1 et G2 de se mettre en
place. La transcription est activée. Les gènes paternels sont donc transcrits pour la première fois à
cette période et avant, c’était le génotype maternel qui contrôle le développement. A ce moment, les
divisions deviennent également asynchrones, certains groupes de cellules proliférant plus vite que
d’autres.

*Figure 3-40. Activation de la transcription à la MBT. Une analyse transcriptomique a été réalisée chez le xénope à
différents stades (voir en haut) et on a extrait des données uniquement les cibles directes de la voie beta-caténine
(tous les éléments de cette voie sont d'origine maternelle avant la MBT). On observe une forte augmentation de la
quantité de transcrits à partir du stade 7 correspondant à la MBT. Source : https://www-cell-
com.insb.bib.cnrs.fr/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30501-0

Qu’est-ce qui déclenche la MBT ? Il semble que ce ne soit pas l’accumulation des divisions cellulaires. Les
interactions cellule-cellule ne sont pas non plus impliquées, car des blastomères dissociés subissent la
transition en même temps que les embryons intacts. Le facteur clé déclenchant la MBT semble être le ratio
ADN/cytoplasme, à savoir la quantité d’ADN présente par unité de masse de cytoplasme. En effet,
l’augmentation artificielle de la quantité d’ADN en laissant plus d’un spermatozoïde entrer dans l’ovocyte
ou en injectant de l’ADN supplémentaire dans le zygote aboutit à une MBT précoce. Cela suggère qu’il existe
une quantité fixe d’un répresseur de transcription présent initialement dans le cytoplasme de l’ovocyte.
Comme ce volume est clivé, la quantité de cytoplasme n’augmente pas, mais la quantité d’ADN si (car elle
est doublée à chaque réplication). Donc la quantité de répresseur par rapport à l’ADN devient de plus en
plus réduite, jusqu’à ce qu’elle soit insuffisante pour se lier à tous les sites disponibles sur l’ADN et la
répression est alors levée.

> Chez les oiseaux

Chez les oiseaux tels que la poule, le clivage ne concerne qu’une toute petite région du volume de
l’ovocyte, le reste restant occupé par le vitellus et restant acellulaire. La première mitose a lieu environ
4 heures après la fécondation et les 16 premières cellules ne sont pas complètement entourées par une
membrane plasmique et restent « ouvertes » sur le vitellus. Ensuite, les nouvelles cellules produites sont
complètement « fermées ». De l’eau est pompé à partir du blanc d’œuf et s’accumule dans une cavité formant
le blastocœle, sous le disque aplati formé par l’embryon lui-même, appelé blastoderme.

122
 *Figure 3-41. Premiers clivages chez l’embryon de
pigeon. Une très grande partie du volume de l’ovocyte
reste non cellularisée. D'après Patten et Carlson,
Foundations of Biology, 1958

Les axes de l’embryon de poule sont mis en place à ce stade. L’axe dorso-ventral est défini par la proximité
avec le vitellus (le côté ventral est le plus proche du vitellus). L’embryon passe alors 20h dans la partie de
l’appareil génital appelé utérus et où se dépose la coquille calcaire. La paroi musculeuse de l’utérus
provoque une lente rotation de l’œuf (10 à 12 tours par heure) assurant ainsi la distribution homogène des
cristaux. Cette rotation a aussi un rôle dans l’établissement de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Lorsque l’œuf est pondu, l’embryon a terminé son clivage et possède 20.000 à 30.000 cellules. Un sous-
ensemble de ces cellules forme un disque quasi-épithélial épais d’une seule couche, l’épiblaste. À la
périphérie de l’embryon, l’épiblaste repose sur une couche rigide de plusieurs épaisseurs de grandes
cellules mésenchymateuses, qui entrent directement en contact avec le vitellus sous-jacent. Cette portion
externe de l’embryon en forme de couronne est connue sous le nom d’Area Opaca (AO). Elle paraît sombre
à cause de très nombreuses gouttelettes lipidiques dans les cellules collées contre le vitellus. Dans la partie
centrale de l’embryon qui paraît nettement plus claire, l’Area Pellucida (AP), des amas de quelques petites
cellules arrondies s’attachent à la face ventrale (inférieure) de l’épiblaste, formant l’hypoblaste primaire.
Au cours du développement initial, l’hypoblaste primaire s’aplatit pour former une couche épithéliale de
grandes cellules minces, l’hypoblaste. Les cellules épiblastiques AP donnent naissance à l’embryon
proprement dit, tandis que l’hypoblaste et l’AO forment des structures extra-embryonnaires.

Durant cette phase, les capacités de régulation de l’embryon de poulet sont remarquables. On peut diviser
le disque embryonnaire en 8 et les 8 portions peuvent produire un embryon entier (Sprat et Haas, 1960).

> Chez les Mammifères

Le clivage a lieu dans les voies génitales femelles, avant l’implantation. Contrairement aux embryons
de drosophile ou de xénope, les premières divisions cellulaires de l’embryon des Mammifères sont
très lentes et elles deviennent assez précocement asynchrones.

123
 *Figure 3-42. Clivage chez la souris et détermination des premiers lignages. A E3,5, l’ensemble épiblaste/endoderme
primitif s’appelle la masse cellulaire interne. D’après https://www.nature.com/articles/ncomms6667

*Figure 3-43. Le développement embryonnaire humain avant l'implantation. L'ovulation, la fécondation, le

développement pré-implantatoire et l'implantation se produisent à des endroits spécifiques de l'appareil
reproducteur féminin en l'espace d'environ une semaine. Source : https://openstax.org/books/anatomy-and-
physiology/pages/28-2-embryonic-development

L’activation du génome zygotique a lieu dans un embryon avec peu de cellules contrairement à la
drosophile et au xénope. Cette activation comprend deux vagues : une mineure et une majeure. Chez la
souris, la vague mineure a lieu à la fin du stade zygote, tandis que la vague majeure se produit au stade 2
cellules (Schulz et Harrison, 2019). Chez l’homme, la vague mineure a lieu au stade 4 cellules tandis que la
majeure se produit au stade 8 cellules. Chez l'homme, la vague mineure a lieu au stade 4 cellules tandis que
la majeure se produit au stade 8 cellules. La vague mineure tant chez la souris que chez l'homme est sous le
contrôle du facteur de transcription DUX4 (De Iaco et al., 2017). Chez la souris, l'ARN polymérase II qui
synthétise les ARNm est positionnée sur de nombreux sites de la chromatine dès le stade zygote mais
change de positionnement au stade 2 cellules juste avant la vague majeure. Ce changement de répartition
essentiel à l'activation du génome zygotique est sous le contrôle des protéines OBOX (Ji et al., 2023).

124
Initialement, les blastomères au stade 8 cellules sont lâchement attachés les uns aux autres mais
lors de la compaction, l’adhérence cellule-cellule devient nettement plus forte (elle a lieu au stade 8
cellules chez la souris et de manière asynchrone entre les stades 8 et 16 cellules chez l’Homme).
*Figure 3-44. Embryon de souris à 8 jours non compacté
(à gauche) puis compacté (à droite). Notez que
l’embryon est entouré par la membrane de fécondation
(la zone pellucide modifiée à la suite de la fécondation).

Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0007117

**Figure 3-45. Compaction chez l’embryon humain.

Image en microscopie électronique à balayage d’un
embryon humain au stade intermédiaire de 10 cellules
où on observe que certaines cellules sont déjà
compactées mais pas d’autres.

Source : https://academic.oup.com/biolreprod/article/55/1/32/2760593

La compaction nécessite la présence d'ions Ca2+ extracellulaires ce qui suggère que des cadhérines,
des molécules transmembranaires jouant un rôle dans l'adhérence cellulaire et dont l'activité
dépend des ions Ca2+, sont impliqués. Des études plus poussées ont montré que la compaction est
causée par l'exocytose de vésicules intracellulaires contenant de la E-cadhérine. Des embryons où les
deux allèles du gène codant la E-cadhérine ont été délétés réalisent quand même la compaction ce qui
montre que la E-cadhérine impliquée à cette étape est d'origine maternelle (Larue et al., 1994). Au cours de
cette étape, les cellules acquièrent une polarité apico-basale comme dans un épithélium.

La formation du blastocyste coïncide avec la démarcation des deux premières lignées dans
l’embryon préimplantatoire de mammifère (à E3,5 chez la souris) :

• la masse cellulaire interne (MCI) formée d’une quinzaine de cellules seulement et qui donne
naissance à l’embryon proprement dit (avec ses trois feuillets), et aussi à l’endoderme et au
mésoderme extra-embryonnaires : il s’agit de cellules pluripotentes.

• le trophectoderme (TE) qui génère le placenta.

La spécification de ces lignages est initiée lorsqu’un groupe de cellules est dirigé vers l’intérieur de
l’embryon au cours de deux séries de divisions asymétriques aux transitions de 8 à 16 cellules et de 16 à 32
cellules. Les cellules à l’extérieur de l’embryon sont destinées à se différencier en TE extra-embryonnaire,
tandis que les cellules à l’intérieur forment la MCI pluripotente. Plus tard, vers E3,5 chez la souris et vers E5
chez l’Homme, les cellules de la MCI deviendront soit l’épiblaste pluripotent qui donnera naissance au fœtus,
soit l’endoderme primitif qui contribuera principalement aux tissus extra-embryonnaires (à ne pas
confondre avec l’endoderme de l’embryon qui se formera plus tard).

125
 ***Figure 3-46. Lignage général de l’embryon de souris et de ses annexes. Les cellules qui ne participent qu’à des
annexes extraembryonnaires sont en vert, celles qui donneront des cellules des annexes et des cellules de l’embryon
sont en hachurés verts. Les flèches bleu clair orientent vers les lignages de l’embryon lui-même.

**Figure 3-47. Expression spécifique de protéines dans la masse cellulaire interne et dans le trophectoderme d'un
blastocyste de souris. Etude par immunofluorescence avec des anticorps reconnaissant Oct-4, Nanog ou Cdx2. On
constate qu'Oct-4 et Nanog sont exprimés dans la masse cellulaire interne mais pas dans le trophectoderme tandis
que Cdx2 est exprimé dans le trophectoderme mais pas dans la masse cellulaire interne. Le DAPI colore l'ADN des
noyaux pour pouvoir apprécier la présence de toutes les cellules. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/134/23/4219/64574/Stochastic-patterning-in-the-mouse-pre

C'est l'activation concomitante des voies de signalisation YAP et Notch qui spécifient les cellules
périphériques à se déterminer en trophectoderme, par activation de l’expression de Cdx2. Dans les cellules
de la MCI, YAP reste dans le cytoplasme et ne peut activer l'expression de Cdx2 (voir Figure 2-5).

Ces données ont été obtenues chez la souris. Chez l’Homme, des expériences suggèrent que CDX2 ne serait
pas essentiel pour l’initiation de la formation du trophectoderme mais ce serait GATA3 qui aurait ce rôle
(Krendl et al., 2017).
126
Un transport actif des ions Na+ par le côté basolatéral de l’épithélium formé par le trophectoderme génère
un flux osmotique d’eau vers l’intérieur de l’embryon. De multiples espaces intercellulaires se forment
d’abord puis fusionnent en une seule cavité remplie de fluide connue sous le nom de blastocœle (Dumortier
et al., 2019).

Les cellules embryonnaires souches (ES) sont dérivées de la masse cellulaire interne (MCI) du
blastocyste. Bien qu’il s’agisse d’une population cellulaire transitoire dans l’embryon, les cellules ES
cultivées in vitro dans des conditions particulières peuvent subir un auto-renouvellement illimité
et sont pluripotentes, donnant naissance à tous les types de cellules (voir Figure 2-57).

Au stade tardif du blastocyste, trois lignées cellulaires distinctes sont observées : l’épiblaste,
l’endoderme primitif, tous deux issus de la MCI et le trophectoderme.
*Figure 3-48. Structure d'un blastocyste de souris à
E4,5

Oct4, Sox2 et Nanog sont des facteurs de transcription qui maintiennent le destin indéterminé des
cellules ES et des épiblastes, tandis que le facteur de transcription à homéoboîte Cdx2 régule la mise
en place et le maintien de l’identité TE au sein du blastocyste de souris, réprimant Oct4 et Nanog
dans le TE. Signalons qu'inversement, Nanog réprime Cdx2 dans l'épiblaste et que les inhibitions croisées
Nanog/Cdx2 se font directement : Cdx2 se fixant sur le promoteur de Nanog et Nanog se fixant sur le
promoteur de Cdx2 (Chen et al., 2009). Gata3 régule le développement du TE en parallèle de Cdx2, et les
deux gènes dépendent d'un troisième gène, Tead4. Gata6 contrôle le développement de l’endoderme
primitif, antagonisant Nanog, ce qui permet de le distinguer de l'épiblaste.

À E4.5, les populations Nanog+ (épiblaste) et Gata6+ (endoderme primitif) sont ségrégées par la
signalisation FGF4 (Yamanaka et al., 2010). Ainsi, les cellules exprimant le récepteur FGFR1 ainsi que la
signalisation autocrine FGF4 s’engagent dans l’épiblaste, tandis que la signalisation paracrine FGF4 via
FGFR1 et FGFR2 détermine les cellules de l’endoderme primitif. Les niveaux d’ERK actifs relativement
faibles dans les cellules FGFR1+ déclenchent une rétroaction négative avec ERK, augmentant l’expression
de Nanog et l’identité pluripotente de l’épiblaste. En revanche, la signalisation FGF dans les cellules
FGFR1+/FGFR2+ avec des niveaux élevés d’ERK actifs stimule la transcription de cibles alternatives, telles
que DUSP, pour réduire l’expression de Nanog et activer celle de GATA6 dans le futur endoderme primitif
(Kang et al., 2017). La suppression de l’activation de ERK par l’inhibiteur PD0325901 (PD032) ou
l’inhibiteur de FGFR PD173074 induit une conversion en épiblaste et aucune spécification en endoderme
primitif n’est alors possible (McLean et al., 2014 ; Bessonnard et al., 2017).

127
 **Figure 3-49. Etablissement des lignages cellulaires
dans la masse cellulaire interne par le fonctionnement
différentiel de la voie de signalisation FGF via ERK. EPI =
épiblaste; PrE = endoderme primitif. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580717303854

ERK inhibe l'expression de Nanog en stimulant le recrutement du facteur de transcription ZFP57 sur de la
chromatine contenant H3K9me3. ZFP57 contribue à propager cette marque de chromatine inhibitrice de la
transcription. L'absence de la triméthylation H3K9me3 sur les séquences régulatrices de Nanog aboutit à
un défaut de différenciation de l'endoderme primitif (Dubois et al., 2022).

Conformément à la réduction de l’activité ERK pour établir la pluripotence naïve dans l’épiblaste, PD032 est
un composant essentiel du cocktail pour dériver et maintenir les cellules souches embryonnaires de souris
(Nichols et al., 2009).

Comme chez la souris, la MCI dans le blastocyste humain à 6 jours après la fécondation in vitro (FIV), a
montré une colocalisation GATA6 et NANOG avant l’apparition de la PE et de l’épiblaste au jour 7 de la FIV
(Roode et al., 2012). Cependant, le traitement par un inhibiteur de ERK ou de FGFR ne modifie pas le nombre
de cellules NANOG, OCT4 ou GATA4+, ce qui suggère que la signalisation FGF-ERK n’est pas requise dans
les embryons humains pour la spécification de la deuxième lignée (Roode et al., 2012). Par conséquent, bien
que la séparation de l’ICM en PE et en épiblaste soit similaire chez les deux espèces, leurs voies de
signalisation contrastent. Ces données indiquent que des mécanismes moléculaires et cellulaires
spécifiques induisent l’initiation et le maintien de la pluripotence des épiblastes chez l’homme.

Lors de l'implantation, le blastocyste établit des contacts avec le tissu maternel et finit par s'attacher
à l'endomètre avant d'y pénétrer. L'attachement et l'adhésion à l'endomètre maternel (à E4.75 chez
la souris, au jour 7 post-fécondation chez l'Homme) sont médiés par le trophectoderme. À ce stade
de développement, deux sous-populations du trophectoderme peuvent être distinguées : la région en
contact avec la MCI située au pôle embryonnaire de l'embryon devient le trophectoderme polaire (qui
formera l'ectoderme extra-embryonnaire qui contribue fortement à la formation du placenta) et la région
entourant la cavité du blastocœle localisée au pôle abembryonnaire devient le trophectoderme mural (qui
formera la couche externe du vésicule vitelline pariétale).

128
 ***Figure 3-50. Suivi des populations de cellules du trophectoderme polaire et mural en pré-implantation et durant
l’implantation chez des souris transgéniques Cdx2::GFP. La GFP est sous le contrôle des séquences régulatrices de
Cdx2. Un déplacement de cellules est observé de la région polaire à la région murale de E3,5 à E4,5 et quelques
cellules changent d’identité passant de la région polaire à la région murale. Les identités des cellules se stabilisent
par la suite. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-019-11482-5

Les cellules du trophectoderme mural perdent l’expression de Cdx2 contrairement aux cellules du
trophectoderme polaire. Malgré une potentialité similaire au début du stade blastocyste, ils finissent par se
différencier à cause de l’exposition différentielle à la signalisation inductive émanant de la MCI. Les cellules
du trophectoderme polaire subissent une transition épithélio-mésenchymateuse et prennent un caractère
invasif. Au contact avec l’endomètre utérin maternel, le trophectoderme polaire prolifère et se différencie
en cytotrophoblaste et en syncytiotrophoblaste à cellules multinucléés qui dirigent la pénétration du
blastocyste à l’intérieur de l’endomètre.

*Figure 3-51. Embryon humain lors de l'implantation

(vers le 7ème jour après la fécondation). La lumière de
l'utérus se trouve dans le cadran en haut vers la droite et
l'endomètre utérin en bas vers la gauche. 2 = endoderme
primitif; 3 = syncitiotrophoblaste; 4 = cytotrophoblaste;
5 = épiblaste; 6= blastocoele. Source :
https://embryology.ch/en/embryogenese/implantation/implantation-
stages/intro/

**Figure 3-52. Analyse transcriptomique de cellules uniques d’embryons humains entre 9 et 11 jours après
fécondation (post-implantation/pré-gastrulation). a) Chaque point représente une cellule et les cellules ont été
positionnées dans un espace où plus elles sont rapprochées, plus leur transcriptome est proche. On distingue 4

129
 groupes de cellules (ou clusters) correspondant aux 4 principaux lignages cellulaires présents à ce stade. Notez
l’abondance des cellules trophoblastiques en comparaison avec les cellules embryonnaires. Hypoblaste = endoderme
primitif. b) “Heatmap” de l’expression de certains gènes dans les populations cellulaires mises en évidence en a). Les
gènes ont été rassemblés en “cluster”, c’est-à-dire par groupe selon le profil de leur expression différentielle. Le bleu
indique une expression faible par rapport à la moyenne et le rouge indique une expression forte par rapport à la
moyenne.

Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-23758-w

La différenciation des cellules en syncytiotrophoblaste dépend de l'expression du facteur de transcription

TBX3.
**Figure 3-53. TBX3 est nécessaire pour la
différenciation des cellules trophoblastiques en
syncitiotrophoblastes. Des cellules humaines
trophoblastiques de la lignée JEG-3 sont induites à
donner des cellules du syncitiotrophoblastes par un
traitement augmentant l'AMPc intracellulaire. Des
expériences précédentes ont montré que ce
traitement augmente l'expression de TBX3. Ce
traitement est maintenant réalisé en présence de
shARN contrôle (shNC) ou de shARN inhibant
l'expression de TBX3 (shTBX3-a et shTBX3-b
correspondant au ciblage de séquences différentes
sur l'ARNm de TBX3). Après 48h, les cellules sont
fixées et traitées par immunofluorescence avec un
anticorps reconnaissant hCGβ qui est un marqueur de
syncitiotrophoblastes (rouge). L'ADN est coloré par le
DAPI. Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3000187

Les grossesses extra-utérines surviennent lorsqu'un ovule fécondé s'implante et se développe à l'extérieur
de l'utérus. Dans presque tous les cas, cela se produit dans la trompe de Fallope, entraînant une grossesse
tubaire. Le contrôle du mouvement des embryons dans l'oviducte et vers l'utérus durant le clivage joue donc
un rôle essentiel. Le transit des embryons à travers l'oviducte est dû à l'action combinée de battements des
cils de l'épithélium de l'oviducte dans un sens précis, ses sécrétions régulées et les contractions périodiques
des muscles environnants (Bianchi et al., 2021).

Dans la période précédant l’implantation et pendant l’implantation, l’endomètre utérin est loin d’être passif.
Les glandes utérines nourrissent bien sûr l’embryon et sécrètent également du LIF (pour Leukemia
Inhibitory Factor) qui déclenche dans les cellules du trophectoderme une cascade de signalisation qui est
indispensable à une bonne implantation (Kelleher et al., 2018).
**Figure 3-54. Une production de LIF suffisante
par l’utérus maternel est indispensable pour que
les embryons de souris s’implantent. Cornes
utérines de souris sauvage (control) et de souris
mutantes qui expriment moins de LIF que
d’habitude. Elles ont été fécondées par des mâles
qui apportent un allèle de β-galactosidase dont
l’activité est ensuite révélée par le X-gal (permet
de repérer les embryons implantés 5 jours après
la fécondation). L’injection de LIF dans la mère au
moment critique (de 4 à 5 jours après la
fécondation) permet aux embryons de
s’implanter. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-018-
04848-8

130
C’est durant le clivage qu’a lieu l’inactivation d’un des chromosomes X chez les femelles des
Mammifères. Cette inactivation permet de compenser le fait que les femelles XX ont 2 allèles
par gène du chromosome X alors que les mâles XY n’en ont qu’un seul. C’est de manière
aléatoire dans chaque cellule que l’inactivation concerne le chromosome X d’origine
paternel ou maternel. Les femelles des Mammifères sont donc des mosaïques génétiques en
ce qui concerne les gènes portés par le chromosome X. Le chromosome inactivé forme une
structure d’hétérochromatine dense appelée corps de Barr. Cette condensation est sous le
contrôle d’un long ARN non codant (lncRNA) de 17kb appelé Xist et qui est transcrit
seulement à partir du chromosome X qui sera inactivé. Cet ARN recrute plusieurs facteurs
qui modifient la structure chromatinienne de ce chromosome et le réduisent au silence
(Boeren et Gribnau, 2021).

*Figure 3-55. Influence de l'inactivation au hasard du chromosome X sur le pelage des chats Calico. D'après
https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(16)30186-1

Le cas particulier de la drosophile

Après la fécondation et la fusion des pronucléi mâle et femelle, le noyau zygotique subit 13 cycles de
réplication en l'absence de division cellulaire ce qui génère un embryon unicellulaire avec environ
5000 noyaux (Schmidt et Grosshans, 2018) (voir Figure 1-8). Les 9 premiers cycles de
réplication/mitose se produisent profondément dans le vitellus de l'embryon et sont très rapides, toutes
les 10 minutes. Au cycle nucléaire 10, les noyaux migrent vers la périphérie et commencent à organiser la
formation de structures d'actine corticale qui initient ensuite la formation de sillons de type cytodiérèse qui
aboutissent à la véritable cellularisation de l’embryon. L'embryon est cellularisé au cycle nucléaire 14.
La cellularisation se fait en 10 minutes durant lesquels des vésicules cytoplasmiques fusionnent pour
former la membrane plasmique.

Ce moment donne lieu également à la transition mi-blastuléenne qui voit s’activer la transcription
de nouveaux ARNm (dits zygotiques) et l’élimination des ARNm maternels. Cependant, signalons que
quelques gènes zygotiques sont exprimés à partir du cycle nucléaire 7.

131
 *Figure 3-56. Chronologie des évènements lors su clivage de la drosophile et activation progressive de la
transcription. Source : https://elifesciences.org/articles/03737

L’activation massive de la transcription au cycle nucléaire 14 s’accompagne de modifications importantes

de la chromatine qui est notamment permise par la présence de facteurs dit pionniers tels que le facteur de
transcription d’origine maternel Zelda qui se lie aux nucléosomes et rendent l’ADN plus accessible (Melody
Foo et al., 2014). La perte de Zelda aboutit à une baisse drastique des gènes dont la transcription est activée
lors de la transition mi-blastuléenne.
***Figure 3-57. Le facteur pionnier Zelda (Zld) rend
l'ADN plus accessible au sein de la chromatine.
L'enrichissement de Zld et de Dorsal (Dl, un facteur de
transcription qui sert ici de témoin négatif) en
immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et
l'hypersensibilité à la DNase I sur la région
transgénique ont été normalisés au locus endogène de
l'enhancer étudié. Les points bleus et les points verts
représentent respectivement Zld et Dl. Le changement
de liaison sur la chromatine de Zld entre les lignées est
fortement corrélé avec le changement
d'hypersensibilité à la DNase I (régression linéaire R 2
= 0,98), alors que le changement de liaison de Dl sur la
chromatine n'est pas corrélé (R2 = 0,02). Source :
https://elifesciences.org/articles/13222

La transition mi-blastuléenne est aussi permise par la levée de l’inhibition apportée par des protéines
comme Tramtrack, Supressor of Hairless (Su[H]) et Runt.

La dégradation des ARNm d’origine maternelle est sous la dépendance de Pumilio, BRAt et Smaug mais
aussi du cluster de microARN miR-309 qui contient 8 microARN et qui est responsable de la dégradation
d’environ 400 ARNm maternels différents ! (Bushati et al., 2008). L'expression de ces microARN est sous la
dépendance de Smaug (Benoit et al., 2009).

Le clivage chez C. elegans

Le premier clivage donne naissance à une grande cellule somatique, le blastomère AB, qui donne naissance
à la majeure partie de l’hypoderme et du système nerveux et à une plus petite cellule P1, qui, en plus de
donner la lignée germinale et les gonades produit également l’intestin et la plupart des muscles de l’animal
(voir Figure 1-17).

132
 **Figure 3-58. La première division cellulaire chez Caenorhabditis elegans. La première mitose est précédée d’un
pseudo-clivage pendant lequel il y a des flux de cytoplasme mettant en place la polarité de l’embryon et une
constriction au niveau du futur plan de clivage. A la fin de la mitose, la cytodiérèse produit une grosse cellule AB (à
gauche) et une petite cellule P (à droite). Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26177-z

**Figure 3-59. Microtubules lors de la première division cellulaire chez

Caenorhabditis elegans. Immunofluorescence avec l’ADN coloré au DAPI (bleu),
l’alpha-tubuline est en vert et la gamma-tubuline (marqueur de centriole) est
en rouge. Notez que les deux centrioles sont localisés près d’un seul noyau à
droite sur la première image. Ce sera le côté postérieur, celui où se trouvera la
cellule P.

Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1006370

P1 subit trois divisions asymétriques successives, générant à chaque fois un blastomère somatique (EMS, C
et D) et un blastomère germinal (P2, P3 et P4).

**Figure 3-60. Passage du stade 2 à 4 cellules chez Caenorhabditis elegans. Sur la première image, la cellule AB est à
gauche, la cellule P1, plus grosse, est à droite. Remarquez que c’est la cellule P1 qui se divise en premier. La
chromatine est marquée par une histone couplée à la GFP (vert) et la membrane plasmique est marquée par PH2
couplée à la Cherry (rouge). Barre d’échelle : 10 μm. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-020-19863-
x

Les blastomères germinaux diffèrent de leurs sœurs somatiques par leur petite taille, leur progression plus
lente dans le cycle cellulaire et leur répression de la transcription. Au stade ∼100 cellules, P4 se divise
symétriquement pour générer Z2 et Z3 qui prolifèrent tout au long du développement larvaire et donnent
naissance aux spermatozoïdes et aux ovocytes de la lignée germinale adulte.

La structuration initiale de l’embryon de C. elegans est contrôlée par une collection d’ARNm et de protéines
codés par la mère qui contrôlent la taille, la position et l’identité des premiers blastomères.

Les sept protéines PAR orchestrent les divisions asymétriques dans l'embryon précoce de C. elegans. Les
embryons mutants par ne parviennent pas à diviser les déterminants somatiques et germinaux au cours des
133
premières divisions. Les protéines PAR contrôlent également le positionnement asymétrique du fuseau
mitotique qui se traduit par des blastomères plus gros et plus petits. Après leur identification initiale en tant
que mutations létales embryonnaires à effet maternel chez C. elegans, il a été démontré que les PAR
contrôlent la polarisation d'une grande variété de types de cellules animales qui réalisent une division
asymétrique.

Deux sous-ensembles de protéines PAR se concentrent dans des domaines corticaux antérieurs et
postérieurs distincts dans le zygote polarisé de C. elegans. Le cortex antérieur est occupé par les protéines
PAR-3 et PAR-6 et la kinase PKC-3 (aPKC chez les mammifères), qui sont collectivement appelées les PAR
antérieures. Le domaine cortical postérieur opposé est occupé par la kinase PAR-1 et la protéine PAR-2
(spécifique aux nématodes), appelées PAR postérieures. Deux protéines PAR supplémentaires, la kinase
PAR-4 et la protéine PAR-5, sont localisées symétriquement dans le cytoplasme et au niveau du cortex
cellulaire.
**Figure 3-61. Interactions de PAR-3 avec ses
partenaires du complexe PAR antérieur. aPKC est le nom
donné chez les Mammifères à la kinase PKC-3. Le site
qu'elle phosphoryle sur Par-3 (domaine APM) est
indiqué. Les autres domaines des protéines sont aussi
indiqués. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-
9258(22)00665-2/fulltext

Les protéines PAR antérieures et postérieures s’associent au cortex cellulaire via une combinaison
d’interactions protéine/protéine et une association directe avec des phospholipides. Les expériences de
suivi de FRAP avec des protéines fusion GFP::PAR-2 et GFP::PAR-6 démontrent que les protéines PAR sont
très dynamiques au niveau du cortex cellulaire, diffusant latéralement le long du cortex et s’échangeant
entre le cortex et le cytoplasme.

PKC-3 phosphoryle PAR-1 et PAR-2, les obligeant à se dissocier du cortex et empêchant ainsi leur invasion
dans le domaine PAR antérieur. De même, PAR-1 et PAR-2 empêchent les PAR antérieurs d’envahir le
domaine postérieur du cortex, en partie par la phosphorylation de PAR-1 et de PAR-3 qui provoque leur
dissociation du cortex. La réduction de l’activité de l’un ou l’autre des complexes PAR conduit à la croissance
du domaine PAR opposé, ce qui indique que l’équilibre entre les activités PAR antérieures et postérieures
aident à positionner leur interface au milieu de l’axe antéro-postérieur.
**Figure 3-62. Antagonisme entre PAR-2 et PAR-6. Des
zygotes transgéniques de C. elegans exprimant des
protéines fusions mCherry::PAR-6 (rouge) et GFP::PAR-
2 sont soumis (à droite) ou non (à gauche) à un
traitement avec un ARN interférent anti-PAR-6. La
région postérieure est à droite. On voit que PAR-2
envahit la région antérieure si l’expression de PAR-6 est
diminuée. L’immunofluorescence pour PAR-1 montre
que lorsque l’expression de PAR-6 est diminuée, il est
mal localisé (plutôt dans la région antérieure alors qu’il
est habituellement dans la région postérieure). Source :
https://www.cell.com/cell-reports/pdf/S2211-1247(21)00702-6.pdf

Avant la polarisation, les protéines PAR sont distribuées symétriquement le long de l’axe antéro-postérieur
avec les protéines PAR antérieures enrichies au niveau du cortex cellulaire et les PAR postérieures dans le
cytoplasme. La rupture de la symétrie provient de la fécondation. Le centrosome du spermatozoïde, qui est
associé au pronucléus mâle à l’extrémité postérieure du zygote, déclenche deux voies de ruptures de

134
symétrie qui établissent la polarité PAR corticale. Dans la première voie, le centrosome initie le flux d’un
réseau d’actomyosine cortical vers l’antérieur qui repousse PAR-6 (et vraisemblablement PAR-3 et PKC-3)
de l’arrière vers le cortex antérieur, permettant ainsi à PAR-2 et PAR-1 de se concentrer dans le cortex
postérieur. Le centrosome initie également une voie de rupture de symétrie, dépendante de PAR-2, qui peut
établir la polarité en absence d’actine et de myosine. PAR-2 se lie aux microtubules émanant du centrosome,
le protégeant de la phosphorylation par PKC-3. Cette protection permet à PAR-2 de se concentrer sur une
petite région du cortex près du centrosome malgré la présence de PKC-3. Le PAR-2 cortical recrute son
partenaire de liaison PAR-1 à partir du cytoplasme et, ensemble, PAR-2 et PAR-1 sont capables de
provoquer la dissociation des PAR antérieurs du cortex via la phosphorylation de PAR-3. L’élimination des
PAR antérieurs permet à plus de PAR-1 et PAR-2 d’atteindre le cortex, initiant ainsi une boucle de
rétroaction positive qui entraîne l’expansion du domaine PAR postérieur et la contraction du domaine PAR
antérieur.

Signalons que les protéines PAR jouent un rôle général dans la polarisation des épithéliums. Leur
première intervention survient lors de la compaction chez la souris, entre le deuxième et le troisième
jour après la fécondation, au stade de 8 cellules. Les protéines Par y définissent des domaines apical
et basolatéral définis. Le domaine apical s’enrichit du complexe Par3-Par6-aPKC, tandis que le
domaine basolatéral s’enrichit de protéines d’adhésion cellulaire (Plusa et al., 2005).

Compétition cellulaire
Au cours des divisions, il y a une compétition cellulaire. C’est un phénomène par lequel les cellules d’une
population “surpassent” les cellules moins aptes dans le même groupe. On pense qu’il est bénéfique pour
les organismes multicellulaires d’assurer le maintien à long terme de populations de cellules saines. Chez la
drosophile et la souris, il a été démontré que les cellules exprimant des niveaux plus élevés de Myc, connus
pour activer l’anabolisme cellulaire, surpassent les cellules avec des niveaux de Myc inférieurs. Ces
expériences ont montré que ce n’est pas le niveau absolu d’expression de Myc qui compte pour le sort d’une
cellule mais le fait qu’elle exprime un niveau de Myc plus élevé que sa voisine. Dans le cas des embryons de
souris, les cellules qui perdent la compétition finissent par mourir par apoptose. Les restes de ces cellules
sont phagocytés par la cellule voisine «plus en forme» qui a une expression de Myc plus élevée (Claveria et
al., 2013; Sancho et al., 2013). Ce mécanisme d’élimination des cellules les moins aptes est un phénomène
naturel sélectionnant les cellules les plus aptes pour contribuer au pool de progéniteurs pluripotents qui
formeront les trois feuillets embryonnaires de l’embryon de souris.

Ces mécanismes sont aussi présents dans les tumeurs et également dans les cultures de cellules
embryonnaires souches (ES). Il existe une expression hétérogène de Myc dans des cellules ES de souris en
culture. Ce déséquilibre Myc entraîne une compétition cellulaire et nécessite un contact cellulaire direct
entre le vainqueur et la cellule éliminée. Des mécanismes biomécaniques via le cytosquelette d'actine ont
été observés et le co-facteur de transcription YAP en aval se retrouve phosphorylé puis dégradé dans les
cellules qui seront éliminées. En revanche, YAP entre dans le noyau et régule la transcription dans les
cellules qui survivent (Price et al., 2021).

LA CARTE MENTALE

135
EN DIRECT DES LABOS

Vidéo sur le travail de l’équipe de Jean-Léon Maître, Institut Curie (Paris), qui étudie le développement
précoce de la souris : https://youtu.be/yTiYLQfJyNQ

136
La gastrulation

*Figure 3-63. Modélisation de la gastrulation des Amphibiens et des Téléostéens avec de la pâte à modeler et une
balle de golf (pour mimer le vitellus qui n’est pas cellularisé chez les Téléostéens). Source : Twitter @Artingerlab

a gastrulation est une étape critique dans le développement de tous les animaux, car c’est

L
l’étape où les trois feuillets (ectoderme, mésoderme et endoderme) prennent leur position
définitive dans l’embryon. Les cellules prolifèrent et surtout migrent abondamment pendant
cette étape. Il y a aussi des migrations cellulaires à des étapes ultérieures du développement,
mais ici, il s’agit de mouvements généralisés à l’échelle de l’embryon alors que plus tard, ce ne seront
que des mouvements localisés.

La gastrulation veut dire littéralement “mise en place du gaster”, c’est-à-dire mise en place de l’intestin
primitif. C’est une des principales résultantes de cette phase de développement, mais c’est une vision trop
restreinte, car non seulement l’endoderme qui forme l’intestin est concerné mais aussi les deux autres
feuillets.

La gastrulation chez les Amphibiens

La gastrulation a été très étudiée chez les Amphibiens, car ce sont les organismes où elle est
particulièrement accessible et bien visible. Les mouvements de la gastrulation ont pu être mis en
évidence par Vogt par la technique des marques colorées en 1929 où il y a utilisation de colorants
vitaux (rouge neutre, bleu de Nil) pour marquer un groupe de cellules et suivre leur migration. (voir
Figure 1-26).

137
*Figure 3-64. Suivi du devenir des marques colorées au cours de la gastrulation d'un Amphibien. Expérience réalisée
par Vogt en 1929. On observe que les marques colorées déposées sur l'endoderme et le mésoderme (respectivement
verte et rouge) pénètrent dans l'embryon en passant par une invagination appelée blastopore tandis que la marque
colorée sur l'ectoderme (bleu).

*Figure 3-65. Mouvements des tissus au cours de la gastrulation de Xenopus laevis.

Ligne du haut : Carte des territoires et déformation des tissus des feuillets embryonnaires de X. laevis pour les stades
10 à 13. Les mouvements de l’ectoderme (blanc), du mésoderme (bleu) et de l’endoderme (jaune) sont indiqués. Le
plancher du blastocœle est indiqué par une ligne rouge. Ligne médiane : Gastrulas en coupes sagittales aux stades 10
à 13. Le pôle animal est en haut, le pôle végétatif en bas, le côté ventral à gauche et le côté dorsal à droite. Ligne du
bas : les gastrulas aux stades précoce, intermédiaire et avancé sont indiqués avec le stade de développement (stades
définis par Nieuwkoop et Faber (1994)) et la chronologie correspondante. Le début de la gastrulation est fixé à 0:00
en heures et minutes. Le blastocœle (bc) et l’archentéron (arc) sont indiqués. Source :
https://elifesciences.org/articles/27190

138
Durant la gastrulation, la cavité de la blastula, le blastocœle, est envahie par des cellules. On observe
qu'une invagination, le blastopore, se creuse et finit par former une cavité, l'archentéron, qui
constituera la lumière du tube digestif. L’archentéron se développe au détriment du blastocœle qui
est écrasé. Le mésoderme entre par la lèvre dorsale du blastopore et entraîne l’endoderme à
l’intérieur. Une partie de l’endoderme forme le bouchon vitellin dans le blastopore. L’ectoderme qui
recouvrait juste une partie de la surface de l’embryon, recouvre tout l’ensemble après la
gastrulation.

*Figure 3-66. Comparaison d’une coupe transversale d’un embryon de xénope avant et après la gastrulation.

Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/xenope1/gastrulation/Gastrula.html

Regardez cette vidéo de la gastrulation (suivie de la neurulation) vue du pôle végétatif :

https://youtu.be/qisrNX3QjUg
Commentaires de la vidéo : 1 ou 2 s : début de la formation du blastopore en forme d’anse de panier. 3 s : Après le petit
saut d’image, le blastopore devient circulaire. 4 -> 5 s : notez en haut les cellules pigmentées qui se déplacent et rentrent
à l’intérieur de l’embryon par le blastopore. 8 s : stade bouchon vitellin : le blastopore apparait comme bouché par les
macromères de l’endoderme. 9 -> 12 s : les mouvements de convergence-extension commencent à allonger l’embryon
selon l’axe antéro-postérieur et le blastopore est repoussé dans la région postérieure (où il donnera l’anus). On est
maintenant en vue dorsale. Après, enchainement avec la neurulation.

Les mouvements de la gastrulation chez les Amphibiens peuvent être caractérisés en plusieurs
composantes :

• L’épibolie est le mouvement de recouvrement de l’ensemble de la surface de l’embryon par

l’ectoderme (alors qu’avant la gastrulation, l’ectoderme ne recouvre que l’hémisphère animal, le
reste de la surface étant de l’endoderme). Deux processus interviennent dans cette augmentation
de surface : la prolifération cellulaire et aussi l’intercalation radiaire : initialement l’ectoderme est
constitué de 3 couches de cellules. Au cours de la gastrulation, les cellules des 2 couches profondes
s’intercalent les unes avec les autres ce qui finit par ne faire qu’une couche profonde : cela crée
mécaniquement plus de surface d’ectoderme (analogie de la pâte à modeler moins épaisse mais
plus étendue).

139
 **Figure 3-67. Intercalation radiaire dans l'ectoderme (ou toit
du blastocœle) autour du pôle animal (PA). L'ectoderme est
constitué initialement de 3 couches (de l'extérieur vers
l'intérieur : gris, rouge, vert foncé). Les cellules des deux
couches les plus internes finissent par ne former qu'une seule
couche. La matrice extracellulaire (MEC) du toit du blastocœle
est représentée en vert clair. Source :
https://ressources.unisciel.fr/biodudev/co/grain_6_3_2.html

• L’encoche blastoporale se forme par l’invagination de cellules en bouteille. Ces cellules ont un “cou”
sous-apical mince et le reste du cytoplasme forme un bulbe basal. Ce sont des cellules de
l’endoderme pharyngien qui se déforment ainsi grâce à l’action de leur cytosquelette : la
constriction apicale est due aux microfilaments d’actine et l’élongation est due aux microtubules.

Si on isole les cellules de l'endoderme pharyngien, la constriction apicale a lieu alors que l'élongation ne se
fait pas, ce qui indique que l'élongation dépend de l'interaction avec les cellules adjacentes (Hardin et Keller,
1988).

La constriction apicale s’accompagne aussi d’endocytose qui a probablement pour rôle de diminuer la
surface membranaire du côté de la constriction (Lee et Harland, 2010) (voir Figure 3-51).

Avec un délai de 2h, les cellules en bouteille apparaissent aussi latéralement et ventralement, complétant
une zone de constriction apicale circulaire : le blastopore prend la forme d’un anneau après avoir eu une
forme d’anse de panier.

Ces cellules servent de butée lors de l’initiation de la gastrulation pour les cellules mésodermiques qui
remontent ainsi vers l’hémisphère animal (involution – voir juste après).

140
 ***Figure 3-68. Mise en évidence de l’endocytose dans la région apicale des cellules en bouteille par la présence de
vésicules biotinylées.

(A) Vue du pôle végétatif (gauche), coupe sagittale médiane (centre) et grossissement supérieur de la coupe sagittale médiane (à
droite) des embryons de stade 10 marqués avec NHS-LC-sulfo biotine (reconnu par un anticorps couplé à la streptavidine) et avec
un anticorps anti-DM1α (tubuline). La flèche indique les cellules en bouteille. La barre d’échelle représente 25 µm. (B) Sections
confocales sagittales médianes d’embryons colorées avec un anticorps anti-EEA1 (un marqueur d’endosome précoce, vert) et la
biotine est repérée en rouge. On constate que la biotine d’origine externe est colocalisée avec le marqueur d’endosome précoce,
mettant en évidence une endocytose. (C) Sections confocales sagittales médianes d’embryons injectés d’ARNm de Rab5 couplé à la
eGFP (Rab5 est présent dans les endosomes précoces) puis fixées et colorées avec de l’anticorps anti-GFP. Les flèches dans (B) et
(C) indiquent la colocalisation de la biotine avec des marqueurs d’endosomes précoces. (D) Sections confocales sagittales médianes
d’embryons après marquage pulse-chasse avec de la biotine (incubation avec de la biotine limitée dans le temps puis incubation
sans biotine). Les embryons ont été fixés aux moments indiqués et colorés avec de l’anti-DM1α (tubuline) et de la streptavidine
(qui se lie à la biotine). Les flèches indiquent les endosomes qui semblent être sur ou près de la membrane basolatérale. Dans toutes
les coupes sagittales médianes, les images sont orientées le côté végétatif vers le bas à gauche ; les barres d’échelle pour (B)–(D)
représentent 50 µm. Source : https://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(09)02143-5

• L’involution est le mouvement du mésoderme qui passe par la lèvre dorsale du blastopore et qui fait
une rotation de presque 180° pour remonter par l’intérieur le long des couches superficielles de
l’hémisphère animal.

141
 *Figure 3-69. Mouvements de la gastrulation autour de la lèvre dorsale du blastopore. Source :
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/xenope1/gastrulation/Gastrula.html

• Les cellules en tête de la lame de cellules mésodermiques qui pénètrent dans l’embryon
migrent activement le long de la matrice extra-cellulaire riche en fibronectine qui
recouvre l’intérieur du toit du blastocœle.
*Figure 3-70. Migration du mésoderme le long de la
matrice extracellulaire du toit du blastocœle. Ici la coiffe
animale (AC) comprenant le toit du blastocœle est
disséquée avec la zone marginale dorsale (DMZ) et
ventrale (VMZ) contenant des cellules mésodermiques
(Me). Les cellules de la DMZ migrent sur le toit du
blastocœle où se trouve de la matrice extracellulaire
riche en fibronectine (ECM). Les cellules
mésodermiques expriment des intégrines qui
interagissent avec l'ECM, ce qui leur permet de migrer.
Notez que les cellules de l'AC expriment aussi des
intégrines mais ne migrent pas. Source :
https://tinyurl.com/3wvd5mn3

Si on retourne le toit du blastocœle (de telle manière à ce qu’il n’y ait plus de fibronectine du
bon côté), ou si on empêche les interactions fibronectine-intégrine par des peptides RGD qui
servent de « leurres » aux intégrines, les mouvements de migration sont inhibés, ce qui donne
des embryons déformés. L’épibolie n’étant pas perturbé dans ce cas, la surface de l’embryon se
plisse.

L’endoderme a longtemps été considéré comme passif lors de la gastrulation des amphibiens mais des
méthodes d’imagerie plus fines ont permis de mettre en évidence des mouvements actifs de ses cellules
(voir cette vidéo : https://doi.org/10.7554/eLife.27190.014)

• La convergence-extension est le mouvement qui permet l’allongement de l’embryon selon

l’axe antéro-postérieur à la fin de la gastrulation et lors de la neurulation. Le tissu qui
s'allonge devient en même temps plus étroit d'où le terme de convergence associé à l'extension.
Des cellules de la corde (mais aussi du neurectoderme qui va former le tube neural) deviennent
polarisées, convergent de la droite ou de la gauche vers le plan médian (ou plan de symétrie

142
 bilatérale) et s’intercalent ce qui a pour effet de créer une force qui allonge l’embryon le long de
l’axe antéro-postérieur.
*Figure 3-71. Mise en évidence des mouvements de
convergence-extension. Des groupes de cellules du
mésoderme chordal sont spécifiquement marquées. On
les suit entre les étapes précoces et les étapes tardives de
la gastrulation. Pour la vue "en face" les couches
cellulaires superficielles (ectoderme) ont été enlevées.
Source :
https://journals.biologists.com/jcs/article/134/14/jcs254011/270966/Twinfilin1-
controls-lamellipodial-protrusive

Des explants dits sandwich, adapté de Schechtman (1942), montrent que le mésoderme chordal/somitique
présomptif et que le tube neural postérieur présomptif peuvent avoir un mouvement de convergence-
extension alors qu’ils ne sont pas attachés à un substrat et sont indépendants d’autres processus
générateurs de force dans l’embryon (Keller et Danilchik, 1988). Les mouvements de convergence-
extension proviennent donc de déterminants intrinsèques à la population de cellules concernée.

Chez le xénope mais aussi chez le poisson-zèbre, l'allongement de l'embryon le long de l'axe antéro-
postérieur ne provient pas seulement des mouvements de convergence-extension mais aussi, un peu
plus tard alors que la corde s'est formée, d'une vacuolisation de ses cellules, notamment celles qui se
trouvent dans sa partie antérieure (McLaren et al., 2021). Des glycosaminoglycanes sont sécrétés dans
les vacuoles ce qui favorise l'absorption osmotique d'eau et l'augmentation de leur taille.

**Figure 3-72. Vacuolisation des cellules de la corde chez le Poisson-zèbre qui participe à l'allongement de l'axe
antéro-postérieur. La vacuolisation progresse de la partie antérieure (plus foncée) à la partie postérieure (plus
claire) de la corde et les progéniteurs exprimant noto (jaune) ajoutent des cellules à la partie postérieure de la corde.
Les images sont issues de coupes sagittales. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/148/18/dev199459/270977/Anterior-
expansion-and-posterior-addition-to-the

Le blastopore, en train de se refermer est rempli par un bouchon vitellin formé par des macromères
végétatifs riches en vitellus. Il est repoussé vers l’arrière et donne l’anus (nous sommes chez un
Deutérostomien).

143
 **Figure 3-73. Fermeture du blastopore au stade
bouchon vitellin. A : vue postérieure, B : coupe
longitudinale. Les cellules en bouteille sont en vert.

Source : https://elifesciences.org/articles/26944

La gastrulation chez les Amniotes

L'embryon de poulet est un organisme modèle pratique pour l'étude de la gastrulation chez les
amniotes, car il est plat, transparent et se développe à l'extérieur de la mère (contrairement à
l'embryon de souris qui est incurvé "en hamac" et implanté dans l'utérus maternel). Les
mouvements cellulaires pendant la gastrulation sont cependant similaires chez les oiseaux et les
mammifères.

Au moment de la ponte, c’est-à-dire à la fin du clivage, l’embryon de poulet est constitué d’environ 20 000 à
30 000 cellules. Un sous-ensemble de ces cellules forme un disque quasi-épithélial épais d’une seule couche,
l’épiblaste, d’un diamètre de 3 mm. À la périphérie de l’embryon, l’épiblaste repose sur une couche rigide
de plusieurs cellules épaisses de grandes cellules mésenchymateuses, qui entrent directement en contact
avec le vitellus sous-jacent. Cette portion externe est connue sous le nom d’Area Opaca (AO) et ne donnera
que des tissus extra-embryonnaires. La partie centrale est l’Area Pellucida (AP) et l’ensemble de l’embryon
stricto sensu provient de cette partie. La couronne de tissu séparant l’AO et l’AP s’appelle la zone marginale
(MZ).

*Figure 3-74. Embryon de poulet au cours de la gastrulation (vue dorsale). L'axe antéro-postérieur est vertical avec
le côté antérieur vers le haut. D'après https://doi.org/10.1016/bs.ctdb.2019.10.001

Dans l’AP, des amas de quelques petites cellules arrondies s’attachent à la face ventrale (inférieure) de
l’épiblaste, formant l’hypoblaste primaire. L’hypoblaste primaire s’aplatit pour former une couche
épithéliale de grandes cellules minces, l’hypoblaste. L’hypoblaste tout comme l’AO ne forme que des
structures extra-embryonnaires.

Une bande de cellules épithéliales à la limite latérale postérieure entre l’AO et l’AP (la zone marginale
postérieure ou PMZ) prend une forme allongée, formant le croissant de Koller en s’épaississant. C’est l’étape
de pré-gastrulation qui rend visible la perte de la symétrie circulaire qui était jusqu’alors celle de la
morphologie de l’embryon. Les signaux inductifs dans la zone marginale sont constitués par cVg1, un ligand
de la famille de TGFβ, dans la PMZ et un gradient de Wnt8c dans l'AO (plus exprimé dans la région
postérieure). Ils induisent une expression de Nodal dans l’épiblaste recouvrant le croissant de Koller et les
cellules qui sont spécifiées en mésendoderme (les cellules mésodermiques ne sont pas clairement séparées
des cellules endodermiques à ce stade).

144
 **Figure 3-75. Analyse de l’expression de cVg1 par hybridation in situ juste avant et durant la gastrulation sur coupes d’embryons
de poulet avec une sonde marquée radioactivement (vieille méthode : on utilise maintenant des sondes marquées biochimiquement
ou fluorescentes). Les chiffres romains désignent les stades précédant la formation de la ligne primitive. (a) Diagrammes
d’embryons de poulet aux stades présentés en (b-g) montrant la position approximative et les plans de coupe. La future région
postérieure est en bas. On y reconnait le croissant de Koller aux stades X-XII. (b) Coupe longitudinale à travers un embryon de stade
XI. (c) Coupe similaire à travers un embryon de stade XII : notez une forte expression de cVg1 dans l’épiblaste postérieur, ainsi
qu’une expression dans les cellules superficielles et profondes de l’area opaca de la zone postérieure, et des niveaux inférieurs dans
l’hypoblaste qui émerge. (d) Coupe transversale un peu oblique à l’extrémité postérieure d’un embryon de stade X-XI : notez les
niveaux élevés d’expression dans les cellules de la zone postérieure de l’area opaca et dans les cellules vitellines profondes
postérieures, qui dans ce spécimen, se sont séparées de l’épiblaste. (e) Coupe, adjacente à celle montrée en (d), hybridée avec une
sonde de contrôle sens (contrôle négatif). (f) Coupe oblique frôlant la ligne primitive nouvellement formée d’un embryon de stade
HH 2+ : des niveaux élevés d’expression sont présents dans l’ectoderme à proximité de la ligne primitive et dans le mésoderme qui
émerge. (g) Coupe oblique juste en arrière de la région du nœud de Hensen d’un embryon de stade HH 6, montrant une forte baisse
de l’expression dans l’ectoderme avec les niveaux d’expression les plus élevés dans le mésoderme paraxial antérieur. Barre
d’échelle = 0,2 mm. Abréviations : ao, area opaca ; e, épiblaste ; ce, ectoderme ; gw, paroi germinale ; h, hypoblaste ; Ks, croissant de
Koller ; m, mésoderme ; n, nœud de Hensen ; np, plaque neurale ; pm, mésoderme paraxial. Source : https://www.cell.com/current-
biology/fulltext/S0960-9822(96)00752-X

L'expression dans la PMZ de cVg1 est activée par le facteur de transcription Pitx2 (Torlopp et al., 2014). Une
autre manifestation de l’axe antéro-postérieur est l’expression de Gata2 qui est exprimé dans l’épiblaste de
l’AO selon un gradient antéro-postérieur (expression plus forte dans la région antérieure). La fonction de
Gata2 dans la région antérieure est d'empêcher à cet endroit la succession d'évènements qui ont lieu dans
la région postérieure ce qui permet d'éviter la formation de deux axes (Bertocchini et Stern, 2012).
L'expression de Gata2 est activée par BMP4 qui est exprimé exclusivement antérieurement.

145
 **Figure 3-76. Induction de la ligne primitive chez l'embryon de poulet

Dans la région postérieure, la ligne primitive qui caractérise l’étape suivante du développement ne se forme
pas immédiatement car l’action de Nodal est restreinte par l’hypoblaste sous-jacent qui secrète
l’antagoniste Cerberus (Voiculescu et al., 2014). Cette sécrétion finit par se tarir.

La gastrulation stricto sensu commence par la formation de la ligne primitive, alors que le
mésendoderme de la région du croissant de Koller à l’interface entre l’AO et l’AP se déplace dans la région
médiane postérieure de l’embryon. Cet événement a lieu 10h après la ponte (stade Hamburger et Hamilton
HH2) et est entièrement dépendant de la bonne formation préalable du croissant de Koller que nous avons
vu aux paragraphes précédents.

Lorsque des cellules COS de mammifères transfectées avec un vecteur d’expression de cVg1 sont greffées
sur la MZ dans la future région antérieure de l’embryon (donc du côté opposé à l’expression habituelle de
cVg1), une ligne primitive ectopique se développe dans plus de 50 % des cas montrant le rôle inductif de
cVg1 dans la formation de la ligne primitive (Seleiro et al., 1996).

**Figure 3-77. L’expression ectopique de cVg1 induit la formation d’une autre ligne primitive (ps) (à gauche. A droite,
c’est la ligne primitive normale). Barre d’échelle = 100 µm. Source : https://www.cell.com/current-
biology/fulltext/S0960-9822(96)00752-X

Lorsqu’on réitère la même expérience aux stades HH 2 ou 4, alors que la ligne primitive s’est déjà formée,
rien ne se passe montrant que la compétence des tissus s’est éteinte (Shah et al., 1997).

La ligne primitive s’allonge vers l’avant jusqu’à son extension maximale 18 heures après la ponte
(stade HH4), atteignant les deux-tiers du diamètre de l’AP. Son extrémité antérieure s’épaissit et
forme le nœud de Hensen, l’homologue de la lèvre dorsale du blastopore, c’est-à-dire l’organisateur
de Spemann. Chez les Amniotes, le nœud de Hensen est non seulement impliqué dans l’induction
neurale mais aussi dans la mise en place de l’axe droite-gauche.

Pour voir une vidéo de la formation et de l’allongement de la ligne primitive, suivre ce lien :
https://doi.org/10.7554/eLife.01817.006

146
 *Figure 3-78. Schémas illustrant la gastrulation de la poule.

La ligne supérieure de schémas montre les embryons aux stades XI-XIV (avant la ligne primitive), HH2 (ligne primitive précoce),
HH3 (ligne primitive moyenne) et HH3+ (ligne primitive moyenne à tardive), vus du côté dorsal (épiblaste). Les flèches désignent
les principaux mouvements morphogénétiques (dits «à la Polonaise ») se produisant dans le plan de l’épiblaste. Après le stade 4
(fin de la gastrulation), la convergence des cellules et leur entrée par la partie antérieure de la ligne primitive ralentit ou cesse (et
ces mouvements continuent à travers les parties médiane et postérieure de la ligne primitive). L’épiblaste antérieur à la ligne
primitive (future plaque neurale) s’allonge (Sheng et al., 2003). Plus tard, la ligne primitive commence à régresser, allongeant
davantage la plaque neurale postérieurement (Spratt, 1947). La ligne inférieure de schémas montre une vue éclatée des embryons
à chacun des stades ci-dessus, avec la rangée supérieure de schémas représentant la couche supérieure (épiblaste en nuances de
jaune), la rangée inférieure montrant la couche inférieure (nuances de bleu/vert : hypoblaste en vert foncé, endoblaste en vert clair,
endoderme définitif ou intestinal en bleu) et la rangée centrale montrant la couche médiane (mésodermique) (ligne primitive, en
rouge). Au sein de l’épiblaste, la région centrale (jaune) est l’area pellucida et la région externe (moutarde) est l’area opaca extra-
embryonnaire. Source : https://elifesciences.org/articles/01817

Pour former cette ligne primitive, d’importants flux tourbillonnaires de cellules se déroulent dans
l’épiblaste. Ces tourbillons tournent dans des directions opposées, à partir de la ligne médiane dans la partie
antérieure et vers la ligne médiane dans la partie postérieure. Dans la partie postérieure de l’épiblaste, là
où les flux cellulaires se rencontrent, les cellules s’empilent les unes sur les autres et l’épiblaste devient
épais de plusieurs diamètres cellulaires, formant la structure visible sous la forme de la ligne primitive.

La ligne primitive s’allonge vers l’avant par des mouvements de convergence extension que vous pouvez
observer sur ce lien : https://doi.org/10.7554/eLife.01817.011 et également celui-ci :
https://youtu.be/SncF8B2Ue5s

Une fois que la ligne primitive s’est étendue à travers l’épiblaste, les cellules plus profondes de la
ligne primitive commencent à s’éloigner radialement de l’axe sagittal car elles sont remplacées par
des cellules de l’épiblaste qui pénètrent dans la ligne primitive après avoir subi une transition
épithélio-mésenchymateuse.

147
*Figure 3-79. Transitions épithélio-mésenchymateuses dans la ligne primitive (ps) chez l’embryon de poulet.

(A–E) Images montrant l’épiblaste uniforme 6 heures (A, stade EG&K XII) et juste avant la formation de la ligne primitive (B, stade
EG&K XIV), la première apparition de la ligne primitive (C, stade HH2), l’accumulation de mésoderme sous la ligne primitive (D,
stade HH3), apparition d’un sillon dans la ligne primitive et l’émigration du mésoderme (E, stade HH3+). (F-K) Microscopie
électronique à balayage d’embryons fracturés avant (F-H) et après (I-K) formation de la ligne primitive. Les flèches blanches
indiquent une EMT possible avant la formation de la ligne primitive. (L–P) Microscopie électronique à balayage de ligne primitive
fracturée, montrant des cellules en EMT avec divers degrés de constriction apicale et d’expansion basolatérale (classées comme «
stades d’entrée 1 à 5 »). (Q) Cet embryon a été cultivé pendant 1 heure après électroporation d’un morpholino fluorescent témoin
dans tout l’épiblaste au stade XI, puis sectionné sagittalement et visualisé sous une longueur d’onde adéquate. Les cellules marquées
dans l’épiblaste présentent des morphologies similaires à celles des images de microscopie électronique (panneaux L-P, « stades
d’entrée 1 à 5 »). (R) Cet embryon a été cultivé pendant 4 heures après électroporation d’un morpholino fluorescent témoin dans
tout l’épiblaste au stade XI, puis fixé (au stade XII), sectionné sagittalement et coloré avec un anticorps anti-fluorescéine (marron).
La coupe montre plusieurs cellules qui ont quitté l’épiblaste et se trouvent maintenant dans l’espace sous-jacent dans toute
l’étendue antéro-postérieure de l’embryon (flèches). Source : https://elifesciences.org/articles/01817

148
Les cellules de l’épiblaste latéral commencent à se déplacer médialement vers la ligne primitive
pour remplacer les cellules que la ligne perd par pénétration. Les premières cellules à pénétrer
forment l’endoblaste ou endoderme définitif, qui remplace l’hypoblaste. Entrent ensuite les cellules
du mésoderme.

Sur la vidéo suivante, on voit bien les mouvements des cellules de l’épiblaste. La ligne primitive se situe en
bas à gauche : https://youtu.be/1w51_M7SJqs

La ligne primitive régresse au cours de la dernière phase de la gastrulation lorsque le nœud de

Hensen se déplace vers l’arrière. La ligne primitive se raccourcit jusqu’à ce qu’elle disparaisse
finalement dans les stades où a lieu la formation des premiers somites. Plus en avant, la neurulation
et la formation du tube neural a déjà commencé. Il y a une désynchronisation des phases de
développement chez les Amniotes avec l’avant qui est plus mature que l’arrière. Ce n’est pas le cas
chez les Amphibiens.

La gastrulation des Amniotes est complexe et il ne faut pas tomber dans des dichotomies caricaturales. Par
exemple, les cellules mésodermiques qui pénètrent sont essentiellement mésenchymateuses et se
déplacent en tant qu’individus, mais elles le font de manière très coordonnée, formant des contacts
fréquents avec les cellules voisines. Signalons aussi que les flux cellulaires associés à la formation de la ligne
primitive ont lieu dans une couche épithéliale de cellules reposant sur une lame basale complexe et reliées
par des jonctions adhérentes et serrées bien développées. Ainsi, il ne faut pas tomber dans la caricature
suivante : cellules épithéliales = cellules statiques. Cellules mésenchymateuses individualisées =
cellules en mouvement.

L’un des concept clé pour comprendre les mouvements au sein d’un épithélium est la polarité cellulaire
planaire (PCP). La voie de signalisation Wnt non canonique est l’un des nombreux régulateurs de la PCP.
L’inhibition de la voie Wnt-PCP perturbe la formation de la ligne primitive. Par exemple, une version
dominante négative de Dishevelled (Dsh-ΔDEP), qui inhibe spécifiquement la voie Wnt-PCP mais n’affecte
pas la signalisation Wnt canonique (dépendante de la β-caténine), n’interfère pas avec la spécification du
mésoderme mais abolit l’allongement de la ligne primitive. Un résultat similaire est obtenu par
électroporation d’un mélange de morpholinos inhibant PRICKLE1, CELSR1 et VANGL2, des protéines
impliquées dans la voie Wnt-PCP (Voiculescu et al., 2007). Chez le poisson zèbre, des mutations dans le
locus vangl2 perturbent les mouvements de convergence-extension pendant la gastrulation, entraînant un
axe antéro-postérieur raccourci et un corps élargi (Solnica-Krezel et al., 1996).
**Figure 3-80. Convergence-extension et voie Wnt/PCP.
Pk et Vangl se localisent antérieurement tandis que
Frizzled (Fzd) et Dishevelled (Dsh) se localisent
postérieurement. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6829399/pdf/cells-08-01198.pdf

La gastrulation chez la souris a été moins étudiée que chez la poule car elle est moins accessible et la
topologie est compliquée par la forme « en hamac » que prend l’embryon et par la présence de structures
extra-embryonnaires plus étendues à ce stade chez la souris que chez la poule. Mais les mécanismes
fondamentaux restent les mêmes. Notons que l’embryon humain n’a pas cette forme en hamac et sa forme
ressemble plus à celle de l’embryon de poule. La gastrulation chez l’Homme commence 14 jours après la
fécondation.
149
Après l’implantation dans l’utérus maternel de l’embryon de souris au stade tardif du blastocyste, aux tout
premiers stades post-implantatoires (autour de E5.5), l’embryon prend la forme d’un cylindre radialement
symétrique constitué d’un épithélium bilaminaire, qui à son tour est composé d’épiblaste et d’endoderme
viscéral distalement, et d’épiblaste et d’ectoderme extra-embryonnaire de manière proximale au site
d’implantation.

**Figure 3-81. Embryon de souris à E5,5 jours exprimant la β-

galactosidase (coloration bleue après incubation avec son substrat, le
X-gal) sous le contrôle d’un promoteur spécifique de l’épiblaste (eme).

exe = ectoderme extra-embryonnaire. emv = endoderme viscéral. exv =

endoderme viscéral extraembryonnaire

Barre, 25 µm.

Source :

http://www.ijdb.ehu.es/web/descarga/paper/10794075

Au cours de la gastrulation chez la souris, la ligne primitive se forme à E6,25 dans l’épiblaste postérieur, à
la jonction entre les régions embryonnaires et extra-embryonnaires (notez l’homologie avec la zone
marginale postérieure de l’embryon de poulet entre l’area pellucida et l’area opaca).

*Figure 3-82. Développement de l'embryon dans les jours qui précèdent l'apparition de la ligne primitive. Les cellules
de l'endoderme viscéral distal se développent dans la zone la plus éloignée de l'ectoderme extraembryonnaire. Celui-
ci secrète en effet des BMP qui inhibent la formation de ce tissu. Ensuite, les cellules de l'endoderme viscéral dorsal
migrent vers le côté antérieur pour former l'endoderme viscéral antérieur. C'est une des premières manifestations
de la mise en place de l'axe antéro-postérieur de l'embryon. C'est au côté opposé (le côté postérieur) que se forme la
ligne primitive (primitive streak). Les cellules violet foncé en haut forment le cône ectoplacentaire. dpc = jours après
la copulation/fécondation. Source : https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rsob.120030

C’est l’activation différentielle de la voie de signalisation Nodal dans l’épiblaste postérieur (et pas l’épiblaste
antérieur) qui permet la formation localisée de la ligne primitive (voir le mécanisme plus loin).

La ligne primitive s’allonge ensuite jusqu’à l’extrémité antérieure de l’embryon. Cette ligne primitive est la
région de l’embryon où les cellules épiblastiques se délaminent par transition épithéliale-mésenchymateuse
pour générer une population de cellules mésenchymateuses qui forment le mésoderme et les couches de

150
l’endoderme définitif (par opposition à l’endoderme primitif). On constate une fois de plus l’homologie avec
ce que nous avons décrit chez la poule.

**Figure 3-83. Cellules mésodermiques et endodermiques dans l'épiblaste juste avant la formation de la ligne
primitive chez la souris. Un embryon de souris de E6,5 a été immunomarqué avec un anticorps reconnaissant
Brachyury (marqueur de mésoderme) et un anticorps reconnaissant Foxa2 (marqueur de l'endoderme définitif et
de l'endoderme viscéral (couche cellulaire à droite)). On constate que dans l'épiblaste certaines cellules expriment
Brachyury et d'autres expriment Foxa2. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/136/6/1029/43865/Foxa2-regulates-polarity-and-epithelialization-in

**Figure 3-84. Analyse en vélocité ARN de la

détermination du mésoderme et de l'endoderme à partir
de l'épiblaste postérieur. Représentation d'une étude de
transcriptomique sur cellules isolées d'embryons de
souris durant la gastrulation. Les flèches désignent les
trajectoires de modifications transcriptomiques que
prennent les cellules au cours du temps (provient de la
comparaison des ARNm épissés et des ARN non épissés
(nouveaux ARN fraîchement transcrits). Les différentes
couleurs représentent l'épiblaste (Epi), l'épiblaste
postérieur (pEpi, état intermédiaire) ou l'endoderme
définitif (DE), le mésoderme de la plaque latérale (LPM)
et l'endothélium naissant (NE). On observe que les
cellules de l'épiblaste postérieur se divisent en deux
groupes, les cellules menant à l'endoderme et les cellules
menant au mésoderme. Source :
https://www.nature.com/articles/s41556-021-00694-
x

Lors de la gastrulation, les cellules de l'épiblaste qui forment un épithélium incurvé et qui migrent en même
temps sont soumises à des tensions mécaniques importantes, notamment dans leur région apicale.
**Figure 3-85. Tensions mécaniques dans les cellules de
l'épiblaste au cours de la gastrulation chez la souris. Un
senseur de tension mécanique dont la fluorescence
dépend de ce paramètre (FLIPPER-TR) est exprimé dans
un embryon de souris transgénique à E6,5 (a). On voit
que la tension mécanique est forte dans la région apicale
de l'épiblaste. Une immunolocalisation de SHROOM2 est
réalisée (b). Il s'agit d'une protéine qui se lie aux
microfilaments d'actine, à la myosine et à ZO-1 qui est
présente dans les jonctions serrées. On observe son
accumulation spécifique dans la région apicale de
l'épiblaste, renforçant la solidité et la contractilité de
cette région. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-022-28590-
4

151
La protéine ASPP2 qui est présente dans les jonctions apicales est alors nécessaire pour maintenir l'intégrité
de l'épithélium dans des conditions de fortes contraintes biomécaniques (Royer et al., 2022).

La transition épithélio-mésenchymateuse dans la ligne primitive est sous la dépendance du facteur

de transcription Snail (ce qui sera aussi le cas un peu plus tard au cours du développement, pour la
transition épithélio-mésenchymateuse des cellules de crêtes neurales). Il réprime notamment
directement l'expression de la E-cadhérine épiblastique et active l'expression de marqueurs
mésenchymateux tels que la vimentine.

Après la transition épithélio-mésenchymateuse et le passage par la ligne primitive, les cellules du

mésoderme migrent en avant vers leurs sites de destination embryonnaire ou latéralement pour former du
mésoderme extra-embryonnaire (plutôt dans la région postérieure de la ligne primitive). Le mésoderme
extra-embryonnaire contribue à l’amnios, à l’allantoïde, au chorion et au sac vitellin (ou vésicule vitelline).
Ce dernier a des fonctions importantes dans la protection et la communication materno-fœtale, ainsi que
dans l’érythropoïèse primitive. Des études de lignage montrent que la destinée des cellules du mésoderme
dépend du moment et de l’endroit où elles quittent la ligne primitive à la gastrulation. En outre, des études
de transplantation indiquent que le devenir des cellules du mésoderme dépend de la position finale de la
cellule plutôt que de son origine dans l’épiblaste. Des études en microscopie électronique ont montré que
les jeunes cellules du mésoderme ont des protrusions, suggérant que ces cellules les utilisent pour migrer
activement. Le cytosquelette se réorganise de manière rapide dans ces cellules et les petites GTPases RhoA
et Rac1, des médiateurs de la réorganisation du cytosquelette, sont nécessaires au bon déroulement de la
migration du mésoderme chez la souris (Migeotte et al., 2011). Les embryons avec la mutation tw9
(également appelée tw18) présentent des défauts majeurs de formation du mésoderme avec des cellules
dépourvues de filopodes. Le gène affecté code une sous-unité de la sérine/thréonine phosphatase PP2A qui
est sous le contrôle de la petite GTPase Rho (Bousquet et al., 2016).

Brachyury ou T est un gène très important pour le développement du mésoderme lors de la gastrulation et
ce, quel que soit le vertébré. Brachyury est le membre fondateur d’une famille de facteurs de transcription
caractérisés par un domaine de liaison à l’ADN conservé, la boîte T ou T-box. À partir d’un orthologue
brachyury dans l’ancêtre commun des métazoaires et des champignons, plusieurs gènes T-box ont été
générés par duplication, et ils se sont encore diversifiés au sein des métazoaires (Sebé-Pedrós et al., 2013 ;
Papaioannou, 2014 ; Gentsch et al., 2017). Le nom du gène Brachyury fait référence au phénotype le plus
évident du mutant T hétérozygote de souris, une queue tronquée, qui a été décrit par Dobrovolskaia-
Zavadskaia dès 1927. Les mutations homozygotes T−/− sont léthaux pour l’embryon et présentent une
accumulation de cellules du mésoderme au niveau de la ligne primitive de la gastrula et une perte du
mésoderme postérieur.
*Figure 3-86. Expression de Brachyury vue par
immunofluorescence dans un embryon de souris à E7,5
en gastrulation. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Brachyury#/media/File:Paul_Burridge_Brachyury_in_E7.5.jpg

152
 **Figure 3-87. Brachyury est nécessaire pour la transition épithélio-
mésenchymateuse complète au cours du développement du mésoderme
lors de la gastrulation. Images en contraste de phase de cellules dérivées
de cellules ES de souris soumises à un protocole qui les poussent à devenir
comme des cellules de gastrula. Les cellules à gauche expriment Brachyury
(Bra+/GFP) et celles à droite ne l’expriment pas (Bra-/-). En l’absence de
Brachyury, les cellules ne subissent pas une EMT complète. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4171571/

Des expériences comme celles montrées ci-dessus ont démontré que Brachyury est nécessaire à la
transition épithélio-mésenchymateuse des cellules du mésoderme au cours de la gastrulation (Turner et al.,
2014).

Pour les cellules de l'endoderme, la transition épithélio-mésenchymateuse n'est que partielle et le facteur
de transcription Foxa2 (qui est exprimé dans l'endoderme mais pas dans le mésoderme) est responsable de
cette transition incomplète (Scheibner et al., 2021). Le facteur de transcription Sox17 est essentiel pour la
détermination des cellules endodermiques. Il est notamment requis pour la synthèse de la membrane basale
de l'endoderme qui permet de bien séparer ce feuillet du mésoderme après la migration (Viotti et al., 2014).
La voie Wnt/β-caténine est également essentielle et les cellules endodermiques où on la rend non
fonctionnelle deviennent des cellules mésodermiques cardiaques (Lickert et al., 2002). Par ailleurs,
certaines cellules issues de l'endoderme viscéral participent aussi à la formation de l'endoderme qui forme
le tube digestif de l'embryon, comme l'ont montré des données de transcriptomique en cellules isolées
(Nowotschin et al., 2019).

Lors de la phase précoce de la gastrulation des Mammifères, des mouvements sont aussi requis dans les
tissus extraembryonnaires, notamment l'endoderme viscéral distal qui migre dans la future région
antérieure pour devenir l'endoderme viscéral antérieur (AVE). La migration cellulaire épithéliale collective
dans l’AVE le positionne correctement et c’est important car il produit des inhibiteurs de la signalisation de
Wnt et Nodal (par exemple, Lefty1, Dkk1, Cerberus1) qui évite que la ligne primitive se forme du côté
antérieur (Belo et al., 1997, Kemp et al., 2005, Perea-Gomez et al., 2002).
**Figure 3-88. Cerberus-like et Lefty sont nécessaires pour
éviter la formation d'un double axe chez la souris à cause
d'une ligne primitive surnuméraire. Double hybridation in
situ avec des sondes reconnaissant l'ARNm de Otx2 (un
marqueur du système nerveux antérieur) et l'ARNm de
T/Brachyury (un marqueur de la chorde) sur des
embryons de souris de E8,5. En I, un embryon sauvage et
en J, un embryon avec un double knock-out Cerl-/-;Lefty-/-.
On constate qu'un double axe a été mis en place chez le
mutant, conséquence de la formation de deux lignes
primitives. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580702003210

Parmi les facteurs essentiels à la migration des cellules de l’AVE, on peut citer les petites GTPases et leurs
activateurs, les GEF (guanine nucleotide exchange factor). β-Pix (Arhgef7) est une GEF des GTPases Rac1 et
Cdc42 et qui se localise sur les adhérences focales. β-Pix favorise à la fois la formation des protubérances
153
cellulaires et inhibe la maturation des adhérences focales. Les embryons de souris mutantes nulles β-Pix
arrêtent leur développement avant E8.0 et ne parviennent pas à spécifier un axe antéro-postérieur car β-
Pix est requis pour la migration épithéliale collective des cellules de l’AVE. En l’absence de β-Pix, les cellules
de l’AVE forment de multiples protubérances cellulaires en raison de l’échec de la localisation de l’activité
Rac1 qui dépend de Cdc42. Cette multitude de protubérances ne permet pas de faire migrer les cellules dans
une direction précise. La migration collective de cette population épithéliale échoue ce qui aboutit à des
signalisations Wnt et Nodal non circonscrites et un axe antéro-postérieur correct ne peut pas se former.

EN DIRECT DES LABOS :

La formation de gastruloïdes :
https://www.unige.ch/communication/communiques/2018/des-cellules-souches-sorganisent-seules-en-pseudo-embryon/

LA CARTE MENTALE :

154
DES MOTS CROISES POUR REVISER

155
La neurulation

*Figure 3-89. Tube neural d’un embryon de poulet qui vient de se refermer. Image d’une coupe transversale
d’embryon de poulet vue en microscopie électronique à balayage donnée par Eric Théveneau, CBI Toulouse. La
structure du neuroépithélium se distingue bien des structures mésenchymateuses autour. Des cellules de crêtes
neurales émergent de la partie la plus dorsale du tube neural (en haut).

La neurulation est une étape du développement où l’attention est essentiellement centrée sur
l’ectoderme, bien que les cellules des autres feuillets avancent dans leur programme de
détermination et de différenciation. C’est au cours de cette étape que l’ectoderme se sépare en
différentes parties : une partie neurale, une partie épidermique et chez les Vertébrés, une partie
intermédiaire entre les deux appelée la bordure neurale. La partie neurale devient le tube neural
générant la moelle épinière et le cerveau et la bordure neurale donne naissance aux cellules de
crêtes neurales et aux placodes.

*Figure 3-90. La partition de l’ectoderme en trois

territoires durant la neurulation. Double hybridation in
situ d’une jeune neurula de xénope, ici en vue dorsale,
avec une sonde reconnaissant l’ARNm de Sox2 et une
autre sonde reconnaissant l’ARNm de EpK (kératine
épidermique). Photo : Mansour Alkobtawi (prise dans
l’équipe d’Anne-Hélène Monsoro-Burq, Institut Curie
(Orsay))

156
 *Figure 3-91. Neurula de xénope en vue dorsale
(légèrement de côté). La plaque neurale céphalique (qui
deviendra le cerveau) est élargie par rapport à la plaque
neurale médullaire (qui deviendra la moelle épinière).
Les bourrelets neuraux se sont soulevés et sont en train
de se rapprocher dans le plan sagittal.

Pour voir une vidéo de fermeture du tube neural chez l’embryon de poulet, suivre ce lien :
https://youtu.be/00xr4kzYZn4

Chez l'Homme, les bourrelets neuraux se soulèvent au 23 ème jour après la fécondation et la fusion de ces
bourrelets générant le tube neural a lieu au 28 ème jour après la fécondation pour la partie médiane et
respectivement au 29ème et au 30ème jour pour la partie antérieure et la partie postérieure.

La dépression dans la plaque neurale qui initie la formation de la gouttière neurale dépend de la constriction
apicale des cellules de la ligne médiane qui ont un rôle moteur essentiel (Haigo et al., 2003; Nishimura et
Takeichi, 2008; Nishimura et al., 2012; McShane et al., 2015). La constriction apicale dépend des
interactions entre l’actine et la myosine. Des régulateurs de l’actine et de la myosine sont nécessaires pour
la fermeture de la plaque neurale (Brouns et al., 2000; McGreevy et al., 2015).

**Figure 3-92. Le régulateur du réseau d’actine

p190Rho-GAP est nécessaire à la neurulation. p190Rho-
GAP est un inactivateur de la petite GTPase Rho qui
participe à l’organisation des microfilaments d’actine
dans la cellule. (A, B) Tête d’embryon sauvage (A) ou
mutant p190Rho-GAP-/- (B) à E15.5. La flèche en B
indique une exencéphalie (absence de fermeture
antérieure du tube neural). (C-D) Images de
microscopies électroniques à balayage de vues frontales
d’embryons de E10,5 sauvage (C) et mutant p190Rho-
GAP-/- (D), montrant le tube neural antérieur ouvert dans
les embryons mutants. f = prosencéphale (cerveau
antérieur); m = mésencéphale. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/127/22/4891/41024/The-adhesion-signaling-molecule-p190-RhoGAP-is

157
 *Figure 3-93. Rôle de la ceinture d’adhérence et de la constriction apicale lors de la neurulation. Source :
https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap4/co/module_Chap4_9.html

La perte du régulateur de l’interaction actine-myosine Shroom entraîne une augmentation de la surface

cellulaire apicale dans le neuroépithélium crânien, ce qui correspond à un défaut de constriction apicale
(McGreevy et al., 2015). Au contraire, la surexpression de Shroom provoque une constriction apicale
ectopique de cellules de l’ectoderme qui ne participent habituellement pas au tube neural (Haigo et al.,
2003). Shroom agit en contrôlant la localisation de ROCK (Rho-associated kinase) qui phosphoryle et active
la myosine-II non musculaire en la phosphorylant sur sa sérine 19 (Amano et al., 1996). ROCK phosphoryle
aussi et inhibe MYPT qui habituellement déphosphoryle et inactive la myosine-II.

**Figure 3-94. Interaction directe entre Shroom (ici Shrm2) et ROCK qui provoque directement et indirectement le
renforcement de la phosphorylation de la myosine-II non musculaire et son action sur la réorganisation du
cytosquelette et le changement de forme des cellules (dont la constriction apicale).

Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)34530-0/fulltext

Des réarrangements planaires sont aussi nécessaires pour les mouvements de la neurulation (Williams et
al., 2014 ; Sutherland et al., 2020) et ils contribuent à rétrécir et à plier la plaque neurale. Aux stades
ultérieurs de la fermeture, les cellules aux bords de la plaque neurale forment des protrusions avant
l’apposition au début des événements de fusion épithéliale (Pai et al., 2012). Des filopodes sont présents
aux extrémités des plis neuronaux chez la souris (Massarwa et Niswander, 2013 ; Pyrgaki et al., 2010), ainsi
qu’un enrichissement en F-actine le long de la frontière entre le neuroectoderme et l’ectoderme non neural
(Hashimoto et al., 2015).

Pour la dernière étape de la neurulation où a lieu une «fusion» épithéliale, les cellules individuelles ne
fusionnent pas réellement les unes avec les autres, mais les cellules situées aux bords des tissus apposés
forment des adhérences de novo pour créer un épithélium continu. La fermeture du tube neural implique
ainsi un type particulier de fusion épithéliale, dans laquelle deux tissus distincts doivent fusionner et se
remodeler : le neuroépithélium pseudostratifié et l’ectoderme de surface squameux. Initialement, chacun
de ces deux tissus forment une couche ectodermique continue ; cependant, lors de la fusion du pli neural, la
continuité de cet épithélium est interrompue aux jonctions bilatérales NE/ES, et de nouvelles adhérences
158
se forment entre les épithéliums accolés de chaque côté. Le remodelage produit alors le tube neural fermé
recouvert par le futur épiderme, lui aussi continu.

***Figure 3-95. Schéma des événements finaux de la

neurulation dans la région troncale de l’embryon de
souris.

Les plis neuraux d’apposition présentent des

protrusions cellulaires à partir de leurs extrémités (à
gauche), les plis neuraux subissent ensuite une fusion
(au milieu) et les deux épithéliums se remodèlent pour
générer un tube neural fermé recouvert d’ectoderme de
surface. D’après
https://elifesciences.org/articles/13273

La neurulation s’accompagne aussi de changements d’adhérences cellulaires. L’ectoderme de la

souris exprime initialement la E-cadhérine mais au cours de la neurulation, la plaque neurale
destinée à devenir le tube neural, éteint l’expression de la E-cadhérine et exprime la N-cadhérine à
la place. Si ce changement est bloqué, la séparation des deux tissus, ectoderme non neural et
neurectoderme, se fait mal.

*Figure 3-96. L’absence de N-cadhérine provoque une déformation du tube neural chez la souris. Deux embryons de
souris à E8,5 sauvage (A) et N-cad-/- (B) en vue dorsale. Notez le tube neural ondulé du mutant et les somites
également mal formés chez lui. Cependant, des études complémentaires montrent que l’architecture épithéliale du
neurectoderme semble normale chez les souris N-cad-/- indiquant qu’une autre cadhérine compense son absence.
Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160696984432

159
 *Figure 3-97. Neurulation chez l’embryon de la souris. Images en microscopie électronique à balayage de souris à 7
somites (A), 12 somites (B) et 24 somites (C). On peut constater que la fermeture du tube est précoce dans la zone
médiane du corps mais que le tube est encore ouvert aux deux extrémités. Ne pas tenir compte des encadrés i. Barres
d’échelle = 100 µm. Source : https://elifesciences.org/articles/13273

L’échec de la fermeture complète du tube neural entraîne des malformations congénitales :

anencéphalie quand pas de fermeture à l’avant et spina bifida quand pas de fermeture à l’arrière.
Les anomalies de fermeture du tube neural sont parmi les malformations congénitales humaines les
plus courantes, affectant 1 grossesse sur 1000 dans le monde (Copp et al., 2013). Comprendre les
mécanismes par lesquels la plaque neurale des vertébrés se replie et fusionne pour former un tube neural
fermé est donc d’une importance primordiale pour mieux comprendre l’origine de ces anomalies et pour
développer des méthodes pour leur prévention. Les voies de signalisation impliquées commencent à être
élucidées. Par exemple, les mouvements initiaux de convergence et d’extension qui rétrécissent et allongent
la plaque neurale sont régulés par la voie de polarité cellulaire planaire Wnt non canonique (Wnt-PCP)
(Wallingford et Harland, 2002; Williams et al., 2014; Lopez-Escobar et al., 2018). La flexion de la plaque
neurale des mammifères à des points de charnière médians et dorsolatéraux est régulée par la signalisation
Shh et BMP (Ybot-Gonzalez et al., 2007).

Chez tous les vertébrés étudiés à ce jour, le facteur de transcription Sox2 est un marqueur général
très précoce de la plaque neurale en développement. Chez le poulet, par exemple, l’expression de Sox2
commence au stade de la ligne primitive tardive (stades HH 4–4+) dans le futur territoire neuronal. Une
plaque neurale morphologiquement reconnaissable ne devient visible qu’après le début de l’expression de
Sox2.

Le profil d’expression complexe de Sox2 est contrôlé par plusieurs éléments régulateurs, chacun étant
responsable de diriger l’expression vers un sous-ensemble spécifique de sites d’expression. Une analyse des
régions non codantes de Sox2 dans l’embryon de poulet a révélé jusqu’à 25 enhancers distincts conservés,
dont deux expliquent l’expression de ce gène dans la plaque neurale précoce. L’un de ces enhancers, nommé
N2, est responsable de l’expression initiale (stade 4-4+) et est activé dans un large domaine correspondant
à l’ensemble du cerveau antérieur/mésencéphale et à la majeure partie du cerveau postérieur. L’autre
enhancer, N1, pilote l’expression dans la partie la plus postérieure du futur cerveau et dans la moelle
épinière et il est activé un peu plus tard (autour du stade 5). L’expression de Sox2 via l’élément N1 est activée
par l’action conjointe des voies de signalisation Wnt et FGF (Uchikawa et al., 2003; Takemoto et al., 2006;
Bouzas et al., 2016). Le facteur de transcription PRDM1 joue également un rôle important : il recrute
l’histone déméthylase Kdm4a qui déméthyle les marques répressives H3K9me3 ce qui rend possible
l’activation de la transcription de Sox2 (Prajapati et al., 2019).
**Figure 3-98. Activation de l'expression de Sox2 par
PRDM1. Les régions en 5' du site de début de la
transcription de Sox2 (TSS) contiennent 4 sites de liaison
sur l'ADN pour PRDM1 (barres oranges et les séquences
consensus de ces sites sont rappelés dans l'encart). En
haut, à droite, des expériences de ChIP-qPCR ont été
réalisées à partir de chromatine d'épiblaste (ou futur
ectoderme) de poulet d'avant la gastrulation (cEpi), de
bordure neurale (NpB) et de plaque neurale (eNP). Les
barres grises foncés à gauche représentent les résultats
avec les contrôles avec une ChIP-qPCR réalisées avec des
anticorps contrôle, les autres barres grises représentent
les résultats avec les contrôles avec une ChIP-qPCR
réalisées avec des anticorps anti-PRDM1. La qPCR sur le
culot de la ChIP a été prévue pour amplifier des
séquences de fixation de PRDM1 sur le promoteur de
Sox2. En bas, la ChIP-qPCR a été réalisée avec des
anticorps anti-H3K9me3 qui est une marque répressive
de la transcription. La chromatine a été extraite de cEpi,
NpB et eNP mais aussi des progéniteurs sensoriels de
placode (SP) et de plaque neurale où on a inhibé
l'expression de PRDM1 (eNP*). On constate que PRDM1
se fixe sur le promoteur de Sox2 dans la plaque neurale

160
 spécifiquement et qu'il y est nécessaire pour éliminer les
formes H3K9me3 répressives de la transcription. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/24/dev181107/223060/PRDM1-controls-the-
sequential-activation-of-neural

Sox2 est nécessaire et suffisant pour produire du tissu neural. Par exemple, l'expression ectopique de Sox2
dans le mésoderme présomitique induit la formation de tissu neural à partir de cellules qui devraient
contribuer aux somites (Takemoto et al., 2011).
*Figure 3-99. L'expression ectopique de Sox2 est
suffisante pour changer la destinée des futures cellules
somitiques en tissu neural. Des souris transgéniques
sont générées qui permettent d'exprimer Sox2 dans du
mésoderme présomitique grâce à un promoteur
spécifique de cette région. On réalise des coupes dans les
embryons obtenus. Les coupes sont de plus en plus
antérieures du haut vers le bas (neurulation pas encore
achevée dans la région la plus postérieure). On réalise
une immunofluorescence permet de détecter la présence
de Sox2 et de Pax6, un marqueur de tube neural On
constate qu'en dehors de ce tube, Pax6 est aussi exprimé
dans des groupes de cellules latérales dans le
mésoderme pré-somitique exprimant Sox2 (flèches).
Source :
https://www.nature.com/articles/nature09729

La plaque neurale est significativement plus large dans la région crânienne par rapport à la moelle épinière,
ce qui suggère que des mécanismes distincts sont nécessaires pour la fermeture du cerveau en
développement. De plus, des signaux régionalisés produisent des destins cellulaires distincts le long de l’axe
antéro-postérieur et dorso-ventral du tube neural.

Les positions dorso-ventrales correspondent à des positions médiolatérales dans la plaque neurale avant la
fermeture du tube neural. Les identités neuronales à différentes positions médio-latérales dans la
plaque puis dorso-ventrales dans le tube sont régulées par les protéines sécrétées Shh, Wnt et BMP,
avec des niveaux élevés de Shh produisant des destins cellulaires ventraux, des niveaux modérés de
Shh produisant des destins cellulaires intermédiaires et des niveaux élevés de Wnt et BMP
produisant des destins cellulaires dorsaux (Dessaud et al., 2008 ; Sagner et Briscoe, 2019). Une polarité
antéro-postérieure est aussi établie.
*Figure 3-100. Les gradients dans le tube neural
établissent des axes de polarité dans le système
nerveux central. Les gradients de BMP/Wnt et celui de
Shh établissent une polarité dorso-ventrale dans le
tube neural (avec les motoneurones (MNs) par
exemple qui se développent dans la région ventrale)
et les gradients de FGF/acide rétinoïque (RA) et Wnt
établissent une polarité antéro-postérieure (avec, de
manière simplifiée, FGF exprimé aux extrémités
antérieure et postérieure du tube neurale et l'acide
rétinoïque dans les régions intermédiaires). Source :
https://stemcellres.biomedcentral.com/articles/10.1186/scrt476

La bordure neurale qui se situe entre le futur tube neural et le futur épiderme donne deux types de
cellules : les cellules de la crête neurale (CCN) et les cellules des placodes (pour ces dernières
seulement dans la bordure neurale antérieure). Les CCN donnent naissance à la plupart des neurones
et des cellules gliales du système nerveux périphérique, aux cellules de la médullosurrénale, à une
grande partie du squelette crânio-facial, aux mélanocytes et aux vaisseaux à la sortie du cœur. Les
placodes forment l’épithélium olfactif, l’oreille interne, le cristallin de l’œil et certains neurones des
ganglions crâniens.

161
 **Figure 3-101. Expression de gènes sélectionnés au cours du développement précoce de la bordure neurale du
xénope. Expression de certains des marqueurs les plus couramment utilisés pour l’ectoderme non-neural, la bordure
neurale et le tube neural. Rangée supérieure : vues dorsales d’embryons de xénope au stade de la plaque neurale
(stade 14, Nieuwkoop et Faber, 1994), avec la région antérieure vers le haut, traités par hybridation in situ : Pax3,
Zic1 et Msx1 sont exprimés à la bordure neurale, l’expression de Six1 délimite l’ectoderme préplacodal qui donne
naissance aux placodes, Sox2 est exprimé dans la plaque neurale et Epk marque l’ectoderme non neural. Notez le
chevauchement partiel entre les expressions de Pax3 et Sox2 dans la plaque neurale latérale correspondant à la
future partie dorsale du tube neural ; et aussi le chevauchement des expressions de Zic1 et Six1 dans l’ectoderme
préplacodal. Barre d’échelle : 500 µm. Rangée inférieure : Coupes transversales d’embryons de xénope au stade 14
traités par hybridation in situ pour les gènes indiqués. Pax3, Zic1 et Hes4 sont exprimés dans la bordure neurale, Sox2
est exprimé dans la plaque neurale avec une chevauchement partiel avec Pax3 dans la plaque neurale latérale et Epk
est exprimé dans l’ectoderme non neural. Barre d’échelle : 100 µm. Source : Pla et Monsoro-Burq, 2018

La co-immunolocalisation de marqueurs de la plaque neurale (Sox2), de la bordure neurale (Pax7), de la

bordure neurale et de l’ectoderme non-neural (Tfap2a, Msx1/2) et des progéniteurs de la placode (Six1) a
montré que ces marqueurs se chevauchent largement dans les cellules de la bordure neurale chez le poulet
(Roellig et al., 2017). Cette co-expression de plusieurs marqueurs est maintenue du début de la neurulation
jusqu’à la fermeture du tube neural. En supposant que chacun de ces marqueurs prédit fidèlement des
destins cellulaires distincts, cette étude indique que la bordure neurale n’est pas divisée en régions à destins
bien définis avant la fermeture du tube neural. Ce n’est qu’après que les différents territoires se définissent
précisément.

Une fois les territoires définis, ils ont des modalités de développement propre. Dans le tube neural
en cours de fermeture, les cellules neuroépithéliales prolifèrent. Avec le début de la neurogenèse,
ces cellules deviennent des cellules de la glie radiaire (cellules souches neurales) qui se divisent
d'abord par division symétrique ce qui augmente leur pool. Puis des divisions asymétriques
apparaissent permettant de régénérer les cellules souches neurales et de produire des précurseurs
de neurones et de cellules gliales.

162
 *Figure 3-102. Production de précurseurs neuronaux et gliaux dans le tube neural. Les cellules souches neurales ont
des caractéristiques de cellules de la glie radiaire. A l’approche de la mitose, leurs prolongements se rétractent et
leur noyau se rapproche de la surface apicale (à côté de la lumière du tube neural). La division est asymétrique et
génère une cellule qui ne produira plus de prolongements apico-basaux et qui sera un précurseur neuronal ou glial
(qui pourra proliférer puis se différencier). La cellule souche neurale s’autorenouvelle grâce à cette division
asymétrique.

D’après https://journals.biologists.com/dev/article/134/10/1943/52765/Mitotic-spindle-orientation-distinguishes-stem

Des expériences de suivi de cellules marquées avec un gène rapporteur introduit par un vecteur rétroviral
dans le tube neural d'un embryon de poulet ont montré que ce sont les mêmes cellules souches neurales
qui donnent naissance aux neurones et aux cellules gliales (Leber et al., 1990).

Lorsqu'on différencie des cellules souches pluripotentes en cellules souches neurales in vitro, elles
prennent la forme de rosettes, mimant la polarité apico-basale du tube neurale.
**Figure 3-103. Rosette composée de cellules
souches neurales. En B, immunofluorescence avec un
anticorps anti-SOX2 (bleu) et un anticorps anti-
Nestine (rouge), un marqueur de cellules souches
neurales. Source :
https://www.eurostemcell.org/unlocking-natures-
secrets-building-human-brain

Des équipes de recherche travaillent également à faire mimer in vitro à des cellules dérivées des cellules
souches pluripotentes humaines les mouvements de la neurulation (Karzbrun et al., 2021).

***Figure 3-104. Système de culture en 3D permettant de suivre une neurulation avec des cellules humaines. Inspirés
de l'organogenèse in vivo, un feuillet bidimensionnel géométriquement contrôlé de cellules souches pluripotentes
163
 humaines polarisées en contact avec une cavité est généré (vert) par le Matrigel qui déclenche une transition de la
culture 2D contrainte vers un épithélium monocouche pluripotent 3D qui s'est enroulé autour d'une seule cavité. Le
tissu 3D a maintenu la pluripotence et pourrait donc donner naissance à de nombreux types de cellules du corps
humain. La formation du tube neural (rouge) est déclenchée en appliquant des molécules mimant ce qu'il se passe
in vivo lors du développement neurologique précoce : un inhibiteur de TGFβ (SB-431542), suivi d'une exposition à
BMP4. Il en résulte un tissu neural en forme de tube recouvert d'ectoderme de surface, récapitulant plusieurs
caractéristiques anatomiques du tube neural embryonnaire. L'expression de la E-cadhérine (futur épiderme) et de
la N-cadhérine (neuroépithélium) est suivi par immunofluorescence et montre des similitudes importantes avec la
situation in vivo. Les temps indiqués ont pour origine le traitement par BMP4. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8828633/

Pour voir les modalités de la délamination et de la migration des crêtes neurales, voir le chapitre
correspondant.

À la fin de la neurulation et au début de l’organogenèse, tous les embryons de Vertébrés se

ressemblent (malgré des premières étapes du développement assez divergentes, notamment à
cause de la quantité et de la répartition du vitellus) : c’est le stade phylotypique.
*Figure 3-105. Modèle du sablier. Le développement des Vertébrés
est très divergent lors des premières étapes puis converge vers un
stade phylotypique qui signe la parenté évolutive entre tous les
Vertébrés avant de diverger à nouveau lors de l'organogenèse
propre à chaque phylum. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Stade_phylotypique#/media/Fichier:Mod%C3%A8le_du_sablier.png

De nouvelles techniques de différenciation in vitro de cellules souches pluripotentes (ES ou iPS) de souris
permettent d'obtenir des embryoïdes capables d'effectuer une gastrulation et une neurulation assez
proches de ce qu'il se passe in vivo (Lau et al., 2022).

**Figure 3-106. Obtention d'embryoïdes de souris au stade de la neurulation. En combinant des cellules ES "naïves"
(orange) avec des cellules ES transfectées pour exprimer Cdx2 (ce qui les oriente vers une différenciation en
ectoderme extraembryonnaire et en chorion, bleu) ou pour exprimer Gata4 (ce qui les oriente vers une
164
différenciation en endoderme viscéral/vésicule vitelline, gris), on obtient une topologie favorable pour qu'un
embryoïde se développe in vitro jusqu'à la neurulation. Source : https://www.cell.com/cell-stem-
cell/fulltext/S1934-5909(22)00377-0

L’organogenèse

*Figure 3-107. Coupe transversale d’embryon de xénope à la fin de la neurulation/début de l’organogenèse vue en
microscopie électronique à balayage. Vue de la région dorsale. Photo donnée par Eric Théveneau, CBI Toulouse.

*Figure 3-108. Organogenèse dans une lignée

transgénique rapportrice de l’activité Wnt chez Xenopus
tropicalis. Pour chaque stade, des vues latérales et
dorsales sont présentées : afb = partie antérieure du
prosencéphale ; bi = îlots sanguins ; cns = système
nerveux central ; ey = œil ; f = nageoires ; h-myo =
myoblastes hypaxiaux ; NC = cellules de la crête neurale
en migration ; ot = vésicule otique ; ov = vésicule optique
; PSM = mésoderme présomitique postérieur.

Source : Borday et al., 2018

165
L’organogenèse correspond à l’étape de formation des organes par prolifération des précurseurs
déterminés puis par leur différenciation. Il peut y avoir encore des migrations (cellules de crête
neurales vers de multiples destinations, myoblastes vers les bourgeons de membres, cellules
germinales vers les gonades en formation…) mais elles ne concernent plus l’embryon entier comme
lors de la gastrulation. Souvent, les organes se forment par interactions entre les tissus (placode
ectodermique et neuroectoderme pour l’œil par exemple), souvent provenant de feuillets
embryonnaires différents (épiderme provenant de l’ectoderme et derme et hypoderme provenant
du mésoderme pour la peau). De l’apoptose localisée permet de “sculpter” et d’ajuster le nombre de
cellules (formation des doigts de nombreux Tétrapodes, sélection des neurones fonctionnels).

Pour les vertébrés, alors qu’à la neurulation et au début de l’organogenèse, tous les embryons se
ressemblent (stade phylotypique), à la fin de l’organogenèse, ils ont la morphologie et l’anatomie
propre à leur espèce avec parfois de larges variations au sein d’un phylum (de la baleine à la souris
chez les Mammifères euthériens par exemple).
*Figure 3-109. Embryon humain en cours
d’organogenèse (50 jours environ, soit 7 semaines).

Alors que les précédentes étapes du développement étaient bien bornées dans le temps,
l’organogenèse a un début et une fin très différenciée selon l’organe considéré. Elle peut se terminer
largement après le développement embryonnaire (cerveau du nouveau-né humain très immature,
glandes mammaires chez la femme). Pour les organismes à développement indirect, la
métamorphose est une période intense d’organogenèse post-embryonnaire. Pour les organes et les
tissus qui se renouvellent en permanence grâce aux cellules souches (peau, intestin, “tissu
sanguin”…), l’organogenèse ne se termine vraiment qu’avec la mort.

Le développement des somites est une étape importante de l'organogenèse. Ces structures
épithéliales du mésoderme paraxial sont composées de cellules multipotentes qui sont spécifiées
par la suite. Elles se divisent en sclérotome (avec des cellules qui réalisent une transition épithélio-
mésenchymateuse) et en dermomyotome. Le sclérotome donne naissance aux vertèbres et aux
tendons (seulement la partie la plus dorsale du sclérotome appelée syndetome). Le dermomyotome
se divise ensuite en myotome (qui donne les muscles du dos et des membres) et en dermatome (qui
donne le derme). La démonstration de ces lignages a notamment été mise en évidence avec les
chimères caille-poulet (voir Figure 1-35).

La régionalisation de chaque somite dépend de signaux paracrines en provenance du tube neural,

de l'ectoderme non-neural (épiderme) et de la chorde.

166
 *Figure 3-110. Rôle de morphogène de Shh dans la différenciation des régions des somites. Shh produit par la chorde
forme un gradient qui détermine la régionalisation du somite (une forte concentration induit le sclérotome qui forme
les vertèbres, une concentration moyenne-faible induit le dermomyotome). Shh n'est pas le seul signal reçu par les
cellules des somites : les signalisations Wnt et BMP contribuent aussi à la régionalisation. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160608011548

Parmi les structures embryonnaires qui changent de forme et de fonction au cours de l'organogenèse, citons
la chorde qui est une structure de soutien général pour l'embryon et un centre de signalisation important
et qui dégénère en partie et finit par donner le noyau pulpeux (ou nucleus pulposus) des disques
intervertébraux (Choi et al., 2008).
**Figure 3-111. Le destin des cellules de la chorde
lors de l'organogenèse chez la souris. Les cellules
de la chorde sont suivies grâce à leur expression de
Shh. La recombinase Cre sous le contrôle de
l'élément régulateur de l'expression de Shh dans la
chorde a été utilisé pour activer R26R :: EYFP. EYFP
est observé en vert. Images fluorescentes
surimposées sur des images en microscopie
classique de la colonne vertébrale (vues dorsales).
A: À E12.5, la chorde commence à former des
"renflements" aux endroits où le noyau pulpeux (ou
nucleus pulposus) du disque intervertébral se
formera (les flèches indiquent la chorde). B : à
E15.5, des noyaux pulpeux clairement délimités se
sont formés à partir des cellules marquées. Une
partie de la chorde est encore observée entre les
disques (flèche). C, D : les cellules marquées sont
limitées au nucleus pulposus et sont pour la plupart
exclues des vertèbres (v) à E16.5 (C) et à P0 (D). NP,
noyau pulpeux. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2646501/

Au cours de l'organogenèse des Vertébrés, la partie antérieure du tube neural se développe pour
donner 3 puis 5 vésicules à l'origine des différentes parties du cerveau. Le canal central peut
s'élargir et former des ventricules remplies de liquide céphalorachidien en continuité avec le canal
de l'épendyme de la moelle épinière qui est position plus postérieure.

167
 *Figure 3-112. Développement de l'encéphale chez l'embryon humain. D'après
https://en.wikipedia.org/wiki/Brain_vesicle#/media/File:1302_Brain_Vesicle_DevN.jpg

Les inductions entre tissus d’origines différentes sont assez nombreuses au cours de l’organogenèse
ce qui montre l’interdépendance de structures dont on soupçonnerait difficilement qu’elles aient un lien
entre elles. Par exemple, les glandes mammaires (qui sont des glandes sudoripares modifiées) sont induites
dans l’épiderme par les somites sous-jacents (qui donnent des vertèbres, des muscles et du derme) via une
signalisation FGF.
***Figure 3-113. Les somites induisent via FGF10 la
formation de la placode (épaississement
épidermique) qui donne naissance à la glande
mammaire. (A) Expression de la β-galactosidase chez
les souris rapportrices de l’activité de la signalisation
Wnt (Topgal) à E10,5 montrant des cellules
répondant à Wnt dans l’ectoderme où se forme la
glande mammaire. (B) L’expression de Fgf10 dans les
somites est activée par les gènes Hox au bon endroit
sur l’axe antéro-postérieur. Fgf10 agit via Fgfr2b dans
l’ectoderme pour déclencher l’expression de Wnt10b
conduisant à la formation de la placode mammaire à
l’origine de la glande mammaire. (C) Expression de
l’ARNm de Fgf10 par hybridation in situ à E10.5
montrant l’expression de Fgf10 dans les somites. (D)
La différenciation progressive de l’épithélium dérivé
de l’ectoderme en glande mammaire, d’abord de
forme cuboïde (stade 30 somites) puis
cylindrique/cylindrique élargi (stade 40 somites)
pour former l’épithélium mammaire constituant la
placode (au stade 50 somites) est associée à une
augmentation de l’expression de Fgf10 dans les
somites en parallèle (colorations rose). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.00415/ful
l

Citons un autre exemple : la formation et le développement de la vésicule otique (dérivée de la placode

otique) qui est à l’origine de nombreuses structures de l’oreille interne :

168
 ***Figure 3-114. Induction de la placode otique et différenciation de la vésicule otique. FGF3, secrété par le cerveau
postérieur et FGF10, secrété par le mésenchyme de la tête, induisent ensemble la formation de la placode otique et
son développement en coupe otique et en vésicule otique. Après la formation de la vésicule otique, FGF20 agit sur
FGFR1 dans l’épithélium prosensoriel en tant que facteur autocrine permissif requis pour la différenciation des
cellules ciliées externes et des cellules de soutien externes dans l’organe de Corti (oreille interne). Source :
https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wdev.176

On peut citer aussi l'induction des hépatocytes et des futures cellules pulmonaires dans l'endoderme est
provoquée par des FGF produits par le mésoderme cardiaque (Shifley et al., 2012).

La morphogenèse de l’œil est aussi le fruit de signalisations croisées entre l’ectoderme (qui forme
le cristallin et la cornée) et le neurectoderme du cerveau antérieur (qui forme la rétine et
l’épithélium pigmenté rétinien).
*Figure 3-115. Morphogenèse de l’œil. D’après
Practical studies of animal development par Billett et
Wild, Ed. Willmer Brothers (1975)

La vésicule optique qui est une expansion du prosencéphale (cerveau antérieur) envoie des signaux
inducteurs vers l'épiderme qui va former la placode du cristallin : BMP4, FGF8 et Delta. L'épiderme avait
déjà été rendu compétent à ces signaux au préalable, dès la gastrulation. La placode du cristallin envoie en
retour des FGF qui activent la formation de la coupe optique, laquelle envoie en retour d'autres FGF qui
provoquent l'invagination de la placode. Il s'agit d'un exemple classique d'inductions réciproques
successives (Ogino et al., 2012). Signalons que les cellules du cristallin envoient aussi des signaux vers
l’épiderme sus-jacent resté à la surface pour y induire la formation de la cornée.

169
 **Figure 3-116. Inductions lors du développement de l'œil chez la souris. Rx, Pax6, Six3, Otx2 et Lhx2 sont exprimés
de manière homogène dans le neuroépithélium aux stades du sillon optique (A) et de la vésicule optique précoce
(OV) (A′). Les signaux inducteurs régionalisent l'OV (A′, A″). La région formant la lentille (ou le cristallin) de
l'ectoderme de surface (SE) exprime Pax6 et Six3 au stade du sillon optique (A). La signalisation BMP et FGF et
l'expression de Sox2 entraînent la formation de la placode du cristallin (A', A″). ANP = plaque neurale antérieure; LP
= placode du cristallin; OV = vésicule optique; pNR = précurseurs de la neurorétine; pOS = précurseurs du pédoncule
optique; pRPE = précurseurs de l'épithélium pigmenté rétinien; SE = ectoderme de surface. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/136/23/3895/43745/Lhx2-links-the-intrinsic-and-extrinsic-factors

Le mésenchyme céphalique intervient également en envoyant des signaux qui activent l'expression de Mitf
dans l'épithélium pigmenté rétinien. Mitf est un facteur de transcription (qui est aussi exprimé dans les
mélanocytes issus des crêtes neurales) et qui active la transcription des gènes codant les enzymes
permettant de synthétiser les mélanines. Le mésenchyme céphalique donne lui-même naissance à la
choroïde (en contact avec l'épithélium pigmenté rétinien) et à la sclérotique.
**Figure 3-117. Dérivés des placodes céphaliques (en couleurs,
les structures auxquelles elles contribuent). En gris, sont
représentés les flux de migration des cellules de crêtes neurales.
Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2020.608880/full

Les placodes olfactives ou nasales donnent notamment naissance aux neurones permettant l'olfaction dans
l'épithélium olfactif et dans l'organe voméro-nasal ainsi qu'aux neurones à GnRH qui vont ensuite migrer et
se localiser dans l'hypothalamus (Cho et al., 2019; Barbotin et al., 2017) et secréter la neurohormone GnRH
en direction de vaisseaux sanguins qui irriguent l'adénohypophyse ou hypophyse antérieure qui elle-même
dérive d'une autre placode, la placode adénohypophysaire. Ces neurones contrôlent alors la reproduction.
Ce lien entre olfaction est reproduction est retrouvé chez les patients du syndrome de Kallmann qui associe
anosmie et hypogonadisme.

EN DIRECT DES LABOS :

Les organoïdes : Des chercheurs du monde entier cherchent actuellement à différencier des cellules souches
en organoïdes, c'est-à-dire en organes produits in vitro, contenant plusieurs types cellulaires organisés et
fonctionnels. Ces organoïdes peuvent apporter de grandes avancées scientifiques fondamentales mais aussi
appliquées pour les thérapies cellulaires (qui deviendraient des thérapies tissulaires voire permettraient la
production de véritables greffons d'organes complets in vitro). Ils peuvent aussi constituer une alternative
partielle à l'expérimentation animale. Voir ce lien : https://youtu.be/bVo856H4fEk
170
Les étapes du développement embryonnaire d'Arabidopsis thaliana et leur contrôle

Introduction
Le développement embryonnaire d'Arabidopsis, a lieu dans la graine qui assure la dispersion de
l'espèce et la survie et la protection de l'embryon.

La double fécondation (caractéristique des Angiospermes) aboutit à deux zygotes : le premier

(diploïde, issu de la fusion d'un gamète mâle et de l'oosphère) donne l'embryon et le deuxième
(triploïde, issu de la fusion d'un gamète mâle et de deux noyaux secondaires du gamétophyte femelle
(= sac embryonnaire)) forme un tissu de réserve : l'albumen. Les réserves protéiques, lipidiques et
glucidiques y sont produites et stockées lors de la phase de maturation de la graine qui suit les
principales étapes du développement embryonnaire. La teneur en eau de la graine diminue ensuite
fortement. Cette dessiccation est un des facteurs de l’entrée en dormance de la graine et permet sa
conservation jusqu’à sa germination.

D'un point de vue évolutif, le développement d'un embryon diploïde correspond au développement d'un
sporophyte diploïde ce qui est une innovation des plantes terrestres ou Embryophytes. La présence de la
graine est une innovation des Spermatophytes (qui comprend les Gymnospermes et les Angiospermes).

Le développement embryonnaire d'Arabidopsis thaliana peut aussi s'observer par embryogenèse

somatique, à partir de cellules non issues directement de la fécondation et qui se dédifférencient. Bien qu'il
existe des différences entre l'embryogenèse somatique et l'embryogenèse "classique", on observe les
mêmes stades et de grandes similarités de mécanismes (Joshi et al., 2022).

**Figure 3-118. Embryogenèse somatique. Un explant est traité par des hormones végétales (PGR pour Plant Growth
Regulators) telles que l'auxine ou les cytokinines et mis en état de stress (mécanique, hydrique ou nutritionnel). Des
changements épigénétiques sont induits et les cellules se dédifférencient (changent notamment de morphologie et
le ratio noyau/cytoplasme augmente). Dans l'embryogenèse somatique indirecte, on laisse un cal de cellules en
prolifération se former tandis que dans l'embryogenèse somatique directe, l'embryogenèse commence tout de suite.
Les embryons somatiques passent par les mêmes stades (à gauche) que les embryons "normaux". Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.861556/full#B117

Quelque soit les modalités d'observation de l'embryogenèse, l'orientation des divisions cellulaires a une
importance cruciale car, du fait de la présence de la paroi, les cellules d'un organisme végétal ne
peuvent pas se déplacer. Elle est aussi importante tout comme la croissance cellulaire pour la mise
en place des deux axes principaux : apico-basal et l'axe radiaire.

171
Présentation générale des étapes

*Figure 3-119. Etapes clés du développement de l'embryon d'Arabidopsis thaliana. AC = cellule apicale ; BC = cellule
basale ; EP = embryon proprement dit ; S = suspenseur ; DS = suspenseur en dégénérescence. Attention, le stade
appelé 2-cell est parfois appelé stade 1 cellule car on ne tient compte que de la cellule apicale qui donne naissance à
(quasiment) tout l'embryon. La cellule basale donne naissance au suspenseur mais aussi à la cellule de l'hypophyse
(rouge) qui participe au méristème racinaire. Établissement du protoderme (vert), de l'hypophyse (rouge), du
méristème provasculaire (rose). La cellule en forme de lentille qui est le précurseur du centre de repos (QC) est en
bleu foncé. La cellule basale de l'hypophyse qui fera partie de la racine est en jaune. Le méristème apical de la racine
est en violet et le méristème apical caulinaire (MAC) est en vert foncé au stade torpedo. Aucune échelle commune n'a
été utilisée dans les dessins. Certains noyaux ne sont pas représentés. Source :
https://portlandpress.com/biochemj/article-pdf/477/19/3743/894729/bcj-2019-0161c.pdf

La première division asymétrique et ses conséquences

Le zygote s'allonge jusqu'à atteindre trois fois sa longueur initiale puis réalise une division
asymétrique qui donne naissance à une petite cellule apicale et à une grande cellule basale. Ensuite,
la cellule apicale donne naissance au proembryon et la cellule basale donne naissance
essentiellement à une structure extraembryonnaire : le suspenseur qui relie l'embryon en
développement au tissu maternel et qui facilite l'apport de nutriments à l'embryon. Le suspenseur
finit par être formé de 7 cellules chez Arabidopsis (mais il peut être composé de jusqu'à 200 cellules chez
certaines Fabacées). Une fois leurs tâches accomplies, les cellules du suspenseur meurent par
apoptose lors de la phase de maturation de la graine. La cellule basale donne néanmoins aussi
naissance à quelques cellules de l'embryon : l'hypophyse.

Cette croissance du zygote et cette première division asymétrique est sous le contrôle de la MAPKK (MAP
kinase kinase) YODA. Un gain-de-fonction de YODA aboutit à une élongation excessive du zygote et à un
suspenseur qui est trop grand (Lukowitz et al., 2004). L'activité de YODA est contrôlée par le récepteur
kinase ERECTA d'origine maternelle et par la protéine SSP (SHORT SUSPENSPOR) qui est traduite dans le
zygote à partir d'un ARNm produit dans le grain de pollen (Bayer et al., 2009; Wang et al., 2021).

172
 *Figure 3-120. YODA et SSP sont nécessaires pour une
bonne taille de la cellule basale qui donne naissance au
suspenseur. Vues en microscopie à contraste
interférentiel d'embryons d'Arabidopsis au stade 2
cellules (cellule apicale colorée artificiellement en jaune
et cellule basale colorée artificiellement en vert) chez
une souche sauvage (WT) ou mutée perte-de-fonction
dans le gène codant YODA (yda) ou SSP (ssp). La
longueur moyenne des cellules apicales (en jaune) et
basales (en vert) sont indiquées. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/science.11677
84

**Figure 3-121. YODA agit en aval des récepteurs de la famille ERECTA pour contrôler l'allongement du zygote et
donc la taille de l'embryon au stade 2 cellules. Vues en microscopie à contraste interférentiel d'embryons
d'Arabidopsis au stade 2 cellules (cellule apicale colorée artificiellement en jaune et cellule basale colorée
artificiellement en bleu) chez une souche sauvage (Col-0) ou mutante perte-de-fonction pour les gènes er et erl2
codant des membres de la famille des récepteurs kinases membranaires ERECTA ou deux lignées mutantes gain-de-
fonction pour YODA (YDApro:yda-CA(Col-0)) ou mutantes perte-de-fonction er et erl2 et en même temps gain-de-
fonction pour YODA (YDApro:yda-CA(er erl2)). On constate que la surexpression de YODA permet de compenser la
perte de fonction des récepteurs ERECTA indiquant que YODA agit en aval de ces récepteurs. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982221011374

La première division asymétrique du zygote jette les bases de la structuration apico-basale de

l'embryon. Les facteurs de transcription de la famille WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX (WOX) jouent un
rôle clé lors de cette étape. WOX8/STIMPY est exprimé dans le zygote, où un autre facteur de transcription,
WRKY2, régule son expression. Cette interaction WRKY2-WOX8 est nécessaire pour la distribution polaire
des organites cellulaires dans le zygote, créant la polarité zygotique nécessaire pour rendre la première
division asymétrique (Ueda et al. 2011). WOX2, co-exprimé avec WOX8 dans le zygote, s'exprime dans la
cellule apicale après la division zygotique asymétrique. Au cours de la suite de l'embryogenèse, WOX2 est
nécessaire pour mettre en place la région la plus apicale et notamment le développement du méristème
apical caulinaire (MAC). En revanche, WOX8 est exprimé dans la cellule basale avec son homologue le plus
proche WOX9/STIMPY-LIKE après la division zygotique, régulant la lignée cellulaire basale. Ils régulent
également l'embryon proprement dit en activant l'expression de WOX2 dans la région apicale (Breuninger
et al. 2008).

173
 *Figure 3-122. Contrôle de la première division asymétrique et du destin de la cellule apicale et de la cellule basale.
Dans le zygote, WRKY2 active l'expression de WOX8 pour favoriser la polarisation de la position du noyau (marron)
et des vacuoles (jaune clair) et la division asymétrique du zygote. Dans l'embryon asymétrique à 2 cellules qui en
résulte, WRKY2-WOX8/9 régule de manière non autonome le développement de l'embryon proprement dit en
activant l'expression de WOX2 (vert) dans la région apicale. Source :
https://link.springer.com/article/10.1007/s00425-022-03870-x

Signalons que l'expression de WOX8 dans la cellule basale puis dans le suspenseur est maintenue par des
peptides provenant de l'albumen comme ESF1 (pour EMBRYO SURROUNDING FACTOR1), ce qui montre
que les tissus extra-embryonnaires ont une influence sur le développement de l'embryon (Costa et al.,
2014).

La cellule apicale subit trois mitoses et forme une structure sphérique appelée embryon octant. Le
développement de la moitié supérieure de cet embryon produit la partie aérienne de la plantule
tandis que la partie inférieure se différencie en hypocotyle et radicule.

L’auxine est produite par l’embryon dans sa région apicale mais provient également du tégument de l'ovule
(donc d'origine maternelle) et est transportée via le suspenseur vers l'embryon (Robert et al., 2018). Avec
l'auxine, ce n'est pas tant la zone de production qui est importante mais son transport et son
accumulation. Ce sont deux paramètres dynamiques essentiels au cours du développement des
plantes. L’auxine migre via des transporteurs spécifiques (transporteurs PIN) jusqu’à la partie
supérieure du suspenseur appelé hypophyse, dans laquelle elle s’accumule lors du stade globulaire.
Cette migration contribue à la formation de la polarité apico-basale qui est responsable de la mise
en place du méristème apical caulinaire. La mutation dans les transporteurs de l’auxine (Tanaka et
al., 2006) conduit à la formation d’un embryon anormal.

L’inactivation du récepteur ABP1 (Auxin Binding Protein) provoque un arrêt du développement de

l’embryon après le stade globulaire car les cellules ne peuvent pas s’allonger (Chen et al., 2001). La mutation
perte-de-fonction de MONOPTEROS aboutit à la disparition d'une grande partie de la région basale.
MONOPTEROS code le facteur de transcription ARF5 dont l'activité dépend de l'auxine (Hardtke et Berleth,
1998). Il se fixe sur des séquences spécifiques devant les gènes dont l'expression est activée par l'auxine,
les AuxRE (pour Auxin Response Element). MONOPTEROS/ARF5 est aussi impliqué dans la formation des
premiers vaisseaux (Weijers et al., 2006). L'auxine joue également un rôle dans le positionnement du plan
de clivage lors des divisions cellulaires. Elle le fait en contrôlant l'expression de IQD6, une protéine associée
aux microtubules et qui contrôle leur dynamique (Vaddepalli et al., 2021).

La signalisation activée par l'auxine interfère avec la signalisation activée par les cytokinines. Par exemple,
dans la région basale qui va former le méristème racinaire, l'auxine active l'expression de ARR7 et de ARR15
qui sont des inhibiteurs de la voie de signalisation des cytokinines. L'absence de cette régulation aboutit à
des défauts majeurs dans la région racinaire (Müller et Sheen, 2008).

174
 **Figure 3-123. Signalisation cytokinine et auxine dans la région du futur méristème racinaire. Les plants
transgéniques expriment la GFP sous le contrôle d'un promoteur répondant à la signalisation activée par les
cytokinines (TCS) : TCS∷GFP au stade globulaire précoce (b) et diminution de l'expression du gène rapporteur au
stade globulaire tardif (c). Cela correspond au pic d'expression de ARR7∷GFP (e), et de ARR15∷GFP (f). L'activité
DR5∷GFP qui est activée par la signalisation de l'auxine y est la plus élevée (f). Une vue agrandie de l'encadré est
présentée. hy = hypophyse; s = suspenseur; lsc = cellule en forme de lentille à l'origine du centre quiescent (voir plus
loin); bc = cellule basale. Source : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18463635/

L'embryon au stade cœur

Au stade cœur, on considère que la plupart des futurs tissus de la plante sont spécifiés. La symétrie
bilatérale se matérialise par le développement des 2 cotylédons. Le méristème apical caulinaire est
mis en place entre les 2 cotylédons. La partie médiane de l'embryon s'appelle l'hypocotyle et la
partie basale donne naissance au méristème racinaire.

*Figure 3-124. Expression de gènes marqueurs de différents territoires dans l'embryon de stade cœur. (C) Embryon
transgénique DR5V2 où l'expression de la protéine fluorescente est sous le contrôle de l'auxine (on observe les
régions qui répondent à l'auxine. Notez la forte expression dans le méristème racinaire). (E) Embryon transgénique
pPLT1::PLT1-YFP avec la YFP fusionnée à PLETHORA 1 dans son domaine d'expression qui correspond au méristème
racinaire. (G) Embryon transgénique pTMO5::3xGFP qui exprime la GFP dans les futures cellules vasculaires. (I)
Embryon transgénique pSCR::SCR-GFP qui exprime la GFP fusionné à SCARECROW dans l'endoderme. (K) Embryon
transgénique pWOX5-dsRED qui marque les cellules dérivées de la cellule basale (le suspenseur et un groupe de
cellules dans la racine appelé hypophyse). (M) Embryon transgénique pCLV3::GFP qui marque les cellules souches
du méristème apical caulinaire. (O) Embryon transgénique pWUS::dsRED qui marque les cellules du centre
organisateur du méristème apical caulinaire. Barre d'échelle = 20 µm. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580721004822

En parallèle, l’albumen se développe : il est tout d’abord syncitial

au début de l’embryogenèse puis cellularisé à partir du développement des cotylédons au stade cœur. Il est
totalement cellularisé au stade torpille. Il régresse ensuite par apoptose et ses réserves sont
progressivement absorbées par les cotylédons lors de leur croissance.

Au stade cœur, l'intense prolifération dans l'embryon qui avait lieu jusque-là diminue, sauf dans les
méristèmes. Les croissances cellulaires deviennent plus fréquentes. Les protéines ABSCISIC ACID
INSENSITIVE 3 (ABI3), FUSCA 3 (FUS3) et LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2), nommées collectivement AFL, ainsi
175
que LEAFY COTYLEDON 1 (LEC1) sont impliquées dans cette transition. La transcription des gènes codant
ces protéines est réprimée par les facteurs E2F qui sont impliqués dans la progression G1/S du cycle
cellulaire (Leviczky et al., 2019).

C'est au stade cœur que le gène FACKEL commence à être exprimé dans des régions précises de l'embryon.
Chez les mutants perte-de-fonction, l'élongation des cellules se fait mal ainsi que l'orientation des divisions
aboutissant à un hypocotyle absent, ce qui amène les cotylédons à être attachés directement à la radicule.

*Figure 3-125. Hybridation in situ avec une sonde

reconnaissant l'ARNm de FACKEL dans un embryon de
stade cœur d'Arabidopsis. La révélation apporte une
couleur rouge/brun. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC316688/

Le gène FACKEL code une stérol-C14-réductase (Schrick et al., 2000).

Les futures cellules de l'épiderme sont alors déterminées : elles donneront plus tard soit des cellules
épidermiques "classiques", soit des cellules de garde des stomates, soit des trichomes. Elles se divisent de
manière péricline (plan de division parallèle à la surface du tissu). Les cellules de l'épiderme sont
déterminées avec notamment l'activation de l'expression d'ARABIDOPSIS THALIANA MERISTEM L1
LAYER (ATML1) (Iida et al., 2019).
*Figure 3-126. Le gène codant ATML1 est
spécifiquement exprimé dans les futures cellules de
l'épiderme dans l'embryon au stade cœur. On observe en
microscopie à fluorescence un embryon au stade cœur
qui est transgénique avec la séquence codante (répétée
3 fois) de la GFP sous le contrôle du promoteur de
ATML1. Barre d'échelle = 10 µm. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/4/dev169300/48989/ATML1-activity-is-restricted-to-the-outermost

L'expression ectopique d'ATML1 dans des cellules plus internes suffit à donner à ces cellules des caractères
épidermiques montrant le rôle instructeur de ce gène pour le destin des cellules (Takada et al., 2013).

Mise en place du MAC et des cotylédons

C'est au stade globulaire que la partie apicale de l'embryon se divise en 3 : la région qui va donner le MAC,
la région qui va donner les cotylédons et la région entre les deux. Le développement initial de cette région
apicale dépend du produit du gène Gurke. Les mutants perte-de-fonction de ce gène ont un défaut important
des régions apicales, avec la présence de cotylédons rudimentaires pour les allèles les moins sévères.

176
 *Figure 3-127. La fonction de Gurke est nécessaire pour le développement de la région apicale d'Arabidopsis. A =
plantule sauvage; B = plantule du même âge avec une mutation perte-de-fonction complète de Gurke; C = plantule du
même âge avec une mutation perte-de-fonction partielle de Gurke. Source :
https://academic.oup.com/pcp/article/45/9/1122/1857702

Gurken correspond au gène ACC1 qui code une acétyl-coA carboxylase qui catalyse la synthèse de malonyl-
coA à partir d'acétyl-coA et de bicarbonate (Baud et al., 2004). On ne comprend pas encore bien par quel
relais cette voie métabolique aboutit à mettre en place toute la structure apicale de l'embryon.

**Figure 3-128. Patrons d'expression des gènes à l'origine du développement du méristème apical caulinaire (MAC).
(A) Embryon globulaire. Le gène AtML1 spécifique de l'épiderme est exprimé à la fois dans la région centrale et dans
la région apicale (jaune ; non représenté en B et C). La flèche blanche indique un signal de la région centrale dans le
positionnement de l'ébauche du MAC. (B) Embryon au stade de transition affichant essentiellement le même schéma
d'expression que l'embryon globulaire. (C) Extrémité supérieure de l'embryon au stade cœur. Les domaines
d'expression des gènes de structuration racinaire, SCR et SHR, et de ZLL/PNH ne sont pas représentés. Dans l'ébauche
du MAC, les domaines d'expression de CLV3 et CLV1 se chevauchent. Notez les domaines d'expression génique
adaxial (REV) et abaxial (FIL, YAB3) dans les ébauches de cotylédons. REV est également exprimé dans l'ébauche
vasculaire. Source : https://www.embopress.org/doi/full/10.1093/emboj/20.14.3609

Bien qu'il soit exprimé très tôt, WUS n'est pas indispensable à la mise en place des cellules souches
du méristème (il ne deviendra primordial que dans un deuxième temps, pour leur maintien). C'est
le facteur de transcription WOX2 qui joue, en revanche, un rôle essentiel pour la première étape. Il
permet d'obtenir le bon ratio cytokinine/auxine dans le méristème (en augmentant la
concentration de cytokinines et en diminuant la concentration d'auxine) nécessaire à la mise en
place du méristème (Zhang et al., 2017). Les relais de WOX2 dans sa fonction sont les facteurs de
transcription homéodomaine-leucine zipper de classe III (HD-ZIP III).

Les facteurs de transcription homéodomaine-leucine zipper de classe III (HD-ZIP III) favorisent la mise en
place du MAC en aval de WOX2 (Zhang et al., 2017). Leur activité est régulée négativement par les
microARNs miR165 et miR166 en complexe avec la protéine AGO1 et qui clivent les ARNm HD-ZIP III
(Byrne, 2006). AGO1 lie également miR168 pour cliver son propre ARNm, garantissant des niveaux
d'expression corrects d'AGO1. La perturbation de cette régulation par rétroaction négative entraîne une

177
augmentation des niveaux d'AGO1 qui provoque des défauts phénotypiques pléiotropes, notamment la
disparition du MAC (Vaucheret et al., 2004). Au cours du développement, la protéine ZLL empêche l'action
de miR165 et miR166 dans une large zone centrale de l'embryon, permettant au MAC de se mettre en place
par l'action des facteurs HD-ZIPIII.

**Figure 3-129. Fonction de AGO1, ZLL et miR165/166 au cours de l'embryogenèse. La protéine ZLL séquestre
miR165/166 et les empêche d'interagir avec AGO1, permettant ainsi l'accumulation d'ARNm HD-ZIPIII dans la
région du MAC et la mise en place puis le maintien des cellules souches (exprimant CLV3). Dans l'embryon mutant
perte-de-fonction zll (à droite), des niveaux plus élevés de miR165/166 peuvent se lier à AGO1, entraînant une
réduction des niveaux de transcription HD-ZIPIII et la disparition du méristème par extinction de l'expression de
CLV3. Les domaines d'expression génique sont indiqués. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2011.00093/full

Les mutations de perte de fonction dans le gène SHOOTMERISTEMLESS (STM), qui code un facteur de
transcription à homéodomaine de la classe KNOTTED entraînent également un défaut de maintien du
MAC. Les cellules de l'apex des embryons mutants stm se différencient au lieu de rester à l'état de
cellule souche (Endrizzi et al., 1996). De plus, les mutants stm présentent une fusion des pétioles des
cotylédons. La répression de la différenciation par STM dans le MAC se produit principalement via la
répression du gène ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) puisque la perte-de-fonction de AS1 dans un fond mutant
stm sauve la formation de MAC (Byrne et al., 2000). L'ARNm de STM est exprimé dans l'ébauche du MAC à
partir du stade embryonnaire globulaire, et l'expression post-embryonnaire se trouve dans tout le MAC,
mais est exclue des ébauches d'organes naissants (Long et al., 1996).

Pour mettre en place la boucle de rétroaction WUSCHEL-CLAVATA qui est essentielle pour le maintien des
cellules souches (voir le chapitre sur le MAC), les cellules souches doivent devenir compétentes à répondre
au signal de WUSCHEL. Cette compétence est acquise grâce à l'action du microARN miR-394 qui bloque la
production de LEAF CURLING RESPONSIVENESS (LCR) qui inhibe l'action de WUS dans les cellules souches
(Knauer et al., 2013).
**Figure 3-130. Rôle de miR-394 dans la régulation des
cellules souches. Les miR-394 (points noirs) produits par
le protoderme (encadrées en vert) répriment la
production de LCR dans les cellules sous-jacentes, ce qui
permet à WUS de réguler l'identité des cellules souches
et l'expression de CLV3. Couleur bleue = cellules souches.
Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580712005837

178
Par rapport aux feuilles ordinaires, les cotylédons présentent de grandes différences dans la morphologie
et les patrons d'expression des gènes. Lorsque LEC2 (Leafy Cotyledon-2) est muté, les cotylédons subissent
certains changements, notamment prennent une forme arrondie et développent des et protubérances
anormales à leur surface. Les cotylédons mutants produisent des trichomes caractéristiques des feuilles,
indiquant que LEC2 est important pour le maintien des caractéristiques des cotylédons au début de
l'embryogenèse (Meinke, 1992).

Les cotylédons de certaines Angiospermes (comme les haricots) peuvent accumuler de grandes
quantités de réserve.

Mise en place du méristème apical racinaire et quelques aspects du développement de l'appareil racinaire
Les racines d'Arabidopsis se développent à partir du méristème apical racinaire où se trouvent des
cellules souches. Chez Arabidopsis, entre 4 et 8 de ces cellules souches forment le centre quiescent.
Elles se divisent très lentement et alimentent et maintiennent une population plus grande de
précurseurs qui prolifèrent. Quand les précurseurs sont poussés trop loin de la région apicale, ils
s'agrandissent puis se différencient. De l'intérieur vers l'extérieur, les tissus cellulaires racinaires
suivants se développent : système vasculaire, péricycle, endoderme, cortex et épiderme et il faut ajouter la
coiffe racinaire (divisée en columelle médiane columelle et coiffe racinaire latérale) à l'extrémité distale de
la racine.
*Figure 3-131. Principales régions d'une racine
d'Angiosperme. Les cellules souches à l'extrémité de la
racine produisent de manière asymétrique des cellules
filles qui se divisent ensuite plusieurs fois pour générer
des colonnes cellulaires, qui acquièrent des identités
tissulaires distinctes en fonction de leur position. Les
cellules de la coiffe racinaire à l'extrémité de la racine
protègent les cellules souches et elles sont sensibles à la
gravité et aux propriétés physicochimiques du sol,
informations qu'elles transmettent aux régions en
arrière.
D'après https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/2-organos-
v/guiada_o_v_raiz.php

*Figure 3-132. Méristème racinaire d'Arabidopsis. Les

cellules QC (rouges), des cellules souches pluripotentes
à faible activité mitotique, maintiennent les cellules
souches environnantes (initiales) qui sont plus actives
mitotiquement, représentées avec des parois surlignées
en noir, construisant ensemble la niche des cellules
souches racinaires. Les différents types de cellules sont
codés par couleur. QC = centre quiescent (rouge) ;
CSC = cellules souches de la coiffe (jaune) ; CC = cellules
de la columelle, partie de la coiffe qui est sensible à la
gravité (vert) ; LRC = coiffe latérale (violet clair) ;
ep = épiderme (violet); c = cortex (turquoise clair);
en = endoderme (turquoise foncé); turquoise
vif = initiales du cortex/endoderme ; violet
foncé = épiderme/initiales de la coiffe latérale ; orange
foncé = initiales de la stèle (ou cylindre central qui
contiendra les tissus conducteurs) ; stèle ou cylindre
central = orange clair ; points gris = granulés d'amidon.
Source :
https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202154105

179
Les cellules de la coiffe racinaire sont déjà présentes chez l'embryon et possèdent même une cuticule. Elles
ont déjà un rôle protecteur des cellules du méristème racinaire (Berhin et al., 2019) ainsi qu'un rôle dans le
gravitropisme.
*Figure 3-133. Participation de l'hypophyse
(appartenant au suspenseur) au méristème racinaire. La
cellule du suspenseur la plus proche du proembryon est
l'hypophyse. Elle subit une division asymétrique,
donnant naissance à une cellule en forme de lentille
(violet) qui donne naissance au centre quiescent (QC) et
à la cellules fille basale (bleu ciel) qui donne naissance
aux cellules columellaires dans la coiffe. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaa0196

L'accumulation localisée d'auxine agit comme un signal de position pour la localisation des cellules
souches racinaires. L'auxine est produite par le proembryon et elle est transportée de manière polarisée
dans le tissu provasculaire vers la région basale de l'embryon. Cela entraîne la formation d'un maximum de
réponse à l'auxine dans les cellules voisines du suspenseur, et la cellule du suspenseur la plus proche prend
un destin hypophysaire (Weijers et al., 2006). Cette cellule hypophysaire active l'expression du gène NO
TRANSMITTING TRACT (NTT) (Crawford et al., 2015) puis se divise et la cellule fille en forme de lentille de
l'hypophyse donne ensuite naissance au centre quiescent (QC). Les gènes SHORT-ROOT (SHR), SCARECROW
(SCR) et WOX5 jouent aussi un rôle crucial dans l'acquisition de l'identité QC. L'expression des gènes SHR et
SCR est sous le contrôle des produits des gènes PLETHORA1 (PLT1) et PLETHORA2 (PLT2) (Aida et al., 2004).
L'expression ectopique des gènes PLT dans l'embryon entraîne la présence ectopique de QC et des cellules
souches racinaires associées. L'expression des gènes PLT est activée par de fortes concentrations d'auxine
ce qui permet d'impliquer l'auxine une deuxième fois, plus directement, dans la formation des cellules QC.

***Figure 3-134. Réseau de régulation génique activé par l'auxine lors de la mise en place du méristème racinaire
(A) L'ontogenèse du méristème racinaire au cours de l'embryogenèse. Les types de cellules et les tissus sont marqués
de différentes couleurs. Notez que l'hypophyse est spécialisée et divisée en un centre quiescent (QC) et une columelle
par une division péricline au stade globulaire précoce. (B) Les flèches pleines indiquent une régulation positive
directe ; les flèches pointillées indiquent une régulation positive indirecte ou multi-étapes ; les symboles en forme
de T indiquent une régulation négative. Sur ce schéma, il faudrait ajouter que PLT active l'expression de SHR et de

180
 SCR. Abréviations : ER, racines embryonnaires ; IAA, auxine/acide indole-3-acétique; CYCD, cycline D; RbR, protéine
apparentée au rétinoblastome. Source : https://www.mdpi.com/1422-0067/22/21/11357/htm

La signalisation activée par l'auxine interfère avec la signalisation activée par les cytokinines. Par exemple,
dans la région basale qui va former le méristème racinaire, l'auxine active l'expression de ARR7 et de ARR15
qui sont des inhibiteurs de la voie de signalisation des cytokinines. L'absence de cette régulation aboutit à
des défauts majeurs dans la région racinaire (Müller et Sheen, 2008) (Voir Figure 3-123).

Les cytokinines qui agissent autour du méristème racinaire restreignent également à leur tour la
signalisation auxine. Les cytokinines sont perçues par le récepteur AHK3 et le signal est transduit par
régulateurs ARR1 et ARR12, ce qui active directement la transcription du répresseur IAA3/SHORT
HYPOCOTYL 2 (SHY2), qui entraîne l'atténuation des réponses à l'auxine et diminue l'expression des
transporteurs PIN (à la fois au niveau de la transcription de leurs gènes et par stimulation de leur
endocytose et de leur dégradation), restreignant le transport de l'auxine (Dello Ioio et al., 2008; Ruzicka et
al, 2009). Ainsi, la balance auxine/cytokinines régule la mise en place du méristème apical racinaire et
régule le nombre de cellules souches avec l'auxine en faveur du méristème et les cytokinines en opposition,
car elles favorisent la différenciation.

L'acide abscissique renforce l'action des cytokinines car ses voies de signalisation aboutissent à augmenter
l'activité du facteur de transcription ABI4 qui inhibe également l'expression de PIN1 (Shkolnik-Inbar et al.,
2011).

L'activité des cytokinines, qui favorise la différenciation est atténuée grâce aux gibbérellines dont le niveau
est élevé dans les jeunes méristèmes racinaires.
Les gibbérellines répriment l'expression de ARR1 ce qui s'accompagne d'une baisse de la transcription de
IAA3/SHY2. En conséquence, la signalisation de l'auxine est libérée de la répression de IAA3/SHY2, avec
l'augmentation l'expression des gènes PIN, et donc des niveaux d'auxine dans le méristème (Moubayidin et
al., 2010)

Le contact entre les cellules QC et les autres cellules souches est essentielle à leur maintien. Cela est dû au
fait que WOX5 produit par les cellules du QC doit pouvoir diffuser par plasmodesmes vers les autres cellules
souches. Il y inhibe l'expression de CDF4 qui stimule la différenciation (Pi et al., 2015).
**Figure 3-136. WOX5 produit par les cellules QC empêche
la différenciation des cellules souches voisines en inhibant
l'expression de CDF4. La protéine WOX5 se déplace des
cellules QC vers les cellules souches de la columelle, où elle
réprime directement le gène codant le facteur de
transcription CDF4. Cela crée un gradient de CDF4, qui
favorise la différenciation opposée au gradient WOX5 qui
empêche la différenciation. Lorsque les cellules filles
s'éloignent des cellules QC, WOX5 ne peut pas y diffuser et
CDF4 stimule leur différenciation. WOX5 réprime la
transcription de CDF4 en recrutant des co-répresseurs
TPL/TPR et l'histone désacétylase HDA19, qui induit la
désacétylation des histones au niveau de la région
régulatrice de CDF4. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580715002889

A l'arrière, certaines cellules sont spécifiées en cellules pro-vasculaires qui vont générer soit le phloème,
soit le xylème. CLE45 est un peptide qui peut se lier au récepteur BAM3 et qui maintient les cellules du
protophloème dans un état prolifératif. Ce n'est que lorsque ce signal est inhibé par le produit du gène
OCTOPUS (OPS) que les cellules du protophloème peuvent se différencier en éléments vasculaires (Breda et
al., 2019).

181
Contrôle de la taille de l'embryon et de la graine
Le contrôle de la taille des graines implique des interactions complexes entre l'embryon et l'albumen, le
tégument d'origine maternelle et la plante mère. Chez le mutant perte-de-fonction megaintegumenta (mnt),
la taille et le poids des graines sont considérablement augmentés, avec un albumen et un embryon plus gros.

**Figure 3-137. Taille plus importante de l'embryon et de la graine chez les mutants mnt. Comparaison de graines
clarifiées vues par microscopie à contraste de phase d'Arabidopsis sauvages (A-E) et mutants perte-de-fonction mtn
(F-J) aux mêmes stades. Barre d'échelle = 100 µm. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/133/2/251/43168/The-AUXIN-RESPONSE-FACTOR-2-gene-of-Arabidopsis

Il existe une série de divisions cellulaires supplémentaires dans le tégument de l'ovule avant même la
fécondation et dans les embryons mutants mnt (un effet maternel dans le premier cas et un effet zygotique
pour le second). mnt a été identifié comme un allèle mutant du facteur de réponse à l'auxine ARF2, un
membre d'une famille de facteurs de transcription qui interviennent dans l'expression des gènes en réponse
à l'auxine (Schruff et al., 2006). L'auxine via ARF2 est donc un répresseur de la division cellulaire. Cet
exemple illustre également l'importance de la croissance de l'ovule avant la fécondation pour déterminer la
taille finale de la graine. Le fait que l'albumen soit lui aussi plus volumineux est un effet secondaire
d'ajustement à un tégument plus grand (qui permet sans doute d'absorber plus de nutriments à partir de
l'organisme maternel).

Le développement des plastes

Les proplastes sont toujours issus du gamétophyte femelle (hérédité cytoplasmique maternelle)
chez Arabidopsis (chez certains Angiospermes il y a une origine mixte (passiflore par exemple) et chez les
Gymnospermes, c'est une origine paternelle). Au cours du développement embryonnaire, les
proplastes se différencient en chloroplastes à partir du stade globulaire, puis, après cette phase
transitoire, ils se différencient en plastes de stockage, les eoplastes ou élaïoplastes (Allorent et al.,
2013 ; Liebers et al., 2017). A la germination, ces plastes redeviennent des chloroplastes sauf à
l'obscurité où ils deviennent des étioplastes dans le cadre d'une morphogenèse particulière appelée
skotomorphogenèse (caractérisée par des cotylédons repliés, un crochet apical, des tiges allongées, des
racines courtes et un manque de chlorophylle et d'anthocyanes). De nombreux gènes plastidiaux sont
essentiels au développement précoce des plantes et les mutations entraînent souvent la létalité des
embryons (Ajjawi et al., 2010 ; Bryant et al., 2011).

182
 *Figure 3-138. Transitions entre les différents types de plastes au cours du cycle de vie de la plante. Des étapes
importantes dans le développement des tissus d'un angiosperme depuis la fécondation jusqu'au développement des
fleurs sont représentées en utilisant le cycle de vie d'Arabidopsis thaliana. La partie interne (fond gris) indique les
principaux types de plastes résidant dans les tissus du stade de développement correspondant. Les flèches indiquent
le type et la direction de transition entre ces types de plastes. L'encart représentant une coupe transversale à travers
un méristème apical caulinaire avec ses différents stades de développement du chloroplaste a été adapté de Charuvi
et al., 2012. L1 - L3 représentent différentes couches cellulaires du méristème apical caulinaire contenant des
chloroplastes avec différents degrés de développement de la membrane thylakoïde. Les changements dans l'appareil
ou l'activité transcriptionnelle des plastides qui se produisent pendant ces transitions sont indiqués par les symboles
NEP (pour Nuclear Encoded RNA Polymerase) et PEP (pour Plastid Encoded RNA Polymerase). La taille des lettres
représente les activités relatives des deux types d'ARN polymérases (nucléaires ou plastidiques) dans le type de
plaste respectif. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2017.00023/full

La vie de la graine
L'embryon se développe dans un contexte particulier : celui de la graine. L'embryon côtoie un tissu
de réserve (l'albumen), le tout enveloppé dans des téguments protecteurs (issus du tégument de
l'ovule). Le micropyle correspond à une cicatrice due au détachement de la graine à ce qui la retenait à
l'ovaire (le funiculus).
*Figure 3-139. La graine d'Arabidopsis thaliana en
dormance. L'albumen micropylaire correspond à une
région particulière qui sécrétera des enzymes lytiques
du tégument de la graine lors de la germination. Source :
http://www.seedbiology.de/html2/pcp06-fig2.html

183
Durant la première phase de son développement, la graine accumule des réserves (chez Arabidopsis, 35%
du poids sec sont des réserves lipidiques, 30% des réserves protéiques et 2% des réserves glucidiques).
Puis il y a déshydratation (avec une perte de plus de 90% de l'eau). Le métabolisme diminue drastiquement
permettant une survie longue de l'embryon dans des conditions défavorables. Le tégument de la graine se
durcit et devient une véritable enveloppe protectrice. La graine entre en dormance, une forme de vie
ralentie qui n'est pas levée simplement par un retour temporaire de bonnes conditions de
germination.
*Figure 3-140. Réserves dans la graine d'Arabidopsis
thaliana en fonction des jours après la fécondation
(DAF). On observe que les protéines s'accumulent
progressivement de manière linéaire alors que les
réserves lipidiques s'accumulent entre les jours 10 et 20
de manière plus marquée. Source :
https://academic.oup.com/plcell/article/14/6/1191/6009758

L'acide abscissique (ABA) s'accumule dans les embryons en maturation et régule de multiples
aspects de la maturation des graines, notamment l'accumulation de réserves de stockage, la
maturation des graines et la dormance des graines (Santos-Mendoza et al., 2008 ; Kanno et al., 2010).
ABI3 fonctionne en partie en aval de la signalisation ABA dans la maturation des graines, et l'insensibilité à
l'ABA chez les mutants perte de fonction abi3 se manifeste par une dormance réduite des graines et une
intolérance à la dessiccation (Santos-Mendoza et al., 2008 ; Tian et al., 2020).
**Figure 3-141. Gènes en aval de ABI3 impliqués dans le
développement de la graine. Source :
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tpj.14854

Une analyse QTL (quantitative trait locus) sur les variations de dormance entre différentes graines
d'Arabidopsis a permis de dégager le rôle important du produit du gène DOG1 (pour DELAY OF
GERMINATION 1) pour l'induction et le maintien de la dormance (Bentsink et al., 2006). La protéine DOG1
se lie à un hème et favorise l'activité d'ABI5 qui est contrôlé aussi par l'ABA et qui favorise la dormance et
DOG1 inhibe aussi les protéines AHG1 et AHG3 qui stimulent la sortie de dormance (Carrillo-Barral et al.,
2020).

184
 **Figure 3-142. Rôles coordonnés de DOG1 et de l'ABA
sur l'entrée et le maintien en dormance et l'inhibition de
la sortie de dormance. Source :
https://www.mdpi.com/2223-7747/9/4/480/htm

L'hormone acide gibbérellique (GA) est considérée comme un antagoniste de l'ABA pour le contrôle
de la germination des graines. En effet, si on inhibe la synthèse de GA dans les graines non dormantes,
cela bloque la germination en favorisant l'accumulation de facteurs DELLA tels que RGL2, qui parmi les cinq
facteurs DELLA d'Arabidopsis joue un rôle majeur dans la répression de la germination (Lee et al., 2002).
Les graines mutantes dépourvues de facteurs DELLA sont complètement non dormantes, même lorsqu'elles
sont placées à des températures fraîches (Kendall et al., 2011).

Le tégument de la graine joue également un rôle. En effet, la couche interne du tégument 1 accumule des
proanthocyanidines un type de tanin flavonoïde, et les mutants transparents testa (tt), déficients en
synthèse de proanthocyanidines, ont une faible dormance. Les tanins sont des antioxydants et leur absence
dans le tégument favorise probablement la libération de la dormance en accélérant l'oxydation des graines
ou en augmentant la perméabilité des graines à l'oxygène. En conséquence, les graines mutantes tt ont des
graines avec une faible viabilité des graines en plus d'une faible dormance (Debeaujon et al., 2000).

Le réveil de la graine et la continuation du développement de la plantule s'appelle la germination.

Elle est contrôlée par l'humidité, la température et la photopériode.

La première structure à émerger de la graine lors de la germination est la racine primaire (ou radicule).

Voir la vidéo : https://youtu.be/zICRjcGoPHM

185
PARTIE 4

Contrôles génétique et épigénétique du

développement

186
Contrôle de la transcription

Présentation générale
La transcription désigne la production d'ARN en prenant comme matrice une séquence d'ADN. Les
ARN produits peuvent être ensuite traduits en protéines ou non.
*Figure 4-1. Du gène aux ARNs et aux protéines. La
transcription permet de produire des ARN à partir
de séquences spécifiques d'ADN. Seule une partie
des ARN, les ARNm, sont ensuite traduits en
protéines.

Le contrôle de la transcription fait intervenir non seulement des séquences d'ADN régulatrices mais
aussi des modifications de cette séquence non codées avec les nucléotides habituels (A, T, C, G) ainsi
que l'état de la chromatine, qui désigne le complexe que l'ADN forme avec des protéines, notamment
les histones. Cela correspond au contrôle dit épigénétique de la transcription.

La transcription démarre par l’ouverture d’une partie de la double hélice d’ADN et son dépliement.
Ensuite, un des brins sert de matrice pour la synthèse de l’ARN. Celle-ci s'effectue en présence d'une
enzyme spécifique, l'ARN polymérase, qui est ADN-dépendante (mais ne nécessite pas d'amorce
contrairement à l'ADN polymérase qui réalise la réplication). L'ARN polymérase catalyse la
formation de liaisons phosphodiester en présence de ribonucléotides 5’-triphosphate (ATP, GTP,
CTP et UTP). La polymérase progresse sur le brin d’ADN matrice et catalyse la synthèse du transcrit
dans la direction 5’ à 3’ en ajoutant des nucléotides à l’extrémité 3’. La séquence du transcrit est
complémentaire à celle du brin d’ADN qui lui a servi de matrice. Le brin dit codant de l'ADN est celui
qui a la séquence identique à celui de l'ARN (les T étant juste remplacés par des U dans l'ARN) mais
ce terme est trompeur car il est complémentaire du brin matrice qui est bien celui qui dirige la
synthèse de l'ARN.

*Figure 4-2. Sens de la transcription et nomenclature des brins. L'ARN est synthétisé de 5' en 3' par l'ARN polymérase
qui lit le brin antisens (matrice, en bas) dans le sens anti-parallèle 3' vers 5'. La séquence d'ARN est complémentaire
à la séquence du brin codant. Le brin codant (en haut) est le brin complémentaire du brin matrice et possède la même
séquence que l'ARN transcrit (les T étant juste remplacés par des U dans l'ARN) et possède la même orientation 5'
vers 3'. Source : https://planet-vie.ens.fr/thematiques/cellules-et-molecules/physiologie-cellulaire/la-transcription-chez-les-eucaryotes

Les Métazoaires ont trois ARN polymérases localisées dans le noyau et qui assurent la synthèse des
différents ARN. Ces polymérases fonctionnent en association avec des protéines spécifiques, les
facteurs de transcription (FT) généraux. L’ARN polymérase I synthétise le pré-ARNr. L’ARN
polymérase II transcrit les précurseurs des ARNm, les microARN et la plupart des petits ARN
nucléaires et c’est celle qui nous intéressera le plus dans le cadre de cet ouvrage. L’ARN polymérase
III produit les ARNt, l'ARNr 5S, une faible fraction des ARN nucléaires et l'ARN 7S impliqué dans la

187
reconnaissance du peptide signal en relation avec la traduction liée au réticulum endoplasmique
granuleux. Enfin, il existe une ARN polymérase IV chez les plantes qui synthétise des siARN (petits ARN
interférents) qui ont un rôle de protection antiviral et qui sont aussi impliqués dans la méthylation de l'ADN
guidée par des ARN (un processus nécessaire pour le silençage des transposons, la stabilité du génome, le
maintien de l'identité cellulaire et la défense contre les génomes exogènes (Zhang et al. 2013)).

La transcription par chacune de ces polymérases implique trois étapes :

1. la reconnaissance de séquences spécifiques sur l’ADN (dans le promoteur ou les enhancers)

2. l’assemblage d’un complexe protéique d’initiation au point de départ de la transcription,

3. l’élongation, c’est-à-dire la synthèse de l’ARN qui s’achève par la terminaison.

En allant plus dans le détail, pour qu’un gène soit transcrit à un niveau important, plusieurs
éléments doivent être réunis :

• un ou plusieurs FT associés à leurs cofacteurs doivent être fixés sur des séquences
spécifiques d’ADN (ce qui suppose que l’état de la chromatine leur permette
d’accéder à ces sites)

• l’action des FT et co-facteurs activateurs doivent surclasser l’action des FT et co-

facteurs répresseurs

• la machinerie associée à l’ARN polymérase II doit être recrutée

• l’ARN polymérase II doit se lancer dans la phase d’élongation après une phase
d’initiation de la transcription qui peut marquer une pause après un début de
transcription.

L'ADN n'est pas nu dans le noyau mais associé à des protéines (notamment les histones) pour former
la chromatine. La chromatine est notamment composée de nucléosomes. L'accès des facteurs de
transcription à l'ADN est fortement contrôlé par les nucléosomes.
*Figure 4-3. Structure d'un nucléosome qui est formé
par un octamère d'histones (2x quatre types d'histones
(2A, 2B, 3, 4). Source : Pierre Baduel. https://planet-
vie.ens.fr/thematiques/developpement/controle-du-developpement/comprendre-
le-role-de-la-chromatine-dans-la

188
 *Figure 4-4. Etapes liées au démarrage de la
transcription.

D’après http://genesdev.cshlp.org/content/33/15-16/960.long

Dans la majorité des cas, l’ARN polymérase II produit des ARN qui ne sont pas «matures» ou
fonctionnels. Ce sont les transcrits primaires, des précurseurs nucléaires des ARN (les pré-ARN). Ils
font l’objet d’une maturation, qui comprend diverses réactions comme des coupures, des
associations d’exons (épissage) ou des modifications chimiques (édition d’ARN, ajout d’une coiffe en
5′ avec une guanosine méthylée qui joue un rôle important plus tard pour l’initiation de la
traduction). Pour voir un exemple d’épissage, comparez la structure de l’ADN génomique de Pax3 et
de son ARNm (voir Figure 4-5) et allez aussi à la Figure 5-52 pour voir un exemple d’épissage
alternatif.

Le processus transcriptionnel nécessite généralement une chromatine peu condensée qui permet
aux ARN polymérases, sous contrôle des FT, de se lier au site d’initiation de la transcription. Cette
euchromatine est observée dans les noyaux des cellules en interphase et représente près de 90 %
de la chromatine totale dont 10% seulement se trouve dans un état suffisamment peu condensé
pour être transcrit. La condensation ou la décondensation de la chromatine est un des points de
contrôle majeur des processus épigénétiques.

189
 *Figure 4-5. Structure du gène, de l’ARNm et de la protéine PAX3, un facteur de transcription spécifique.

PB = domaine paired; HD = homéodomaine; PST = région riche en proline, sérine et thréonine.

D’après https://en.wikipedia.org/wiki/PAX3#/media/File:PAX3.hg38.fig.new.7.tif

L’euchromatine en particulier est soumise à des protéines régulatrices nucléaires qui agissent soit
globalement sur la structure de la chromatine (par exemple, Polycomb et Trithorax qui assurent
respectivement le maintien de la répression et de l’activation des gènes Hox) soit localement sur les
régions promotrices pour activer ou réprimer la transcription des gènes. De nombreuses classes de
protéines régulatrices ont été identifiées chez les organismes eucaryotes. Elles sont synthétisées par
la machinerie traductionnelle cytoplasmique et rentrent dans le noyau parfois de manière
contrôlée, ce qui peut être un niveau de régulation de la transcription (pas de transcription possible
si le facteur de transcription reste dans le cytoplasme). Ils possèdent des domaines hautement
conservés qui correspondent à des séquences de fixation soit avec l’ADN soit avec d’autres protéines
régulatrices.

Ces protéines régulatrices agissent principalement par :

– Condensation/Décondensation de l’ADN via la désacétylation/l’acétylation des lysines des

histones qui entraîne une augmentation/diminution de l’affinité entre histones et ADN,

*Figure 4-6. L'acétylation ou la désacétylation des lysines des histones (ici les lysines 9 et 14 (K9/14) de l'histone
H3) contrôle la condensation de la chromatine et indirectement l'initiation de la transcription. Ces réactions sont
contrôlées par des enzymes (histone acétyltransférases et histone désacétylases). D'après
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.00625/full

– Masquage des sites de fixation sur les promoteurs,

– Recrutement d’autres facteurs et stabilisation des ARN polymérases,

– Méthylation de la cytosine (carbone 5) dans l’ADN grâce à des méthyltransférases spécifiques

adressées au noyau, ce qui a comme conséquence de réprimer la transcription.

190
– Modulation de l’activité kinase du complexe protéique TFIIH phosphorylant le domaine C-terminal
de l’ARN polymérase II qui marque la transition entre l’initiation et l’élongation.

Il est important de noter que le promoteur central sert d’échafaudage pour l’assemblage du
complexe de pré-initiation (PIC), qui est composé de l’ARN polymérase, des facteurs de transcription
basaux (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF et TFIIH) et de l’ADN du promoteur. De multiples éléments
promoteurs centraux ont été identifiés comme des régions liées par des composants PIC distincts.

C’est TFIID qui initie la formation du PIC. TFIID est composé de la protéine de liaison à la boîte TATA
(TBP) et de 13 à 14 facteurs associés au TBP (TAF) (Antonova et al., 2019 ; Patel et al., 2020).

***Figure 4-7. Structures en cryo-microscopie électronique (cryo-EM) de TFIID et de sa liaison à l’ADN. (a)
Reconstruction cryo-EM du TFIID humain lié à l’ADN d’un promoteur avec une boîte TATA (TATA box). (b)
Reconstructions cryo-EM de TFIID, avec un contour transparent de TFIID (c) Modèle atomique de TFIID humain
utilisant le même code de couleur de sous-unité. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X19301113

Le premier élément promoteur central identifié et peut-être le plus connu est la boîte TATA (Goldberg,
1979), liée par le TBP et découverte à l’origine dans les gènes des histones de la drosophile. La boîte TATA
et le TBP sont tous deux conservés des Archébactéries à l’homme (Reeve, 2003). Les promoteurs principaux
étaient auparavant classés comme ayant ou n’ayant pas de boîte TATA, mais en fait seule une minorité de
promoteurs de métazoaires contiennent une boîte TATA (Gershenzon et Ioshikhes, 2005 ; Kim et al.,
2005 ; Dikstein, 2011). Ainsi, les promoteurs sans TATA nécessitent toujours une liaison au TFIID,
vraisemblablement par l’intermédiaire d’autres éléments promoteurs.

L’élément initiateur (Inr), qui englobe le site de départ de la transcription est le motif de promoteur le plus
répandu chez la drosophile (FitzGerald et al., 2006). Il est lié par les sous-unités TAF1 et TAF2 de TFIID
(Louder et al., 2016).
**Figure 4-8. Séquences et position par rapport au
site de départ de la transcription (TSS) de quelques
éléments de fixation du complexe de pré-initiation
dans les promoteurs centraux. Source :
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2006-7-7-r53

191
Le motif DPE est le motif en aval du site de départ de la transcription le mieux caractérisé, précisément
localisé de + 25 à + 30 nucléotides par rapport à ce site (Kutach et Kadonaga, 2000). Il est reconnu par TFIID.
Le motif DPE a été largement impliqué dans le contrôle des réseaux de régulation des gènes du
développement (GRN) (Zehavi et al., 2014).

**Figure 4-9. Importance pour la transcription des séquences DPE chez la drosophile. La distance entre l’Inr et le DPE est
strictement maintenue dans une variété de promoteurs centraux de la drosophile. (A) Analyse de transcription in vitro des
promoteurs de noyau contenant du DPE. Une série de promoteurs minimaux ont été construits avec les séquences d’ADN indiquées
sur la figure. Des versions de type sauvage (Wt) et mutantes DPE (Mut) de ces constructions de promoteurs ont été soumises à une
analyse de transcription in vitro. (B) Le positionnement des séquences de type DPE par rapport à l’Inr est important pour la fonction
DPE. Dans les promoteurs Mut1, les séquences de type DPE sont mutées en créant un espacement inapproprié par rapport à l’Inr,
tandis que dans les promoteurs Mut2, les séquences DPE sont mutées mais en gardant l’espacement approprié par rapport à l’Inr.
Les promoteurs ont été soumis à une analyse de transcription et le pourcentage de transcrit par rapport aux séquences normales
est précisé. Source : https://journals.asm.org/doi/10.1128/MCB.20.13.4754-4764.2000

Les gènes homéotiques Hox spécifient l’identité des segments le long de l’axe antéro-postérieur de
l’embryon en développement chez tous les animaux multicellulaires. Tous les promoteurs des gènes Hox
de drosophile n’ont pas de boîte TATA, et la majorité d’entre eux contiennent des motifs DPE
fonctionnels (Juven-Gershon et al., 2008). Fushi tarazu (ftz) est un gène pair-rule orchestrant la phase de
segmentation du développement embryonnaire de la drosophile, exprimé le long de l’axe antéro-postérieur.
Le promoteur de ftz contient une boîte TATA et une séquence DPE mais le facteur de transcription Caudal
active préférentiellement la transcription de ftz via la séquence DPE (Juven-Gershon et al., 2008).

192
 *Figure 4-10. Caudal active principalement la
transcription du gène pair-rule ftz via le DPE. Le
promoteur central de ftz contient à la fois des motifs
DPE et TATA. Les constructions rapportrices
contiennent des séquences d’enhancer et de
promoteur ftz de -988 à +40 par rapport au site de
départ de la transcription +1, et sont identiques à
l’exception de la mutation du DPE ou du TATA. Les
différentes constructions et un plasmide permettant
l’expression de Caudal ont été transfectés dans des
cellules S2 de drosophile et l’activité du gène
rapporteur a été mesurée. Source :
http://genesdev.cshlp.org/content/22/20/2823.full

Le TCT est un motif d’initiation de la transcription polypyrimidique qui est conservé de la drosophile à
l’homme, et souvent rencontré pour les gènes codant des protéines ribosomiques et des protéines
impliquées dans la régulation traductionnelle (Parry et al., 2010). Cet exemple met en évidence l’importance
d’éléments promoteurs de noyau spécifiques pour des systèmes transcriptionnels fonctionnels distincts.

L'ARN polymérase II est formé de douze sous-unités dont la plus grosse est la sous-unité RBP1. Elle contient
un domaine C-terminal qui comprend jusqu'à une cinquantaine de répétitions du motif d'acides aminés :
Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser appelé domaine CTD. La phosphorylation des sérines de ces répétitions
(notamment par le facteur de transcription général TFIIH) est essentielle au démarrage de la transcription.
Le domaine CTD phosphorylé contribue également au recrutement des enzymes qui synthétisent la coiffe
5' de l'ARNm.
*Figure 4-11. Deux formes, phosphorylées ou non sur le
CTD, de l'ARNpol II. Le complexe formant l'ARNpol II est
incubé en présence de TFIIH et en présence ou non d'ATP
(qui sert de donneur de phosphate pour la
phosphorylation). En présence d'ATP (et de TFIIH), on
détecte la forme RNAPIIO qui migre moins loin en
western-blot car la queue CTD de la sous-unité RBP1 est
très phosphorylée. Sans phosphorylation (en absence
d'ATP), on détecte la forme déphosphorylée appelée
RNAPIIA. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)63712-7/fulltext

Après le démarrage de la transcription, il existe une pause proximale de la polymérase, alors que le transcrit
fait entre 20 et 60 nucléotides de long. La pause de l'ARN polymérase II a été découverte dans le promoteur
de la protéine de choc thermique 70 de la drosophile (hsp70). Le développement et l’application à l’échelle
du génome de techniques mesurant directement l’ARN naissant ont révélé que la pause de l’ARN
polymérase II lorsque le transcrit est long de 20 à 60 nucléotides est une caractéristique commune des
gènes de drosophile et de mammifères (Core et Adelman, 2019 ; Wissink et al., 2019). En général, l’étendue
et le moment de la pause sont régulés via le positionnement des nucléosomes (Luse et al., 2020). La pause
de l’ARN polymérase II est désormais considérée comme une étape majeure dans la régulation de
l’expression des gènes (Gaertner et Zeitlinger, 2014). Par exemple, la pause de l’ARN polymérase II permet
une synchronisation de l’expression des gènes qui est cruciale pour le bon développement du mésoderme
(Lagha et al., 2013). c-Myc, un facteur de transcription oncogène et qui est aussi important dans la
production de cellules pluripotentes (iPS) agit essentiellement en mettant fin à la pause transcriptionnelle
(Rahl et al., 2010). Le mécanisme général de levée de la pause transcriptionnelle implique le facteur P-TEFb,
un complexe protéique qui comprend la cycline T1 et CDK9. CDK9 stimule l'avancée de l'ARNpol II en
phosphorylant le résidu sérine-2 dans les séquences de 7 acides aminés répétées du domaine C-terminal
(CTD) de l'ARNpol II (Ni et al., 2004).

193
 **Figure 4-12. L'activité de P-TEFb est nécessaire pour
phosphoryler le CTD de l'ARNpol II sur la sérine 2 mais pas
sur la sérine 5. Des cellules de glande salivaire de larve de
drosophile sont incubées ou non en présence de
flavopiridol qui est un inhibiteur de l'activité kinase du
facteur P-TEFb et elles subissent un choc thermique pour
activer la transcription dépendante du facteur de
transcription HSF. On observe les chromosomes polytènes
de ces cellules et on réalise des immunomarquages avec
des anticorps reconnaissant soit la forme de la CTD
phosphorylée sur la sérine 2 ou sur la sérine 5 et avec un
anticorps reconnaissant HSF. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276503005264

Aspect modulaire du contrôle de la transcription

Les séquences régulatrices contrôlant l’expression d’un seul gène du développement peuvent être
très complexes avec des multiples sites de fixation pour des facteurs de transcription différents. Ces
séquences régulatrices forment souvent des modules indépendants. Dans le promoteur d’un gène
qui est positionné de manière très précise autour du site de début de la transcription, il peut y avoir
plusieurs séquences spécifiques reconnues par des facteurs de transcription spécifiques en plus de
la boîte TATA ou de la séquence DPE lesquelles sont reconnues par les facteurs de transcription
généraux.

*Figure 4-13. Exemples de domaines de fixation à l’ADN de facteurs de transcription spécifiques. Vous pouvez voir
la structure de la protéine Pax3 à la Figure 4-5.

194
 **Figure 4-14. Structure de deux molécules du facteur de
transcription myogénique MyoD accrochées à l’ADN. On
voit bien la forme hélice-boucle-hélice. L’hélice qui
s’insère dans le sillon de l’ADN est dite basique et elle
interagit avec les charges négatives des phosphates des
nucléotides. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Myogenesis#

*Figure 4-15. Homéodomaine (rose fuschia) de la

protéine codée par le gène Antennapedia de Drosophila
melanogaster lié à un fragment d’ADN. L'homéodomaine
est composé de 3 hélices alpha. Il y a interactions de
l’hélice de reconnaissance (hélice 3) et de l’extrémité N-
terminal avec respectivement le grand sillon (ou sillon
majeur) et le petit sillon (ou sillon) mineur de la double
hélice d’ADN. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Bo%C3%AEte_hom%C3%A9otique#/media/Fichier:ADN_et_hom%C3%A9odomaine.png

**Figure 4-16. Le domaine de liaison à l'ADN du récepteur

des œstrogènes humains alpha (ERα) est caractérisé par
deux doigts de zinc typiques des récepteurs aux
hormones stéroïdes. Quatre cystéines coordonnent
chacune de manière tétraédrique deux ions zinc (gris). La
boîte proximale (boîte P) responsable de la
reconnaissance spécifique de l'ADN est représentée en
rouge, la boîte distale (boîte D) qui contrôle la
dimérisation du domaine de fixation à l'ADN est
représentée en vert. (B) La structure secondaire présente
la structure cristalline du domaine de fixation à l'ADN de
ERα humain (bleu) lié à l'ADN (noir). Les quatre chaînes
latérales d'acides aminés de la boîte P interagissant avec
les bases de l'ADN sont représentées en rouge. Ces
résidus font partie d'une hélice α responsable de la
reconnaissance spécifique de la séquence d'ADN qui est
positionnée dans le sillon principal de l'ADN
(perpendiculaire au plan de la représentation). On peut
voir une deuxième hélice α amphipathique croiser
l'hélice de reconnaissance avec les résidus rouges de la
boîte P à angle droit (dans le plan de la représentation).

195
 Situés entre les deux hélices se trouvent les résidus verts
de la boîte D favorisant la dimérisation du domaine de
fixation à l'ADN. Source :
https://www.researchgate.net/publication/12443523_Steroid_hormone_receptors_An_update

Plus éloignés du site du début de la transcription, en aval ou en amont du gène, peuvent se trouver
des enhancers. Ce sont des séquences d’ADN de quelques centaines de paires de bases de long (en
moyenne 500 pb) et ils comprennent des sites de liaison à des facteurs de transcription spécifiques.
Le lien entre ces derniers et les facteurs de transcription généraux au promoteur se fait grâce à un
gros complexe appelé le Médiateur, composé d’une trentaine de sous-unités. Sur le même modèle
que les enhancers qui activent en général la transcription, on trouve des silencers qui inhibent la
transcription.
*Figure 4-17. Un exemple d’interaction entre le
Médiateur, un facteur de transcription GATA sur un
enhancer et le complexe des facteurs de transcription
généraux avec l’ARN polymérase II. Dans ce cas précis,
l’interaction directe entre GATA et les sous-unités Med1
et Med19 du Médiateur (en bleu) a été démontrée.
Source : https ://www.jbc.org/article/S0021-
9258(17)50017-4/fulltext

Pour voir l’action d’un silencer, allez à la figure 1-41.

Contrairement aux promoteurs, les enhancers et les silencers peuvent être déplacés ou inversés
sans que cela ne perturbe en général la transcription du gène-cible. Pour les déplacements
néanmoins, il faut qu'ils restent dans le même domaine topologique d'association de la chromatine
(TAD) que le gène-cible (voir plus loin).
*Figure 4-18. L'inversion d'un enhancer de Nanog ne
perturbe pas le niveau de sa transcription. Un
enhancer (rectangle jaune) placé 5kb en amont du site
du début de la transcription du gène Nanog (rectangle
gris avec marqué exon 1) est inversé en utilisant le
système Cre/Lox inductible par le tamoxifène (4OHT)
(pour faire cela, les séquences Lox sont insérées en
anti-parallèle et non pas parallèle comme d'habitude
lorsqu'il s'agit de faire une délétion). On extrait les
ARN et on fait une analyse RT-qPCR pour le gène
Nanog et d'autres gènes présents dans la même région
génomique à partir de cellules sauvages (barres
noires), de cellules mutantes mais non traitées au
tamoxifène (barres grises) et de cellules mutantes
traitées au tamoxifène (barres blanches). On constate
que le niveau de transcription est le même pour tous
les gènes, notamment Nanog. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)00185-
4/fulltext

196
L’activité des enhancers et des silencers dépend du contexte et la perturbation de leur action peut
entraîner des anomalies du développement et des maladies. Par exemple, on a trouvé chez un
patient atteint d’aniridie une mutation ponctuelle dans un enhancer contrôlant l’expression de
PAX6 et qui se trouve à 150 kb en aval de la séquence codante de PAX6 qui était normale (Bhatia et
al., 2013).

L’indépendance de ces modules permet au hasard des mutations durant l’évolution de produire des «
monstres prometteurs » où l’expression d’un gène donné est éliminée d’une région de l’embryon (ou ajoutée
dans une région de l’embryon) sans que cela affecte les réseaux génétiques d’autres régions.

La complexité de la régulation de la transcription est sans doute due à la pléiotropie fonctionnelle élevée
des gènes du développement, qui nécessitent donc de nombreuses séquences régulatrices pour contrôler
leurs patrons d’expression spatio-temporellement complexes, et pour organiser et intégrer des inductions
spécifiques du destin cellulaire. Il existe aussi des cas où l’utilisation concomitante de plusieurs enhancers
permet une redondance de fonction afin de stabiliser la transcription dans l’espace et le temps, réduisant
ainsi le risque d’une diminution de l’expression d’un gène alors que la fonction de la protéine
correspondante exige une concentration maximale. Ces redondances participent à la robustesse des réseaux
de régulation géniques.

Citons l’exemple du contrôle de la transcription de Sox9 lors de la gonadogénèse mâle. Pendant une brève
période de 2 jours au milieu de la gestation, l’expression de Sox9 est activée par SRY dans les gonades de
souris mâles. SOX9 oriente ensuite la gonade bi-potentielle vers la voie de différenciation testiculaire, ce qui
signifie qu’une activation appropriée de l’expression de Sox9 est essentielle pour éviter un décalage entre
le sexe génétique et le sexe morphologique. Le mécanisme contrôlant la transcription de Sox9 semble être
très sensible au dosage, car diverses mutations hétérozygotes du locus peuvent provoquer une inversion
du sexe (Bishop et al., 2000; Huang et al., 1999; Kim et al., 2015). Le gène Sox9 est positionné près d’une
extrémité d’un grand domaine topologique d’association (TAD) de 2 Mb (voir plus loin pour comprendre la
notion de TAD), qui contient plusieurs enhancers. Chacun de ces enhancers peut amener un gène rapporteur
à être exprimé dans les gonades. Cependant, la suppression de chaque enhancer individuellement n’est pas
suffisante pour mimer la perte de fonction Sox9, à l’exception notable de la séquence Enh13 (Gonen et al.,
2017; Sekido et Lovell-Badge, 2008, Gonen et al., 2018). Cet enhancer Enh13 qui fait 557 pb de long se
trouve à 565 kb en amont de Sox9, dans la région «XY SR» connue pour provoquer une inversion du sexe XY
lorsqu’il est supprimé (Gonen et al., 2018).

197
 **Figure 4-19. La suppression de l’enhancer Enh13 contrôlant l’expression de Sox9 conduit à une inversion complète
du sexe chez une souris XY.

(A) Schéma de l’emplacement de Enh13 en amont de Sox9. Les flèches turquoise et violettes représentent les sgRNA
externes et internes utilisés pour supprimer Enh13 par la technique CRISPR/Cas9. Les flèches noires représentent
les amorces PCR utilisées pour génotyper les embryons. (B) Images en fond clair et sections colorées à l’hématoxyline
et à l’éosine (H&E) des gonades E13.5 XY Enh13+/+, Enh13+/- et Enh13-/- et XX Enh13+/+. On voit les tubes séminifères
en développement dans les gonades qui ont un phénotype mâle (les deux à gauche) (C) Immunomarquage des
gonades E13.5 de type sauvage XY, Enh13+/-, Enh13-/- et XX de type sauvage. Les gonades ont été colorées pour le
marqueur de cellules de Sertoli (présentes normalement que chez un mâle) SOX9 (vert), le marqueur des cellules de
la granulosa (présentes normalement que chez une femelle) FOXL2 (rouge) et le DAPI (bleu). Les gonades à inversion
sexuelle ne peuvent être distinguées des gonades WT XX, tandis que la délétion hétérozygote ne semble pas altérer
la morphogenèse des testicules. Les barres d’échelle représentent 100 µm. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6034650/

La délétion homozygote d’Enh13 seule réduit la transcription de Sox9 à environ 20% du niveau observé
chez une souris XY de génotype sauvage, se rapprochant du niveau trouvé dans les gonades femelles XX, ce
qui n’est évidemment pas suffisant pour activer la différenciation des testicules. La sensibilité à la perte
d’Enh13 semble dépendre du temps: cet enhancer agit tôt pour activer la transcription de Sox9 tandis que
d’autres enhancers moins éloignés de la séquence codante du gène peuvent par la suite compléter l’activité
d’Enh13. On trouve des séquences consensus de SOX9 dans les enhancers de son propre gène, ce qui suggère
que l’enhancer Enh13 agit d’abord pour activer la transcription de Sox9, puis la protéine SOX9 se fixe sur
Enh13 et sur d’autres enhancers pour stabiliser la transcription de son propre gène dans une boucle directe
de rétroaction positive (Sekido et Lovell-Badge, 2008). Ce cas illustre que les tissus en développement
passent parfois par un goulot d’étranglement où un dosage et un timing transcriptionnels précis sont
nécessaires pour déclencher l’activation d’un gène qui ensuite se stabilise et se fortifie.

198
L’attribution d’éléments de régulation, tels que des séquences d’enhancers, à un gène cible particulier a été
problématique jusqu’à récemment. Des développements technologiques et conceptuels ont non seulement
facilité la détection de séquences d’enhancers mais aussi leur association avec des gènes particuliers, par
exemple en testant des marques épigénétiques spécifiques ou l’accessibilité de la chromatine et aussi en
examinant les profils d’interaction ADN-ADN. Ce dernier ensemble de techniques permettant de révéler
l'architecture 3D de l'ADN a révélé l'existence de domaines topologiques d’association (TAD) (Dixon
et al., 2012). Il s’agit de structures de chromatine définies par leur probabilité accrue d’interactions
physiques internes. Ainsi, les enhancers ont beaucoup plus de probabilité de participer au contrôle
de la transcription de gènes qui se trouvent dans le même TAD qu’eux plutôt qu’en dehors. Des
modifications de cette structure topologique de la chromatine peut aboutir à des malformations
telles que celles observées dans certaines maladies génétiques (Tena et al., 2021).
**Figure 4-20. Fonctions des TAD dans la
régulation de la transcription. (A) Co-régulation
de la transcription de plusieurs gènes d’un même
TAD à partir d’un enhancer, (B) Empêchement
d’un enhancer d’agir sur la transcription d’un
gène en dehors du TAD, (C) Formation de
frontières entre des larges domaines de
chromatine condensée et des domaines actifs,
(D) Arrêt d’une transcription anti-sens. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371509/

Les TAD sont des régions génomiques relativement petites (environ 1 Mo en moyenne) (Bonev et al.,
2017), et leurs limites sont contrôlées par la protéine à doigt de zinc CTCF et un complexe de
cohésine formant un anneau.

**Figure 4-21. Structure des TAD (domaines topologiques d’association). Les frontières entre les TAD sont
caractérisés par des séquences de 1 à 2 kb appelées isolateurs (insulators en anglais). Ils ont été découverts en
premier chez la drosophile mais ils sont courants chez les eucaryotes. CTCF se fixe sur les isolateurs chez les
Mammifères. Chez la drosophile, c’est la protéine Su(Hw) qui joue ce rôle. Lorsqu’il est attaché à un isolateur, Su(Hw)
forme une association avec d’autres protéines, telles que CP190 et Mod (mdg4), cette dernière agissant comme une
colle moléculaire entre une paire d’isolateurs permettant à l’ADN entre eux de former une boucle et un domaine
topologique.

199
 **Figure 4-22. Structure de la protéine CTCF. Elle
possède un domaine central avec 11 doigts de zinc. Les
doigts de zinc 3 à 7 interagissent directement avec l'ADN
sur des séquences consensus (voir au-dessus) et les
autres doigts de zinc modulent cette interaction. CTCF
se fixe sur 40.000 à 80.000 sites dans le génome des
Mammifères. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/6/dev137729/48856/Developing-in-3D-the-role-
of-CTCF-in-cell

Les TAD sont généralement stables au cours du développement (Rao et al., 2014) et peuvent aider à isoler
les régions régulatrices d’interférences en provenance du reste du génome qui pourraient les perturber
(Dixon et al., 2016) et en même temps faciliter des contacts enhancers-promoteurs très transitoires en leur
sein. L’intérieur d’un TAD devient un espace de chromatine dynamique et sûr où les enhancers peuvent agir
sur leurs gènes cibles. A une autre échelle de temps, les TAD sont aussi très conservés au cours de
l’évolution.

**Figure 4-23. Exemple de mutation qui abolit une frontière de TAD créant un TAD plus grand où les enhancers
agissant habituellement sur le gène Eph4a arrivent à agir également sur l’expression du gène Ihh, provoquant une
polydactylie (Lupiañez et al., 2015). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.702787/full#B70

Un exemple classique de régulation transcriptionnelle à longue distance mais au sein d’un même TAD
implique une séquence régulatrice du gène codant le morphogène Sonic Hedgehog (Shh) (Lettice et al.,
2003). L’enhancer de membre ZRS qui permet son expression dans la zone d’activité polarisante (ZPA) (qui
est nécessaire à la polarité antéro-postérieure du membre) est positionné dans le gène Lmbr1 situé à 1 Mb
en amont du gène cible Shh. La délétion homozygote de cet enhancer inhibe la transcription de Shh dans les
bourgeons des membres, démontrant que ZRS est nécessaire pour le dosage et la spécificité tissulaire de la
transcription de Shh dans le membre (Sagai et al., 2005). L’expression de Shh n’est alors pas affectée dans
d’autres régions de l’embryon, démontrant une fois de plus le contrôle modulaire de l’expression des gènes.
Par ailleurs, seules les cellules de la ZPA présentent dans la ZRS l’acétylation sur la lysine 27 de l’histone H3
(H3K27ac) qui est activatrice (VanderMeer et al., 2014), montrant bien que cet enhancer n’est fonctionnel
que dans cette région de l’embryon.

Shh et son amplificateur ZRS sont aux extrémités opposées du même TAD, mais la distance de 1 Mb entre
eux est considérablement réduite dans l’espace 3D par le repliement de la chromatine (Symmons et al.,
2016; Williamson et al., 2016). Si on introduit une mutation qui détruit les frontières du TAD, l’expression
de Shh est abolie car le repliement de la chromatine ne se fait pas correctement et ZRS se retrouve trop
éloigné du promoteur de Shh. Si, par une nouvelle mutation, on rapproche ZRS du promoteur, alors
l’expression est en partie restaurée (voir cette figure : https://marlin-
prod.literatumonline.com/cms/attachment/8fd714d3-57dc-4e8e-aa8f-5229e4b919ef/fx1.jpg ).

Contrairement aux exemples discutés ci-dessus, dans lesquels un seul enhancer domine la régulation,
certains complexes de régulation fonctionnent par additivité d’enhancers, par lequel chacun de plusieurs
enhancers fournit un pourcentage défini de la sortie transcriptionnelle totale produite. Dans ce cas, on
s’attendrait à une corrélation entre le nombre d’enhancers supprimés et l’intensité de la baisse de la
transcription. Cependant, ces effets peuvent être compliqués par la force variable des enhancers individuels
qui interagissent avec un promoteur. Les enhancers faibles peuvent agir de manière additive en raison de
200
leur interaction peu fréquente avec le promoteur cible, mais, paradoxalement, la sortie transcriptionnelle
combinée de plusieurs enhancers puissants peut être inférieure à la somme de leurs contributions
individuelles en raison de la concurrence et de l’interférence entre les éléments pour le promoteur (Bothma
et al., 2015). Dans ce cas, on ne peut pas prédire la contribution d’un enhancer individuel (et donc les
conséquences de sa suppression) sans comprendre le mécanisme global à l’œuvre.

Le gène Ihh (Indian hedgehog) qui code une protéine essentielle pour la croissance osseuse dans les
membres et le crâne, fournit un bon exemple d’additivité des enhancers. Plusieurs éléments enhancers en
amont ont été cartographiés et l’analyse de transgène rapporteur a montré que les activités des enhancers
se chevauchent largement dans leurs domaines d’expression, indiquant que chaque enhancer contribue à
une partie de l’effet activateur dans ces tissus. En utilisant un ensemble d’allèles de délétion, il a été montré
que la quantité de transcription de Ihh est liée au nombre d’enhancers présents, une observation qui est
bien corrélée avec une augmentation de la transcription au-dessus des niveaux de type sauvage lorsque les
mêmes enhancers sont dupliqués (Will et al., 2017). En conséquence, la quantité de raccourcissement des
membres observée évolue proportionnellement à la quantité d’enhancers présents démontrant que
l’addition d’activateurs peut produire des phénotypes qui changent avec le dosage.

***Figure 4-24. Les suppressions progressives d’enhancers révèlent un contrôle additif de l’expression de Indian
Hedgehog (Ihh)

(A) Locus de Ihh avec de multiples enhancers en cluster en amont du gène Ihh et qui se trouvent dans les introns du gène voisin
Nhej1. Suppressions générées par CRISPR/Cas9 au locus. Le knock-out Ihh-/- est montré à titre de comparaison (signal d’arrêt). La
région chromosomique supprimée est représentée par une ligne pointillée. (B) L’hybridation in situ montre l’expression de Ihh lors
de la formation des doigts (E13.5). Barre d’échelle = 200 µm (C) Colorations squelettiques des membres antérieurs, de l’autopode
et du crâne (E17.5). Les mutants présentant des phénotypes anormaux sont indiqués par des astérisques. Les souris Del(2–9) et
Del(4–9) entraînent une réduction massive de la taille des membres et une ossification réduite similaire à knock-out Ihh-/-, tandis
que les souris Del(4–6) et Del(7–9) n’ont pas montré d’anomalies visibles des membres. Tous les mutants étudiés présentaient des
défauts du crâne (ossification retardée), un effet moins important chez les mutants Del(7–9) (tête de flèche). Barres d’échelle =
2000μm (membres antérieurs), 500μm (autopodes) et 1000μm (crânes). (D) Analyse RT-qPCR de l’expression de Ihh dans le
membre antérieur E13.5, la plaque de croissance osseuse E17.5 (coude) et le crâne. La suppression de l’intron 3 de Nhej1 englobant
les enhancers i2 à i9 a entraîné une perte presque complète de l’expression d’Ihh dans tous les tissus, tandis que des suppressions
plus petites réduisent partiellement l’expression. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5617800/

L’expression colinéaire des gènes Hox au cours de la formation des membres fournit un exemple bien étudié
d’entrées spatiales et temporelles complexes. Aux locus HoxD et HoxA, une expression appropriée nécessite

201
des arrangements topologiques uniques des séries de gènes et de leurs enhancers à longue portée respectifs
(Berlivet et al., 2013).

***Figure 4-25. Organisation topologique étudiée en Hi-

C des gènes HoxA et Evx1 dans le génome des cellules du
bourgeon de membre distal de souris. Les gènes sont
organisés en trois sous-TAD dans le membre (en haut).
L’enrichissement de l’interaction dans les tissus de la
tête par rapport au membre (en bas) montre une
augmentation significative de l’interaction entre les
gènes qui sont exprimés dans le membre distal par
rapport à la tête (enrichissement négatif dans la tête
donc en fait enrichissement positif dans le membre).
Pour comprendre ce genre de diagramme voir
https://dridk.me/tad.html. Source :
https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1004018

Au locus HoxD, les TAD flanquant le groupe de gènes de la partie 3′ du complexe dirigent l’expression
précoce des Hox exprimés dans la région proximale du membre et ceux à côté de la partie 5′ du complexe
dirigent l’expression plus tardive des Hox exprimés dans la région distale. Au cours du temps, il y a un
changement de la topologie chromatinienne qui permet de passer d’un patron d’expression précoce des
gènes du locus HoxD à un patron d’expression tardif (Andrey et al., 2013).

Bien que les régions régulatrices autour des gènes de développement s’étendent fréquemment sur de
grands intervalles génomiques pauvres en gènes, ils ne contiennent rarement qu’un seul gène. En
conséquence, les enhancers peuvent ignorer les promoteurs de certains gènes – même s’ils sont proximaux
– tout en agissant spécifiquement sur d’autres (Spitz et al., 2003). Plusieurs mécanismes peuvent expliquer
cela, comme l’incompatibilité entre les types d’enhancer et de promoteur (Zabidi et al., 2015). Il peut y avoir
une sensibilité spécifique selon l’état cellulaire, permettant aux enhancers de basculer entre deux gènes
cibles très similaires (Sharpe et al., 1998).

Au locus du gène codant le facteur de croissance FGF8, plusieurs gènes sont intercalés entre Fgf8 et ses
enhancers, mais les enhancers n’agissent pas sur ces gènes. Dans ce cas, il semble y avoir une exigence
structurelle dans la topologie qui définit les promoteurs avec lesquels les enhancers de Fgf8 peuvent
interagir. Cependant, lorsque le locus est perturbé par des mutations ou que des parties de celui-ci sont
déplacées ailleurs, les enhancers de Fgf8 agissent ectopiquement pour conduire la transcription des gènes
non contrôlés habituellement par eux (Marinić et al., 2013). Un mécanisme similaire a été observé au locus
Pitx1 durant le développement du bourgeon de membre (Kragesteen et al., 2018).

Enfin, dernier cas de figure étudié ici, l’interaction entre deux facteurs de transcription sur une même
séquence régulatrice ou deux séquences très proches. Tous les cas de figure sont possibles : l’un des
facteurs peut empêcher l’autre de se fixer ou alors au contraire, la fixation de l’un favorise la fixation
et l’activité de l’autre, créant une synergie. Nous allons prendre l’exemple de l’activation de la
transcription de MITF (qui code un facteur de transcription essentiel pour le développement des
mélanocytes) par Sox10 et Pax3.

202
 *Figure 4-26. SOX10 agit en synergie avec PAX3 sur le
promoteur de MITF. (A) L’expression du gène rapporteur
de la luciférase est sous le contrôle du promoteur MITF
normal (pMITF) ou muté avec une délétion ponctuelle
(pMITFdel1718 et pMITFdel2061) et avec ou sans six sites
potentiels de liaison SOX10 supprimés
(pMITFdel1718SOX) ou les 2 sites de liaison PAX3
supprimés ansi que les 6 sites SOX10 (pMITFdel1718
SOX+P1+P2). Ces constructions ont été transfectées dans
des cellules HeLa en combinaison avec des vecteurs
d’expression contrôles et des vecteurs permettant
d’exprimer PAX3 et/ou SOX10 (barres noires, gris clair et
gris foncé correspondant aux divers scénarios). Les
données de toutes les transfections sont présentées sous
forme de facteur d’induction au-dessus des niveaux de
base. Source :
https://academic.oup.com/hmg/article/9/13/1907/627
353

Focus sur les contrôles épigénétiques

Les modifications épigénétiques de la chromatine permettent aux cellules de répondre à des
variations de leur environnement tout en maintenant leur séquence génomique. Elles sont une
composante essentielle de la plasticité phénotypique. Ces modifications permettent aussi de
produire de multiples types de cellules différenciées à partir d'un même génome.

Les histones et tout particulièrement leur région N-terminale peuvent être la cible de très
nombreuses modifications post-traductionnelles qui influencent la compaction de la chromatine et
donc l’accessibilité des facteurs de transcription à leurs séquences cibles.

*Figure 4-27. Diverses modifications post-traductionnelles des histones qui forment le nucléosome. Notez que
l'essentiel des modifications se fait sur des lysines (K) mais d'autres acides aminés peuvent être impliqués. Source

Par spectrométrie de masse, on a par exemple découvert plus de 150 combinaisons différentes de
modifications post-traductionnelles sur l'histone H3 humaine ! (Garcia et al., 2007).

*Figure 4-28. Modifications post-traductionnelles des histones et activation/répression de le transcription des

gènes. Les modifications activatrices sont représentées en haut (rose) et les modifications inhibitrices en bas
203
 (gris). Leur localisation moyenne par rapport au site de début de la transcription (TSS) est montrée (mais c'est
une moyenne avec des larges variations). K suivi du nombre correspond à la position de la lysine affectée ; ac =
acétylation ; me1, me2, me3 = simple, double et triple méthylation. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2023.1086573/full

Par l’action des histone acétylases, les histones formant les nucléosomes sont acétylées sur les
fonctions amines des lysines basiques dans les queues « amino-terminales » allongées des histones.
Cette acétylation a pour conséquence de supprimer les charges positives des lysines et donc
d’empêcher la formation des nucléosomes, permettant ainsi la transcription de l’ADN non
compactée. Ce phénomène d’acétylation est réversible grâce à l’action des histone désacétylases
(HDAC) qui sont aussi connues par ailleurs pour recruter des ADN méthylases responsables de la
méthylation de l’ADN bloquant la transcription.

Les groupes acétyle sur les histones sont également reconnus par les protéines qui contiennent des
domaines de liaison à l'acétyl-lysine appelés bromodomaines (BRD) (Sanchez et Zhou, 2009). Les protéines
BRD ont un large éventail d'activités sur la chromatine, notamment l'ajout d'autres modifications des
histones, le remodelage de la chromatine et plus généralement la régulation de la transcription
(Filippakopoulos et al., 2012).

Chez les eucaryotes, la 5-méthylcytosine (5mC) est présente à certains nucléotides suivis d’une
guanosine (séquences CpG). Chez les végétaux, la 5mC peut se trouver aussi au sein de séquences CNG (N
étant n'importe quel nucléotide) ou CHH (avec H = A, T ou C). Cette méthylation ne gêne pas l'appariement
des bases azotées car elle se trouve en position latérale mais elle peut être reconnue par des protéines
spécifiques ou empêcher la fixation d'autres protéines.

Le taux de méthylation reste très faible chez la drosophile (0,034%), faible chez les mammifères (quelques
%; 7,6% chez la souris par exemple) mais atteint 30 % chez les végétaux, ce qui est logique vu l'éventail
plus large de leurs cytosines pouvant être méthylées. Pour savoir comment on détecte cet ADN méthylé,
suivre ce lien : https://www.edimark.fr/Front/frontpost/getfiles/22702.pdf

**Figure 4-29. Méthylation d'une cytosine dans le site actif d'une ADN méthyltransférase. Le donneur de méthyl est
une molécule appellée SAM (S-Adenosyl methionine). Source : https://en.wikipedia.org/wiki/5-
Methylcytosine#/media/File:DNMT_reaction_mechanism.tif

L'ajout d'un résidu méthyl sur une cytosine à une position du génome qui n'en avait jamais eu
s'appelle la méthylation de novo. Elle est catalysée par les ADN méthyltransférases DNMT3a et
DNMT3b. DNMT3L peut interagir avec ces enzymes et augmenter leur activité enzymatique, mais
elle n'a pas d'activité enzymatique propre (Gujar et al., 2019). Lors de la réplication, une séquence
5’-CpG-3’ méthylée sur un brin de l'ADN est reconnue et méthylée sur l'autre brin néoformé par une
ADN méthyltransférase particulière, Dnmt1, ce qui lui permet de se perpétuer dans une lignée
cellulaire, assurant une mémoire épigénétique. Cette réaction s'appelle la méthylation de maintien.

204
 *Figure 4-30. Méthylation de novo et méthylation de maintien. D'après https://www.mdpi.com/2073-
4425/10/2/172

Des souris déficientes en DNMT1 meurent à la gastrulation, ce qui démontre le rôle très important de la
méthylation de maintien. Dans les deux cas (méthylation de novo et méthylation de maintien), le transfert
de méthyle se fait à partir d'une molécule particulière : la S-adénosyl-L-méthionine (SAM).

Dans un gène ou dans ses séquences cis-régulatrices, ces méthylations empêchent la transcription
de l’ADN en ARN soit en tant qu’obstacle stérique à la fixation d’un FT soit en favorisant l’action des
histones désacétylases, qui, nous l’avons vu, rendent la chromatine moins accessible aux FT. On a
ainsi découvert que le facteur de transcription MeCP2, qui se lie principalement au CpG méthylé (il
s’appelle d’ailleurs methyl-CpG-binding protein 2), agit comme un répresseur transcriptionnel en
recrutant le complexe histone désacétylase (HDAC) lors de la répression de la transcription dans les
ovocytes de Xenopus laevis (Jones et al., 1998, Nan et al., 1998).

Le syndrome de Rett est un trouble neurodéveloppemental progressif sévère chez les femmes,
principalement causé par des mutations dans le gène MeCP2 (Amir et al., 1999). Ce syndrome est caractérisé
par une période de développement apparemment normal pendant 6 à 18 mois, suivie d’une régression et
de l’apparition de diverses anomalies neurologiques, notamment une microcéphalie, une altération de la
fonction motrice, des tremblements, des convulsions, des déficits cognitifs, des mouvements stéréotypés de
la main et des caractéristiques autistiques. Le profil de méthylation CpG dans l’ADN des patients n’est pas
modifié mais comme MeCP2 muté ne peut pas s’y fixer ou s’y fixe mais ne peut pas agir (selon la mutation
présente), des gènes sont transcrits alors qu’ils ne devraient pas l’être et cela perturbe le développement
post-natal du cerveau.

La méthylation de l’ADN est le principal mécanisme moléculaire de l’empreinte parentale qui concerne une
centaine de gènes chez les Mammifères : seul l’un des allèles soit provenant du père ou soit provenant de la
mère s’exprime. Dans le syndrome de Prader-Willi, les gènes impliqués (SNRPN et NDN) ne s’expriment
habituellement qu’à partir des allèles hérités du père. Les allèles de la mère restent très peu transcrits. Si
un individu hérite d’allèles non fonctionnels ou d’une délétion totale de cette région du chromosome 15 du
père, les allèles maternels, même produisant des protéines fonctionnelles, ne peuvent compenser.
L'empreinte parentale existe aussi chez les végétaux : par exemple le gène FWA est exprimé uniquement à
partir de l'allèle maternel dans l'albumen des graines d'Arabidopsis thaliana, et la méthylation est aussi
impliquée (Kinoshita et al., 2004).

Les cytosines peuvent être déméthylées par des enzymes TET qui produisent une série de formes oxydées
de la 5-méthylcytosine, notamment la 5-formylcytosine. Cette forme de cytosine peut être utilisée comme
une marque de déméthylation récente et donc comme un site d'activation (ou de réactivation) de
l'expression des gènes (Gao et al., 2020). La 5-formylcytosine peut elle-même être encore oxydée en 5-
carboxycytosine par les TET. Ce sont alors les enzymes de réparation qui la remplacent par une cytosine
normale.

205
 **Figure 4-31. Méthylation et déméthylation de la cytosine. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.653222/full

Les enzymes TET sont notamment très actives dans le pronucléus mâle du zygote où a lieu une
déméthylation massive du génome paternel. Dans d'autres cas, signalons que souvent, la déméthylation se
fait par absence de maintenance de la méthylation après la réplication. C'est le cas pour le génome maternel
après la fécondation qui est moins méthylé que le génome paternel et qui subit une déméthylation passive.

**Figure 4-32. Changements de niveau de méthylation des CpG dans le génome paternel et maternel après la
fécondation. Le génome des spermatozoïdes de souris présente une méthylation sur 80 à 90% de ses sites CpG, soit
environ 20 millions de sites méthylés. Après la fécondation, la déméthylation des chromosomes paternels est
presque achevée en 6 heures par un processus actif, avant la réplication de l'ADN (ligne bleue). L'ovocyte mature a
environ 40% de ses sites CpG qui sont méthylés. La déméthylation des chromosomes maternels se produit en grande
partie par le blocage des enzymes de méthylation de maintien et la dilution de l'ADN maternel méthylé pendant la
réplication (ligne rouge). La morula (au stade 16 cellules), n'a qu'une petite quantité de méthylation de l'ADN (ligne
noire). La méthylation commence à augmenter à 3,5 jours après la fécondation dans le blastocyste et une grande
vague de méthylation se produit alors aux jours 4,5 à 5,5 dans l'épiblaste, passant de 12% à 62% de méthylation,
atteignant ensuite le niveau maximum après implantation dans l'utérus. Au septième jour après la fécondation, les
cellules germinales primordiales (PGC) nouvellement formées dans l'embryon implanté se séparent des cellules
somatiques restantes. À ce stade, les PGC ont le même niveau de méthylation que les cellules somatiques. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/TET_enzymes#/media/File:Methylation_levels_during_mouse_very_early_embryoni
c_development.jpg

Chez les plantes, la méthylation de novo des séquences CG chez les plantes est principalement contrôlée par
DRM2 avec en partie la voie de méthylation de l'ADN dirigée par l'ARN et maintenue par l'ADN
méthyltransférases 1 (MET1), un homologue de Dnmt1. La méthylation de novo des séquences CHH est
réalisée par DRM2, tandis que celle des séquences de type CNG est réalisée par CMT3 (Chan et al. 2005).
Des changements importants de méthylation peuvent être causés par certains stress : par exemple, un stress
thermique induit une augmentation de l'expression de DRM2 et une hausse de la méthylation dans le
génome d'Arabidopsis (Naydenov et al., 2015).

206
 **Figure 4-33. La voie de méthylation de l'ADN dirigée
par ARN. Chez les végétaux, l'ARNpol IV synthétise un
ARN à partir de régions d'ADN riches en séquences
répétées. Cet ARN est pris en charge par RDR2 qui
synthétise un deuxième brin d'ARN complémentaire. Cet
ARN double brin est coupé en fragments de 24
nucléotides par DCL3. Un brin de ces petits ARN s'associe
à AGO4 et reconnaît un transcrit synthétisé par l'ARNpol
V. Cette interaction permet le recrutement de DRM2, une
de novo ADN méthyltransférase qui méthyle l'ADN.
D'après la thèse de Lauriane Simon, Université
Clermont-Ferrand II.

La méthylation peut également concerner les histones, notamment l’histone H3. Certaines méthylations de
l’histone H3 facilitent la transcription telles la triméthylation sur la lysine 4 (H3K4me3), d’autres la
répriment telles que la triméthylation sur la lysine 9 (H3K9me3).
**Figure 4-34. Une triple méthylation répressive de
la transcription sur la 9ème lysine de l’Histone H3.
Les histones méthyltransférases Suv39h1, Suv39h2
et Setdb1 sont les enzymes responsables de cette
méthylation. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6759373/

207
Nous constatons qu’à quelques acides aminés près, une même modification (la triméthylation sur une
lysine) a des effets radicalement opposés sur la transcription !

Des mutations dans des enzymes permettant de méthyler des lysines des histones peuvent aboutir à des
anomalies développementales comme par exemple dans le syndrome de Kabuki caractérisé par un retard
mental et des malformations de la face et qui est provoqué par des mutations perte-de-fonction dans le gène
codant l'histone-lysine N-méthyl transférase 2D (KMT2D ou MLL2) qui catalyse la méthylation de la lysine
4 de l'histone H3.

Des enzymes spécifiques assurent aussi les déméthylations de lysines précises sur les différentes histones.
Citons comme enzymes de déméthylations des histones, les protéines contenant un domaine appelé Jumaji
C (JmjC). Elles sont impliquées dans de multiples processus développementaux comme notamment le
déclenchement de la floraison chez Arabidopsis (Gan et al., 2014).

**Figure 4-35. Les histones déméthylases Jmj30 et Jmj32 sont nécessaires pour inhiber la floraison lorsqu'il fait
chaud. Des plants d'Arabidopsis thaliana sauvages (WT) ou simple ou double mutants perte-de-fonction pour les
gènes codant Jmj30 et Jmj32 sont cultivés à 22°C ou à 29°C. Des expériences complémentaires montrent qu'à 29°C,
en absence de Jmj30 et de Jmj32, il y a significativement plus de H3K27me3 (marque répressive) dans les séquences
régulatrices dans les gènes impliqués dans la répression de la floraison que lorsque l'une des deux histone
déméthylases est présente. Ainsi, les gènes impliqués dans la répression de la floraison sont plus exprimés chez les
mutants et la floraison a lieu. Source : https://doi.org/10.1038/ncomms6098

Au début du développement embryonnaire, l’épigénome subit des changements massifs. Lors de la

fécondation, les génomes des gamètes – spermatozoïdes et ovocytes – doivent être reprogrammés afin
d’obtenir la totipotence. Ce processus implique un décompactage des génomes gamétiques hautement
condensés et une réinitialisation globale des états de la chromatine pour conférer la plasticité épigénétique
nécessaire au développement d’un nouvel organisme. L’établissement de la pluripotence chez les
mammifères nécessite l’effacement de la mémoire épigénétique et, en tant que telle, l’hypométhylation
globale est une caractéristique déterminante des diverses cellules pluripotentes, y compris les cellules
souches embryonnaires naïves (ESC), les cellules germinales primordiales (PGC) et les cellules souches
pluripotentes induites (iPSC). La déméthylation au cours du développement précoce des Mammifères est
contrôlée par les enzymes TET (Rasmussen et Helin, 2016). L’activité déméthylase de ces enzymes entraine
l’expression de la protéine associée à la pluripotence développementale 3 (DPPA3/PGC7/STELLA). DPPA3
se lie alors directement à la protéine UHRF1 et provoque sa libération de la chromatine. UHRF1 se lie
normalement à l’ADN hémiméthylé généré pendant la phase S par la réplication semi-conservative et
recrute l’ADN-méthyltransférase de maintenance, DNMT1. L’expulsion de UHRF1 de l’ADN hémiméthylé
inhibe ainsi la méthylation de maintenance et provoque une déméthylation passive globale (Mulholland et
al., 2020).

208
 ***Figure 4-36. Dans les cellules pluripotentes, DDPA3 déplace UHRF1 de l’ADN hémiméthylé. Dans des cellules
embryonnaires souches (ES) en phase S, on exprime une forme taguée par la GFP de la protéine UHRF1 et on induit
l’expression de DPPA3 à t= – 90 minutes. Une image est prise à partir de t= 0 au microscope à fluorescence toutes les
10 minutes. L’ADN est marqué par le SiR-DNA (voir lien pour voir explication sur ce marquage). Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-020-19603-1

Des approches génétiques chez le nématode Caenorhabditis elegans pour examiner comment la répression
médiée par les protéines du groupe Polycomb (PcG) peut être héritée, ont montré que la méthylation
répressive des histones (H3K27me3) déposée par le complexe PRC2 des protéines PcG se transmet par les
spermatozoïdes et les ovules entre les générations (Gaydos et al., 2014). La transmission de modifications
épigénétiques à travers plusieurs générations a été observée chez de nombreuses autres espèces, y
compris chez les Mammifères. Ainsi, certaines modifications épigénétiques échappent à la grande
remise à plat qui a lieu à la fécondation ou peu après.

Un cas particulier où la transcription est contrôlée indirectement par les ARNm

Il existe un paradoxe dans l'utilisation des outils génétiques chez les organismes-modèles : les
expériences knock-down (où on diminue l'expression d'une protéine par un microARN, un siARN
ou un morpholino) sont souvent plus efficaces pour produire un phénotype que les expériences
knock-out où on introduit dans le gène une séquence qui code un codon STOP prématuré ou où on
délète un ou plusieurs exons. Il a été montré que chez le poisson-zèbre et la souris, les codons STOP
prématurés initient un processus connu sous le nom de dégradation de l'ARNm médiée par une
mutation non-sens (nonsense-mediated mRNA decay en anglais), qui se produit dans le
cytoplasme. Cette dégradation déclenche l'activation du complexe protéique COMPASS, qui
entraîne une modification de la machinerie épigénétique qui contrôle la transcription et déclenche
l'augmentation de la transcription des gènes présentant une similarité de séquence avec le gène
muté non-sens, ce qui aboutit à une compensation fonctionnelle qui peut diminuer voire masquer
les effets du knock-out (El-Brolosy et al., 2019).

EN DIRECT DES LABOS

Travail d’une équipe de recherche et épigénétique : https://youtu.be/ZsSrPgeSJ58

209
LA CARTE MENTALE

Contrôle de la traduction

*Figure 4-37. Structure d’un ARNm

Généralités
a conversion de l’information portée par l’ARNm en protéine représente la traduction. Il s'agit

L
de l'interprétation de la séquence des ribonucléotides portée par l'ARNm en acides aminés. Elle
est réalisée selon un code appelé le code génétique. Ce sont les ribosomes, des complexes
formés de protéines et d'ARNr (ARN ribosomique) qui réalisent la traduction avec l'aide des
ARNt (ARN de transfert).

Dans ce système, un triplet de nucléotides, ou codon, désigne un acide aminé. Les ARNt permettent
de faire le couplage entre un codon donné et l'acide aminé correspondant. Il y a quatre codons
particuliers. Un codon AUG appelé codon-initiateur codant pour la méthionine permet de
commencer la traduction et 3 codons appelés codon stop (UAA, UAG, UGA) provoquent l’arrêt de la
traduction. La traduction s'effectue dans le cytoplasme, mais sa localisation peut être contrôlée (soit
par la localisation de l’ARNm, soit par la localisation des ribosomes).

210
 *Figure 4-38. Code génétique. La première base (lettre) du codon (en 5') est au centre, puis la deuxième base plus en
périphérie, puis la dernière complètement à la périphérie (en 3') de la représentation. Un acide aminé peut être codé
par plusieurs codons différents (souvent avec les 2 premières bases identiques), ce que l'on appelle la
dégénérescence du code génétique mais un codon donné ne code qu'un acide aminé. A quelques exceptions près, le
code génétique est universel, ce qui signe la parenté de tous les êtres vivants actuels. Cette universalité permet les
transferts horizontaux de gènes entre des espèces quelquefois éloignées (transfert de gènes entre deux organismes
non lié à la reproduction). Source : https://www.genome.gov/genetics-glossary/Genetic-Code

La traduction s'effectue dans le cytoplasme, mais sa localisation précise peut être contrôlée (soit par
la localisation de l’ARNm, soit par la localisation des ribosomes).

Initiation de la traduction
Lorsque l’ARNm arrive dans le cytosol, il est pris en charge par des facteurs d’initiation de la
traduction. Ces protéines éliminent la protéine de coiffe (protéine CBC) puis interagissent avec les
protéines fixées sur la queue poly A. Ainsi, la traduction ne peut démarrer que si les deux extrémités de
l’ARNm sont intactes.

Parmi les facteurs d'initiation de la traduction, citons eIF4E qui se lie à la coiffe 5' des ARNm. Son activité
peut être augmentée par une phosphorylation sur la sérine 209 à la suite de la réception par la cellule de
facteurs de croissance.

211
 **Figure 4-39. Contrôle par la signalisation de l'activité
d'initiation de la traduction de eIF4E. En présence de
facteurs de croissance la voie PI3Kinase/Akt/mTOR est
activée et phosphoryle les 4E-BPs qui sont des protéines
inhibitrices de eIF4E. En parallèle, la voie Ras/Raf/ERK
est activée et sa cible Mnk1/2 phosphoryle eIF4E sur la
sérine 209 et stimule son activité. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2018.00561/full

eIF4E est surexprimé dans une grande variété de tumeurs, notamment les mélanomes. On pense qu'il
stimule la tumorigenèse et la progression tumorale en facilitant la traduction des ARNm qui codent des
protéines facilitant la prolifération et la survie. Dans les mélanomes métastatiques, une forte
phosphorylation de eIF4E sur la sérine 209 est associé avec un mauvais pronostic (Carter et al., 2016).

eIF4E forme le complexe eIF4F avec la protéine d'échafaudage eIF4G et une hélicase eIF4A pour initier la
traduction dépendante de la coiffe.

*Figure 4-40. Le complexe d'initiation de la traduction. eIF4F est formé par eIF4A, eIF4G et eIF4E. Le complexe 43S
est formé par eIF3, la petite sous-unité ribosomale (40S), et eIF2, qui à son tour est formé par l'initiateur méthionine-
ARNt (Met-ARNt) et le GTP. L'ARNm est recruté dans le complexe eIF4F à travers l'interaction de l'extrémité 3 'et de
la protéine de liaison à la queue polyA (PABP) et de la coiffe 5' et eIF4E. UTR : région non traduite. Source :
https://www.mdpi.com/1999-4915/7/2/739

La traduction est initiée par la petite sous-unité du ribosome (40S) qui se fixe sur l'extrémité 5’ de
l'ARNm, aidée par des facteurs d'initiation de la traduction qui ont reconnu la coiffe 5'. Cette petite
sous-unité du ribosome est accompagnée de l'ARNt initiateur qui porte la méthionine. La sous-unité
se déplace jusqu'à ce qu'elle parvienne au codon-initiateur. Alors, il y a un changement de conformation
du complexe et les facteurs d’initiation se dissocient et la grande sous-unité ribosomique (60S) se fixe dans
une position permettant à l’ARNt initiateur d'occuper le site P du ribosome. Ensuite, un second ARNt chargé
de son acide aminé et accompagné d’un facteur d’élongation associé au GTP, vient occuper le site A du
ribosome.

212
Dans certains cas de stress (hypoxie, infection virale, génotoxicité), la cellule diminue le niveau global de
traduction en freinant son initiation. Cependant, en cas d'hypoxie par exemple, on observe que la traduction
des ARNm codant des facteurs de croissance angiogéniques (comme le VEGF) qui permettent d'initier la
formation de nouveaux vaisseaux sanguins est stimulée. Le blocage général de la traduction est surmonté
par l'utilisation comme lieu d'assemblage des ribosomes non pas de la coiffe 5' mais d'un IRES (pour internal
ribosome entry site). L'IRES se trouve dans la région 5' non traduite (5'UTR) des ARNm. Le complexe
d'initiation est alors composé d'ITAF (IRES trans-acting factors) et de longs ARN non codant comme long
ARN non codant comme NEAT1 (nuclear-enriched abundant transcript 1) (Godet et al., 2022). Dans certains
cas, ce complexe s'associe à l'ARNm dès le noyau (la traduction a toujours lieu dans le cytoplasme).

Translocation et terminaison de la traduction

La translocation est le déplacement relatif de l'ARNm et du ribosome. Elle permet la croissance de
la chaine polypeptidique de 7 à 15 acides aminés par seconde chez les Procaryotes et de 3 à 5 acides
aminés par seconde chez les Eucaryotes.

*Figure 4-41. *ARNt chargé par un acide aminé (ici la

phénylalanine) et possédant un anticodon (ici GAA) en
interaction avec le codon correspondant sur l'ARNm (ici
UUU). Ici, l'anticodon n'est pas exactement la séquence
complémentaire du codon selon la règle du wobble : le
troisième nucléotide du codon (ici le U en 3' vers la
gauche de l'ARNm) n'a pas besoin d'être reconnu de
manière très stricte. Remarquez aussi la structure
secondaire particulière de l'ARNt. Remarquez la
structure secondaire particulière de l'ARNt. Source : IJsbrand
Kramer - Université Bordeaux 1
https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap6/co/module_Chap6_10.html

L'appariement codon-anticodon est le facteur essentiel de sélection. Si l'appariement codon-

anticodon est suffisamment fort, le GTP est hydrolysé ce qui provoque la dissociation du facteur
d’élongation. L’hydrolyse du GTP produit également un changement de conformation du ribosome, ce qui
active l’ARNr 28S (ARNr 25S chez les plantes). Il s’agit d’un ribozyme qui catalyse la formation d’une
liaison peptidique entre la méthionine et le deuxième acide aminé. Si l'appariement codon-anticodon
n'est pas suffisamment fort, l'ARNt quitte le site A sans que le GTP puisse être hydrolysé et donc la liaison
entre les acides aminés n'est pas réalisée. Des essais successifs de différents couples ARNt-acide aminé qui
se présentent de façon aléatoire peuvent se succéder. Une fois la liaison peptidique réalisée, l’hydrolyse
du GTP lié à un second facteur d’élongation provoque un second changement de conformation du
ribosome menant au déplacement relatif de l'ARNm et du ribosome, appelé translocation. Le site A
se trouve libre pour recevoir un troisième ARNt chargé d'un troisième acide aminé et ainsi de suite.

Jusqu'à une période récente, on pensait que les codons synonymes (ceux qui présentent des séquences
différentes sur l'ARNm mais qui aboutissent à un même acide aminé) ne provoquaient pas de différences et
avaient été négligés dans l'étude des mutations humaines par exemple. On s'est rendu compte que certains
codons sont utilisés plus rarement que d'autres et que la quantité d'ARNt correspondant à ces codons
peuvent être rares, ralentissant la translocation et donc la production de la chaîne polypeptidique. Cela peut
entraîner des conséquences sur la mise en place de la conformation des protéines et altérer leur fonction
(Walsh et al., 2020).

213
La vitesse à laquelle se fait la translocation et l'élongation de la chaine polypeptidique en croissance est
variable selon la séquence qui est lue mais aussi selon l'âge de l'organisme. Des pauses de la traduction
peuvent même s'observer ce qui peut être bénéfique pour laisser le temps à des domaines de la protéine de
prendre leur bonne conformation avec éventuellement l'aide de protéines chaperons (Kim et al., 2015).
Mais avec l'âge, des pauses traductionnelles plus longues sont observées chez la levure et chez C. elegans
aboutissant à des "embouteillages de ribosomes" et à des protéines naissantes avec des conformations
partielles qui peuvent former des agrégats (Choe et al., 2016; Stein et al., 2022). De tels processus ont été
impliqués dans la neurodégénération (Ishimura et al., 2014).

Les translocations se poursuivent avec ajout d'acides aminés à la chaîne polypeptidique en cours de
synthèse jusqu'à la terminaison. Celle-ci est programmée dans l'ARN messager par un des trois
codons stop, qui est lié à un facteur de terminaison de l'élongation associé au GTP. Aucun ARNt
possède l'anticodon correspondant, le site A reste donc inoccupé. L'hydrolyse de la liaison du
dernier acide aminé avec son ARNt signe la fin de la traduction. Il se forme ainsi l'extrémité carboxy
terminale de la protéine. Les deux sous-unités du ribosome se dissocient et libèrent l'ARNm qui peut
être traduit à nouveau (phénomène d'amplification : un gène peut être transcrit de multiples fois en
ARNm et chaque ARNm peut être traduit de multiples fois).

Récemment, il est apparu que les ARNt n’étaient pas de simples liens entre les codons et les acides
aminés. Les ARNt peuvent être clivés pour former des 5’tRFI ou des 3’tRFI selon le fragment
considéré et ils peuvent inhiber ou faciliter la traduction selon le contexte. Ils peuvent même
contrôler la transcription d’après un mécanisme encore inconnu. Les 5’tRFIGly/GCC (c’est-à-dire
un fragment 5′ de l’ARNt lié à la glycine et qui reconnait le codon GCC) et 5’tRFIGlu/CTC sont
capables d’activer la transcription de leur propre gène ce qui augmente la quantité d’ARNt
disponible. Cela a lieu autour de la MBT (transition mi-blastuléenne) chez le poisson-zèbre et si on
inhibe ce phénomène, le développement est anormal. Il s’agit d’une boucle de rétroaction positive
qui doit augmenter la production d’ARNt pour permettre de traduire les nouveaux ARNm à la
reprise de la transcription lors de la MBT et pour pouvoir produire une quantité importante de
nouvelles protéines (Chen et al., 2021).

Dans le cytoplasme, la région 3’ non codante des ARNm permet de contrôler l’amorçage de la traduction. Ce
contrôle dépend de modifications de la polyadénylation des ARNm qui doivent être stockés dans les cellules.
C’est particulièrement le cas dans les ovocytes où des ARNm sont stockés dans le cytoplasme au cours de
l’ovogénèse et seront indispensables aux premiers stades du développement où il n’y a pas de transcription
(ces ARNm sont codés par des gènes dits à effet maternel). La traduction de ces ARNm stockés doit être
temporairement réprimée, jusqu’à être activée au bon moment après la fécondation. Les ovocytes
contiennent de nombreux ARNm de réserve dont la queue polyA est réduite à 20-40 résidus. Dans ces
conditions, les protéines de liaison à l’extrémité 3’ ne se fixent pas, mais une protéine, la maskine, reconnaît
la courte queue poly A, s’y fixe et interagit avec la coiffe en 5’. Elle empêche alors l’interaction de la coiffe
avec les facteurs d’initiation de la traduction et la fixation de la petite sous-unité des ribosomes. Si
l’ovulation ou la fécondation ont lieu, la maskine est déplacée, ce qui permet à la poly A-polymérase
d’allonger la queue polyA. Les protéines qui participent à la traduction peuvent alors se fixer et favoriser le
recrutement des ribosomes.

214
 Focus sur les ribosomopathies

Les ribosomopathies sont des maladies caractérisées par des mutations dans les
composants du ribosome ou des facteurs clés de la biogenèse du ribosome qui produisent
des phénotypes spécifiques dans divers tissus. Par exemple, l’anémie Diamond Blackfan
(DBA), qui résulte d’une haploinsuffisance de ∼20 différentes protéines ribosomiques
essentielles (RP), a pour symptômes des anomalies congénitales mal comprises, telles que
des malformations craniofaciales et des membres (notamment des doigts), ainsi que
altération de la différenciation érythroïde (Sieff, 2010; Yelick et Trainor, 2015). Le défi
scientifique posé par cette maladie est de comprendre comment ce qui affecte des protéines
qui sont exprimées presque partout puissent avoir des effets aussi spécifiques.

De nombreuses études suggèrent que les phénotypes des ribosomopathies peuvent résulter
de l’activation du facteur de transcription p53 induit par le stress. En particulier, on pense
que des mutations dans les protéines ribosomiques conduisent à la stabilisation et à
l’activation de p53 par un mécanisme dans lequel le stress nucléolaire et la biogenèse de
ribosomes défectueux entraîne l’inhibition du principal régulateur inhibiteur de p53, Mdm2
(Deisenroth et al., 2010; Dutt et al., 2011, Morgado-Palacin et al., 2015). La stabilisation de
p53 contribue aux ribosomopathies via l’activation transcriptionnelle de gènes impliqués
dans la régulation de la prolifération cellulaire et de l’apoptose (Deisenroth et Zhang, 2010).
Le rôle de p53 dans la génération de ces phénotypes est bien mis en évidence lors de
l’examen de l’haploinsuffisance de RP in vivo. Des études sur des modèles de souris et de
poisson zèbre de DBA ont démontré que l’haploinsuffisance de RP peut entraîner des
défauts spécifiques aux tissus, qui peuvent être sauvés par la perte de p53 (Barlow et al.,
2010; Danilova et al., 2008; McGowan et Mason, 2011). Bien que ces résultats mettent en
évidence le rôle de p53 dans le développement de phénotypes de maladies, la façon dont les
effets globaux médiés par p53 sur les cellules, tels que l’arrêt du cycle cellulaire et
l’apoptose, peuvent conduire à des phénotypes de développement aussi spécifiques aux
tissus reste un paradoxe. Alternativement, il a été suggéré que des mutations dans les RP
peuvent conduire à une dérégulation traductionnelle indépendante de p53 (Dalla Venezia
et al., 2019; Khajuria et al., 2018). Malgré cela, les modifications apportées à la traduction
ont été largement inexplorées dans les contextes de développement in vivo associés à
l’haploinsuffisance RP. Une récente étude de culture cellulaire a identifié des défauts de
traduction dans les cellules hématopoïétiques lors de la déplétion des RP habituellement
mutées dans le DBA et suggère que les niveaux de ribosomes peuvent jouer un rôle dans ce
dysfonctionnement (Khajuria et al., 2018). Cependant, il est difficile de savoir comment cette
hypothèse rend compte de phénotypes complexes in vivo et comment elle peut être
conciliée avec le rôle connu de p53 dans l’étiologie des phénotypes de ribosomopathie.

215
Il existe de plus en plus de preuves que le ribosome peut se diversifier structurellement et
fonctionnellement pour réguler la traduction (Gilbert, 2011 ; Sulima et Dinman, 2019). Par exemple,
l’expression spécifique de la grande protéine de sous-unité ribosomique L38 (RPL38) (Kondrashov et al.,
2011) et les segments d’expansion ribosomique (Leppek et al., 2020) régulent la traduction de certains
gènes Hox.
***Figure 4-42. Mutations homéotiques causées par la
présence d’un allèle perte-de-fonction (Ts) du gène
codant la protéine ribosomique Rpl38. Ces modifications
ont été reliées à des altérations des domaines de
traduction des gènes Hox. On en déduit que cette
protéine ribosomique joue un rôle très spécifique pour
la traduction d’une catégorie particulière d’ARNm.
Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4445650/#!po=13.7500

Les paralogues des protéines ribosomiques (RP) diversifient l'activité des ribosomes au cours du
développement des gonades (Hopes et al., 2021), et l'hétérogénéité intracellulaire des ribosomes régule la
traduction (Shi et al., 2017).

Les segments d'expansion (ES) consistent en une multitude de structures d'ARNr qui ressemblent à des
tentacules et qui s'étendent à partir du ribosome central. Les ES sont remarquablement variables en
séquence et en taille à travers l'évolution eucaryote avec des fonctions largement inconnues. En
caractérisant la liaison du ribosome à un élément régulateur dans le 5' UTR de l'ARNm de Hoxa9, des
chercheurs ont identifié une structure secondaire sous la forme d'une tige-boucle modulaire qui se lie à un
seul ES, ES9S. L'édition du génome pour perturber spécifiquement le site de l'interaction Hoxa9-ES9S
aboutit à une production plus faible de la protéine HoxA9 ce qui démontre l'importance fonctionnelle d'une
telle liaison sélective ARNm-ARNr dans le contrôle de la traduction.

Les modifications post-transcriptionnelles des ARNr comme la 2’-O-méthylation sur le ribose peuvent aussi
contribuer à des modifications de l’efficacité de la traduction (Khoshnevis et al., 2022).

Contrôle de la dégradation des ARNm

La déadénylation est une première étape de la dégradation des ARNm cytoplasmiques (Wiederhold
et Passmore, 2010). Le complexe enzymatique impliqué dans le raccourcissement poly(A) est le complexe
CCR4-NOT (Doidge et al., 2012; Temme et al., 2014). Chez les mammifères, l’importance physiologique de
la déadénylation de l’ARNm médiée par le complexe CCR4-NOT a été démontrée dans les spermatocytes et
les ovocytes en parallèle avec la méiose où la dégradation des ARNm est massive (Sha et al., 2018 ; Yu et al.,
2016) puis ce complexe a été retrouvé agir dans de multiples types cellulaires (Mostafa et al., 2020).

216
 ***Figure 4-43. Des transcrits maternels sont
dégradés au cours de la maturation ovocytaire. Cnot6l,
l’un des quatre gènes codant pour les sous-unités
catalytiques du complexe CCR4-NOT de
désadénylation des ARNm, est préférentiellement
exprimé dans les ovocytes et médie la dégradation des
ARNm maternels couplée à la méiose. GVBD =
dégradation de la vésicule germinative = sortie du
blocage de prophase I de méiose lors de l’ovulation.
Source : https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.201899333

La méthylation de l'adénosine est la modification la plus courante de l'ARN chez les eucaryotes. Le groupe
méthyle est attaché à la position azote-6 de l'adénosine, créant la N6-méthyladénosine ou m6A. Cette
modification est reconnue chez la drosophile par la protéine FMR1 au sein d'un motif AGACU sur les ARNm
maternels et aboutit à la stimulation de leur dégradation (Zhang et al., 2022).

Des ARNm peuvent être protégés de la dégradation. Par exemple au cours du développement et de la
physiologie adulte du système nerveux, des protéines se liant à l’ARN appelées HuA, HuB, HuC et HuD
stabilisent deux familles d’ARNm qui, sans ces protéines, seraient dégradées plus vite (Perrone-Bizzozero
et Bird, 2013). Des mutations dans HuD ont été associées à des déclenchements précoces de la maladie de
Parkinson (Nourredine et al., 2005).
***Figure 4-44. Interaction de la protéine de liaison à
l’ARN HuD avec ses ARNm cibles. Les motifs de
reconnaissance d’ARN (RRM) 1 et 2 dans HuD
interagissent avec des éléments riches en AU (ARE) dans
le 3’UTR des ARNm cibles tandis que RRM3 lient et
protègent les longues queues poly(A). Source :
https://www.fbscience.com/Scholar/articles/pdf/Scholar389.pdf

La dégradation peut être précédée de l’élimination de la coiffe 5′ ce qui rend les ARNm cibles incapables
d’être traduits (Charenton et Graille, 2018). La déplétion chez la souris de la protéine qui réalise cette
élimination, Dcp1a, aboutit à une léthalité à E10,5 avec un grand retard de développement, montrant le rôle
fondamental de ce mécanisme (Ibayashi et al., 2021).

Contrôle de la localisation de la traduction

Il existe un premier contrôle de la localisation de la traduction via la reconnaissance du peptide
signal en 5′ de la protéine naissante durant le début de la traduction. Ce peptide signal est reconnu
par un complexe SRP (constitué par 6 protéines et un ARN) qui arrime les ribosomes au réticulum
endoplasmique qui devient granuleux (REG). La protéine en production traverse alors la membrane
du REG. Elle peut s’y arrêter et devenir transmembranaire ou alors poursuivre son passage et se
retrouver dans la lumière du REG. Cela concerne notamment les protéines secrétées qui, lorsqu’elles
sont des morphogènes ou font partie de la matrice extracellulaire, ont un rôle considérable au cours
du développement.

217
 *Figure 4-45. Les protéines synthétisées par les
ribosomes du REG parcourent le système
endomembranaire et peuvent être secrétées (ligands
activant des voies de signalisation par exemple) ou
insérées dans la membrane plasmique (récepteurs des
voies de signalisation par exemple). D'après
https://openstax.org/books/biology-2e/pages/4-4-the-
endomembrane-system-and-proteins

Signalons que le peptide signal est clivé par une peptidase dans le REG et ne fait donc pas partie des
protéines matures.

La localisation de la traduction au REG n'est pas seulement un problème d'adressage. Dans le

système endomembranaire qui est constitué par le REG, l'appareil de Golgi et les vésicules de
sécrétion, les protéines issues de la traduction peuvent subir une maturation et des modifications
post-traductionnelles qui affectent leur fonction de manière essentielle. Parfois, des protéines
chaperons les aident à avoir une conformation correcte. Par exemple, la protéine chaperon Mesd
aide LPR5 et LRP6, les co-récepteurs des ligands Wnt, à avoir une conformation fonctionnelle. En son
absence, les souris mutées présentent des défauts de développement de même nature qu'une
déficience en signalisation Wnt (Hsieh et al., 2003).

Mais à l’intérieur même de la catégorie des protéines traduites dans le cytoplasme (et non pas à la
surface du REG), il peut exister des localisations particulières de la traduction qui résultent de la
localisation des ARNm dans des régions spécifiques de la cellule. Ce ciblage et cette localisation
asymétrique de l’ARNm sont le résultat d’une cascade d’événements ordonnés qui consistent en la
formation d’un complexe ribonucléoprotéique, la translocation du complexe vers les sites
d’ancrage, l’ancrage des particules au cytosquelette et la traduction locale des ARNm.

Dans la plupart des cas, la localisation des ARNm est spécifiée par des séquences de la région 3’ non
traduite (3’UTR) des ARNm. C’est par exemple le cas dans les ovocytes de drosophile et d’amphibien,
les myoblastes, les neurones et les fibroblastes. Dans ces deux derniers types de cellules, les ARNm
de l’actine alpha et gamma sont présents autour du noyau tandis que celui de l’actine beta est
localisé à la périphérie des cellules au niveau des lamellipodes ou des cônes de croissance. L’ARNm
codant cette forme d’actine possède des séquences particulières sur son 3’UTR qui permet ce
transport vers le cortex cellulaire.

Voir une vidéo sur la localisation dynamique de l’ARNm codant l’actine beta dans une cellule en migration :
https://youtu.be/du_iDp_tV5Y : Dynamique en temps réel de l’ARNm de la β-actine dans une cellule en
migration. La localisation de l’ARNm de la β-actine est hautement dynamique et corrélée à la protrusion et
à la migration cellulaires. La traduction de la β-actine se fait donc au plus proche des structures qui en ont
besoin. Dans la vidéo, on utilise la technique de marquage MS2-GFP (MS2 est une protéine qui a une forte
affinité pour les ARN et que l'on peut cibler sur un ARNm particulier) pour visualiser l'ARNm endogène de
la β-actine. La carte des couleurs montre l'intensité de fluorescence représentant la concentration d'ARNm
de β-actine (Hye Yoon Park and Robert H. Singer, Albert Einstein College of Medicine).

218
Les microARN et l’inhibition de la traduction
De curiosité au début des années 2000, les microARN sont passés au statut de composants fréquents
et indispensables pour comprendre l’expression des gènes par régulation de la traduction (Bartel,
2018). On estime que près de la moitié des ARNm codés par le génome humain ont un microARN qui les
contrôle.

Les microARN (miARN) sont produits à partir de transcrits de l’ARN polymérase II, la même qui
synthétise les ARNm. Les transcrits primaires sont longs de plusieurs centaines à plusieurs milliers de
nucléotides et sont appelés pri (pour primary transcript)-miARN. Un pri-miARN peut contenir la séquence
d’un ou de plusieurs miARN. Les miARN sont également produits à partir de certains introns excisés et des
régions 3′ non traduites de certains pré-ARNm. Des structures en épingle à cheveux de 70 nucléotides de
longueur avec un appariement de bases imparfait dans la tige se forment dans les pri-miARN. Une RNase
nucléaire spécifique d’ARN double brin appelée Drosha agit alors dans le noyau avec une protéine appelée
DGCR8 chez l’homme (Pacha chez la drosophile) et clive la région en épingle à cheveux du long précurseur,
générant un pré-miARN.

**Figure 4-46. Etapes de maturation en miARN. D’après https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)62316-

X/fulltext

***Figure 4-47. Clivage d’un pri-miARN (ici pri-miR-9-1)

par Drosha. Notez les structures secondaires de l’ARN
qui sont spécifiquement reconnues par la RNAse. D’après
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-
1247(18)31984-3

Selon la structure secondaire du pri-miRNA des clivages alternatifs peuvent être produits par Drosha,
augmentant le répertoire de cibles dont la traduction sera inhibée à partir d’un seul pri-miRNA (Bofill-De
Ros et al., 2019). Certains pri-miRNA sont polycistroniques, c'est-à-dire qu'ils forment plusieurs boucles qui
donneront naissance à plusieurs microARN différents (tels miR156, miR166 ou miR395 chez les
Angiospermes) (Merchan et al., 2009).

219
 **Figure 4-48. Un exemple de pri-miARN
polycistronique. Ici le pri-miARN permettant de générer
les miARNs miR395m à miR395x chez le riz.
Source : https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2009-10-12-r136

Signalons que des précurseurs de microARN sont aussi générés à partir d'introns selon des modalités
différentes de celles décrites ci-dessus. On appelle ces microARN des mirtrons (Ruby et al., 2007).

Quel que soit les modalités de leur production, les pré-miARN sont reconnus et exporté du noyau par
l'Exportine-5 (Yi et al., 2003). Une fois dans le cytoplasme, la RNase spécifique de l’ARN appelée Dicer agit
avec une protéine de liaison à l’ARN double brin appelée TRBP chez les humains (Loquacious chez la
drosophile) pour cliver davantage le pré-miARN en un miARN double brin. Celui-ci fait environ deux tours
d’une hélice d’ARN de forme A, avec des brins de 21-23 nucléotides de long et deux nucléotides non appariés
à chaque extrémité. Enfin, l’un des deux brins est sélectionné pour l’assemblage dans un complexe de
silencing induit par l’ARN (RISC) où la région 5′ du miARN monocaténaire est attachée à la protéine
Argonaute (Iwasaki et al., 2010). Le miARN reconnait sa séquence cible, le plus souvent dans la région
3’UTR de l’ARNm cible. Le blocage de la traduction se fait alors de différentes manières, par blocage
de l’initiation ou de l’élongation de la traduction. Les protéines de la famille Argonaute sont capables de
se lier à la guanosine méthylée de la coiffe 5′ des ARNm et sont essentiels dans ce processus (Djuranovic et
al., 2011). Certains miARN et complexes associés sont capables de recruter des endonucléases qui
détruisent les ARNm.

Les miARN sont clairement essentiels pour le développement embryonnaire et ce, dès les stades
précoces. En effet, le knock-out de Dicer chez la souris aboutit à une impossibilité d’obtenir des
miARN matures et les embryons arrêtent leur développement autour de la gastrulation avec une
taille réduite et une absence d’induction du mésoderme (Bernstein et al., 2003). De même chez
Arabidopsis, le mutant perte-de-fonction dcl1 (Dcl1 est l'équivalent de Dicer chez les plantes) aboutit à une
léthalité embryonnaire (Schauer et al., 2002).

Certains miARN peuvent être produits de manière massive et avoir de multiples cibles : c’est le cas de miR-
430 chez le poisson-zèbre. Lors de l’activation de la transcription dans l’embryon (MBT), des centaines
d’ARNm maternels perdent leur queue polyA et sont dégradés. Ce processus est provoqué par la fixation
sur leur 3’UTR de miR-430 qui est codé par un gène qui a 90 copies dans le génome du poisson-zèbre. Plus
tard, miR-430 a un rôle dans la neurogenèse (Takacs et Giraldez, 2016). Inversement, l'expression d'un
même ARNm peut être contrôlée par plusieurs miARN (comme par exemple MYB2D contrôlé par miR-828
et miR-858 (Guan et al., 2014)).

220
Des surexpressions ou des expressions trop faibles de miARN ont été associées à des tumeurs et également
une partie des déficiences mentales de la trisomie 21 trouve son origine dans la surexpression de miR-155
qui est codé par un gène sur le chromosome 21 (Nuovo et al., 2018). Des protéines peuvent aussi inhiber la
maturation des miARN comme Lin28 qui se fixe sur les pre-miARN de Let7 et empêche les clivages
nécessaires par Dicer (Nam et al., 2011). Cette régulation joue un rôle important dans le contrôle des cellules
souches et la tumorigénèse.

**Figure 4-49. L'équilibre entre le miARN Let-7 et l'inhibiteur de sa maturation LIN28 a une importante signification
biologique. L'expression de LIN28 est élevée dans les cellules indifférenciées où ces protéines bloquent la maturation
de la famille des microARN Let-7. Au fur et à mesure que la différenciation progresse, l'expression de LIN28 diminue,
entraînant la production de microARN Let-7 matures qui régulent eux-mêmes négativement LIN28. Lors de la
tumorigenèse, de la cicatrisation des plaies (en particulier chez les jeunes mammifères) et de la génération de cellules
iPS, LIN28 contribue à la pluripotence, à l'auto-renouvellement, à la dédifférenciation et/ou à la tumorigenèse
(transformation). Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2017.00031/full

Chez les végétaux, les microARN peuvent être transportés sur de longues distances via les plasmodesmes
ou le phloème et agir de manière non-cellulaire autonome. Par exemple, des microARN sont synthétisés
dans les tiges en cas de carence nutritive et transportés vers les racines où elles participent à l'activation
des réponses pour compenser ces carences (Buhtz et al., 2010, Lin et al., 2008). Chez les Fabacées, miR-
2111-3 est un microARN exprimé dans les cellules du phloème des feuilles et qui est transporté par la sève
brute et inhibe dans les racines l'expression de TML (TOO MUCH LOVE) qui est un inhibiteur de la formation
de nodosités (Tsikou et al., 2018).
*Figure 4-50. miR-2111-3 est exprimé dans le phloème
des feuilles matures de la Fabacée Lotus japonicus et est
transporté dans les racines où il provoque la
dégradation de l'ARNm de TML. A gauche, activité du
gène rapporteur GUS sous le contrôle du promoteur du
gène codant miR-2111-3. yl = feuilles jeunes; ml =
feuilles matures. A droite, on sépare les parties
aériennes et les racines de la plante et on détecte par RT-
qPCR les quantités de miR-2111-3 et de l'ARNm TML
dans les racines isolées relativement aux racines laissées
en contact avec les parties aériennes. Source :
https://asset-
pdf.scinapse.io/prod/2889513053/2889513053.pdf

221
LA CARTE MENTALE

222
PARTIE 5

Structures et processus cellulaires

Le cytosquelette

e cytosquelette est un réseau de fibres protéiques dans le cytosol et aussi dans le nucléoplasme.

L
Il assure une fonction de soutien de structures cellulaires (comme les microvillosités) et de
cohésion des tissus (via les jonctions adhérentes auxquelles il participe), permet les
déformations cellulaires transitoires et la mobilité cellulaire (migration cellulaire,
déplacement des spermatozoïdes…) et assure la mise en mouvement de structures intracellulaires
(organites, vésicules, chromosomes lors de la division cellulaire…).

En résumé, le cytosquelette est la charpente de l’architecture de la cellule et contrôle ses

mouvements et les mouvements de ses structures internes. Il est composé de microfilaments
(actine), de microtubules (tubuline) et de filaments intermédiaires.
*Figure 5-1. Les trois composantes du cytosquelette.
D'après https://biosignaling.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12964-021-00713-2

La nature dynamique du réseau de microfilaments et de microtubules est une propriété

fondamentale pour de nombreuses fonctions assurées par le cytosquelette.

Les microfilaments d’actine

Voir cette vidéo en introduction : https://youtu.be/G2s4ApgTHaU

L’actine est une famille de protéines globulaires multifonctionnelles qui forment des
microfilaments dans le cytosquelette et des filaments minces dans les fibrilles musculaires. On la
trouve dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes, où elle peut être présente à une concentration
supérieure à 100 µM; sa masse est d’environ 42 kDa, avec un diamètre de 4 à 7 nm. C’est la protéine la plus
abondante dans un grand nombre de cellules animales (à commencer par les cellules musculaires mais pas
seulement). Chez les vertébrés, il y a trois groupes principaux d’isoformes d’actine :

• l’α-actine, qui se trouve dans les structures contractiles musculaires;

• la β-actine, trouvée aux bords en expansion des cellules qui produisent des protrusions pour
se déplacer (lamellipodes...);

• la γ-actine, qui se trouve dans les filaments des fibres de tension.

Voir la vidéo sur la localisation de l’ARNm codant la β-actine dans une cellule en migration :
https://youtu.be/du_iDp_tV5Y : La localisation de l’ARNm de la β-actine est hautement dynamique et
corrélée à la protrusion et à la migration cellulaires. La traduction de la β-actine se fait donc au plus proche
des structures qui en ont besoin. Dans la vidéo, on utilise la technique de marquage MS2-GFP (MS2 est une
223
protéine qui a une forte affinité pour les ARN et que l'on peut cibler sur un ARNm particulier) pour visualiser
l'ARNm endogène de la β-actine. La carte des couleurs montre l'intensité de fluorescence représentant la
concentration d'ARNm de β-actine (Hye Yoon Park and Robert H. Singer, Albert Einstein College of
Medicine).

Une protéine d’actine est la sous-unité monomérique des microfilaments, l’un des trois principaux
composants du cytosquelette. L’actine peut être présente sous forme de monomère libre appelé
actine G (globulaire) ou dans le cadre d’un microfilament, sous la forme d’un polymère linéaire
appelé actine F (filamenteux) qui fait 7 nm de diamètre. L’incorporation d’une molécule d’actine G dans
un microfilament se fait avec l’hydrolyse d’un ATP. Les monomères d’actine G s’agencent selon une
hélice dextre avec des liaisons non covalentes. Un tour d’hélice est formé de 13 monomères. Deux brins
F-actine parallèles doivent pivoter de 166 degrés pour être correctement placés l’un sur l’autre. Cela crée
la structure en double hélice des microfilaments trouvés dans le cytosquelette.
*Figure 5-2. Structure de l’actine sous sa forme G et sa
forme F. Les microfilaments d’actine sont polarisés avec
une extrémité dite barbelée (quelquefois appelée +) où
les nouveaux monomères sont ajoutés (avec l’aide de la
profiline) et une extrémité pointue où les monomères
sont enlevés (quelquefois appelée -). Le microfilament
d’actine est donc en équilibre dynamique.

De nombreuses protéines interagissent avec l'actine et elles peuvent être classifiées en plusieurs
catégories :

(1) celles qui permettent la nucléation d'un nouveau microfilament (Arp2/3, formines...)
(2) celles qui régulent la polymérisation/dépolymérisation de microfilaments pré-existants
(profiline, ADF/cofiline...)
(3) celles qui permettent un assemblage de plusieurs microfilaments (fimbrine, villine, α-
actinine...)
(4) celles qui utilisent les microfilaments pour des mouvements ou le transport (myosines...)

Des facteurs de nucléation sont nécessaires pour stimuler la polymérisation de l'actine. Un de ces
facteurs de nucléation est le complexe Arp2/3, qui imite un dimère de G-actine afin de stimuler la
nucléation (ou la formation du premier trimère) de la G-actine monomère. Le complexe Arp2/3 se
lie aux filaments d'actine à 70 degrés pour former de nouvelles branches d'actine à partir des
filaments d'actine existants. La nucléation médiée par Arp2/3 est nécessaire pour la migration
cellulaire.

224
 *Figure 5-3. Formation d’une nouvelle branche
d’actine F par le complexe Arp2/3.

*Figure 5-4. Les mélanoblastes ne migrent pas à

destination en absence de Arp3. Les
mélanoblastes sont des dérivés de crêtes
neurales qui migrent sur de très longues
distances avant de s’associer avec l’épiderme.
Grâce au système Cre/Lox, Arp3 a été délété dans
les mélanoblastes uniquement. On obtient des
souris qui ont d’importants défauts de
pigmentation. Une analyse plus poussée montre
que cela est essentiellement dû à une migration
déficiente des mélanoblastes. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/147/22/dev194555/226206/The-Arp2-3-complex-is-crucial-for-colonisation-of

Un lamellipode est une protrusion cellulaire générée par la force de la polymérisation des
microfilaments contre la membrane plasmique. Dans le cas où il est soumis à une force de compression
(rencontre d'un obstacle par exemple) qui plie les microfilaments d'actine, les nouveaux microfilaments
générés grâce à Arp2/3 seront préférentiellement orientés pour croître contre la force et les microfilaments
orientés plus latéralement verront leur croissance arrêtée (Winkelman et al., 2020). Le réseau de
microfilaments en croissance réagit ainsi rapidement aux contraintes mécaniques subies par la cellule.
**Figure 5-5. Biais dans le sens de la ramification
lorsqu'un lamellipode est soumis à des forces de
compression. Dans un réseau ramifié, les forces de
compression plient les filaments loin de la membrane
plasmique. Cela stimule les ramifications du côté de la
membrane comprimée (flèches bleu cyan) et inhibe la
croissance des microfilaments qui se développent vers le
côté opposé par coiffage (rouge). Source :
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1114292109

Arp2/3 sont également importants pour l'organisation du réseau de microfilaments chez les plantes et leur
absence cause de multiples défauts de morphogenèse (dans l'épiderme, les trichomes, les poils absorbants
notamment) (Mathur et al., 2003).

225
 *Figure 5-6. Un défaut de complexe Arp2/3 chez
Arabidopsis provoque des défauts d'organisation du
tissu épidermique des cotylédons. A gauche, on
observe la surface épidermique de cotylédons de
plants d'Arabidopsis sauvages et à droite, de plants
mutants perte-de-fonction pour le gène WURM qui
code pour Arp2 et pour le gène DISTORTED1 qui
code pour Arp3. Les cellules épidermiques
présentent un défaut majeur d'expansion. Source :
https://academic.oup.com/plcell/article/15/7/1632/6010067

Les formines constituent une autre famille impliquée dans la nucléation des microfilaments d’actine. Elles
agissent en aval de la signalisation activée par la petite GTPase RhoA. Les souris qui n’ont plus Fhod3, un
membre de cette famille, ne sont pas capables de refermer leur tube neural lors de la neurulation car la
constriction apicale qui dépend de l’actine dans les cellules de la plaque neurale ne peut pas se faire
correctement.
**Figure 5-7. Un facteur impliqué dans la
nucléation de l’actine est indispensable à la
fermeture du tube neural et à la bonne organisation
du neuroépithélium. Images de microscopies
confocales de coupes transversales au niveau du
rhombomère 4 d’embryons de souris sauvages et
Fhod3-/- à E9.5. WGA = wheat germ agglutinin,
protéine qui se fixe sur les résidus glucidiques de
protéines membranaires (= marqueur de
membrane plasmique). Hoeschst = marqueur
d’ADN. Barre d’échelle = 50 µm. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)39386-8/fulltext

La dynamique de polymérisation de l’actine peut être modifiée. La profiline est une protéine qui
aide l’actine F à se polymériser du côté barbelé du microfilament existant. Elle permet d’échanger
un ADP contre un ATP qui est indispensable à la polymérisation. La protéine ADF (pour Actin
Depolymerizing Factor) ou destrine accélère le “tapis roulant” de l’actine, c’est-à-dire la
dépolymérisation du côté pointu, augmentant la concentration d’actine G, ce qui provoque
l’accélération de la polymérisation du côté barbelé.

226
 *Figure 5-8. Rôle de l’ADF (ou destrine) dans l’accélération du dynamisme de la polymérisation/dépolymérisation
de l’actine. Les lettres dans les formes correspondent à diverses conformations de l’actine. D’après
https://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.472.1017&rep=rep1&type=pdf

D'autres protéines de la même famille qu'ADF, les cofilines, ont des fonctions similaires. Lorsqu'elles sont
phosphorylées sur la sérine 3, elles sont incapables de se fixer avec une affinité suffisante sur les
microfilaments, ce qui permet à la cellule contrôler leur activité (Elam et al., 2017).
**Figure 5-9. La forme phosphorylée de la cofiline a
une moindre affinité pour l'actine. On mesure la
quantité de cofiline associée in vitro à des
microfilaments selon sa concentration sous sa forme
sauvage (WT) ou sous une forme mutée où la sérine
3 est remplacée par l'acide aspartique, chargée
négativement et qui mime une phosphorylation. On
voit que la courbe est décalée vers la droite. Notez
l'aspect sigmoïde de la courbe de la forme mutée qui
montre un effet coopératif de la fixation des cofilines
dans ce cas. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-
9258(20)32854-4/fulltext

Les protéines CP dites de capping, quant à elles, bloquent les côtés barbelés ce qui inhibe la croissance des
microfilaments avec CP et favorise ainsi la croissance des microfilaments sans CP.

La capacité d’une cellule à former ou à détruire de manière dynamique des microfilaments fournit
l’échafaudage qui lui permet de se remodeler rapidement en réponse à son environnement ou aux
signaux internes de l’organisme. Les monomères formant l’actine sont reliés par des liaisons faibles
et non covalentes d’où la rapidité et la réactivité en ce qui concerne la polymérisation et la
dépolymérisation.

Les microfilaments peuvent être organisés en faisceaux parallèles (comme dans les microvillosités
de certaines cellules épithéliales), en réseaux maillés (comme dans les lamellipodes ou dans le
réseau sous-membranaire) ou en faisceaux contractiles (comme dans les fibres musculaires ou dans
les cellules en migration).

227
*Figure 5-10. Trois arrangements des microfilaments d’actine avec les protéines associées. La fimbrine crée des
arrangements très serrés de microfilament qui ne permettent pas à la myosine II de s'y associer. On trouve
notamment la fimbrine à la base des microvillosités mais c'est la villine qui la remplace dans les régions plus apicales.
Source : https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap4/co/module_Chap4_8.html

*Figure 5-11. Organisation des microfilaments dans les microvillosités. Les microvillosités sont des replis de la
membrane plasmique de 0,5 à 1 µm de long, soutenus par des microfilaments (chaque microvillosité en contient
entre 20 et 30) et qui permettent d'augmenter la surface d'échanges dans la partie apicale de certaines cellules
épithéliales (notamment les entérocytes de l'intestin qui ont environ 3000 microvillosités formant une "bordure en
brosse" au contact de la lumière intestinale). Source : https://rnbio.upmc.fr/microvillosites

**Figure 5-12. Homodimère d'α-actinine. L'α-

actinine permet de relier deux microfilaments au
sein des faisceaux contractiles et de les maintenir à
la bonne distance pour que la myosine-II puisse agir.
Cet homodimère est formé de deux protéines en
configuration anti-parallèle. ABD = domaine de
fixation à l'actine. SR = répétitions de type spectrine.

228
 Les domaines EF sont de type calmoduline et
peuvent fixer des ions Ca2+. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1917269
117

Le réseau d’actine dans une cellule peut être visualisé grâce à la phalloïdine couplée à un
fluorophore. La phalloïdine est un peptide bi-cyclique extrait du champignon Amanita phalloides,
l’amanite phalloïde. Elle se lie spécifiquement aux filaments d’actine, empêchant sa
dépolymérisation et empoisonnant la cellule. Cette propriété de liaison avec l’actine lui permet
d’être utilisé en imagerie cellulaire afin de visualiser les polymères d’actine quand la phalloïdine est
couplée avec des molécules fluorescentes comme l’Alexa 488 (émet dans le vert) ou l’Alexa 555
(émet dans le rouge).

Dans les cellules mésenchymateuses en migration, entre 10 et 30 microfilaments d'actine peuvent

s'associer et former des fibres de tension (ou fibres de stress). Ces fibres sont reliées aux points
focaux d'adhérence qui servent de points d'appui de la cellule sur la matrice extracellulaire.

*Figure 5-13. Points focaux d'adhérence et fibres de stress (ou de tension) d'actine (A) Superposition de la projection
maximale d'images de microcopie confocale d'une cellule d'ostéosarcome humain exprimant la protéine paxilline-
GFP (vert, seul en C) et colorée avec de la phalloïdine-CF405 (rouge, seul en B), une toxine qui se lie spécifiquement
à l'actine F. Barre d'échelle : 5 µm. Source : https://www.mdpi.com/2079-7737/10/11/1189

229
 *Figure 5-14. Liens fonctionnels microfilaments d’actine/matrice extracellulaire. Structure des fibres de tension (ou
de stress) et accrochage aux points focaux d’adhérence. Source :
https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap4/co/module_Chap4_9.html

**Figure 5-15. Trois types de fibres de stress (de

tension) visibles dans cette cellule d’ostéosarcome. Les
fibres de stress ventrales sont accrochées des 2 côtés à
des points focaux d’adhérence et les fibres de stress
dorsales seulement d’un côté. L’actine est révélée par
la phalloïdine et les points focaux d’adhérence par un
anticorps anti-phosphotyrosine. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542796/

L’actine participe à de nombreux processus cellulaires importants. Citons la contraction musculaire,

la motilité cellulaire, le guidage axonal, la division cellulaire, notamment la cytokinèse (ou
cytodiérèse), la signalisation cellulaire et l’établissement et le maintien des jonctions cellulaires et
de la forme cellulaire. Beaucoup de ces processus sont médiés par des interactions de l’actine avec
des complexes protéiques associées aux membranes cellulaires.

Dans la contraction musculaire, l’actine polymérisée se lie à une autre protéine, la myosine. Cette
dernière s’accroche au polymère d’actine et la fait coulisser par rapport à elle; à l’autre bout du
filament de myosine, un autre filament d’actine procède de façon symétrique; les deux filaments
d’actine se rapprochent donc l’un de l’autre, c’est la contraction musculaire.

230
 *Figure 5-16. Organisation d’un sarcomère. Chaque sarcomère (qui mesure environ 2 µm de longueur) peut être
divisé axialement en différentes zones en fonction de son ultrastructure : la bande I (isotrope) où seuls des filaments
fins d'actine sont présents, la bande A (anisotrope) qui contient des filaments d'actine et les filaments épais de
myosine qui se chevauchent, le disque Z qui borde le sarcomère à ses extrémités, ancrant les extrémités barbelées
(+) des filaments d'actine, et la bande H au centre, où seuls les filaments de myosine sont présents et réticulés. Les
filaments minces sont orientés de manière antiparallèle au niveau des disques Z et associées par de multiples
interactions moléculaires. En fait, plus de 50 protéines font partie des disques Z matures, et elles sont considérées
comme l'une des structures macromoléculaires les plus complexes dans les organismes vivants. Les disques ne
jouent pas uniquement un rôle dans le maintien de l'architecture des myofibrilles, mais jouent également un rôle
dans la signalisation, la mécanodétection et la mécanotransduction. Les protéines du disque Z ont récemment été
identifiées comme étant la cible de multiples phosphorylations, modulant ainsi directement les interactions et la
dynamique des protéines.

Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Sarcom%C3%A8re#/media/Fichier:Sarcomere_FR.svg

Dans les cellules musculaires striés squelettiques, l'actine interagit avec la troponine et la tropomyosine qui
rendent l'interaction avec la myosine dépendante de la présence de Ca 2+ dans le cytosol.
*Figure 5-17. L'interaction actine-myosine dans les
cellules musculaires striées squelettiques dépend de la
concentration cytosolique des ions Ca2+ grâce à la
troponine et à la tropomyosine. D'après
https://www.nature.com/scitable/content/troponin-
and-tropomyosin-regulate-contraction-via-calcium-
14723328/

L'interaction actine/myosine qui se passe à grande échelle lors de la contraction des muscles peut
se passer à plus petite échelle avec de la myosine dite non musculaire lors de la déformation des
cellules, comme par exemple lors de la constriction apicale nécessaire pour la formation des cellules
en bouteille au cours de la gastrulation des amphibiens ou pour la formation du tube neural lors de
la neurulation. L'interaction actine/myosine joue aussi un rôle dans la migration. Pour s'associer à
l'actine et se déplacer sur le microfilament, la myosine doit avoir sa chaine légère phosphorylée par des
231
kinases de type ROCK (pour Rho-associated protein kinase). Le mécanisme est donc différent de la
contraction musculaire.

L’actine joue un rôle dans la phase finale de la mitose et des divisions méiotiques : la cytodiérèse.
Elle forme l’anneau contractile permettant de séparer les cellules-filles. La constriction de cet anneau
est essentielle. Il est composé de faisceaux de filaments d’actine se chevauchant dans des orientations
mixtes, de moteurs myosine-II non musculaires, de protéines de réticulation et de protéines d’échafaudage.
C'est l'activité équatoriale de la petite GTPase RhoA qui contrôle la mise en place de ces faisceaux de
filaments d'actine (Nishimura et al., 2006). Le recrutement et l'activation de la myosine II se fait par ROCK
qui est activé par RhoA (Matsumura, 2005).

*Figure 5-18. Localisation de RhoA et de l'ADN au cours de la cytokinèse dans les cellules HeLa. En interphase, la
petite GTPase RhoA (panneaux supérieurs) se distribue de manière diffuse dans le cytoplasme. Après le début de la
mitose, RhoA commence à s'accumuler dans le cortex cellulaire (métaphase). L'accumulation de RhoA au niveau du
cortex équatorial est détectée juste avant la formation du sillon de clivage (tête de flèche) et après quoi il forme une
structure annulaire à ce niveau (anaphase à télophase). Enfin, RhoA se localise au milieu du corps (télophase tardif).
Les panneaux inférieurs montrent l'ADN coloré par DAPI. Barre d'échelle : 10 μm. Source :
https://journals.biologists.com/jcs/article/119/1/104/28780/Centralspindlin-regulates-ECT2-and-RhoA

Pendant longtemps, il a été suggéré que la constriction annulaire est entraînée par un glissement relatif des
filaments d’actine propulsé par la myosine, analogue à la contraction du sarcomère musculaire. Mais
contrairement aux sarcomères musculaires, l’orientation des filaments d’actine formant l’anneau est
désordonnée. Des facteurs supplémentaires sont donc nécessaires pour expliquer le fonctionnement des
anneaux contractiles. Il est intéressant de noter que les phases de la constriction de l’anneau se sont révélées
indépendantes de la myosine-II. Par exemple, dans les embryons de C. elegans, la constriction se poursuit
après l’inactivation conditionnelle de la myosine-II et dans les embryons de drosophile, une phase
indépendante de la myosine-II a été identifiée lors du clivage. De plus, plusieurs organismes manquent
complètement de myosine-II. Les sources possibles de la force motrice sous-jacente aux mécanismes de
constriction indépendants de la myosine pourraient être des protéines de réticulation de l’actine et du
désassemblage des filaments d’actine. L’anilline, une protéine d’échafaudage et de réticulation de l’actine
non motrice hautement enrichie dans l’anneau contractile pendant la cytokinèse est impliquée. Elle entraîne
de manière autonome le glissement relatif des filaments d’actine et se couple avec le désassemblage des
filaments d’actine pour générer la contractilité. L’anilline est contrôlée par la petite GTPase Rho.

232
 ***Figure 5-19. La petite GTPase Rho contrôle l'anneau
contractile lors de la cytodiérèse. La GTPase Rho est
l'activateur principal de la cytodiérèse. Rho-GTP active
de multiples effecteurs essentiels : Rho kinase, Citron
kinase, la formine Diaphanous et la protéine
d'échafaudage multi-domaines, anilline. L'anilline est
l'organisateur principal de la cytodiérèse qui peut lier de
nombreux autres composants du réseau de signalisation
Rho et de la membrane plasmique. Dans l'anneau
contractile, l'anilline organise deux sous-réseaux
cytosquelettiques dépendants de Rho : l'actomyosine et
l'anillo-septine. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.575226/full

Signalons que dans les ovocytes de Mammifères, il n'y a pas de centrioles et bien que des microtubules dits
acentriolaires s'organisent, ils ne sont pas aussi longs que les microtubules astraux que l'on trouve
habituellement lors de la mitose. Par conséquent, le positionnement du fuseau méiotique très excentré (qui va
produire un globule polaire) ne peut dépendre que marginalement des microtubules mais dépend
essentiellement des microfilaments d'actine. Deux éléments interviennent : un premier réseau d'actine initiée
par les nucléateurs Formine-2 et Spire1/2 puis un autre réseau initié par Arp2/3 (Azoury et al., 2008; Pfender
et al., 2011, Holubcova et al., 2013; Chaigne et al., 2013). La myosine-II en interaction avec l'actine, tire le
fuseau mitotique vers la partie corticale de l'ovocyte (Simerly et al., 1998), ce qui permet d'excentrer
fortement les chromosomes et permet la division très asymétrique donnant naissance à un ovocyte et à un
globule polaire.

Chez les végétaux, le réseau de microfilaments d'actine est impliqué dans de nombreux processus
morphogénétiques à l'échelle cellulaire, notamment le développement des trichomes à la surface des
feuilles (Mathur et al., 1999) et le développement des poils absorbants dans les racines (Takatsuka et Ito,
2020).
**Figure 5-20. Contrôle par le cytosquelette du
positionnement des poils absorbants. ACT2 et ACT7
sont des isoformes particulières d'actine-G. Les lignes
noires représentent les interactions protéiques
directes. Les voies de signalisation de l'éthylène et de
l'auxine convergent vers le complexe AIP1-2-ACT7
pour contrôler le positionnement de la formation des
poils absorbants, qui est finalement un cas de mise en
place de polarité planaire. Cela se fait en coordination
avec le positionnement des petites protéines G de type
Rho (ROP2/4/6). Les flèches noires pleines et en
pointillés représentent respectivement une action
directe ou indirecte sur la cible. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2020.580935/full

La croissance du tube pollinique est également sous la dépendance du comportement dynamique du réseau
de microfilaments d'actine, notamment pour le contrôle de l'exocytose polaire qui permet la croissance. Le
dynamisme des microfilaments est sous le contrôle de GTPase de type Rho, ROP1.

233
 **Figure 5-21. ROP1 et le dynamisme de l'actine lors de
la croissance du tube pollinique. Le réseau est composé
de plusieurs voies favorisant de manière coordonnée
l'exocytose à la pointe du tube pollinique et les boucles
de rétroaction positives et négatives, qui peuvent
s'équilibrer pour maintenir une certaine taille de la coiffe
ROP1 apicale qui définit le domaine de croissance de la
pointe. ROP1 est activé localement à la membrane
plasmique ce qui active plusieurs voies menant à
l'exocytose polaire. La voie RIC4 favorise l'assemblage de
la F-actine et induit l'accumulation de vésicules
exocytaires à la pointe, et favorise les boucles de
rétroaction positives pour augmenter la zone d'activité
de ROP1 en ciblant les composants en amont de ROP1
tels que RopGEF et PRK2. En parallèle, ROP1 active aussi
RIC3 qui provoque une entrée de Ca2+ qui facilite
l'exocytose tout en dépolymérisation les microfilaments
qui ne sont plus utiles. Source :
http://europepmc.org/article/MED/21729760

Dans les cellules photosynthétiques, lorsque la source de lumière change de position, les chloroplastes se
déplacent de telle manière à absorber la lumière de manière optimale : maximum d'absorption dans la
pénombre mais minimum d'absorption en lumière vive. Ce mouvement induit par la lumière et l'ancrage
final des chloroplastes dépend des microfilaments (Kadota et al., 2009). Chez certaines plantes, un maillage
de filaments d'actine enveloppe les chloroplastes lorsqu'ils sont ancrés et cette disposition se transforme
en une disposition plus linéaire lorsque les chloroplastes se déplacent. La protéine CHUP1 fait le lien entre
les chloroplastes et les microfilaments d'actine (Kong et al., 2020).

**Figure 5.22. Contrôle des mouvements chloroplastiques. La protéine phot2, qui fonctionne comme un
photorécepteur pour la réponse d'évitement des fortes intensités lumineuses, se localise dans l'enveloppe externe
du chloroplaste. Phot1 et phot2, qui interviennent dans la réponse d'accumulation, se localisent sur la membrane
plasmique. Les signaux de la réponse d'accumulation et d'évitement sont libérés par les photorécepteurs et sont
reçus par un récepteur de signal probablement associé à CHUP1, qui ancre le chloroplaste à la membrane plasmique
(PM) via une protéine membranaire inconnue (marquée X). Une polymérisation potentielle dépendante de CHUP1
des filaments d'actine est initiée par l'incorporation d'actine liée à la profiline. KAC agit pour favoriser la
polymérisation d'actine avec CHUP1 ou dans le maintien des filaments d'actine, au moins dans la réponse
d'accumulation. Les filaments d'actine polymérisés sont regroupés par THRUMIN1, qui se localise sur la membrane
plasmique, de sorte que les filaments d'actine y sont fixés. Ainsi, le chloroplaste glisse vers l'avant par l'actine
nouvellement polymérisée. Source : https://journals.biologists.com/jcs/article/131/2/jcs210310/76989/Actin-
mediated-movement-of-chloroplasts

234
Le réseau de microtubules

*Figure 5-23. Immunofluorescence de microtubules dans des cellules endothéliales humaines en culture. Notez
comme les microtubules sont plus denses autour d’une région à côté du noyau. C’est là que se trouve le centrosome,
le centre organisateur des microtubules. Source.

Voir la vidéo de présentation des microtubules : https://youtu.be/86ts4RjitYE

Les microtubules sont des fibres creuses de 24 nm de diamètres, formées de 13 protofilaments,

chacun formés d’hétérodimères de tubuline α et β.
*Figure 5-24. Structure d'une portion de microtubule.
Les microtubules sont creux. Leurs parois sont
constituées de 13 dimères polymérisés d'α-tubuline et
de β-tubuline (image de droite). L'image de gauche
montre la structure moléculaire de la tubuline. Source :
https://opened.cuny.edu/courseware/lesson/622/overview

Les microtubules sont polarisés avec un pôle + très dynamique et un pôle – plus stable.
L’allongement de l’extrémité + se fait par ajout de dimères α-β-tubuline et hydrolyse du GTP lié à la
β-tubuline en GDP+Pi. L’hydrolyse a lieu avec un petit retard par rapport à l’incorporation générant
une coiffe GTP qui est importante pour la stabilité des microtubules (Brouhard et Rice, 2018).

235
 *Figure 5-25. Dynamisme des microtubules. Les
microtubules grandissent par l'addition de dimères de
tubuline liée au GTP. Lorsque cette coiffe GTP est perdue,
les microtubules subissent une "catastrophe", un
raccourcissement rapide par dépolymérisation. D’après
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2018.00165/full

**Figure 5-26. Ralentir l’hydrolyse du GTP stabilise les

microtubules. Kymographes représentant une
agrégation d’images dans le temps (axe vertical). La
tubuline est couplée à un fluorophore vu en mauve, et
EB3, une protéine qui se fixe aux extrémités couvertes de
GTP des microtubules est couplée à la GFP. E254D est un
mutant de la β-tubuline chez qui la lyse du GTP est
ralenti. Source :
https://elifesciences.org/articles/51992

L’agencement général du réseau microtubulaire d’une cellule est sous le contrôle d’un centre
organisateur, le centrosome, un complexe protéique organisé autour de 2 centrioles. De là,
rayonnent les microtubules avec leurs extrémités – du côté du centrosome.

*Figure 5-27. Centrosome formé de 2 centrioles. L'un est dit fils car il dérive de l'autre centriole au cours du cycle
cellulaire précédent. L'ensemble "centrioles + matériel péricentriolaire" est appelé centre organisateur des
microtubules ou MTOC. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Centrosome#/media/Fichier:Centrosome_(standalone_version)-fr.svg

236
 *Figure 5-28a. Polymérisation des microtubules à partir du centriole. Notez la présence de γ-tubuline (=gamma-
tubuline, en rose) dans le complexe TuRC (Tubulin Ring Complex) qui initie la formation du microtubule.

Source : https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap4/co/module_Chap4_20.html

**Figure 5-28b. Initiation de la formation d'un microtubule.

(A) Les molécules de γ-tubuline (jaune) dans le γ-TuRC sont positionnées dans une hélice à un tour via leur liaison
aux protéines GCP (bleu). (B) Les molécules de γ-tubuline se lient aux dimères α / β-tubuline provenant du cytosol
et cela favorise l'interaction latérale entre les dimères α / β-tubuline à mesure qu'ils se transforment en
protofilaments (un protofilament est une seule chaîne bout à bout de dimères de tubuline). (C) L'assemblage des
microtubules progresse lentement à travers une étape instable où le démontage est plus probable que l'assemblage
continu (comme indiqué par l'épaisseur des flèches bidirectionnelles). (D) L'assemblage finit par atteindre un stade
stable, où un microtubule contenant suffisamment de dimères de tubuline s'est formé. (E) Une fois cette étape passée,
la polymérisation des microtubules est favorisée et peut progresser rapidement. Source :
https://portlandpress.com/essaysbiochem/article/62/6/765/78500/Microtubule-nucleation-by-tubulin-complexes-and

Néanmoins, le centrosome n’est pas nécessaire pour que se forment des microtubules. Si on le détruit avec
un laser, des microtubules se formeront ailleurs mais le réseau sera moins organisé. Les cellules végétales
n'ont pas de centrosome (mais ont tout de même le complexe TuRC (Tubulin Ring Complexe avec la γ-
tubuline pour initier la formation des microtubules).

De l’autre côté, du côté positif, les protéines EB se fixent sur la coiffe GTP et contrôlent la dynamique du
réseau (Akhmanova et Steinmetz, 2015).

237
Les tubulines sont particulièrement abondantes dans les neurones (jusqu’à 20 % des protéines totales). Ce
sont les microtubules qui soutiennent les prolongements que constituent les dendrites et l’axone avec de
nombreuses protéines régulatrices associées.

***Figure 5-29. Organisation des microtubules et des protéines associées (MAP) dans les axones et les dendrites.
Dans les axones, les microtubules (MT) forment des faisceaux stables et polarisés, qui assurent l’intégrité structurelle
des axones et servent de “rails” pour guider les protéines motrices dépendantes des MT. Les MT axonales sont
stabilisées par plusieurs MAP dont Tau, MAP1B et DCX. Le cône de croissance contient un ensemble de MT stables et
dynamiques, qui sont essentiels pour l’avancement du cône de croissance d’un axone en développement. Diverses
protéines +TIPs s’accumulent aux extrémités + des MT en croissance dans le cône de croissance, où ils régulent la
dynamique des MT pendant la croissance et le guidage des axones. Les MT de polarité mixte sont situés dans les
dendrites où MAP1A et MAP2 contribuent à la stabilisation de la MT. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2018.00165/full

La stabilité des microtubules est contrôlée par des modifications post-traductionnelles de certains acides
aminés des tubulines (acétylation, glutamylation, tyrosination…) et par l’association avec des MAP (pour
Microtubule Associated Proteins).
**Figure 5-30. Quelques modifications post-
traductionnelles des tubulines. La diversité des
modifications post-traductionnelles (acétylations et
désacétylations, phosphorylations,
polyglutamylations, tyrosinations, polyglycylations...)
permet de générer un "code tubuline" qui produit une
diversité de propriétés mécaniques et fonctionnelles
pour les microtubules selon le contexte cellulaire. Des
enzymes spécifiques catalysent ces modifications soit
sur les microtubules, soit sur les dimères de tubuline
non encore inclus dans les microtubules. Source :
https://www.tubintrain.eu/wp-content/uploads/2021/03/Anne-
Catherine-c0d95f3c-3341-4d52-9a57-d00da770513d.pdf

La plupart des modifications post-traductionnelles concerne la partie C-terminale des tubulines qui est
justement de l’interaction avec les MAP mais aussi avec les moteurs moléculaires (Song et Brady, 2015).
Dans les neurones, MAP2 et MAP4 ainsi que la protéine TAU s’associent aux microtubules sur toute leur
longueur, et réduisent fortement la probabilité de déclenchement de la “catastrophe”, c’est-à-dire de la
dissociation rapide des microtubules.

238
 **Figure 5-31. Microtubules dans un axone reliés par la protéine TAU. Image en microscopie électronique à balayage.
Les flèches vertes indiquent certaines des protéines TAU visibles qui relient plusieurs microtubules entre eux.
L'axone provient d'un neurone de porc. Barre d'échelle = 100 nm.
Source : https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.04.01.485819v1

Des mutations hétérozygotes et faux-sens des gènes codant la tubuline α ou β sont associées à un large
éventail de malformations du cerveau humain, appelées tubulinopathies. Par exemple, deux mutations au
niveau de la valine 409 de TUBA1A, V409I et V409A ont été identifiées chez des patients atteints
respectivement de pachygyrie (circonvolutions du cortex trop peu nombreuses) et de lissencéphalie
(circonvolutions du cortex absentes). L'expression ectopique des mutants TUBA1A-V409I/A perturbe la
migration neuronale chez la souris et déclenche une ramification excessive des neurites dans les cultures
neuronales primaires de rat, montrant l'importance des microtubules dans la neurogenèse (Hoff et al.,
2022).

*Figure 5-32. Inhibiteurs de la dynamique et de la fonction des microtubules. Des molécules peuvent déstabiliser les
microtubules comme le nocodazole et la colchicine ou au contraire les stabiliser (ce qui diminue leur dynamique qui
est par exemple nécessaire au bon déroulement de la mitose) comme le taxol et ses dérivés (paclitaxel, docetaxel)
issus de l'if. La vinblastine extraite de la pervenche de Madagascar empêche la polymérisation des tubulines pour
former les microtubules. Toutes ces molécules sont utilisées en chimiothérapie contre le cancer. Les MAP
(Microtubule-Associated Proteins) peuvent aussi inhiber la fonction des microtubules, de même que certaines
modifications post-traductionnelles. Source : https://www.abcam.com/reagents/small-molecules-for-microtubule-
research

Le transport intracellulaire est une fonction cellulaire essentielle qui est assurée par un vaste
réseau cytosquelettique et trois grandes classes de protéines motrices, à savoir les kinésines, les
dynéines et les myosines (Hirokawa et al. 2009; de Lanerolle 2012 ; Olenick et Holzbaur 2019). Alors que

239
les myosines sont responsables du transport à courte distance le long de filaments d’actine orientés de
manière aléatoire, les kinésines et les dynéines assurent un transport directionnel à longue distance
sur un réseau de microtubules polarisés (Titus, 2018).

*Figure 5-33. Les moteurs moléculaires le long des microtubules. Les dynéines permettent le transport vers
l'extrémité - des microtubules tandis que les kinésines permettent le transport vers le côté +. Grâce à la spécificité
de ces transporteurs, la polarité des microtubules est traduite en une direction de transport à travers le cytoplasme.
Source : https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap4/co/module_Chap4_22.html

La kinésine-1, un moteur dirigé vers l’extrémité + des microtubules, a été la première kinésine identifiée et
est bien caractérisée (Hirokawa et al. 2009). Il s'agit d'un tétramère comportant deux sous-unités lourdes
et deux sous-unités légères. Elle transporte diverses cargaisons, notamment des protéines, des organites,
des complexes nucléoprotéiques (RNP) et même des virus (Chudinova et Nadezhdina 2018; Garcin et
Straube 2019; Banerjee et al. 2020) et est essentiel pour de nombreux processus tels que le transport
réticulum endoplasmique (ER)-Golgi, la distribution mitochondriale dans les axones et les dendrites, la
migration cellulaire et la formation des axes chez les embryons.

La chaine lourde des kinésines abrite un domaine moteur N-terminal, suivi d’une longue tige enroulée qui
médie l’homodimérisation, et une queue flexible avec une fonction de régulation (Seeger et Rice 2013). Les
deux domaines moteurs sont alimentés par l’hydrolyse de l’ATP, qui provoque des changements de
conformation qui permettent à la molécule de kinésine de se déplacer de manière processive le long des
microtubules (Qin et al. 2020).

Voir la reconstitution du déplacement de la kinésine sur un microtubule : https://youtu.be/y-uuk4Pr2i8

À la figure 3-14, vous pouvez voir le rôle de la kinésine dans le transport des ARNm dans l’ovocyte de
drosophile.

Les kinésines transportent diverses cargaisons, notamment des protéines, des organites, des complexes
nucléoprotéiques (RNP) et même des virus (Chudinova et Nadezhdina 2018; Garcin et Straube 2019;
Banerjee et al. 2020) et est essentiel pour de nombreux processus à différentes échelles tels que le transport
réticulum endoplasmique (ER)-Golgi, la distribution mitochondriale dans les axones et les dendrites, la
migration cellulaire et la formation des axes chez les embryons.

240
Des mutations dans des kinésines peuvent être associées à des maladies comme par exemple des mutations
dans KIF1A, qui appartient à la famille de la kinésine-3 et qui provoquent la paraplégie spastique familiale
ou la maladie KAND (pour KIF1A-associated neurological disorder). Les symptomes sont liés à des défauts
de transport vésiculaire et de transport d'organites le long des microtubules des axones et des dendrites où
KIF1A joue un rôle important (Chiba et al., 2019).

L'activité des kinésines peut être contrôlée par les MAP (Microtubule-Associated Proteins). Par exemple,
MAP7 (ou enscocine) facilite le recrutement de la kinésine-1 sur les microtubules et active sa motilité
(Hooikaas et al., 2019). En revanche, Tau inhibe l'activité de la kinésine-1 et de la kinésine-3 (mais pas
l'activité de la kinésine-2) (Balabanian et al., 2022).

Signalons que des membres de la famille des kinésines (kinésine-8 et kinésine-13), une fois arrivés au pôle
+ des microtubules en profitent pour provoquer une « catastrophe » c’est-à-dire la dépolymérisation rapide
des microtubules (Shreshta et al., 2019).
***Figure 5-34. Modèles proposés pour la
dépolymérisation des microtubules par la kinésine-8 (A)
Le modèle de dépolymérisation active propose que les
protéines motrices kinésine-8 se déplacent sur le
microtubule vers l'extrémité + où elles s’accumulent
pendant un certain temps avant de dépolymériser la MT.
(B) Le modèle de coiffage propose que kinésine-8, en
particulier la kinésine Kif18A humaine, supprime la
dynamique du microtubule aux extrémités + en servant
de facteur de coiffage. Le coiffage bloque à la fois la
croissance et le rétrécissement, conduisant au bout d’un
moment à la catastrophe su microtubule. Source :
https://www.mdpi.com/2218-273X/9/1/1/htm

Les microtubules forment également les cils primaires qui ont un rôle important dans la
signalisation (par exemple de la voie Hedgehog) et les cils vibratiles qui mettent en mouvement le
milieu extérieur (important notamment dans la mise en place de l'asymétrie droite/gauche).

Un cil primaire est présent à la surface de la plupart des cellules quiescentes de l'organisme. Il est produit à
partir d'un centriole qui s'arrime à la membrane plasmique et devient le corps basal du faisceau des
microtubules qui forme l'axonème (Sanchez et Dynlacht, 2016).

241
 **Figure 5-35. Structure d'un cil primaire. Les cils sont
attachés à la face apicale de la cellule au niveau du corps
basal, qui est entouré de matériau péricentriolaire. Neuf
triplets de microtubules organisés radialement partent
du corps basal vers la zone de transition, puis s'étendent
sous forme de doublets de microtubules dans l'axonème
ciliaire. Des images de micrographie électronique de
chaque partie du cil sont présentées à gauche. Source :
https://www.cell.com/fulltext/S0092-
8674%2809%2900322-5

Un mauvais développement des cils crée des pathologies appelées ciliopathies. La protéine OFD1 est un
composant des centrioles et recrute IFT88, une protéine nécessaire à la formation des cils primaires (Singla
et al., 2010). Des mutations perte-de-fonction du gène codant OFD1 sont impliqués dans plusieurs
ciliopathies (maladie rénale polykystique, syndrome de Bardet-Biedl et syndrome orofaciodigital de type
1).

Les microtubules forment aussi les flagelles, notamment celui du spermatozoïde.

**Figure 5-36. Structure de l’axonème du flagelle d’un

spermatozoïde de mammifère. Le flagelle est limité par
une membrane plasmique et contient une matrice dans
laquelle se trouvent des microtubules longitudinaux,
rectilignes et parallèles les uns avec les autres. Un double
microtubule central, de faible longueur, qui se termine
dans la partie proximale de l’axonème, est entouré d’une
gaine centrale. Neuf paires de microtubules
périphériques (microtubules A et B, appelés aussi
tubules A et B dans ce cadre). Le tubule A (en général
plus petit) porte deux bras formés de dynéine (qui
peuvent s’attacher transitoirement au tubule B du
doublet voisin) et possède un rayon, fibres à disposition
radiaire se terminant par un renflement. Les tubules sont
formés de plusieurs microtubules. Les 9 doublets sont
reliés entre eux par des ponts de nexine. Source :
https://www.researchgate.net/figure/Structure-de-laxoneme-du-
flagelle-dun-spermatozoide-de-mammifere-Laxoneme-
est_fig2_302889759

Dans les cellules végétales, des faisceaux de microtubules corticaux (juste sous la membrane
plasmique) jouent un rôle fondamental pour guider les mouvements des complexes de cellulose
synthase qui permettent la synthèse de cellulose de la paroi. L'orientation des microfibrilles de
cellulose est directement dépendante de l'orientation des microtubules corticaux. Cette orientation
242
détermine ensuite selon quel axe la cellule va pouvoir s'allonger, ce qui est un paramètre crucial
pour la morphogénèse des tissus végétaux.

*Figure 5-37. Les microtubules corticaux des cellules végétales guident l'orientation des fibres de cellulose dans la
paroi. Un complexe en forme de rosette contenant plusieurs cellulose synthases sont rattachés aux microtubules
corticaux par des protéines de liaison, telles que CSI1 et donnent naissance à plus d'une douzaine de chaînes
cellulosiques, qui forment rapidement une microfibrille de cellulose cristalline dans la paroi cellulaire. Les
microtubules corticaux sont reliés entre eux par des protéines comme MAP65 qui stabilise l'ensemble de la structure.
Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4441250/

Le rôle des microtubules lors des divisions cellulaires est traité dans le chapitre "Cycles et divisions
cellulaires".

Signalons que le développement et la dynamique des réseaux de microtubules et des microfilaments

d'actine sont coordonnés. Les protéines de la famille des spectraplakines lient même directement ces deux
composants du cytosquelette (Zhang et al., 2017).

***Figure 5-38. Structure de la spectraplakine de la drosophile. La protéine est codée par le gène Shot (pour Short
stop). Elle est impliquée dans l'extension des neurites lors de la différenciation des axones, le développement des
trachées et des photorécepteurs, entre autres. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0960982221006692

Les filaments intermédiaires

Contrairement aux 2 cas précédents, les filaments intermédiaires ne sont pas polarisés. Ils font 10
nm de diamètre, donc d’une taille intermédiaire par rapport aux microfilaments d’actine (qui sont
plus petits) et aux microtubules (qui sont plus gros). Le rôle de ces filaments est essentiellement
structural : maintien de la forme des cellules et contrôle de leur résistance aux contraintes
mécaniques. Chez les plantes, ces rôles sont tenus par la paroi et il n'y a pas de filaments intermédiaires
connus.

Chez les animaux, des rôles supplémentaires pour les filaments intermédiaires émergent comme par
exemple pour la vimentine qui a un rôle dans la migration et la prolifération cellulaire. C'est un marqueur
classique d'état mésenchymateux dans des études sur les transitions épithélio-mésenchymateuses (voir

243
Figure 5-119a). Des souris déficientes en vimentine présentent des défauts de cicatrisation de blessure dus
à un manque de migration et de prolifération (Cheng et al., 2016). Les filaments de vimentine peuvent
interagir avec les microtubules et sont nécessaires pour le maintien de la polarité lors de la migration (Gan
et al., 2016), y compris celle de cellules tumorales (Xuan et al., 2020). Un rôle moins classique de la
vimentine est de stabiliser des ARNm codant des sous-unités du collagène en s'associant à la région 5' de
ces ARNm dans un complexe avec la protéine LARP6 (Challa et Stefanovic, 2011).

De nombreux filaments intermédiaires sont attachés via un complexe aux desmosomes et aussi aux
hémidesmosomes qui relient les cellules épithéliales à la lame basale.

La kératine forme un filament intermédiaire en s’enroulant en hélice autour d’autres kératines. Sa séquence
contient beaucoup d’acides aminés soufrés ce qui permet de former beaucoup de ponts disulfures et lui
confère sa rigidité. Elle est produite en quantité dans les kératinocytes qui sont les cellules constituant
l’épiderme de la peau et la cornée. Il existe une très grande variété de sous-types de kératine (codés par 54
gènes chez l'Homme) (Moll et al., 2008).
**Figure 5-39. Coupe de cornée de souris traitée en
immunohistochimie avec un anticorps anti-kératine 12
(coloration brun-rouge). On observe l’expression de la
kératine-12 dans les kératinocytes de la cornée (qui est
un épiderme particulier). La kératine-12 est spécifique
des kératinocytes de la cornée et n’est pas exprimée
dans les kératinocytes de la peau. Source :
https://www.abcam.com/keratin-12k12-antibody-epr17882-ab185627.html#lb

La kératine 15 est spécifiquement exprimée dans les cellules souches de l'épiderme (Lyle et al., 1998).

Certaines kératines sont attachées aux hémidesmosomes qui sont des structures à la base des
cellules épithéliales qui les accrochent fermement à la lame basale.

*Figure 5-40. Structure des hémidesmosomes. À gauche, image en microscopie électronique à transmission de
cellules épithéliales de trachées de souris avec les hémidesmosomes (indiqués avec des flèches) qui attachent ces
cellules à la lame basale en dessous. À droite, schéma de la structure des hémidesmosomes à la jonction épiderme-
derme.

244
 Sources : https://en.wikipedia.org/wiki/Hemidesmosome#/media/File:Ultrastructure_of_tracheal_hemidesmosomes_in_mice.JPEG et
http://biologiedelapeau.fr/spip.php?page=forum&id_article=47

*Figure 5-41. Expression de GFAP et de la vimentine,

deux filaments intermédiaires dans un astrocyte en
culture. Immunofluorescence avec un anticorps
reconnaissant GFAP (rouge) qui est exprimé surtout
dans les astrocytes (et aussi quelques autres types
cellulaires) et un anticorps reconnaissant la vimentine
qui est exprimé plus largement dans de nombreux types
cellulaires. Des mutations dans la séquence codante de
GFAP peuvent causer des troubles du système nerveux
(maladie d'Alexander). Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Glial_fibrillary_acidic_protein#/media/File:Astrocyte5.jpg

Certains filaments intermédiaires sont nucléaires telles les lamines qui maintiennent la structure
du noyau en formant un réseau sous la membrane interne nucléaire.
*Figure 5-42. Réseau de lamines sous la face interne de
la membrane nucléaire vu en microscopie électronique à
balayage. Les lamines forment un réseau en maille
orthogonale. Source :
https://www.nature.com/articles/323560a0

Elles participent aussi à la liaison chromatine/membrane nucléaire. Les lamines sont

phosphorylées par le complexe Cycline B/CDK1 (=MPF) lors de la prophase, ce qui aboutit au
désassemblement de la membrane nucléaire nécessaire à la suite de la mitose. Le clivage des
lamines par la caspase 6 participe à la désorganisation du noyau qui accompagne l’apoptose.

Les lamines A et C sont générées à partir du même gène LMNA par épissage alternatif. Des mutations perte-
de-fonction dans ce gène peuvent aboutir à des laminopathies, un ensemble de pathologies contenant
notamment la progéria ou syndrome d'Hutchinson-Gilford qui est caractérisé par un vieillissement
prématuré et au niveau cellulaire, par des noyaux très déformés.

245
LA CARTE MENTALE

DES MOTS CROISES POUR REVISER :

QUIZZ SUR LE CYTOSQUELETTE : https://learningapps.org/watch?v=ptrci3iej23

246
EN DIRECT DES LABOS

Marie-Emilie Terret (Collège de France, Paris) sur le réseau particulier du cytosquelette dans les ovocytes :
https://www.college-de-france.fr/site/campus-innovation-lycees/Marie-milie-Terret-Division-cellulaire-
ou-comment-transmettre-correctement-son-patrimoine-genetique-.htm

POUR ALLER PLUS LOIN

Site spécialisé sur la mécanobiologie (en anglais) : https://www.mechanobio.info/

Les matrices extracellulaires animales

hez les organismes pluricellulaires, les cellules restent solidaires après la fin de la mitose. Cela

C
est dû à l’adhérence cellule-cellule mais aussi à l’adhérence cellule-matrice extracellulaire. La
matrice extracellulaire (MEC) est un réseau macromoléculaire tridimensionnel de
glycoprotéines qui non seulement permet l’attachement cellulaire, mais aussi agit comme un
signal pour les cellules (par ses propriétés mécaniques (mécanotransduction) et par ses propriétés
biochimiques). La MEC agit également comme un réservoir d’autres molécules de signalisation
(Hynes, 2009). La MEC interagit de manière dynamique avec les cellules pour réguler leur
comportement et à leur tour, les cellules réagissent en modifiant la matrice et donc l’environnement
local. Il faut donc parler des matrices extracellulaires au pluriel, tant la diversité est importante.
Ainsi, les MEC ne constituent pas un simple ciment pour les cellules mais ont des rôles importants
pour tous les processus cellulaires.

Les adhérences inter-cellulaires et des cellules à la MEC ne doivent pas être vues comme des
systèmes séparés mais comme un ensemble de signaux s’intégrant dans la cellule par des réponses
impliquant notamment le cytosquelette et tout particulièrement les microfilaments d’actine. Des
perturbations de interactions cellule-cellules ont des répercussions sur les interactions cellules-MEC et
inversement comme cela a été démontré par exemple lors des mouvements morphogénétiques permettant
de former l’amnioséreuse (une annexe embryonnaire dorsale) chez la drosophile (Goodwin et al., 2017).

Composition et mise en place des matrices extracellulaires animales

Les principaux constituants des MEC animales sont les suivants :

• Le collagène (= 25% du poids des protéines totales des Mammifères) est constitué de
longues chaines polypeptidiques avec des répétitions de triplets Glycine-Proline-
HydroxyProline. Trois chaines dites alpha forment une triple hélice avec le plus petit acide
aminé, la glycine, à l’intérieur. Cette unité structurale du collagène est stabilisée par des
liaisons hydrogène. Plusieurs hélices s’associent en fibrille (0,5 µm de diamètre) puis en
fibre (qui peut atteindre plusieurs µm de diamètre) qui résiste aux forces d’étirement.

247
 *Figure 5-43a. Fibres de collagène observées
longitudinalement ou transversalement et
fibroblaste (qui les produit) vus au microscope
électronique à transmission dans la muqueuse
intestinale humaine. Source :
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/5-
celulas/2-componentes_proteinas.php

*Figure 5-43b. Fibres de collagène de type I.

Image au microscope électronique à
transmission d’une section mince à travers une
zone de tissu pulmonaire de mammifère.
L’image à fort grossissement de la zone du tissu
conjonctif montre des fibres de collagène de
type I. Les stries proviennent du décalage des
différentes fibrilles lors de la formation des
fibres. Source :
https://commons.wikimedia.org/wiki/Category:Cell_biology#/media/File:Fibers_of_Collagen_Type_I_-
TEM.jpg

*Figure 5-44. Différents états du collagène. L'origine des

stries visibles en microscopie électronique est aussi
expliquée par le décalage entre les différentes triples
hélices de tropocollagène au sein des fibrilles. D'après
https://en.wikipedia.org/wiki/Collagen#/media/File:Collagen_biosynthesis_(en).png

Ces complexes supramoléculaires ne peuvent se former qu’en dehors de la cellule d’où des étapes de
maturation au fur et à mesure de la sécrétion.

248
 **Figure 5-45. Etapes de la production de fibres de collagène. D'abord, les chaînes α sont synthétisées dans le
réticulum endoplasmique granuleux (REG), où la proline devient hydroxyproline par hydroxylation. La proline et
l'hydroxyproline peuvent représenter jusqu'à 20 % de la chaîne α. La glycosylation (type O-glycosylation) des
chaînes α se produit également dans le REG. À ce stade, trois chaînes alpha se lient par des liaisons hydrogène pour
finalement former la molécule de pro-collagène. Des ponts disulfures se forment également entre les chaînes α. Les
molécules de pro-collagène sont reconnues et liées par des récepteurs transmembranaires et conditionnées dans
des vésicules recouvertes de COPII. Les vésicules COPII typiques ont un diamètre de 60 à 90 nm, mais les vésicules
COPII transportant le pro-collagène ont un diamètre de 500 nm car les molécules de pro-collagène ont une longueur
d'environ 300 nm. Les molécules de pro-collagène arrivent à l'appareil de Golgi, le traversent et sont libérées du TGN
vers l'espace extracellulaire par exocytose. Il est à noter que certaines cellules polarisées sont capables de
sélectionner différents domaines de la membrane cellulaire pour libérer différents types de collagène dans
différentes régions autour d'elles. Pendant ou après le processus de libération, les séquences terminales d'acides
aminés des chaînes α des molécules de pro-collagène sont éliminées par voie enzymatique ce qui transforme le pro-
collagène en collagène. Ces séquences terminales empêchaient l'assemblage spontané des molécules de collagène à
l'intérieur de la cellule. Dans les collagènes fibrillaires, les molécules de collagène sont spontanément assemblées en
microfibrilles qui à leur tour se rejoignent pour former des fibrilles de collagène. Source :
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/5-celulas/imagenes/colageno2.png

La synthèse d’hydroxyproline à partir de la proline est réalisée sur les chaînes polypeptidiques dans le
réticulum endoplasmique par la prolyl-hydroxylase qui nécessite de l’acide ascorbique (vitamine C). En son
absence, les fibres de collagène sont altérées et cela peut provoquer le scorbut (qui a donné son nom à
l’acide ascorbique), une maladie caractérisée par des lésions de la peau et des vaisseaux sanguins. Le
collagène de type IV est particulier car il a de courtes régions qui ne sont pas en hélice. Il ne
s’assemble pas en fibre mais en réseau et c’est un constituant des lames basales (voir plus loin).

Signalons que d'un point de vue évolutif, la présence de collagène est un caractère dérivé partagé
exclusif des Métazoaires (Spongiaires + Eumétazoaires). La présence de lame basale avec le
collagène de type IV est un caractère dérivé partagé exclusif des Eumétazoaires.

• La fibronectine est constituée d’un dimère de grosses chaines polypeptidiques α et β liées

par des ponts disulfures. Elle possède des domaines de fixation au collagène, aux sulfates
d’héparanes (un glycosaminoglycane, voir plus loin) et aux intégrines (séquence RGD (Arg-
Gly-Asp)) qui sont les récepteurs cellulaires à la MEC (voir plus loin). Les souris dépourvues
d’allèles fonctionnels de la fibronectine meurent au cours du développement embryonnaire au jour
8,5 après la fécondation (E8,5) en raison de défauts du mésoderme et de la vascularisation
(Georges‐Labouesse et al., 1996), soulignant l’importance critique de cette protéine de la MEC
pour le développement embryonnaire à partir de la gastrulation.

249
*Figure 5-46. Structure d’une chaine polypeptidique de fibronectine. Les différents domaines sont présentés ainsi
que les différentes régions des principales interactions. Notez que la fibronectine est un dimère de 2 chaines liées
par des ponts disulfures (voir à droite). D’après https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.1600188

• La laminine : est un gros complexe de trois longues chaines arrangées en croix. On la trouve
dans les lames basales. Comme le collagène de type IV, les laminines peuvent s’auto-
assembler en réseau maillé. Les différentes sous-unités de laminine ont également des sites de
liaison avec les intégrines à la surface des cellules et pour les protéoglycanes. De plus, les laminines
sont étroitement associées à une autre protéine d’adhésion, appelé nidogène, qui se lie au collagène
de type IV. En raison de ces multiples interactions, la laminine, le nidogène (ou entactine), le
collagène de type IV et les protéoglycanes forment des réseaux réticulés au sein des lames
basales.

*Figure 5-47. Tissu pulmonaire de souris traité en

immunohistochimie avec l’anticorps anti-laminine
gamma3 (marquage brun). On voit que la lamine se
trouve à la base de l’épithélium, dans la lame basale.
Source :
https://www.abcam.com/laminin-gamma-3-antibody-epr22699-151-ab234429.html#lb

250
 *Figure 5-48. Structure de la laminine avec ses 3 chaînes
et domaines d'interaction avec le collagène et les
intégrines (à gauche). D'après
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/5-
celulas/2-componentes_glucoproteinas.php

• Les glycosaminoglycanes (GAGs) : ce sont de longues chaines d’oses formées par répétition
de deux résidus glucidiques (diholoside) : par exemple, acide glucuronique/N-
acétylglucosamine. Les GAG présentent beaucoup de charges négatives exposées : ils attirent les
ions et donc l’eau. Par conséquent, il y a une résistance à la compression. Les GAG (sauf l’acide
hyaluronique) sont généralement associés de manière covalente à des protéines dites
centrales. L’ensemble constitue les protéoglycanes (qui peuvent comprendre jusqu’à 95 % de
leur poids sous forme de polysaccharide). Les protéoglycanes peuvent contenir de 1 jusqu’à plus
de 100 chaînes GAG attachées aux résidus sérines d’une protéine. De nombreuses protéines
centrales (allant de 10 à plus de 500 kDa) ont été identifiées, de sorte que les protéoglycanes
constituent un groupe diversifié de macromolécules. Leur assemblage se fait généralement dans le
réticulum endoplasmique granuleux et l'appareil de Golgi avant sécrétion. De très gros complexes
peuvent se former (ex : complexe géant du cartilage).
**Figure 5-49. Différents types de
glycosaminoglycanes (GAG). D'après
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/5-
celulas/2-componentes_glucidos.php

Parmi les GAG, le HSPG (Heparan Sulfate Proteoglycane) joue un rôle particulièrement important
que l’on peut diviser en 3 :

1) Ils agissent comme corécepteurs pour les voies Wnt, FGF, Hedgehog (Hh) et BMP (Kreuger et
al., 2006, Shiau et al., 2010, Yan et Lin, 2007).

2) Les HSPG modifient la capacité des molécules de signalisation à se déplacer d’une cellule à l’autre
(Yan et Lin, 2009) et affectent donc les gradients de morphogènes.

3) Les HSPG peuvent être clivés ou éliminés de la membrane cellulaire, modifiant la concentration et
la disponibilité du ligand pour les cellules adjacentes (Manon-Jensen et al., 2010).
251
 **Figure 5-50. Interaction des héparane sulfate
protéoglycanes (HSPG) avec les voies de signalisation
FGF et Wnt. Dans la signalisation FGF2, les chaînes
héparane sulfate (HS) du glypican-4 (GPC4) à ancrage
GPI modulent la liaison du FGF2 à son récepteur, le
FGFR. La liaison du FGF2 aux HS nécessite des 2-O-
sulfates (encadré). La phosphorylation qui s’ensuit des
tyrosines intracellulaires du récepteur sert d’ancrage
aux interactions avec les protéines adaptatrices
cytosoliques, ce qui entraîne l’activation de la cascade
MEK/ERK et des cibles en aval. Dans la signalisation
Wnt canonique, la liaison du ligand Wnt à son
récepteur, Frizzled est contrôlée par le syndecan-1
(SDC1) via des sites de 6-O-sulfatation sur les chaînes
HS (encadré). La présence de sites de 6-O-sulfatation
sur les chaînes HS permet leur liaison avec une haute
affinité sur les ligands Wnt et empêche leur interaction
avec leurs récepteurs Frizzled. En présence de Sulf1, les
6-O-sulfates sont éliminés de la chaîne HS, ce qui
entraîne une liaison de faible affinité des ligands Wnt
aux sites 6-O-desulfatés permettant leur présentation
aux récepteurs Frizzled. La liaison de Wnt à son
récepteur entraîne l’accumulation de β-caténine dans le
cytoplasme, qui se transloque dans le noyau pour
activer la transcription de gènes cibles en aval. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnint.2017.00028/full

Ainsi, les HSPG sont importants pour le contrôle des gradients de morphogène. La perturbation des HSPG
entraîne des défauts de gastrulation et de guidage axonal (Clément et al., 2008, Lee et al., 2004, Poulain et
Chien, 2013, Topczewski et al., 2001). Des désulfatations des HSPG peuvent être nécessaires dans certains
cas : par exemple chez des souris mutantes qui n'expriment pas Sulf1 et Sulf2 qui sont des enzymes
extracellulaires qui enlèvent des fonctions 6-0-sulfates sur les HSPG, l'innervation des muscles lisses par les
neurones entériques de l'œsophage ne se fait pas correctement. Le GDNF se lie trop fort aux HSPG-6-0-
sulfatés et ne peut correctement diffuser pour agir efficacement sur les récepteurs des neurones (Ai et al.,
2007).

**Figure 5-51. La désulfatation partielle des HSPG par Sulf1 et Sulf2 est nécessaire pour une bonne croissance des
neurites des neurones entériques. Des fragments d'œsophage d'embryons de souris à E11,5 ont été disséqués puis
cultivés sur du collagène en présence de diverses concentrations de GDNF. On constate qu'en absence des activités
de désulfatation de Sulf1 et de Sulf2, les neurites (=axones + dendrites) croissent moins bien à partir des explants.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/134/18/3327/64478/SULF1-and-SULF2-regulate-heparan-
sulfate-mediated

Toutes ces molécules présentent une très grande diversité, d’origine génétique (chez l’Homme il y a
20 chaînes de collagène α différentes) mais aussi grâce à des épissages alternatifs. Il en résulte des
isoformes spécifiques des tissus. C’est le cas de la fibronectine dont le pré-ARNm contient 50 exons. Il
252
subit un épissage différent dans les fibroblastes et les hépatocytes. Dans le fibroblaste, l’ARNm contient
deux exons de plus que celui produit dans l’hépatocyte. L’isoforme produite par le fibroblaste est sécrétée
dans le tissu alentour et permet l’adhérence des cellules à la MEC. L’isoforme générée par l’hépatocyte est
sécrétée dans le sang et ne favorise pas l’adhérence des cellules. On peut aussi citer l’épissage alternatif du
produit du gène COL2A1 qui code plusieurs formes de collagène produits soit dans les chondroblastes (les
progéniteurs des chondrocytes), soit dans les chondrocytes différenciés qui forment le cartilage.
**Figure 5-52. Epissage alternatif du gène COL2A1.
Un épissage ou l’autre a lieu selon que le gène est
exprimé dans les chondroblastes (à gauche) ou
dans les chondrocytes (à droite). Il aboutit à des
fibres de collagène qui ont des propriétés
différentes. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4317353/#!po=7.95455

Rôle structural des matrices extracellulaires

> Rôle de support et de soutien : développement des tissus cartilagineux et osseux

Les tissus squelettiques des Vertébrés sont constitués de cartilage, d’os, de dentine et d’émail. Ils se
développent généralement à partir du mésoderme, sauf dans la tête où les cellules de crêtes
neurales (d’origine ectodermique) font une contribution majeure aux tissus squelettiques. Les os
des Vertébrés ont un rôle de support et de soutien. Ils sont essentiellement constitués de MEC
minéralisée par l’hydroxyapatite : Ca10(PO4)6(OH)2. Le squelette sert aussi de réserve essentielle de
calcium. Les cellules sécrétant la MEC à l’origine des os sont les ostéoblastes qui deviennent des
ostéocytes une fois que la MEC autour d’eux est minéralisée. Cette MEC est particulièrement riche
en collagène de type I, la plus résistante à l’étirement.
*Figure 5-53. Exemple de tissu osseux (os hyoïde de
souris, un exemple d'os trabéculaire ou spongieux). Bone
marrow = moelle osseuse. Source :
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-
english/guiada_a_oseo.php

Le cartilage est constitué de MEC non minéralisée, riche en collagène de type II, en GAG et en
protéoglycanes de type aggrégane. Les cartilages dits élastiques sont enrichis en élastine (cartilage
élastique du pavillon de l'oreille, de l'épiglotte...). L'élastine est une longue protéine riche en proline et

253
en glycine (ce qui rappelle le collagène) avec une forte teneur en acides aminés hydrophobes responsables
de son élasticité.

Le cartilage joue un rôle important de soutien général (chez les Chondrichthyens) ou localisé
(anneaux de cartilage permettant de maintenir ouverte la trachée artère, disques intervertébraux,
cartilage hyalin des articulations). Il est produit par des chondrocytes dont le développement est
contrôlé, entre autres, par le facteur de transcription Sox9 (Liu et al., 2017).
*Figure 5-54. Cartilage hyalin d'une articulation (entre
deux phalanges d'un doigt de souris) coloré par le bleu
alcian. Les cellules dans les logettes sont les
chondrocytes. Le reste est du tissu osseux.
D'après https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/a-
imagenes-grandes/cartilago_hialino.php

*Figure 5-55. Identification du cartilage dans des

cultures de cellules de crêtes neurales. Certains
cartilages céphaliques proviennent de la différenciation
des cellules de crêtes neurales (CCN). Ici, des cellules de
CCN en culture forment des agrégats (A) qui sont
identifiés grâce à une coloration bleu alcian (B), à une
hybridation in situ détectant l'expression de Sox9 (C) et à
une immunofluorescence avec un anticorps anti-
chondroïtine sulfate (D) comme étant composés de
chondrocytes. Source :
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708806104

Les tissus squelettiques minéralisés sont considérés comme l’une des innovations majeures des
Vertébrés. Parmi les animaux existants, seuls les vertébrés Gnathostomes (à mâchoires) possèdent
des tissus squelettiques minéralisés. Les vertébrés sans mâchoire (myxines et lamproies) n’ont que
des endosquelettes cartilagineux. Les Chondrichtyens n’ont que du cartilage et pas d’os, par perte
secondaire au cours de l’évolution.

Les tissus osseux peuvent être produits directement : c’est ce qu’on appelle l’ossification intramembranaire
où les cellules mésenchymateuses se différencient en ostéoblastes et synthétisent la matrice extracellulaire
osseuse. Cela concerne par exemple une bonne partie des os du crâne.

254
 **Figure 5-56. Ossification intra-membranaire. L’ossification intra-membranaire suit quatre étapes. (a) Les cellules
mésenchymateuses se regroupent en amas et des centres d’ossification se forment. (b) L’ostéoïde sécrété piège les
ostéoblastes, qui deviennent ensuite des ostéocytes. (c) La matrice trabéculaire et le périoste se forment. (d) L’os
compact se développe en surface de l’os trabéculaire, et des vaisseaux sanguins se condensent en moelle rouge.
Source : https://openstax.org/books/anatomy-and-physiology/pages/6-4-bone-formation-and-development

Les tissus osseux peuvent parfois succéder à du tissu cartilagineux. On parle alors d’ossification
endochondrale. Notamment, lors de la croissance des os longs, c’est la prolifération des chondroblastes dans
le cartilage dit de conjugaison qui rallonge l’os. Ces chondroblastes se différencient en chondrocytes et
s’entourent d’une matrice extracellulaire riche en collagène II et en GAG. Puis les chondrocytes deviennent
hypertrophiques et meurent par apoptose, laissant la place à du tissu osseux.

**Figure 5-57. Ossification endochondrale vue sur une coupe longitudinale d’os long de chat. Photo : Patrick Pla, à
partir de la collection d’histologie de la Préparation à l’Agrégation SVTU, Université Paris-Saclay

255
 ***Figure 5-58. Extrémité d’un os long en croissance avec une ossification endochondrale. Le développement des
chondrocytes avec des marqueurs des différentes étapes est présenté à gauche et le développement des ostéoblastes
et des ostéocytes avec des marqueurs des différentes étapes est présenté à droite. Source :
https://www.mdpi.com/2221-3759/4/2/20/htm

Les chondrocytes hypertrophiques secrètent Indian Hedgehog (Ihh) qui induit la formation d'ostéoblastes
dans le perichondrium en y activant l’expression de Runx2 (Hoyle et al., 2022). Le taux d’augmentation de
taille de ces chondrocytes hypertrophiques est étroitement corrélé à la vitesse de croissance des différents
éléments squelettiques (Cooper et al., 2013).

Il faut noter que certains chondrocytes hypertrophiques ne meurent pas et se transdifférencient en

ostéoblastes qui deviennent des ostéocytes et participent à la formation de la MEC osseuse (Yang et al.,
2014, Zhou et al., 2014).

Le facteur de transcription SOX9 joue un rôle clé dans la différenciation des chondrocytes mais aussi pour
maintenir les cartilages de conjugaison après la naissance et pour protéger le cartilage articulaire adulte de
la dégradation arthrosique. En particulier, SOX9 protège la lignée des chondrocytes en empêchant leur
dédifférenciation en progéniteurs mésenchymateux squelettiques et leur redifférenciation en ostéoblastes
(Haseeb et al., 2021).

La prolifération dans les cartilages de conjugaison prend fin, notamment sous l'influence de la signalisation
FGF. Lors de l'achondroplasie qui aboutit à une forme de nanisme d'origine génétique, le récepteur FGFR3
présente une mutation ponctuelle (une arginine en position 380 au lieu d'une glycine) qui le rend actif trop
tôt ce qui arrête prématurément la croissance des os longs (Savarirayan et al., 2021).

L’arthrose est causée par une dégénérescence du cartilage près des articulations. Cette dégradation
est causée par une production élevée d’enzymes protéolytiques, telles que la métalloprotéase
MMP13 et les aggrécanases, comme ADAMTS4 et 5. Elles dégradent des composants importants de
la matrice du cartilage, tels que le collagène de type II (COL2A1) et l’aggrécane. On observe aussi
l’expression de marqueurs de chondrocytes hypertrophiques (tel le collagène COL10A1), ce qui
rappelle l’ossification endochondrale et il a été proposé que l’arthrose est une récapitulation
ectopique pathologique de ce processus (Van den Kraan et Van der Berg, 2012).

256
Les signaux impliqués dans la chondrogenèse et l’ostéogenèse sont étudiés de près non seulement pour
leurs aspects fondamentaux mais aussi pour des raisons thérapeutiques, à la recherche de traitements de
réparation tissulaire. Par exemple, des cellules souches mésenchymateuses se transforment plus
massivement en ostéoblastes exprimant Runx2 si l’inducteur BMP2 leur est présenté sur de la fibronectine,
ce qui montre une synergie entre les facteurs de croissance et la MEC (Llopis-Hernandez et al., 2016).
**Figure 5-59. BMP2 associé à la fibronectine est plus efficace
que BMP2 soluble pour produire des ostéoblastes à partir de
cellules souches. Des cellules souches mésenchymateuses sont
mises à incuber sur de la fibronectine et incubées avec du
BMP2 dans le milieu (ligne du bas), avec BMP2 pré-attaché à la
fibronectine en absence (ligne du milieu) ou en présence de
l’anticorps P5F3 qui bloque les interactions entre BMP2 et la
fibronectine (ligne du haut). Une immunofluorescence avec un
anticorps reconnaissant RUNX2, un marqueur d’ostéoblastes
est réalisée (vert). Trois images sont présentées. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.1600188

La détermination et la différenciation des ostéoblastes est un processus activé notamment par le facteur de
transcription Runx2.

**Figure 5-60. Régulation de la détermination, de la prolifération et de la différenciation des ostéoblastes par un

réseau de régulation génétique. Runx2 induit la détermination des cellules mésenchymateuses multipotentes en
préostéoblastes. Ihh est nécessaire à l'expression de Runx2 dans le périchondrium des os endochondraux. Runx2
induit l'expression de Sp7, et ensemble Runx2, Sp7 ainsi que la signalisation canonique Wnt induisent la
différenciation des préostéoblastes en ostéoblastes immatures. Runx2 et Sp7 sont également impliqués dans la
maturation des ostéoblastes. Runx2 régule la prolifération des préostéoblastes en induisant l'expression des
récepteurs Fgfr2 et Fgfr3. L'expression de Runx2 et celle des gènes des voies de signalisation Hedgehog, FGF, Wnt et
Sp7 sont réciproquement régulées. Source : https://www.mdpi.com/1422-0067/20/7/1694/htm

SPARC (codant la protéine sécrétée acide et riche en cystéine) est un gène ancien trouvé à la fois dans les
Protostomiens et les Deutérostomiens (Bertrand et al., 2013). Ses orthologues vertébrés sont exprimés dans
le cartilage, les os et les dents, où ils peuvent se lier au calcium et agir comme protéine chaperons du
collagène extracellulaire (Kawasaki et Weiss, 2005). Des membres spécifiques de la famille SPARC ont été
dupliqués chez des vertébrés à mâchoires (les Gnathostomes) pour générer la famille de gènes des
phosphoprotéines secrétées de liaison au calcium (SCPP), qui sont impliquées dans la formation de tissus
hautement minéralisés, tels que la dentine et l’émail (Kawasaki et al., 2005). Ils ont donc un rôle important
dans la minéralisation de la MEC.

Certains produits de gènes peuvent s'opposer à l'ostéogenèse tels le long ARN non codant (lncRNA) Hotair
qui inhibe l'expression de ALPL et BMP2 qui favorisent l'ostéogenèse. Lorsqu'il y a une fracture, la voie
Wnt/-caténine est activée et diminue l'expression de Hotair, favorisant ainsi la régénération osseuse
(Carrion et al., 2014).
257
De manière normale, la MEC osseuse est régulièrement renouvelée et ce sont les ostéoclastes qui se
chargent de sa résorption. Ce sont des cellules d'origine hématopoïétique (lignée myéloïde) et
multinucléées (par fusion cellulaire) qui accomplissent leur fonction en sécrétant des acides, de la
collagénase, de la cathépsine K et des métalloprotéases (notamment MMP-9 et MMP-13) qui, ensemble,
digèrent la MEC osseuse.
**Figure 5-61. Détermination et différenciation des
ostéoclastes. Les ostéoclastes sont apparentés aux
macrophages et sont dérivés des cellules souches
hématopoïétiques. En présence de M-CSF, les cellules
hématopoïétiques forment des colonies appelées CFU-M,
composées de cellules précurseurs communes des
macrophages et des ostéoclastes. Via la signalisation
RANKL-RANK, ces cellules sont orientées vers un destin
d'ostéoclastes mononucléés et fusionnent ensuite pour
devenir des ostéoclastes multinucléés. Ces ostéoclastes
résorbent la matrice osseuse en sécrétant des acides
(H+), des protéases (par exemple, la cathépsine K ou
CTSK) et des métalloprotéinases matricielles (MMP).
Source : https://www.mdpi.com/2073-4409/9/9/2073

*Figure 5-62. Ostéoclaste en train de déminéraliser la

matrice extracellulaire d'un os. Photo prise en
microscopie électronique à balayage où on observe un
ostéoclaste qui vient de se déplacer vers la gauche après
avoir déminéralisé et dégradé une portion de la matrice
extracellulaire (ECM) osseuse. La matrice n'a pas été
entièrement dégradée et des fibres de collagène I sont
encore bien visibles. Source :
https://academic.oup.com/endo/article-
abstract/119/1/119/2540258

Les œstrogènes favorisent la différenciation précoce des ostéoblastes et inhibent l'activité des ostéoclastes
(Farr et al., 2019). La diminution des niveaux d'œstrogènes après la ménopause augmente l'activité des
ostéoclastes, diminue la densité osseuse, conduisant finalement à l'ostéoporose.

> Rôle d’organisation des tissus

Au cours des analyses histologiques des tissus animaux, on peut rencontrer différents types de
tissus :

• épithélium (fortes interactions cellule-cellule + présence d’une lame basale)

• tissu conjonctif (interaction cellule-MEC prédominante)

o aéré : beaucoup de cellules (derme)

o dense : peu de cellules (tendon, cartilage, os)

Les lames basales sont constituées de laminine, de collagène type IV (collagène non en fibrille mais
réticulé), et d’héparansulfate protéoglycane. Leur épaisseur varie entre 60-100 nm. On trouve des
lames basales au niveau basal des épithéliums, des endothéliums et autour des cellules musculaires.

Au niveau structural, elles permettent :

258
 1) L’attachement des cellules épithéliales au tissu conjonctif sous-jacent (rôle des
hémidesmosomes qui lient la cellule à la lame basale) (voir Figure 5-40).

2) L’attachement des cellules musculaires striées les unes aux autres et la protection
mécanique du tissu musculaire (la plupart des dystrophies musculaires prennent leur origine
dans des défauts de protéines dont le rôle habituel est de correctement arrimer la cellulaire
musculaire striée squelettique à la lame basale).

3) La compartimentation tissulaire : les cellules épithéliales ne se mélangent pas avec les

cellules conjonctives sauf cas pathologique (cellules tumorales issues d’un carcinome). Au
cours du développement embryonnaire, certaines cellules épithéliales peuvent quitter leur
épithélium d’origine et migrer (par exemple les cellules mésodermiques au cours de la
gastrulation des Amniotes ou les cellules de crêtes neurales). Ces cellules qui réalisent une
transition épithélio-mésenchymateuse doivent au préalable lyser la lame basale grâce à la
sécrétion d’enzymes spécifiques (les métalloprotéinases, voir page 190).

Rôle dans le transport, la signalisation et la migration des matrices extracellulaires

> Rôle au cours de la fécondation

La zone pellucide est la matrice extracellulaire entourant l’ovocyte II, riche en glycoprotéines ZP1,
ZP2, ZP3 et ZP4. Chez les Mammifères, elle est sécrétée par l’ovocyte I au stade pré-antral. Un
spermatozoïde ne peut la traverser que s’il a franchi l’étape de la capacitation au préalable. La zone
pellucide joue un rôle dans la fixation du spermatozoïde et le déclenchement de la réaction
acrosomiale. Cette réaction permet la sécrétion d’acrosine qui digère la zone pellucide, créant un
passage pour le spermatozoïde. La zone pellucide participe à la barrière d’espèces. Une fois que la
fécondation a eu lieu, les granules corticaux de l’ovocyte sont exocytés et des enzymes clivent les
protéines ZP1, ZP2 et ZP3. Cela constitue une protection contre la polyspermie. > Voir le chapitre sur
la fécondation pour des détails supplémentaires sur la zone pellucide.

> Les intégrines, à l’interface entre la MEC, le cytosquelette et les voies de signalisation

Chez les animaux, les molécules de la MEC servent de ligands à des récepteurs sur la membrane
plasmique appelés intégrines. Les intégrines sont une famille de protéines transmembranaires
constituées de deux sous-unités, désignées α et β, avec des combinaisons de 18 sous-unités α et 8
sous-unités β formant 24 intégrines (toutes les combinaisons α/β ne sont pas possibles). Les
intégrines reconnaissent des motifs spécifiques qui sont présents dans les diverses molécules de
l’ECM. Le motif le plus commun est la séquence RGD que l’on trouve dans la fibronectine, la
vitronectine, l’ostéopontine et la nephronectine.
**Figure 5-63. Classification des intégrines en fonction
de leurs interactants extracellulaires. RGD correspond à
une succession d’acides aminés que l’on trouve dans la
fibronectine, la vitronectine, l’ostéopontine et la
nephronectine. Source : https://www.mdpi.com/1420-
3049/24/8/1537/htm

La liaison des intégrines à leur ligand modifie la conformation de l'hétérodimère tant dans leur
domaine extracellulaire qu'intracellulaire.

259
 *Figure 5-64. Changement de conformation des dimères
αβ d'intégrines lors de la fixation d'un ligand (appelé
outside-in signaling, nous verrons le inside-out signaling
plus loin). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fchem.2019.00489/full

En plus d’attacher les cellules à la MEC, les intégrines servent d’ancrage indirect pour le
cytosquelette. Il en résulte un lien du cytosquelette à la MEC qui est responsable de la stabilité des
jonctions cellule-matrice. De par cette position particulière, les intégrines sont soumises à plusieurs
forces mécaniques et peuvent être considérés comme des senseurs biomécaniques tant de
l’environnement de la cellule que des tensions internes en provenance du cytosquelette.

Les hémidesmosomes qui relient les cellules épithéliales à la lame basale sont formés par l’intégrine
α6β4 et sont reliés aux filaments intermédiaires (et non aux microfilaments d’actine comme c’est
plus habituellement le cas) (voir Figure 5-40).

> Rôle de la MEC dans la prolifération et la survie

L’interaction des intégrines avec les protéines de la MEC active des voies de signalisation qui
favorisent la progression du cycle cellulaire (Fiore et al., 2018). Cette interaction peut agir en synergie
avec celle des facteurs de croissance et de leurs récepteurs pour activer les voies qui stimulent la
prolifération PI3kinase/Akt et MAPK/Erk (Moreno-Layseca et al., 2014). Des régulations croisées peuvent
avoir lieu : par exemple dans les cellules épithéliales de glande mammaire, l'expression des récepteurs à
l'EGF (EGFR) dépend de l'activation de l'intégrine β1 par la MEC et l'expression de l'intégrine β1 est sous le
contrôle des voies de signalisation activées par EGFR (Grassian et al., 2011). Les interactions intégrines-
MEC aboutissent aussi à diminuer l'expression des facteurs anti-mitotiques tels que p27 et p21 (Li et al.,
2005).
*Figure 5-65. Voies de signalisation reliant
les intégrines à la survie cellulaire.
L'activation par les intégrines d'Akt via
PI3-K ou ILK (Integrin-Linked Kinase)
joue un rôle important dans l'effet anti-
apoptotique de l'adhésion médiée par la
MEC. L'activation d'Erk et de JNK
contribue également à l'augmentation de
la survie cellulaire. Source :
https://www.jci.org/articles/view/15468

260
 *Figure 5-66. Voies de signalisation reliant les intégrines
à la progression du cycle cellulaire. L'activation
synergique des GTPases Ras et Rho par les intégrines et
les facteurs de croissance est nécessaire à la progression
du cycle cellulaire. L'activation de Rac1, Cdc42 et RhoA
peut faciliter l'activation d'Erk via Ras. Erk, ainsi que JNK
et ILK (Integrin-Linked Kinase), peuvent induire
l'expression de la cycline D1, favorisant ainsi la
progression du cycle cellulaire. De plus, les intégrines
peuvent favoriser la prolifération en inhibant les
inhibiteurs du cycle cellulaire comme p21cip et p27kip.
Source : https://www.jci.org/articles/view/15468

Les voies de signalisation activées par les facteurs de croissance et les intégrines peuvent aussi interagir
différemment : ces voies de signalisation peuvent activer des intégrines initialement inactives via le
recrutement de la taline (une voie appelée inside-out, de l'intérieur vers l'extérieur, qui est en contraste
avec la voie habituelle des intégrines activées par la MEC (outside-in). Des intégrines actives qui
interagissent avec la MEC peuvent alors en retour activer des voies de signalisation qui renforcent l'effet
des facteurs de croissance comme on l'a vu plus haut. Tout cela correspond à une boucle de rétroaction
positive.

**Figure 5-67. Le recrutement de la taline à la membrane plasmique par des voies de signalisation permet d'activer
les intégrines. La liaison de ligands (agonistes) à certains récepteurs membranaires provoque une hydrolyse des
phospholipides libérant du diacylglycérol (DAG) et de l'inositol triphosphate (IP3). IP3 augmente les niveaux
cytosoliques d'ions Ca2+. Le DAG et le Ca2+ favorisent le chargement en GTP de Rap1 et sa translocation membranaire.
Rap1 recrute alors la molécule adaptatrice d'interaction RIAM avec son partenaire de liaison, la taline, à la membrane
plasmique. La taline change alors la conformation des intégrines qui deviennent actives et capables de se lier à des
éléments de la MEC. Source : https://www.mechanobio.info/what-is-mechanosignaling/what-is-the-extracellular-
matrix-and-the-basal-lamina/what-are-focal-adhesions/what-is-talin/

La MEC a aussi un rôle dans le réveil des cellules quiescentes en G0 et leur ré-entrée dans le cycle cellulaire.
Par exemple, les lésions des muscles squelettiques (mêmes distantes) induisent la libération du facteur de
croissance des hépatocytes (HGF) de la MEC environnante, ce qui amorce la prolifération des cellules
souches musculaires (Rodgers et al., 2017).

261
 **Figure 5-68. La MEC stocke des précurseurs de HGF,
mobilisables pour activer les cellules souches
musculaires. Dans des conditions normales, l’enzyme
HGFA circule dans le sang sous sa forme inactive (pro-
HGFA). Lors d’une blessure, la thrombine activée
catalyse le clivage de la pro-HGFA en une forme active.

Le HGFA active circule alors dans le sang et catalyse le

clivage du pro-HGF en HGF actif dans les tissus de tout le
corps. Le pro-HGF était stocké notamment dans la MEC
à proximité des cellules souches musculaires (MuSC)
appelées aussi cellules satellites. Transformé en HGF
actif, il va se lier au récepteur c-Met à la surface de ces
cellules et les sortir de leur quiescence et les rendre
prêtes à proliférer en cas de besoin. Source :
https://www.cell.com/cell-reports/pdf/S2211-
1247(17)30427-8.pdf

Une cellule épithéliale doit rester accrochée à sa lame basale sinon elle meurt par apoptose
(phénomène d’anoikis). Il s’agit d’un processus physiologique normal d’homéostasie tissulaire. Par
exemple, dans l’épithélium intestinal, lorsque les entérocytes atteignent le sommet des villosités,
elles se détachent de la lame basale et subissent une anoikis. Les chondrocytes sont également
dépendants de la MEC pour leur survie. Si on incube des chondrocytes en culture avec des anticorps qui
bloquent la fonction des intégrines, ils se détachent de la MEC, rétrécissent et meurent. La signalisation
initiée par l’interaction MEC/intégrine a un rôle dans la survie et la suppression de l’apoptose via la voie de
signalisation PI3kinase-Akt, l’augmentation de la transcription de Bcl2 (qui s’oppose à l’apoptose) et, dans
certains cas, l’inhibition de la voie p53. L’activation de Akt inhibe à plusieurs niveaux le programme
d’anoikis : par l’inactivation de la caspase-9, par la phosphorylation de la protéine pro-apoptotique Bad et
par l’activation de NF-κB (Taddei et al., 2011). Lors de l'anoikis, tous ces mécanismes protecteurs cessent
de fonctionner et la protéine JNK est alors un activateur majeur de l'apoptose (Valencia-Exposito et al.,
2022).

262
 **Figure 5-69. JNK est nécessaire à l'apoptose dans un modèle expérimental d'anoikis dans le disque imaginal de
l'aile de drosophile. On diminue l'expression de l'intégrine β1 de drosophile (appelée βPS et codée par le gène mys)
grâce à une interférence à ARN (B et C, A est un contrôle négatif). En C, on surexprime un inhibiteur de JNK codé par
le gène puc. On détecte par immunofluorescence βPS (bleu) et les cellules en apoptose (anticorps reconnaissant
l'effecteur apoptotique Dcp1 (rouge) et fluorescence verte de la GFP car les drosophiles expriment sous son propre
promoteur Hid-GFP, avec Hid qui est une protéine pro-apoptotique). On constate une activation importante de
l'apoptose dans la région où l'expression de l'intégrine est inhibée mais cette apoptose dépend de l'activité de JNK
(l'inhibition de JNK abolit en grande partie l'activation de l'apoptose).
Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.892691/full

La résistance à l’anoikis est une des propriétés fondamentales des cellules tumorales métastatiques
provenant de cellules épithéliales.

**Figure 5-70. L’acquisition de la résistance à l’anoikis et ses conséquences. D’après

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/path.3000

Les mécanismes qui permettent aux cellules tumorales d'échapper à l'anoikis commencent à être compris
(voir par exemple Mohammed et al., 2022).

> Rôle dans la détermination et la différenciation

La manipulation de la rigidité de la MEC peut modifier la différenciation cellulaire comme cela a été montré
lors de la différenciation des cellules ES : un substrat trop rigide diminue la différenciation en mésoderme
(Przybyla et al., 2016). Cet effet de la MEC a aussi été démontré à plus grande échelle avec des cellules
souches mésenchymateuses, des cellules satellites musculaires et durant la différenciation des
cardiomyocytes (Smith et al., 2017).

263
 **Figure 5-71. Différenciation des cellules souches basée
sur la rigidité de la MEC

A : Des cellules souches mésenchymateuses déposées sur des

gels de collagène (appelé après substrat) avec une rigidité
indiquée (exprimée en microélasticité, matrice molle à gauche
et rigide à droite) se différencient durant une semaine. Les gels
mous dirigent la différenciation en adipocytes, tandis que les
gels plus rigides induisent la différenciation en ostéoblastes. B :
la rigidité du substrat détermine le type de prolifération des
cellules souches musculaires satellites : les substrats avec une
rigidité semblable au tissu musculaire naturel conservent
souvent les propriétés des cellules souches (définies par
l’expression de Pax7), tandis que les substrats rigides épuisent
le pool de cellules souches en induisant la différenciation des
deux cellules filles (définies par l’expression de MyoD). C : les
progéniteurs musculaires finissent par se différencier et
fusionner en fibres musculaires multinucléées remplies de
sarcomères contractiles. La formation de sarcomères est plus
efficace sur une MEC à la rigidité semblable à celle d’un tissu
musculaire normal, alors que la rigidité au-dessus ou en dessous
de ce niveau conduit à une altération de la formation des
sarcomères. D : Des cardiomyocytes immatures sont dérivés le
long d’une série d’étapes à partir de cellules souches
embryonnaires sur un substrat mou. À mesure que le cœur se
développe, le substrat devient plus rigide et les cardiomyocytes
deviennent plus alignés et contractiles. Cependant, dans un
cœur fibreux plus rigide, la contraction des cardiomyocytes est
altérée. Alternativement, les iPSC peuvent être induites à former
des cardiomyocytes sur du plastique ; cependant, ces
cardiomyocytes ne sont pas capables de produire la force
contractile d’un cardiomyocyte mature sain. Source :
https://journals.physiology.org/doi/full/10.1152/physiol.00026.2017

La MEC peut constituer un co-signal nécessaire pour l’action d’autres molécules. Si on cultive in vitro
des cellules épithéliales mammaires sur du collagène ou de la laminine en présence de prolactine, les
cellules s’organisent en acinus, se différencient et produisent des protéines et des lipides spécifiques du lait.
Sans MEC, cette différenciation n’a pas lieu. On constate une hausse de la transcription de beta-caséine et de
WAP (Whey Acidic Protein) par le facteur de transcription AP1 en présence de MEC et une hausse de
l’expression des récepteurs aux œstrogènes (Muschler et al. 1999; Novaro et al. 2003).
*Figure 5-72. Inhibition de l’expression de la β-caséine
par des anticorps bloquant la fonction de l’intégrine
α6β1. Des tests pour l’induction de l’expression de la β-
caséine dans les cellules épithéliales mammaires SCp2
ont été effectués sur des cellules initialement étalées sur
du plastique puis exposées à un milieu contenant
l’hormone lactogène prolactine, avec ou sans la
laminine, et en présence/absence des anticorps
bloquant la fonction des sous-unités d’intégrine β1, α6,
α1, α5 ou αv. L’expression de la β-caséine a été observée
par western-blot à partir d’extraits cellulaires et
apparaît comme un doublet migrant à ∼34 kDa.
L’expression de la caséine induite par la laminine a été
inhibée en présence d’anticorps bloquant les intégrines
β1 et α6 mais pas les autres intégrines. Source :
https://www.molbiolcell.org/doi/full/10.1091/mbc.10.9.2817

Cet exemple n’est pas isolé et la signalisation provenant des intégrines peut donc contrôler la
différenciation cellulaire via l’activation de la transcription de gènes spécifiques.

Chez la drosophile, le collagène IV se lie à Dpp (un orthologue des BMP) et améliore ses interactions avec
les récepteurs de ce ligand. Cette interaction collagène/Dpp est cruciale dans la régulation de l’axe
264
dorsoventral et du nombre de cellules souches germinales dans l’ovaire, deux processus qui dépendent des
gradients de Dpp (Wang et al., 2008).

La bonne différenciation des structures épithéliales tubulaires dépend en grande partie de la membrane
basale de ces épithélia comme par exemple la formation des trachées chez la drosophile. Leur forme et leur
longueur dépend de la présence de la laminine dans leur lame basale (Klussmann-Fricke et al., 2022).
*Figure 5-73. La morphogénèse des trachées chez les
embryons de drosophile est perturbée en absence de
laminines dans la lame basale de l'épithélium trachéen.
Source : https://www.cell.com/cell-
reports/fulltext/S2211-1247(22)00495-8

De nombreux événements morphogénétiques de l’embryogenèse sont coordonnés par des contractions

musculaires, tels que l’allongement de l’embryon chez C. elegans et la squelettogenèse chez le poisson zèbre,
la souris, le poulet et d’autres vertébrés. Au cours de ces processus, les informations mécaniques des fibres
musculaires sont relayées via les adhérences matrice-muscle et transmises à travers les tissus par les
jonctions cellule-matrice et cellule-cellule. Notamment, les embryons de C. elegans s’appuient sur la MEC
pour coordonner la communication entre les tissus musculaires, épidermiques latéraux et épidermiques
dorsaux/ventraux (Gillard et al., 2019). Les signaux mécaniques générés par les contractions musculaires
sont transmis vers et entre les cellules épidermiques via la MEC et les jonctions adhérentes. Lorsque des
mutations fonctionnelles modifient les protéines d’adhérence matrice-muscle (par exemple, NOAH-1 et
NOAH-2), les contractions musculaires ne peuvent pas transmettre de signaux à travers la MEC, les fibres
d’actine intracellulaire ne parviennent pas à se polariser, les cellules s’orientent de manière inadéquate le
long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon et cela a pour conséquence un arrêt du processus d’élongation
de C. elegans (Vuong-Brender et al., 2017).

La protéine de la MEC appelée anosmine est requise pour la formation des cellules de crêtes neurales
crâniales. C’est la conséquence du fait que le dépôt local d’anosmine améliore la signalisation FGF8 tout en
limitant les signaux BMP5 et Wnt3a (Endo et al., 2012). Ces résultats montrent comment une seule protéine
de la MEC peut coordonner plusieurs activités de divers ligands pour affecter la destinée d’un groupe de
cellules.

> Rôle dans la migration

L’inactivation par recombinaison homologue (knock-out) de la fibronectine chez la souris aboutit à

de graves défauts mésodermiques liés à la perturbation de la migration au cours de la gastrulation.
La MEC (et notamment la fibronectine) est donc essentielle pour la migration cellulaire. Une autre
démonstration en est apportée sur des embryons d’Amphibiens avec l’action d’anticorps anti-
intégrine ou aussi de peptides RGD(S) (Arg-Gly-Asp(-ser)) (qui se fixent sur les intégrines sur le
domaine de fixation habituel à la fibronectine et empêchent l’interaction intégrine-fibronectine).
Cela provoque un blocage de l’involution et de la migration du mésoderme au cours de la
gastrulation. Des études complémentaires ont montré que les cellules du mésoderme utilisent
l’intégrine α5β1 pour adhérer et migrer directionnellement sur la matrice de fibronectine qui se
trouve sur le toit du blastocœle.

Des criblages génétiques à grande échelle chez le poisson zèbre ont identifié plusieurs mutations interférant
avec les mouvements de convergence-extension lors de la gastrulation, notamment knypek (kny, pour «
court » en polonais ; Solnica-Krezel et al. 1996). Les mouvements défectueux de convergence-extension chez
les mutants kny sont associés à l’échec des cellules mutantes à acquérir une morphologie cellulaire polarisée

265
médio-latéralement. Le clonage positionnel indique que kny code un glypicane, un protéoglycane de sulfate
d’héparane (HSPG) largement exprimé au cours de la gastrulation. Kny est liée à la signalisation Wnt non
canonique car elle améliore la signalisation Wnt11 qui active la voie non canonique Wnt/PCP (Topczewski
et al., 2001).

La MEC peut contrôler la migration en modulant les réponses des cellules à des voies de signalisation. Ainsi,
la fibronectine (FN) et la vitronectine (VN) modulent les réponses des cellules endothéliales au HGF (Scatter
Factor), un important médiateur pro-angiogénique dont le récepteur est Met. De nombreux sites de liaison
pour HGF ont été identifiés sur la FN et sur la VN. HGF stimule la migration et la prolifération des cellules
endothéliales mais en l’absence de co-stimulation avec une FN ou VN, HGF ne peut stimuler la migration des
cellules comme il le fait habituellement mais conserve sa capacité à induire une réponse proliférative en
utilisant la voie MAPKinase. En favorisant l’association du récepteur Met et des intégrines, les complexes
HGF-FN et HGF-VN activent la migration des cellules endothéliales grâce à la voie PI-3 kinase impliquant un
mécanisme dépendant de Ras (Rahman et al. 2005).
**Figure 5-74. L’association de Met avec les intégrines
est conduite par son ligand HGF quand il est lié à la
fibronectine ou à la vitronectine. (A) Des cellules
endothéliales humaines ont été ensemencées dans des
puits en plastique recouverts de collagène-1,
fibronectine (FN) ou vitronectine (VN) et ont été
stimulées avec une solution saline ou HGF (10 ng/ml)
pendant 60 min. Les cellules ont été lysées et les lysats
correspondants ont été immunoprécipités avec des
anticorps contre les intégrines α2β1 (pistes 1 et 4), αvβ3
(pistes 2 et 5) et α5β1 (pistes 3 et 6). Les
immunocomplexes ont été analysés par western blot
avec un anticorps anti-Met (panneau supérieur). Le
panneau inférieur montre les niveaux de Met dans les
lysats cellulaires totaux avant immunoprécipitation. (B)
Des cellules endothéliales humaines ont été stimulées
avec HGF seul ou avec des complexes HGF-FN ou HGF-VN
durant les périodes indiquées. Les cellules sont lysées et
les lysats immunoprécipités avec un anticorps
polyclonal anti-phosphotyrosine-Met et les complexes
immuns analysés par western blot en utilisant un
anticorps monoclonal contre Met.

(C) Les cellules endothéliales été stimulées avec HGF seul

ou HGF-FN ou HGF-VN pendant 15 minutes. Les cellules
ont été lysées et les lysats immunoprécipités avec des
anticorps monoclonaux contre les intégrines α5β1 et
αvβ3 et les complexes immuns analysés par western blot
avec un anticorps polyclonal dirigé contre Met. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC553973/pdf/1471-
2121-6-8.pdf

Le guidage axonal peut être considéré comme un cas particulier de migration avec le corps cellulaire qui ne
bouge pas et seulement l’avant de l’axone qui se déplace (cône de croissance). La MEC est également
impliquée de manière importante dans le guidage axonal.
**Figure 5-75. Défaut de guidage axonal des cellules
ganglionnaires de la rétine chez le mutant perte-de-
fonction de la laminine α1 chez le poisson-zèbre. Vues
ventrales d’un embryon de poisson-zèbre 2 jours après
la fécondation sauvage (A) ou mutant bashful (= perte-
de-fonction de la laminine α1) (B) après une
immunohistochimie avec l’anticorps ZN-5 qui reconnaît
les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes. On
voit bien le chiasma optique chez l’embryon sauvage

266
 alors que chez le mutant, les axones restent du côté
ipsilatéral. Source : https://anatomypubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/dvdy.20604

Au niveau cellulaire, les intégrines lient la MEC et forment des agrégats appelés points focaux
d’adhérence. Ces derniers servent de points d’appui (de béquilles) à la cellule lors de ses
déplacements. Ces points focaux d’adhérence sont reliés au cytosquelette d’actine qui agit sur la
migration via une interaction avec la myosine-II. Ces points d’adhérence sont transitoires sinon la
cellule ne pourrait avancer plus loin. Une cascade de signalisation permet de mettre en place puis de
détruire les points focaux d’adhérence : elle est sous la dépendance de FAK, une tyrosine kinase activée par
les intégrines.
*Figure 5-76. Image d’immunofluorescence (60x)
du cytosquelette (actine : vert) et d’une protéine
appartenant aux points focaux d’adhérence
(paxilline : rouge) dans les cellules endothéliales
humaines de veine ombilicale (HUVEC). Source :
https://commons.wikimedia.org/wiki/Category:Cells#/media/File:CellAdhesion.jpg

La rigidité de la MEC a une influence importante sur le nombre de points focaux d'adhérence, les protéines
qui y sont associées et la répartition du cytosquelette.

*Figure 5-77. Influence de la rigidité de la MEC sur les points focaux d'adhérence et le réseau de microfilaments
d'actine. Des cellules souches mésenchymateuses sont mis en culture en présence de MEC avec différents niveaux de
rigidité (très peu rigide (1 kPa) à très rigide (34 kPa) et sur du verre, un substrat extrêmement rigide). Au bout de
quelques heures, les cellules sont fixées et traitées en immunofluorescence avec un anticorps anti-paxilline (A, en
vert) et de la phalloïdine couplée à un fluorophore rouge (B). La paxilline est une protéine des points focaux
d'adhérence. Source : https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674(06)00961-5

Remodelage et lyse des MEC

Des approches d’imagerie dynamique avec des molécules de la MEC marquées par fluorescence ou des
protéine-fusion avec la GFP ont démontré que les réseaux de MEC sont des structures hautement
dynamiques qui sont soumises à un étirement et à une contraction constante ainsi qu’à une réorganisation
267
médiée par les cellules et le mouvement des tissus (Czirok et al., 2004; Loganathan et al., 2016; Sivakumar
et al., 2006).

Parmi les principales protéases qui participent à ces processus pour permettre le remodelage tissulaire et
l’invasion cellulaire, on trouve les métalloprotéinases matricielles (MMP). Les MMP appartiennent à une
superfamille de protéases caractérisées par la présence d'un ion Zn 2+ dans leur domaine catalytique qui est
requis pour leurs fonctions protéolytiques. Elles sont trouvées dans tous les organismes, et cette
superfamille comprend également des protéases telles que les ADAM (A Disintegrin And
Metalloproteinase), les serralysines et les astacines. Un sous-groupe au sein de la famille des MMP est formé
par les métalloprotéinases matricielles de type membranaire (MT-MMP), ancrées à la membrane plasmique
par un domaine transmembranaire de type I (MT1-MMP/MMP-14, MT2-MMP/MMP-15, MT3-MMP/MMP-
16 et MT5-MMP/MMP-24) ou une ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) (MT4-MMP/ MMP-17 et MT6-
MMP/MMP-25). Plusieurs MT-MMP sont exprimées dans des tissus normaux jouant un rôle dans
l’homéostasie, mais la plupart d’entre elles sont induites dans des maladies ou des tissus en inflammation.
Bien que la plupart de nos informations actuelles concernant ces enzymes proviennent d’études sur le
cancer, la première MMP identifiée, la collagénase, a été trouvée dans la résorption de la queue des têtards
pendant la métamorphose des Amphibiens Anoures. Son expression est activée par des hormones
thyroïdiennes. D’autres membres de ces endopeptidases ont aussi été impliqués dans la résorption de la
queue au cours de la métamorphose de la grenouille, notamment MMP-2, MMP-9, MMP-11, MMP-13 et
MMP-18.

EN DIRECT DES LABOS :

Voir un vidéo sur le travail d’une équipe qui fait des recherches sur la matrice extracellulaire :
http://igfl.ens-lyon.fr/equipes/f.-ruggiero-matrix-biology-and-pathology/activite?set_language=fr&cl=fr

LA CARTE MENTALE :

DES MOTS CROISES POUR S’ENTRAINER :

268
269
Les parois des cellules végétales
Lorsqu'au XVIIème siècle Robert Hooke a observé au microscope des tissus végétaux, il a observé des
logettes qu'il a appelé cellule. On sait maintenant qu'il avait observé surtout de la paroi cellulaire,
car le tissu observé (du liège) est essentiellement formé de cellules mortes et seule la paroi
cellulaire persiste.
*Figure 5-78. Les premières "cellules" observées par
Robert Hooke en 1665 sont surtout des parois végétales.
Source : Micrographia :
https://en.wikipedia.org/wiki/Robert_Hooke#/media/File:RobertHookeMicrographia1665.jpg

De manière similaire, le bois est essentiellement constitué de cellules mortes dont il ne reste que la
paroi. Les propriétés du bois découlent donc directement des propriétés de la paroi cellulaire.

La paroi des cellules végétales constitue leur "squelette". Pour les végétaux aériens, elle est un
élément indispensable pour leur soutien et notamment la croissance en hauteur. Lorsqu'elle est
lignifiée, la paroi cellulaire permet une grande solidité qui permet de développer des structures très
hautes qui assurent l'accession à un maximum de lumière, principale source d'énergie. Cela se fait
au prix de l'impossibilité de la migration cellulaire, ce qui distingue les cellules végétales des cellules
animales.

*Figure 5-79. Schéma d'une coupe transversale de tige (âgée de 2 ans).

Les tissus secondaires (issus du cambium et du phellogène) sont en caractères gras. Avec le temps, l’accroissement
du bois va comprimer le parenchyme médullaire jusqu’à le faire disparaître. Source : https://planet-
vie.ens.fr/thematiques/vegetaux/anatomie-vegetale-et-histologie-vegetale/la-structure-secondaire-des-tiges

270
 *Figure 5-80. Coloration d'une coupe de tige au carmin-vert d'iode. La cellulose est alors colorée en rouge et la lignine
en vert. Source : https://planet-vie.ens.fr/thematiques/vegetaux/anatomie-vegetale-et-histologie-vegetale/colorations-de-cellulose-et-lignine

Constituants des parois des cellules végétales

> Cellulose

La cellulose, connue pour être la molécule organique la plus abondante sur Terre, joue un rôle
essentiel dans le règne végétal. Elle est classée parmi les polysaccharides, des polymères complexes
composés de multiples unités de glucose. La structure de la cellulose se distingue par des liaisons β-
(1→4) entre les glucoses, contrairement à l'amidon et au glycogène qui présentent des liaisons α-
(1→4) ainsi que des ramifications α-(1→6). Deux glucoses liés par des liaisons β-(1→4) forment la
cellobiose. Une chaîne de cellulose comporte entre 1.000 à 30.000 glucoses selon les espèces et les tissus.

*Figure 5-81. Comparaison de la polymérisation à l'origine de l'amidon et du glycogène et de celle à l'origine de la

cellulose. La liaison osidique est différente et aboutit à un diholoside différent (maltose et cellobiose). Source :
https://www.youtube.com/watch?v=P7ByiVPKSCY

*Figure 5-82. Représentation schématique d'une partie de microfibrille comprenant deux chaînes de cellulose. Les
liaisons hydrogène inter- et intra-moléculaires contribuent à la solidité de la cellulose et sa forte résistance à la
traction. D'un glucose au suivant dans une chaine, il y a une rotation de 180° qui permet de réaliser une succession

271
 de liaisons hydrogène entre l'oxygène du cycle et le OH en position 3, conférant ainsi une structure fibreuse à la
cellulose. Il n'y a pas de ramifications.
Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Cellulose#/media/Fichier:Liaisons_hydrog%C3%A8ne_entre_mol%C3%A9cules_de_cellulose.svg

L'association de 36 chaînes de cellulose entre elles par des liaisons hydrogènes inter-moléculaire forme une
microfibrille (d'un diamètre de 10-25 nm). L'association de 6 microfibrilles de cellulose forme une
macrofibrille et un agencement de plusieurs macrofibrilles forme une fibre de cellulose.

La biosynthèse de la cellulose implique des cellulose synthases organisées en rosette intégrée dans
la membrane plasmique. La cellulose est synthétisée à partir de molécules de glucose activées par
l'UDP. La cellulose synthase couple l'élongation du polymère cellulosique avec sa translocation vers
l'extérieur de la cellule à travers un pore dans la membrane plasmique.
*Figure 5-83. Le complexe de la cellulose synthase (CS)
et les protéines associées. La CS forme des rosettes
hexagonales (à 6 faces) avec 3 sous-unités de cellulose
synthase A (CESA), ce qui donne 18 CESA au sein de
chaque CS. CSI1 relie le complexe aux microtubules
corticaux grâce à la liaison de son domaine C2 et facilite
le mouvement bidirectionnel des complexes à travers la
membrane plasmique. CC1 et CC2 se lient aux
microtubules via le domaine N-terminal CC1/2,
nécessaire au maintien de l'activité du complexe et de la
dynamique des microtubules. KOR1 fait partie
intégrante du complexe des CS et régule la biosynthèse
de la cellulose grâce à son activité endo-1,4-ß-d-
glucanase. COBRA, une protéine ancrée par
glycosylphosphatidylinositol (GPI) dans la membrane
plasmique, se déploie dans la matrice extracellulaire et
régule l'activité du complexe CS, l'organisation des
fibres de cellulose et l'interaction avec d'autres
composants de la paroi cellulaire. Source :
https://www.mdpi.com/2223-7747/7/3/52

Dans les cellules végétales, des faisceaux de microtubules corticaux (juste sous la membrane
plasmique) jouent un rôle fondamental pour guider les mouvements des complexes de cellulose
synthase qui permettent la synthèse de cellulose de la paroi. L'orientation des microfibrilles de
cellulose est directement dépendante de l'orientation des microtubules corticaux. Cette orientation
détermine ensuite selon quel axe la cellule va pouvoir s'allonger (l'allongement se fait
perpendiculairement à l'orientation des microtubules corticaux et des microfibrilles de cellulose),
ce qui est un paramètre crucial pour la morphogénèse des tissus végétaux (voir Figure 5-37).

Grâce à sa rigidité et sa solidité, la cellulose constitue la principale composante des parois

cellulaires des plantes, lui conférant ainsi un rôle clé dans leur architecture et leur protection. Elle
offre une structure de soutien aux cellules végétales, leur permettant de résister aux forces
mécaniques et aux pressions environnementales. De plus, la cellulose est également impliquée dans
le transport de l'eau et des nutriments à travers les plantes.

La dégradation de la cellulose est bien moins répandue dans le monde vivant que celle de l'amidon et est
réalisée par certaines enzymes spécifiques appelées cellulases, présentes chez des micro-organismes, tels
que les bactéries et les champignons. Ces enzymes sont capables de décomposer la cellulose en ses unités
de glucose constitutives, rendant ainsi la cellulose accessible comme source d'énergie ou de matériaux pour
ces organismes et les organismes qui les abritent (les hôtes des microbiotes intestinaux par exemple).

Outre son importance biologique, la cellulose est également utilisée par l'homme dans divers secteurs
industriels où elle constitue un matériel de choix en raison de son abondance et de ses propriétés physiques.
En tant que matière première renouvelable, elle est utilisée dans la production de papier, de textiles tels
que le coton (les poils des graines de coton sont composés à près de 95% de cellulose, un record), et même

272
dans la fabrication de bioplastiques respectueux de l'environnement. Les gènes impliqués dans la formation
de la paroi cellulaire du coton sont d'ailleurs très étudiés pour des raisons économiques (You et al., 2023).

> Hémicelluloses

Ce sont des polysaccharides (glucose, xylose, arabinose...) plus courtes que dans la cellulose et ramifiés par
des chaines très courtes. Ils font le lien entre les fibrilles de celluloses (avec lesquelles elles peuvent se lier
par des liaisons hydrogènes). Tandis que les celluloses assurent l'armature de la paroi, les hémicelluloses
assurent sa cohésion. Chez les Angiospermes, les chaines latérales courtes commencent en général par un
xylose (et ce sont donc des xyloglucanes). La callose est une hémicellulose qui est produite en cas de
blessure pour éviter l'entrée de pathogènes.

> Pectines

Il s'agit de polysaccharides riches en acides polygalacturoniques. Ils influencent la porosité et l'extensibilité

de la paroi. Les acides galacturoniques portent chacun un groupement carboxyle COO - et lorsqu'ils ne sont
pas méthylés, ces groupements peuvent interagir par liaisons ioniques avec des ions Ca 2+. Ces ions attirent
l'eau ce qui est à l'origine des propriétés gélifiantes des pectines.
*Figure 5-84. Schéma général de la structures des
pectines. Les acides galacturoniques peuvent être
méthylés et non méthylés. Lorsqu'il y a des successions
longues de plusieurs acides galacturoniques non
méthylés, elles forment une structure en "boîte à œufs"
qui enferment des ions Ca2+ par liaisons ioniques. Par
ailleurs, la présence de rhamnose dans la chaîne
provoque un changement de direction. Source :
https://uel.unisciel.fr/biologie/module1/module1_ch03/co/apprendre_ch3_12.ht
ml

Les précurseurs des pectines sont synthétisés dans l'appareil de Golgi et transportés vers la membrane
plasmique, où ils sont traités et incorporés dans la paroi existante. Les pectines sont particulièrement
abondantes dans la lamelle moyenne qui correspond à la partie centrale de la paroi, à l'interface entre la
paroi synthétisée par une cellule et celle synthétisée par la cellule voisine. La lamelle moyenne est par
ailleurs la couche la plus appauvrie en cellulose parmi les différentes couches de la paroi.

> Lignines

La lignine désigne un ensemble de macromolécules polyphénoliques qui sont déposées

secondairement dans la paroi. Elle est la principale composante du bois. La lignine confère une
grande rigidité à la paroi et elle est spécifique des Trachéophytes (elle est aussi présente chez quelques
algues rouges par convergence évolutive). Elle est essentielle au port des plantes qui font plus d'1 mètre de
hauteur et où la pression du turgescence contre la paroi primaire ne suffirait pas à maintenir la plante
érigée. La lignine permet aussi à la paroi des faisceaux de xylème de supporter la pression négative liée à
l'évapotranspiration.

Le précurseur de la formation de la lignine est la phénylalanine. Cet acide aminé subit une désamination
oxydative par la Phénylalanine ammonia-lyase (PAL) puis une série d'autres étapes enzymatiques.

273
 **Figure 5-85. Étapes générales de la production de lignine via la voie phénylpropanoïde. Les monomères de lignine
H, G et S sont les unités de base des polymères de lignine. Les tailles relativement petites des structures chimiques
des lignines C et 5H par rapport aux monomères de lignine H, G et S indiquent que les monomères de lignine C et 5H
sont rares. Abréviations : 4CL = 4-coumarate:CoA ligase ; C3H = p-coumaroyl shikimate 3′-hydroxylase ; C4H =
cinnamate 4-hydroxylase ; CAD = alcool cinnamylique déshydrogénase ; COMT = acide caféique/5-
hydroxyconiféraldéhyde 3-O-méthyltransférase ; CSE = caféoyl shikimate estérase ; F5H = férulate/coniféraldéhyde
5-hydroxylase ; HCT = hydroxycinnamoyl CoA:shikimate hydroxycinnamoyl transférase ; PAL = L-phénylalanine
ammoniaque-lyase. Source : https://www.cell.com/trends/plant-science/fulltext/S1360-1385(16)30008-5

La transcription des gènes codant les enzymes impliquées dans la biosynthèse des lignines est sous le
contrôle des facteurs de transcription VND1-7 et NST1-3.

> Subérine
*Figure 5-86. Ecorce de chêne-liège (Quercus suber) très
riche en subérine. Source : https://www.voyage-hors-
saison.fr/2009/bormes-les-mimosas-et-detente-le-vallon-des-caunes/ecorce-de-
chene-liege/

La subérine est un polymère lipidique (longues chaînes de polyesters d'acides gras et de composés
phénoliques liés aux chaînes lipidiques par des liens esters et éthers) imperméable qui se dépose dans la
paroi de certains tissus (endoderme des racines qui sépare les tissus vasculaires du cortex, liège ou suber
dans le périderme, tégument de diverses graines, également dans les zones d'abscission). Avec la cutine qui
lui est proche, la subérine joue un rôle de protection contre la déshydratation, contre les parasites et aussi
contre le feu.

La subérine se dépose aussi au niveau des sites de blessure et d'abscission.

274
 *Figure 5-87. Zone d'abscission foliaire chez le noyer
recouverte de subérine (marron-beige). On observe également
les cicatrices des éléments vasculaires (brun-vert). Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Abscission#/media/Fichier:Bladlitteken_van_Juglans_regia.jpg

Chez Arabidopsis, il y a expression au niveau de ces sites du gène FAR4, codant une acide gras-CoA réductase
impliquée dans la synthèse de la subérine (Domergue et al., 2010).
*Figure 5-88. Expression de gène rapporteur GUS sous le
contrôle du promoteur de FAR4, un gène codant une
enzyme impliquée dans la synthèse de la subérine, dans
des feuilles blessées d'Arabidopsis. Source :
https://academic.oup.com/plphys/article/153/4/1539/6111261

> Protéines

Les protéines sont en proportion très minoritaires dans la paroi cellulaire des végétaux ce qui est
une situation très différente de la matrice extracellulaire des animaux. Il s'agit de HRGP
(Hydroxyprolin Rich Glyco Protein) qui est une protéine de structure, d'enzymes impliquées dans le
renouvellement ou le remodelage de la paroi (cellulases, pectinases...) ou qui interviennent dans la défense
contre les pathogènes (chitinase).

Dépôt de la paroi cellulaire primaire et secondaire

Dans les derniers stades de la mitose, une cellule végétale assemble un phragmoplaste qui est un
réseau de microtubules important pour le dépôt de matériau à la plaque cellulaire où se formera la
paroi entre les deux cellules-filles. Des vésicules dérivées de l'appareil de Golgi remplies de pectine
voyagent le long de ces microtubules et s'alignent le long de la plaque cellulaire et fusionnent formant la
lamelle pectique. Du réticulum endoplasmique se place en travers de cette lamelle pectique, ce qui ménage
des espaces qui formeront les plasmodesmes, reliant le cytoplasme de cellules voisines. Les couches
cellulosiques se déposent par la suite dans la plaque cellulaire pour former la paroi entre les deux cellules
filles.

La paroi primaire est d'abord déposée dans toutes les cellules, puis après une éventuelle phase de
croissance, la paroi secondaire est déposée dans les cellules de certains tissus (xylème,
sclérenchyme...).

La biosynthèse de la cellulose implique des cellulose synthases (ou CESA) organisées en rosette
intégrée dans la membrane plasmique. Au cours de l'épaississement de la paroi, la cellulose fraichement
synthétisée est donc toujours celle la plus proche de la membrane plasmique et la plus ancienne cellulose à
une plus grande distance.

Les différentes CESA sont codées par une famille multigénique. L'étude de mutants a montré que trois sous-
unités CESA différentes, CESA1, 3 et 6, sont importantes pour la biosynthèse de la cellulose de la paroi
cellulaire primaire. Un certain niveau de redondance fonctionnelle est observé entre CESA2, 5 ou 9 avec

275
CESA6, alors que les sous-unités CESA1 et 3 ne sont pas redondantes et sont donc nécessaires à la synthèse
de la cellulose (Desprez et al., 2007; Persson et al., 2007).

Les CESA 4, 7 et 8 sont spécifiquement impliquées dans la synthèse de cellulose dans les parois secondaires
et la transcription des gènes correspondants est co-régulée (Perrson et al. 2005, Brown et al., 2005).

Une modulation précise de la biosynthèse de la paroi secondaire riche en lignine se réalise en fonction des
paramètres de l’environnement. Par exemple, les blessures favorisent le métabolisme de la lignine via
l'inhibition de l'expression de l'activité (via des modifications post-traductionnelles) du facteur de
transcription LTF1, de la famille MYB qui est un inhibiteur de la production de lignine (Gui et al., 2019). De
manière générale, LTF1 retarde le dépôt de lignine dans la paroi pour donner le temps à la croissance de la
paroi primaire de se faire suffisamment.
*Figure 5-89. LTF1 est nécessaire pour éviter un dépôt
de la lignine trop précoce par rapport à la croissance en
longueur de la plante. Des plants de jeunes peupliers
contrôle (LE62) et mutants perte-de-fonction pour le
gène LTF1 sont mis à pousser. Des coupes transversales
des tiges sont colorées au phloroglucinol–HCl (qui colore
en rose fuschia la lignine). On constate qu'en absence de
LTF1 fonctionnelle, la plante est plus petite et il y a plus
de lignine déposée dans la paroi (couleur rose plus
marquée). Source : https://www.cell.com/molecular-
plant/fulltext/S1674-2052(19)30173-X

Les gibbérellines (une famille d'hormones végétales diterpéniques tétracycliques) stimulent la production
de la paroi secondaire.
**Figure 5-90. Les gibbérellines stimulent la production
de la paroi secondaire en activant via CEF1 la
transcription des gènes codant des enzymes pour sa
synthèse. Des plants de riz sauvages (CEF1) ou mutés
perte-de-fonction cef1 pour un gène codant un facteur de
transcription sont cultivés ou non avec des gibbérellines
(GA). 6 heures plus tard, on extrait les ARNm et on
analyse par RT-qPCR l'expression de gènes dont les
produits sont impliqués dans la synthèse de la paroi
secondaire. Source :
https://link.springer.com/article/10.1007/s11103-
015-0376-0

Croissance de la paroi cellulaire primaire

La croissance de la paroi primaire est un élément essentiel à la croissance en longueur des tiges et,
dans une moindre mesure, des racines. L'auxine à de fortes concentrations joue surtout un rôle
positif sur l'élongation cellulaire dans la tige et un rôle inhibiteur dans la racine.
*Figure 5-91. Représentation schématique de la courbe
dose-réponse de l'auxine sur l'élongation cellulaire.
Source : https://planet-
vie.ens.fr/thematiques/developpement/controle-du-
developpement/le-gravitropisme-des-vegetaux

276
Dans la tige, l'auxine induit une expansion cellulaire rapide et cela peut être mimé par exemple en
incubant des segments d'hypocotyle dans un milieu acide (pH 4,5). Cependant, l'action des protons
n'est pas directe sur les composants de la paroi car l'expansion en milieu acide n'a pas lieu si les
hypocotyles ont été traités au préalable avec des protéases. On en déduit le modèle suivant : l'auxine
agit en acidifiant l'apoplasme où se trouve la paroi cellulaire, ce qui entraîne l'activation de
protéines localisées dans la paroi qui lui permettent de se relâcher avec la pression de turgescence.
Il s'agit d'un mécanisme de croissance connu sous le nom de "théorie de la croissance acide" qui date
des années 1970.

*Figure 5-92. Acidification de la paroi dans la zone d'élongation de la racine. On observe des cellules de l'épiderme
de racines en croissance d'Arabidopsis. Les changements de pH ont été visualisés avec des valeurs ratiométriques de
HPTS (molécule dont la fluorescence dépend du pH et qui ne rentre pas dans les cellules (reste dans l'apoplasme)).
La barre latérale montre la coloration de la fluorescence en fonction du pH (pH élevé en haut et pH bas (acide) en
bas). Barre d'échelle = 10 µm. Source : https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1613499114

Dans la tige, l'auxine déclenche l'efflux de protons, en activant la H +-ATPase de type P localisée dans
la membrane plasmique. Chez Arabidopsis, les H+-ATPases sont codées par une famille de gènes qui
comprend 11 membres appelés AHA. A la suite de la présence d'auxine, la phosphorylation de l'avant-
dernier résidu Thr conservé (Thr948 dans AHA1, Thr947 dans AHA2) invalide l'autoinhibition de l'activité
de la pompe ATPase par la région C-terminale cytoplasmique. L'auxine induit l'expression dépendante de
TIR1/AFB des protéines SAUR qui agissent comme des inhibiteurs des phosphatases PP2C.D, qui sont
responsables de la déphosphorylation de l'avant-dernier résidu des pompes. La signalisation auxine active
donc des inhibiteurs des inhibiteurs des H+-ATPases. En parallèle, la signalisation activée par l'auxine
stimule l'activité des kinases TMK qui phosphorylent l'avant-dernière Thr des pompes à protons (Lin et al.,
2021).
***Figure 5-93. Rôle de AHA1 et de TMK dans
l'acidification de la paroi en réponse à l'auxine.
Comparaison du pH apoplastique dans les hypocotyles
2-3 jours après la germination de plants de type sauvage
(Col-0), et mutées ost2-2D qui a une pompe à proton
AHA1 continuellement active et le mutant perte-de-
fonction tmk1-1 /mk4-1. Les changements de pH ont été
visualisés avec des valeurs ratiométriques de HPTS
(molécule dont la fluorescence dépend du pH et qui ne
rentre pas dans les cellules (reste dans l'apoplasme)). La
barre latérale montre la coloration de la fluorescence en
fonction du pH (pH élevé en haut et pH bas (acide) en
bas). Barre d'échelle : 100 μm. Source :
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03976-
4

En parallèle, l'auxine stimule également l'exocytose de vésicules qui contiennent des pompes à H +
enrichissant ainsi la membrane plasmique et permettant une acidification de la paroi encore plus
importante. L'auxine diminue également l'endocytose des pompes à H + en inhibant l'expression de la
protéine de type SNARE SYP132 qui est impliquée dans ce processus (Xia et al., 2019).

277
 *Figure 5-94. Effet de l'auxine sur l'expression de SYP132
impliqué dans l'endocytose des pompes à protons. Des tiges
d'Arabidopsis sont soumises pendant 0, 60 ou 180 min à un
traitement avec un analogue de l'auxine (NAA) et leur ARNm
sont extraits. On étudie par RT-PCR l'expression de 3 gènes
codant des protéines de type SNARE, SYP121, SYP123 et SYP132.
On compare l'expression après traitement relativement à
l'expression sans traitement. Il y a une diminution significative
spécifique de l'expression de SYP132 qui est impliqué dans
l'endocytose des pompes à protons. Source :
https://academic.oup.com/plphys/article/180/2/837/611774
2
Les protéines activées par la baisse de pH dans la paroi en réponse à l'auxine sont principalement
les expansines.
*Figure 5-95. Localisation de l'α-expansine dans des
cellules en expansion. Marquage avec des anticorps
dirigés contre l'α-expansine et couplés à des particules
d'or (points noirs denses). On observe un marquage dans
les parois cellulaires (en haut en A et en B dans la région
marquée CW) et dans des vésicules de sécrétion dérivées
de l'appareil de Golgi (têtes de flèches en B). (A) Cellule
épidermique de la région de croissance d'un hypocotyle
de concombre étiolé. (B) Cellule épidermique d'un
coléoptile de maïs étiolé. Source :
https://academic.oup.com/pcp/article/43/12/1436/1914942

Outre les expansines, l'acidité pariétale active aussi les xyloglucanes endotransglycosylases (XET) qui
hydrolysent le squelette des xyloglucanes. Elles permettent l'insertion de nouvelles molécules de
xyloglucanes permettant la croissance.

A plus long terme, l'auxine agit en faveur de la croissance cellulaire en stimulant la transcription
des gènes codant les expansines ou les enzymes de synthèse des glucides pariétaux.

Les gibbérellines jouent un rôle dans la croissance de la paroi primaire, notamment au niveau des
entrenœuds de la tige. Plusieurs mécanismes complémentaires y contribuent, notamment la régulation
des microtubules qui forment un réseau essentiel pour le dépôt de la cellulose et l'expansion cellulaire.

278
 **Figure 5-96. Les gibbérellines (GA) favorisent le dépôt
de cellulose via le contrôle de la formation des
microtubules. En l'absence de GA, les protéines DELLA
retiennent le complexe préfoldine (PFD) dans le noyau
par interaction directe. La présence de GA entraîne la
destruction des protéines DELLA, ce qui permet au
complexe préfoldine d'atteindre le cytoplasme,
entraînant une production accrue de dimères de
tubuline. La disponibilité accrue de la tubuline est en
corrélation avec l’alignement des microtubules corticaux
transversaux et l’expansion cellulaire. Source :
https://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-
9822(13)00445-4

Signalisation à partir de la paroi cellulaire

Il existe une voie de signalisation qui permet à la cellule de connaitre l'intégrité de sa paroi cellulaire et de
réagir en cas de perte de cette intégrité ou de croitre si la paroi est normale.

**Figure 5-97. Structure de la paroi et stimuli à l'interface paroi/membrane plasmique. PAMPs = pathogen-
associated molecular patterns; DAMPs = damage-associated molecular patterns. Source :
https://ntnuopen.ntnu.no/ntnu-xmlui/bitstream/handle/11250/2644346/Vaahtera.pdf?sequence=5

L'une des principales protéines impliquées est FERONIA (FER) qui est une kinase qui joue un rôle dans la
préservation de l'intégrité des cellules en croissance dans les racines et dans la réponse aux stress biotiques
et abiotiques. Le mécanisme par lequel FER perçoit l'état de la paroi cellulaire est peu connu mais il implique
des stimuli mécaniques à l'interface paroi/membrane plasmique (Vaahtera et al., 2019) ainsi que des
stimuli chimiques : par exemple, la pectine ou les produits de dégradation dérivés de la pectine résultant de
la dégradation de la paroi cellulaire lors d'une infection par un agent pathogène sont impliqués dans les
réponses au stress biotique et abiotique et peuvent activer des changements dans les niveaux calciques
intracellulaires et d'oxygène réactif (ROS) (Benedetti et al., 2015).

279
Destruction de la paroi cellulaire
La dégradation de la cellulose est bien moins répandue dans le monde vivant que celle de l'amidon et est
réalisée par certaines enzymes spécifiques appelées cellulases, présentes chez des micro-organismes, tels
que les bactéries et les champignons. Ces enzymes sont capables de décomposer la cellulose en ses unités
de glucose constitutives, rendant ainsi la cellulose accessible comme source d'énergie ou de matériaux pour
ces organismes et les organismes qui les abritent (les hôtes des microbiotes intestinaux par exemple).

Lors de l'abscission des feuilles, l'éthylène provoque la lyse de composants des parois cellulaires dans la
zone d'abscission. Cet effet est contre-balancé par l'auxine lorsque ce n'est pas encore la période de la chute
des feuilles.

Par ailleurs, dans les laboratoires de recherche, on peut réaliser une dégradation de la paroi
cellulaire pour mettre en culture des protoplastes, des cellules végétales sont paroi qui prennent
une forme sphérique. Les protoplastes sont utilisés pour réaliser des transformations génétiques, étudier
la biochimie cellulaire sans être perturbé par des composants de la paroi, etc...
*Figure 5-98. Protoplaste de mésophylle de feuille de poireau.
Source :
https://www.snv.jussieu.fr/bmedia/paroi/morphologie.htm

Adhérences cellule-cellule

**Figure 5-99. Cellules musculaires lisses de souris traitées en immunofluorescence pour voir la N-cadhérine (jaune)
et l’actine (mauve). Source : Twitter @jonahbk

280
 hez les Métazoaires, les cellules se maintiennent ensemble par des adhérences intercellulaires

C
et des adhérences avec la matrice extracellulaire.

L'adhérence intercellulaire peut être montrée par des expériences simples comme celle ci-
dessous :

*Figure 5-100. Mise en évidence de l'adhérence cellulaire et du rôle des molécules impliquées. Des cellules de rétine
d'embryon de poulet de 10 jours de développement sont dissociées puis on les laisse flottante dans un milieu de
culture pendant 30 minutes. Elles se réassocient alors en amas. En présence d'anticorps bloquants dirigés contre le
domaine extracellulaire de la protéine N-CAM, cette adhérence ne se fait pas. Source :
https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap3/co/module_Chap3_5.html

L'adhérence intercellulaire maintient la cohésion des tissus et permet de former des barrières entre
deux milieux différents. Les cellules peuvent ainsi contrôler les échanges entre ces deux milieux. Au
cours du développement, où les cellules peuvent être amenées à changer de position et donc de
cellules voisines, les adhérences sont particulièrement dynamiques. Elles peuvent être aussi
porteuses d'une information et à ce titre peuvent entrer dans la catégorie des communications
juxtacrines (communication entre cellules voisines).

Les complexes d’adhérence

Ces complexes sont présents surtout dans les épithéliums.

Les adhérences jonctionnelles se présentent comme des complexes moléculaires. Parmi eux, les
desmosomes sont composés d’une plaque de 100 à 500 nm de diamètre, constituée de protéines telles que
la desmoplakine ou la desmoglobine et de cadhérines desmosomiales transmembranaires (desmogléines,
desmocollines). Comme pour toutes les cadhérines, leurs parties extracellulaires se solidarisent en
présence de Ca2+. La plaque interne est reliée à des filaments intermédiaires. Les desmosomes sont
impliqués dans la résistance à la déformation et au stress mécanique des épithéliums (Green et al.,
2019). Ils sont aussi présents dans les jonctions entre les cardiomyocytes et permettent de les
maintenir solidaires lors de la contraction musculaire cardiaque.

281
 *Figure 5-101. Histologie du muscle cardiaque. On voit les disques intercalaires (intercalated discs) constitués de
desmosomes et de jonctions gap, assurant la cohésion mécanique et électrophysiologique de l'ensemble du muscle.
Source : http://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/8-tipos-celulares/cardiomiocito.php

La présence de desmosomes est un caractère dérivé partagé exclusif des Eumétazoaires (excluant les
Spongiaires parmi les Métazoaires).

Autre adhérence jonctionnelle, les jonctions serrées qui forment la ceinture apicale des épithéliums
(et ne sont présentes que chez les Eumétazoaires, excluant les Spongiaires). Elles sont formées de
claudines et d’occludines et reliées aux microfilaments d’actine via les protéines ZO-1/-2/-3.

*Figure 5-102. Structure et fonction des jonctions serrées. A droite, est illustré le fait que ces jonctions sont étanches
et assurent que les échanges à travers un épithélium se font en traversant les cellules qui peuvent ainsi contrôler ces
échanges. Source : https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap3/co/module_Chap3_6.html

Ces jonctions serrées forment une barrière étanche qui bloque la circulation intercellulaire,
assurant que les échanges de part et d’autre de l’épithélium se feront à travers les cellules de
manière contrôlée (perméabilité sélective de l'épithélium). Une brèche dans les jonctions serrées
augmente la perméabilité entre les cellules et peut causer des pathologies (par exemple, des maladies
chroniques inflammatoires de l'intestin) (Choi et al., 2017). Elles permettent aussi de restreindre la
282
diffusion des protéines membranaires et donc d’assurer la spécificité de composition du domaine
apical et basolatéral de la membrane plasmique des cellules épithéliales.

Voir la vidéo : https://youtu.be/-RDH0fZ2bJ0 : Formation de jonctions serrées dans des cellules

épithéliales exprimant la protéine fusion ZO1-Cherry (Cherry est un fluorochrome).

Les claudines forment une famille de 27 membres chez les Mammifères. Diverses combinaisons de
claudines sont exprimées dans les différents cellules épithéliales. La perte de la claudine 11 dans des souris
knock-out n’est pas compensable par d’autres claudines dans les cellules de Sertoli des testicules et aboutit
à la perte de leur phénotype épithélial et à une stérilité (Mazaud-Guittot et al., 2010).

Dernière adhérence jonctionnelle, la ceinture d’adhérence ou zonula adherens. Elle est composée
de cadhérines et de caténines qui sont reliées à des microfilaments d’actine. L’alternance
microfilaments/zonula adherens forme une structure supracellulaire qui coordonne le
comportement de la population de cellules. Par ce moyen, une pression ou un étirement à un endroit
d’un épithélium sera “ressentie” par d’autres cellules assez loin.
*Figure 5-103a. Ceinture d'adhérence entre cellules de
l'épiderme. Des kératinocytes ont été cultivés jusqu'à former
un tapis cellulaire monocouche puis ont été traités en
immunofluorescence. Les « fermetures-éclairs » d’E-cadhérine
(jaunes) forment des jonctions adhérentes entre les cellules
voisines et sont attachés via leur domaine intracytoplasmique
au cytosquelette d'actine (rouge) via des protéines
intermédiaires (non révélées ici). Les noyaux sont colorés en
bleu par le DAPI. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867403001089

*Figure 5-103b. Rôle de l’actine dans la ceinture d’adhérence. L’actine est reliée à l’α-actinine et plusieurs
microfilaments peuvent être reliées à la myosine II qui peut permettre une contraction apicale de la cellule. Les
cadhérines sont en rouge. Les microfilaments d’actine sont reliées au domaine intracellulaire des cadhérines par les
caténines (en marron). Source : https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap4/co/module_Chap4_9.html

La mise en place de toutes ces zones d’adhérence est étroitement régulée lors de la formation d’un
épithélium (par exemple lors d’une transition mésenchyme-épithélium ou lors du développement de
structures acineuses comme les glandes mammaires). Le facteur de transcription TFAP2a est souvent
283
impliqué dans l’activation de l’expression de la E-cadhérine qui est importante pour ces jonctions (voir plus
loin) (Leask et al., 1991; Behrens et al., 1991; Hennig et al., 1996) et ERK3 est nécessaire pour que TFAP2a
puisse bien activer ses cibles (Takahashi et al., 2018).

**Figure 5-104. La déplétion de ERK3 entraîne des jonctions adhérentes et serrées défectueuses dans l’épithélium
de l’épiderme embryonnaire de Xenopus laevis. A) Des morpholinos (MO) contrôle ou contre ERK3 (divers séquences
MO1, MO2, MO3) ont été injectés dans l’hémisphère animal des deux blastomères ventraux au stade 4 cellules. Les
embryons injectés ont été fixés au stade 13 pour réaliser une immunofluorescence à l’aide d’un anticorps anti-E-
cadhérine. Les surfaces apicales de l’épithélium épidermique ont été observées par microscopie confocale. Barres
d’échelle, 10 µm. L’ARNm CAAX-GFP (200 pg) a été co-injecté de manière à visualiser la membrane plasmique. B)
Analyse en RT-qPCR de l’expression du gène codant la E-cadhérine et de celui codant ZO-1. Les niveaux d’expression
de E-cadhérine ou de ZO-1 ont été normalisés à ceux de l’odc, un gène “de ménage”. C) Même expérience que
précédemment mais avec aussi des embryons injectés avec un MO ciblant TFAP2A. L’immunofluorescence utilise un
anticorps anti-ZO-1. D) chaque point indique le nombre de lacunes dans les signaux ZO-1 par champ microscopique.
L’intensité du signal de fluorescence est également quantifiée (E). Source : https://www.jbc.org/article/S0021-
9258(20)39082-7/fulltext

Les jonctions d’adhérence ne sont pas de simples zones qui “collent” les cellules les unes aux autres.
Ce sont des centres de signalisation. Par exemple, lors de la formation du blastocyste de la souris, les
cellules de la périphérie deviennent des cellules du trophectoderme (TE) et les cellules internes deviennent
des cellules de la masse cellulaire interne (MCI). La protéine Angiomotine est associée aux jonctions
d’adhérence dans les cellules internes et active la voie de signalisation Hippo qui réprime l’activité de YAP,
un co-facteur de transcription. Dans les cellules en périphérie, Angiomotine est décrochée des jonctions
adhérentes et se retrouve dans la partie apicale de la cellule. Dans ce cas, la voie Hippo n’est pas activée et
YAP s’associe dans le noyau avec le facteur de transcription TEAD et active l’expression de Cdx2 qui spécifie
les cellules en TE (Hirate et al., 2013).

Les cadhérines
Comme leur nom le suggère, les cadhérines sont des molécules d’adhérence cellulaire dépendantes
des ions Ca2+. Ce sont des protéines transmembranaires qui interagissent avec les mêmes
cadhérines sur les cellules adjacentes (interactions homophiles).

284
 *Figure 5-105. Conformation du domaine extracellulaire
de la C-cadhérine en présence et en absence d'ions Ca2+.
Le domaine extracellulaire formé de 5 répétitions de
domaines EC conserve sa forme et sa rigidité lorsque les
motifs de liaison au Ca2+ sont entièrement chargés.
L'élimination du Ca2+ conduit à des conformations
déformées résultant du mouvement indépendant les uns
par rapport aux autres des domaines EC. Source :
https://www.ks.uiuc.edu/Research/cadherin/

*Figure 5-106. Démonstration de l'interaction

homophilique des cadhérines. Des cellules épithéliales
d'ovaires de hamster (cellules CHO) sont transfectées
avec des vecteurs permettant l'expression soit de la N-
cadhérine, soit de le E-cadhérine associées à des
fluorophores vert ou rouge comme indiqués sur la
légende. On mélange les deux populations de cellules et
on laisse des agrégats se faire en présence de Ca2+.
Lorsque les deux types de cellules expriment la N-
cadhérine, les cellules se mélangent mais lorsqu'un type
de cellules exprime la N-cadhérine et l'autre la E-
cadhérine, les cellules se regroupent selon la cadhérine
qu'elles expriment. Source :
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.0905349106

Cependant, quelques cas d'interactions hétérophiliques ont été observés dans certains contextes cellulaires
(Dash et al., 2022).

Les cadhérines sont ancrées à l’intérieur de la cellule par un complexe de protéines appelées
caténines. Ce complexe se lie aux microfilaments d’actine de la cellule.

285
 *Figure 5-107. Structure de la E-cadhérine (à gauche) de la N-cadhérine (à droite) et des complexes intracellulaires
associés. La E-cadhérine et la N-cadhérine sont des cadhérines dites classiques et partagent des structures similaires.
Toutes deux forment des interactions homophiliques avec les répétitions EC de leur domaine extracellulaire. Elles
forment un complexe cadhérine-caténine intracellulaire et contrôlent les microfilaments d’actine. La différence
structurelle entre l’E-cadhérine et la N-cadhérine aboutit au fait que l’E-cadhérine se lie à l’isoforme plus courte de
la caténine p120 tandis que la N-cadhérine se lie à l’isoforme plus longue. Source : https://www.mdpi.com/2073-
4409/8/10/1118/pdf

*Figure 5-108. Immunofluorescence de la β-caténine

dans des cellules endothéliales humaines. On voit que la
β-caténine est concentrée aux jonctions entre cellules,
associée à des cadhérines :
https://commons.wikimedia.org/wiki/Category:Cell_biology#/media/File:Catenin-humanendothel.jpg

L'interaction vinculine/α-caténine est particulièrement importante pour transmettre les forces de

tension entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule dans un épithélium (Seddiki et al., 2018). La tension
intracellulaire induit des changements conformationnels dans l'α-caténine exposant son site cryptique de
liaison à la vinculine (VBS pour Vinculin Binding Site) (Yonemura et al., 2010; Yao et al., 2014). Une fois liée
à l'α-caténine, la vinculine réalise une transition vers une conformation ouverte capable de se lier au
cytosquelette d'actine, permettant à son tour aux complexes d'adhésion de se renforcer et de résister à des
forces plus élevées dans les cellules sous tension (le Duc et al., 2010; Dumbauld et al., 2013).

286
 ***Figure 5-109. Interactions dépendantes de la force entre la vinculine et l'α-caténine. À faible force (<5 pN), l'α-
caténine existe sous une conformation de faisceau d'hélice auto-inhibée qui empêche la liaison à la vinculine. À force
élevée (> 30 pN), la liaison de la vinculine est également inhibée car la conformation en hélice α du site de liaison à
la vinculine est instable. Dans la plage de force intermédiaire (5–30 pN), la conformation auto-inhibée de l'α-caténine
est libérée et le site de liaison à la vinculine est exposé. La vinculine recrute alors de nouveaux microfilaments
d'actine à la jonction. Source : https://www.nature.com/articles/ncomms5525

L’ensemble de ces interactions intègrent les cellules épithéliales dans une unité mécanique. Le blocage de
la fonction des cadhérines par une inhibition de leur expression ou par des anticorps bloquants peut
empêcher la formation de tissus épithéliaux et provoque la désagrégation des cellules (Takeichi et al. 1979).
*Figure 5-110. Conséquences de l'inhibition de
l'expression de la C-cadhérine lors de la gastrulation du
xénope. Coupes sagittales de gastrulas de xénope
injectés ou non avec un morpholino qui inhibe la
production de la C-cadhérine (la cadhérine la plus
abondante chez les gastrulas de xénope). Le mésoderme
antérieur est entouré en rouge, le mésoderme
préchordal est entouré en orange et le mésoderme
chordal est entouré en jaune. Sans C-cadhérine, on
observe que les cellules ne forment plus d'adhérences
entre elles, les tissus sont plus relâchés. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2107953118

La E-cadhérine est la cadhérine la plus courante dans les tissus épithéliaux. D’elle dépend la stabilité
de l’épithélium mais aussi son dynamisme. Par exemple, le mutant half-baked chez le poisson-zèbre possède
des allèles mutés perte-de-fonction de la E-cadhérine et présente des défauts de gastrulation, notamment
de l’intercalation radiaire qui est nécessaire à l’épibolie de l’épiblaste. Cette intercalation radiaire qui
correspond au déplacement des cellules de la couche interne à la couche externe de l’épiblaste dépend des
glissements des cellules les unes sur les autres et la E-cadhérine est essentielle dans ce processus (Kane et
al., 2005).

Une classe de cadhérines appelées protocadhérines (Sano et al. 1993) ne possède pas de domaine
d’interaction avec les caténines et ne dépend pas du cytosquelette d’actine. L’expression de protocadhérines
similaires permet de garder ensemble des cellules épithéliales durant une migration. L’expression de
protocadhérines différentes provoque en revanche une séparation des tissus. C’est notamment le cas chez
le xénope lorsque les cellules qui forment la corde expriment la protocadhérine AXPC et se séparent de
celles qui forment les somites et qui expriment la protocadhérine PAPC (Chen et Gumbiner, 2006; Yoder et
Gumbiner, 2011). AXPC semble avoir un rôle supplémentaire dans la spécification du destin des cellules de

287
la corde que la simple adhérence différentielle. PAPC quant à elle, pourrait agir sur l’adhérence différentielle
en diminuant l’expression de la C-cadhérine.

Les changements d’expression des cadhérines accompagnent les changements de destinée des
cellules. L’ectoderme de la souris exprime initialement la E-cadhérine mais au cours de la
neurulation, la plaque neurale destinée à devenir le tube neural éteint l’expression de la E-
cadhérine et exprime la N-cadhérine à la place. Si ce changement est bloqué, la séparation des deux
tissus, ectoderme non neural et neurectoderme se fait mal (voir Figure 3-96).

Il peut y avoir des différences entre espèces : la N-cadhérine ne semble pas jouer un rôle crucial dans
l’architecture du neuroépithélium chez la souris mais elle joue un rôle important chez le poisson-zèbre.

*Figure 5-111. Sans N-cadhérine, l’organisation du neuroépithelium dans la région postérieure du cerveau est altérée
chez le poisson-zèbre. Coloration au céramide Bodipy (coloration de la membrane plasmique) de coupes
transversales microscopiques confocales au niveau du cerveau postérieur d’un embryon de poisson-zèbre 24 après
la fécondation ; (A) poisson sauvage, (B, C) poisson mutant pac qui ne produit plus de N-cadhérine fonctionnelle. Les
pointes de flèches rouges indiquent les cellules arrondies, les flèches bleues indiquent les structures en forme de
rosette ectopique dans les régions dorsales du mutant pac, et les flèches blanches indiquent la lumière du ventricule
du tube neural et la lumière ectopique dans les structures en forme de rosette dorsale chez pac. Les encarts dans A,
B montrent des coupes longitudinales à travers le mésencéphale et le rhombencéphale. La limite mésencéphale-
rhombencéphale est indiquée par des têtes de flèches blanches et les niveaux auxquels les coupes transversales sont
prises sont indiqués par de fines flèches blanches. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/129/14/3281/41702/parachute-n-
cadherin-is-required-for-morphogenesis

Lors de la transition épithélio-mésenchymateuse qui mène à l’émergence des cellules de crêtes neurales, il
y a aussi des modifications importantes d’expression des cadhérines. Chez l'embryon de poulet, l'expression
de la N-cadhérine et de la cadhérine 6B est remplacée par celle de Cadhérine-7 et de Cadhérine-11 (Chalpe
et al., 2010 ; Nakagawa et Takeichi, 1998). Non seulement la transcription du gène codant la N-cadhérine
est diminuée mais en plus la partie extracellulaires des protéines encore présentes est clivée par la
métalloprotéinase ADAM10 (Shoval et al., 2007).

288
 **Figure 5-112. Clivage de la N-cadhérine par la métalloprotéase ADAM10. (A) Représentation schématique des sites
de clivage de la N-cadhérine et des régions de liaison aux anticorps. La N-cadhérine complète de 135 kDa peut être
clivée par une activité métalloprotéinase en fragments N-terminaux de 95 kDa (NTF) et en fragments C-terminaux
de 40 kDa (CTF1), qui peuvent ensuite être clivés par une activité de type γ-sécrétase en fragments solubles de 35
kDa (CTF2). (B) Le clivage constitutif de la N-cadhérine est réduit dans les fibroblastes embryonnaires de souris MEF
ADAM10-/-. Les MEF ont été préincubés avec un inhibiteur de γ-secrétase (0,5 μM) pendant la nuit et récoltés.
Western-blot avec des extraits cellulaires totaux de fibroblastes ADAM9-/-, ADAM10-/-, ADAM15-/- et ADAM17-/-,
de cellules BACE1-/- (BACE1 est la β-sécrétase 1) et de MEFs sauvage (WT) incubés avec un anticorps anti-N-
cadhérine C-terminal. Les surnageants de ces cellules ont également été soumis à une analyse western blot en
utilisant des anticorps anti-N-cadhérine N-terminale (MNCD2). N-Cad/FL : N-cadhérine complète ; CTF : fragment
carboxy-terminal de la N-cadhérine ; NTF : fragment N-terminal de la N-cadhérine. (C) Les cellules déficientes en
ADAM10 ont été retransfectées de manière stable avec l'ADAM10 de type sauvage (A10-/-retr) et comparées aux
MEF de type sauvage et déficientes en ADAM10 pour l'expression de la N-cadhérine en présence d'un inhibiteur de
γ-sécrétase (0,5 μM). N-cad/FL : N-cadhérine complète ; CTF : fragment C-terminal de la N-cadhérine ; NTF : fragment
N-terminal de la N-cadhérine ; p : précurseur d'ADAM10 ; m : forme mature d'ADAM10. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC549617/

Cependant, une fois de plus, ce n’est pas un mécanisme général car chez le xénope, l’expression de la N-
cadhérine est augmentée au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules de crêtes
neurales (Bahm et al., 2017). Dans ce modèle, la N-cadhérine permet aux cellules migrantes de mieux
répondre au chémoattracteur Sdf1. De plus, les cellules de crêtes neurales céphaliques migratrices
établissent des jonctions communicantes ou jonction-gaps qui permettent de répondre aux sémaphorines
(Bannerman et al., 2000; Huang et al., 1998; Waldo et al., 1999 ; Xu et al., 2006). On voit particulièrement
bien dans cet exemple qu’il ne faut pas imaginer l’adhérence cellule-cellule comme antinomique de
migration cellulaire.

Dans un autre système comme la cicatrisation de l'épiderme de l'embryon de drosophile, la transition

épithélio-mésenchymateuse est réalisée en partie par endocytose de la E-cadhérine (Hunter et al., 2015).

Les interactions médiées par les cadhérines peuvent être essentielles entre des cellules souches et les
cellules de leur niche pour que les cellules souches conservent leurs propriétés. C’est le cas dans les
ovarioles de drosophile. Les cellules souches germinales sont en contact avec les cellules de la coiffe dans la
partie la plus antérieure des ovarioles. Les interactions E-cadhérine/E-cadhérine assurent que les cellules
souches germinales ne se différencient pas. Lorsqu’au cours d’une division cellulaire, une des deux cellules

289
filles de la cellule souche perd le contact avec les cellules de la coiffe, elle commence à se différencier en
cystoblaste qui va subir la méiose.

Les protéines Dscam chez la drosophile appartiennent à la famille des molécules d’adhérence
cellulaire et jouent un rôle important dans l’immunité et dans la mise en place en place des circuits
nerveux. Ces protéines sont très diversifiées mais elles proviennent d’un seul gène qui contient 115
exons. La diversité est générée par épissage alternatif : 20 exons sont toujours présents mais 95
sont “optionnels” et de multiples combinaisons sont générées. Les interactions homophiliques
n’ont lieu qu’entre protéines identiques mais pas entre protéines même très proches (Wojtowicz
et al., 2009). Cela suggère que le rôle de Dscam dans le guidage axonal et la mise en place des
réseaux neuronaux chez la drosophile est lié à des reconnaissances et des adhérences très précises
entre cellules.

Autres molécules d’adhérences cellulaires

*Figure 5-113. Diversité des protéines impliquées dans

l'adhérence cellule-cellule. D'après
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/5-
celulas/3-adhesion.php

Contrairement à ce que l’on pourrait penser les intégrines sont également impliquées dans l’adhérence
cellule-cellule. Par exemple, les cellules souches hématopoïétiques restent dans leur niche, accrochées aux
cellules stromales voisines et les intégrines participent à ces jonctions.

290
 **Figure 5-114. Adhérences avec les cellules stromales
voisines et la matrice extracellulaire des cellules souches
hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Remarquez
que les intégrines sont impliquées non seulement dans
les interactions avec la matrice extracellulaire mais aussi
avec les autres cellules (interactions intégrine
α4β1/VCAM-1, intégrine αLβ2/ICAM-1 et intégrine
α4β7/MadCAM-1). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.756231/full

Si on utilise des anticorps bloquant l’interaction intégrine α4β1/VCAM-1, les cellules souches
hématopoïétiques finissent par s’échapper dans la circulation sanguine (Papayonnoupoulou et al., 1995).
L’interaction entre l’intégrine α4β7 et MadCam-1 est essentielle pour le recrutement des cellules souches
hématopoïétiques dans la moelle osseuse soit au cours du développement, soit au cours de transfusions
(Katayama et al., 2004). Chez les patients atteints de leucémie myéloïde aigue, l’interaction intégrine
α4β1/VCAM-1 est un élément important de la résistance à la chimiothérapie parce que cette interaction
active la signalisation NF-kB dans les cellules stromales qui en retour envoient des signaux favorisant la
survie des cellules tumorales (Jacamo et al., 2014).

VCAM-1 est aussi impliqué dans le maintien des cellules souches neurales dans la zone sous-ventriculaire
du télencéphale où de la neurogénèse se déroule chez les Mammifères adultes. Lorsqu’avec une
micropompe, on injecte en continu pendant 6 jours des anticorps bloquant anti-VCAM dans la zone sous-
ventriculaire d’une souris, la couche des cellules épendymaires qui constitue une partie de la niche des
cellules souches neurales est désorganisée (Kokovay et al., 2012). Cela aboutit à augmenter la prolifération
des cellules souches neurales dont une grande partie est habituellement quiescente. Dans ce système,
VCAM-1 est exprimé par les cellules souches neurales. Son partenaire sur les cellules épendymales n’a pas
été encore trouvé.

L'adhérence cellulaire médiée par les intégrines et les molécules qui s'y lient peut être contrôlée. Par
exemple, lors d'une inflammation, les cellules endothéliales produisent des chimiokines en direction des
leucocytes qui activent des voies de signalisation intracellulaires qui activent les intégrines à la surface en
leur faisant changer de conformation et qui permet de les faire interagir avec ICAM-1 qui est présente à la
surface des cellules endothéliales. Cette interaction permet de ralentir puis d'arrêter les leucocytes,
préalable à leur traversée de l'endothelium vers le site de l'inflammation.

291
 **Figure 5-115. Contrôle de l'adhérence entre les
leucocytes et les cellules endothéliales par des
chimiokines exprimées lors de l'inflammation. Source
: IJsbrand Kramer - Université Bordeaux 1
https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap3/co/cours-molecules-
adherence.html

LA CARTE MENTALE

Les transitions épithélio-mésenchymateuses et la migration cellulaire

Les transitions épithélio-mésenchymateuses

La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) est un phénomène cellulaire complexe qui
consiste pour une cellule en l’acquisition de propriétés mésenchymateuses à la place de
caractéristiques épithéliales. Cela implique la perte (éventuellement partielle) d’interactions
cellule-cellule et de la polarité apico-basale, et le gain de caractéristiques mésenchymateuses telles
que les expansions cytosoliques, la polarité arrière-avant et l’augmentation de la capacité de
migration et d’invasion, le tout accompagné d’un changement radical de type d’interactions cellules-
matrice extracellulaire (MEC). Il ne faut cependant pas voir ces états de manière trop binaire : il
existe de nombreux états intermédiaires.

L’EMT est impliquée dans de nombreux processus physiologiques (développement embryonnaire,

cicatrisation) et pathologiques (fibrose, cancers). De nombreuses études sur les EMT lors du
développement embryonnaire ont été suivies de la découverte des mêmes acteurs impliqués dans
le passage de tumeurs in situ à des métastases (80 % des cancers ont pour origine des cellules
épithéliales et c'est lorsqu'elles deviennent mésenchymateuses que les cellules tumorales deviennent
vraiment dangereuses).

292
*Figure 5-116. Passage d’un état épithélial à un état mésenchymateux (EMT) avec quelques marqueurs associés.
Signalons qu’il existe des transitions inverses, mésenchymateuses vers épithéliales (MET). Source :
https://www.mdpi.com/2075-4655/3/1/1

*Figure 5-117. Un exemple de transition épithélio-

mésenchymateuse. Les cellules de crêtes neurales
céphaliques sont marquées en hybridation in situ
fluorescente avec une sonde reconnaissant l'ARNm de
TFAP2B sur des coupes transversales d'embryons de
poulet. Les noyaux sont marqués au DAPI. Au stade HH9,
les cellules sont incluses encore pour la plupart dans le
tube neural qui est un (neuro)épithélium tandis qu'au
stade HH10, les cellules sont devenues
mésenchymateuses et migrent à travers les tissus
embryonnaires. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2009997117

Historique
Elizabeth Hay (1927-2007) à Harvard a été la première à décrire l’EMT et à utiliser plus tard ce terme. À partir de
1958, elle a travaillé sur la régénération des membres d’amphibiens et notamment décrit la dédifférenciation des
cellules cartilagineuses des membres de la salamandre, qui peuvent participer à la formation de nouveaux membres
en se redifférenciant. Ce processus ressemble à une EMT. Elizabeth Hay a ensuite travaillé sur le développement
embryonnaire du poulet. Grâce aux descriptions très précises des images de microscopie optique et électronique
obtenues à partir de tissus embryonnaires, elle a identifié et répertorié différents phénotypes cellulaires. En 1968, elle
a décrit comment les tissus mésenchymateux sont issus des cellules épithéliales lors de l’émergence et de la migration
des cellules de la crête neurale.

Hay et son équipe ont utilisé le terme EMT pour la première fois en 1982, dans une publication décrivant une culture
de cellules épithéliales de cristallin de poulet en suspension dans des gels de collagène qui peut conduire à des
expansions cytosoliques, comme dans les pseudopodes. Ces cellules sont alors capables de se déplacer
individuellement dans la matrice de collagène, et elles ressemblent à des cellules mésenchymateuses. En 1982, des
chercheurs suisses et allemands (équipe de Karl Illmensee, Université de Genève) ont montré que les premières
cellules mésenchymateuses apparaissant lors de l’embryogenèse de souris proviennent de cellules épithéliales qui
perdent l’expression des protéines des desmosomes et des cytokératines et commencent à exprimer la vimentine.

Depuis 1990, quelques équipes ont montré la grande importance des protéines de la famille du TGF (facteur de
croissance transformant), TGF-α et TGF-β1-3 au cours de l’EMT. En effet, l’expression du TGF-α conduit à un phénotype
mésenchymateux et invasif dans les cellules cancéreuses de la prostate de rat. En 1991, Potts et al. ont montré
l’importance du TGF-β3 dans l’EMT des cellules endothéliales cardiaques embryonnaires et en 1994, ils ont montré
que les cellules épithéliales mammaires peuvent subir une EMT après un traitement au TGF-β. En 1999, le laboratoire
de Peter Ten Dijke (Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Suède) a montré pour la première fois l’implication
des protéines SMAD dans l’induction de l’EMT après activation du récepteur TGF-β. Enfin, l’équipe de Hay a travaillé
en 2008 sur des lignées cellulaires cancéreuses, montrant que les facteurs de transcription de la famille SNAIL peuvent
induire l’expression du TGF-β3.

293
Les cellules épithéliales sont considérées comme ayant tout ou partie des caractéristiques
biologiques cellulaires suivantes : polarité apicobasale, jonctions serrées, jonctions adhérentes,
jonctions gaps, desmosomes, hémidesmosomes reliés à une lame basale, filaments intermédiaires à
base de kératine, faisceau cortical de fibres d’actine. Cependant, la plupart des tissus épithéliaux
embryonnaires ne contiennent pas ce spectre complet de caractéristiques, et les composants moléculaires
généralement associés à ces structures subcellulaires ne sont pas uniquement ou universellement présents
dans les cellules épithéliales (Nakaya et Sheng, 2013). L’expression de la E-cadhérine par exemple peut être
détectée dans des cellules non épithéliales (Filimonow et al., 2019), et de nombreuses structures
épithéliales telles que l’endothélium vasculaire n’expriment pas la E-cadhérine (Giampietro et al., 2012; van
Roy, 2014) mais la N-cadhérine et la VE-cadhérine. De plus, lorsque le même processus de développement
est étudié (par exemple la gastrulation ou la formation des crêtes neurales), les types et la dynamique de
l’expression des cadhérines peuvent dépendre de l’organisme modèle. Ainsi, au lieu d’utiliser des
marqueurs moléculaires, un épithélium peut être mieux défini comme un groupe de cellules qui sont
collectivement polarisées avec des surfaces apicales et basolatérales partagées et qui fonctionnent comme
une barrière physicochimique entre deux compartiments (Yang et al., 2020).

Les cellules mésenchymateuses, en revanche, sont définies comme des cellules non épithéliales.
Elles ne maintiennent pas une polarité cellulaire stable, ont des interactions cellule-cellule et
cellule-matrice dynamiques, ont des filaments intermédiaires à base de vimentine et des fibres de
tension d’actine, et sont plus mobiles que les cellules épithéliales. Au cours du développement, les
cellules doivent souvent se déplacer sur de longues distances depuis leur lieu d’origine jusqu’à leur
destination finale.

*Figure 5-118. Activation de l'expression de la vimentine, un marqueur de mésenchyme, lors d'un modèle de
cicatrisation. Un tapis de cellules épithéliales mammaires humaines MCF10A a été perturbé par une "blessure"
réalisée par un cône de pipette à t=0h. On observe par immunofluorescence la cinétique d'expression de la vimentine
qui est un marqueur de mésenchyme. Il y a une transition épithélio-mésenchymateuse, les cellules migrent pour
combler la blessure (et prolifèrent aussi) puis redeviennent épithéliales (disparition de l'expression de la vimentine
8 jours après la blessure). Source : https://journals.biologists.com/jcs/article/112/24/4615/26046/Vimentin-
contributes-to-human-mammary-epithelial

294
 *Figure 5-119a. Augmentation de l’expression de la
vimentine par TGF-β2. Images en contraste de phase
représentatives illustrant la morphologie de cellules ARPE-
19 (épithélium pigmenté rétinien) à 48 h après le début du
traitement avec TGF-β2 et images d’immunofluorescence
représentatives du marqueur mésenchymateux de la
vimentine (vert) et du DAPI (noyaux, bleu) à 72 h. Les barres
d’échelle sont de 50 μm. Source :
https://www.mdpi.com/14220067/22/9/4701/htm

*Figure 5-119b. Changements d’expression

protéiques qui accompagne l’EMT activée par le
TGF-β. Des cellules A549 (cellules humaines
épithéliales d’adénocarcinome alvéolaire) ont été
exposées à 5 ng/mL de TGF-β pendant 0, 1, 2 et 3
jours. (A) Analyse par western-blot de l’expression
de la E-cadhérine, de la N-cadhérine, de la
vimentine, de la β-caténine et du facteur de
transcription Snail. La β-actine a servi de témoin de
charge ; (B–D) les niveaux de la protéine indiquée
ont été quantifiés. Source :
https://www.mdpi.com/2072-6643/9/9/980/htm

Outre des changements d'expression de gènes, l'EMT peut s'accompagner d'un changement d'isoforme des
protéines par épissage alternatif comme c'est le cas pour CTNND1 (ou p120Cas), une caténine impliquée
dans l'adhérence cellule-cellule et le récepteur FGFR2. Dans le cas de CTNND1, l'épissage alternatif qui
maintient l'exon 2 dans l'ARNm mature au cours de l'EMT génère une isoforme qui déstabilise les
adhérences intercellulaires. Dans le cas de FGFR2, l'inclusion de l'exon IIIc change la spécificité du récepteur
pour ses ligands ce qui influence les capacités de migration (Segelle et al., 2022).
**Figure 5-120. Epissage alternatif de CTNND1 au cours
de l'EMT. Dans un système cellulaire inductible de l'EMT
en 7 jours (des cellules de carcinomes mammaires
humaines où on peut activer l'expression de SNAIL1), on
quantifie par RT-qPCR la présence de l'exon 2 parmi tous
les transcrits de CTNND1 (qui code une caténine
impliquée dans l'adhérence cellule-cellule) au cours du
temps (en abscisse en jours). On utilise comme témoins
des cellules où l'EMT n'a pas été induite (UNT) et des
cellules qui ont subi une EMT mais ensuite la
transformation inverse en épithélium (MET). Les
ordonnées représentent le ration entre les ARNm
matures ayant l'exon 2 et tous les ARNm matures. Source
: https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-
1247(22)00076-6

295
Les variations des organisations cellulaires épithéliales et mésenchymateuses et les interconversions ont
été décrites en utilisant divers termes. On distingue les organisations : entièrement épithélial (état E total;
présentant toutes ou la plupart des caractéristiques épithéliales), entièrement mésenchymateux (état M
total; présentant toutes ou la plupart des caractéristiques mésenchymateuses), partiellement épithélial
(état E partiel; présentant certaines caractéristiques épithéliales au-dessus du minimum mais ne
remplissant pas les critères pour être classé comme un état M), et partiellement mésenchymateux (état M
partiel; ne répondant pas à l’exigence minimale d’un épithélium, mais ne présentant pas non plus de
caractéristiques complètes M). De même, les transitions peuvent être considérées comme un EMT complet
ou partiel, selon les points de début / fin d’une transition donnée dans une étude. La multitude d’états
intermédiaires (qui peuvent être stables ou partiellement stables) est appelée spectre EMT (Nieto
et al., 2016).

Plusieurs processus et modèles de développement ont longtemps été utilisés pour les études sur
l’EMT. Citons la gastrulation (Bardot et Hadjantonakis, 2020; Keller et al., 2003; Nakaya et Sheng, 2008),
la formation des crêtes neurales (Ahsan et al., 2019; Piacentino et al., 2020; Shellard and Mayor, 2019),
la somitogenèse (Kalcheim et Ben-Yair, 2005; Nakaya et al., 2004; Pourquie, 2018; Takahashi et al., 2005)
et la formation des valves cardiaques (von Gise et Pu, 2012).

Se rendre à la figure 3-79 pour voir un exemple de transition épithélio-mésenchymateuse pendant

la gastrulation d’un embryon de poulet.

Au cours de l’EMT, la lame basale sous la couche épithéliale se décompose sous l'action des protéines MMP
(métalloprotéases matricielles caractérisées par un site catalytique avec ion Zn 2+ lié à trois histidines)
(Horejs, 2016). L'expression des MMP augmente de manière importante au cours de l'EMT. Selon les MMP,
elles agissent soit en étant accrochées à la membrane plasmique (en étant transmembranaires ou ancrées
par le GPI (glycosylphosphatidylinositol)), soit secrétées dans la lame basale (Itoh, 2015).

De très nombreuses voies de signalisation convergent pour activer l’EMT et concentrent leur
contrôle sur un petit nombre de facteurs de transcription qui coordonnent l’EMT à l’échelle
cellulaire et moléculaire (voir Figure 5-122).

Bien que diverses voies de signalisation puissent réguler l’EMT en fonction du contexte cellulaire,
l’activation des répresseurs transcriptionnels des familles Snail, Twist et Zeb est une étape précoce
largement conservée.
*Figure 5-121. L'expression du facteur de transcription
TWIST induit une EMT. Des cellules épithéliales rénales de
chien (lignée MDCK) sont transfectées avec un vecteur
d'expression vide ou un vecteur d'expression du gène
humain TWIST. On observe les cellules en microscopie à
contraste de phase et en microscopie à fluorescence pour
l'immunofluorescence anti-TWIST et anti-CDH1 (E-
cadhérine). Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160616303657

296
**Figure 5-122. De multiples voies de signalisation régulent l’EMT. Les régulations croisées entre plusieurs voies de
signalisation augmentent l’expression des facteurs de transcription EMT, notamment SNAI1, SLUG, TWIST et ZEB et
entraînent une perte des caractéristiques épithéliales et une acquisition des caractéristiques mésenchymateuses. La
voie Wnt/β-caténine induit l’EMT en interagissant avec TCF/LEF. Les facteurs de croissance dont l’EGF, le FGF et le
facteur de croissance des hépatocytes (HGF) se lient à leurs récepteurs respectifs pour activer la signalisation RAS/ERK,
la signalisation RAS/PI3K et la signalisation RAS/RAC. L’activation de la voie RAS/RAC conduit ensuite à la
réorganisation du cytosquelette en augmentant l’expression de RAC et de Cdc42. La voie Hippo inhibe la voie YAP/TAZ,
mais elle est supprimée lorsque la quantité de PI3K et de F-actine est augmentée par d’autres voies de signalisation
pendant l’EMT. La voie Shh/GLI et les voies JAK/STAT augmentent l’expression de SNAI1 qui pilote le programme EMT.
La voie TGF-β favorise l’EMT via Smad ou mais aussi de manière indépendante à Smad. La signalisation TGF β/Smad
active le complexe Smad2/3 qui entre dans le noyau et interagit avec des facteurs de transcription pour conduire l’EMT,
activer la voie p38 MAPK et augmenter l’expression de HMGA2 qui active l’expression de la N-cadhérine. La signalisation
non-Smad active la signalisation PI3K/AKT pour induire l’EMT en supprimant GSK3 et en favorisant l’expression de NF-
κB. NCID clivé par la voie Notch, se déplace dans le noyau et active l’expression de SLUG. La N-cadhérine augmente
l’expression de RhoA pour renforcer la jonction cellule-cellule et renforcer le réarrangement du cytosquelette.

Source : https://www.mdpi.com/2073-4409/8/10/1118

Au cours de l’EMT, les protéines à doigt de zinc Snail et Slug, transcrits respectivement à partir des gènes
Snai1 et Snai2, répriment directement la transcription des gènes impliqués dans le phénotype épithélial,
notamment les composants des protéines des jonctions serrées et d’adhérence telles que l’E-cadhérine.

Twist1, quant à lui, est un facteur de transcription de type bHLH (hélice-boucle-hélice basique) et il se fixe
aussi directement sur le promoteur du gène codant la E-cadhérine et réprime son expression. Cette
inhibition a été observée dans au cours du développement embryonnaire mais aussi dans les tumeurs du
sein (Vesuna et al., 2008). Twist1 active aussi directement l'expression du gène codant PCOLCE (pour
Procollagen C-Endopeptidase Enhancer), une protéine secrétée impliquée dans la maturation du

297
procollagène en collagène (Bildsoe et al., 2016). Ainsi, les cellules exprimant Twist1 remodèlent la MEC
autour d'elles.

BILAN DE L’EMT :

**Figure 5-123. Bilan de l’EMT.

Source : https://www.mdpi.com/2218-273X/10/12/1676

La compréhension du contrôle des EMT est crucial pour comprendre la formation de métastases à
partir de tumeurs in situ. On retrouve de nombreux facteurs découverts en embryologie qui jouent
un rôle lors de la progression des tumeurs.

298
 **Figure 5-124. Modèle d'équilibre EMT / MET
dans le cancer.
Dans les cellules cancéreuses humaines, les
états mésenchymateux et épithéliaux sont
induits et maintenus par des programmes de
régulation transcriptionnels et post-
transcriptionnels. Ces programmes sont
contrôlés par la régulation par rétroaction entre
les facteurs de transcription OVOL et ZEB1,
inducteurs critiques de MET et EMT
respectivement. De plus, ces facteurs de
transcription contrôlent l'expression d'ESRP1,
un régulateur de l'épissage crucial pour le MET
et réprimé dans l'EMT. Par conséquent, un
niveau d'OVOL élevé et un niveau de ZEB1 faible
stabilisent l'état épithélial en diminuant
l'invasion des cellules cancéreuses et les
métastases, et inversement pour l'état
mésenchymateux. Source :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0076773

Les migrations cellulaires

La migration cellulaire est essentielle lors de l’embryogenèse afin de gastruler, d’allonger l’axe des
vertébrés et de distribuer les cellules dans l’embryon pour contribuer au développement des
organes. La complexité du microenvironnement embryonnaire signifie que les cellules en migration
doivent changer rapidement leur forme, développer des protubérances qui pénètrent dans des
espaces de différentes tailles, parcourir des environnements où les signaux envoyés par les autres
cellules et par la matrice extracellulaire (MEC) sont différents.

Les modes de migration cellulaire individuelle et collective diffèrent largement en fonction des exigences
fonctionnelles spécifiques des cellules et des tissus, ainsi que de l’environnement à travers lequel les cellules
doivent migrer. Comment naviguer dans des microenvironnements complexes avec des barrières à la
migration ? Comment comprimer le corps cellulaire et en particulier le noyau volumineux et souvent peu
compressible à travers la MEC et les pores des tissus ? Et comment coordonner la migration de groupes de
cellules dans la migration cellulaire collective ? Pour faire face à ces défis, les cellules doivent détecter,
contourner et/ou briser les barrières de la MEC tout en maintenant les interactions nécessaires avec les
tissus environnants et, comme c’est le cas pour la migration collective, les autres cellules d’un groupe.

Comme dit plus haut lors de la partie sur les EMT, il ne faut pas avoir une image trop caricaturale : cellules
épithéliales = immobile, cellule mésenchymateuse = mobile. Des cellules épithéliales peuvent migrer
collectivement.

Dans les cellules migrantes, les microfilaments d’actine forment de longues structures parcourant
une bonne partie du cytoplasme et accrochés à la membrane plasmique et, indirectement, à la MEC
par les points focaux d’adhérence. Ces fibres sont appelées fibres de tension ou fibres de stress (voir
les Figures 5-13 et 5-14). Les microfilaments sont accrochés entre eux par de l’α-actinine pour former
une fibre. Les fibres de tension peuvent être associées à la myosine-II non musculaire ce qui permet
le déplacement de la cellule (Burridge et Wittchen, 2013).

La régulation dynamique de la signalisation d’adhésion est importante pour que la motilité

cellulaire se produise. La tyrosine kinase FAK agit comme un nœud de signalisation au niveau des
points focaux d’adhérence pour favoriser la réorganisation continuelle du cytosquelette que
nécessite la migration. FAK régule la motilité cellulaire initiée par les intégrines et les récepteurs de
facteurs de croissance. La liaison du ligand à une intégrine associée à FAK provoque l’autophosphorylation

299
de FAK au niveau du résidu Tyr397. Cela révèle un motif de liaison pour les protéines contenant le domaine
SH2 telles que Src, qui phosphoryle davantage FAK sur Tyr861, Tyr925, Tyr576 et Tyr577.
*Figure 5-125. Phosphorylation de FAK au niveau des
points focaux d'adhérence. Immunofluorescence avec un
anticorps reconnaissant la forme phosphorylée de FAK
sur la tyrosine 397 (vert) et reconnaissance des
microfilaments d'actine grâce à la phalloïdine-RFP
(rouge). Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3001759

*Figure 5-126. Phosphorylation de FAK sur la tyrosine

397 lors de la mise en place de l'adhérence à la
fibronectine. Des cellules HEK293 sont ensemencées à t=
0 sur une boîte de culture cellulaire recouverte de
fibronectine. On extrait les protéines de cellules après
différentes périodes suivant l'ensemencement et on
réalise un western-bot avec un anticorps reconnaissant
FAK (quelque soit sa forme, phosphorylée ou non) ou
reconnaissant FAK quand elle est phosphorylée sur la
tyrosine 397 (α-pFAK). Source :
https://bmcmolcellbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2121-12-49

Lors de la migration, des points focaux d'adhérence doivent se désassembler pour que de nouveaux
puissent se mettre en place. Lors du désassemblage, les intégrines subissent une endocytose dans
des puits bordés de clathrine.

**Figure 5-127. Contrôle de l'internalisation des intégrines lors du désassemblage dynamique des points
d'adhérence focaux. Image de microscopie en fluorescence (à gauche) montrant les points d'adhérence focaux, qui
résultent du regroupement des intégrines (en vert), et qui sont connectées au système contractile actine-myosine de
la cellule ou fibres de tension (ou de stress) (en rouge). Le schéma (à droite) représente la séquence des évènements
moléculaires survenant au cours de l’endocytose de l’intégrine dépendante de la clathrine, qui se produit au bord de
l’adhérence focale. La protéine ICAP-1 (integrin cytoplasmic domain-associated protein-1) agit comme une protéine
adaptatrice : elle permet le positionnement de la protéine NME (nucleoside diphosphate kinase) à proximité de
l’intégrine (1), d’AP2 (adaptor protein 2) et de la dynamine (2). NME catalyse la synthèse de GTP (guanosine
triphosphate) ce qui permet d'alimenter la dynamine en GTP dans les puits recouverts de clathrine (3), et ainsi
permet la déformation de la membrane et la fission de la vésicule (4, 5) pour assurer l'endocytose des intégrines. Ce
mécanisme est aussi à l'œuvre pour limiter la taille des points d'adhérence focaux. Source :
https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2023/07/msc230108/msc230108.html

300
La polarisation des cellules en un front protrusif et un dos rétractile est la caractéristique
déterminante de la migration de type mésenchymateux. Fait intéressant, un certain nombre d’études
ont rapporté que les ARNm des protéines ribosomiques (RP) peuvent fortement se localiser sur les fronts
protrusifs de certaines cellules de type mésenchymateux (Mardakheh et al., 2015; Mili et al., 2008; Wang et
al., 2017). C’est logique car des protéines essentielles sur le front de migration sont traduites sur place au
plus près de leur localisation finale. C’est le cas notamment de la β-actine.

Voir une vidéo sur la localisation dynamique de l’ARNm codant l’actine beta dans une cellule en migration :
https://youtu.be/du_iDp_tV5Y : Dynamique en temps réel de l’ARNm de la β-actine dans une cellule en
migration. La localisation de l’ARNm de la β-actine est hautement dynamique et corrélée à la protrusion et
à la migration cellulaires. La traduction de la β-actine se fait donc au plus proche des structures qui en ont
besoin. Dans la vidéo, on utilise la technique de marquage MS2-GFP (MS2 est une protéine qui a une forte
affinité pour les ARN et que l'on peut cibler sur un ARNm particulier) pour visualiser l'ARNm endogène de
la β-actine. La carte des couleurs montre l'intensité de fluorescence représentant la concentration d'ARNm
de β-actine (Hye Yoon Park and Robert H. Singer, Albert Einstein College of Medicine).

La localisation des ARNm de protéines ribosomiques (RP) dépend de LARP6. Sa présence entraîne une
activation de la synthèse de RP, conduisant à une amélioration de la biogenèse des ribosomes et à une
capacité de synthèse des protéines accrue requise pour soutenir la migration et la prolifération importante
de cellules mobiles. Dans les carcinomes mammaires humains, une expression plus élevée de LARP6 est
associée aux sous-types invasifs de type mésenchymateux. La transition épithélio-mésenchymateuse induit
l’expression de LARP6, qui agit pour promouvoir la synthèse des protéines afin d’améliorer la prolifération
et l’invasion des cellules malignes.

La partie la plus à l'arrière de la cellule en migration peut s'allonger et quelque fois se détacher. Quand il n'y
a pas détachement, la membrane plasmique postérieure peut être "recyclée" vers l'avant, par endocytose
puis transport vésiculaire.
*Figure 5-128. Flux membranaires d'une cellule en
migration (vers la droite). La membrane plasmique
postérieure est endocytée dans des vésicules qui sont
transportées à l'avant puis fusionnée avec la membrane
plasmique à l'avant pour contribuer à l'augmentation de
la surface membranaire due notamment aux
lamellipodes. Au cours du déplacement, un flux
membranaire partiel vers l'arrière contribue à la force
cellulaire qui lui permet de se déplacer sur la matrice
extracellulaire. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2007229117

> Diversité des modes de migration

Les cellules présentent différentes manières de migrer : de manière isolée ou collective.

301
 *Figure 5-129. Différents types de migration.

Une cellule isolée en migration est une cellule polarisée avec une protrusion membranaire à l’avant,
suivie de forces de poussées. Puis à l’arrière du noyau, des forces contractiles et la rétraction
membranaire.

La migration amiboïde présente des protrusions membranaires très larges, sans présence de filopodes, ni
de fibres de tension d’actine, ni de points focaux d’adhérence tandis que la migration mésenchymateuse
présente un ou plusieurs lamellipodes ponctués de filopodes, des fibres de tension d’actine reliés à des
points focaux d’adhérence. A la place des fibres de tension, les cellules en migration amiboïde ont un réseau
d’actine sous la membrane plasmique à l’arrière de la cellule. La migration amiboïde est rapide (de l’ordre
de 10 µm par seconde) tandis que la migration mésenchymateuse est plus lente (moins de 1 µm par
seconde).

Les cellules peuvent migrer individuellement mais aussi en groupe. Dans la vidéo ci-dessous on peut
observer la migration de cellules MDCK, des cellules rénales de chien. Les cellules migrent ensemble (et sont
parcourues par des vagues d’activité de la kinase ERK mises en évidence par un biosenseur EKAREV-NLS)
(Hino et al., 2020) : https://youtu.be/prSjVaATx0g

Les repères directionnels pour une migration collective orientée sont perçus par les cellules à l'avant
appelées cellules leader puis transmis vers les cellules plus en arrière via des forces mécaniques transmises
via des jonctions cellule-cellule (Omelchenko et al., 2003, Reffay et al., 2014, Yamaguchi et al., 2015; Das
et al., 2015, Tambe et al., 2011). Les cellules en arrière peuvent aussi transmettre des informations vers les
cellules leader via des tensions mécaniques transmises par l'adhérence cellulaire (mécanotransduction)
(Boutillon et al., 2022).

**Figure 5-130. Contrôle de la migration collective des cellules de bordure dans les ovarioles de la drosophile. Les
cellules de bordure forment un groupe (cluster) de 6 à 10 cellules qui migrent entre les cellules nourricières dans les
ovarioles de drosophile. (A) Un gradient de ligands des récepteurs tyrosine-kinase (en violet) émis par l'ovocyte se
forme entre les cellules nourricières. Il active ces récepteurs préférentiellement à l’avant du cluster de cellules de
bordure. (B) La polarisation de la signalisation des récepteurs tyrosine-kinase est transformée en une forte
polarisation de Rac, une petite GTPase (que nous verrons en détail plus loin). Rac est actif dans toutes les cellules,
mais son activité est beaucoup plus importante dans la cellule leader et Rac y active la formation d'une protrusion.
(C) La myosine II induit une contractilité à la base et à la pointe de la protrusion de la cellule leader mais aussi à
l’arrière du cluster. Cette contractilité propulse le cluster vers l’avant. PVR : PDGF/VEGF receptor, orthologue des
récepteurs du PDGF (platelet-derived growth factor) et du VEGF (vascular endothelial growth factor) ; EGFR
: epithelial growth factor receptor. Keren est un ligand de l'EGFR. Source :
https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2023/07/msc230106/msc230106.html
302
 > La formation des lamellipodes et des filopodes

C’est la polymérisation de l’actine qui est le principal moteur de la formation des lamellipodes. Ces
expansions cellulaires peuvent faire jusqu'à 200 nm d'épaisseur répartis sur jusqu'à plusieurs dizaines de
µm le long de l’avant de la cellule. Les microfilaments d’actine constituant le lamellipode sont orientés avec
leurs extrémités barbelées (+) à croissance rapide dirigées vers l’extérieur.

**Figure 5-131. Dynamisme du réseau d’actine vue par une expérience de FRAP sur de l’actine fusionnée à la GFP
dans un lamellipode de cellules de mélanomes de souris. Le carré de la deuxième image représente la zone soumise
au photoblanchiment. Les chiffres en haut à droite des images correspondent aux secondes. Un graphique montre le
retour de l’intensité de fluorescence dans deux zones F et B. On constate que la zone à l’avant est plus dynamique
qu’à l’arrière. Barre d’échelle = 3 µm.

Source : https://www.embopress.org/doi/full/10.1038/emboj.2008.34

Le complexe Arp2/3 est constitué de 7 sous-unités et est associé aux microfilaments d'actine au
niveau du lamellipode (voir Figure 5-5).

La suppression des composants du complexe Arp2/3 par ARN interférence (ARNi) ou la

séquestration du complexe dans le cytosol inhibe la formation de lamellipodes (Machesky et Insall,
1998 ; Kunda et al, 2003 ; Steffen et al, 2006).
*Figure 5-132. Localisation du complexe Arp2/3 dans les
lamellipodes d’un kératocyte de xénope en migration.
Immunofluorescence de Arp2/3 (a) et de l’actine (b) puis
addition des deux colorations (c). Source :
https://rupress.org/jcb/article-
pdf/145/5/1009/1285979/9903075.pdf

Arp2/3 contribue à générer des nouveaux microfilaments en les branchant sur des filaments
préexistants ce qui permet d’expliquer l’aspect en maille du réseau d’actine dans les lamellipodes
(voir Figure 5-3). De nouveaux microfilaments branchés se forment à l’avant tandis que les plus anciens
303
se désassemblent à l’arrière, comme dans un tapis roulant. C’est la cofiline qui est responsable du
désassemblage à l’arrière qui permet de rendre à nouveau disponible des monomères d’actine G pour la
polymérisation à l’avant (Carlier et al, 1999; Ghosh et al, 2004; Hotulainen et al, 2005; Andrianantoandro et
Pollard, 2006).

*Figure 5-133. Aspect très branché des microfilaments d’actine dans un lamellipode de kératocyte de xénope en
migration dû à l’action de Arp2/3. Vues en microscopie électronique à balayage. Barre d’échelle : 0,1 µm.

L’activation du complexe Arp2/3 dans les lamellipodes est médiée par le complexe WAVE (Stradal et al,
2004) et par les protéines de la famille WASp.

La formation des lamellipodes est aussi sous le contrôle de la petite GTPase Rac qui active les
protéines de la famille WASp qui activent ensuite Arp2/3. La formation des filopodes est en revanche
sous le contrôle de la petite GTPase Cdc42 tandis que les fibres de tension de l’actine sont mises en
place sous l’action de la petite GTPase Rho qui active ROCK (laquelle augmente l’activité de la myosine
II) et qui active les formines. Il y a donc une répartition des rôles des 3 GTPases Rac, Cdc42 et Rho. Il peut y
avoir des antagonismes : Rac active PAK qui inhibe l’activité de la myosine II associée aux fibres de tension
d’actine. Ce mécanisme assure que les fibres de tension se forment à l’arrière, à une certaine distance du
lamellipode.

*Figure 5-134. Action des petites GTPases Rho, Rac et Cdc42 sur la forme des cellules, les microfilaments d'actine et
les points d'adhérence focaux. Des fibroblastes de souris 3T3 sont microinjectées avec des versions constitutivement
actives de Rho, Rac ou Cdc42 et les microfilaments sont révélés avec un marquage phalloïdine-GFP (A, C, E, G) et les
points d'adhérences focaux sont révélés par immunofluorescence avec un anticorps anti-vinculine (B, D, F, H). On
observe que Rho induit la formation de fibres de tension d'actine et de nombreux points d'adhérence focaux, Rac
induit la formation de lamellipodes et Cdc42 induit la formation de filopodes. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/science.279.5350.509

304
 *Figure 5-135. Fonctionnement des petites GTPases
(valable pour Rho, Rac, Cdc42 mais aussi pour d’autres
protéines de signalisation comme Ras). Les petites
GTPases sont actives lorsqu’elles sont liées à du GTP.
Elles deviennent inactives lorsqu’elles lysent le GTP et
elles le font d’autant plus vite qu’elles sont assistées par
des GAP, GTPase Activating Protein (qui agissent donc
comme des inhibiteurs). Le GDP est remplacé par un GTP
ce qui active à nouveau la petite GTPase et les GEF
(Guanine nucleotide Exchange Factor) accélèrent le
processus (elles agissent donc comme des activateurs).
D’après https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2019.00121/full

*Figure 5-136. Activités polarisées Rac et Rho dans une

cellule en migration. Rac active les protéines WASP qui
activent Arp2/3 qui permet de créer des branchements
au réseau d’actine. Le maillage de ce réseau est stabilisé
par la filamine qui est activée par PAK, elle-même activée
par Rac. De l’autre côté de la cellule, Rho active ROCK qui
organise la formation des fibres de tension de l’actine et
active la myosine en phosphorylant sa chaîne légère, ce
qui stimule la motilité.

**Figure 5-137. La migration des interneurones des

éminences médianes vers le cortex est freinée en
absence de RhoA. Les interneurones corticaux sont
générés dans les éminences ganglionnaires ventrales du
télencéphale (les deux masses que l’on voit en bas des
images A et B). Ils migrent ensuite dorsalement vers le
cortex. Les cellules des éminences médianes sont
marquées par la GFP sous le contrôle d’un promoteur qui
leur est spécifique et on suit leur migration sur des
coupes de cerveau de souris à E14,5 sauvage (contrôle)
ou avec une mutation perte-de-fonction de RhoA dans
ces cellules (RhoA-Olig2-CKO). On observe une
migration moins étendue des interneurones corticaux
dans les embryons RhoA-Olig2-CKO à E14.5. Pour la
quantification, le cortex cérébral a été divisé en trois
régions également espacées comme indiqué par des
lignes en pointillés et des nombres. La diminution du
nombre de cellules EGFP+ est la plus importante dans la
région 1 qui est celle la plus éloignée de leur point de
départ. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/140/15/3139/45742/RhoA-and-Cdc42-are-
required-in-pre-migratory

305
Comme effecteurs des GTPases de la famille Rho, citons aussi les protéines mDia, qui font partie des
formines. Les formines mDia sont des protéines conservées au cours de l’évolution qui initient, allongent et,
dans certains cas, regroupent les filaments de F-actine qui forment les filopodes, les lamellipodes et les
ruffles (des ondulations de la membrane plasmique caractéristiques de l’avant des cellules en migration).
mDia2 contrôle aussi la stabilité des points focaux d’adhérence durant la migration collective de cellules
épithéliales (Gupton et al., 2007).
**Figure 5-138. La formine mDia2 est nécessaire
pour une bonne organisation des points d’adhérence
focaux dans des cellules en migration. Des cellules
Ptk1 (cellules épithéliales de rein de rat-kangourou)
contrôles ou injectées avec un anticorps anti-mDia2
sont fixées puis traitées en immunofluorescence
avec un anticorps anti-paxilline (qui est présent dans
les points d’adhérence focaux). Source :
https://journals.biologists.com/jcs/article/120/19/3475/35195/mDia2-regulates-actin-and-focal-adhesion-dynamics

Tout aussi importante que la polymérisation des microfilaments d'actine, la dépolymérisation de

ces microfilaments est essentielle pour le dynamisme nécessaire à la migration et pour que des
monomères actine G puissent être remobilisés ailleurs. La protéine POD-1 chez C. elegans est un
exemple de protéine qui débranche les microfilaments branchés formés par Arp2/3 (Xie et al., 2021). En
absence de POD-1, les cellules embryonnaires de C. elegans ont de graves défauts de polarisation et de
migration.
**Figure 5-139. POD-1 déstabilise les branchements du
réseau de microfilaments formés par Arp2/3. En haut,
filaments d'actine (1, 2 μM, 50% marqués au vert
d'Oregon) se développant en présence de 13,5 nM
d'Arp2/3 ± 100 nM de POD-1 observés par microscopie
TIRF. Le temps est représenté en secondes. Les flèches
rouges indiquent des branchements d'actine qui se
détachent en présence de POD-1. Barre d'échelle = 3 μm.
En bas, filaments d'actine (1,2 μM, 50 % marqués au vert
de l'Oregon) poussant en présence de complexe Arp2/3
13,5 nM et POD-1 marqué par Alexa Fluor-568 observés
par microscopie TIRF. Les flèches blanches indiquent la
localisation de POD-1. Barre d'échelle = 1 μm. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.210080511
8

Parmi les paramètres importants pour la migration, citons la directionalité du mouvement, ou la capacité
pour des cellules à maintenir un cap. Prenons un exemple pour montrer que ce paramètre est crucial. β-Pix
(Arhgef7) est une GEF des GTPases Rac1 et Cdc42 qui se localise sur les points focaux d’adhérence. Les
embryons de souris mutantes nulles β-Pix arrêtent leur développement avant E8.0 et ne parviennent pas à
spécifier un axe corporel antéro-postérieur car β-Pix est requis pour la migration épithéliale collective des
cellules de l’AVE (endoderme viscéral antérieur) et aussi du mésoderme. Etudions la migration de cellules
d’explants du mésoderme plus en détail :

306
 **Figure 5-140. β-Pix est nécessaire à la directionalité de la migration des cellules du mésoderme chez la souris. (a,
b) Trajectoires de migration cellulaire vues en microscopie à contraste de phase pendant 4h superposées à une image
d’explants de mésoderme sauvage (WT) ou muté sans β-Pix (β-PixΔEpi) cultivés in vitro. Le suivi montre que la
migration des cellules d’explant de mésoderme de type sauvage est directionnelle (a) et est interrompue et
accompagnée de changement de directions avec les cellules mutantes sans β-Pix (b). (c–f) L’emplacement des
protrusions cellulaires dépend de β-Pix. Images en contraste de phase (c, e) avec superpositions (d, f) de cellules
individuelles en migration sur une surface 2D. Une cellule de mésoderme de type sauvage (c, d) montre des
protrusions limitées à un front de migration restreint, contrairement à la cellule mutante β-PixΔEpi (e, f), où le front
de migration est plus grand et la protrusion plus large. (g) La migration directionnelle persistante est interrompue
dans les cellules d’explant mutantes. (h) Les vitesses cellulaires sont significativement plus élevées en l’absence de
β-Pix que dans les cellules de type sauvage. Barres d’échelle, 100 µm (a, b), 30 µm (c–f). Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-020-19889-1

On constate que la vitesse de migration est plus élevée dans des cellules sans β-Pix mais la persistance de la
migration dans une direction donnée n'est pas assurée générant des défauts majeurs au cours de la
gastrulation (Omelchenko et al., 2020). Des expériences complémentaires ont montré que β-Pix interagit
avec Scribble et ensemble, ces protéines contrôlent la polarité cellulaire et l'activité de Cdc42 (Zaritsky et
al., 2017).

LA CARTE MENTALE :

EN DIRECT DES LABOS :

307
Vidéo sur une équipe de recherche qui travaille sur la rétroaction mécanique lors de la formation de
protrusions cellulaires : https://www.insb.cnrs.fr/fr/cnrsinfo/vers-une-comprehension-moleculaire-du-
controle-mecanique-de-la-migration-cellulaire

308
Les cycles et les divisions cellulaires

*Figure 5-141. Deux anaphases de mitose vues dans un

épithélium utérin de lapine en phase folliculaire. Photo :
Patrick Pla, à partir de la collection histologique de la
Préparation à l’Agrégation SVTU de l’Université Paris
Saclay.

egardez cette vidéo : https://youtu.be/eLbyeWNYMAk qui montre un petit groupe de cellules,

R
avec quelques divisions, dans le système nerveux central d’un embryon de Xenopus laevis en
développement. Les cellules expriment l’histone-2B fusionnée à la protéine fluorescente verte
(H2B-GFP) pour marquer les chromosomes et une protéine fluorescente rouge ciblée sur la
membrane (memRFP).

Les êtres vivants ont la capacité de se reproduire. Les cellules qui constituent les unités de base du
vivant ne font pas exception. Leur prolifération doit cependant être régulée au cours du
développement puis au cours de l’homéostasie tissulaire des organismes pluricellulaires de telle
manière à obtenir un ensemble harmonieux et fonctionnel. Des anomalies de ces régulations
peuvent aboutir à des tumeurs.

*Figure 5-142. Caractéristiques des cellules tumorales. Les cellules tumorales échappent notamment aux contrôles
qui freinent le cycle cellulaire (icone STOP), maintiennent de manière anormale des voies de signalisation
intracellulaire favorables à la prolifération et peuvent se répliquer "à l'infini". C'est pourquoi l'étude du cycle
cellulaire est importante non seulement en biologie du développement mais aussi en cancérologie. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2021.661583/full

Le cycle cellulaire est un processus étroitement régulé composé de quatre phases : G1, S (phase de
réplication), G2 et M (mitose). Aux premiers stades du cycle cellulaire, une présence continue de
facteurs de croissance et de nutriments est requise jusqu’à ce que le point de restriction G1 soit
atteint, après quoi les cellules sont engagées dans un programme de division cellulaire. Le point de
contrôle G2/M sert à s’assurer que tout l’ADN a bien été répliqué et le point de contrôle

309
métaphase/anaphase permet d’assurer une distribution précise du matériel génétique entre les
deux cellules filles.
*Figure 5-143. Quantité d'ADN dans le noyau au cours du
cycle cellulaire. La réplication de l'ADN lors de la phase S
double progressivement la quantité d'ADN. La mitose
permet de répartir équitablement l'ADN entre les deux
cellules-filles et rétablit la quantité normale d'ADN par
cellule. L'unité utilisée ici est "c", la quantité d'ADN dans
une cellule haploïde.

*Figure 5-144. Durées moyennes passées dans les

différentes phases du cycle cellulaire par des cellules
humaines proliférantes en culture. On remarque que la
mitose est la phase la plus courte et qu’en son sein la
métaphase et l’anaphase qui sont pourtant
spectaculaires avec l’alignement puis le déplacement
des chromosomes vers les deux pôles de la cellule sont
très brefs.

Après la division, chaque cellule peut soit répéter le cycle, soit entrer dans un état de repos appelé
G0 (quiescence).

*Figure 5-145. Cycle cellulaire et quiescence.

D’après https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2018.00059/full

Les cellules entrent dans G0 juste avant la différenciation ou en réponse à l'absence de facteurs de
croissance ou en réponse à un stress génotoxique. La quiescence implique un arrêt temporaire du cycle
cellulaire. Une perte définitive de la capacité de prolifération s'appelle la sénescence, et concerne
par exemple la plupart des cellules différenciées.

310
Quiescence ou prolifération ? Entrée et progression dans la phase G1
Le fait qu’une cellule entre dans G0 ou passe par G1 pour continuer le cycle est dicté par la régulation
de plusieurs facteurs clés, notamment les cyclines et les kinases dépendantes des cyclines (CDK), les
inhibiteurs de CDK et la protéine du rétinoblastome (Rb). Les complexes cycline-CDK entraînent la
progression du cycle cellulaire par la phosphorylation des protéines impliquées dans chacune des
phases du cycle cellulaire (Malumbres, 2014).

Les kinases dépendantes des cyclines (CDK) sont des sérine/thréonine kinases dont l’activité
dépend d’une sous-unité régulatrice, une cycline. Sur la base de la séquence du domaine kinase, les CDK
appartiennent au groupe de kinases CMGC (du nom des initiales de certains membres), avec les protéines
kinases activées par les mitogènes (MAPK) et la glycogène synthase kinase-3β (Gsk3β).

Les complexes cycline D-CDK4/6 et cycline E-CDK2 favorisent la progression dans G1 (Aktas et al.,
1997). Ainsi, des niveaux élevés de cycline D ou de cycline E et de CDK4/6 augmentent la
prolifération en entraînant le passage à travers G1. A l’inverse, des stimuli qui diminuent
l’abondance et l’activité de ces protéines induisent une quiescence (Aktas et al., 1997). CDK4/6 peut
aussi agir sur la croissance cellulaire en activant mTORC1, un complexe avec la kinase mTOR1 qui stimule
l’anabolisme (production de nouvelles molécules) et inhibe le catabolisme (destruction de molécules). Elle
active mTORC1 en inhibant un de ses inhibiteurs, TSC2. CDK4/6 couple ainsi croissance et division cellulaire
(Romero-Pozuelo et al., 2020).
**Figure 5-146. Action conjointe de CDK4/6 (couplés
avec une cycline) sur la prolifération et la croissance.

Source : https://www.cell.com/cell-
reports/pdfExtended/S2211-1247(20)30394-6

De nombreuses voies de signalisation peuvent faciliter la progression de la cellule en G1. Akt est une
sérine/thréonine kinase activée par des voies de signalisation en provenance de nombreux
récepteurs de facteurs de croissance (par exemple les FGF). Akt a de multiples effets pour aboutir à
une stimulation de l’avancée dans le cycle : augmentation de la transcription de cycline D1 via
l’inhibition de GSK3 et l’entrée dans le noyau de la -caténine qui s’associe avec les facteurs de
transcription LEF/TCF, augmentation de la traduction de l’ARNm de cycline D1 via la voie mTOR. Akt fait
également sortir du noyau des inhibiteurs de la progression du cycle tels les inhibiteurs de CDK, p21
et p27.

311
 *Figure 5-147. Mode d’action d’Akt pour la progression
dans la phase G1 du cycle. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Akt/PKB_signaling_pathway#/media/gulation.png

p21 (CDKN1A), p27 (CDKN1B) et p57 (CDKN1C) sont des inhibiteurs de CDK (ou CKI) qui favorisent
la quiescence, et effectivement les cellules quiescentes présentent généralement des niveaux élevés
de ces protéines (Aktas et al., 1997 ; Barr et al., 2017 ; Cheung et Rando, 2013 ; Fujimaki et al., 2019).
Par exemple, p27 est fortement exprimé pendant la quiescence dans les fibroblastes en culture (Oki et al.,
2014). Des diminutions de l'activité ou des niveaux d'inhibiteurs de CDK peuvent conduire à la sortie
de la quiescence et à la réentrée dans le cycle cellulaire (Arora et al., 2017; Urban et al., 2021).

**Figure 5-148. p21 inhibe l'activité de CDK2 dans des cellules épithéliales mammaires. Des cellules épithéliales
mammaires humaines MCF10A sont mis en culture dans un milieu qui favorise la prolifération de la plupart d'entre
elles. On suit l'activité de CDK2 (observée par un senseur fluorescent que l'on ne détaillera pas ici) au cours du cycle
cellulaire en prenant l'anaphase de la dernière mitose comme temps de référence (t=0). Lorsque p21 est exprimé (à
gauche) on constate que 26% des cellules n'ont pas d'activité CDK2 qui remonte après la fin de la mitose (l'activité
de CDK2 dans ces cellules est représentée en rouge). Les cellules qui ont cette faible activité de CDK2 entrent en
quiescence. En absence de p21 chez des cellules mutantes (à droite), la proportion de cellules où l'activité de CDK2
reste très faible et qui entrent en quiescence tombe sous 2%. Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-
8674(13)01143-4

Ainsi, en raison du rôle régulateur critique de ces facteurs du cycle cellulaire, les signaux d'induction
de la quiescence agissent généralement pour diminuer l'activité cycline-CDK ou augmenter les
niveaux d'inhibiteur de CDK.

L’équilibre entre la cycline D qui pousse à la prolifération et p27 qui oriente vers la quiescence dépend aussi
de la densité cellulaire. Une cellule fille qui vient d’être générée par mitose a “gardé en mémoire” la densité
cellulaire où se trouvait sa cellule mère et cela modifie l’activité de ces protéines. C’est une composante de
ce que l’on appelle l’inhibition de contact. Une forte densité dans la cellule mère supprime l’activité ERK qui
aboutit à un ratio p27/Cycline D augmenté dans la cellule fille (Fan et Meyer, 2021).

312
 **Figure 5-149. La densité avant la mitose détermine le
comportement des cellules filles après la mitose. D’après
https://www.cell.com/cell-reports/pdf/S2211-
1247(21)00853-6.pdf

La protéine dite “du rétinoblastome” Rb est une cible majeure de la phosphorylation par CDK4/6 et
un acteur central dans la décision prolifération-quiescence. Elle a été découverte et étudiée
initialement dans le cadre des rétinoblastomes, des tumeurs de l’œil affectant principalement des
enfants mais cette protéine joue un rôle dans toutes les cellules. Rb inhibe la prolifération en se liant
à et en inactivant E2F, un activateur transcriptionnel clé pour les gènes du cycle cellulaire et de la
division cellulaire (Cheung et Rando, 2013 ; Yao et al., 2008). La phosphorylation de Rb par la cycline
D-CDK4 empêche sa capacité à réprimer E2F, permettant l’entrée dans le cycle cellulaire (Yao et al.,
2008). L’activité E2F est suffisante pour inciter les cellules quiescentes à entrer dans la phase S,
tandis que la prévention de l’activation E2F inhibe la réentrée dans le cycle cellulaire. Ainsi, la voie
Rb-E2F agit comme un interrupteur qui intègre des signaux de croissance gradués dans une décision
binaire prolifération contre quiescence.

Rb peut également agir en maintenant la quiescence en dehors de la voie E2F. Dans les cellules quiescentes,
le Rb hypophosphorylé s’associe au complexe promoteur d’anaphase lié à Cdh1 ou cyclosome (APC/CCdh1)
pour cibler Skp2, un activateur de la dégradation de l’inhibiteur de CDK p27 (Binné et al., 2007). Cela permet
au p27 de s’accumuler et de favoriser davantage la quiescence. L’activité APC/CCdh1 est nécessaire pour
maintenir les hépatocytes dans un état quiescent, et sa perte entraîne une réentrée de ces cellules dans le
cycle cellulaire et une insuffisance hépatique ultérieure (Wirth et al., 2004).

Rb a deux membres de la même famille qui lui sont étroitement liés, RBL1/p107 et RBL2/p130 (Sadasivam
et DeCaprio, 2013). Comme Rb, p107 et p130 sont des suppresseurs de tumeurs qui empêchent l’expression
des gènes dont les produits font avancer le cycle cellulaire. Elles réalisent cette action en se liant aux
protéines de répression E2F4/5 (Claudio et al., 1994). De plus, p130 fonctionne dans le cadre du complexe
DREAM (DP, RB-like, E2F4/5 et MuvB) (Litovchick et al., 2007). DREAM s’assemble pendant la quiescence
et inhibe la progression du cycle cellulaire en inhibant la transcription de nombreux gènes du cycle
cellulaire régulés habituellement par E2F, notamment les gènes codant les facteurs de transcription B-MYB
et FoxM1 (Fischer et al., 2016). En conséquence, les perturbations de p130 ou du complexe DREAM
permettent l’expression de ses gènes cibles du cycle cellulaire habituellement réprimés, déplaçant
l’équilibre de la quiescence vers la prolifération (Forristal et al., 2014; Iness et al., 2019).

313
 **Figure 5-150. Des cellules n’exprimant plus Rb, p107 et p130 passent massivement en phase S même en absence
de facteurs de croissance. Des cultures de fibroblastes provenant de souris sauvages (wt) ou homozygotes pour des
mutations perte-de-fonction p107-/-;p130-/- ou Rb-/- ou p107-/-;p130-/-;Rb-/- (=TKO pour triple knock-out) sont
cultivées en présence de sérum qui contient des facteurs de croissance (A) ou en son absence (B). Les phases de leur
cycle cellulaire sont observées en FACS après coloration de l’ADN à l’iodure de propidium. En A à gauche, le premier
pic correspond aux cellules n’ayant pas répliqué leur ADN, le second pic à celles qui ont répliqué leur ADN mais ne
se sont pas encore divisées (en phase G2 ou en mitose avant la cytodiérèse). Les cellules avec une fluorescence
intermédiaire sont en phase S en train de répliquer leur ADN. Le pourcentage de cellules en phase S cellulaire est
indiqué, avec des écarts types (+/-). On constate qu’en présence de facteurs de croissance une proportion nettement
plus importante de cellules TKO sont en phase S que les autres cellules mais semblent bloquées à ce stade car on ne
voit pas de pic correspondant aux cellules G2/M. En absence de facteurs de croissance, cette tendance est même
amplifiée et on voit également que les autres mutants ont plus de réplication et de mitoses que les wt. Source :
http://m.genesdev.cshlp.org/content/14/23/3037/F4.expansion.html

Revenons à la progression du cycle cellulaire. La phosphorylation de Rb par CDK4/6 entraine via E2F1
l'activation de la transcription de gènes codant les protéines indispensables à la transition G1/S et
à la réplication qui suit. Parmi ces cibles, on trouve le gène codant une nouvelle cycline, la Cycline E.
Elle s’associe avec la kinase CDK2 et ce nouveau complexe phosphoryle également la protéine Rb. Il
y a donc mise en place d'une boucle de rétro-activation positive qui amplifie la phosphorylation de
Rb et la libération de E2F. L’hyperphosphorylation de Rb (sur 14 sites) permet le passage du « point
de restriction ». A partir de ce point, les cellules peuvent poursuivre leur cycle cellulaire de manière
autonome (indépendamment de la présence de facteurs de croissance, d'éléments de la matrice
extracellulaire...).

Bilan :

314
 *Figure 5-151. Contrôle de la progression dans la phase
G1. Notez que E2F1 peut aussi activer la transcription du
gène codant la cycline E.

Réplication de l’ADN et progression en phase G2

En fin de phase G1, le facteur E2F stimule la transcription de gènes permettant l’entrée et la
progression dans la phase S (cycline A).

Une ubiquitine ligase nommée SCF provoque la dégradation des inhibiteurs de CDK de phase S, ce qui
permet à ces CDK d'être actifs. Lorsque la cellule est entrée en réplication, SCF provoque aussi la
dégradation des cyclines exprimées en phase G1.

La réplication commence au niveau de multiples séquences d'origines de réplication sur chaque

chromosome reconnues par les complexes ORC. Des hélicases inactives sont chargées aux origines
de réplication (et ce, dès la phase G1 en ce qui concerne le complexe de pré-réplication constitué de
Mcm2-7). Puis les cycline/CDK de phase S ainsi que la kinase DDK favorisent l'activation des
hélicases en facilitant leur association avec des co-facteurs (Moiseeva et al., 2018). Ces hélicases
séparent alors les deux brins d'ADN permettant à la machinerie de réplication de s'installer. A partir
de cette origine, deux fourches de réplication progressent en s'écartant. Les complexes cycline-CDK
de phase S stimulent l'arrivée de l'ADN hélicase et de la machinerie de réplication. En revanche, ils
inhibent les complexes ORC une fois la réplication enclenchée, de telle manière à ce que l'ADN ne
soit pas répliqué plusieurs fois. Les complexes de pré-réplication qui sont indispensables à la
réplication suivante, ne peuvent se mettre en place qu'en phase G1 et pas avant.

315
 *Figure 5-152. Contrôle de la réplication de l'ADN dans le cycle cellulaire. Le chromosome est préparé pour la
réplication de l'ADN en phase G1, lorsque des complexes de pré-réplication sont assemblés aux origines de
réplication (rouge). La transformation de ces complexes en complexes de pré-initiation et leur activation en phase S
entraînent le déroulement de l'hélice d'ADN et l'initiation de la réplication de l'ADN. Deux fourches de réplication se
forment à partir de chaque origine jusqu'à ce que le chromosome entier soit dupliqué. La ségrégation des
chromosomes dupliqués en phase M (mitose) aboutit alors à deux cellules filles avec des chromosomes identiques.
L'activation des origines de réplication provoque également le désassemblage du complexe de pré-réplication. Étant
donné que de nouveaux complexes de pré-réplication ne peuvent pas être formés aux origines avant le G1 suivant,
chaque origine ne peut être activée qu'une seule fois dans chaque cycle cellulaire. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Pre-
replication_complex#/media/File:Overview_of_chromosome_duplication_in_the_cell_cycle.svg

Il arrive que la réplication s'arrête ou progresse plus lentement à certains loci. C'est ce qui arrive parfois
lors de la première division cellulaire chez l'embryon humain (passage du zygote au stade 2 cellules) où la
réplication peut se terminer seulement en phase G2. Des anomalies chromosomiques peuvent en résulter
(Palmerola et al., 2022).

Signalons que les histones sont synthétisées essentiellement en phase S et s'associe à l'ADN nouvellement
synthétisé juste derrière la fourche de réplication. Si des histones ne sont pas synthétisées en quantité
suffisante, il y a un rallongement de la phase S voire un arrêt du cycle en phase G2 (Günesdogan et al., 2014).

La réplication du centrosome, le centre organisateur des microtubules, est une importante étape
préliminaire pour la mitose, sachant le rôle important que les fuseaux de microtubules jouent
durant la division cellulaire. Cette réplication est coordonnée avec la réplication de l’ADN par la
CyclineE-CDK2 (Hanashiro et al., 2008). Elle phosphoryle notamment directement la nucléophosmine
(NPM)/B23 qui est responsable de l'initiation de la réplication des centrioles (Okuda et al., 2000). Le
processus est semi-réplicatif (comme pour l'ADN) : un nouveau centrosome est formé d'un ancien
centriole associé à un nouveau. Des mécanismes de contrôle permettent de s'assurer que le
centrosome ne s'est répliqué qu'une seule fois par cycle cellulaire.
*Figure 5-153. Réplication du centrosome.
Source : https://europepmc.org/article/med/20647763

316
Des anomalies de la régulation du nombre de réplication du centrosome par cycle peuvent aboutir à un
nombre plus élevé de centrosomes et à des fuseaux mitotiques multipolaires. On peut les trouver dans les
cellules tumorales et cela cause des aneuploïdies (nombre anormal de chromosomes dans une cellule).
*Figure 5-154. Fuseaux mitotiques multipolaires (vert)
dans une cellule tumorale en division. Les centrosomes
sont observés grâce à un immunomarquage révélé en
rouge. On observe que la cellule tumorale a le double du
nombre de centrosomes par rapport à une cellule
normale dans cette phase du cycle (métaphase). Les
chromosomes sont marqués en bleu. Source :
https://www.hhmi.org/bulletin/fall-2014/errors-
division

Signalons que la production de nouveaux centrioles peut aussi avoir lieu en dehors du cadre de la division
cellulaire, par exemple lors de la production de cils dans les cellules multiciliées en train de se différencier.
De manière intéressante, cette production de nouveaux centrioles peut dépendre de protéines qui
interviennent aussi au cours du cycle cellulaire (Jord et al., 2017).

La mitose et le contrôle de ses étapes

Pour réviser les phases de la mitose, voir cette vidéo : https://youtu.be/ofjyw7ARP1c

L’entrée en mitose à partir du stade G2 est contrôlé par CDK1 associée à la cycline B. Ce complexe
est aussi appelé MPF (pour M-phase Promoting Factor). CDK1 est le seul membre de la famille
véritablement indispensable à l’accomplissement du cycle cellulaire. Chez la souris, le knock-out de CDK1
est très rapidement léthal, ce qui n’est pas le cas des knock-out de CDK2, CDK4 ou CDK6 et CDK1 peut
compenser l’absence de toutes les autres CDK (Santamaria et al., 2007).

Comme souvent avec les CDK, la quantité de CDK1 reste assez constante au cours du cycle cellulaire.
C’est l’accumulation de cycline B au-delà d’un certain seuil en phase G2 qui fait basculer la cellule en
mitose.

Une forte activité cyclineB-CDK1 provoque une condensation des chromosomes via la
phosphorylation des complexes de condensines (Bazile et al., 2010), la dispersion de la membrane
nucléaire via la phosphorylation des lamines, la séparation des centrosomes, la formation du fuseau
mitotique et l’assemblage des kinétochores qui couplent les chromosomes aux microtubules (voir
plus loin). Une fois que les chromosomes sont attachés aux microtubules du fuseau, la cycline B est
dégradée en fin de métaphase et la cellule passe à la deuxième phase de la mitose vers l’anaphase.
C’est le complexe ubiquitine ligase APC/C (avec son co-activateur Cdc20) qui cible la cycline B pour
la dégradation. Si tous les chromosomes ne sont pas attachés au fuseau, APC/C n’est pas activé et la
cellule conserve un haut niveau de cycline B. C’est ce que l’on appelle le point de contrôle
métaphasique ou point de contrôle du fuseau. Il s’agit d’être sûr que tous les chromosomes sont
arrimés au fuseau avant de les répartir dans les deux cellules-filles.

L’activité de CDK1 est aussi régulée par des phosphorylations. Cdc25 est une phosphatase qui enlève
des phosphorylations qui inhibent CDK1 et qui avaient été ajoutées par la kinase Wee1. Les
premiers complexes actifs CyclineB-CDK1 inhibent Wee1 créant une boucle de rétroaction positive.

317
 **Figure 5-155. Les trois transitions du cycle mitotique impliquant Cycline B-Cdk1. Pendant la phase G2, la Cycline
B s’accumule et se lie à Cdk1 qui est phosphorylée à T161 par CAK et à Y15 et T14 par Wee1/Myt1. Le complexe est
donc inactif. À la transition G2 à M, Wee1/Myt1 sont désactivés tandis que Cdc25 est activé, favorisant les
déphosphorylations Y15 et T14 et l’activation de Cdk1. Au cours de la phase M, Cycline B-Cdk1 phosphoryle de
nombreux substrats mitotiques, notamment Wee1/Myt1 et Cdc25. A partir du milieu de la phase M, la cycline B est
dégradée si la cellule passe le point de contrôle métaphase/anaphase.

Source : https://celldiv.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13008-020-00065-2

Plk1 (pour Polo-Like Kinase 1) est une sérine/thréonine kinase qui active Cdc25 ce qui favorise l’activation
de CyclineB-Cdk1. L’expression de Plk1 est augmentée dans de nombreuses cellules cancéreuses et c’est
une cible de choix pour des traitements.

**Figure 5-156. Activation de Polo-like kinase 1 (Plk1)

qui est nécessaire à l’entrée en mitose. Polo-like kinase 1
(Plk1) est rapidement activée peu de temps avant la
CyclinB1-Cdk1.

Plk1 s’associe avec la phosphatase Cdc25C1 et induit sa

phosphorylation avant l’entrée en mitose. Les
phosphorylations de Cdc25C1 dépendantes de Plk1 sont
suffisantes pour promouvoir l’entrée mitotique, même
lorsque l’activité de Plk1 est inhibée. L’activation de Plk1
pendant la phase G2 dépend des niveaux d’activité de
CyclinA2-Cdk, montrant comment un facteur de
promotion de la phase S, prépare aussi les cellules à
s’engager dans la mitose. Source :
https://www.cell.com/cell-reports/comments/S2211-
1247(17)30673-3

La condensation des chromosomes est assurée par la condensine, un complexe de 5 protéines qui
forment un anneau et plusieurs de ces complexes peuvent s’assembler pour former un super-
anneau. La condensine est la cible de la CyclineB-CDK1 qui l’active par phosphorylation. Pendant
l’interphase, une phosphorylation par la caséine kinase II assure que la condensine ne sera pas active et que
les chromosomes de ne condenseront pas inopinément.

L’assemblage et la fonction du fuseau mitotique nécessitent que les microtubules subissent des
périodes alternées de croissance et de rétrécissement, ainsi que l’action de moteurs moléculaires,
qui peuvent réticuler et séparer les microtubules du fuseau. Un bon équilibre entre la dynamique
des microtubules et le glissement des microtubules est essentiel dans tous les processus mitotiques
pour obtenir une séparation fidèle des chromosomes (Cheerambathur et al., 2013; Yukawa et al., 2019).
318
Des dysfonctionnements à ce niveau peuvent mener à une mauvaise répartition des chromosomes dans les
cellules filles et donc à des aneuploïdies (nombre anormal de chromosomes dans une cellule). C'est un
phénomène qui est courant dans de nombreux types de cancer (Tanaka et al., 2009).

Par ailleurs, les cellules doivent adopter la bonne forme (généralement arrondie pour les cellules animales)
pour entrer en mitose car les microtubules astraux doivent être correctement ancrés à la périphérie de la
cellule et notamment à son réseau cortical d'actine. Cela passe par une augmentation de la pression
osmotique intracellulaire et par une rigidification du cortex cellulaire (Stewart et al., 2011).

Les microtubules s’attachent aux centromères des chromosomes par l’intermédiaire d’un complexe
appelé kinétochore. Deux kinétochores sont présents à chaque centromère et chacun d’entre eux peut
interagir avec une vingtaine de microtubules.
*Figure 5-157. Cellule humaine en métaphase.
Immunofluorescence avec la tubuline visualisée en vert
et une protéine du kinétochore en rouge. L'ADN des
chromosomes est visualisé en bleu grâce au DAPI. On
voit le fuseau de microtubules dont certains s'accrochent
au kinétochore. D'autres microtubules sont orientés vers
la périphérie et sont des microtubules astraux qui jouent
un rôle dans l'orientation de la division cellulaire. Au
centre du "rayonnement" des microtubules à chaque
côté, on trouve un centrosome (avec 2 centrioles).
Source : https://en.wikipedia.org/wiki/File%3AKinetochore.jpg

*Figure 5-158. Les fuseaux mitotiques en métaphase et anaphase. Le fuseau est composé de trois grandes classes de
microtubules (interpolaires, kinétochoriaux et astraux), chacune avec des fonctions particulières qui contribuent aux
forces générées lors de la mitose. Les forces comprennent les forces de poussée et de traction résultant
respectivement de la polymérisation et de la dépolymérisation des microtubules et qui sont largement responsables
du mouvement des chromosomes (1 et 2), et les forces de résistance, ou tension, générées entre les paires de
kinétochores et centromères-sœurs, qui sont couplés par des complexes protéiques de condensine et de cohésine
associées au centromère (3). Les MAP (protéines associées aux microtubules) réticulent les microtubules
interpolaires antiparallèles pour créer une zone médiane stable qui permet à la kinésine de générer des forces de
glissement qui écartent les pôles du fuseau (4). Alors que les quatre types de forces sont actifs dans les fuseaux
319
 métaphasiques, la tension et la cohésion entre les chromatides-sœurs se terminent à la transition métaphase-
anaphase tandis que le mouvement chromosomique à l'anaphase est dominé par les forces de traction générées par
les microtubules. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2023.1096333/full

Des dysfonctionnements à ce niveau peuvent mener à une mauvaise répartition des chromosomes dans les
cellules filles et donc à des aneuploïdies (nombre anormal de chromosomes dans une cellule). C'est un
phénomène qui est courant dans de nombreux types de cancer (Tanaka et al., 2009).

Par ailleurs, les cellules doivent adopter la bonne forme (généralement arrondie pour les cellules animales)
pour entrer en mitose car les microtubules astraux doivent être correctement ancrés à la périphérie de la
cellule et notamment à son réseau cortical d'actine. Cela passe par une augmentation de la pression
osmotique intracellulaire et par une rigidification du cortex cellulaire (Stewart et al., 2011).

**Figure 5-159. La rigidité et l’arrondissement des cellules mitotiques sont des facteurs essentiels pour un bon
ancrage des microtubules astraux. A) Lors de leur entrée en mitose, les cellules se détachent de leur support et
s’arrondissent. Cela requiert la rigidification du cortex d’actomyosine et son association à la membrane plasmique.
Les protéines iASPP et myosine 1c (Myo1c) contribuent à la rigidification des cellules mitotiques. Les propriétés de
Myo1c lui permettent de lier la membrane plasmique au cortex sous-jacent. La protéine iASPP est capable de
s’associer à Myo1c. B) En l’absence de iASPP ou de Myo1c, la cellule perd en rigidité, comme l’atteste l’analyse par
microscopie à force atomique (mesure, à l’aide d’un rayon laser, de la déviation d’un micro-levier terminé par une
pointe nanométrique qui vient indenter la région corticale). Les microtubules astraux perdent leur ancrage cortical
à l’un des deux pôles de la cellule mitotique, plus lâche et plus allongée, ce qui crée une dissymétrie des forces
exercées par l’intermédiaire de ces microtubules astraux. Les défauts d’organisation du fuseau mitotique peuvent
entraîner diverses anomalies de répartition des chromosomes, un phénomène qu’aggraveront les contraintes
externes de l’environnement tissulaire. Source :
https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2022/06/msc220034/msc220034.html

Les microtubules s'attachent aux centromères des chromosomes par l'intermédiaire d'un complexe
appelé kinétochore. Deux kinétochores sont présents à chaque centromère et chacun d'entre eux peut
interagir avec une vingtaine de microtubules.

320
 ***Figure 5-160. Structure des kinétochores dans des
cellules de vertébrés. (A) Schéma montrant
l'attachement des chromosomes aux microtubules du
fuseau par l'intermédiaire des kinétochores ; (B) Les
premiers travaux sur le kinétochore ont identifié des
plaques interne et externe, séparées par une couche
translucide. Les microtubules sont attachés sur la plaque
externe du kinétochore. Les pointes de flèches indiquent
la plaque interne (IP), la plaque externe (OP), la couche
translucide (TL) et les microtubules du kinétochore
(MT). (C) La couronne (Co) est une structure fibreuse qui
est plus clairement visible sur les kinétochores avant la
fixation des microtubules. Un kinétochore fait 250 nm de
long et 80 nm de large ; (D,E) Avant la fixation des
microtubules (D), les kinétochores des vertébrés
adoptent une forme de croissant, ce qui n'est plus le cas
après la fixation des microtubules (E); (G) Une cellule
PtK2 (cellule de rein de rat-kangourou) en
prométaphase vue en microscopie électronique. Les
pointes de flèches indiquent des fibrilles fines reliant
l'extrémité des microtubules au kinétochore. Source :
https://www.mdpi.com/2079-7737/6/1/5/htm

Les kinétochores sont des mécanosenseurs qui permettent de contrôler la stabilité de l’attachement
des microtubules et la répartition des microtubules s’attachant à un même chromosome pour que
lors de l’anaphase, les chromatides sœurs soient tirées vers des extrémités séparées de la cellule et
non vers le même côté. Ils sont le point nodal du point de contrôle métaphasique ou point de contrôle de
l’assemblage du fuseau.
**Figure 5-161. Structure d’un kinétochore. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2015.00225/full

La partie interne du kinétochore, en contact avec la chromatine, s’appelle le CCAN (pour Constitutive
Centromere Associated Network) et est constituée d’un complexe de multiples protéines CENP. Parmi elles,
CENP-A interagit directement avec la chromatine, notamment les histones H3 et H4. CENP-U est
responsable du recrutement de PLK1 (pour Polo-Like Kinase-1), une sérine/thréonine kinase qui a de
nombreux rôles lors de la mitose (et que nous avons déjà vu agir lors de la transition G2/M). Ici, elle
phosphoryle et active APC/C qui est le principal acteur du point de contrôle métaphasique. Signalons que
les kinétochores d’organismes modèles bien étudiés tels que C. elegans et la drosophile sont dépourvus de
tout le répertoire de CENP, à l’exception de CENP-C, ce qui laisse à penser que des protéines alternatives
doivent jouer un rôle similaire chez eux (et peut-être chez l’ensemble des Ecdysozaires) (Musacchio et
Desai, 2017). Également, les végétaux doivent avoir des complexes centromériques et des kinétochores
assez différents puisque les gènes orthologues de ceux exposés ici ne sont pas présents dans leur génome
(Yamada et Goshima, 2017).

La partie externe du kinétochore est celle sur laquelle les microtubules s’attachent. Elle est formée de 3
complexes : Knl1, Mis12 et Ndc80. C’est ce dernier complexe qui interagit tout particulièrement avec les
microtubules. La sérine/thréonine kinase Aurora B, un régulateur majeur de la fixation du kinétochore aux
microtubules phosphoryle jusqu’à neuf sites dans la queue N-terminale de la protéine Ndc80. Ces
321
phosphorylations neutralisent la charge positive intrinsèque du domaine N-terminal de Ndc80, diminuant
considérablement l’affinité de liaison du complexe Ndc80 pour les microtubules. Aurora B peut ainsi
éliminer tout mauvais attachement des microtubules au kinétochore. Les microtubules détachés
grandissent à nouveau et ont une chance de mieux s’attacher. Aurora B phosphoryle aussi des composants
du complexe interne des kinétochores comme CENP-C, ce qui rend le complexe plus solide (Kren et
Musacchio, 2015).
*Figure 5-162. Le point de contrôle de
l'assemblage du fuseau (dite SAC). La voie SAC
prend naissance au niveau des kinétochores et
converge en plusieurs étapes vers l'assemblage du
complexe du point de contrôle mitotique ou
métaphasique, qui agit comme l'effecteur de la
voie. Ce complexe cible le complexe APC/C pré-lié
à une seconde molécule de Cdc20 (qui peut agir à
la fois comme co-activateur d'APC/C et comme
sous-unité du complexe du point de contrôle).
APC/Cdc20 provoque la poly-ubiquitylation (Ub)
de la Cycline B et de la sécurine, favorisant la sortie
de la mitose et la séparation des chromatides
sœurs. Le complexe du point de contrôle
métaphasique inhibe cette activité de l'APC/Cdc20
jusqu'à ce que tous les chromosomes soient
correctement attachés des deux côtés. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2015.00225/full

Lorsque tous les chromosomes sont correctement attachés, APC/C provoque la dégradation de la
Cycline B comme nous l’avons vu ce qui permet de passer à la terminaison de la mitose via
l’anaphase et la télophase.

*Figure 5-163. Dégradation de la cycline B et blocage de la fonction kinase de CDK1 dans la dernière partie de la
mitose. La première étape de la dégradation de la cycline B est sa polyubiquitination par APC/C ubiquitine ligase,
alors que la cycline B est encore associée à CDK1. Ainsi, la polyubiquitination médiée par APC/C cible le protéasome
non seulement la cycline B mais l'ensemble du complexe, qui est toujours actif lorsque la cycline B est à l'état
polyubiquitiné. Le protéasome induit ou catalyse la dissociation de la cycline B de son partenaire CDK1 avant de
dégrader la cycline B. CDK1 devient alors inactif (passage de la couleur verte à la couleur rouge). De plus, la thréonine
161 de CDK1 est déphosphorylée par PP2C ce qui est un verrou supplémentaire pour assurer son inactivité. Source
: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3132491/

Il provoque également la dégradation de la sécurine, qui jusque-là empêchait la séparase de cliver

les molécules de cohésine. La cohésine étant maintenant dégradée, les chromatides peuvent se
séparer. Une autre protéine qui jusque-là protégeait la cohésine de la dégradation, Shugoshine est
également envoyée à la dégradation par l’action de APC/C (Rattani et al., 2015).

322
 ***Figure 5-164. La déplétion de Shogoshine 1 (Sgo1)
provoque une séparation précoce des chromatides
sœurs et un arrêt mitotique. Des cellules HeLa
synchronisées ont été transfectées avec le siARN Sgo1 ou un
siARN contrôle, récoltées à intervalles de 2 heures après la
libération et examinées par étalement des chromosomes et
coloration au Giemsa. 100 cellules ont été notées pour l’indice
mitotique, et 100 cellules mitotiques ont été classées en sept
catégories en fonction de la configuration des chromosomes,
comme illustré en (B) pour chaque point de temps. (A) La
fréquence de chaque catégorie de cellule mitotique est donnée
en pourcentage du nombre total de cellules, de sorte que la
somme de chaque colonne représente l’indice mitotique. (B)
Images représentatives de sept catégories de cellules
mitotiques. Étalement des chromosomes : (a) prophase ; (b)
métaphase ; (c) anaphase ; et (d) télophase. (e) Phase précoce
de la disjonction précoce des chromatides-sœurs. À ce stade, les
chromatides-sœurs commencent à se séparer. Les pointes de
flèches indiquent les chromosomes dont la cohésion
centromérique semble être perdue. (f) Phases ultérieures de la
séparation des chromatides-sœurs. A ce stade, les paires de
chromatides-sœurs ne sont plus discernables, les restes de la
plaque métaphasique sont encore visibles et les chromatides-
sœurs ne se sont pas encore hypercondensées. (g) Chromatides
simples dispersées. Les chromatides-sœurs sont complètement
séparées et distribuées au hasard les unes par rapport aux
autres, les chromatides individuelles sont hypercondensées, ce
qui donne un aspect “frisé”. Notez que la séparation des
chromatides dans les anaphases normales (c) est différente de
la séparation précoce des chromatides-sœurs (e-g), en ce sens
que des chromatides disjointes et appariées coexistent dans la
même cellule.
(C) Une partie des cellules récoltées pour l’analyse des figures A
et B ont été fixées à l’éthanol et leur contenu en ADN a été
analysé par cytométrie de flux (après coloration fluorescente à
l’iodure de propidium). On voit que la mitose est bloquée car le
nombre de cellules 2C devient stable au cours du temps quand
Sgo1 est déplété par le siARN. Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.0030086

Au cours de l’anaphase, le fuseau s’allonge pour écarter les pôles du fuseau et séparer les deux ensembles
de chromosomes (Mallavarapu et al., 1999; Roostalu et al., 2010 ; Vukušić et al., 2017). L’allongement du
fuseau est réalisé par la génération de forces de glissement des microtubules au niveau de la zone médiane
du fuseau (Kiyomitsu et Cheeseman, 2013; Redemann et al., 2017). La zone médiane est le chevauchement
des microtubules au centre du fuseau, formé de microtubules orientés de manière antiparallèle
(microtubules interpolaires), qui proviennent des deux pôles opposés du fuseau.

Le glissement des microtubules est favorisé par les membres de la famille de la kinésine-5 dans la plupart
des organismes (Avunie-Masala et al., 2011; Brust-Mascher et al., 2009). La kinésine tétramère réticule les
microtubules antiparallèles et les sépare. En marchant vers les extrémités positives de chacun des deux
microtubules antiparallèles la kinésine-5 peut déplacer les microtubules les uns par rapport aux autres
(Kapitein et al., 2005). La kinésine-5 est surexprimée dans certaines tumeurs (gliomes, neuroblastomes et
tumeurs du poumon et du sein) (Rath et Kozielski, 2012).

**Figure 5-165. Structure de la kinésine-5. Elle est formée d'un tétramère avec 2 groupes de 2 molécules avec des
orientations opposées. Les têtes motrices aux 2 extrémités se déplacent chacune sur un microtubule antiparallèle à
celui de l'autre côté au niveau du chevauchement des microtubules du fuseau au milieu de la cellule en anaphase.
Source : https://elifesciences.org/articles/51131

323
Parallèlement au glissement des microtubules, les microtubules interpolaires doivent croître à une vitesse
qui permet au fuseau de s’allonger tout en maintenant la zone médiane du fuseau. La croissance des
microtubules doit se produire avec au moins la vitesse à laquelle les microtubules du fuseau glissent pour
maintenir le chevauchement des microtubules, nécessaire à la stabilité du fuseau. La dynamique des
microtubules pendant l’anaphase est régulée par CLASP, qui favorise la polymérisation des microtubules
(Bratman et Chang, 2007; Maton et al., 2015). Pendant ce temps, l’actine forme un anneau contractile dans
la région de séparation des deux cellules (voir ci-dessous et Figure 5-11).

*Figure 5-166. Rôle du cytosquelette dans la télophase et la cytodiérèse. (A) Pendant la cytodiérèse (ou cytokinèse),
le cortex cellulaire se contracte au niveau de la zone médiane, formant le sillon de clivage ou de division. De
nombreux acteurs de ce processus peuvent être classés dans deux ensembles principaux de structures : le réseau
contractile (CN) et le fuseau mitotique, représentés par les deux grandes pièces du puzzle. (B) Le CN est constitué de
filaments d’actine, de myosine II et de réticulateurs d’actine, qui sont organisés en mailles ou en anneaux et qui
génèrent des forces mécaniques au niveau du sillon de division. Un régulateur majeur de ce CN chez les métazoaires
est la petite GTPase RhoA (Chircop, 2014). (C) Le fuseau mitotique est composé de microtubules antiparallèles et
interdigités qui forment soit les microtubules astraux, soit le fuseau central. Avec ses protéines de liaison et ses
moteurs, le fuseau mitotique sépare les chromosomes, positionne le sillon de clivage et aide à réguler la séparation
des cellules filles. Voir aussi la Figure 5-11. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.00441/full

La cytodiérèse correspond au pincement qui se forme entre les 2 cellules-filles et qui aboutit à leur
séparation. Il est contrôlé par un anneau contractile d’actine/myosine.

*Figure 5-167. Cytodiérèse observée dans un embryon de souris entre 16 et 32 cellules. Il s'agit d'un embryon
transgénique qui exprime les protéines fusion H2B-RFP qui marque la chromatine des chromosomes (violet) et
GAP43-GFP qui marque la membrane plasmique (vert). Les pointillés rouge surlignent la zone de pincement entre
les deux cellules-filles. Une reconstitution 3D est réalisée à partir d'images prises au microscope confocal.
Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2119381119

324
C'est l'activité équatoriale de la petite GTPAse RhoA qui contrôle la mise en place des faisceaux de filaments
d'actine formant l'anneau contractile (Nishimura et al., 2006). Le recrutement et l'activation de la myosine
II se fait par ROCK qui est activé par RhoA (Matsumura, 2005).

*Figure 5-168. Localisation de RhoA et de l'ADN au cours de la cytokinèse dans les cellules HeLa. En interphase, la
petite GTPase RhoA (panneaux supérieurs) se distribue de manière diffuse dans le cytoplasme. Après le début de la
mitose, RhoA commence à s'accumuler dans le cortex cellulaire (métaphase). L'accumulation de RhoA au niveau du
cortex équatorial est détectée juste avant la formation du sillon de clivage (tête de flèche) et après quoi il forme une
structure annulaire à ce niveau (anaphase à télophase). Enfin, RhoA se localise au milieu du corps (télophase tardif).
Les panneaux inférieurs montrent l'ADN coloré par DAPI. Barre d'échelle : 10 μm. Source :
https://journals.biologists.com/jcs/article/119/1/104/28780/Centralspindlin-regulates-ECT2-and-RhoA

Une fois les cellules séparées, l’activité APC/C reste importante de telle manière à ce qu’aucune cycline
mitotique ne puisse s’accumuler. Ce n’est que lors du passage G1 vers S du cycle suivant que l’activité
d’APC/C redevient nulle.

BILAN DU CONTRÔLE DU CYCLE CELLULAIRE

**Figure 5-169. Bilan du contrôle du cycle cellulaire. Le cycle cellulaire est régulé par de nombreuses CDK qui
forment des complexes avec leurs partenaires cyclines associés. Le cycle cellulaire contient plusieurs points de
contrôle (rouges) pour prévenir l'instabilité génomique, ainsi que pour assurer une réplication fidèle. Les cellules
sortent du cycle cellulaire et entrent dans l'état de repos réversible ou permanent (phase G0) régulé par la cycline
C/CDK3. Différents signaux extracellulaires, tels que le signal mitogène, conduisent à la synthèse de cycline D et
stimulent CDK4/6, ce qui favorise l'entrée dans le cycle cellulaire. Les complexes CDK4/6 actifs initient la
325
 phosphorylation (P) de la protéine Rb, libérant ainsi les facteurs de transcription E2F, entraînant l'expression de la
cycline E, de la cycline A, de la cycline B et de nombreux gènes nécessaires à la progression de la phase S. La cycline
E active ensuite CDK2 et contribue à la poursuite de la phosphorylation de Rb, progresse en phase S et initie la
synthèse d'ADN. Vers la fin de la phase S, la cycline A élimine la cycline E et forme un nouveau complexe, la cycline
A/CDK2. La cycline A/CDK2 termine la phase S en phosphorylant CDC6 et E2F1 ; il entraîne la transition du cycle
cellulaire de la phase S à la phase G2, puis active CDK1 par la cycline A, conduisant les cellules à entrer dans la phase
M. Lors de la mitose, l'activité CDK1 est maintenue par le complexe cycline B/CDK1. La dérégulation de CDK1 permet
la séparation des chromosomes et l'achèvement de la mitose et de la cytokinèse. Les inhibiteurs INK4, CIP/KIP et
CDK4/6 (ainsi que les molécules utilisées en chimiothérapie anti-tumoral palbociclib, ribociclib et abemaciclib)
inhibent l'activité de CDK/cycline. L'ubiquitination (Ub) des cyclines est impliquée dans la régulation de l'expression
de nombreuses protéines pour contrôler les activités cycliques des CDK, telles que SCF et APC/C. Les protéines PLK1
et Aurora A sont impliquées dans la progression de la phase S et de la phase G2 à la phase M. De plus, les points de
contrôle des dommages à l'ADN préservent l'intégrité génomique et déclenchent l'arrêt du cycle cellulaire via le point
de contrôle kinase 2 (CHK2) et p53 en phase G1 ou via CHK1 en phase S ou G2. P dans un cercle en pointillé indique
une déphosphorylation. Les ovales verts indiquent des régulateurs positifs et les ovales bleus indiquent des
régulateurs négatifs de la progression du cycle cellulaire. Source : https://www.mdpi.com/1422-
0067/21/6/1960/htm

Les particularités des divisions des cellules végétales

*Figure 5-170. Stades de mitose sur une coupe
histologique d'apex de racine d'oignon. La flèche noire
indique une prophase, la flèche verte une métaphase, la
flèche bleu une anaphase et la flèche rouge une
télophase/cytokinèse où on distingue un
phragmoplaste entre les chromosomes.

Les végétaux n'ont pas de centrosomes, le centre de nucléation et d'organisation des microtubules
que l'on trouve dans les cellules animales. Les fuseaux mitotiques s'organisent quand même, mais
de manière différente. Le fuseau métaphasique est généralement en forme de tonneau sans un seul
point de focalisation à chaque pôle. Dans les derniers stades de la mitose, une cellule végétale
assemble un phragmoplaste qui est un réseau de microtubules important pour le dépôt de matériau
à la plaque cellulaire où se formera la paroi entre les deux cellules-filles.

326
 *Figure 5-171. Comparaison des phases de la mitose entre une cellule animale et une cellule végétale. (A) Des cellules
humaines de carcinome de colon HCT116 sont colorées avec un anticorps anti-α-tubuline (vert) et DAPI (violet); (B)
Les fuseaux microtubulaires sont mis en évidence dans la mousse Physcomitrella patens par la GFP-tubuline (vert)
et il existe aussi un marquage histone H2B-RFP (violet). Les deux principales différences entre les fuseaux mitotiques
animaux et végétaux sont la présence de centrosomes et de microtubules astraux bien développés chez les animaux,
et la morphologie du fuseau d'anaphase (le « phragmoplaste » chez les plantes). Barre d'échelle = 5 µm. Source :
https://www.mdpi.com/2079-7737/6/1/6/htm

Le phragmoplaste se forme au centre de la cellule-mère qui a presque achevé de se diviser. Il se développe

ensuite latéralement vers les bords de la cellule. Au cours de sa croissance, de nouveaux microtubules sont
recrutés dans la périphérie et démantelés au centre. Des microfilaments d'actine sont également présents
et avec les microtubules, ils coordonnent l'intense activité sécrétrice qui permet le dépôt de la nouvelle
paroi cellulaire.

Des différences sont présentes aussi avant même la mitose avec la formation de la bande
préprophasique en phase G2 tardive. Il s’agit d’un anneau de microtubules qui est positionné au
niveau de la future plaque métaphasique et au niveau du futur phragmoplaste. Le BPP permet de
recruter un ensemble de MAP (Microtubule-Associated Proteins) qui est conservé tout au long de la division
et marque le site exact d'insertion de la plaque cellulaire par le phragmoplaste lors de la cytokinèse.
*Figure 5-172. La bande de préprophase prédit le plan de
division cellulaire : 1) Formation de la bande de
préprophase. 2) Le fuseau métaphasique s'oriente avec
l'équateur le long du plan marqué par la bande
préprophase. 3) Le phragmoplaste et la plaque cellulaire
se forment le long du plan marqué par la bande de
préprophase. 4) La nouvelle paroi cellulaire des cellules
filles se connecte à la paroi cellulaire mère le long de la
ligne de l'emplacement de la bande préprophase. D'après :
https://en.wikipedia.org/wiki/Preprophase_band#/media/File:Preprophaseband.png

Les particularités de la méiose

327
 *Figure 5-173. Comportement des chromosomes pendant la prophase I et la métaphase I. Barre d’échelle = 5 µm.
Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)01414-5

La méiose consiste en deux divisions cellulaires successives suivant un seul cycle de réplication de
l’ADN, ce qui permet de générer des gamètes haploïdes à partir de cellules parentales diploïdes au
cours de la reproduction sexuée.

> Voir le schéma général :

https://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9iose#/media/Fichier:Le_d%C3%A9roulement_de_la_m
%C3%A9iose.svg

(attention, sur le schéma, on part d'une cellule germinale et non d'une cellule souche)

> Vidéo de comparaison entre la méiose et la mitose : https://youtu.be/2btojTTvZVU

L'une des grandes particularités de la méiose sont les crossing-overs en prophase I. Ces
recombinaisons entre chromosomes homologues sont l'une des clés de la création de la diversité
génétique par la reproduction sexuée. En recombinant au hasard les allèles d'origine paternel et
maternel, les crossing-overs assurent que chaque gamète aura une combinaison inédite et unique
d'allèles à transmettre à la descendance. Les crossing-overs ont aussi constitué un modèle d'étude
qui a été important dans l'histoire de la génétique pour savoir si des gènes se trouvent sur un même
chromosome et si oui, pour établir la distance génétique entre ces deux gènes. C'est un apport
essentiel de la génétique de la drosophile développé par Thomas H. Morgan au début du XX ème siècle
: pour en savoir plus, voir ce site.
*Figure 5-174. Crossing-over. Il s'agit d'une vision
simplifiée car plusieurs crossing-overs peuvent avoir
lieu simultanément entre deux chromosomes
homologues. D'après
https://opened.cuny.edu/courseware/lesson/659/overview

Un crossing-over commence par l'action de la protéine SPO11 (ou de ses homologues) et de ses protéines
associées dans un complexe qui catalyse la formation de cassures double brin programmées. Ensuite, les
extrémités de cette cassure sont réséquées et traitées par plusieurs nucléases et hélicases pour générer des
surplombs étendus d'ADN simple brin (ADNsb) 3' (Symington, 2016). Ces ADNsb exposés sont
successivement recouverts par la protéine de réplication A (RPA) et s'associent à deux recombinases
conservées RAD51 et DMC1 pour former des nucléofilaments, qui sont responsables de la recherche
d'homologie et de la formation de la double jonction Holliday (dHJ).

328
 **Figure 5-175. Méiose et recombinaison homologue. (A) Formation de gamètes haploïdes à partir d'une cellule
diploïde avec une seule paire de chromosomes homologues pour simplifier. La formation de cassures double brins
favorisent l'appariement de chromosomes homologues et conduisent à l'échange de fragments chromosomiques
(crossing-overs) dans le contexte de chiasma. (B) La recombinaison méiotique est initiée par la formation de
cassures double brins médiée par Spo11 et conduit à la formation de croisements via une résolution à double
jonction Holliday (dHJ) dépendante de ZMM ou des non-crossingovers par complétion de brins dépendant de la
synthèse. (C) Relations entre la recombinaison méiotique et la structure chromosomique d'ordre supérieur. La
formation de cassures double brins (DSB) se produit dans des boucles. Au fur et à mesure que la recombinaison
progresse, le complexe synaptonémal (SC) polymérise entre les axes et est désassemblé avant la séparation des
chromosomes. Les protéines de l'axe Red1 (ovales rouges) et Hop1 (ovales jaunes) sont montrées. (D) Lors de la
métaphase I, les chromosomes homologues sont maintenus ensemble par les chiasmas et la cohésine. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.642737/full

Finalement, les dHJ sont résolus. Une partie des enzymes impliquées ont aussi des fonctions de réparation
de l’ADN ce qui n’est pas étonnant puisque le processus moléculaire des crossing-overs a commencé par
une cassure double brin. Mais certaines des enzymes sont originales à la méiose. La bonne réalisation des
crossing-overs nécessite un coalignement spatial de chromosomes homologues. Une structure
macromoléculaire protéique tripartite, également appelée complexe synaptonémal (SC), s’assemble entre
les chromosomes homologues coalignés et stabilise la structure de ces derniers (Gao et Colaiácovo, 2018).

Les crossing-overs sont scrutés par des points de contrôle de la méiose. La progression dans le cycle
cellulaire peut être retardée ou une apoptose peut être déclenchée si les recombinaisons ne se déroulent
pas normalement (Subramanian et al., 2014).

L’autre grande originalité par rapport à la mitose est la non-séparation des chromatides d’un même
chromosome lors de l’anaphase de la 1ère division méiotique. Les chromosomes homologues se
séparent mais pas les chromatides de chaque chromosome. Cela tient au comportement particulier des
anneaux de cohésine qui ont des sous-unités différentes par rapport aux anneaux présents à la mitose
(Haering et al., 2008; Brar et al., 2009).

Lors de la seconde division méiotique, ces anneaux sont clivés et la séparation des chromatides peut se faire
(Schökel et al., 2011).

329
 ***Figure 5-176. Comparaison des anneaux de cohésine
mitotique et méiotique. Les protéines du cycle de cohésine
spécifiques de la méiose sont SMC1β, RAD21L, REC8 et STAG3.
Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.710033/full

Il est courant que la méiose subisse des arrêts chez les futurs gamètes femelles : par exemple chez les
Vertébrés, la méiose s'arrête en prophase I lors du développement embryonnaire puis reprend à l'ovulation
et s'arrête ensuite en métaphase II. Le dernier déblocage a lieu lors de l'activation de l'ovocyte à la
fécondation. Lors du deuxième arrêt, en métaphase II, le facteur CSF ou facteur cytostatique maintient la
présence de cycline B-CDK1 par inhibition d'APC/C. CSF est en fait composé des membres d'une voie de
signalisation, la voie Mos/MAPK. Lors de la fécondation, l'entrée des ions Ca 2+ dans le cytoplasme inactive
les composants de cette voie (par l'intermédiaire de CamKII et de la calcineurine), provoquant la
dégradation de la cycline B et le basculement dans la dernière partie de la deuxième division méiotique.

La polyploïdisation
La polyploïdisation ou augmentation du nombre de chromosomes dans une cellule se produit dans de
nombreuses cellules végétales et animales dans le cadre d'un programme de développement, où il est
crucial d'augmenter la taille des cellules et la production métabolique. Elle est assez fréquente chez les
végétaux et plus rares chez les animaux. Par exemple, la polyploïdisation des neurones géants des limaces
Limax leur permet d'atteindre la taille énorme dont ils ont besoin pour transmettre des signaux sur de
grandes distances (Yamagishi et al., 2012), et la polyploïdisation des cellules gliales sous-périneurales de la
drosophile assure l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique pendant la croissance des organes
(Unhavaithaya et al., 2011). Chez les vertébrés, les cellules polyploïdes sont présentes dans de nombreux
organes, tels que le foie, le sang, la peau, le pancréas, le placenta et les glandes mammaires, où elles jouent
des fonctions importantes dans l'homéostasie tissulaire, la régénération et en réponse aux dommages. Les
cellules polyploïdes peuvent soit être mononucléées, comme les mégacaryocytes (Mattia et al., 2002) et les
cellules géantes du trophoblaste, soit multinucléées, comme les cellules épithéliales mammaires.

La polyploïdie peut survenir soit par fusion cellulaire, soit par des cycles cellulaires non canoniques dans
lesquels les cellules répliquent leur ADN mais ne se divisent pas. Deux types de cycles cellulaires inhabituels
conduisent à la polyploïdie : l'endoréplication et l'endomitose. Dans l'endoréplication, la phase M est
ignorée, ce qui entraîne des cycles de réplication de l'ADN (phase S) et des phases G sans mitose ni
cytokinèse intermédiaires. Les cycles cellulaires endoréplicatifs donnent de grandes cellules mononucléées.
Dans l'endomitose, les cellules entrent en mitose, mais ne subissent pas de division cellulaire, ce qui donne
des cellules polyploïdes avec un seul noyau ou 2 noyaux, selon que la phase M est interrompue avant ou
après le début de la ségrégation des chromosomes sœurs (qui se produit normalement pendant l'anaphase).

330
 **Figure 5-177. Variantes du cycle cellulaire produisant des cellules polyploïdes. (A) Le cycle cellulaire classique
responsable de la prolifération cellulaire contient une phase G1 au cours de laquelle une croissance cellulaire
suffisante doit se produire avant le début de la réplication de l'ADN en phase S. Une phase G2 précède la mitose. (B)
L'endoréplication implique des oscillations entre une phase G et une phase S et peut produire des cellules polyploïdes
ou éventuellement polytènes, qui se distinguent par le fait que les chromatides répliquées restent en association
physique. (C) L'endomitose se distingue par l'entrée en mitose mais par l'élimination de certaines étapes de la
mitose. Cela peut impliquer une absence de la rupture de l'enveloppe nucléaire mais aussi de l'assemblage d'un
fuseau dans le noyau et de la ségrégation des chromatides sœurs, ou juste une absence de cytokinèse. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537166/

***Figure 5-178. Tétraploïdisation dans les

trophoblastes extra-villeux
(A) Au début de la grossesse, les précurseurs des
cellules du trophoblaste extra-villeux expriment le
récepteur EGFR et forment une colonne cellulaire dite
hautement proliférative, qui donne lieu à des
précurseurs exprimant HLA-G à l'extrémité distale de
la colonne cellulaire. Au cours de cette transition, un
cycle cellulaire endoréplicatif provoque la
tétraploïdisation. L'endoréplication dans les
trophoblastes HLA-G+ est caractérisée par un patron
d'expression Cycline A+/p57-. Lors de l'invasion dans
l'endomètre utérin, les trophoblastes extra-villeux
perdent leur activité cyclique avec un phénotype
cycline A-/p57+ dominant et subissent une sénescence
cellulaire. L'induction de la sénescence cellulaire est au
moins en partie régulée par p57 et la cycline E. (B)
L'équilibre entre l'endoréplication et la sénescence est
perturbé dans le cas de môle hydatiforme, une
anomalie rare de la grossesse où les cellules
trophoblastiques présentent une activité
endoréplicative exacerbée caractérisée par une
augmentation de la cycline A+/p57, une
polyploïdisation accrue et une sénescence cellulaire
réduite. Source :
https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1007698

Les divisions asymétriques

A l’issue de la mitose, les 2 cellules-fille ont certes reçu le même patrimoine génétique mais le
contenu cytoplasmique reparti entre elles n’est pas forcément homogène.

Voir cette vidéo de présentation des divisions asymétriques : https://youtu.be/K4z1Sc1l8Xc

Les cellules filles de telles divisions peuvent différer non seulement par leur héritage des
déterminants, mais aussi par leur taille relative. De telles divisions asymétriques sont répandues au
cours du développement. Elles peuvent notamment concerner les cellules souches : les divisions
asymétriques assurent leur maintien (voir Figure 2-29).

> Divisions asymétriques lors de l’embryogenèse précoce de C. elegans

L’embryogenèse précoce chez le nématode C. elegans présente plusieurs divisions asymétriques qui
produisent des cellules filles de différentes tailles et de différentes destinées. La première division
asymétrique est le clivage inégal du zygote en une grande cellule antérieure AB et la plus petite
cellule postérieure P1, correspondant respectivement à environ 60 % et 40 % de la taille totale de
l’embryon.

La symétrie du zygote est brisée par le centrosome apporté par le spermatozoïde (Goldstein et Hird,
1996; Sadler et Shakes, 2000). Si ce centrosome est détruit par un rayon laser UV, la première division
n’est pas asymétrique comme normalement.

331
En parallèle de la réorganisation du réseau de microtubules autour du centrosome paternel, le réseau
cortical d’actine-myosine contractile se déplace vers le futur embryon antérieur (Munro et al., 2004),
accompagné de l’établissement de domaines corticaux mutuellement exclusifs des protéines PAR,
avec aPKC-3/PAR-3/PAR-6 du côté antérieur et PAR-1/PAR-2/LGL-1 du côté postérieur (Rose et
Gönczy, 2014). L’inhibition réciproque des protéines PAR antérieures et postérieurs est un élément
essentiel de la polarisation. PAR-1 est capable de phosphoryler PAR-3 ce qui mène à sa dégradation
et la phosphorylation de PAR-2 par aPKC empêche sa bonne localisation (voir Figure 5-136).

Voir une vidéo de la première division de C. elegans avec aPKC (couleur magenta) et PAR-2 (vert).
On voit clairement la mise en place de la division asymétrique : https://youtu.be/jatsERpBvok

Le réseau de polarité PAR assure ensuite la distribution asymétrique des protéines et des ARNm par l’action
de médiateurs de polarité, dont les protéines de liaison à l’ARN MEX-5/6, qui sont présentes selon un
gradient antéro-postérieur (AP) juste avant le premier clivage (Schubert et al., 2000) (voir Figure 5-137).

*Figure 5-179. Division asymétrique orientée lors du

développement précoce de C. elegans. La première
division zygotique chez C. elegans se déroule de manière
asymétrique pour générer des cellules AB et P1 de taille
et de contenu cytoplasmique différents. Les protéines
Par dans le zygote sont localisées le long d’un axe cortical
antérieur-postérieur : les complexes Par-3/Par-6/aPKC
(rouge) localisés antérieurement et Par-1/Par-2 (bleu)
localisés postérieurement se répriment mutuellement.
L’orientation du fuseau le long de cet axe de polarité est
régulée par le complexe GPR-1/2 et LIN-5 (qui est
enrichi au niveau du cortex postérieur), assurant une
asymétrie correcte dans la distribution des protéines de
polarité dans les cellules filles. Ce complexe induit
également un déplacement physique postérieur de
l’appareil du fuseau par rapport au centre de la cellule,
générant ainsi une asymétrie de taille dans les cellules-
filles. Source : https://www.mdpi.com/2221-
3759/3/4/129/htm

Les marqueurs de polarité antéro-postérieure dirigent également le positionnement asymétrique du fuseau

mitotique, qui est situé légèrement décentré vers le côté postérieur à la fin de l’anaphase, provoquant ainsi
un premier clivage inégal (Grill et al., 2001). Ce positionnement asymétrique du fuseau repose sur un
complexe conservé au cours de l’évolution qui ancre la dynéine motrice au cortex cellulaire (Kotak et
Gönczy, 2013). Chez C. elegans, ce complexe ternaire comprend les protéines associées à la membrane GOA-
1 et GPA-16, les protéines GPR-1/2, ainsi que la protéine LIN-5, qui interagit avec la dynéine (Srinivasan et
al., 2003). La dynéine ainsi ancrée dans le cortex cellulaire exerce une force de traction sur l’extrémité + des
microtubules astraux en dépolymérisation et, par conséquent, sur les pôles attachés du fuseau. En réponse

332
aux signaux de polarité antéro-postérieure, davantage de GPR-1/2 et de LIN-5 sont présents dans le cortex
postérieur, ce qui provoque une force nette plus importante tirant sur le pôle postérieur du fuseau,
entraînant le clivage inégal du zygote en une grande cellule AB et une petite cellule P1 (Park et Rose, 2008).

**Figure 5-180. Relations entre les composants de la

polarité antéro-postérieur dans l’embryon de C. elegans.
Le contact entre le centrosome et le cortex rompt la
symétrie du zygote et entraîne le retrait de PAR-3/PAR-
6/PKC-3 de la partie postérieure d’une manière
dépendante de NMY-2. Pendant ce temps,
l’enrichissement de PAR-2 à la partie postérieure se
produit en même temps que celui de PAR-3/PAR-
6/PKC-3 à la partie antérieure. À son tour, PAR-1
empêche l’accumulation de MEX-5/6 au niveau
postérieur. La présence de MEX-5/6 à l’avant empêche
la présence de granules P et de PIE-1 de ce côté de
l’embryon, et renforce également la distribution
antérieure de PAR-3/PAR-6/PKC-3. En conséquence de
cette séquence d’interactions, les granules P et PIE-1
sont ségrégués vers le postérieur du zygote, contrôlant
la position des futures cellules germinales. Source :
http://dev.wormbook.org/chapters/www_asymcelldiv/asymcelldiv.html

Au cours des stades ultérieurs de l’embryogenèse de C. elegans, la plupart des cellules dérivées de
AB se divisent symétriquement de manière synchrone, tandis que les descendants de P1 subissent
trois divisions asymétriques supplémentaires. Globalement, cela conduit à la génération de sept des
cellules fondatrices qui produiront chacune des tissus spécifiques ; par exemple, E donnera naissance à
l’intestin et P4 à la lignée germinale. Le destin de chaque cellule fondatrice est spécifié par des composants
maternels distribués de manière asymétrique, ainsi que par des mécanismes régulés de traduction et de
dégradation des protéines (Zacharias et Murray, 2016).

La ségrégation asymétrique des déterminants est également utilisée lors des premiers clivages de
l’embryon de C. elegans pour spécifier la lignée germinale et la lignée somatiques. Le zygote subit
quatre divisions asymétriques, dont chacune donne naissance à un blastomère somatique plus grand (AB,
EMS, C et D) et à un blastomère germinal plus petit (P1, P2, P3 et P4). Au cours de ces divisions, les
granules P et les protéines nécessaires au développement de la lignée germinale sont hérités
préférentiellement par l’une des 2 cellules-filles. Les granules P sont de gros complexes
ribonucléoprotéiques que l’on trouve exclusivement dans la lignée germinale.

333
 *Figure 5-181. Répartition des granules P au cours des
premières divisions asymétriques chez C. elegans

L’observation dans le zygote de granules P marqués par fluorescence dans des embryons vivants a révélé
que la ségrégation des granules P implique à la fois un mouvement dirigé et une dégradation localisée. Avant
le premier clivage, les granules P sont dispersés dans tout le cytoplasme puis migrent vers le pôle postérieur
où se formera le blastomère germinatif P1. Les granules P qui restent dans la partie antérieure sont
dégradés (ou désassemblés). Le cytosquelette d’actine et plusieurs protéines corticales localisées de
manière asymétrique le long de l’axe antéro-postérieur sont nécessaires à la ségrégation des granules P. Un
autre facteur qui sépare la lignée germinale dans les embryons précoces est PIE-1, une protéine codée par
la mère nécessaire pour inhiber la transcription de l’ARNm et le développement somatique dans les
blastomères de la lignée germinale. Comme les granules P, la protéine PIE-1 se trouve initialement dans
tout le cytoplasme des embryons nouvellement fécondés et s’enrichit dans le cytoplasme postérieur avant
le premier clivage. En conséquence, PIE-1 est présent principalement dans P1 au stade 2 cellules. La
ségrégation asymétrique de PIE-1 est répétée dans les blastomères germinaux P1, P2 et P3.
*Figure 5-182. Expression de la protéine fusion PIE-1-
GFP chez C. elegans. On voit que la protéine est exprimée
dans les cellules germinales (en haut) et plus tôt au cours
du développement elle est spécifiquement présente dans
les cellules P1, P2 et P3. Source :
https://elifesciences.org/articles/63300

334
Dans P4, qui se divise également et sépare les granules P à ses deux descendants (Z2 et Z3), PIE-1 reste
uniforme et est également réparti entre les deux filles.

Comme de nombreux ARN maternels, l’ARN pie-1 est présent dans tous les blastomères jusqu’au stade 4
cellules. Après le stade de 4 cellules, il est perdu dans les blastomères somatiques et conservé uniquement
dans les blastomères de la lignée germinale. Il est donc peu probable que la localisation de l’ARN contribue
à la localisation de PIE-1 avant le stade 4 cellules, mais il pourrait être impliqué dans les stades ultérieurs.
La traduction localisée de l’ARNm pie-1 pourrait également concentrer PIE-1 dans la lignée germinale. La
capacité de PIE-1 à s’associer aux centrosomes pendant la mitose peut contribuer aussi à sa distribution
asymétrique. Au début de chaque mitose, PIE-1 s’accumule autour des deux centrosomes du fuseau
naissant. Au fur et à mesure que le fuseau tourne en vue du clivage, PIE-1 disparaît du centrosome destiné
à la fille somatique (« centrosome somatique ») et n’est retenu que sur le centrosome destiné à la fille
germinale (« centrosome germinal »).

> Divisions asymétriques lors de la formation du système nerveux de la drosophile

L'autre modèle abondamment étudié pour examiner la distribution asymétrique des déterminants du
destin cellulaire est le neuroblaste de la drosophile, le type cellulaire à l'origine du développement
du système nerveux central. Les neuroblastes se divisent de manière asymétrique le long de l'axe apical-
basal pour produire un grand neuroblaste apical (auto-renouvellement) et une petite cellule mère
ganglionnaire du côté basal (GMC). Bazooka (Baz, l'homologue de Par-3) interagit physiquement avec Par-
6 et la protéine kinase atypique C (aPKC), formant le complexe Par, localisé sur la membrane cellulaire
apicale du neuroblaste mitotique qui établit un repère apical pour la division asymétrique (Wodarz et al.,
2000). aPKC phosphoryle Miranda (Mira) qui forme alors un croissant localisé du côté basal (Atwood et al.,
2009). Mira fonctionne comme une protéine adaptatrice qui lie Prospero (Pros, orthologue du mammifère
Prox1), le facteur de transcription à homéodomaine qui contrôle la différenciation de la GMC qui génère
deux neurones post-mitotiques ou deux cellules gliales (Shen et al., 1997).

*Figure 5-183. Localisation de aPKC au pôle apical de neuroblastes en mitose. Des coupes d'embryons de drosophile
de stade 10 sont traitées en immunofluorescence avec des anticorps reconnaissant aPKC (rouge), Nrt (Neurotactine,
un marqueur de la membrane plasmique basolatérale, bleu) et avec un marquage de l'ADN (vert). Les neuroblastes
sont indiqués par une étoile. d-f : en prophase, g-i en métaphase. Source :
https://rupress.org/jcb/article/150/6/1361/45486/Drosophila-Atypical-Protein-Kinase-C-Associates

335
 **Figure 5-184. Division cellulaire asymétrique dans les neuroblastes de drosophile. Les neuroblastes (NBs) se
divisent de manière asymétrique pour s’auto-renouveler et pour générer une cellule fille plus différenciée. Le
complexe Par (Baz, Par6 et aPKC ; ligne bleue) se localise de manière asymétrique au niveau du cortex apical des
NBs. Le complexe Par recrute Inscuteable (Insc, ligne verte), qui recrute à son tour le complexe Pins/Mud/Gαi (ligne
orange) au cortex cellulaire apical. Grâce à Mud, ces complexes apicaux orientent le fuseau mitotique par rapport à
l’axe apical-basal établi. Par une cascade d’événements de phosphorylation, le complexe apical Par dirige les
déterminants du destin cellulaire Numb, Pros et Brat (ligne rouge) vers le cortex cellulaire basal. Lorsque le NB se
divise de manière asymétrique, ces déterminants du destin cellulaire sont séparés vers le GMC, où ils favorisent la
différenciation plutôt que l’auto-renouvellement. A, apical; B, basal. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/139/23/4297/45400/Drosophila-neuroblasts-a-model-for-stem-cell

Outre Mira, aPKC phosphoryle également Numb ce qui le dirige vers le cortex basal des neuroblastes. Numb
facilite l'endocytose du récepteur Notch, conduisant à l'inhibition de la signalisation Notch dans le GMC, ce
qui rend possible la différenciation neuronale.

La polarisation est suivie d'un alignement du fuseau mitotique le long de l'axe de polarité, conduisant à une
ségrégation asymétrique des déterminants du destin cellulaire. Lorsque l'axe de division est
perpendiculaire à l'axe de polarité, les deux cellules filles perpétuent l'état de cellules souches.

Semblable aux neuroblastes de drosophile, les progéniteurs épidermiques de souris maintiennent le contact
avec la membrane basale pour établir la polarité initiale au cours du développement (Poulson et Lechler,
2010; Williams et al., 2011). La polarisation de la distribution des orthologues de souris d’Insc, LGN, NuMA
et dynéine est nécessaire pour diriger l’axe de division. La perte de polarité dans les progéniteurs
épidermiques de la souris entraîne des défauts de stratification de la peau et une différenciation incorrecte
(Lechler et Fuchs, 2005).

Dans les neuroblastes de drosophile, tout comme d'ailleurs dans les progéniteurs épidermiques de souris,
on retrouve les orthologues des protéines PAR que l’on a rencontré lors des premières divisions chez C.
elegans. Par exemple, le domaine PAR se forme au niveau du cortex apical pendant la mitose où il empêche
l’accumulation de déterminants du destin neuronal, les restreignant au cortex basal. Les domaines corticaux
résultants sont coupés en deux par le sillon de clivage conduisant à la ségrégation des déterminants dans la
cellule fille basale où ils favorisent la différenciation au détriment de l’auto-renouvellement (Homem et
Knoblich, 2012).

Lors des divisions asymétriques, des organelles et des vésicules peuvent se répartir de manière inégale
entre les cellules filles. Par exemple, dans les cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire du
cerveau de la souris adulte, les gouttelettes lipidiques peuvent se répartir de manière inégale et la cellule
souche neurale fille qui en hérite le plus prolifère plus vite (Ramosaj et al., 2021).

336
 **Figure 5-185. Répartition inégale des
gouttelettes lipidiques lors de la division de
cellules souches neurales et effet sur la
prolifération. d) Analyse des divisions cellulaires
pour étudier la répartition des gouttelettes
lipidiques (LD) après une division dans les cellules
souches neurales (NSPC) de la zone sous-
ventriculaire (SVZ) de souris adultes.
Immunofluorescence avec des anticorps anti-PLIN2
qui est une protéine spécifique des LD (blanc), anti-
tubuline qui permet de voir le fuseau mitotique
(vert). L'ADN (DAPI) est représenté en bleu. e) La
quantification de la répartition des LD montre qu'un
tiers des NSPC en division dans la SVZ distribue les
LD de manière asymétrique (31,4 %). Le
pourcentage d'asymétrie augmente même jusqu'à la
moitié de toutes les cellules (51,4 %) lorsqu'on
analyse le volume des LD. f) Illustration
schématique de l'analyse time-lapse pour étudier les
conséquences de l'héritage asymétrique des LD. g)
L'analyse par imagerie time-lapse de cellules filles
appariées a révélé une augmentation significative
du temps jusqu'à la prochaine division chez la fille
qui a hérité asymétriquement moins de LD. h) Les
cellules filles individuelles appariées de l'analyse
time-lapse et leur temps jusqu'à la prochaine
division sont indiqués. Les points rouges illustrent
les divisions pour lesquelles le temps jusqu'à la
prochaine division était plus court dans la fille qui a
hérité asymétriquement de plus de LD. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-021-
27365-7

> La détermination des stomates

Chez Arabidopsis, un modèle classique de division asymétrique est apporté par le lignage qui donne
naissance aux stomates.

337
 **Figure 5-186. Lignage avec des divisions asymétriques (et symétriques) des cellules de garde stomatiques. Une
cellule protodermique (grise) s'engage dans la lignée stomatique lorsqu'elle devient une cellule mère méristémoïde
(MMC). Les MMC subissent une division asymétrique et produisent une cellule méristémoïde plus petite (M, rouge)
et une plus grande cellule (SLGC; blanche). Les cellules méristémoïdes peuvent subir des divisions asymétriques
d'autorenouvellement (amplification) générant une cellule M et une nouvelle SLGC. Les cellules méristémoïdes
peuvent aussi se différencier en une cellule-mère des cellules de garde (GMC; vert clair). Un GMC se divise une fois
symétriquement pour former une paire de cellules de garde (GC; vert foncé). Les SLGC ont deux options : ils peuvent
se différencier en cellules pavimenteuses (blanches), ou ils peuvent adopter un destin MMC et subir une division
asymétrique (espacement) pour créer une nouvelle cellule méristémoïde secondaire qui est positionné à l'écart de
la cellule de lignée stomatique existante. Trois facteurs de transcription apparentés de la famille bHLH, SPCH, MUTE
et FAMA, forment des hétérodimères avec les bHLH-LZ ICE1 ou SCRM2 (non illustrés), et sont nécessaires et
suffisants pour conduire respectivement aux destins méristémoïdes, GMC et GC. Source :
https://www.researchgate.net/publication/249998233_Stomatal_Development_in_Arabidopsis/figures?lo=1

L'initiation du lignage stomatique correspond à la spécification des cellules mères méristémoïdes (MMC)
qui déclenche une division asymétrique qui crée une petite cellule qui est un précurseur stomatique
transitoire appelé cellule méristémoïde (M) et une grande cellule appelée SLGC. La spécification des MMC
dépend de l'expression de SPEECHLESS (SPCH) et de son partenaire hétérodimérique SCREAM (SCRM) tout
en étant restreinte par les protéines EPF2, ERECTA et TMM, ce qui assure que des stomates ne seront pas
trop rapprochés au sein de l'épiderme (Horst et al., 2015). La cellule méristémoïde continue à exprimer
SPCH tandis que cette expression est perdue par la cellule SLGC. Les cellules méristémoïdes peuvent ensuite
subir elle-même des divisions asymétriques avec auto-renouvellement ce qui leur donne un caractère de
cellule souche. Puis lorsqu'une cellule méristémoïde cesse ses divisions asymétriques, elle cesse d'exprimer
SPCH et commence à exprimer MUTE, devenant une cellule-mère des cellules de garde (GMC) (Pillitteri et
al., 2007). Celle-ci subit une division symétrique pour donner les deux cellules de garde d'un stomate.

LA CARTE MENTALE
338
L’apoptose

’apoptose permet de faire disparaître des cellules sans que leur contenu soit déversé au contact

L
d’autres cellules. Le noyau se condense, l’ADN se fragmente, les cellules diminuent de volume et
expriment à leur surface des signaux (par exemple de la phosphatidylsérine, un phospholipide qui
est normalement présent très majoritairement sur le feuillet interne de la membrane plasmique et qui
se retrouve en majorité sur le feuillet externe lors de l'apoptose) qui vont stimuler leur phagocytose par
d’autres cellules. Des grosses cellules peuvent se fragmenter en structures plus petites appelées corps
apoptotiques et entourées d’une membrane plasmique altérée. Ce sont alors ces corps apoptotiques qui
sont phagocytés. Tout le processus ne déclenche pas d'inflammation.
*Figure 5-187. Cellule en apoptose en train de se
fragmenter en corps apoptotiques. (cellules HeLa vues
en microscopie électronique à balayage). Source :
Thomas Deerinck and Mark Ellisman, NCMIR, UCSD

La technique de choix pour observer l’apoptose est le TUNEL (Terminal Transferase dUTP
Nick End Labeling). Au cours de l’apoptose, l’ADN se fragmente. On fait agir sur des embryons
ou des cellules en culture fixés une Terminal Transférase qui ajoute des nucléotides
marqués (par exemple du BrdUTP) à l’extrémité des fragments d’ADN puis ces nucléotides
sont reconnus par un anticorps couplé à un fluorophore. Les cellules apoptotiques ont
beaucoup plus de marquage que les cellules normales à cause de la fragmentation de l’ADN
et donc apparaissent fluorescentes. Une autre méthode repose sur le fait qu'une cellule
apoptotique présente de la phosphatidylsérine sur la moitié externe de sa membrane plasmique
(alors qu'une cellule normale n'en possède que sur sa moitié cytoplasmique). L'annexine A5 (ou
annexine V) est une protéine qui reconnait la phosphatidylsérine et peut être couplée à un
fluorophore ce qui permet de reconnaitre les cellules apoptotiques par fluorescence.
Chez les métazoaires, les mécanismes apoptotiques sont conservés au cours de l’évolution et
permettent aux organismes multicellulaires de préserver l’homéostasie tissulaire (Ameisen, 2002).

339
Des mutations qui inhibent des membres des voies de signalisation de l’apoptose sont très
courantes dans les cellules tumorales (Hanahan et Weinberg, 2000).

L’apoptose a lieu de multiples fois au cours du développement, ce qui peut paraître paradoxal alors
que l’organisme se construit. Mais le développement peut se dérouler selon un processus sélectif
darwinien où plus de cellules que nécessaires sont produites et seules les cellules les plus
fonctionnelles survivent : c’est typiquement le cas des neurones (Buss et al., 2006). L’apoptose peut
permettre d’éliminer des structures devenues inutiles de part une détermination qui était jusqu’alors
bipotentielle (cas de l’élimination des canaux de Wolff (chez les mammifères femelles) et des canaux de
Müller (chez les mâles)) et elle a un rôle dans la morphogenèse qui fonctionne alors comme de la
sculpture (apoptose dans la zone interdigitale qui permet de séparer les doigts).

L’apoptose peut aussi jouer le rôle de “contrôle qualité” des populations de cellules. Par exemple, chez le
poisson-zèbre, les cellules qui ne répondent pas correctement à un gradient morphogène de Wnt (en
activant trop ou pas assez sa voie de signalisation impliquant la β-caténine) meurent par apoptose.

***Figure 5-188. Apoptose des cellules qui répondent de manière anormale à un gradient morphogène de Wnt. a)
Schéma de la formation d’un gradient d’activité Wnt/β-caténine chez le poisson-zèbre lors de la gastrulation A :
antérieur, P : postérieur. b) Des embryons transgéniques exprimant le gène rapporteur GFP sous le contrôle de la
voie Wnt/β-caténine sont utilisés. L’activation de la caspase-3 (vue par sa phosphorylation en immunofluorescence,
rose) qui est un marqueur d’apoptose est observée dans des cellules avec une activité Wnt/β-caténine anormale. La
ligne pointillée indique une activité anormale du rapporteur Wnt/β-caténine (trop forte en haut, trop faible en bas).
L’élimination mise en évidence ici permet de lisser le gradient d’action de la voie Wnt/β-caténine. Barres d’échelle =
200 μm. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-019-12609-4

Ced-3 a été le premier effecteur apoptotique découvert chez Caenorhabditis elegans en 1986 (Ellis et
Horvitz, 1986, lien vers une version commentée de cet article) (voir Figure 1-19). Cet organisme modèle se
prêtait bien à ce genre d’étude car on connaît très précisément le nombre de ses cellules à tout stade de
développement et donc une apoptose diminuée chez un mutant ne pouvait pas passer inaperçue.

Les premiers orthologues de ced-3 chez les mammifères, la caspase-9 chez l'homme (anciennement appelée
enzyme de conversion de l'interleukine-1β) et Nedd-2 chez la souris, ont été décrits peu après (Yuan et al.,
1993). Des homologues de ces protéines ont également été trouvés chez les insectes, à savoir Dcp-1 et Drice
chez la drosophile. Ces protéines qui déclenchent l’apoptose ont été nommées caspases, qui signifie
cysteine-aspartic proteases, reflétant leur spécificité pour les sites contenant des liaisons peptidiques avec
l’acide aspartique, qu’elles clivent à l’aide de la cystéine présente dans leur site actif (QACXG). Jusqu’à
présent, environ 15 membres de la famille des caspases ont été décrits chez l’homme et la souris (Shalini et
al., 2015).

Il est à noter que chez les mammifères, certaines caspases sont également impliquées dans l’inflammation.
Un rôle également non apoptotique pour la caspase effectrice clé, la caspase-3, a été identifié dans la

340
formation des fibres du cristallin. Les cellules épithéliales qui forment le cristallin perdent leur noyau au
cours de cette différenciation sans mourir et la caspase-3 contrôle ce processus (Ishizaki et al., 1998).
**Figure 5-189. Marquage TUNEL dans les cellules du
cristallin en différenciation. Les noyaux des cellules du
cristallin dégénèrent au cours de la différenciation avec
une fragmentation de l’ADN (ce qui est détecté par le
TUNEL) qui dépend de la caspase-3, comme dans une
apoptose mais les structures cellulaires en dehors du
noyau survivent. (B) est un agrandissement de la zone
indiquée en (A). Source :
https://rupress.org/jcb/article-
pdf/140/1/153/1274425/15025.pdf

Les caspases apoptotiques sont classées en deux groupes : les caspases initiatrices (caspase-2, -8, -9
et -10) et les caspases exécutrices (caspase-3, -6 et -7). Ces protéases sont synthétisées sous forme de
zymogènes inactifs. Elles doivent se dimériser pour devenir actives. Les caspases initiatrices peuvent s’auto-
activer via autocatalyse, cependant, des interactions supplémentaires avec un complexe de protéine
d’activation sont généralement nécessaires. Par exemple, le taux d’activation de la caspase-9 est
supérieur de plusieurs ordres de grandeur par rapport à la forme libre lorsqu’elle est ancrée dans
un complexe supramoléculaire appelé apoptosome contenant la protéine APAF-1 (Rodriguez et
Lazebnik, 1999). La caspase-8 est plutôt activée par le complexe de signalisation induisant la mort (DISC).
***Figure 5-190. Formation de l’apoptosome.

L’interaction du cytochrome c avec le domaine WD40

d’APAF-1 induit une modification de la conformation
d’APAF-1 et son heptamérisation via son domaine NOD.
La pro-caspase-9 est recrutée par APAF-1 grâce à leurs
domaines CARD respectifs, et le complexe APAF-
1/Cytochrome c/Caspase-9 forme l’apoptosome,
capable d’activer les caspases effectrices 3, 6 et 7. Extrait
de la thèse de Caroline Pirou, 2016.

Eliminer l’expression de APAF-1 et donc abolir la formation de l’apoptosome peut sauver des cellules
embryonnaires de l’apoptose comme dans l’exemple suivant :

341
 *Figure 5-191. L’absence d’APAF-1 sauve les cellules de crêtes neurales de l’apoptose dans les arcs pharyngiens des
souris HAND2-/-. Coupes transversales à travers les arcs pharyngiens (pa) d’embryons de souris E10,5-E11 traitées
en TUNEL (E-H). Les coupes ont aussi été traitées au DAPI (A-D). Les génotypes des souris sont indiqués. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160604007791

Les caspases exécutrices sont activées par les caspases initiatrices, puis elles clivent un large
ensemble de substrats, conduisant à l’apoptose (Kumar, 2007).
*Figure 5-192. L’activité de la caspase-3 dépend de la
caspase-9 et d’APAF-1. (En haut) Un fractionnement
d'extraits protéiques de cellules en apoptose a généré 17
fractions qui sont traitées ensuite par western-blot pour
détecter la présence de APAF-1 qui fait partie de
l'apoptosome et de la caspase-9 (C-9). Une caspase-3
initialement inactive est incubée avec ces fractions puis
son activité est testée. On constate que c'est seulement
avec les fractions contenant APAF-1 et la caspase-9 que
l'activité de la caspase-3 est significativement
augmentée. Avec d'autres expériences, on montrerait
qu'APAF-1 active la caspase-9 qui a son tour active la
caspase-3. Source :
http://genesdev.cshlp.org/content/13/24/3179.long

Plusieurs centaines de protéines sont clivées par les caspases lors de l’apoptose. Elles ciblent
notamment des protéines structurales comme les constituants du cytosquelette : actine, kératines et
lamines nucléaires (Caulin et al., 1997; Mashima et al., 1997). Cela participe à la condensation
cytoplasmique et nucléaire observée lors de cette mort cellulaire.
*Figure 5-193. L’actine est une des cibles des caspases
lors de l’apoptose. Des cellules cancéreuses humaines
HeLa ou A431 sont traitées avec un étoposide VP qui
induit l'apoptose et avec ou sans Z-D-DCB qui inhibe les
caspases ou Z-D-OH qui est une molécule proche sans
effets sur les caspases. Un western-blot est réalisé sur les
extraits protéiques de ces cellules permettant de
reconnaître l'actine. Une protéine d'actine intacte fait 42
kDa (ou 42 K ici). Les formes clivées de l'actine font 31 K
et 15 K. Source :
https://www.nature.com/articles/1202558

Les caspases ciblent également des protéines impliquées dans le métabolisme et la réparation de l’ADN
comme PARP (Poly ADP Ribose Polymerase) ou les DNA-PK (DNA-dependent Protein Kinase). Les caspases
ciblent la protéine ICAD (Inhibitor of Caspase-Activated DNase), qui est normalement associée en complexe
avec la DNase CAD. Cette dernière n’est alors plus inhibée et peut participer à la fragmentation de l’ADN
caractéristique de l’apoptose (Enari et al., 1998).

Certaines cibles de caspase sont impliquées dans des processus non apoptotiques, notamment la
prolifération et la différenciation cellulaires (Kuranaga et Miura, 2007). Au cours de tels processus,
l’étendue des cibles des caspase reste strictement contrôlée dans le temps et dans l’espace, évitant la mort
342
cellulaire. Des cibles habituelles des caspases en cas d’apoptose sont protégées. Par exemple, dans
l’érythropoïèse, le facteur de transcription GATA-1 est protégé de la protéolyse médiée par les caspases par
la protéine chaperon Hsp70 (De Maria et al., 1999 ; Ribeil et al., 2007).

Signalons qu’il existe également des voies de signalisation de l’apoptose indépendantes des caspases qui
peuvent être médiées par d’autres protéases. Citons les cathepsines, les calpaïnes, la serpine/endonucléase
LEI/L-DNase II (Leukocyte Elastase Inhibitor/LEI-derived DNase II) ou le facteur AIF (Apoptosis Inducing
Factor) qui peuvent médier la fragmentation de l’ADN en absence d’activation des caspases, ou encore des
sérine-protéases mitochondriales comme Omi/HtrA2, localisée dans l’espace intermembranaire
mitochondrial et pouvant être relarguée dans le cytosol (Cregan et al., 2004; Mathiasen et Jäättelä, 2002;
Torriglia et al., 2008)

En amont de la cascade d’activation des caspases, on trouve deux voies appelées extrinsèques et
intrinsèques. Dans la voie extrinsèque, la stimulation des récepteurs de mort tels que Fas/Apo1 ou
TRAIL, conduit à l’activation de la caspase-8 initiatrice et au clivage en aval de la caspase-3 effectrice.
Le ligand Fas est par exemple exprimé à la surface des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules NK
(Natural Killer) et peut provoquer la mort de cellules infectées par des virus, de certaines cellules tumorales
et de cellules issues d'une greffe.
*Figure 5-194. Voie d'activation extrinsèque de
l'apoptose via l'interaction FASligand/FAS et
molécules apparentées. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2017.00403/full

La voie intrinsèque implique les mitochondries, et notamment la libération du cytochrome c de

l’espace intermembranaire mitochondrial dans le cytosol. Le cytochrome c libéré se lie à la protéine
d’amarrage Apaf-1 et facilite la formation du complexe apoptosome qui recrute et active la caspase-
9. Ce complexe apoptosome caspase-9/APAF-1/cytochrome c est la forme holoenzymatique de la caspase-
9, qui active par clivage protéolytique l’exécuteur de l’apoptose caspase-3 comme nous l’avons vu.

Les mitochondries jouent un rôle central dans l’activation des caspases par la voie intrinsèque
(Singh et al., 2019). Lors de divers stimuli induisant la mort, la membrane externe mitochondriale est
altérée, permettant la libération du cytochrome c dans le cytosol et l’activation ultérieure de la
cascade des caspases. Ce phénomène, appelé perméabilisation de la membrane externe
mitochondriale, est strictement régulé par la famille de protéines Bcl-2 (Kale et al., 2018).

Les protéines de la famille Bcl-2 partagent un ou plusieurs domaines d’homologie Bcl-2 (BH) (Youle et
Strasser, 2008). Sur la base d’analyses de structure et de fonction, les protéines Bcl-2 ont été classées en

343
trois groupes : à domaine BH3 uniquement, multidomaine pro-apoptotique et multidomaine anti-
apoptotique (Chipuk et al., 2010).

Une fois activées, les protéines multidomaines pro-apoptotiques, telles que Bax et Bak, forment des
canaux sur la membrane externe des mitochondries, induisant la fuite d'agents activateurs de
l'apoptose dans le cytosol, notamment le cytochrome c (Bleicken et al., 2013) ou encore Smac/Diablo,
des protéines qui s'attachent aux protéines inhibitrices de l'apoptose, IAP et les inhibent (Rehm et al., 2003).
*Figure 5-195. Localisation de Bax aux mitochondries
lors de l’induction de l’apoptose. Les cellules D407
(épithélium pigmenté rétinien humain) ont été
transfectées avec des vecteurs d’expression de mito-BFP
(bleu qui est exprimé dans les mitochondries) et GFP-
BAX. Les cellules sont traitées 24 heures plus tard avec 1
µM de staurosporine (un inducteur de l’apoptose)
pendant 1 heure (E) ou 3 heures (F) ou un contrôle DMSO
(le solvant dans lequel est dissous la staurosporine)
(D). Une localisation ponctuelle, co-localisée avec les
mitochondries, est détectée dans l’heure suivant l’ajout
de staurosporine. Source :
https://journals.plos.org/plosone/article/figures?id=10.1371/journal.pone.0184434

*Figure 5-196. Régulation mitochondriale de l'apoptose.

La perméabilisation de la membrane externe
mitochondriale médiée par Bax/Bak entraîne une
libération dans le cytosol des protéines de l'espace
intermembranaire mitochondrial. Le cytochrome c se lie
au monomère Apaf-1, entraînant son changement
conformationnel et son oligomérisation. La procaspase-
9 est recrutée dans les complexes Apaf-1 heptamériques
formant l'apoptosome. Cela conduit à l'activation de la
caspase-9 et, par le clivage médié par la caspase-9, à
l'activation des caspases exécutrices -3 et -7. La
libération de Smac et Omi de l'espace intermembranaire
mitochondrial facilite l'activation des caspases en
neutralisant l'inhibiteur de la caspase XIAP. Source :
http://dx.doi.org/10.1101/cshperspect.a008706

Les protéines multidomaines anti-apoptotiques, notamment Bcl-2, Bcl-xL et Mcl-1, neutralisent Bax et
Bak en formant des hétérodimères avec eux à travers un sillon hydrophobe formé par leurs domaines BH1,
BH2 et BH3, protégeant ainsi la cellule de l’apoptose (Petros et al., 2004).

Les protéines à domaine BH3 seul sont des protéines pro-apoptotiques qui jouent le rôle de “sentinelles”
capables d’intégrer divers stress cellulaires et de déplacer l’équilibre en faveur des acteurs pro-
apoptotiques en antagonisant les membres de la famille anti-apoptotique Bcl-2 ou en activant Bax et Bak
(Youle et Strasser, 2008). Par exemple, l'expression du gène codant la protéine PUMA est activée par p53 à
la suite de dommages à l'ADN qui ne sont pas réparés et PUMA inhibe l'activité des acteurs anti-
apoptotiques et stimule l'activité des acteurs pro-apoptotiques (Wang et al., 2007).

344
 **Figure 5-197. Contrôles de l’activité de Bcl-2 et de Bax. D’après
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1631069105000909

*Figure 5-198. L'activation de la transcription de PUMA par p53 est nécessaire à une bonne induction de l'apoptose
en cas de dommages à l'ADN. Les cellules humaines de cancer colorectal HCT116 avec les génotypes indiqués (sans
p21 pour éviter que les cellules n'entrent en quiescence, avec ou sans PUMA (PUMA-KO) et avec ou sans les 2 sites
de fixation de p53 sur le promoteur de PUMA (BS-KO)) ont été infectées avec un adénovirus permettant la
surexpression de p53 (Ad-p53) ou traitées avec des agents qui endommagent l'ADN, le 5-FU (50 μg/ml), l'oxaliplatine
(50 μM), l'étoposide (40 μM), l'adriamycine (0,4 μg/ml) , camptothécine (100 nM) ou irradiation γ (IR; 12 Gy).
L'apoptose est mise en évidence par coloration nucléaire. Après les traitements indiqués pendant 48 h, les cellules
attachées et flottantes ont été fixées et analysées par microscopie à fluorescence après coloration au Hoechst 33258.
Les cellules avec des noyaux fragmentés et condensés ont été comptées comme des cellules apoptotiques. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.0700020104

Les facteurs dits de survie sont des ligands qui activent des voies de signalisation qui s’opposent à
l’apoptose. Elles peuvent agir en augmentant l’expression de Bcl-2 ou de Bcl-xL, en inactivant Bad (c’est ce
que fait Akt par exemple) ou en inhibant des inhibiteurs de IAP (ces derniers sont anti-apoptotiques).

Les noms des protéines impliquées dans l'apoptose dans ce chapitre sont ceux des Mammifères. L'apoptose
a été abondamment étudiée chez le nématode C. elegans et chez la drosophile. Dans ces modèles, il existe
des protéines orthologues à celles des Mammifères.

345
 **Figure 5-199. Conservation des cascades de signalisation des caspase (a) Chez C. elegans, les signaux apoptotiques
activent la transcription de EGL-1 (protéine BH3 uniquement), dont la liaison à CED-9 (protéine de la famille BCL-2)
libère CED-4 et favorise par conséquent l'activation de la caspase CED-3. (b) Chez la drosophile, différents signaux
de développement deviennent des stimuli apoptotiques et activent les antagonistes de l'IAP, Reaper, Hid et Grim
(RHG). Les protéines RHG se localisent dans les mitochondries et favorisent la dégradation de DIAP1. DIAP1 inhibe
Dronc et les caspases effectrices Drice et Dcp-1 de telle manière que la dégradation de DIAP1 libère les caspses. Dronc
et son activateur Ark forment le complexe apoptosome, qui active les caspases effectrices en aval. (c) Chez les
mammifères, l'interaction entre les protéines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques de la famille BCL-2 contrôle la
libération de protéines localisées dans les mitochondries, notamment les antagonistes du cytochrome-c (cyt-c) et
d'IAP tels que Smac, HtrA2 et ARTS. La liaison de cyt-c à Apaf-1 favorise l'assemblage des apoptosomes, qui recrute
la pro-caspase-9 et facilite la cascade protéolytique. Les antagonistes de l'IAP libèrent la caspase-9 de l'inhibition par
XIAP, entraînant l'activation de l'apoptosome et des caspases effectrices en aval (caspase-3 et caspase-7). Les
protéines homologues fonctionnelles d’une espèce à l’autre sont représentées de la même manière par la couleur et
la forme. Source : https://www.nature.com/articles/cdd201736

Certains virus empêchent l'activation des voies apoptotiques ce qui prolonge la vie des cellules qu'ils ont
infectées et favorise leur propagation. Par exemple, le virus de la famille de l'herpès HHV8, responsable de
la maladie de Kaposi, exprime une protéine vFLIP qui inhibe la caspase-8 (Ruder et al., 2020).

Un déclenchement déficient de l'apoptose est une des caractéristiques des cellules tumorales. Cela
assure leur survie et leur croissance, et également leurs résistances aux traitements (Hata et al.,
2015). Elles expriment souvent plus fortement des membres anti-apoptotique de la famille Bcl2. Par
exemple, dans le lymphome folliculaire, qui est le second lymphome le plus fréquent chez l'adulte (4000
nouveaux cas chaque année en France), est le plus souvent causé par une translocation qui déplace le gène
codant Bcl2 (qui veut dire d'ailleurs B-cell lymphoma 2) situé sur le chromosome 18 vers une région du
chromosome 14 qui contient les séquences régulatrices d'un gène codant une chaîne lourde
d'immunoglobulines exprimée dans les lymphocytes B. Ainsi, Bcl2 est surexprimé et bloque toute possibilité
d'apoptose, même en cas d'accumulation d'autres mutations qui causent des cancers. Des mutations gain-
de-fonction dans la séquence codante de Bcl2 peuvent aussi être décelées dans certains lymphomes
folliculaires (Correia et al., 2015).

Des nouvelles molécules thérapeutiques sont étudiées pour inhiber leur activité ou également pour stimuler
directement des protéines pro-apoptotiques telles que Bax (Reyna et al., 2017).

346
 **Figure 5-200. La petite molécule BTSA1 active
l'apoptose dans des cellules leucémiques en stimulant
l'activité de Bax. BTSA1 est une molécule d'intérêt
pharmacologique (structure tenue secrète) testée pour
ses capacités à induire l'apoptose dans des cellules
leucémiques myéloïdes NB4 au bout de 6 heures de
traitements. On extrait par fractionnement les protéines
cytosoliques et mitochondriales des cellules traitées
avec le solvant (DMSO) ou avec différentes doses de
BTSA1 et on réalise un western-blot avec des anticorps
reconnaissant BAX, le cytochrome c (cyto c) et les
témoins de charge actine et VDAC. On constate un effet-
dose dans la localisation de Bax sur les mitochondries et
dans la fuite de cytochrome c dans le cytosol. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5793879/

L’élimination des cellules apoptotiques

Les cellules qui subissent une mort cellulaire programmée sont généralement englouties par des cellules
phagocytaires ce qui évite les réponses inflammatoires ou maintient l'homéostasie tissulaire. L'échec de ce
processus entraînerait une accumulation redondante de cellules apoptotiques dans l'organe, conduisant
finalement au développement de maladies inflammatoires auto-immunes ou neurodégénératives (Doran et
al., 2020).

Avant d'être reconnus par les phagocytes, les cellules apoptotiques libèrent ou exposent certaines
molécules qui favorisent leur reconnaissance et leur élimination. Les macrophages de mammifères sont
divisés en deux sous-groupes en fonction de leurs cytokines inflammatoires (Röszer, 2015), M1 et M2. Ce
sont les macrophages M2 qui sont impliqués dans la phagocytose des cellules apoptotiques. Les cellules
épithéliales et les fibroblastes peuvent également absorber une quantité limitée de particules apoptotiques
et jouer un certain rôle (Cao et al., 2004; Monks et al., 2005; Juncadella et al., 2013).

Il existe d'autres morts cellulaires régulées que l'apoptose : la ferroptose est une mort cellulaire
par accumulation de peroxides de lipides. Cette accumulation peut être provoquée par des ions
Fe2+ d'où son nom. Elle peut aussi être provoquée par un défaut de glutathion qui ne peut plus
jouer son rôle d'antioxydant. Au cours de la ferroptose, il n'y a pas de fragmentation de l'ADN
contrairement à l'apoptose (Han et al., 2020). La nécroptose est une autre forme de mort cellulaire
caractérisée par une augmentation de la perméabilité membranaire qui la rapproche de la nécrose
et qui est médiée par un complexe appelé nécrosome et qui dépend notamment de la
phosphorylation de RIPK3, l'un des composants du nécrosome (Zhang et al., 2009). La nécroptose
peut s'observer par exemple dans le cas de cellules infectées par des virus qui inhibent les
caspases activatrices de l'apoptose (Berghe et al., 2014). Citons également la pyroptose qui
correspond à la formation de pores dans la membrane plasmique par les protéines de la famille
des gasdermines.

Les vésicules extracellulaires

347
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules produites et excrétées par les cellules et
entourées d'une bicouche lipidique. Elles étaient autrefois considérées comme des déchets
cellulaires mais elles constituent en fait une forme importante de communication intercellulaire et
attirent désormais une attention considérable en raison de leurs rôles dans une variété de
processus physiologiques et pathologiques.

L'une des principales classes de VE est constituée par les exosomes, de petites vésicules, dont la
taille varie de 30 à 150 nm de diamètre, qui se forment dans des corps multivésiculaires (MVB) et
sont acheminées vers la surface cellulaire (au lieu des lysosomes où ces corps multivésiculaires
aboutissent habituellement). Les MVB fusionnent avec la membrane plasmique et libèrent leur
contenu, les exosomes, dans l'espace extracellulaire. Un tel processus a pu être observé in vivo par
exemple lors de la formation du réseau des trachées chez la drosophile où des exosomes sont émis dans la
lumière trachéale (Camelo et al., 2022).

**Figure 5-201. Génération et libération d'exosomes et

d'ectosomes. Le corps multivésiculaire (MVB) est une vacuole
endocytaire occupée par des vésicules correspondant à des
vésicules intraluminales distinctes (ILV) remplies par des
molécules spécifiques chargées à partir du cytosol. Le
bourgeonnement vers l'intérieur des vésicules est suivi de leur
fission et de la libération d'ILV dans la lumière du MVB
(diamètre de 50 à 150 nm). Lors de leur génération, les MVB
peuvent évoluer dans deux directions alternatives (flèches) :
vers les lysosomes (Lyso) ou vers la membrane plasmique.
L'exocytose du MVB est suivie d'une libération extracellulaire
rapide de vésicules, appelées exosomes (Exo). L'assemblage et
la libération des ectosomes de la surface cellulaire ont lieu au
niveau de la membrane plasmique. L'étape initiale est
l'assemblage de microdomaines membranaires plus grands
(100 à 400 nm de diamètre d'ectosome). Leur composition est
distincte de celle de la membrane plasmique d'origine et
partiellement similaire à celle des membranes ILV. Des
molécules spécifiques, composées de protéines, de lipides et
d'acides nucléiques, s'accumulent dans la lumière de la vésicule.
Lors de leur courbure rapide vers l'extérieur et de leur
bourgeonnement, les vésicules de l'ectosome (Ecto) subissent
un pincement et un détachement vers l'espace extracellulaire. N
= noyau. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.877344/full

***Figure 5-202. Mécanismes de bourgeonnement des vésicules intraluminales lors de la formation des
exosomes. L’ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) qui permet la formation des MVB puis des
exosomes fait intervenir de manière séquentielle quatre sous-unités, ESCRT-0, -I, -II et -III, qui séquestrent les cargos
dans des microdomaines à la membrane des endosomes tardifs et leur permettent de bourgeonner en tant que
vésicules intraluminales. Une ubiquitine (Ub) est associée aux sous-unités ESCRT. ALIX est une protéine accessoire
de l’ESCRT, qui permet en principe de contourner les sous-unités ESCRT-0, -I, -II et de relier directement ses
partenaires à l’ESCRT-III. La synténine lie directement ALIX avec son domaine N-terminal et les tétraspanines
(CD63/tétraspanine-6) et les syndécanes grâce à ses deux domaines PDZ. Source :
https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2021/12/msc200706/msc200706.html

L'autre classe majeure de VE est le plus souvent appelée microvésicules (MV). Les MV sont
nettement plus grandes que les VE dérivées des MVB et leur diamètre varie de 0,2 à 1,0 μm de

348
diamètre et se forment à la suite de leur bourgeonnement vers l'extérieur et de leur fission de la
membrane plasmique (Desrochers et al., 2016; Latifkar et al., 2019).

Une variété de protéines, d’ARNm et de micro-ARN est associée aux MV et aux exosomes. Cette cargaison
est souvent localisée dans la lumière des VE, même si, dans certains cas, elle est associée à la surface de la
vésicule (Jeppesen et al., 2019; Valadi et al., 2007; Desrochers et al., 2016; Ratajczak et al. , 2006).

Plusieurs protéines de liaison à l'ARN (RBP) ont été impliquées dans la sélection et le chargement des ARN
dans les VE, notamment les protéines nucléaires hétérogènes ribonucléoprotéines A2/B1 (hnRNPA2B1)
(Villarroya-Beltri et al., 2013), SYNCRIP (Hobor et al., 2018 ; Santangelo et al., 2016), HuR (Mukherjee et al.,
2016) et les protéines MVP (Statello et al., 2018 ; Teng et al., 2017). YBX1 a été impliqué dans le chargement
du microARN miR-233 dans les exosomes (Shurtleff et al., 2016).

Les MV et les exosomes peuvent transférer leur cargaison vers d'autres cellules (c'est-à-dire
receveuses) et, ce faisant, modifier le comportement cellulaire. Par exemple, lors d'un exercice
musculaire intense les cellules musculaires striées squelettiques relarguent des exosomes contenant des
microARN à destination du foie qui aboutissent à une meilleure sensibilité à l'insuline et donc à une
meilleure régulation de la glycémie (Castano et al., 2020).
*Figure 5-203. Réponse différente à une alimentation
sucrée de la glycémie sanguine en fonction des
exosomes. Des exosomes purifiées à partir du plasma de
souris sédentaires (EXO-CT) ou faisant régulièrement
des exercices intenses (EXO-RUN) ont été injectés 2 fois
par semaine pendant 4 semaines dans des souris
sédentaires. Puis un repas riche en sucre est donné à t=0
et la glycémie est suivie sur deux heures. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2016112117

Les rôles des VE dans la progression du cancer ont été étudiés. Elles aident à façonner le
microenvironnement tumoral, à promouvoir l'immunosuppression et à améliorer la croissance, la survie,
l'invasion et la propagation métastatique des cellules cancéreuses (Antonyak et Cerione, 2014; Antonyak et
al. ., 2011; Costa-Silva et al., 2015; Kreger et al., 2016; Van Niel et al., 2018). Par exemple, des cellules
faiblement métastatiques issues de cancer du sein secrètent des vésicules extracellulaires riches en
Transglutaminase 2 (Tg2) qui activent les fibroblastes environnants à produire une matrice extracellulaire
favorable à la migration (Schwager et al., 2022). Ces VE ont été particulièrement bien étudiées dans le cas
des tumeurs des cellules sanguines dans la moelle osseuse (Ohyashiki et al., 2017).

349
 *Figure 5-204. Les tumeurs hématologiques changent leur microenvironnement de la moelle osseuse grâce à des
vésicules extracellulaires. Les cellules tumorales sécrètent des vésicules extracellulaires (petits cercles verts) vers
leurs cellules environnantes telles que les cellules stromales mésenchymateuses de la moelle osseuse (BM-MSC), les
cellules endothéliales et les cellules immunitaires. MDSC, cellule suppressive d'origine myéloïde ; NK, natural killer;
RBC, globule rouge. Source : https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rstb.2016.0484

Cependant, les VE ont également un impact sur un large éventail de processus physiologiques. Dans les
blastocystes de souris, Les VE produites par les cellules pluripotentes dans l'ICM sont transférés au
trophectoderme pour favoriser l'implantation, une étape précoce de la grossesse dans laquelle l'embryon
en développement se fixe et envahit l'utérus (Desrochers et al., 2016). Les MV transportent alors la laminine
et fibronectine qui interagissent avec les intégrines le long des surfaces des trophoblastes, et déclenchent
l'activation de deux kinases de signalisation, JNK et FAK, ce qui stimule la migration des trophoblastes.

**Figure 5-205a. Les microvésicules en provenance des

cellules ES stimulent la polarité migratoire des
trophoblastes. Les trophoblastes HTR8/SVneo ont été
incubés avec un milieu sans sérum ou avec ce milieu avec
des Microvésicules isolées à partir de cellules ES pendant
1h. Les cellules sont fixées puis la F-actine est reconnue
par la phalloïdine couplée à la rhodamine et Rac1 est
reconnu par immunofluorescence. Les pointes de flèche
indiquent les lamellipodes. Barre d'échelle = 20 μm.
Source : https://www.nature.com/articles/ncomms11958

**Figure 5-205b. Les microvésicules en provenance des

cellules ES stimulent la phosphorylation de FAK dans les
trophoblastes. Western-blot réalisé à partir de
trophoblastes HTR8/SVneo privés de sérum et traités
avec un milieu sans sérum supplémenté avec des MV
provenant de cellules ES pendant les durées indiquées.
Le rapport de chaque paire phospho-FAK/FAK totale est
présenté. Source :
https://www.nature.com/articles/ncomms11958

**Figure 5-205c. Modèle résultant des expériences précédentes. D'après

https://www.nature.com/articles/ncomms11958

Dans le système nerveux, de nombreuses fonctions des vésicules extracellulaires ont pu être mises en
évidence à la fois en situation développementale, physiologique et pathologique. Par exemple, au cours du
développement, les astrocytes produisent des VE qui exposent à leur surface la protéine synapsine-1 qui se
lie au récepteur neuronal NCAM (neuronal cell adhesion molecule). L’internalisation de cette protéine après
350
sa fixation à son récepteur par les neurones favorise la survie neuronale et la croissance des dendrites et
des axones (Wang et al., 2011).

**Figure 5-206. Les différents rôles des vésicules extracellulaires dans le système nerveux central. Le panneau
supérieur (fond vert) représente les conditions physiologiques, le panneau inférieur (fond rouge) représente les
conditions pathologiques. La diversité du contenu vésiculaire est illustrée dans la vésicule centrale. La couleur des
VE dépend de leur origine cellulaire. BHE : barrière hémato-encéphalique ; CMH : complexe majeur
d’histocompatibilité ; DNF : dégénérescence neurofibrillaire. Source :
https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2021/12/msc200646/msc200646.html

Les exosomes peuvent avoir un rôle dans la régulation des cellules souches et dans le vieillissement. Par
exemple, des exosomes produits par des adipocytes péri-musculaires de souris âgées (mais pas de souris
jeunes) contiennent de grandes quantités de miARN Let-7d-3p qui inhibent la prolifération des cellules
souches musculaires (les cellules satellites) et des précurseurs musculaires en diminuant l'expression du
facteur de transcription HMGA2 (Itokazu et al., 2022).

351
PARTIE 6

Les voies de signalisation

Figure 6-1. Quelques exemples de voies de signalisation.

Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30359-3

352
 es cellules perçoivent des molécules de leur environnement et parmi celles-ci, certaines sont

L
produites par d’autres cellules, d’espèces différentes ou de la même espèce. Si on se concentre sur ce
dernier cas, même des organismes caractérisés comme unicellulaires peuvent échanger des signaux.
C’est le cas des bactéries dont les signaux de quorum sensing affectent l’expression de leurs gènes et
contrôlent leur métabolisme, leur mobilité et leur reproduction. Chez la levure à l’état haploïde, un
peptide sécrété signale à d’autres levures haploïdes d’arrêter de proliférer et d’entamer la fusion avec la
cellule sécrétrice. A fortiori, dans des organismes pluricellulaires dont le développement doit être
coordonné, des signaux sont échangés entre les cellules et affectent tous les processus cellulaires :
prolifération, survie, migration, détermination et différenciation.

Ces signaux doivent être reçus par des cellules compétentes, c’est-à-dire qui expriment des
récepteurs appropriés. Ceux-ci déclenchent dans la cellule-cible des réactions à court terme, en
quelques secondes à quelques minutes. Les phosphorylations sur des sérines, des thréonines et
des tyrosines sont de loin les plus courantes. Ensuite, des réactions à plus long terme sont activées
sous la forme de modifications de l’expression de gènes, essentiellement au niveau de la
transcription (mais pas seulement).

Les voies de signalisation fonctionnent comme des modules de signalisation mais elles ne sont
instructives que dans un contexte donné. La voie Notch est utilisée au moins une dizaine de fois au
cours du développement embryonnaire d’un organisme à différents endroits. Les voies Shh, FGF et
BMP de même. Ce qui donne la véritable instruction est le contexte dans lequel cette signalisation
a lieu où la compétence des cellules et l’intégration de multiples signaux sont les paramètres les
plus importants.

Les cellules ne font pas qu'intégrer les signaux de manière additionnelle. Deux voies de
signalisation peuvent également agir en opposition (l'une empêche l'action de l'autre) ou en
synergie (l'action des deux voies de signalisation sur un processus cellulaire correspond plus que
la simple somme de l'action des deux voies). Il peut y avoir ainsi un cross-talk, c'est-à-dire un
dialogue croisé entre deux voies de signalisation.
*Figure 6-2. Exemple de cross-talks entre voies de
signalisation. Cet exemple illustre les cross-talks au
cours de la formation des synapses. On voit que
plusieurs voies convergent vers l'activation de CREB qui
va stimuler la transcription de gènes cibles. De même,
l'activation de plusieurs récepteurs différents
(récepteurs aux FGF, à IGF, à BDNF et aussi aux Wnt
(signalisation non canonique) peut activer la voie
MAPK/ERK. Les récepteurs aux IGF et au BDNF activent
Akt qui inhibe GSK3β et renforce ainsi la voie canonique
Wnt/β-caténine. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnsyn.2014.00004/full

Ici, pour plus de facilité, nous présenterons les voies de signalisation séparément mais dans la cellule,
certains effecteurs sont en commun.

Les voies de signalisation WNT

a signalisation Wnt joue divers rôles dans le développement animal, le maintien des cellules

L
souches (dans l’intestin par exemple) et la cancérogenèse (Nusse et Clevers, 2017). En 1982, Wnt1
a été initialement identifié chez les vertébrés comme un oncogène du cancer du sein, avant que l’on se
rende compte qu’il s’agissait d’un orthologue de Wingless connu chez la drosophile pour son rôle dans
la polarisation des segments selon l’axe antéro-postérieur. 90% des cancers colorectaux sont causés par

353
des altérations génétiques des facteurs de la voie Wnt (Cancer Genome Atlas). Par conséquent, les
inhibiteurs chimiques de la signalisation Wnt présentent un énorme potentiel thérapeutique.

Les Wnts sont conservés chez tous les animaux métazoaires. Chez les Mammifères, la complexité et la
spécificité de la signalisation Wnt sont en partie causées par l’existence de 19 ligands Wnt. Ce sont des
protéines riches en cystéine d’environ 350-400 acides aminés qui contiennent un peptide signal N-terminal
pour la sécrétion. Ces protéines subissent des modifications post-traductionnelles, notamment une
palmitylation qui est essentielle à leur bon fonctionnement. Les récepteurs des Wnt, Frizzled (FZD)
possèdent sept domaines transmembranaires et sont aussi diversifiés : il en existe 10 chez les
Mammifères.

Voie Wnt canonique

L’interaction entre Wnt, Frizzled et la protéine 5/6 liée au récepteur des lipoprotéines (LRP5/6)
active la signalisation Wnt. Le principal résultat de l’activation de la signalisation Wnt est la
stabilisation de l’activateur transcriptionnel β-caténine. La voie est donc connue sous le nom de
signalisation canonique Wnt ou Wnt/β-caténine.

La β-caténine a un domaine central d’environ 530 acides aminés de 12 répétitions en tandem de type
armadillo (ARM) flanqué à chaque extrémité de régions désordonnées d’environ 100 résidus. Elle est non
seulement impliquée dans la voie Wnt canonique mais elle est aussi associée au complexe liant les
cadhérines au réseau d’actine. La coordination et la répartition entre ces deux fonctions est encore mal
comprise.

*Figure 6-3. Voie canonique Wnt/β-caténine. (A) En l’absence de Wnt, la protéine d’échafaudage Axin avec APC, GSK3
et CK1 forment le complexe de destruction de la β-caténine. La β-caténine interagit avec le complexe et est
phosphorylée par GSK3 et CK1α (CK1). La β-caténine phosphorylée est ubiquitinée par le SCFβ-Trcp et dégradée par
le protéasome. Les niveaux de β-caténine restent donc faibles et la transcription dépendante de la β-caténine des
gènes cibles Wnt/β-caténine est inhibée. (B) Wnt interagit avec les récepteurs Frizzled FZD et LRP6. GSK3 et CK1γ
liés à Axin phosphorylent les motifs PPPS/TP dans le domaine intracellulaire de LRP6. LRP6 phosphorylé sert de site
d’amarrage pour Axin, facilitant l’interaction entre Axin et LRP6 et inhibant l’activité kinase de GSK3. Cela provoque
la dissociation et l’inactivation du complexe de destruction de la β-caténine, conduisant à la stabilisation de la β-
caténine et à l’activation de la transcription des gènes cibles Wnt/β-caténine. (C) Wnt induit des agrégats LRP6 d’une
manière dépendante de Dishevelled (DVL). Dans cette condition, FZD, Axin et GSK3 peuvent également s’agréger
avec LRP6, générant des signalosomes LRP6. PIP2 est généré via PIP5K1 lié au DVL. PIP2 accélère la formation des
signalosomes LRP6 et la phosphorylation de LRP6, entraînant une activation supplémentaire de la signalisation
Wnt/β-caténine.

D’après https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.714330

354
En l’absence de Wnt, la protéine d’échafaudage Axin forme un complexe de destruction avec la protéine
polypose adénomateuse coli (APC), la glycogène synthase kinase 3β (GSK3β) et la caséine kinase 1
alpha (CK1α) qui se lie à la β-caténine cytoplasmique, conduisant à sa phosphorylation par CK1α et
GSK3β. La β-caténine phosphorylée est ubiquitinylée par le complexe ubiquitine ligase SCFβ-Trcp E3,
un processus qui la cible pour la dégradation par le protéasome 26S.
*Figure 6-4. La surexpression de GSK3β a un effet
opposé à une suractivation de la voie Wnt. On injecte
dans un des blastomères d'un embryon de xénope au
stade 2 cellules un ARNm codant Xwnt-1 (surexpression
du ligand Wnt) ou GSK3β (surexpression de GSK3β).
Lors de la neurulation, on fixe les embryons que l'on
traite en hybridation in situ pour suivre l'expression de
gènes exprimés dans les crêtes neurales (Sox10 et
Snail2). On constate qu'il y a une extension du territoire
des crêtes neurales du côté (droit) où il y a suractivation
de la voie Wnt, mais la surexpression de GSK3β a un effet
inverse, suggérant que l'activité de GSK3β s'oppose à
l'action de la voie Wnt. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160603001611

**Figure 6-5. La mutation des serines de la β-caténine que GSKβ phosphoryle abolit l'ubiquitinylation de la β-
caténine. Des cellules Neuro2A (neuroblastome de souris) sont transfectées avec des vecteurs permettant
l'expression de forme taguée de la β-caténine sauvage (β.His6, β.myc) et de forme taguée myc de β-caténine mutée
(β.K19R, β.K49R, β.K19,49R (sites de d'ubiquitination mutés, voir la séquence en bas), β.5SD (5 sérines qui sont des
cibles de GSK3β transformées en aspartate) et β.4SA (4 sérines qui sont des cibles de GSK3β transformées en
alanine). Les cellules sont traitées ou non par ALLN qui inhibe la dégradation par le protéasome permettant
l'accumulation de protéines ubiquitinylées qui auraient dû être dégradées. Les extraits protéiques sont
immunoprécipités par myc et le culot obtenu est analysé par un western-blot avec un anticorps anti-β-caténine. La
grosse bande correspond à la β-caténine non ubiquitinylée et la bande juste au-dessus correspond aux formes
ubiquitinylées. On constate que la mutation des sérines que cible GSK3β abolit toute forme d'ubiquitinylation de la
β-caténine. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1170003/

L'ubiquitination (ou ubiquitinylation) des protéines est une modification post-traductionnelle avec
des rôles cellulaires importants. L'ubiquitine qui est un petit peptide de 76 acides aminés (8,5 kDa)
est attachée sur des lysines de la protéine cible par une cascade de trois enzymes : d'abord l'enzyme
d'activation de l'ubiquitine E1 (UBA), puis une enzyme de conjugaison de l'ubiquitine E2 (UBC) et
enfin une ligase d'ubiquitine E3.

355
 *Figure 6-6. Ubiquitination de la β-caténine phosphorylée par GSK3β en absence de Wnt par l'ubiquitine E3-ligase
SCF. Cette ubiquitine E3-ligase agit au sein d'un complexe avec E2 et des protéines régulatrices. Source :
https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap7/co/module_Chap7_8.html

En présence de Wnt, le complexe de destruction de la β-caténine est recruté à la membrane

plasmique et inactivé. En conséquence, la β-caténine est stabilisée puis transloquée vers le noyau
pour activer l’expression de gènes cibles impliqués dans la prolifération cellulaire, la
différenciation, l’auto-renouvellement des cellules souches et de nombreux autres processus
biologiques.

Il est bien connu que la dérégulation de la signalisation Wnt provoque des troubles du
développement et plusieurs maladies telles que le cancer (Nusse et Clevers, 2017). Notamment,
l’hyperactivation de la β-caténine, due à des mutations de APC, de AXIN ou du CTNNB1 (gène de la
β-caténine), est un facteur de risque bien connu de carcinogenèse, en particulier du cancer du côlon
(Bugter et al., 2021).
**Figure 6-7. Différentes manières avec lesquelles on a
constaté des pertes de fonction ou d'expression d'APC
dans les cellules cancéreuses. Une mutation peut aboutir
à un codon STOP précoce et à une protéine APC tronquée,
non fonctionnelle. Le promoteur du gène APC peut être
hyperméthylé aboutissant à l'inhibition de son
expression. Le facteurs de transcriptions inhibiteurs
EZH2 et YY1 peuvent aussi être surexprimés ou encore
les facteurs de transcription activateurs CDX2, CEBPZ,
USF1/2 peuvent être sous-exprimés. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.653222/full

LRP5 (ou LRP est un un co-récepteur pour Wnt pour transduire la signalisation Wnt/β-caténine
(Pinson et al., 2000; Tamai et al., 2000; Wehrli et al., 2000). Le domaine extracellulaire de LRP5/6
interagit avec Wnt et, avec Frizzled, active la signalisation Wnt/β-caténine. LRP5/6 avec un domaine
extracellulaire tronqué est constitutivement actif et peut activer la signalisation Wnt/β-caténine
indépendamment de Wnt (Liu et al., 2003). A l’inverse, LRP5/6 avec un domaine intracellulaire tronqué agit
comme une forme dominante-négative, inhibant la signalisation Wnt/β-caténine (Tamai et al., 2000). Il
existe cinq motifs PPPS/TP dans le domaine intracellulaire LRP5/6, et les résidus sérine/thréonine dans
ces motifs sont phosphorylés lors de la stimulation Wnt (Tamai et al., 2004). GSK3β et CK1γ sont les
principales kinases qui phosphorylent respectivement les motifs PPPS/TP et leurs régions flanquantes
(Davidson et al., 2005 ; Zeng et al., 2005). Cela montre le rôle dual de GSK3β et CK1γ qui par leur

356
phosphorylation de LPR5/6 stimulent la voie canonique Wnt et par leur phosphorylation de β-caténine
l’inhibent. La fixation du ligand Wnt permet le basculement du deuxième mode vers le premier mode.

La protéine Dishevelled (DVL) est essentielle pour l’agrégation de LRP5/6 avec Frizzled induite par
Wnt. En présence de Wnt, des composants de signalisation Wnt/β-caténine supplémentaires tels que Axin,
CK1α et GSK3β forment un complexe avec LRP5/6 connu sous le nom de signalosome (Bilic et al., 2007). La
formation de signalosomes conduit à une phosphorylation supplémentaire de LRP5/6 par GSK3β qui à son
tour favorise une plus grande agrégation des composants de signalisation Wnt/β-caténine (Zeng et al.,
2008).
**Figure 6-7. Un peptide mimant une forme
phosphorylée de LPR6 est capable d’activer la voie
canonique Wnt. Des embryons de xénope sont injectés
dans la future région ventrale avec des peptides avec un
fragment de la séquence intracellulaire de LPR6 mutée
de manière à la rendre inactive (A-mut) ou mutée de
manière à mimer sa phosphorylation (introduction d’un
acide aminé chargé négativement, Phos-A). On laisse les
embryons se développer jusqu’au stade neurula et on
quantifie la proportion d’embryons avec un double axe
(ce qu’il arrive quand la voie canonique Wnt est activée).
Par RT-PCR, on étudie l’expression de Xnr3, un gène
activé par la voie Wnt (témoin positif avec injection de
Wnt8). On observe un effet dose sur cette activation avec
la quantité de Phos-A introduite. Source :
https://journals.plos.org/plosone/article/figures?id=10.1371/journal.pone.0004926

Le résultat final est une dissociation accrue de la β-caténine loin du complexe de destruction, lui
permettant de s’accumuler dans le cytoplasme puis de se déplacer vers le noyau (Cselenyi et al., 2008;
Wu et al., 2009). L’activation de LRP6 induite par Wnt3a est rapide et l’agrégation des composants
impliqués dans la signalisation Wnt/β-caténine peut être observée dès 30 min par imagerie de cellules
vivantes (Bilic et al., 2007).

Un autre acteur important dans le signalosome est PIP5K1, une phosphatidylinositol phosphate kinase dont
l’activation est médiée par FZD et DVL (Pan et al., 2008). L’activation de PIP5K1 conduit à la production de
phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (ptdIns(4,5)P2), qui à son tour induit l’agrégation et la
phosphorylation de LRP6 (Pan et al., 2008). Par conséquent, les composants non protéiques tels que les
phospholipides jouent également un rôle crucial dans la signalisation Wnt/β-caténine médiée par LRP6.

Une fois dans le noyau, β-caténine ne se fixe pas directement à l’ADN et ne peut ainsi pas être
considéré comme un facteur de transcription. Elle va interagir avec des facteurs de transcription
TCF/LEF qui, eux, se fixent à l’ADN au niveau de séquences-cibles. Les facteurs TCF/LEF inhibent la
transcription des gènes cibles en l’absence de signal Wnt. Après stimulation cellulaire par les
ligands Wnt, l’accumulation de la β-caténine dans le noyau déloge un corépresseur transcriptionnel
comme Groucho de la liaison avec TCF (Arce et al., 2009 ; Daniels et Weis, 2005).

357
 **Figure 6-8. A la recherche des domaines de LEF-1 qui
se lient à Groucho. A) Des billes de glutathion liées avec
GST-Groucho (panneau du milieu) ou GST (panneau du
bas) ont été testées pour l’interaction avec des
constructions de délétion LEF-1 traduites in vitro et
marquées au 35S (le résultat des différentes traductions
est montré dans le panneau du haut). B) Les délétions N-
terminales de LEF-1 1-234 et 1-191 (pistes 2 et 3) n’ont
pas pu interagir avec GST-Groucho. LEF-1 1-256 (piste 1)
interagit fortement avec Groucho mais un mutant de
délétion dépourvu d’un domaine appelé CRD mais
conservant un domaine appelé HMG (Δ110-295, piste 4)
interagit faiblement. Un contrôle négatif GST montre que
LEF-1 n’interagit pas avec GST ou les billes. Gel SDS-
PAGE coloré au Coomassie de GST-Groucho purifié (piste
1) ou de GST seul (piste 2). C) Alignement des acides
aminés de la séquence putative de liaison de Groucho
(GBS) et des séquences flanquantes dans LEF-1 et
d’autres membres humains de la famille LEF/TCF ainsi
que les orthologues de D. melanogaster (pangolin) et de
C. elegans (POP-1). Source :
https://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2407-9-159

Les mutations dans TCF7L2 qui code TCF4 sont impliquées dans de nombreux types de cancers et elles
favorisent la migration et l’invasion des cellules cancéreuses colorectales humaines. Parmi les cibles de β-
caténine/LEF-TCF on trouve l’oncogène c-Myc et aussi la cycline D1 qui est impliquée dans la
progression à travers la phase G1 du cycle cellulaire vers la phase S.

Dans les embryons de vertébrés, les quatre homologues du TCF sont fonctionnellement spécialisés. Alors
que certains membres de la famille TCF, tels que LEF1, sont nécessaires pour l’activation de la transcription
(Arce et al., 2006 ; Galceran et al., 1999), TCF3 réprime de nombreux gènes (Cole et al., 2008; Houston et al.,
2002 ; Kim et al., 2000). Le poisson zèbre déplété en TCF3 présente un défaut crânien antérieur, qui peut
être sauvé par un forme constitutive répresseur du TCF3 (Kim et al., 2000).
**Figure 6-9. TCF3 agit comme un répresseur de la
transcription. Le mutant de poisson zèbre headless
(uninjected) qui a une mutation perte-de-fonction de
Tcf3 ne peut être sauvé que par l’expression d’une forme
constitutivement répressive de Tcf3 (domaine de
fixation à l’ADN de Tcf3 fusionné au domaine répresseur
de Engrailed (Eng)). Le mutant n’est pas sauvé par
l’expression d’une forme de Tcf3 constitutivement
activatrice de la transcription (VP16-Tcf3). Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4018833/

358
Des expériences de perte de fonction sur le xénope révèlent les rôles opposés de la β-caténine et de TCF3
dans la spécification des axes dorsoventral et antéropostérieur (Houston et al., 2002 ; Liu et al., 2005).

Semblable aux embryons de Xenopus appauvris en TCF3, les souris mutantes pour le gène Tcf3 présentent
un mésoderme axial élargi et une perte de tissus nerveux antérieurs; ces défauts peuvent être en grande
partie sauvés par l’expression d’une construction TCF3 répressive dépourvue du domaine d’interaction
avec la b-caténine (Merrill et al., 2004). Ainsi, TCF3 joue le rôle d’inhibiteur de la voie Wnt.

Signalons que la β-caténine ne se fixe pas qu’à des facteurs LEF/TCF mais aussi à d’autres protéines formant
un véritable centre d’activation transcriptionnel.
**Figure 6-10. Domaines de la β-caténine et les
protéines avec lesquelles elle interagit. La β-caténine
possède de multiples partenaires de liaison nucléaire
qui jouent un rôle essentiel dans l’activation des gènes
cibles de la voie Wnt. TCF/LEF sert de facteur de liaison
à l’ADN pour le complexe d’activation
transcriptionnelle, tandis que BCL9/BCL9-2 forme un
échafaudage pour d’autres facteurs nécessaires pour
activer la transcription dépendante de Wnt. Lors de la
translocation de la β-caténine vers le noyau, la
chromatine associée aux éléments de réponse aux Wnt
est altérée pour favoriser l’activation des gènes cibles
via le recrutement de complexes de remodelage des
histones médiée par la β-caténine. Les histones
acétyltransférases, comme CBP/p300, acétylent les
nucléosomes associés aux éléments de réponses aux
Wnt, favorisant ainsi la transcription des gènes. Un
autre remodeleur de la chromatine, SET-1, qui est une
histone méthyltransférase, ajoute des groupes méthyle
à la lysine 4 de l’histone 3 (H3K4me), une marque
associée à une transcription active. Source :
https://www.mdpi.com/2073-
4425/11/8/886/pdf

Voies Wnt non canoniques

Dishevelled est un composant de la voie Wnt-Wingless qui est impliqué à la fois dans la voie canonique et
dans les voies non canoniques. Initialement, Dishevelled a été appelé ainsi à cause du mutant perte-de-
fonction chez la drosophile où les soies présentes à la surface de l’aile sont désorientées (et non pas alignées
les unes par rapport aux autres comme d’habitude) ce qui indique un problème de polarité cellulaire
planaire.

La polarité cellulaire planaire (PCP) fait référence à la polarisation collective des cellules le long d’un plan
tissulaire et est contrôlée par un ensemble conservé de protéines associées à la membrane connue sous le
nom de voie PCP centrale (Yang et Mlodzik, 2015; Strutt et al., 2016; Butler et Wallingford, 2017). La voie
PCP dirige un large éventail de comportements cellulaires polarisés à travers une variété de tissus,
notamment les battements ciliaires dirigés, la motilité cellulaire collective et l’alignement des soies à la
surface de la cuticule des Insectes et des poils sur la surface de la peau des Mammifères (Niessen et al., 2012;
Devenport, 2014; Davet et al., 2017).
*Figure 6-11. Effet d'un mutant d'un gène codant une
protéine de la voie Wnt/PCP sur l'orientation des soies
de l'aile de drosophile. Normalement, les soies à la
surface de l'aile de la drosophile sont tous alignés,
indiquant une polarité planaire de l'épithélium
épidermique. A gauche, chez le mutant perte-de-fonction
strabismus (stbm), on observe une orientation
désordonnée des soies. L'expression par transgénèse
d'un gène stbm sauvage (couplé au gène codant YFP pour
des études de localisation non montrées ici) chez le
mutant rétablit le phénotype sauvage. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/130/13/3007/41971/Strabismus-is-asymmetrically-localised-and-binds

359
La voie de la PCP est essentielle au développement embryonnaire, et la perturbation génétique de la PCP
entraîne de graves anomalies du développement, notamment des anomalies du tube neural et des
cardiopathies congénitales (Curtin et al., 2003 ; Phillips et al., 2007 ; Wang et al., 2019).

La PCP requiert les fonctions de plusieurs protéines centrales conservées, Prickle, Van Gogh/Strabismus,
Dishevelled, Frizzled et Flamingo/Stan, identifiées à l’origine dans des études génétiques chez la drosophile.
Dans les tissus épithéliaux de la drosophile, la PCP se manifeste par la distribution des complexes
membranaires Frizzled/Dishevelled et Prickle/Van Gogh dans des domaines opposés à l’intérieur de
chaque cellule (Adler, 2012; McNeill, 2010; Peng et Axelrod, 2012).

*Figure 6-12. Établissement de la polarité cellulaire planaire. La polarité cellulaire planaire (PCP) correspond à
l'organisation des cellules sur un plan orthogonal à l'axe apical-basal d'un épithélium. La PCP est établie par une
distribution asymétrique des complexes avec les complexes Vangl-Pk et Fzd-Dvl qui se localisent sur les côtés
opposés de la cellule. La polarité cellulaire est maintenue et propagée aux cellules voisines par le biais d'interactions
intercellulaires protéine-protéine entre complexes opposés et d'interactions homophiles entre Fmi/Celsr.
Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.887100/full

**Figure 6-13. Voie Wnt/PCP. Source :

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6829399/pdf/cells-08-01198.pdf

Le complexe Frizzled/Dishevelled induit une cascade de signalisation médiée par la voie non canonique qui
provoque l’activation des petites GTPases Rho et Rac qui contrôlent l’arrangement du cytosquelette et
notamment des microfilaments d’actine (Fanto et al., 2004; Habas et al., 2001).

Wnt5a est un ligand activant la voie PCP. Il interagit avec la région extracellulaire de LRP6 et cette
interaction inhibe l’activation de Rac1, une protéine cible de la signalisation Wnt non canonique (Bryja et
al., 2009). De plus, Wnt5a interfère avec l’interaction entre Wnt3a et LRP6, entraînant également l’inhibition
de la signalisation Wnt/β-caténine (Bryja et al., 2009; Grumolato et al., 2010).

360
Le mécanisme moléculaire du choix de l’activation de la voie canonique ou d’autres voies après fixation du
ligand WNT à ses récepteurs est encore mal compris. On sait que parmi les 19 ligands Wnt identifiés chez
les Mammifères, certains d’entre eux, Wnt1, Wnt3a et Wnt8, activent préférentiellement Wnt/β-caténine
tandis que d’autres, Wnt5a et Wnt11, activent principalement la voie Wnt/PCP. Ror1/2 est un récepteur
tyrosine kinase qui a un domaine extracellulaire riche en cystéine de type Frizzled et il est un co-récepteur
impliqué dans la réception du signal Wnt pour activer la voie PCP. Le choix des voies canonique ou PCP se
fait sans doute par des affinités différentielles entre LPR5/6 et Ror1/2.

De manière intéressante, la localisation du facteur de transcription GRHL3 détermine le passage de la voie

Wnt canonique à la voie Wnt/PCP au cours du développement. Lorsqu'il est dans le noyau, GRHL3 favorise
l'activité de la voie Wnt/β-caténine qui accompagne la détermination de l'épiderme à partir de l'ectoderme
et lorsqu'il passe dans le cytoplasme, GRHL3 stimule la voie Wnt/PCP qui intervient dans la morphogenèse
de l'épithélium épidermique et dans sa polarité (Kimura-Yoshida et al., 2022).

***Figure 6-14. Rôle de la localisation de GRHL3 et de son action sur les voies Wnt lors de la formation de l'épiderme.
GRHL3 exerce deux fonctions différentes liées à la détermination de l'épiderme et à la morphogenèse de cet
épithélium au cours du développement. La première fonction est médiée par GRHL3 nucléaire en tant que facteur de
transcription en aval de la β-caténine. La deuxième fonction est médiée par GRHL3 cytoplasmique impliquant la voie
Wnt non canonique, qui contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP). La voie Wnt non canonique facilite la formation
des fibres d'actomyosine et modifie par conséquent les propriétés physiques telles que la rigidité mécanique des
cellules nécessaires à la morphogenèse épithéliale. SE = Ectoderme de surface, NE = Ectoderme neural. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-018-06171-8

Le syndrome de Robinow est une maladie génétique causant des malformations squelettiques, génitales et
rénales. Il y a une grande variété de génotypes aboutissant à ce syndrome mais toutes les mutations
découvertes résident dans des gènes de la voie de signalisation Wnt non canonique, notamment ROR2,
WNT5A et aussi DVL1 (Dishevelled-1) et DVL3 (Person et al., 2009). Ces données soutiennent l’hypothèse
selon laquelle le syndrome de Robinow résulte d’une perturbation de la voie Wnt/PCP. Les défauts cranio-
faciaux observés chez les patients et l’expression de ROR2 lors de la spécification et de la migration des
crêtes neurales céphaliques qui forment une bonne partie du squelette cranio-facial sont sans doute liés
(Schille et al., 2016).

361
Une autre voie non canonique aboutit à l’augmentation de la concentration de Ca 2+ dans le cytoplasme. Les
Wnt se fixent alors au co-récepteur tyrosine kinase Ryk. Chez la drosophile, l’orthologue de Ryk, Derailed,
est impliqué dans la répulsion des axones en croissance par Wnt5 (Yoshikawa et al., 2003).
**Figure 6-15. Voie de signalisation Wnt/Ca2+.
L'activation de la voie Wnt/Ca2+, une voie indépendante
de la β-caténine, entraîne la libération de Ca2+ du
réticulum endoplasmique (ER), qui active les protéines
kinases CAMKII et PKC. Cette voie déclenche des
événements en aval avec notamment l'activation des
facteurs de transcription NFκB et CREB et la
transcription de leurs gènes-cibles en aval. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.692888/full

Contrôle de la sécrétion et de la diffusion des Wnt

La molécule de drosophile Wingless (Wg) est la molécule de la famille WNT la plus étudiée in vivo
(Hausmann et al., 2007). Ces études ainsi que les travaux sur C. elegans ont identifié des gènes qui régulent
la biogenèse des Wnt et leur sécrétion. Le gène Porcupine code une protéine transmembranaire du RE
(Reticulum endoplasmique) qui contient un domaine O-acyl transférase, qui a un rôle dans la modification
post-traductionnelle de Wg impliquant un transfert d’acyl comme une palmitoylation (ou palmitylation)
(Hausmann et al., 2007). Une déplétion de Porcupine entraîne une accumulation de Wg et de WNT3A dans
le RE et la palmitoylation de WNT3A est diminuée à sa sérine 209 (Takada et al., 2006), suggérant que
Porcupine est responsable de cette modification post-traductionnelle.

Deux autres complexes protéiques qui contrôlent la sécrétion de Wnt/Wg ont été identifiés. Wntless (Wls),
également connue sous le nom de Evenness interrupted (Evi) ou Sprinter (Srt), chez la drosophile, et le
complexe rétromère chez les nématodes (Hausmann et al., 2007). Les mutants porcupine, wls et retromer
phénocopient les mutant Wg/Wnt mutants chez la drosophile et C. elegans, attestant de leurs rôles
essentiels dans la biogenèse Wnt.

Wls est une protéine à plusieurs domaines transmembranaires localisée dans l’appareil de Golgi, les
compartiments endocytaires et la membrane plasmique et est essentielle pour la sécrétion de Wg.

Le complexe rétromère, composé de cinq sous-unités, a d’abord été étudié chez la levure. Il médie le trafic
membranaire des protéines entre les endosomes et l’appareil de Golgi (Hausmann et al., 2007).

362
 ***Figure 6-16. Structure du complexe rétromère
qui permet de récupérer et recycler Wls, une
protéine nécessaire à la sécrétion de
Wingless/Wnt. Ce complexe assure le transfert des
protéines des endosomes à l’appareil de Golgi.
Source. png

Le complexe rétromère est requis pour la récupération/le recyclage des Wls de l’endosome au Golgi
(Belenkaya et al., 2008 ; Franch-Marro et al., 2008 ; Pan et al., 2008 ; Port et al., 2008), qui est probablement
médiée par une interaction directe entre Wls et la sous-unité du rétromère Vps35. La perte de fonction du
rétromère provoque la dégradation de Wls dans les lysosomes et aboutit à la réduction de la sécrétion de
Wls et donc de Wg/Wnt. Ces études ont conduit au modèle suivant : Wnt est glycosylé et ses résidus
lipidiques sont modifiés par Porcupine, et il est escorté par Wls du Golgi à la membrane plasmique pour la
sécrétion. Wls est recyclé par endocytose et renvoyé au Golgi par le complexe rétromère.

La visualisation des ligands Wnt est essentielle pour comprendre leur distribution. Dans le disque alaire de
la drosophile, les protéines Wg sont largement distribuées à partir des cellules marginales des ailes, où Wg
est exprimé (Strigini et Cohen, 2000; Zecca et al., 1996). En outre, la dispersion à longue distance de Wg a
été mise en évidence par une expérience dans laquelle Wg a été capturé par Frizzled2 (un de ses récepteurs)
exprimé de manière distale (Chaudhary et al., 2019). De même, les ligands Wnt endogènes marqués avec
des protéines fluorescentes ont montré des distributions à longue distance chez C. elegans (Pani et
Goldstein, 2018).

*Figure 6-17. Gradient de la protéine Wnt marquée avec un tag fluorescent observé chez Caenorhabditis elegans.
Projection d’intensité maximale de la fluorescence Wnt/EGL-20::YPET chez un ver vivant au stade tardif L1 illustrant
le gradient antéropostérieur de Wnt coloré ; (f) tracé de profil de l’intensité de fluorescence Wnt/EGL-20::YPET

363
 antéropostérieur dans le même ver qu’en (e); (g) projections d’intensité maximale d’un animal vivant au stade
intermédiaire L1 montrant des membranes plasmiques de cellules sources de Wnt marquées par Pegl-20>2x
mKate2::PH (magenta) et Wnt/EGL-20::mNG protéine (vert) ; (h) tracé de profil des intensités de fluorescence
normalisées EGL-20::mNG et Pegl-20> 2x mKate2::PH le long de l’axe antéropostérieur illustrant la dispersion de
Wnt à partir des cellules sources. L’orientation des animaux est indiquée (head = tête, tail = queue). Barres d’échelle
= 20 µm. Source : https://elifesciences.org/articles/38325

En plus de ces observations chez les invertébrés, les ligands Wnt8 endogènes se dispersent loin de leurs
cellules sources dans les embryons de Xenopus (Mii et al., 2017). D’autre part, chez la souris, Wnt3
s’accumule à quelques diamètres de cellules de ses cellules sources dans le microenvironnement de
l’intestin (Farin et al., 2016). Ces études montrent que les ligands Wnt se dispersent bien dans les tissus et
les embryons, bien que la plage de dispersion varie.

Les molécules de surface cellulaire, par exemple les protéoglycanes de sulfate d’héparane (HS) (HSPG), ont
également un rôle important dans la distribution et la signalisation de Wnt. Les HSPG se composent d’une
protéine centrale et de plusieurs chaînes de glycosaminoglycane HS (GAG). Parmi les HSPG, la protéine
centrale glypicane et les chaînes HS sont nécessaires à la distribution et à la signalisation de Wg chez la
drosophile.

*Figure 6-18. Les protéoglycanes à sulfate d’héparane sont nécessaires à la signalisation Wnt chez la drosophile.
Observation de la cuticule d’un embryon de drosophile sauvage (A) et d’un embryon muté sugarless (B) qui présente
un défaut de synthèse des HSPG (héparane sulfate protéoglycanes). Le phénotype obtenu est un défaut de polarité
segmentaire similaire à celui qui est obtenu lorsque la signalisation wingless est défectueuse. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/124/18/3565/39459/The-Drosophila-sugarless-gene-modulates-Wingless

364
Antagonistes et agonistes naturels de la voie Wnt
**Figure 6-19. Mécanismes d’inhibition de la
signalisation Wnt. (A,B) La liaison de Dkk1 à LRP6
perturbe la formation du complexe Fz-LRP6 induite
par Wnt (A) et/ou induit l’endocytose de LRP6 en
présence de son corécepteur Kremen (B). (C) sFRP,
WIF-1 et Cerberus séquestre Wnt, inhibant ainsi la
signalisation Wnt canonique et non canonique. (D)
Les sFRP peuvent également inhiber la signalisation
Wnt canonique et non canonique en se liant à Fz. (E)
La liaison de Wise/SOST à LRP6 bloque la formation
de complexes Fz-LRP6 induite par Wnt. (F) IGFBP-
4 se lie à LRP6 et Fz, empêchant ainsi la
transduction du signal par Wnt. Source :
http://m.cshperspectives.cshlp.org/content/5/3/a015081.long?view=long&pmid=23085770

Les protéines sécrétées Frizzled-related (sFRP) dont Frzb se lient à Wnt et l'empêchent d'activer ses
récepteurs. Cela joue un rôle dans de nombreux processus développementaux, par exemple la mise en place
de l'épithélium stomacal et intestinal.

*Figure 6-20. Les sFRP inhibent la signalisation Wnt. Coupes transversales d'intestins de souris à E13,5 traitées en
immunofluorescence avec un anticorps reconnaissant Phospho-c-Jun. On distingue l'épithélium (au centre) et le
mésenchyme (Me). Wnt5a active ici la phosphorylation de c-Jun (moins de signal fluorescent chez les souris Wnt5a-
/-) par une voie non canonique. Lorsque plusieurs gènes codant des SFRP sont invalidés, la phosphorylation de c-Jun

est plus importante dans l'épithélium et aussi dans le mésenchyme. Comme le montrent d'autres expériences,
l'inhibition de la signalisation Wnt par les sFRP joue ici un rôle important dans l'orientation des divisions des cellules

365
 de l'épithélium intestinal et dans la mise en place de leur polarité apico-basale. Source :
https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000427

La signalisation Wnt/LRP5/6 est antagonisée par les protéines Dickkopf (Dkk), qui se lient et inhibent
LRP5/6 (Mao et al., 2001 ; Semenov et al., 2001).

Au début du développement des vertébrés, Dkk1 est exprimé dans l’endomesoderme antérieur et joue un
rôle important dans la mise en place de l’axe antéro-postérieur en inhibant la signalisation Wnt/LRP6 dans
l’organisateur de la tête et la plaque précordale (Glinka et al., 1998 ; Hashimoto et al., 2000 ; Shinya et al.,
2000 ; Mukhopadhyay et al., 2001).

Les autres récepteurs de Dkk sont les protéines transmembranaires Kremen1 et 2 (Krm1 et 2, appelés
collectivement Krms). Dkk1 forme un complexe ternaire complexe avec Krm1 ou 2 et LRP6, qui est éliminé
de la surface de la cellule arrêtant ainsi la transduction du signal Wnt (Mao et al., 2002). Chez le Xénope,
Krms et Dkk1 sont co-exprimés dans la plaque précordale et coopèrent fonctionnellement dans l’inhibition
de Wnt pour réguler la mise en place de l’axe antéro-postérieur dans le tube neural (Davidson et al., 2002).
Krm1 est aussi nécessaire à la formation du thymus chez la souris en agissant comme inhibiteur de Wnt
(Osada et al., 2006).
*Figure 6-21. Kremen1 diminue la transcription des
gènes cibles de la voie canonique Wnt/β-caténine. Le
gène rapporteur luciférase se trouve sous le contrôle
d’un promoteur avec des sites de fixation pour LEF/TCF
(système TopFlash). Cette construction est transfectée
dans des cellules épithéliales du thymus provenant de
souris sauvages (WT) ou Krm1-/- (KO) et l’activité
luciférase est mesurée. Source :
https://www.hindawi.com/journals/jir/2006/602150/

Dans les embryons de xénope, Krm2 est exprimé dans diverses régions qui n’expriment pas Dkk1 (Davidson
et al., 2002), notamment dans les cellules de crêtes neurales. L’expression de Krm2 est activée par Wnt et
est requis pour la formation des crêtes neurales. Dans ce cas, en absence de Dkk1, Krm2 stimule la
signalisation Wnt et favorise, via une liaison directe, la localisation de la surface cellulaire de LRP6. Ces
résultats montrent que Krms agit comme inhibiteur ou activateur de la signalisation Wnt en fonction de la
présence ou de l’absence de Dkk.

Bighead est un autre antagoniste de la voie Wnt. Il ressemble dans son mode d’action à Dkk. Il est produit
par l’organisateur de Spemann et se fixe sur LPR6 ce qui aboutit à son endocytose et donc à l’absence de
possibilité pour Wnt d’activer correctement ses cellules cibles (Ding et al., 2018). Comme pour Dkk, son
action est nécessaire pour qu’une tête normale se forme.

Autres antagonistes de la voie Wnt, les ligases E3 transmembranaires simples ZNRF3/RNF43 qui
ubiquitinylent et provoquent l’internalisation et la dégradation de Frizzled et de LRP6. ZNRF3/RNF43 sont
activés par la voie de signalisation Wnt elle-même ce qui montre qu’il s’agit d’une boucle de rétroaction
négative (Koo et al., 2012).
*Figure 6-22. RNF43 induit l’internalisation et la
dégradation de Frizzled. Localisation subcellulaire de
SNAP–Frizzled5 (FZD5) et du mutant SNAP–FZD5 6KR dans
des cellules HEK293T co-transfectées avec un contrôle ou
RNF43. La protéine de surface SNAP–FZD5 a été marquée
avec SNAP–Alexa549 pendant 15 min et chassée pendant
5 min. Notez que RNF43 induit une internalisation rapide
de SNAP–FZD5. SNAP–FZD5 6KR (mutée sur des lysines)
est résistante à l’internalisation induite par RNF43. Barres

366
 d’échelle, 10 μm. Source :
https://www.nature.com/articles/nature11308

Les ligands R-spondine se fixent sur leur récepteur LGR4/5/6 et séquestrent ZNRF3/RNF43, conduisant à
la clairance membranaire de ZNRF3/RNF43 (Carmon et al., 2011 ; Glinka et al., 2011 ; Koo et al., 2012).
Ainsi, les R-spondines augmentent l’abondance membranaire des récepteurs Wnt et potentialisent la
signalisation Wnt.

LGR5 est une protéine intéressante. Son gène a été identifié initialement comme une cible de la voie Wnt
dans les cellules souches intestinales (elle est un marqueur classique qui permet d’identifier ces cellules).
C’est une protéine à 7 domaines transmembranaires de la famille des rhodopsines. Le fait que ce soit un
récepteur de la R-spondine qui potentialise la signalisation Wnt montre qu’une boucle de rétroaction
positive est à l’œuvre dans les cellules souches de l’intestin (de Lau et al., 2014) (voir Figure 2-32).

Notum est un autre inhibiteur de la voie Wnt et il agit sous la forme d’une boucle de régulation négative car
sa sécrétion est activée par la voie Wnt. Il agit en tant que carboxyestérase et il dépalmitoyle Wnt (Kakugawa
et al., 2015). La palmitoylation est nécessaire à la fixation de Wnt à Frizzled donc cela inhibe la réception du
signal Wnt.
**Figure 6-23. Dépalmitoylation de Wnt par Notum
aboutissant à une inhibition de l'interaction de Wnt avec
son récepteur Frizzled. Source :
https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jmedchem.0c01974

De nombreux petites molécules chimiques inhibitrices ou activatrices de la voie Wnt ont été
découvertes ces dernières années. Elles sont importantes pour manipuler la voie Wnt, notamment
dans les protocoles de différenciations des cellules souches pluripotentes mais aussi pour
développer des traitements anti-cancéreux (Bayle et al., 2021).

367
 ***Figure 6-24. Bilan des petites molécules agissant sur la voie Wnt. Il faudrait ajouter CHIR99021 qui est un
inhibiteur de GSK3β et donc un activateur de la voie Wnt. Source :
https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.jmedchem.0c01974

Signalons qu'une voie de signalisation chez les végétaux ressemble à la voie Wnt : la voie activée par les
brassinostéroïdes. En absence de ligand, un orthologue de GSK3 appelé BIN2 phosphoryle un co-facteur de
transcription appelé BZR1 (qui n'a rien à voir évolutivement avec la β-caténine) et l'empêche de
s'accumuler dans le noyau. La fixation d'un brassinostéroïdes rend BIN2 inactif et permet à BZR1 de
s'accumuler dans le noyau et de réguler la transcription. Cette voie joue un rôle dans l'élongation des
cellules et aussi du tube pollinique et pour la différenciation des faisceaux vasculaires.

***Figure 6-25. Voie de signalisation des brassinostéroïdes (hexagone rouge sur le schéma). Une voie de
signalisation végétale qui ressemble à la voie canonique Wnt/β-caténine avec l'intervention d'un orthologue de
GSK3. Source : https://www.biorxiv.org/content/10.1101/351056v1.full

La voie de signalisation Hedgehog

Les protéines sécrétées par la famille Hedgehog (Hh) sont des morphogènes qui ont été initialement
identifiés chez la drosophile. Chez la drosophile, Hh est co-responsable (avec Wingless) de la
régionalisation lors de la segmentation embryonnaire (gène de polarité segmentaire) et du
développement des disques imaginaux larvaires (Lee et al., 2016). Le gène tire son nom du fait que la
larve ressemble à un hérisson avec une multitude de denticules pointus resserrés.

368
 *Figure 6-26. Phénotype de la mutation Hedgehog chez
la larve de drosophile. D’après
https://en.wikipedia.org/wiki/Hedgehog_signaling_pathway#/media/File:Denticlebands.png

Chez les Vertébrés, il existe trois orthologues : Sonic Hedgehog (Shh), qui est essentiel par exemple
pour le développement des membres et la polarité dorso-ventrale du tube neural (Briscoe et
Thérond, 2013), Indian Hedgehog (Ihh) qui est essentiel pour le bon développement du squelette (St
Jacques et al., 1999) et le rétrocontrôle des cellules intestinales différenciées sur les précurseurs intestinaux
(Van Dop et al., 2009) et Desert Hedgehog (Dhh) qui a des fonctions importantes dans les cellules de
Sertoli des testicules.
*Figure 6-27. Exemple d’action de Shh en tant que
morphogène. Des explants de tube neuraux sont cultivés en
présence de diverses concentrations de Shh et des
immunomarquages sont ensuite réalisés avec des anticorps
reconnaissant des protéines de différentes régions du tube
neural selon l’axe dorso-ventral (à droite). Ces protéines
spécifient différents types de neurones dans le tube neural.
Plus Shh est concentré, plus il spécifie des neurones qui sont
ventraux. D’après https://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/handle/2027.42/62511/nature06347.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Les protéines de la famille Hh sont modifiées par des ajouts lipidiques: un acide palmitique (acide gras
saturé) sur leur région aminoterminale et un cholestérol attaché de manière covalente à leur région
carboxyterminale (Pepinsky et al., 1998; Porter et al., 1996). Ces modifications lipidiques rendent les
protéines Hh hydrophobes, ce qui leur confère une forte affinité pour les membranes cellulaires. Ces
caractéristiques semblent quelque peu paradoxales pour les molécules de signalisation extracellulaires, et
suggèrent l’existence de mécanismes de transport des protéines Hh dans l’espace extracellulaire gorgé
d’eau. Néanmoins, elles jouent un rôle important dans la forme et l’étendue du gradient de la protéine, ce
qui est essentiel pour un morphogène. Une forme mutée de Shh qui ne peut avoir du cholestérol attaché à
sa région carboxyterminale diffuse trop vite et trop loin causant des malformations dans les bourgeons de
membre par exemple, car le gradient de ce morphogène est plus étalé que normalement (Li et al., 2006).

Hh peut se propager en association avec des particules lipidiques extracellulaires (Greco et al., 2001), qui
sont des particules de lipoprotéines (Panáková et al., 2005).
369
 ***Figure 6-28. Shh est sécrété sous des formes associées aux lipoprotéines et sans lipoprotéines.

Étude par centrifugation en gradient de densité puis analyse des fractions en western-blot de Shh humain sécrété
par des cellules HeLa en l’absence ou en présence de sérum bovin fœtal (FBS). Les cellules HeLa transfectées avec un
vecteur d’expression de Shh ont été cultivées dans un milieu sans sérum ou en présence de 10 % de FBS, et des
volumes égaux de surnageants ont été analysés. Les couleurs indiquent les fractions correspondant aux lipoprotéines
bovines de très basse, basse et haute densité (VLDL, LDL et HDL). En présence de sérum, Shh s’associe
majoritairement avec les LDL.
Source : https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.1001505

Les particules de lipoprotéines permettent à Hh de se propager en fournissant un support auquel Hh peut

se lier, protégeant ses régions hydrophobes lipidiques. Chez la drosophile, c’est la lipoprotéine Lipophorin
(Lpp; également connue sous le nom d’apolipophorine) qui transporte Hh. Chez la larve, elle est
principalement produite dans le corps adipeux (Palm et al., 2012) avant être libéré dans l’hémolymphe. La
réduction du niveau total de Lpp circulante dans les larves en appauvrissant spécifiquement l’expression
de Lpp dans le corps adipeux conduit à une diminution du mouvement intercellulaire de Hh. Ce traitement
n’a pas provoqué de suppression générale de la signalisation Hh; au lieu de cela, seules les cibles Hh à longue
portée ont été réduites.

Des mécanismes complémentaires peuvent agir en parallèle. En effet, Hh peut également être sécrété sur
des vésicules extracellulaires (VE), ou transporté le long d’extensions cellulaires, appelées cytonèmes, afin
de remplir sa fonction de régionalisation selon son gradient (Bischoff et al., 2013; Gradilla et al., 2014;
Parchure et al., 2018).

Les cytonèmes sont des expansions cellulaires longues et fines qui permettent le transport de protéines
avant leur sécrétion (Kornberg et Roy, 2014). Ce sont des filopodes particuliers, généralement inférieurs à
200 nm de diamètre, qui peuvent atteindre la taille de 300 μm. Des cytonèmes fonctionnant au cours de la
morphogenèse ont été découverts pour la première fois dans les disques imaginaux des ailes de drosophile
(Ramírez-Weber et Kornberg, 1999). Des études ultérieures ont montré qu’ils contenaient des molécules
de signalisation, notamment HH (ou Shh chez les Vertébrés), WNT, TGFβ, des ligands de Notch et des
facteurs de croissance (Fairchild et Barna, 2014).

La voie Hedgehog (HH) est une voie de signalisation conservée au cours de l’évolution et elle est
activée via la fixation du ligand aux récepteurs Patched (PTCH), une grande protéine à 12 domaines
transmembranaires. En absence de SHH, PTCH inhibe la protéine à 7 domaines transmembranaires
Smoothened (SMO) en l’envoyant à la dégradation (Taipale et al., 2002). Un autre mécanisme
complémentaire implique l’élimination par PTCH du cholestérol du feuillet interne de la membrane
plasmique, cholestérol dont a besoin SMO pour être actif (Kinnebrew et al. 2021). La liaison de SHH au
récepteur PTCH libère cette inhibition en bloquant le conduit hydrophobe dont se sert PTCH pour faire
sortir le cholestérol du feuillet interne de la membrane plasmique (Zhang et al., 2018), le rendant disponible
pour SMO, mais aussi en provoquant l'endocytose de PTCH grâce à l'action des E3 ubiquitine ligase
Smurf1/2 (Yue et al., 2014).

370
 **Figure 6-29. Action du récepteur Patched (PTCH) sur
la distribution du cholestérol dans la membrane
plasmique et inhibition par Shh. Grâce à un conduit
hydrophobe, PTCH (ici modélisé avec sa structure
tertiaire) déplète le feuillet interne de la membrane
plasmique en cholestérol et SMO ne peut pas être activé.
Shh bloque ce conduit ce qui aboutit à la présence de
cholestérol dans le feuillet interne, ce qui active SMO.
Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867418313795

**Figure 6-30. Shh provoque l’endocytose des récepteurs

Patched1 (Ptch1). (A) Images en microscopie confocale de
fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) exprimant les
protéines fusion Ptch1-GFP (vert) et Rab7-RFP (rouge). Rab7
est une protéine des endosomes. Ptch1 est sous sa forme
sauvage ou sous la forme Δ2PY, c’est-à-dire sans le motif PPXY
qui le fait reconnaitre par les E3 ubiquitine ligase Smurf1/2.
Les cellules sont cultivées en présence ou en absence de Shh
(ici juste son fragment N-terminal désigné par ShhN) (B) calcul
des coefficients de colocalisation dans A entre Ptch1-GFP et
Rab7-RFP. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4080449/pdf/elife02555.pdf

La protéine transmembranaire SMO est alors activée. Elle est couplée à une protéine G mais elle peut
transduire le signal par des voies effectrices et dépendantes et aussi indépendantes de la protéine G pour
induire des réponses en aval (Arensdorf et al., 2017; Belgacem et Borodinsky, 2011; Ho Wei et al., 2018).
L'activation de SMO provoque sa translocation dans le cil primaire où il active des effecteurs
transcriptionnels GLI qui entrent dans le noyau et induisent l'expression des gènes cible de la
famille Hedgehog (Corbit et al., 2005).

371
 *Figure 6-31. Shh provoque la translocation de Smo dans le cil (et nécessite la phospholipase A2 pour le faire). Des
cellules NIH 3T3 prétraitées ou non avec MAFP (5 μM), un inhibiteur de la phospholipase A2, et ont été stimulées
avec du milieu contenant Shh (ici appelé ShhN) ou SAG, un agoniste de SMO (100 nM) et leur cil primaire est observé
par microscopie confocale à immunofluorescence avec les anticorps reconnaissant les antigènes indiqués. Pour
toutes les images, la pointe du cil est indiquée par une pointe de flèche. VEH désigne le solvant qui sert de contrôle.
(A) Quantification de la fluorescence de Smo au niveau du cil.

(B–F) Images représentatives pour chaque condition. Cep290 est un marqueur de la base du cil. L’α-tubuline acétylée
est un marqueur du cytosquelette du cil. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124717306757

*Figure 6-32. Voie de signalisation Hedgehog. D'après

https://journals.biologists.com/dev/article/148/9/dev195552/261696/Hedgehog-signaling-and-the-primary-cilium

Le cil primaire de la cellule se compose de neuf doublets de microtubules formant un axonème. D’une
longueur moyenne de 5 μm, il s’étend à partir du centriole amarré à la membrane appelé corps basal.
L’axonème est entouré d’une membrane ciliaire, qui est un compartiment spécialisé et distinct de la
membrane plasmique.

Le cil primaire peut être considéré comme un centre de signalisation de la cellule, à la fois le
récepteur du signal mais aussi l’amplificateur car les protéines nécessaires à la transduction du
signal s’y trouvent concentrées (Anvarian et al., 2019).

372
Des expériences indiquent que Patched doit se trouver dans le cil primaire pour que la voie de signalisation
Hedgehog soit activée. En effet, un mutant Ptch1 qui produit une protéine avec sa queue C-terminale délétée
ne plus entrer dans le cil mais peut toujours fixer le ligand Hedgehog. Or cette forme est incapable de
transduire le signal (Kim et al., 2015).

L'importance du cil primaire se retrouve dans le fait que des mutations provoquant des ciliopathies peuvent
altérer le fonctionnement de la voie Shh. Par exemple, des patients avec une mutation dans le gène
INPP5E (codant une protéine impliquée dans la composition en phosphoinositol de la membrane des cils)
sont affectés par le syndrome de Joubert causé par des défauts dans le cervelet et aussi parfois dans le
cortex, deux structures dont le développement harmonieux dépend de Shh. L'étude d'organoïdes cérébraux
à partir de cellules iPS où une mutation de INPP5E a été introduite par CRISPR/Cas9 a montré que
l'environnement ciliaire modifié suractive la voie Shh provoquant des défauts développementaux
aboutissant à la pathologie (Schembs et al., 2022).

Il existe aussi des voies de signalisation activées par Shh sans intervention du cil primaire :

**Figure 6-33. L’activation de la petite GTPase Rho par SHH est indépendante du cil.

On travaille avec des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) sauvages (WT) ou délétés pour Kif3a qui code une
protéine nécessaire au développement du cil primaire (Kif3a-/-). (A) Western blot de l’expression endogène de KIF3A
dans des lysats cellulaires des différentes cellules. p38 a été utilisé comme témoin de charge. (B) Coloration des cils
primaires par immunofluorescence avec un anticorps reconnaissant l’α-tubuline acétylée (vert) dans les cellules. Les
noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI. Le graphique à barres montre le % moyen ± SEM de cellules ciliées dans
les deux génotypes. (C) Induction de GLI1 dans les MEF WT et Kif3a-/- après 24h de privation de sérum suivie d’une
incubation de 48h en présence de véhicule (-), de 2,5 µg/ml SHH, ou 5 µM purmorphamine (PUR), un activateur de
la voie Shh. (D,E) Etude par western-blot et quantification de Rho activé (lié au GTP) sur la quantité de Rho total dans
les MEF avec les différents génotypes avec des durées différentes de stimulation avec SHH. Les rapports ont été
exprimés relativement à t = 0.

Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0203170

Une fois que Patched est inactivé par Hedgehog, Smoothened rentre dans le cil et il inactive la PKA
et SuFu qui faisait se transformer les facteurs de transcription Gli en leur forme répressive (GliR,
clivés et réduits à leur partie C-terminale). Les Gli prennent donc une forme activatrice de la
transcription quand la voie Hedgehog est activée. Ce sont des facteurs de transcription dont le
domaine de fixation à l’ADN est à doigts de zinc. En présence de Hedgehog, Gli2 et Gli3 ne sont plus
clivés et possèdent une partie N-terminale qui les rend activateur de la transcription (GliA). Gli1 est
toujours activateur de la transcription mais il est très peu exprimé en absence de Hedgehog. Il est
l’une des premières cibles de l’activation de la voie Hedgehog et de Gli2 et de Gli3 et sa présence
renforce l’activation des gènes cibles.
373
 *Figure 6-34. Différentes réponses en fonction de la dose de Hedgehog selon l'état activateur ou répresseur des Gli
(NB : Gli1 ne peut être qu'activateur). Les cellules compétentes à recevoir le signal Hedgehog (Hh) hébergent des
rapports variables de GliR et GliA, ce qui se traduit par l'activation transcriptionnelle différentielle de gènes cibles de
Gli. En l'absence de Hh, la majorité des Gli existent sous forme de Gli R, ce qui conduit à la répression d'un sous-
ensemble de gènes cibles Gli (gène A), et la protéine Gli pleine longueur est maintenue inactive par des mécanismes
inhibiteurs. Le gène A est déréprimé lorsque les niveaux de GliR sont réduits en réponse à la stimulation Hh. La
signalisation Hh conduit à l'activation de protéine Gli pleine longueur préexistante (formant Gli A), ce qui entraîne la
transcription du gène B, que de faibles niveaux de GliA peuvent activer. Le gène C est transcrit plus tard lorsque des
niveaux plus élevés de GliA sont présents (notamment grâce au renfort de Gli1). Source :
https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-cellbio-092910-154048

Les gènes Gli1, Gli2 et Gli3 forment une famille multigénique qui a évolué par duplication de gènes. Les
Protostomiens tels que la drosophile et les cordés non vertébrés tels que l'ascidie ou Amphioxus n'ont qu'un
seul gène Gli (appelé Cubitus interruptus chez la drosophile) donc les duplications ont eu probablement eu
lieu au début de l'histoire évolutive des Vertébrés (Islam et al., 2010).

Shh inactive Sufu en favorisant sa poly-ubiquitinylation sur la lysine 257, ce qui conduit à sa dégradation
dans le protéasome. C’est la protéine E3 ligase Fbxl17 qui cible Sufu (Raducu et al., 2016). La
phosphorylation de Sufu sur les Ser-346 et 342 par la PKA et la glycogène synthase kinase 3β (GSK3β)
stabilise Sufu contre la dégradation induite par Shh.
**Figure 6-35. Interactions entre la protéine E3 ligase
Fbxl17, Sufu et les facteurs de transcription Gli. Source :
https://www.embopress.org/doi/epdf/10.15252/embj.201593374

PKA intervient aussi dans la conversion de GliA en GliR. Lors de la fixation de Shh, le récepteur à 7 domaines
transmembranaires GPR175 (aussi nommé TPRA1) est transloqué dans le cil et active la protéine G α-i ce
qui diminue la quantité d’AMPcyclique (AMPc) et réduit l’activité de PKA (Singh et al., 2015).

374
 *Figure 6-36. La déplétion de Gpr175 altère la
signalisation Hh. (A) pourcentage d’activité luciférase
par rapport au contrôle dans des fibroblastes de souris
transfectés avec un vecteur permettant d’exprimer la
luciférase sous le contrôle de séquences activés par Gli
(Gli-Luc). Les cellules sont traitées par des siARN
contrôle (NTC), des siARN contre Ift88 (qui code une
protéine nécessaire au fonctionnement du cil et donc de
la signalisation Hh) et siARN contre Gpr175 en présence
(noir) ou en absence de Hh (gris). (B) Etude par RT-qPCR
de l’expression de Gli1 endogène dans les cellules
soumises aux conditions indiquées (Gli1 étant ici étudié
comme une cible de la voie Hh). Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)39576-4/fulltext

BILAN DE LA SIGNALISATION Hedgehog :

*Figure 6-37. Voie de signalisation Hedgehog. A gauche : En l’absence de Hh, Ptch1 dans le cil primaire supprime
l’activité de Smo et empêche sa localisation dans le cil. Gpr175 n’est pas présent dans le cil et donc n’interagit pas
avec le Gα-i ciliaire conduisant à des concentrations locales élevées d’AMPc. L’AMPc stimule la PKA (les astérisques
désignent les formes actives de toutes les protéines) qui phosphoryle Gli3 pleine longueur (et Gli2; Gli-FL), ce qui
déclenche le clivage de Gli3 dans sa forme répresseur (Gli-R). Gli3-R réprime l’activation transcriptionnelle des gènes
cibles de la voie Hh. A droite : En présence de Hh, Ptch1 est retiré du cil, permettant à Smo d’entrer dans le cil et
d’être activé. Cela conduit à l’accumulation de Gpr175 dans les cils, où il interagit avec Gα-i ce qui inhibe la production
locale d’AMPc, empêchant l’activité de la PKA et le clivage Gli3. Le complexe SuFuGli-FL s’accumule à la pointe du cil
primaire se dissocie et Gli-FL activé (GliA*) sort du cil et pénètre dans le noyau ce qui active la transcription des
gènes cibles de Hh tels que Gli1. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)39576-4/fulltext

Des molécules peuvent activer ou atténuer la voie de signalisation Hedgehog. Par exemple, les protéines
Cdo et Boc qui appartiennent à la famille N-CAM et qui sont exprimés à la membrane plasmique
interagissent avec Shh et facilitent son interaction avec le récepteur Patched. Lors de la polarisation dorso-
ventrale du tube neural, Cdo est exprimé dans la plaque du plancher où Shh est exprimé tandis que Boc est
exprimé dans les régions les plus dorsales atteintes par le gradient morphogène de Shh. La surexpression
de Boc ou de Cdo aboutit à une ventralisation cellulaire-autonome des cellules où a lieu cette surexpression
mais les cellules aux alentours sont dorsalisés, ce qui indique bien un effet potentiateur de la signalisation
Shh pour les cellules qui expriment Boc ou Cdo mais la séquestration de Shh par ces molécules aboutit à
appauvrir la région autour en Shh et a donc un effet dorsalisant (Tenzen et al., 2006). Dans diverses tumeurs,
Cdo induit une apoptose en activant la cascade des caspases à moins que Shh n'interagisse avec lui (Delloye-
Bourgeois et al., 2013). Inhiber la production de Shh peut alors s'avérer une stratégie anti-tumorale
intéressante.
375
 **Figure 6-38. L'inhibition de Shh a des effets anti-tumoraux via une apoptose dépendante de Cdo (ou autre nom,
Cdon ici). Des cellules humaines A549 dérivées d'une tumeur du poumon sont transfectées avec un siARN contrôle
(scr. = séquence aléatoire) ou un siARN Shh et/ou un siARN CDON, inhibant la production de Shh et/ou CDO (=CDON)
respectivement. Les cellules sont ensuite greffées en sous-cutané sur des souris immunodéficientes nude et on suit
la taille des tumeurs et l'activité apoptotique de la caspase-3. Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.1001623

De son côté, la protéine TMED2 retient SMO dans le réticulum endoplasmique et dans l'appareil de Golgi
diminuant ainsi la présence de SMO à la membrane plasmique. La voie de signalisation SHH est ainsi moins
activée dans les cellules-cibles (Di Minin et al., 2022).
**Figure 6-39. TMED2 est un régulateur négatif de la
signalisation SHH lors de la différenciation neuronale.
Des cellules ES sont différenciées en neurones avec un
protocole qui rappelle la différenciation ventrale dans le
tube neural. Une immunofluorescence est réalisée avec
des anticorps reconnaissant OLIG2 (vert) ou NKX2.2
(rouge) qui sont exprimées habituellement dans la partie
ventrale du tube neurale sous l'influence de SHH. On
constate que la présence de SHH dans le milieu est
nécessaire à l'activation de l'expression de ces 2
protéines (avec une activation modérée de OLIG2 et une
faible activation de NKX2.2 avec les doses de SHH
utilisées). Cette activation dépend de SMO car les cellules
ES Smo-/- n'activent pas l'expression de ces protéines.
Dans 2 lignées de cellules ES Tmed2-/-, OLIG2 et surtout
NKX2.2 sont exprimées de manière plus importante, ce
qui montre que Tmed2 est nécessaire pour moduler
l'activité SHH dans les cellules. Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3001596

En plus de la cascade canonique dépendante de Gli, il existe un certain nombre de voies non canoniques
indépendantes de Gli, opérant via la kinase de la famille Src (Sloan et al., 2015; Yam et al., 2009), les petites
GTPases Rac1 et RhoA (Ho Wei et al., 2018; Polizio et al., 2011), l’activation de NF-ĸB via PKC (Qu et al.,
2013) et de l’axe Ca2 + -Ampk (Teperino et al., 2012).

Des tératogènes perturbent la voie Hedgehog, notamment la cyclopamine, un alcaloïde stéroïde

produite par une Liliacée (Veratrum californicum) qui inhibe la voie Hedgehog en se fixant sur
Smoothened. Citons également le piperonylbutoxide qui est présent dans des pesticides (Everson et al.,
2019).

Hedgehog dans la mise en place de l’axe antéro-postérieur du disque imaginal de l’aile de drosophile
Dans les disques imaginaux des ailes de drosophile, Hh est sécrété dans le compartiment postérieur (P) et
se propage vers le compartiment antérieur (A) (Capdevila et al., 1994 ; Tabata et Kornberg, 1994). La
376
signalisation Hh ne se produit pas dans les cellules du compartiment P car elles n’expriment pas de
composants critiques de la voie Hh, tels que l’effecteur transcriptionnel Ci qui est l’orthologue des facteurs
de transcription Gli des Vertébrés (Eaton et Kornberg, 1990). En revanche, les cellules du compartiment A
peuvent recevoir et répondre à Hh mais sont incapables de produire Hh. Dans les cellules du compartiment
A situées à proximité de la source de production de ligands Hh à la frontière A/P, la signalisation Hh
déclenche l’activité de la voie et, par conséquent, une augmentation de la transcription des gènes cibles
(Ingham et al., 1991 ; Basler et Struhl, 1994 ; Capdevila et al., 1994 ; Tabata et Kornberg, 1994 ; Chen et
Struhl, 1996).

*Figure 6-40. La surexpression de Hedgehog dans la région antérieure de l’aile provoque une duplication en miroir.
Grâce au système UAS-GAL4, l’expression de Hh a été mise indirectement via GAL4 sous le contrôle du promoteur
d’un gène exprimé dans la région antérieure (vers le haut). B est un agrandissement d’une région de A. La
numérotation correspond aux différentes veines.

Source : https://www.embopress.org/doi/epdf/10.1002/j.1460-2075.1994.tb06768.x

Dans une recherche de lipides endogènes qui agissent comme des antagonistes des SMO, les endocannabinoïdes ont été
identifiés comme inhibiteurs de la signalisation Hedgehog (Khaliullina et al., 2015). Leur action en tant qu’inhibiteurs de
la voie HH a pu être démontrée à la fois dans le développement des disques alaires de la drosophile et dans les cellules de
mammifères en culture. Les endocannabinoïdes sont des acides gras/alcools liés à des groupes de tête polaire qui agissent
via les récepteurs aux cannabinoïdes GPCR de type 1 (CB1R; CNR1) et de type 2 (CB2R; CNR2) (Lu et Mackie, 2020;
Maccarrone et al., 2015). Les phytocannabinoïdes sont des ingrédients bioactifs du cannabis et comprennent le Δ9-
tétrahydrocannabinol (THC) et le cannabidiol (CBD), le premier étant le principal composant psychoactif. Ces composés
exercent leurs effets via CB1R, CB2R et/ou d’autres récepteurs, le CB1R étant responsable de la médiation des principaux
effets neurocomportementaux du THC (Lu et Mackie, 2020 ; Schurman et al., 2020). THC et le CBD inhibent la signalisation
HH de la même manière que les endocannabinoïdes, (Khaliullina et al., 2015). Ces résultats soulèvent la possibilité que
l’exposition in utero aux phytocannabinoïdes puisse être tératogène, en raison de sa capacité à inhiber la signalisation HH
à des moment-clés du développement. Le THC est en effet tératogène pour les souris génétiquement sensibilisées qui
présentant une activation moindre de la voie HH. Le THC a induit des phénotypes de perte de fonction de HH de manière
dose-dépendante, notamment une holoprosencéphalie (pas de séparation du télencéphale en deux hémisphères), une
malformation typique d’une perte de la voie Hedgehog (Chiang et al., 1996 ; Cohen et Shiota, 2002). Le THC agit donc
comme un « tératogène conditionnel », dépendant du contexte génétique car les souris sauvages n’ont pas présenté de
phénotypes.
Shh, développement du cervelet et cancer
Shh est impliqué dans le développement du cervelet post-natal et a été impliqué dans la genèse de 25 à 30%
des médulloblastomes, un type de cancer touchant essentiellement les enfants qui se développe dans le
cervelet. Des mutations de PATCHED-1, de SMO et de SUFU ont été caractérisées dans ces tumeurs (Tamayo-
Orrego et Charron, 2019). Les cellules tumorales expriment le marqueur Atoh1 des précurseurs des cellules
granulaires et ces dernières sont très probablement les cellules d’origine des cellules tumorales. Cet
exemple illustre le fait que les cellules tumorales gardent une signature des cellules qui leur ont donné
naissance. Cela affecte les propriétés de ces cellules et donc le pronostic et les traitements à mettre en
œuvre.

377
 **Figure 6-41. Rôle de SHH au cours du développement postnatal du cervelet. Les précurseurs des cellules
granulaires (GCP), les progéniteurs qui donnent naissance aux neurones granulaires, prolifèrent dans la couche
externe (EGL) du cervelet en réponse à SHH produit par les neurones de Purkinje. Les neurones granulaires peuplent
ensuite la couche cellulaire interne granulaire (IGL) après que les GCP aient migré à travers la couche cellulaire de
Purkinje en utilisant les prolongements radiaux de la glie de Bergmann. Le pic de prolifération de GCP s’étend sur les
sept premiers jours postnataux chez la souris ; chez l’Homme, il s’étend de la seconde moitié de la gestation au
sixième mois postnatal. Une suractivation de la voie SHH dans les GCP mène à l’apparition d’un sous-type particulier
de médulloblastome. Source : https://f1000research.com/articles/8-1823/v1

**Figure 6-42. Effet de mutations perte-de-fonction de

Patched1 et de p53 sur le développement du cervelet.
A gauche, coupe transversale dans le cervelet d'une
souris sauvage de 5 semaines. A droite, coupe
transversale dans le cervelet d'une souris du même
âge avec un génotype Ptc+/–;p53–/–. La mutation perte-
de-fonction de Patched empêche son action inhibitrice
sur la voie Shh. Lorsqu'on traite les souris mutées avec
un inhibiteur de Smoothened, le cervelet est normal.
Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610804002417

Notez que la signalisation Shh est impliquée dans d'autres types de tumeurs, notamment le carcinome
basocellulaire qui est le cancer le plus fréquent de la peau (Gambini et al., 2022). On y trouve fréquemment
des mutations perte-de-fonction du gène codant PATCHED1.

La famille TGFβ et ses voies de signalisation

a famille des ligands de type TGFβ et les voies de signalisation associées jouent un rôle

L
fondamental dans de multiples processus cellulaires au cours du développement
embryonnaire. Le rôle d’un seul membre de cette famille est souvent multiple (effets
pleïotropiques) selon le principe général que les voies de signalisation sont souvent réutilisées
de multiples fois au cours du développement dans des localisations différentes. Il faut les considérer
comme des modules dont les entrées et les sorties dépendent largement du contexte.

TGF-β
Après excrétion par les cellules productrices, le ligand TGF-β est essentiellement présent sous une forme
latente car associé à la protéine LAP. Une interaction avec des intégrines (αvβ8 ou αvβ6 par exemple)
permet à TGF-β de prendre sa conformation active, de quitter LAP et de s'associer à ses récepteurs (Brown
et Marshall, 2019).

La signalisation TGF-β passe par deux types de récepteurs transmembranaires à sérine-thréonine

kinase. La liaison du ligand au récepteur TGF-β de type II (TβRII) stabilise la formation d'un
complexe avec le récepteur TGF-β de type I (TβRI) et induit l'activation du récepteur TβRI par la
kinase du récepteur TβRII. Les SMADs agissent alors comme effecteurs de signalisation. La
378
phosphorylation C-terminale de Smad2 ou SMAD3 par TβRI entraîne un changement de
conformation qui favorise l'hétéromérisation avec SMAD4 et stimule la translocation nucléaire des
complexes SMAD. Dans le noyau, les protéines SMAD régulent la transcription en se liant à l'ADN et
en interagissant avec d'autres facteurs de transcription.

*Figure 6-43. Voie de signalisation de TGF-β. Source : https://www.mdpi.com/1422-0067/22/14/7575/htm

Cette interaction avec d’autres facteurs est nécessaire car les complexes SMAD ont une faible affinité pour
l’ADN. Phospho-SMAD3 se lie directement à l’ADN avec SMAD4 au niveau d’éléments spécifiques de liaison
à SMAD. Les complexes Phospho-SMAD2-SMAD4, en revanche, ne se lient pas directement à l’ADN mais sont
recrutés par d’autres facteurs de transcription, le premier caractérisé étant le facteur de transcription
forkhead, FOXH1 (anciennement appelé Fast1) (Chen et al., 1996).

Le TGF-β régule la différenciation mésenchymateuse, inhibant la différenciation des ostéoblastes, des

myoblastes et des adipocytes.
*Figure 6-44. TGF-β inhibe la différenciation des
myoblastes C2C12. (a,b) Les cellules C2C12 ont été
induits à se différencier en milieu témoin (a) ou en milieu
supplémenté en TGF-β (b). Les myotubes ont été colorés
en immunofluorescence pour la chaîne lourde de
myosine (CMH) (vert). Les noyaux ont été colorés au
DAPI (bleu). La barre d’échelle indique 100 µm. (c,d)
Indice de fusion, défini comme le nombre de myotubes
avec ≥ 2 noyaux/nombre total de noyaux et l’indice de
différenciation défini comme le nombre de noyaux dans
les myotubes MHC+. Le nombre total de noyaux a été
réduit par le traitement au TGF-β. (e,f,g,h,i) Dans les
myoblastes et les myotubes, les niveaux de
phosphorylation de SMAD2 (f,g) et de SMAD3 (h,i) vus
par western-blot ont augmenté après 1 h de traitement
au TGF-β. LY364947 est un inhibiteur du récepteur de
TGF-β. Pan-actine sert de contrôle de chargement. Les
niveaux de phosphorylation sont affichés sous forme
d’intensité relative de pSMAD/SMAD total. Les données
sont normalisées aux valeurs de la condition de contrôle.
Source : https://www.mdpi.com/2073-
4409/9/2/375/pdf

379
C’est SMAD3, et non SMAD2, qui médie cette inhibition par le TGF-β de la différenciation des ostéoblastes
et des myoblastes. Dans ce dernier cas, SMAD3 interagit physiquement avec MyoD et perturbe sa liaison à
l’ADN, réduisant ainsi l’expression génique spécifique au muscle. Dans l’inhibition de la différenciation
ostéoblastique médiée par le TGF-β, SMAD3 réprime la fonction de CBFA1 sans perturber sa liaison à l’ADN.

C’est encore SMAD3 qui inhibe la différenciation adipocytaire en aval de TGF-β. L’adipogenèse, activée par
C/EBPβ ou C/EBPδ, est inhibée par TGF-β sans diminution des niveaux de protéine C/EBP. Les C/EBP
interagissent physiquement à la fois avec SMAD3 et SMAD4, et cette interaction est corrélée à la répression
de la transcription médiée par C/EBP au niveau des promoteurs des gènes codant des protéines essentielles
pour la différenciation adipocytaire, avec des sites de liaison C/EBP multimérisés. Mais l’action de SMAD3
et SMAD4 n’affectent pas la liaison de C/EBP à ces séquences cibles. Ces données représentent le premier
exemple d’inhibition directe de la fonction de transactivation d’un facteur de transcription par SMADs (Choy
et Derinck, 2003).

D’une manière générale, la signalisation TGF-β a une fonction pro-matrice extracellulaire (MEC). Elle
favorise le dépôt net de la matrice en augmentant l’expression de composants spécifiques de la MEC tels
que la fibronectine et le collagène, en activant l’expression des inhibiteurs des protéases de la MEC tels que
l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène-1 (PAI-1) et les inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases
matricielles (TIMPs), tout en diminuant l’expression des protéases qui dégradent les composants de la
matrice, comme la collagénase interstitielle.
**Figure 6-45. L’induction de l’expression de la
fibronectine par TGF-β nécessite l’activation de la
kinase JNK. (A) L’induction de l’expression de la
fibronectine après stimulation par le TGF-β a été
testée dans des cellules BAHgpt (une lignée de
fibrosarcome humain) transfectées avec un vecteur
d’expression vide ou permettant d’exprimer JNKDN
(une forme dominante-négative de JNK1), MKK4DN
(une forme dominante-négative de MKK4 (MKK4 est
un activateur de la voie JNK) et p38DN (une forme
dominante-négative de p38) par western-blot. (Il
manque un contrôle de dépôt à ce western-blot).
Source : https://www.embopress.org/doi/full/10.1093/emboj/18.5.1345

Comme nous le voyons sur la figure ci-dessus, l’activation de l’expression de la fibronectine passe par une
voie de signalisation particulière, la voie de signalisation JNK. Une autre voie de signalisation, la voie p38
aboutissant à l’activation de ATF-2 et CREB ne semble pas impliquée (Hocevar et al., 1999).

Cette stimulation de la production de la MEC par TGF-β en fait un des acteurs majeurs de la fibrose où du
tissu abîmé est remplacé généralement par des fibroblastes et de la MEC qui n'est pas fonctionnelle
(Fragogiannis, 2020).

Dans certains contextes cependant, notamment cancéreux, la signalisation TGF-β peut au contraire stimuler
la dégradation de la MEC via l’activation de l’expression des métalloprotéinases, notamment MMP-9. TGF-β
agit à ce moment-là non pas par les SMAD mais par l’intermédiaire de TAK1 (pour TGF-β activated kinase)
qui agit à son tour sur JNK et p38 comme cela a été démontré dans des cellules tumorales de cancer du sein
(Safina et al., 2007). TGF-β peut favoriser la progression tumorale en favorisant les transitions épithélio-
mésenchymateuses (EMT) (voir Figure 5-119a et b).

Outre l'activation de l'expression des coordinateurs majeurs de l'EMT, les facteurs de transcription de la
famille Snail/Twist, les récepteurs TGF-β peuvent avoir un rôle plus direct : Par6, un régulateur de la
polarité des cellules épithéliales et de l'assemblage des jonctions serrées, interagit avec les récepteurs TGF-
β et est phosphorylée par le récepteur de type II, TGF-βRII. La phosphorylation de Par6 est nécessaire pour
l'EMT dépendant du TGF-β dans les cellules épithéliales de la glande mammaire et contrôle l'interaction de
Par6 avec l'ubiquitine ligase E3 Smurf1. Smurf1, à son tour, cible la petite GTPase RhoA pour la dégradation,
entraînant ainsi une perte de jonctions serrées (Ozdamar et al., 2005).
380
 **Figure 6-46. Action directe des récepteurs TGF-β sur Par6 qui se répercute sur la dégradation de RhoA qui contrôle
la polarité des cellules épithéliales. L'activation des récepteurs par le ligand TGF-β aboutit (entre autres) à la
phosphorylation de Par6 qui permet de recruter Smurf qui est une E3-ubiquitine ligase. Smurf ubiquitinyle RhoA ce
qui provoque sa dégradation. Source : https://www.science.org/doi/10.1126/science.1105718

Dans d'autres contextes, TGF-β peut avoir une action anti-tumorale. Dans un type particulier de cancer du
côlon, on peut ainsi trouver des mutations du récepteur de TGF-β qui le rendent inactif et la signalisation
TGF-β ne peut plus exercer son action modératrice sur la prolifération des cellules de carcinome du colon.
**Figure 6-47. Une mutation qui tronque le récepteur au
TGF-β est associée à certains types de cancer du colon.
Le récepteur TGF-β de type II (TGF-βRII) est
fréquemment inactivé dans certains types de cancers du
côlon. Dans l'ADN qui a été séquencé ici, les deux
derniers adénines (en gras) ont été délétées et le
cadre de lecture lors de la traduction s'en trouve décalé.
Il s'agit d'une mutation non-sens qui cause une fin
prématurée de la traduction à cause de la présence d'un
codon STOP dans le nouveau cadre de lecture. Le
récepteur tronqué perd son domaine de signalisation
intracellulaire C-terminal qui est crucial pour sa
fonction. Cette perte permet aux cellules du carcinome
du côlon de devenir résistantes aux effets inhibiteurs de
croissance du TGF-β. Source :
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9872311/

BMP
Les membres de la famille BMP se distinguent des autres membres de la superfamille TGF-β en ayant sept
(plutôt que neuf) cystéines conservées dans la protéine mature. Ils ont été d’abord caractérisés par leur
capacité à faire différencier les ostéoblastes en ostéocytes mais leurs fonctions sont très variées.
Signalons que malgré son nom, BMP1 est à part dans la famille, et est une protéase.

En général, les BMP agissent en tant qu’homodimères mais des hétérodimères ont aussi été caractérisés
(BMP2/7 ou BMP4/7 par exemple) (Hazama et al., 1995; Bi et al., 2013).

381
 **Figure 6-48. La différenciation des ostéoblastes
murins (cellules MC3T3-E1) est stimulée par des
hétérodimères BMP2/BMP7.

Des pré-ostéoblastes sont soumis pendant 28 jours

aux différents traitements puis une coloration
rouge alizarine qui met en évidence la matrice
extracellulaire osseuse (marqueur d’une
différenciation des pré-ostéoblastes en
ostéoblastes) est effectuée. ATRA = Acide
rétinoïque tout-trans, une molécule impliquée
dans la résorption osseuse et l’ostéoporose. Source
: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0078198

Les voies de signalisation activées ressemblent à celles de TGF-β mais ce sont les SMAD-1, -5 et -8
qui sont activées et non pas les SMAD-2 et -3. SMAD4 est toujours impliqué.

Les BMP sont fortement impliqués dans la mise en place de l’axe dorso-ventral et antéro-postérieur
chez les Vertébrés.

382
*Figure 6-49. L'inhibition de l'expression de Bmp2, Bmp4 et Bmp7 par des morpholinos antisens inhibe
la phosphorylation endogène de Smad1 et provoquent une dorsalisation et des troncatures postérieures
des embryons de xénope. (A) Conception des morpholinos (MO) antisens Bmp4, Bmp7 et Bmp2 qui
ciblent le codon de démarrage de la traduction dans les deux pseudoallèles exprimés dans l'espèce
subtétraploïde X. laevis. (B) La traduction in vitro en présence d'acides aminés marqués au S 35de Bmp4,
Bmp7 et Bmp2 est spécifiquement inhibée par les MO respectifs. (C) Les MO pour Bmp2, Bmp4 et Bmp7
(à 12 ng chacun) ont été injectés seuls ou en combinaison dans les 4 blastomères d'un embryon de
xénope. (D) La phosphorylation de Smad1 dans les embryons de stade 11 est diminuée par la co-injection
de plusieurs MO de Bmp. (E-H) Les embryons injectés par Bmp4 MO (F) sont dorsalisés avec des têtes
élargies (comparer avec les embryons de contrôle, E). Les pointes de flèches rouges délimitent le
marqueur de la moelle épinière Hoxb9 (> 85 %, n = 60). (G) Le phénotype dorsalisé induit par le MO
Bmp4 est sauvé par micro-injection de 100 pg d'ARNm Bmp4 de souris. (H) La microinjection d'ARNm
de souris Bmp4 seul (100 pg) donne des embryons ventralisés avec de petites têtes, sans yeux et des
structures de moelle épinière réduites (pointes de flèches rouges). (I-L) Les embryons déplétés en Bmp4
(J) se développent en têtards nageurs sans nageoires ventrales et avec des têtes légèrement plus grosses
que les embryons témoins (I). Notez la position de l'anus, qui est déplacé (postériorisé) jusqu'au bout de
la queue (tête de flèche blanche ; >72 %, n=61). (K) Les têtards déplétés en Bmp7 se développent avec
une perte partielle de la nageoire ventrale et un anus postérieur (tête de flèche blanche ;> 79 %, n = 51).
(L) La double déplétion de Bmp4 et Bmp7 se traduit par des têtards dépourvus de structures de queue
(> 90 %, n = 39). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/132/15/3381/52502/Depletion-of-Bmp2-Bmp4-Bmp7-and-Spemann-organizer

383
 *Figure 6-50. Phosphorylation différentielle
de SMAD1/5 selon l’axe dorso-ventral lors de
la gastrulation chez le poisson-zèbre. Des
embryons de poisson-zèbre sauvage (CTRL)
ou muté n’exprimant plus SMAD4
(MZsmad4a) à 40% d’épibolie sont fixés puis
traités en immunofluorescence avec des
anticorps reconnaissant les formes
phosphorylées de SMAD1 et 5 (vert) et avec
du DAPI reconnaissant l’ADN (violet). Le côté
dorsal est à droite. On constate un gradient
d’activité de la voie BMP plus important du
côté ventral et une diminution progressive
vers le côté dorsal. SMAD4, auquel les formes
phosphorylées de SMAD1 et 5 s’associent
doit être présent. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-021-26486-3

SMAD4 est commun entre la voie de TGF-, la voie des BMP et la voie de Nodal (voir plus loin pour la voie
Nodal). Chez le poisson-zèbre, BMP a besoin de SMAD4 en aval pour activer correctement ses gènes cibles
alors que Nodal peut quand même activer ses propres gènes cibles via des voies de signalisation de
compensation (Guglielmi et al., 2021).

**Figure 6-51. SMAD4 est nécessaire à l’activation par BMP de ses cibles mais pas pour Nodal. Des embryons de
poisson zèbre sauvages et mutants (MZsmad4a) n’exprimant plus SMAD4 ont été soumis à une analyse
transcriptomique RNAseq et les gènes ont été classés selon qu’ils sont des cibles de la voie de signalisation BMP ou
des cibles de la voie de signalisation Nodal. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-26486-3

Les ligands BMP peuvent être piégés dans l'espace intercellulaire et empêchés d'agir sur leurs
récepteurs par diverses protéines sécrétées : Chordine, Noggin, Follistatine et Gremlin. Cette
inhibition a des fonctions très importantes lors de la mise en place des axes, du contrôle de l'apoptose
interdigitale ou lors de la formation du cortex (Ichinose et al., 2021).

384
 *Figure 6-52. Gremlin est nécessaire à la bonne
formation des couches internes du cortex. Le cortex
d'embryons de souris à E20,5 est fixé puis observé en
coupes en immunofluorescence avec un anticorps
reconnaissant les formes phosphorylées de SMAD1/5/8
(activées par BMP) et un anticorps reconnaissant Ctip2,
un marqueur des couches internes V/VI du cortex. Les
souris sont soit Grem1flox/flox (mais sans Cre
recombinase) soit Grem1cKO, c'est à dire avec une
délétion des 2 allèles codant Gremlin1 par une Cre
exprimée dans le cortex. On constate que sans Gremlin1,
la voie BMP est anormalement activée dans les couches
V/VI du cortex et cela a pour conséquence une épaisseur
plus faible de ces couches (vue sur coupe avec coloration
de Nissl). Barres d'échelle = 100 µm. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/148/14/dev195883/270850/The-BMP-antagonist-gremlin-1-contributes-to-the

La signalisation BMP peut aussi être modulée à la hausse ou à la baisse par différents acteurs
intracellulaires. Smurf1 est une E3 ubiquitine ligase qui active la dégradation des récepteurs aux BMP ainsi
que de SMAD1/5 (Murakami et Etlinger, 2019). Le recrutement de Smurf1 peut être facilité par SMAD6 et
SMAD7 qui peuvent également se fixer sur les récepteurs BMP activés de type I et bloquer la
phosphorylation des SMAD1/5/8 (Yan et al., 2009).

Bambi a, quant à lui, une structure très proche des récepteurs de type I de BMPR, mais a un domaine
intracellulaire raccourci, sans aucune activité sérine/thréonine kinase. Il s’agit donc d’un pseudo-récepteur,
qui joue un rôle de dominant-négatif en bloquant les interactions entre les récepteurs de type I et de type II
(Ornichtchouk et al., 1999). Bambi bloque non seulement la signalisation BMP, mais aussi TGF- et Nodal.
Bambi interagit en plus avec le récepteur aux Wnt, Frizzled et aussi avec son effecteur Dishevelled et il
facilite leur interaction, ce qui facilite l’activation de la voie canonique Wnt/-caténine (Lin et al., 2008). On
voit donc que Bambi inhibe la voie de signalisation BMP (et apparenté) pour activer une autre voie de
signalisation concurrente, Wnt.

La calcineurine qui est une phosphatase activée par les ions Ca 2+ est capable de déphosphoryler SMAD1/5
et donc d’inhiber la voie de signalisation BMP. Ce rôle a été démontré en aval des FGF qui activent une voie
de signalisation menant à une augmentation de Ca2+ cytoplasmique et donc à l’activation de la calcineurine
dans le futur tissu neural chez la souris (Cho et al. 2014). Ainsi, les FGF contribuent à l’induction neurale (en
plus de Chordine et de Noggin qui capturent les BMP avant qu’ils n’atteignent leurs récepteurs).

FHL3 est, au contraire, une protéine qui facilite la signalisation BMP en stimulant la fixation des complexes
SMAD1/5/8-SMAD4 sur les séquences régulatrices de ses gènes-cibles. Le gène codant Wnt8 est ainsi plus
fortement activé en aval de la signalisation BMP en présence de FHL3 et cela permet de mieux induire de la
bordure neurale dans un premier temps puis de mieux spécifier les cellules de crêtes neurales dans un
deuxième temps (Alkobtawi et al., 2021).

385
 **Figure 6-53. FHL3 renforce la signalisation BMP deux fois lors de la formation des cellules de crêtes neurales. Au
stade jeune neurula, FHL3 renforce la signalisation BMP dans le mésoderme paraxial ce qui permet d’augmenter
l’expression de Wnt8 qui diffuse vers la bordure neurale sus-jacente et induit l’expression de gènes importants pour
la formation des cellules de crêtes neurales. Plus tard, au stade neurula âgée, FHL3 renforce à nouveau la
signalisation BMP dans la bordure neurale ce qui permet de produire à nouveau plus de Wnt8 qui par un mécanisme
autocrine favorise la spécification des crêtes neurales. Dans les 2 cas, FHL3 interagit directement avec le complexe
SMAD1/5/8/SMAD4 et facilite sa fixation sur le promoteur de Wnt8. NB = bordure neurale ; NC = crêtes neurales.
NP = plaque neurale.

SMAD1/5/8 peuvent avoir des fonctions indépendantes de SMAD4. Notamment, ils peuvent se fixer sur le
complexe Drosha et accélérer la maturation de pri-miARN en microARN. C’est le cas pour le microARN miR-
21 qui contrôle la différenciation des cellules musculaires lisses de la paroi des vaisseaux sanguins sous le
contrôle des BMP.
**Figure 6-54. BMP4 active la maturation des
précurseurs du miARN miR-21 en provoquant la liaison
de SMAD1/5 avec le complexe Drosha (b) Des cellules
musculaires lisses ont été transfectées avec des siRNA
de contrôle (Control-siRNA) ou des siRNA contre p68
(p68-siARN) p68 est un composant du complexe Drosha
qui participe au processus de maturation des pri-miARN
en pré-miARN (qui deviennent ensuite des microARN).
L’expression de pri-miR-21, pré-miR-21 et miR-21
mature a été examinée après un traitement de 2h avec
BMP4. (c) Extraits nucléaires préparés à partir de
cellules traitées avec BMP4 (2h) et soumis à une
immunoprécipitation avec des anticorps anti-p68, anti-
DROSHA, ou IgG non spécifique (contrôle), suivi d’une
immunodétection sur western-blot avec anti-SMAD1/5,
anti-p68 ou anti-DROSHA. Le signal des anticorps anti-
lamine A/C sert de contrôle. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2653422/pdf/nihms-95861.pdf

Nodal
Les ligands de la famille Nodal empruntent en partie les mêmes voies que la signalisation TGFβ. Cependant,
les récepteurs, les gènes cibles et les interactants régulateurs sont différents.

386
 **Figure 6-55. Production, maturation de Nodal et voies de signalisation activées par Nodal. Les niveaux d'expression
de Nodal sont affectés par l'activité de la super-famille miR-430. Une fois la protéine traduite, elle doit être traitée
dans l'espace extracellulaire par des convertases (Furine et PACE4). L'interaction de Nodal avec les BMP (BMP3,
BMP7), Lefty ou avec Cerberus à l'extérieur des cellules affecte sa capacité à se lier aux récepteurs. Nodal se lie aux
récepteurs I et II de l'Activine et au co-récepteur Cripto/Criptic qui phosphorylent Smad2/3 (comme TGFβ). Ces
Smads forment un complexe avec Smad4 et entrent dans le noyau et avec l'aide de p53, Mixer ou FoxH1 activent la
transcription des gènes (notamment ceux impliqués dans l'induction du mésoderme et de l'endoderme).
Ectodermine, PPM1A, XFDR et Tgf1 inhibent la voie en entrant en compétition avec les composants de Smad ou les
facteurs de transcription. Notez que Nodal et son répresseur Lefty peuvent tous deux exprimés en réponse à la
signalisation Nodal, ce qui provoque des rétroactions positives ou négatives. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Nodal_signaling_pathway#/media/File:Nodal_signaling.jpg

L'activine et Nodal partagent les mêmes récepteurs et activent les mêmes voies de signalisation. Souvent,
on utilise l'activine plutôt que Nodal comme ligand pour des cultures in vitro car elle est plus facile à
produire en tant que protéine recombinante.

La protéine Lefty est un antagoniste de Nodal et elle agit de 2 manières : en se fixant sur Nodal directement
et en se fixant au co-récepteur Cripto et en empêchant l’interaction de Nodal avec lui de manière
compétitive. Le gène codant Lefty est une cible de la voie de signalisation Nodal ce qui en fait un exemple
classique de rétroaction négative. Les souris mutantes Lefty2-/- et les poissons-zèbres mutants perte-de-
fonction pour Antivin (l’orthologue de Lefty) produisent trop de mésoderme et ont une ligne primitive trop
étendue en conséquence d’une suractivation de la voie Nodal (Meno et al., 1999).

387
 **Figure 6-56. Sans rétroaction négative de Lefty, la voie
Nodal génère une ligne primitive et un mésoderme
hypertrophiés.

Coupes transversales de gastrulas de souris sauvages (L,

M) ou mutants Lefty2-/- (I, J). J et M sont des
agrandissements des régions indiquées en I et L. ect =
ectoderme; mes = mésoderme; ps = ligne primitive et ve
= endoderme viscéral. Source :
https://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-
2765(00)80331-7.pdf

La signalisation Nodal est fortement active dans les cellules souches pluripotentes (ES ou iPS) en culture et
est nécessaire au maintien de leurs propriétés. La différenciation de ces cellules s’accompagne souvent
d’une baisse de la signalisation Nodal, liée entre autres à l’activation de l’expression de Lefty. Dans les
cellules souches pluripotentes, l’expression de Lefty est réprimée par un microARN, miR-302. Si on
surexprime ce microARN, l’expression de Lefty est plus faible que normalement et les cellules mettent plus
de temps à se différencier. L’expression des gènes de pluripotence Nanog, Oct4 et Sox2 met plus de temps à
s’éteindre (Barroso-DelJesus et al., 2011).

La voie de signalisation Nodal est essentielle pour mettre en place l’asymétrie droite-gauche. Elle est activée
par un flux de liquide extracellulaire contrôlé par des battements ciliaires vers la gauche au sein de
l’organisateur droite-gauche qui se trouve dans le plan de symétrie bilatérale et qui est dérivé du nœud de
Hensen. La pression exercée vers la gauche active des mécanosenseurs ciliaires qui contiennent des canaux
cationiques Pkd2 nécessaires à la mise en place de la polarité droite-gauche (Pennekamp et al., 2002).
S’ensuit une entrée de Ca2+ dans le cytoplasme qui active une cascade de transduction aboutissant à
l’inhibition de l’inhibiteur de la voie Nodal, Dand5 (aussi appelé Cerl2). Les ARNm de Dand5 sont dégradés
plus rapidement sous l’action de la protéine Bicc1 activée par le Ca 2+ (Nakamura et al., 2012, Maerker et al.,
2021). La voie de signalisation Nodal peut ainsi agir et activer la transcription de Pitx2 (Yoshioka et al.,
1998).

Bien que présentée ici de manière séparée, les signalisations Nodal et BMP peuvent être inter-dépendantes.
Par exemple dans l’embryon de souris, Nodal dérivé de l’épiblaste induit la synthèse de BMP4 dans
l’ectoderme extra-embryonnaire qui à son tour favorise l’expression de Nodal dans l’épiblaste (Robertson,
2014).

Les voies de signalisation FGF

FGF veut dire facteur de croissance des fibroblastes. Le terme de facteur de croissance est assez
limitant, et même si ces facteurs font effectivement croitre les populations de cellules par
prolifération, leurs rôles ne se limitent pas à cela. Les facteurs de croissance peuvent aussi jouer un
rôle instructeur qui provoque des changements sur la détermination des cellules et non pas
seulement un rôle sur leur quantité. Et, comme nous allons le constater, les FGF ont des cibles
nettement plus diversifiées que les fibroblastes !

La famille FGF est composée de 22 membres (FGF 1-14 et 16-23). Chacun possède un domaine central
conservé de 120 acides aminés. Ces ligands sont organisés en sept groupes basés sur des relations
phylogénétiques.

388
 ***Figure 6-57. Familles de ligands FGF chez l’Homme. Source :
https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wdev.176

Les FGF se lient avec une faible affinité aux protéoglycanes d’héparane sulfate (HSPG) présents sur
la plupart des surfaces cellulaires et des matrices extracellulaires. Cette interaction est nécessaire
à leur activité.

Les premiers FGF à avoir été identifiés sont les FGF1 et FGF2, purifiés à partir d’extraits d’adénohypophyse
et montrant des propriétés mitogéniques (Armelin, 1973; Gospodarowicz et al., 1974). Il existe deux FGFs
chez C. elegans : let-756 (let, lethal) essentiel au développement du nématode, et egl-17 (egl, egg-laying
defective) requis pour la migration des myoblastes sexuels (Burdine et al., 1997). Egl-17 est clairement
l’orthologue de la famille FGF11/12/13/14 des Vertébrés (Itoh, 2007). Les relations phylogénétiques de
let-756 sont moins définies. Trois homologues ont été identifiés chez D. melanogaster : branchless,
orthologue de la plupart des FGF des Vertébrés et qui est impliqué dans la migration cellulaire et la
ramification des trachées, et thisbe et pyramus impliqués dans le développement (Stathopoulos et al., 2004;
Sutherland et al., 1996). Heartless est le nom de leur récepteur chez la drosophile.
***Figure 6-58. La signalisation FGF est nécessaire
à la migration des cellules mésodermiques lors de
la gastrulation de la drosophile (A-F) Embryons de
type sauvage avec immunohistochimie avec un
anticorps reconnaissant Twist et montrant les
premières cellules mésodermiques qui
commencent à migrer (A), puis à un stade ultérieur,
une fois la migration terminée (B). Dans les
embryons mutants BSC25 (délétion de la région
génomique qui inclut les gènes codant les FGF
thisbe et pyramus) et les embryons mutants htl qui
n’expriment pas Heartless (le récepteur aux FGF)
les cellules du mésoderme restent agglutinées (C, E)
à un stade où les cellules de type sauvage ont initié
la migration (A), mais se propagent finalement et
contactent les cellules ectodermiques exprimant
Dpp (D, F) presque comme le font les cellules de
type sauvage (B).

Source : http://genesdev.cshlp.org/content/18/6/687.full

389
Au cours de l’évolution, des évènements supplémentaires de duplication du génome chez le poisson-zèbre
portent le nombre de FGFs à 27 comprenant 21 homologues humains (tous excepté le FGF9), et 6 paralogues
(Itoh, 2007).

Les FGFs agissent pour la plupart via leurs récepteurs FGFRs. Selon la combinaison ligand/récepteur,
différentes voies de signalisation sont activées et interviennent dans une multitude de processus comme
l’angiogenèse, la prolifération et la survie cellulaires, la différenciation ou encore la migration. Chez les
mammifères, quatre gènes codant des récepteurs de FGF (FGFR1–4) ont été identifiés mais la diversité est
bien plus grande à cause de multiples épissages alternatifs (Ornitz et Itoh, 2015; Brewer et al., 2016). Du
fait de cette implication dans des processus fondamentaux, de nombreuses pathologies sont associées à des
niveaux protéiques anormaux ou à des mutations des FGFs ou de leurs récepteurs. Ils sont notamment
souvent associés à plusieurs types de cancer ou à des défauts de développement (Ornitz and Itoh, 2015).

De nombreux FGF présentent des interactions de haute affinité avec plusieurs FGFR, tandis que certains
activent des récepteurs uniques ou des isoformes de récepteurs. La plupart des FGF ont démontré une
activité mitogène dans une variété de systèmes. Cependant, quelques-uns, les FGF 11-14, 19 et 21-23, ne
présentent pas de fonctions prolifératives. La capacité mitogène d’un FGF est probablement dépendante du
ou des FGFR avec lesquels il interagit. Par exemple, le FGF-19 joue un rôle dans la régulation de la synthèse
du cholestérol et des acides biliaires grâce à une interaction unique non héparine-dépendante avec le
FGFR4. Quant à FGF23, il joue un rôle dans la régulation physiologique du métabolisme du phosphate et de
la vitamine D.

Les récepteurs aux FGF sont des récepteurs tyrosine kinase. Les modèles classiques d’activation du
récepteur tyrosine kinase impliquent la liaison du ligand, la dimérisation du récepteur, la
transactivation du domaine kinase, la phosphorylation des tyrosines intracellulaires. Ces sites
phosphorylés permettent l’ancrage et l’activation des effecteurs qui orchestrent l’activation des voies de
signalisation en aval (Lemmon et Schlessinger 2010).

*Figure 6-59. Conséquences de la fixation d'un ligand sur un récepteur tyrosine kinase. La liaison du ligand induit la
dimérisation des récepteurs tyrosine kinase, juxtaposant ainsi les domaines kinases intracellulaires dans une
orientation/proximité adéquate de sorte que la transphosphorylation des tyrosines (représentées par des symboles
Y) dans la boucle d'activation (boucle A), et donc l'activation de la fonction kinase secondaire peut se produire. Cela
déclenche à son tour des transphosphorylations secondaires (montrées en turquoise) dans de nouveaux domaines,
créant des sites d'amarrage pour le recrutement de substrats intracellulaires distincts (montrés dans un assortiment
de formes/couleurs en bas à droite). Source : https://f1000research.com/articles/7-872/v1

Différents seuils de force et de stabilité des dimères peuvent également entrer en jeu, ainsi que la
dynamique de signalisation engagée par chaque voie en aval (Vasudevan et al. 2015; Zinkle et Mohammadi
390
2018; Li et Elowitz 2019). Pour les FGFR, où les voies en aval ont été particulièrement bien étudiées, ERK1/2
et Akt sont les principaux effecteurs (Lanner et Rossant 2010; Brewer et al., 2016), mais la voie STAT peut
également être activée ainsi que la voie PLCγ.

*Figure 6-60. La voie de signalisation FGF (et celle d'un

autre facteur de croissance (PDGF)) aboutissent à la
phosphorylation de ERK et de Akt. Des cellules
mésenchymateuses embryonnaires de souris sont
incubées durant une durée indiquée en minutes (de 0 à
120 minutes) à 50 ng/mL de FGF1 ou à 30 ng/mL de
PDGF. Les extraits protéiques sont analysés en western-
blot avec un anticorps reconnaissant la forme
phosphorylée de ERK ou un anticorps reconnaissant la
forme phosphorylée de AKT ainsi qu'un anticorps
reconnaissant la β-tubuline (contrôle). L'augmentation
de la phosphorylation est quantifiée relativement aux
cellules sans traitement. Notez l'aspect transitoire de
l'augmentation de la phosphorylation et la dynamique
différente entre les effets de FGF et de PDGF. Source :
https://elifesciences.org/articles/07186

**Figure 6-61. Voies de signalisations activées par les FGF et leurs récepteurs. La liaison des FGF canoniques au FGFR avec de
l’héparane sulfate (HS) (porté par un HSPG) comme cofacteur induit la formation d’un complexe ternaire FGF-FGFR-HS, qui active
le domaine tyrosine kinase intracellulaire du FGFR par phosphorylation de résidus tyrosine spécifiques. Le récepteur activé est
couplé à plusieurs voies de signalisation intracellulaires, notamment les voies RAS-MAPK, PI3K-AKT, PLCγ et STAT. La voie RAS-
MAPK : Le substrat majeur de la kinase FGFR, FRS2α, qui est constitutivement associé à la région juxtamembranaire de FGFR
interagit avec CRKL lié à pY463 et est phosphorylé par la kinase FGFR activée. FRS2α phosphorylé recrute la protéine adaptatrice
GRB2, qui recrute ensuite le facteur d’échange SOS. SOS recruté active la GTPase RAS qui se trouve à la membrane et qui active
alors la voie MAPK. MAPK active les membres de la famille des facteurs de transcription Ets tels que Etv4 (Pea3) et Etv5 (Erm) et
les régulateurs négatifs des voies de signalisation FGF tels que SHP2, CBL, SPRY, SEF et DUSP6. La voie PI3-AKT : Le GRB2 activé
recrute également la protéine adaptatrice GAB1, qui active alors l’enzyme PI3K, qui phosphoryle ensuite l’enzyme AKT. AKT a de
multiples activités, notamment l’activation du complexe mTOR 1 par l’inhibition de TSC2 et la phosphorylation du facteur de
transcription FOXO1 l’amenant à sortir du noyau. La voie PLCγ : La kinase FGFR activée recrute et active l’enzyme PLCγ, qui produit
de l’IP3 et du DAG par l’hydrolyse de PIP2. IP3 induit la libération d’ions Ca 2+ à partir des réserves intracellulaires et l’activation
des voies de signalisation en aval. DAG active l’enzyme PKC et ses voies de signalisation en aval. GRB14 inhibe l’activation du PLCγ.
La voie STAT : la kinase FGFR active également STAT1, 3 et 5. Ces voies de signalisation activées régulent principalement
l’expression des gènes dans le noyau. SPRY interagit avec GRB2 pour inhiber la voie RAS-MAPK et réguler la voie PI3K-AKT. Les
dimères de GRB2 sont amarrés à l’extrémité c-terminale de FGFR2 où ils inhibent SHP2, permettant une activité de kinase de

391
 récepteur de faible niveau. Les molécules colorées en rouge fonctionnent généralement pour inhiber la signalisation FGFR. Source
: https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wdev.176

**Figure 6-62. Focus sur la voie PI3Kinase-Akt-TORC1. Les PI3K sont sous forme de dimères p110/p85 dans les
cellules. Après avoir reçu un stimulus externe (par exemple via un récepteur tyrosine kinase (RTK) comme FGFR),
la sous-unité régulatrice p85 interagit avec la section intracellulaire du récepteur activé. L'activation de l'isoforme
catalytique p110 qui s'ensuit déclenche alors une cascade de phosphorylations associées à la membrane plasmique
lipidique avec la transformation de PIP2 à PIP3. Cette transformation peut être renversée par PTEN qui freine ainsi
l'activation de la voie. PIP3 se lie aux deux protéines effectrices en aval : PDK1 et AKT qui sont transloqués pour ce
faire à la membrane plasmique. PDK1 phosphoryle AKT sur la thréonine 308. L'activation résultante de l'activité
sérine-thréonine kinase d'AKT lui permet d'inhiber TSC1/2 qui était un inhibiteur de mTORC1 (le complexe qui
contient la kinase mTOR1). Cette dernière protéine stimule la croissance cellulaire. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.595818/full

Les récepteurs FGFR peuvent aussi être endocytés à la suite de l’activation de leur voie de signalisation en
aval. Les récepteurs peuvent alors être dégradés ou recyclés à la membrane plasmique. L’endocytose et les
mécanismes de trafic intracellulaire ont une influence importante sur la dynamique spatiale et temporelle
du signal, qui influence les effets biologiques d’une exposition aux FGF (Sorkin et von Zastrow, 2009). La
mutation perte-de-fonction de LIS1 qui code une protéine associée à la dynéine et au trafic vésiculaire
aboutit à un phénotype rappelant une déficience en signalisation FGF (comme par exemple des membres
tronqués voire absents dûs à l’absence de réponse en provenance de l’AER produisant des FGF au cours de
la croissance des bourgeons de membre).
***Figure 6-63. LIS1 est essentielle à la stabilité des
récepteurs aux FGF. Des fibroblastes embryonnaires de
souris sauvages ou Lis1-/- sont traités avec du
cycloheximide (CHX) qui inhibe la traduction et traitées
avec FGF2. A différents moments de ce traitement
(jusqu’à 6h), on extrait les protéines et on les étudie par
western-blot pour l’expression des récepteurs FGFR1 et
FGFR2, de LAMP1, une protéine lysosomale et de LIS1.
GAPDH sert de contrôle. On constate que la quantité de
FGFR est toujours plus basse dans les cellules mutées
que les cellules sauvages en présence du ligand, et qu’il y
a une baisse très importante de FGFR2 au cours du
temps. Cela indique une dégradation accrue des
récepteurs. Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(18)30272-9

392
Avec d’autres expériences, Liu et al. (2018) ont montré que LIS1 était essentiel pour ramener des FGFR à la
membrane plasmique après endocytose activée par le ligand. En son absence, les FGFR sont trop envoyés
dans les lysosomes et sont dégradés de manière excessive, rendant moins efficace la réception du signal
FGF.

Cependant, une destruction des récepteurs et de leurs ligands est quelque fois souhaitable. Par exemple,
lors de la gastrulation du poisson-zèbre, le gradient FGF8 est trop étendu si les récepteurs liés à FGF8 ne
sont pas suffisamment dégradés. Les récepteurs liés à leur ligand sont d’abord endocytés dans des vésicules
couvertes de clathrine. Une protéine appelée HSC70 est essentielle pour désassembler la clathrine de ces
vésicules avant que celles-ci ne fusionnent avec les endosomes. S’il y a une mutation perte-de-fonction du
gène codant HSC70 alors il n’y a plus suffisamment de clathrine disponible pour les endocytoses et le
gradient de FGF8 s’étend causant des défauts de développement (Rengarajan et al., 2014).

***Figure 6-64. Envoi de FGF8 et de son récepteur à la dégradation ce qui permet de restreindre la portée du gradient
de FGF8.

Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0086373

Parmi les cibles de ERK activés par la signalisation FGF on peut signaler DNMT3A, une DNA-
méthyltransférase qui méthyle l’ADN de novo sur des cytosines (ajout de nouvelles méthylations et non
simple entretien) aboutissant à une inhibition de la transcription. La phosphorylation de DNMT3A par ERK
empêche la DNA-méthyltransférase d’agir et d’inhiber la transcription.

***Figure 6-65. DNMT3A est directement phosphorylé par ERK.

393
 (A) Schéma du DNMT3A humain montrant les sites de phosphorylation (S255) et d’amarrage d’ERK (ERK D-domain).
(B) Les sites de phosphorylation et d’amarrage d’ERK1/ERK2 sont conservés sur DNMT3A chez les vertébrés (Ec,
Equus caballus ; Gg, Gallus gallus ; Hs, Homo sapiens ; Mm, Mus musculus ; Rn, Rattus norvegicus). (C) Test de l’activité
kinase ERK2 (en utilisant du γ-32P-ATP) sur des formes sauvages ou mutantes de GST-hDNMT3A (GST est un tag
pour mieux reconnaitre et isoler la protéine). Il y a des mutations soit sur le site de phosphorylation S255, soit sur
les sites d’amarrage de ERK. (D) Etude par western-blot utilisant des anticorps anti-DNMT3A-phosphoS255 (qui
reconnait la forme phosphorylée) ou anti-DNMT3A (qui reconnait toutes les formes) après phosphorylation in vitro
par ERK2 de formes sauvages ou mutantes de GST-hDNMT3A. (E) Les bourgeons de membre (isolés à partir
d’embryons de poulet au jour 4) ont été séparés en régions proximale (P), moyenne (M) et distale (D). Des quantités
égales de protéines de chaque région de bourgeon de membre ont été analysées par western-blot avec des anticorps
anti-DNMT3A-phosphoS220 (le site de phosphorylation chez le poulet est décalé par rapport à l’humain) anti-
DNMT3A, anti-phosphoERK, anti-ERK ou anti-β-actine. On constate que plus on est proche de la partie distale du
bourgeon de membre et de l’AER qui produit FGF, plus ERK et DNMT3A sont phosphorylés. Source :
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(14)00622-6

Dans le bourgeon de membre, les FGF en provenance de la partie distale (AER) inhibent DNMT3A via la
phosphorylation par ERK, empêchant d’inhiber la transcription de Sox9 par méthylation de l’ADN. Le
maintien de l’expression de Sox9 est crucial dans le mésenchyme pour qu’il puisse encore produire du
cartilage durant toute la croissance du bourgeon de membre.

Alors que dans la plupart des types cellulaires, le FGF induit la prolifération et protège de l’apoptose, dans
les chondroblastes, il provoque un arrêt de la croissance et contribue à leur différenciation en chondrocytes.
Toutes les protéines Rb deviennent déphosphorylées lors du traitement par FGF et l’activité du complexe
cycline E/CDK2 (qui contrôle la progression durant la phase G1) est inhibée (Kalupoeva et Basilico, 2012).
L’expression de p21 est augmentée. C’est exactement l’inverse de ce que l’on observe dans la plupart des
cellules, ce qui montre bien que l’action des ligands sur leurs cibles est contexte-dépendant et dépend de la
compétence des cellules.

Lors de cette fonction inhibitrice de la prolifération des chondroblastes et activatrice de la différenciation

en chondrocytes, FGF agit via le récepteur FGFR3. Ce récepteur est constitutivement actif à cause de
mutations chez des patients atteints de dysplasie (ou nanisme) thanatophore, qui présentent des os longs
et des côtes raccourcis (leur croissance dépend initialement du cartilage). La forme mutée de FGFR3
s’autophosphoryle sur les tyrosines intracellulaires et active la voie STAT en aval de ce récepteur sans qu’il
y ait de ligands FGF et aboutit à la différenciation de chondrocytes alors même que le nombre de précurseurs
n’est pas suffisant pour aboutir à une taille normale du squelette (Webster et Donoghue, 1996).
**Figure 6-66. Phosphorylation constitutive sur des
tyrosines de la forme mutée de FGFR3 qu’on trouve
dans la dysplasie thanatophore. Des fibroblastes de
souris (NIH3T3) sont transfectés par des vecteurs
permettant l’expression de la forme sauvage de FGFR3
(Gly380) et d’une forme mutée de FGFR3 (Arg380)
qu’on a trouvée chez un patient atteint de dysplasie
thanatophore. Des cellules ont également été
transfectées avec le vecteur d’expression vide (Mock).
Les cellules ont été cultivées dans un milieu sans aucune
source de FGF. FGFR3 a été immunoprécipité puis les
protéines récupérées ont été analysées par western-
blot incubées avec un anticorps anti-FGFR3 et un
anticorps reconnaissant les tyrosines phosphorylées.
Source : https://www.embopress.org/doi/epdf/10.1002/j.1460-
2075.1996.tb00384.x

Implication de la signalisation FGF dans le développement précoce de la souris

Dans le blastocyste de souris à E4.5, les populations Nanog+ (épiblaste) et Gata6+ (endoderme primitif)
sont ségrégées par la signalisation FGF4 (Yamanaka et al., 2010). En effet, les cellules exprimant le récepteur
FGFR1 ainsi que la signalisation autocrine FGF4 s’engagent dans l’épiblaste, tandis que la signalisation
paracrine FGF4 via FGFR1 et FGFR2 détermine les cellules de l’endoderme primitif.
394
 *Figure 6-67. Signalisation paracrine FGF4 de l'épiblaste
(EPI) vers l'endoderme primitif (PE). Dans les cellules
EPI (à gauche), un niveau plus élevé de NANOG en
collaboration avec OCT4 et SOX2 active l'expression de
Fgf4 et réprime l'expression de GATA6 ainsi que le
niveau de signalisation FGF, comme l'indique le faible
niveau d'ERK phosphorylé. Dans les cellules PE (à
droite), FGF4 sécrété par les cellules EPI active
fortement les récepteurs FGFR1 et FGFR2 et la voie de
signalisation en aval (beaucoup de ERK phosphorylé).
Cette signalisation FGF plus élevée augmente
l'expression de GATA6 et réprime l'expression de
NANOG. La signalisation FGF et GATA6 activent en
coopération les gènes en aval, tels que Sox17 et Gata4.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/143/7/1063/47817/Lineage-
specification-in-the-mouse-preimplantation

Les niveaux d’ERK relativement faibles dans les cellules FGFR1+ déclenchent une rétroaction négative,
augmentant l’expression de Nanog et l’identité pluripotente de l’épiblaste. En revanche, la signalisation FGF-
ERK dans les cellules FGFR1+/FGFR2+ active des cibles alternatives, telles que DUSP, pour réduire
l’expression de Nanog et GATA6 dans le futur endoderme primitif (Kang et al., 2017). La suppression de la
signalisation FGF par l’inhibiteur de MEK PD0325901 (PD032) ou l’inhibiteur de FGFR PD173074 induit
une conversion en épiblaste et aucune spécification en endoderme primitif n’est alors possible (McLean et
al., 2014 ; Bessonnard et al., 2017). Conformément à la réduction de l’activité MEK pour établir la
pluripotence naïve dans l’épiblaste, PD032 est un composant essentiel du cocktail pour dériver et maintenir
des cellules souches embryonnaires de souris (Nichols et al., 2009).

Comme chez la souris, la masse cellulaire interne (MCI) dans le blastocyste humain à 6 jours après la
fécondation in vitro, a montré une colocalisation GATA6 et NANOG avant l’apparition de l’endoderme
primitif et de l’épiblaste au jour 7 après la fécondation (Roode et al., 2012). Cependant, le traitement par
inhibiteur de MEK ou FGFR ne modifie pas le nombre de cellules NANOG, OCT4 ou GATA4+, ce qui suggère
que la signalisation FGF-MEK n’est pas requise dans les embryons humains pour la spécification de la
deuxième lignée (Roode et al., 2012). Par conséquent, bien que la ségrégation de l'ICM en endoderme
primitif et en épiblaste soit similaire chez les deux espèces, les voies de signalisation sont différentes. Ces
données suggèrent que des mécanismes moléculaires et cellulaires spécifiques induisent l'initiation et le
maintien de la pluripotence des épiblastes chez l'homme.

L’acide rétinoïque

*Figure 6-68. L’acide rétinoïque.

’acide rétinoïque (AR) est une petite molécule lipophile qui agit comme ligand des récepteurs

L
nucléaires de l’AR (RAR). L’AR est synthétisé à partir du rétinal par la rétinaldéhyde déshydrogénase
de type 2 (Raldh2) et dégradée en métabolites polaires par Cyp26. L’AR peut se présenter sous forme
d’AR tout-trans ou sous la forme de son isomère l’acide 9-cis rétinoïque.

Le rétinol est transporté dans le sérum par la protéine de liaison au rétinol (RBP4) sécrétée par le foie. Le
rétinol pénètre dans les cellules via un récepteur spécifique STRA6, et la protéine cellulaire de liaison au
rétinol (CRBP) facilite la conversion du rétinol en esters de rétinyle pour le stockage. Dans un tissu sécréteur
395
d’AR, le rétinol est oxydé en rétinaldéhyde par l’alcool déshydrogénase (ADH) ou la rétinol déshydrogénase
(RDH), et le rétinaldéhyde est oxydé en AR par la rétinaldéhyde déshydrogénase (RALDH). L’AR est ensuite
libéré et absorbé par les cellules environnantes. Les cellules qui expriment le cytochrome P450 (CYP26)
déclenchent une oxydation de l’AR pour sa dégradation et ne sont pas des cellules cibles de l’AR. Les cellules
cibles de l’AR expriment une protéine cellulaire de liaison à l’AR (CRABP) qui facilite son absorption et son
transport vers le noyau où l’AR se lie à son récepteur (RAR). Le complexe composé de RAR lié au ligand
avec RXR attaché à l'élément de réponse à l'acide rétinoïque (RARE) de l'ADN régule la transcription
des gènes cibles en modifiant la liaison des corépresseurs et des coactivateurs.

**Figure 6-69. Génération d’acide rétinoïque (AR) et mécanisme moléculaire utilisé par l’AR pour contrôler
l’activation ou la répression transcriptionnelle des gènes cibles. (A) L’AR est synthétisée par conversion séquentielle
du rétinol (vitamine A) en rétinaldéhyde par la rétinol déshydrogénase 10 (RDH10), suivie de la transformation du
rétinaldéhyde en AR. L’AR peut être dégradée par les enzymes CYP26. (B,C) L’hétérodimère formé par les récepteurs
nucléaires de l’AR (RAR) complexés avec les récepteurs X des rétinoïdes (RXR) se lie à des séquences d’ADN non
codantes appelées éléments de réponse à l’AR (RARE). La liaison de l’AR à RAR crée des changements
conformationnels qui modifient le recrutement des coactivateurs des récepteurs nucléaires (NCOA) ou des
corépresseurs des récepteurs nucléaires (NCOR) entraînant une modification des marques épigénétiques sur
l’histone H3, notamment l’acétylation de la lysine 27 (K27ac) associée à activation ou la triméthylation de la lysine
27 (K27me3) associée à la répression de la transcription. En présence de l’AR, les enhancers RARE stimulent le
recrutement de NCOA qui entraînent une augmentation localisée de H3K27ac et/ou une diminution de H3K27me3
conduisant à une expression accrue des gènes cibles tels que Meis1 et Meis2 dans le tissu du tronc embryonnaire (B).
En présence d’AR, les silencers RARE stimulent le recrutement de NCOR qui entraîne une diminution localisée de
H3K27ac et/ou une augmentation de H3K27me3 conduisant à une diminution de l’expression des gènes cibles tels
que Fgf8 dans le tissu du tronc embryonnaire (C). Source : https://doi.org/10.3390/biom11010080

En contraste avec les autres molécules classiques de signalisation en embryologie, l’acide rétinoïque
est lipophile et traverse sans problème la membrane plasmique. Les récepteurs aux rétinoïdes
appartiennent à la superfamille des récepteurs nucléaires. Ce sont des facteurs de transcription
ligand-dépendants qui sont divisés en deux grandes familles. Les récepteurs nucléaires à l’acide rétinoïque
(RARs) sont spécifiques à l’AR tout-trans alors que les récepteurs de rétinoïde X (RXRs) ont comme ligand
naturel l’acide 9-cis-rétinoïque. Il existe 3 isotypes (α, β et γ) pour chaque famille. Chaque récepteur, comme
tout autre récepteur nucléaire, possède des domaines communs à leur activité. Le domaine d’activation de
la transcription est retrouvé dans les régions N-terminales, soit A et B. La région E, contient le domaine de
liaison au ligand et la zone fonctionnelle de transactivation ligand-dépendant. Enfin, le domaine de liaison
à l’ADN se trouve dans la région C et est composé de 2 hélices α ainsi que d’une extension COOH terminale.

396
La liaison à l’ADN est possible seulement sous forme d’homodimère (RXR_RXR) ou d’hétérodimère
(RAR_RXR) sur des séquences spécifiques dans les régions promotrices des gènes cible.

Les RAREs (rétinoic acid response elements) sont composés de plusieurs répétitions d’AGGTCA séparé par
2 à 5 nucléotides et constitue les séquences visées par les hétérodimère RAR_RXR. Les RXREs sont composés
de la même répétition mais séparés par un seul nucléotide et sont ciblés par les homodimères RXR_RXR. La
liaison du ligand, AR tout-trans ou acide 9-cis-rétinoique, aux RNR entraine le recrutement de co-activateurs
ou co-répresseurs selon le cas. De plus, une enzyme de remodelage de la chromatine est simultanément
mobilisée et travaille de concert avec le co-activateur ou le co-répresseur afin de respectivement
décompacter ou condenser la chromatine. Selon les situations, il y aura donc soit activation ou répression
de la transcription du gène cible. Les récepteurs à l’AR ont comme cibles plus de 500 gènes dont CYP26A1
codant l’enzyme de dégradation de l’AR (boucle de rétroaction négative) et les gènes Hox impliqués dans le
développement embryonnaire.

De nouveaux récepteurs orphelins liés aux rétinoïdes (RORs) ont récemment été identifiés. Leur liaison à
l’ADN est possible grâce à l’intermédiaire de séquences spécifiques ROREs incluant la répétition de la
séquence (A/G)GGTCA. Contrairement aux RAR et RXR, les RORs n’ont pas besoin de former des dimères et
se lient aux ROREs directement sous forme de monomère. Les RORs sont impliqués notamment dans le
développement de la rétine, du cervelet et du système lymphatique.

Dans la quasi-totalité des leucémies promyélocytaires aiguës (LPA), une translocation impliquant les
chromosomes 15 et 17 provoque une fusion du gène codant le récepteur de l'acide rétinoïque RARα
avec le gène codant PML (nommé d'après la leucémie promyélocytaire). Une fois synthétisée, la
protéine-fusion bloque la différenciation des promyélocytes en différents types de granulocytes, qui
dépend normalement de la liaison de l'AR à son récepteur, RARα. Un traitement par de l'AR s'est
révélé efficace pour provoquer des rémissions de ce type de leucémie car il induit la dégradation des
protéines-fusions dysfonctionnelles PML/RARα.

***Figure 6-70. Modèle de guérison des leucémies promyélocytaires aigues (LPA) par dégradation de la protéin-
fusion dysfonctionnelle PML/RARα ou PML/RARA. La translocation du chromosome t(15;17) produit la protéine de
fusion PML/RARA, qui forme un dimère, se lie à l'ADN et réprime la transcription de nombreux gènes, y compris les
cibles que RARA active habituellement. Cela entraîne le bloquage de la différenciation des promyélocytes. Les
complexes PML/RARA recrutent également la protéine normale PML, ce qui perturbe les complexes ou corps
397
 nucléaires (NB) contenant PML dans le noyau. Le traitement combiné à l'acide rétinoïque et à l'arsenic (As) induit la
dégradation de la protéine PML/RARA et la dérépression des gènes cibles, ce qui provoque à la fois la différenciation
terminale des cellules leucémiques et la reformation des NB. Cela aboutit à la guérison définitive de la maladie chez
la plupart des patients. Source : https://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article/1/2/117/2298/The-Drug-
Induced-Degradation-of-Oncoproteins-An

Au cours de l’embryogenèse précoce des vertébrés, les régions de synthèse et de dégradation de l’AR ont
été cartographiées en détectant l’ARN messager codant les enzymes de ce métabolisme. Par exemple, au
cours de l’organogenèse chez le poisson zèbre, raldh2 est exprimé dans le mésoderme au milieu du tronc,
tandis que cyp26 est exprimé à la fois aux extrémités antérieure et postérieure de la plaque neurale. Ainsi,
un gradient bilatéral d’AR se forme avec la concentration la plus élevée dans le milieu du tronc et la
concentration la moins élevée à chaque extrémité.

Les rétinoïdes régulent l’expression des gènes Hox. In vitro, l’ajout d’AR induit l’expression des gènes Hox
d’une manière dépendante du temps et de la dose (Papalopulu et al., 1991). L’exposition in vivo à l’AR
pendant des fenêtres gestationnelles spécifiques provoque des transformations homéotiques vertébrales
qui coïncident avec l’antériorisation des domaines d’expression des Hox (Kessel et Gruss, 1991). Dans le
cerveau postérieur, l’antériorisation de l’expression de Hox induite par l’AR (Conlon et Rossant, 1992)
entraîne une altération de l’identité des rhombomères (Marshall et al., 1992). Pour plusieurs gènes Hox, la
réponse à l’AR est directement médiée par la présence d’un élément de réponse acide rétinoïque (RARE)
trouvé 5′ et/ou 3′ aux régions codantes (Dupé et al., 1997, Gould et al., 1998, Huang et al., 2002).

Dans le cerveau postérieur, quatre RARE contrôlent chacun l’expression d’un gène Hox. La mutation du
RARE de Hoxa1, du RARE de Hoxb1, du RARE de Hoxb4 ou du RARE de Hoxd4 (Nolte et al., 2003) aboutit à
une réduction ou à la perte de l’expression d’un gène rapporteur dans le cerveau postérieur en
développement, et abolit la réactivité du transgène au traitement par l’AR. Le remplacement du RARE de
Hoxb4 par le RARE de Hoxb1 antériorise l’activité transgénique du rapporteur dans le cerveau postérieur
(Gould et al., 1998). Par conséquent, la nature du RARE, ainsi que les récepteurs spécifiques qui le lient,
peuvent être importants dans l’établissement des domaines d’expression des gènes Hox.

Un gradient d’AR a été mis en évidence dans le cerveau postérieur (Dupé et Lumsden, 2001; Maden et al.,
1998). Ce gradient semble être établi par les actions opposées de deux enzymes. Le produit du gène Raldh2
qui convertit le rétinaldéhyde en AR est fortement exprimé dans le mésenchyme cervical entourant la
moelle épinière (Niederreither et al., 1997). Cyp26A1, dont le produit inactive l’AR par oxydation, est
exprimé dans les régions du cerveau antérieur et moyen de la plaque neurale et dans le rhombomère r2
(r2) (Fujii et al., 1997, MacLean et al., 2001). Cyp26B1, un homologue de Cyp26A1, est exprimé dans r3 et r5
à E8,0 (MacLean et al., 2001). À E9,5, Cyp26B1 est fortement actif dans r5 et r6, et faiblement actif dans la
surface basale de r2, r3 et r4. L’expression de ces gènes établit un gradient d’AR entre le cerveau postérieur
antérieur (élevé) et caudal (bas) (Dupé et Lumsden, 2001) et établit ainsi les domaines d’expression des
gènes Hox sensibles à la RA. Les gènes Hox qui sont induits par l’AR à des concentrations plus faibles in vitro
ont des bordures plus antérieures (Hunt et al., 1991) que ceux nécessitant des concentrations plus élevées.
Par conséquent, la régulation spatiale des gènes responsables de la structuration du cerveau postérieur est
régulée par l’accumulation locale d’AR.

Un apport excessif d’AR provoque des fentes palatines chez la souris. Les souris avec une délétion dans
Cyp26b1, codant une enzyme clé de la dégradation de l’AR, ont une fente palatine, une micrognathie, une
troncature des membres antérieurs et postérieurs et des défauts d’ossification dans les os de la calvaria
(Maclean et al., 2009). De plus, les souris présentant une mutation de la rétinol déshydrogénase 10, une
enzyme de la synthèse de l’AR (souris Rdh10m366Asp), ont des taux d’AR réduits et présentent une fente
médiane, une syndactylie et un cerveau antérieur mal formé (Ashique et al., 2012). Les souris présentant
des mutations négatives dominantes du récepteur alpha de l’acide rétinoïque (Rara403*) et les souris
présentant un déficit des récepteurs alpha et gamma de l’AR (Rara–/–;Rarg–/–) présentent une fente médiane
(Lohnes et al ., 1994 ; Mark et al., 2009). Ainsi, une quantité appropriée d’AR est cruciale pour le
développement embryonnaire normal, avec des niveaux de AR trop ou trop faibles provoquant une fente
palatine chez la souris. Une diminution des taux sériques de vitamine A et de protéine de liaison à la PR 4
(RBP4), un translocateur de l’AR a été signalée chez des patients (Steinhof et al., 2021). De plus, on sait qu’un
398
apport excessif en vitamine A est associé à de multiples malformations congénitales (Martinez-Frias et
Salvador, 1990). Cependant, la dose tératogène minimale semble être bien supérieure au niveau consommé
par la plupart des femmes par le biais de suppléments de multivitamines et de vitamine A pendant la
grossesse (Sommer et al., 2012).

La voie de signalisation Notch

Les ligands qui se lient et activent les récepteurs Notch sont des protéines transmembranaires, et
donc l’activation de la signalisation Notch dépend des interactions directes de cellule à cellule
(communication juxtacrine). Cette communication permet de limiter la signalisation aux
interactions cellulaires locales et permet aux cellules de communiquer directement avec leurs
voisines.

Néanmoins, au cours de certains processus de développement, il a été découvert que des ligands activent
Notch exprimé à la surface de cellules situées à distance. Une telle signalisation à longue portée emprunte
des projections cellulaires structurées par l’actine apparentées à des filopodes appelées cytonèmes pour
délivrer des signaux d’activation à Notch sur des sites distants (de Joussineau et al., 2003). Par exemple, la
cellule de la pointe distale de C. elegans a de longs processus cellulaires qui contiennent le ligand Lag2 et
s’étendent jusqu’aux cellules de la lignée germinale dont ils régulent la prolifération par l’activation de
l’homologue Notch Glp1 (Fitzgerald et Greenwald , 1995).

***Figure 6-71. Structure des récepteurs Notch et de ses ligands. (A) Les quatre récepteurs Notch humains (NOTCH1-
4) sont structurellement similaires. Tous les récepteurs possèdent des domaines extracellulaires de type EGF, et les
quatre récepteurs partagent une similitude dans les domaines intracellulaires, mais NOTCH4 n’a pas le domaine TAD.
Lors de leur passage par l'appareil de Golgi les précurseurs des récepteurs Notch sont clivés par la Furine (clivage
S1). Ainsi le domaine extracellulaire et le domaine transmembranaire/intracellulaire sont reliés par des liaisons
faibles. (B) Tous les ligands humains de Notch des familles Delta-Like et Jagged contiennent DSL qui est le domaine
d’interaction avec Notch. Les familles de ligands Notch peuvent être distinguées par le nombre de domaines
extracellulaires de type EGF. Unique à la famille Jagged, une insertion de 24 acides aminés entre les 10e et 11e
domaines de type EGF est présente chez JAGGED1 et JAGGED2. La région riche en cystéine est une autre
caractéristique unique des ligands de la famille Jagged. À l’extrémité C-terminale de DLL1, DLL4 et JAGGED1 se
trouve un motif PDZ. EGF : facteur de croissance épidermique ; LNR : répétitions lin-12/Notch ; HD : domaine
d’hétérodimérisation ; NRR : Région de régulation négative ; RAM : module d’association RBPjκ ; NLS : Signal de
localisation nucléaire ; TAD : domaine d’activation transcriptionnelle ; PEST : domaine riche en proline (P), acide

399
 glutamique (E), sérine (S), thréonine (T); DLL : de type Delta ; DSL : domaine Delta/Serrate/LAG-2 ; PDZ : protéine
de densité post-synaptique (PSD95), suppresseur de grande tumeur du disque de drosophile (Dlg1) et Zonula
occludens-1 (ZO-1). Source : https://doi.org/10.3390/biom11060849

L’activation de la voie de signalisation Notch nécessite une interaction physique entre un récepteur
Notch et son ligand, qui provoque des réponses dépendantes du contexte cellulaire.

Plusieurs études cristallographiques et fonctionnelles montrent que l’interaction entre le domaine

Delta/Serrate/lag-2 (DSL) des ligands de Notch et les domaines de type facteur de croissance épidermique
(EGF) 10 et 11 du récepteur Notch est nécessaire à l’activation de la voie Notch.

**Figure 6-72. L’interaction entre le ligand et le récepteur de la voie Notch entraîne la transcription des gènes cibles
de Notch dont le promoteur héberge CBF1. L’interaction du domaine DSL de DELTA-LIKE1 (DLL1) avec les 10ème et
11ème domaines de type EGF active l’endocytose de DLL1. Cela expose le site S2 de Notch au clivage par ADAM10 ou
TACE. Avant l’activation de Notch, les gènes cibles de Notch sont réduits au silence par le recrutement de
corépresseurs par CBF1. Le clivage S2 expose les acides aminés clés au clivage S3 par la γ-sécrétase, libérant le
domaine intracellulaire NIC1 dans le noyau de la cellule cible. NIC1 se lie à CBF1 et déplace les corépresseurs et active
l’expression du gène cible de Notch. ADAM10 : une désintégrine et métalloprotéase 10 ; CBF1 : facteur de liaison au
promoteur C 1 (également appelé RBPjκ) ; NIC1 : domaine intracellulaire de NOTCH1 ; TACE : ADAM17/Enzyme de
conversion du TNFα. Source : https://doi.org/10.3390/biom11060849

Lors de l’interaction récepteur-ligand, le ligand “attire” le récepteur Notch exposant ainsi un site spécifique
à la base du domaine extracellulaire de Notch pour le clivage S2. L’endocytose du ligand lié est cruciale pour
cette étape de l’activation de la voie Notch (Parks et al., 2000; Nichols et al., 2007) et c’est la force physique
exercée par cette endocytose qui fait changer la conformation de Notch et expose le site de clivage S2.
L’étape du clivage S2 est l’étape limitante de la succession d’événements qui va aboutir à la libération du
domaine intracellulaire de Notch (NIC). Deux métalloprotéases de la famille ADAM (A Disintegrin and
Metalloprotéases) sont impliquées dans le clivage S2 : ADAM10 et ADAM17/TNF-α converting enzyme
(TACE). Le knock-out d’ADAM10 ou de TACE est léthal à l’état embryonnaire, les embryons knock-out
d’ADAM10 présentant des défauts similaires aux knock-outs du récepteur Notch (Hartmann et al., 2002).

Le clivage séquentiel sur le site S2 expose davantage le NIC restant pour le clivage S3. Le complexe γ-
secrétase composé de 4 protéines transmembranaires (Préséniline qui est le composant enzymatique avec
une activité aspartyl-protéase, Nicastrine, APH1 et Pen2) libère le NICD.

400
 **Figure 6-73. Le complexe γ-sécrétase avec ses 4
composants. Les résidus aspartyl nécessaires pour
l'activité de la préséniline sont indiqués en orange. Le
DAPT qui est un inhibiteur classiquement utilisé du
complexe γ-sécrétase se fixe près de ce site actif et le
bloque. Source : https://www.mdpi.com/2073-
4409/8/3/209

Il existe une diversité au site de clivage S3, avec un clivage NICD observé à divers résidus d’acides aminés.
Les fragments de NIC produits présentent des demi-vies et une activité Notch différentes, suggérant une
spécificité du clivage S3 comme mécanisme de régulation de l’activation de Notch (Tagami et al., 2008).

Signalons qu’un clivage d’une autre protéine, APP, par la γ-sécrétase produit Aβ40 ou Aβ42 qui est un
peptide formant des plaques amyloïdes extracellulaires qui sont impliqués dans la maladie d’Alzheimer.

Le domaine intracellulaire de Notch fonctionne directement comme transducteur de signal (Kopan

et Ilagan, 2009). Il n’y a pas d’amplification par une cascade de phosphorylation contrôlée par des
enzymes comme on peut le voir dans d’autres voies de signalisation. Dans le noyau, le domaine
intracellulaire de Notch forme un complexe avec la protéine de liaison à l'ADN CSL (soit CBF1/RBJκ
chez les Mammifères, Su(H) chez la drosophile, LAG1 chez C. elegans) et des coactivateurs
transcriptionnels (notamment Mastermind) qui activent l'expression des gènes cibles de Notch tels
que hairy et les gènes de la famille HES.

Avant l’arrivée du domaine intracellulaire de Notch, CBF1 fonctionne comme un répresseur de la

transcription. Après, il y a recrutement d’activateurs au complexe tels que les protéines de la famille
Mastermind. L’absence de Mastermind 1 chez la souris provoque des déficiences dans le développement
dans les lymphocytes dont on sait qu’ils nécessitent une activation de la voie Notch (Oyama et al., 2007).
**Figure 6-74. EMSA montrant la formation du
complexe Mam-domaine intracellulaire de Notch
(NotchIC)-RBP-J (RBP-J est l’autre nom de CBF1)
sur ses éléments promoteurs cibles (un fragment
du promoteur de Hes1). Des extraits protéiques
de cellules 293T transfectées avec les vecteurs
d’expression pour les protéines indiquées
présentent des protéines qui se lient à l’élément
RBP-J du promoteur Hes1, retardant la migration
de cet ADN sur un gel non dénaturant (pour
préserver la conformation des protéines et
l’interaction avec l’ADN). Signalons que l’identité
des protéines fixées à l’ADN est corrélative et qu’il
faudrait les identifier formellement avec un
anticorps. Source : Kitagawa, 2015

La famille Hes des répresseurs transcriptionnels à hélice-boucle-hélice basique (bHLH) (Hes1, Hes3
et Hes5) agit en aval de la signalisation Notch (Kageyama et Ohtsuka, 1999). Ces répresseurs inhibent
fortement la différenciation neuronale et maintiennent les cellules souches neurales dans le
cerveau des mammifères en développement en réprimant l'expression des facteurs proneuraux tels
que Ascl1 et Neurog1/2 (Ohtsuka et al., 1999 ; Hatakeyama et al., 2004).

401
 *Figure 6-75. Neurogenèse prématurée chez les doubles mutants Hes1-/-;Hes5-/-. (A) Dans les souris sauvages, les
cellules souches neurales prolifératives (Ki67+) sont situées dans toute la paroi tandis que les neurones (TuJ1+)
résident dans la couche externe à E10.5. (E) Chez les doubles mutants Hes1-/-;Hes5-/-, il existe de très nombreux
neurones (TuJ1+) tandis que le nombre de cellules souches neurales (Ki67+) sont significativement diminuées. (B-
D, F-H) L’analyse par hybridation in situ montre que l’expression de Dll1, Mash1 (autre nom plus utilisé actuellement
= Ascl1) et Math3, des gènes proneuraux est fortement activée chez les doubles mutants Hes1-/-;Hes5-/- (F-H), par
rapport au type sauvage (B-D). Barre d’échelle : 100 µm. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/131/22/5539/52460/Hes-genes-regulate-size-shape-and-
histogenesis-of

Les souris mutantes Hes1-/- présentent des phénotypes sévères provoqués par une différenciation
neuronale accélérée, tandis que les souris mutantes Hes3-/- ou Hes5-/- ne présentent que des
phénotypes légers en raison de la compensation par Hes1 dont l’expression est augmentée (Cau et
al., 2000).

Des voies de signalisation à partir de Notch "non canoniques" ont été mises en évidence. Par exemple,
lorsqu'il fixe Delta, Notch favorise la croissance et le guidage des axones pionniers dans l'embryon de
Drosophile (les axones qui relient deux segments différents) en supprimant localement la signalisation Abl
(Crowner et al., 2003; Kuzina et al., 2011). Pour ce faire, Notch se lie à deux composants en amont de la voie
Abl (Le Gall et al., 2008) et les inhibent : la protéine adaptatrice Disabled (Dab), qui localise la protéine Abl
et stimule son activité kinase et le facteur d'échange de guanine (GEF) Trio, qui active la signalisation
dépendante d'Abl par la GTPase Rac.

Les récepteurs Notch possèdent plusieurs ligands. Par exemple, deux ligands (Delta et Serrate)
existent chez la drosophile et cinq (DLL1, DLL3, DLL4, JAG1 et JAG2) se trouvent chez l’homme.
L’existence de plusieurs ligands explique, en partie, la régulation spatio-temporelle de l’activité de Notch, et
peut également contribuer à moduler les niveaux et la durée des signaux. Différents ligands peuvent
également déclencher des réponses distinctes via le même récepteur Notch. Par exemple, les ligands Jagged
et Delta conduisent à des destins différents lors de la détermination cellulaire au cours du développement
de l’oreille interne, de l’angiogenèse et de l’hématopoïèse (Benedito et al., 2009 ; Petrovic et al., 2014). Par
exemple, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) se développent à partir de cellules à caractères
endothéliales dans la paroi de l’aorte de l’embryon. Jagged1 active faiblement la voie Notch dans certaines
cellules qui vont alors inhiber le programme de différenciation endothélial et activer le programme de
transformation en HSC, tandis que les cellules qui interagissent avec DLL4 activent fortement la voie Notch
et s’engagent définitivement dans la différenciation endothéliale (Gama-Norton et al., 2015).

402
 **Figure 6-76. Jagged 1 et Delta 4 ont des effets opposés sur la capacité des cellules à former des cellules souches
hématopoïétiques (a) Principe de l’expérience : des cellules d’embryons de souris à E10.5 CD31+CD45-Ter119- (des
cellules pouvant donner soit des cellules souches hématopoïétiques, soit des cellules endothéliales) ont été purifiées
par FACS et incubées dans le milieu avec des anticorps bloquants anti-Dll4 ou anti-Jag1 ou des anticorps contrôles
pendant 7 jours. (b) Les graphiques représentent le changement moyen du nombre total de cellules obtenu après
culture avec anti-Dll4 ou anti-Jag1 par rapport aux cultures avec l’anticorps contrôle. Les cellules CD31+c-Kit–CD45–
sont des cellules endothéliales, les cellules CD31+c-kit+CD45– et CD45+ sont des cellules souches hématopoïétiques
à divers stades de maturation (c) Nombre relatif de progéniteurs hématopoïétiques obtenus en b (testés par la
capacité à former des colonies de cellules hématopoïétiques). Source :
https://www.nature.com/articles/ncomms9510

Également, la signalisation par un ligand fort peut être réduite lors de l’expression d’un deuxième ligand
qui active un signal plus faible, car ce ligand est en compétition avec le premier pour se lier à Notch
(Benedito et al., 2009 ; Petrovic et al., 2014). De plus, les glycotransférases Fringe augmentent l’affinité entre
les récepteurs Notch et les ligands (Panin et al., 1997), fournissant une couche régulatrice supplémentaire.
Les enzymes Fringe ajoute une N-acétylglucosamine sur un O-fucose préalablement ajouté sur Notch au
cours de sa maturation. Dans ce cas, Notch a en général plus d'affinités pour les ligands Delta mais moins
d'affinités pour les ligands Jagged et/ou Serrate. La balance entre ces deux ligands influence de nombreux
processus développementaux mais aussi lors de la tumorigenèse.

**Figure 6-77. Implication de Lunatic Fng (LFNG) dans le cancer du sein triple négatif. (A) Quand LFNG est
correctement exprimé, Notch sur les cellules épithéliales mammaires interagit préférentiellement avec Delta (Dll) ce
qui aboutit à une activation modérée de NICD et de ces cibles et contribue à inhiber l'avancée dans le cycle cellulaire.
(B) Un déficit en LFNG entraîne une activation accrue de Notch médiée par JAG1 (et non plus Delta) et une expression
exacerbée de c-Myc, de la cycline D1, du récepteur du facteur de croissance 1 analogue à l'insuline (Igf-1R) et de
l'activateur du plasminogène urokinase (uPA) ce qui entraîne une prolifération marquée. La signalisation Met et IGF-
1R peut également stimuler la prolifération. Source : https://www.mdpi.com/1420-3049/27/6/1783

403
L'expression des ligands de Notch est quelque fois sous le contrôle de la voie de signalisation Notch elle-
même. Par exemple, durant le développement de l'oreille interne des vertébrés, la voie Notch active
l'expression de Jag1 et de Dll4 mais inhibe l'expression de Jag2 et de Dll1 (Kiernan et al., 2001; Neves et al.,
2011).

Les ligands de Notch peuvent être clivés par des protéines de la famille ADAM, créant de formes solubles de
ligands, ce qui a pour effet de diminuer le signal activateur de Notch (Zolkiewska, 2008). Par exemple lors
du développement de l'aile de drosophile, l'orthologue d'ADAM10, Kuzbanian-like (Kbl) est nécessaire pour
cliver Delta et permettre un développement normal de la marge et des "veines" de l'aile (Sapir et al., 2005).
**Figure 6-78. Des protéases de la famille ADAM sont
capables de cliver Delta. Des cellules S2 d'insectes ont été
transfectées avec des vecteurs permettant d'exprimer
Delta et des protéines de la famille ADAM Kul, Kuz,
dTACE et Dmeltrin. Un western-blot est réalisé à partir
du surnageant (medium) et d'un extrait cellulaire (cells)
avec un anticorps anti-Delta. Remarquez l'apparition
d'une forme tronquée de Delta (64 kDa au lieu de 98
kDa) dans le surnageant en présence des protéases (à
l'exception de Dmeltrin). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/132/1/123/42813/Unidirectional-Notch-signaling-
depends-on

Rappelons que ADAM10 est impliqué dans le clivage activateur S2 du récepteur Notch (voir plus haut), ce
qui montre le rôle très ambivalent de cette protéase.

Les récepteurs Notch et ses ligands sont largement exprimés au cours du développement et, dans de
nombreux cas, les cellules en interaction expriment à la fois des ligands et des récepteurs. Les cellules
prennent des destins différents car la signalisation Notch est constamment activée dans une seule des deux
cellules en interaction, ce qui indique que la polarité de signalisation doit être hautement régulée. On pense
que les niveaux relatifs de Notch et de ses ligands présents sur les cellules en interaction établissent la
polarité de signalisation nécessaire pour garantir que les destins cellulaires corrects sont générés au bon
moment du développement. Chez l’homme, l’haploinsuffisance de Jagged1 ou Notch2 est associée au
syndrome d’Alagille, caractérisé par des défauts de développement du foie, du cœur, du squelette et des
yeux (McDaniell et al., 2006), tandis que l’haploinsuffisance de Notch1 est impliquée dans un sous-type de
maladie aortique héréditaire (Garg et al., 2005). Dans ces différents cas, l’un des allèles permet toujours de
générer une protéine fonctionnelle mais en quantité moindre qu’avec deux allèles normaux donc on voit
bien l’importance de la quantité de protéines produites.

Le niveau de l’activité Notch peut aussi réguler l’état d’une population de cellules souches. Par exemple,
dans la zone ventriculaire télencéphalique du poisson zèbre adulte, les cellules souches neurales oscillent
entre un état de quiescence et le recrutement et ce sont les niveaux de la lente oscillation de l’activité Notch
qui dirige ce changement d’état (Chapoton et al., 2010) (voir Figure 2-40).

En plus, ce sont les progéniteurs en division (c’est-à-dire les cellules recrutées qui ont perdu leur caractère
de cellules souches et qui, après prolifération, vont se différencier en neurones) qui sont la source de ligands
pour Notch, imposant une quiescence transitoire aux cellules souches voisines. C’est un mécanisme d’auto-
régulation : quand il y a trop de progéniteurs, ils activent un signal dans les cellules souches pour les
404
remettre dans un état de quiescence et pour produire moins de progéniteurs. Cela permet de maintenir un
équilibre entre population de cellules quiescentes et population de cellules prolifératives.

La voie de signalisation Notch est aussi impliquée dans le contrôle du nombre de cellules satellites (les
cellules souches qui permettent de régénérer le tissu musculaire squelettique strié).
**Figure 6-79. Rôle dans le maintien des cellules
satellites de Hey1 et HeyL, des effecteurs de la voie
Notch. On étudie les muscles de souris où HeyL est absent
et où le gène Hey1 est soit présent à l'état hétérozygote
(contrôle, Cont), soit totalement délété de manière
inductible dans les cellules satellites grâce au système
CreLox (co-dKO). Les cellules du tissu musculaire sont
étudiées en FACS et la fraction correspondant aux
cellules satellites est caractérisée par une forte
expression du marqueur SM/C2.6 et une faible
expression de Sca-1 (encadré sur les résultats du FACS).
On constate que cette fraction est plus faible en absence
de Hey1 et de HeyL. Ne pas tenir compte des graphes FSC
et SSC. En bas, coupe transversale d'un muscle injecté
(ou non) 14 jours auparavant avec de la cardiotoxine
(CTX) qui induit une lésion musculaire. Dans le muscle
des souris contrôles, on constate une très bonne
régénération alors que dans les muscles où Hey1 et HeyL
sont absents dans les cellules satellites, la régénération
ne s'est pas bien faite et de la matrice fibreuse riche en
collagène a remplacé le tissu musculaire. Cela est dû à un
nombre insuffisant de cellules satellites. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/4/dev163618/49002/Cell-autonomous-and-
redundant-roles-of-Hey1-and

Des études chez la drosophile et C. elegans ont identifié des mécanismes de rétroaction transcriptionnelle
positifs et négatifs qui amplifient de petites différences dans l’expression de Notch et de ses ligands qui
introduisent un biais pour déterminer laquelle des cellules en interaction va envoyer ou recevoir le signal
Notch (Seugnet et al., 1997). Des boucles de rétroaction peuvent également faire osciller la signalisation
Notch dans les cellules (Lahmann et al., 2019 ; Seymour et al., 2020).

Numb est un antagoniste de la signalisation Notch. Il agit en empêchant la localisation de Sanpodo sur la
membrane cellulaire. Or Sanpodo est nécessaire à la bonne activation de Notch (O’Connor-Giles et Skeath,
2003). Numb recrute également des ligases E3 comme Itch qui ubiquitinylent le domaine intracellulaire de
Notch (NICD) et l'orientent ainsi vers la dégradation (McGill et Glade, 2003).
***Figure 6-80. Action de la protéine Numb sur
Sanpodo lors d’une division asymétrique. Dans la
cellule A, Sanpodo (Spdo) se localise à la membrane
plasmique, où il favorise l’activation de la signalisation
Notch par Delta. Dans la cellule B, la présence de
Numb inhibe la localisation membranaire de Spdo. En
l’absence de protéine Spdo à la membrane cellulaire,
une signalisation Notch efficace ne se produit pas dans
la cellule B malgré la présence de Delta dans la cellule
voisine. Source :
https://www.cell.com/developmental-
cell/fulltext/S1534-5807(03)00226-0

L’un des principaux modèles où Numb (et Notch) a été étudié est la neurogenèse chez la drosophile. Le
développement du système nerveux central de la drosophile commence dans l’ectoderme
ventrolatéral, dans la région dite neurogénique où théoriquement toutes les cellules groupées en
405
cluster exprimant le gène achaete-scute (orthologue de Ascl1) peuvent participer au système
nerveux. Les interactions cellulaires médiées par Notch régulent la sélection de cellules souches
neurales individuelles ou neuroblastes (NB) au sein du cluster. Ce processus s’appelle l’inhibition
latérale et les cellules qui ont la voie Notch la moins activée deviennent les NB et inhibent
l’expression des gènes proneuraux dans les cellules voisines où la voie Notch est plus activée.
*Figure 6-81. Inhibition latérale par la voie Notch.
Initialement, toutes les cellules sont équivalentes, à la
fois émettrices et réceptrices mais l’une des cellules va
exprimer plus de Delta (car elle exprime un peu plus du
facteur de transcription achaete-scute (ou Ascl1) qui
active l’expression de Delta). Cette cellule va plus activer
la voie Notch dans les cellules voisines. Cela va avoir pour
effet d’y inhiber l’expression des gènes proneuraux mais
aussi l’expression de Delta, amplifiant le processus. La
signalisation Notch agit via les facteurs de transcription
Hes (ou E(spl), enhancer of split chez la drosophile).
NICD = domaine intracellulaire de Notch. D’après
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2020.00929/full

Chaque NB subit ensuite une série de divisions asymétriques pour se régénérer (caractère de cellule
souche) et produire une cellule précurseur secondaire plus petite, connue sous le nom de cellule mère
ganglionnaire (GMC). Les NB régénérés continuent de se diviser, chaque cycle de division produisant un NB
et un GMC spécifié de manière unique. Enfin, chaque GMC se divise de manière asymétrique pour produire
des neurones frères qui acquièrent des destins distincts A et B.

La capacité des GMC à se diviser de manière asymétrique dépend de la présence d’une signalisation Notch
active dans la cellule A et de l’absence de signalisation Notch dans la cellule B. L’activation différentielle de
la signalisation Notch dans les neurones A et B nécessite la localisation asymétrique du déterminant Numb
dans les GMC, sa ségrégation ultérieure à une seule cellule fille (la cellule B) et la capacité de Numb à bloquer
le signal Notch (Buescher et al. 1998, Schuldt et Brand 1999). On voit ainsi que Numb agit comme un
déterminant du destin cellulaire (Knoblich, 2010). La machinerie cellulaire qui permet de la localiser dans
une seule des cellules filles lors des divisions asymétriques commencent à être bien connus.
**Figure 6-82. Protéines impliquées dans les
divisions asymétriques et conséquences sur la voie
Notch. Source de la partie gauche du schéma

406
Des cas de cis-inhibitions ont été rapportés : les ligands et les récepteurs Notch co-exprimés dans la même
cellule s’inhibent mutuellement, supprimant la signalisation intercellulaire (Sprinzak et al., 2010 ; del Álamo
et al., 2011 ; Fiuza et al., 2010).

***Figure 6-83. La co-expression du ligand avec Notch inhibe l’activité de signalisation de Notch. A : Disques
imaginaux d’aile de drosophile avec des clones Ser−/Dl− marqués par l’expression de la GFP [A,D,G et vert dans C,F,I].
Cela veut dire que les cellules fluorescentes vertes n’expriment plus de ligands de Notch alors que les autres cellules
l’expriment. L’expression de Wingless [B,E,H et rouge dans C,F,I] qui est un gène cible de la voie de signalisation
Notch nous permet de savoir si cette signalisation est active. Notez que la signalisation Notch ectopique est observée
dans les cellules sans ligands bordant les cellules de type sauvage (cellules jaunes qui correspond à la superposition
de la fluorescence rouge et verte) B : Analyse de l’inhibition induite par le ligand sur l’activité de signalisation de
Notch dans des tests de rapporteurs cellulaires (cellules qui émettent des photons produits par la luciférase quand
la voie de signalisation Notch est active, en ordonnées des graphiques). Dans le premier graphique, les cellules avec
le gène rapporteur expriment Notch seul ou Notch et Serrate (Ser, un ligand) et des cellules voisines expriment ou
non Serrate. Dans le deuxième graphique, le principe est le même mais avec le ligand Delta (Dl). Dans les cellules
rapportrices on exprime aussi Fringe (Fng) qui renforce la signalisation Notch et qui la rend plus détectable. Source
: https://anatomypubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/dvdy.22207

Une telle « inhibition cis » est importante dans divers processus de développement, notamment la
neurogenèse, la formation des ailes chez la drosophile et le maintien des cellules souches épidermiques
humaines postnatales (Micchelli et al., 1997 ; Jacobsen et al., 1998 ; Franklin et al. al., 1999; Lowell et al.,
2000). Cependant, quelques interactions cis activatrices ont été observées. Tout dépend du contexte
cellulaire (Nandagopal et al., 2019).

En résumé, la voie de signalisation Notch est le principal régulateur des décisions binaires
concernant le destin des cellules au cours du développement embryonnaire (Henrique et
Schweisguth, 2019).

Il a été découvert récemment que le microbiote pouvait "manipuler" la signalisation Notch de son
hôte pour influencer la différenciation cellulaire dans l'intestin. Chez le poisson-zèbre, les bactéries
intestinales activent la voie de signalisation du récepteur TLR qui aboutit à activer Myd88, un
inhibiteur de la voie Notch. Cette inhibition favorise la différenciation des cellules épithéliales
intestinale sécrétrices par rapport aux autres types cellulaires de cet épithélium (Troll et al., 2018).

407
La voie de signalisation Hippo et ses composants YAP/TAZ

a voie de signalisation Hippo est originale car elle n’a pas de ligand, ni de récepteur clairement identifié.

L
Pourtant, il s’agit d’une voie fonctionnellement conservée au cours de l’évolution et impliquée dans la
prolifération cellulaire, la survie, les décisions relatives au destin cellulaire et dans la régénération
(Camargo et al., 2007). La voie Hippo a été initialement identifiée par des criblages génétiques en
mosaïque pour les suppresseurs de la prolifération chez la drosophile (Udan et al., 2003). La cascade de
signalisation Hippo contrôle la taille des organes et l’homéostasie tissulaire par le biais de la régulation de
la prolifération, de l’apoptose et de la régénération (Zheng et Pan, 2019).
*Figure 6-84. Hippo contrôle la taille des organes. Des
clones de cellules avec une mutation perte-de-fonction
de Hippo ont été produits chez la drosophile soit dans la
tête (a), soit dans les haltères (à la place des ailes dans le
segment thoracique 3, organe qui sert pour
l’équilibration lors du vol) (c). Des drosophiles sauvages
sont montrées pour comparaison (b, d). Source :
https://www.nature.com/articles/ncb1050

Sa dérégulation donne naissance à diverses maladies (Zhao et al., 2007 ; Zheng et al. al., 2020). Par exemple,
des études familiales ont révélé que les patients présentant des mutations hétérozygotes non-sens dans
YAP1, un des composants majeurs de la voie, présentent divers défauts, notamment une déficience
intellectuelle, une fente orofaciale ou un colobome, une anomalie du développement de l’œil (Williamson et
al., 2014). Certaines anencéphalies sont liées à des mutations causant la perte d’activité de NUAK2 (une
sérine/thréonine kinase) qui a pour conséquence une rétention cytoplasmique de YAP (Bonnard et al.,
2020). YAP ne peut donc plus activer la transcription de composants associés au cytosquelette importants
pour la neurulation. Signalons que NUAK2 est aussi important par une voie indépendante de YAP pour la
mise en place du cytosquelette et des molécules associées pour assurer la constriction apicale qui fait partie
des déformations nécessaires pour l’accomplissement de la neurulation et de la fermeture du tube neural.

408
 **Figure 6-85. Mécanisme pathologique causant l’anencéphalie chez les embryons humains dépourvus d’activité
NUAK2 causant une signalisation Hippo-YAP altérée. Dans un embryon normal, le neuroépithélium exprime des
niveaux élevés de NUAK2, permettant à YAP de rentrer dans le noyau et d’activer des gènes cibles (on dit que la voie
Hippo est désactivée à ce moment là – voir plus loin). Cela conduit à la réorganisation du réseau d’actomyosine pour
entraîner une constriction cellulaire apicale. En cas d’absence d’activité de NUAK2, le repliement du tube neural et
sa fermeture défectueuses causent une anencéphalie léthale. Source :
https://rupress.org/jem/article/217/12/e20191561/152044/A-loss-of-function-NUAK2-mutation-in-humans-
causes

De plus, le Cancer Genome Atlas a identifié la voie de signalisation Hippo comme l’une des 10 voies de
signalisation canoniques fréquemment altérées dans les cancers humains (Sanchez-Vega et al., 2018).

Lorsque la signalisation Hippo est activée, les composants en amont de la voie de signalisation, Mst1/2 et
Salv1 sont phosphorylés, puis activent les kinases Lats1/2 qui phosphorylent YAP et son coactivateur
transcriptionnel TAZ (Misra et Irvine, 2018). Ces phosphorylations aboutissent à la dégradation de ces
protéines. Lorsque la signalisation Hippo est désactivée, YAP et TAZ fonctionnent comme des co-
activateurs transcriptionnels et forment un complexe dans le noyau avec des facteurs de
transcription, notamment ceux de la famille TEAD, et activent l’expression de multiples gènes cibles
(Hong et Guan, 2012, Wang et al., 2018).

**Figure 6-86. Voie de signalisation Hippo. L'activation de la voie Hippo déclenche une cascade de phosphorylation
qui conduit à la phosphorylation des effecteurs de la voie Hippo, YAP/TAZ. La phosphorylation de YAP/TAZ aboutit
à leur destruction, bloquant l'expression génique médiée par TEAD qui a besoin de ces co-activateurs. L'inactivation

409
 de la voie Hippo empêche la phosphorylation de YAP/TAZ, permettant leur translocation nucléaire et donc
l'activation de la transcription médiée par TEAD. Source : https://www.nature.com/articles/s41536-022-00209-8

YAP et TAZ comme mécanotransducteurs

Les cellules doivent interpréter des signaux mécaniques au cours de la morphogenèse et cela se
traduit par des comportements cellulaires spécifiques. YAP/TAZ jouent souvent un rôle important
dans ces processus.

YAP/TAZ apparaissent en effet comme des capteurs de forces mécaniques (Dupont et al., 2011 ;
Panciera et al., 2017). La mécanotransduction YAP/TAZ peut être déclenchée par la densité cellulaire (soit
par l’adhésion cellule-cellule, soit par la surface cellulaire réduite (Zhao et al., 2007 ; Aragona et al., 2013 ;
Benham-Pyle et al., 2015), par la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) (Dupont et al., 2011 ; Aragona
et al., 2013 ; Elosegui-Artola et al., 2016), et par la contrainte de cisaillement (Nakajima et al., 2017). Cette
régulation peut être dépendante ou indépendante de la voie Hippo.

Dans le contexte de la densité cellulaire, les protéines de jonction cellulaire régulent l'activité YAP/TAZ. Par
exemple, la protéine de la neurofibromatose de type 2 (NF2 ou Merlin) qui se trouve en aval de la
signalisation contrôlée par les cadhérines et des intégrines, fonctionne comme un échafaudage des
composants de la cascade Hippo dans les jonctions cellule-cellule. NF2 recrute LATS1/2 à la membrane
plasmique, permettant l'activation de LATS1/2 par MTS1/2, ce qui conduit à l'inhibition de l'activité
YAP/TAZ (Mendosa et al., 2018).

Les composants des points d’adhérence focaux, qui relient cytosquelette et MEC, régulent également
l’activité YAP/TAZ en modulant la localisation subcellulaire de YAP (Kim et Gumbiner, 2015 ; Elosegui-
Artola et al., 2016). La rigidité de la MEC et la géométrie cellulaire contrôlent l’activité YAP/TAZ grâce à de
petites RhoGTPases déclenchant la tension du cytosquelette d’actomyosine (Dupont et al., 2011). Les forces
exercées par l’ECM peuvent entraîner l’activité YAP/TAZ par le biais de différents mécanismes. La GTPase
RAP2 liée à Ras transduit la rigidité de la MEC en réponses cellulaires YAP/TAZ via l’activation de la voie
Hippo (Meng et al., 2018).

**Figure 6-87. Une faible rigidité de la matrice extracellulaire active la voie Hippo (et diminue donc l'activité
YAP/TAZ) via la GTPase RAP2. Des cellules épithéliales de rein HEK293A sont mises en culture sur une MEC peu
rigide (1 kPA) ou très rigide (40 kPa) et l'expression de 3 gènes cibles dont l'expression est activée par YAP/TAZ est
étudiée par RT-qPCR. Les cellules sont soit sauvages (WT), soit n'expriment pas la GTPase RAP2 (RAP2-KO), soit
n'expriment pas YAP et TAZ (YAP/TAZ dKO). Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6128698/

Le complexe nucléaire SWI/SNF inhibe YAP/TAZ en réponse à une signalisation mécanique, de telle sorte
que pour déclencher l’activité YAP/TAZ, l’accumulation nucléaire de YAP/TAZ et l’inhibition de SWI/SNF
sont nécessaires (Chang et al., 2018). Les forces de la MEC peuvent réguler le transport à travers les pores
nucléaires entraînent l’importation nucléaire de YAP d’une manière indépendante d’Hippo (Elosegui-Artola
et al., 2017). De plus, Piezo1, un canal ionique mécanosensible, peut médier les effets de la rigidité du
substrat sur la localisation nucléaire du YAP (Pathak et al., 2014).

YAP/TAZ ne sont pas seulement modulés par des forces mécaniques, mais peuvent aussi contribuer en
retour à des modifications dans les forces mécaniques dépendantes de l’actomyosine en régulant
l’expression des gènes du cytosquelette et de la MEC (Porazinski et al., 2015 ; Lin et al., 2017, Nardone et al.,
2017). De plus, les signaux extracellulaires peuvent activer ou inhiber l’activité YAP/TAZ via les récepteurs
410
couplés aux protéines G (GCPR). Les GTPases Rho médient l’activation de YAP/TAZ par les GPCR, modulant
la tension du cytosquelette d’actomyosine (Yu et al., 2012). YAP/TAZ peut aussi indirectement augmenter
la rigidité de la MEC ce qui provoque une boucle de rétroaction positive (la rigidité de la MEC activant
YAP/TAZ) (Calvo et al., 2013).

En conclusion, YAP/TAZ agissent en tant qu’intégrateurs principaux de stimuli chimiques et mécaniques

dans différents contextes biologiques. Ils sont donc impliqués dans de nombreux processus migratoires qui
doivent intégrer les signaux biochimiques et biomécaniques. Par exemple, YAP est nécessaire aux
mouvements de convergence extension chez le poisson-zèbre, nécessaire à l'allongement de l'embryon
selon l'axe antéro-postérieur (Sousa-Ortega et al., 2023).

*Figure 6-88. YAP est nécessaire aux mouvements de convergence extension lors de la gastrulation du poisson-zèbre.
Suivi de la migration des cellules des embryons en gastrulation WT (A), mutant yap1−/− (B) et mutant
yap1−/−;yap1b−/− (C) et exprimant Histone2B::GFP pour la visualisation des noyaux. Chaque trajectoire cellulaire
est représentée par une ligne de couleur. Lorsqu'elle est présente, la ligne médiane de l'embryon formée par
convergence dans le plan de symétrie bilatérale est représentée par des lignes pointillées blanches. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-023-38482-w

YAP/TAZ dans le contrôle de la prolifération cellulaire pendant le développement

Des études de culture cellulaire montrent que la voie Hippo est activée lorsque la densité cellulaire est
importante et que l'inhibition de contact est activée, amenant à arrêter la prolifération. Cette activation de
la voie Hippo provoque la destruction de YAP (Kim et al., 2007). La surexpression de YAP permet aux
cellules d'ignorer l'inhibition de contact.

411
 *Figure 6-89. La localisation de YAP est régulée par la densité cellulaire. Les cellules NIH-3T3 et MCF10A ont été
cultivées à faible densité (haut) ou à forte densité (confluence) (bas). YAP a été immunolocalisé avec un anticorps
anti-YAP. On observe YAP dans le noyau des cellules peu denses mais à forte densité, il est exclu du noyau. Source :
http://genesdev.cshlp.org/content/21/21/2747.long

YAP est donc actif dans le noyau en phase proliférative des cellules. Au cours du développement
embryonnaire, YAP et également TAZ sont des régulateurs de la prolifération cellulaire et de la croissance
tissulaire (Camargo et al., 2007 ; Lei et al., 2008 ; Ota et Sasaki, 2008). YAP/TAZ déclenchent la prolifération
des progéniteurs mésenchymateux gastro-intestinaux (Cotton et al., 2017) et des cellules de la crête neurale
crânienne (Wang et al., 2016). YAP à lui seul contrôle également la prolifération des cardiomyocytes avec
l’aide de TEAD (Ota et Sasaki, 2008 ; Heallen et al., 2011) et des cellules épithéliales pulmonaires (Lin et al.,
2017).
*Figure 6-90. Prolifération réduite dans le myocarde des
embryons Tead1-/-. Distribution des cellules marquées
au BrdU dans les embryons de type sauvage (A, B) et
Tead1-/- (C, D) à E9.5. (B, D) Images agrandies des zones
encadrées en A et C. L'endocarde n'a pas l'expression de
Tead1. Abréviations : ec, endocarde ; fg, intestin
antérieur ; ht, cœur ; mc, myocarde ; nc, notocorde ; nt,
tube neural. Barres d'échelle : en A, 100 μm pour A, C ; en
B, 50 μm pour B, D. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/135/24/4059/64995/Mammalian-Tead-proteins-regulate-cell

De plus, YAP-TEAD maintient les progéniteurs de l'oreille interne grâce à l'activation des gènes du cycle
cellulaire (Gnedeva et al., 2020). Dans le même ordre d'idée, YAP/TAZ régulent la prolifération cellulaire
dans les progéniteurs neuraux de la moelle épinière de poulet en maintenant leurs propriétés de cellules
souches par l'activation du régulateur du cycle cellulaire cyclinD1 et l'inhibition du marqueur de
différenciation neurale NeuroM (Cao et al., 2008). La signalisation YAP/TAZ-TEAD régule également la
prolifération des progéniteurs neuraux dans le cerveau embryonnaire des mammifères (Han et al., 2015).
412
YAP/TAZ stimulent l'expansion des progéniteurs neuraux dans l'hippocampe en aval de NF2 (Lavado et al.,
2013) et maintiennent les progéniteurs neuraux dans le cortex en développement en activant la
transcription des gènes de prolifération et en empêchant la différenciation neurale (Lavado et al., 2018).
Parallèlement, YAP maintient également les propriétés prolifératives des progéniteurs basaux dans le
cortex humain (Kostic et al., 2019). Enfin, YAP/TAZ-TEAD entraîne la prolifération de progéniteurs neuraux
dans le cerveau postérieur du poisson zèbre en aval de la tension de l'actomyosine (Voltes et al., 2019). Bien
que YAP/TAZ jouent un rôle essentiel dans la croissance des tissus au cours du développement
embryonnaire, ils ne sont pas nécessaires à la physiologie normale dans la plupart des tissus adultes. Ainsi,
alors que la surexpression de YAP/TAZ a un effet important sur l'hyperprolifération tissulaire et la
promotion de la réparation tissulaire après une blessure, la suppression de YAP/TAZ dans de nombreux
contextes adultes n'a pas d'effet sur la prolifération tissulaire. En conclusion, YAP/TAZ jouent un rôle crucial
dans l'auto-renouvellement des cellules progénitrices au cours du développement embryonnaire.

Une inhibition de YAP/TAZ aboutit donc à la fin de la prolifération et permet la différenciation. Cela a été
bien démontré au cours du développement des hépatocytes où un miARN, miR-122, inhibe la traduction de
deux composants de la voie : TAZ et la phosphatase PPP1CC (qui déphosphoryle YAP1 et lui permet
d'échapper à la dégradation). miR-122 s'oppose ainsi à YAP/TAZ qui sont nécessaires pour la prolifération
des précurseurs des hépatocytes (Zhang et al., 2021).
***Figure 6-91. Inhibition de YAP/TAZ par miR-
122 au cours de la différenciation des hépatocytes.
Lors de la prolifération des précurseurs des
hépatocytes, la voie Hippo (et notamment
LATS1/2) phosphoryle YAP1 l'amenant à être
dégradé. Mais la phosphatase PPP1C
déphosphoryle YAP1 et lui permet de rentrer dans
le noyau et de s'associer avec TEAD. TAZ est
également actif. A la fin de la phase de
prolifération, le miARN miR-122 est exprimé et
inhibe la traduction de PPP1C et de TAZ. Source :
https://www.nature.com/articles/s41419-021-04436-7

Rôle de YAP et TAZ dans la détermination cellulaire

La voie Hippo a un rôle fondamental dans la première détermination cellulaire au cours du développement
des Mammifères : les cellules du blastocyste au stade 64 cellules deviennent soit des cellules du
trophectoderme, soit des cellules de la masse cellulaire interne.

Il semble que ce soit la forme des cellules liées à leur position qui est à l’origine de cette dichotomie et donc
c’est une conséquence d’une mécanotransduction (ce qui nous rapproche d’une partie évoquée plus haut).
Les cellules apolaires, à l’intérieur du blastocyste activent la kinase STK3/MST qui phosphoryle le facteur
de transcription YAP1 ce qui le retient dans le cytoplasme. Dans les cellules polarisées du bord du
blastocyste, STK3/MST est moins activé et donc YAP1 peut entrer dans le noyau et, avec TEAD4, il active
l’expression du facteur de transcription Cdx2. Cdx2 supprime l’expression des gènes codant les facteurs de
pluripotence Oct4 et Nanog, et active l’expression de diverses protéines nécessaires à la différenciation du
trophectoderme (voir Figure 2-5).

Dans des gastruloïdes en 2D générées à partir de cellules souches humaines, YAP1 est nécessaire à la mise
en place de l'ectoderme. En absence de YAP, du mésoderme et de l'endoderme se forme à son détriment.
YAP est nécessaire pour limiter l'activation de la voie de signalisation Nodal et ainsi permettre à de
l'ectoderme d'être déterminé (Stronati et al., 2022).

413
 **Figure 6-92. Rôle de YAP1 dans la détermination de l'ectoderme dans des gastruloïdes humains générées à partir
de cellules ES. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213671121006512

La voie de signalisation de l’auxine et ses rôles

*Figure 6-93. Acide indole-3-acétique (IAA ou auxine).

Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Indole-3-
acetic_acid

Le petit composé acide indole-3-acétique (IAA ou auxine et qui a un pKa = 4,7), une molécule connue
depuis les années 1930, a un rôle essentiel dans la régulation de la croissance et du développement
des plantes. Un système élaboré de transporteurs d'entrée et de sortie cellulaire régule la
distribution de l'auxine dans les tissus végétaux. Les changements induits par l'auxine dans
l'expression des gènes médient de très nombreuses réponses en aval qui dépendent du contexte
cellulaire.

Synthèse et transport de l’auxine

La principale auxine naturelle, l'acide indole-3-acétique (IAA) est en grande majorité synthétisée par la voie
de l'acide indole-3-pyruvique (IPA) dépendant du tryptophane (Korasick et al., 2013). TRYPTOPHAN
AMIDOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS1 (TAA1) et les protéines apparentées (TAR) convertissent le
tryptophane en IPA (Stepanova et al., 2008). Une voie partant du tryptophane mais indépendante de la
première permet de produire IAOx (indole-3-acetaldoxime) via les cytochromes P450 monooxygénases
CYP79B2 et CYP79B3. L'importance physiologique de la biosynthèse de l'IAA dépendante de l'IAOx a été
démontrée par l'analyse des doubles mutants cyp79b2; cyp79b3, qui ont des hypocotyles plus courts et des
niveaux d'IAA réduits lorsqu'ils sont cultivés à des températures élevées (Zhao et al., 2002).

414
 *Figure 6-94. Voies de biosynthèse de l'IAA chez les plantes. Les
voies YUC et CYP79B qui conduisent à la synthèse d'IAOx sont
illustrées respectivement par des flèches bleues et rouges. La
voie de biosynthèse de l'IAA dépendante de l'IAOx est
représentée dans les carrés gris. Les gènes clonés qui codent
potentiellement des enzymes pour les biosynthèses IAA, CL et IG
sont indiqués en italique. TRP = tryptophane. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2664063/

YUCCA est une famille de gènes codant des flavine-monooxygénases qui catalysent la N-hydroxylation de la
tryptamine, une étape qui mène aussi à la production de IAOx. Le mutant gain-de-fonction yucca présente
un phénotype indiquant une surproduction d'IAA : ces mutants, quand ils sont cultivés à la lumière, ont des
hypocotyles allongés et des cotylédons courbés vers le bas (épinastie). Ce mutant s'est avéré avoir des
niveaux endogènes élevés d'IAA libre résultant d'une transcription accrue du gène YUCCA (Cheng et al.,
2006). Le contrôle de l'expression des protéines YUCCA est impliqué dans la croissance des feuilles via leurs
effets sur la synthèse d'IAA et le facteur de transcription PLETHORA est un des acteurs majeurs de ce
contrôle (Pinon et al., 2012). Les facteurs de transcription de type hélice-boucle-hélice basique, PIF4 et PIF5,
par la régulation de TAA1 et YUCCA8, intègrent la température dans la voie de signalisation de l'auxine pour
contrôler la croissance de l'hypocotyle d'Arabidopsis.

L'IAA peut être modifié/inactivé de plusieurs manières, notamment par oxydation ou par conjugaison
d'acides aminés et de glucides.

Une fois les auxines synthétisées, elles doivent être distribuées de manière différentielle dans les différents
tissus de la plante. Le transport polarisé de l'auxine a été mis en évidence en 1932 par Van der Weijl grâce
à des expériences où des blocs de gélose avec ou sans auxine sont apposés sur des apex de germination. Le
dosage de l'auxine dans la gélose une heure après leur apposition a montré que l'auxine est toujours
transportée de la région apicale vers la région basale et ce, indépendamment de la gravité.

Les auxines peuvent se déplacer à longue distance dans le phloème ou de proche en proche via un système
de transport de cellule à cellule (Habets et Offringa, 2014). La vitesse moyenne de déplacement de l'auxine
est de 1 cm/h. Ce transport est requis pour l'accumulation locale d'auxine et la génération de gradients
pendant les stades de croissance et de développement (Geisler et al. 2014; Soriano et al. 2014).

415
 *Figure 6-95. Le transport polarisé de l'auxine est nécessaire à
la mise en place des axes de la plantule. L'acide N-1-
naphthylphthalamidique (NPA) inhibe le transport polarisé de
l'auxine passant par les cellules. Les embryons traités avec cet
inhibiteur ont une croissance racinaire réduite et n'arrivent pas
à former correctement des tiges et des feuilles. DMSO est le
solvant du NPA et sert de contrôle. Source :
https://academic.oup.com/plcell/article/26/6/2568/6098515

L'IAA peut se déplacer à travers la membrane plasmique par diffusion passive sous sa forme non
chargée (IAAH), alors que sous sa forme anionique (IAA-), il nécessite des transporteurs spécifiques
d'efflux et d'influx d'auxine (Petra´sˇek et Friml 2009).
*Figure 6-96. Propriétés chimiques et transport de
l'auxine. Les pourcentages des formes anioniques et
protonées de l'IAA (acide indole acétique) sont donnés
en fonction du pH en mettant l'accent sur les gammes de
pH apoplastique (dans la paroi, entre 5 et 5,5) et
cytosolique (entre 7 et 7,5) (A). Modèle de transport de
l'auxine montrant les différentes familles de
transporteurs : AUX/LAX, PIN et PGP. La forme
artificielle de l'auxine 1-NAA (acide 1-naphtalène
acétique) est lipophile et diffuse librement à l'intérieur
de la cellule (B). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2012.00225/full

416
Les transporteurs d'influx sont constitués par AUX1 et ses protéines apparentées LIKE AUX1 (AUX/LAX).

*Figure 6-97. Des mutations dans les gènes AUX/LAX entraînent des défauts de développement liés à un défaut
d'auxine. AUX1 régule le gravitropisme racinaire. AUX1 est exprimé dans les tissus qui sont impliqués dans la
perception de la gravité, la transmission du signal et la réponse et la mutation dans aux1 provoquent des racines
agravitropes (A). AUX1 et LAX3 régulent le développement des racines latérales (Swarup et al., 2008). AUX1 est
exprimé dans les ébauches des racines latérales tandis que LAX3 dans les cellules corticales et épidermiques en
contact avec les ébauches et les doubles mutants aux1; lax3 ont un retard important dans l'émergence des racines
latérales (B). LAX2 régule la structuration vasculaire dans les cotylédons (Péret et al., 2012). LAX2 est exprimé dans
les tissus vasculaires au cours du développement embryonnaire et les mutants lax2 présentent des ruptures
vasculaires dans les cotylédons (C). Barres d'échelle = 20 μm. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2012.00225/full

L'exportation de l'auxine hors des cellules dépend des transporteurs PIN (Adamowski et Friml, 2015).
Leur importance physiologique est soulignée par des phénotypes mutants perte-de-fonction pin souvent
sévères, qui peuvent être imités par l'application d'acide naphtylphtalamique (NPA), souvent utilisé en
expérimentation, qui est un inhibiteur compétitif des PIN. La famille des protéines PIN est exclusive au
règne végétal. Elles ont dix hélices transmembranaires comprenant deux domaines à cinq hélices
transmembranes séparées par une boucle cytosolique. Les PIN canoniques (PIN1–4 et PIN7 chez A.
thaliana) sont caractérisés par une longue boucle (323–355 résidus) et sont principalement situés dans la
membrane plasmique, tandis que les PIN non canoniques (PIN5, PIN6 et PIN8) possèdent une boucle
beaucoup plus courte et peuvent être trouvés dans les membranes du réticulum endoplasmique. Ils
pourraient jouer un rôle de régulation du stockage de l'auxine.

417
 **Figure 6-98. Structure des PIN longs et courts
d'Arabidopsis thaliana. (A) Structure de PIN1. Les
parties de la boucle hydrophile marquées de cases
grises indiquent une disposition approximative des
régions conservées (C) et variables (V) entre les
différents PIN. Les positions des motifs canoniques
hautement conservés HC1 à HC4 sont indiquées par des
lignes pleines avec les acides aminés correspondants.
(B) Structure de PIN5 avec 10 domaines
transmembranaires séparés par une courte région
hydrophile. Les positions des acides aminés en italique
indiquent le début et la fin du domaine hydrophile
court. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.00985/full

Les longues boucles des PIN canoniques ont des sites de phosphorylation qui régulent l'activité ; les boucles
sont auto-inhibitrices, nécessitant une activité kinase pour initier le transport.

PID (PINOID) est une sérine/thréonine kinase qui phosphoryle PIN1 (Christensen et al., 2000).
**Figure 6-99. La surexpression de la kinase PID
perturbe la signalisation de l'auxine. Expression du gène
rapporteur de l'activité de l'auxine DR5::GUS à
l'extrémité de racines de plants d'Arabidopsis sauvage
(F) et surexprimant PID (G). Barre d'échelle = 50 μm.
Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-
8674(00)80682-0

Des études complémentaires ont montré que la phosphorylation de PIN1 par PID aboutit à une localisation
cellulaire différente de la protéine de transport (localisation apicale plutôt que basale), ce qui limite le
transport habituel de l'auxine (Friml et al., 2004, Michniewicz et al., 2007).

De nombreuses hormones modulent la signalisation de l'auxine en agissant sur les transporteurs PIN.

418
 **Figure 6-100. Régulation hormonale du trafic de PIN. Les transporteurs d'auxine polaire (par exemple les PIN)
subissent un recyclage constant entre la membrane plasmique et les compartiments endosomaux (flèches vertes).
En réponse à des signaux développementaux ou environnementaux, les niveaux de PIN peuvent être diminués par
leur redirection vers la dégradation lytique dans les vacuoles (flèches bleues). Les hormones végétales interfèrent
avec différentes étapes de la voie du trafic PIN, contribuant ainsi à affiner le transport de l'auxine et la régulation de
la croissance et du développement des plantes. ABA, acide abscissique; BR, brassinostéroïdes ; CK, cytokinines ; GA,
acide gibbérellique; JA, acide jasmonique; NO, oxyde nitrique ; SA, acide salicylique ; SL, strigolactones ; LE,
endosome tardif ; MVB, corps multivésiculaire ; PVC, compartiment prévacuolaire ; TGN, réseau transgolgien.

Les cytokinines qui agissent autour du méristème racinaire restreignent la signalisation auxine en
agissant sur les transporteurs PIN. Les cytokinines sont perçues par le récepteur AHK3 et le signal est
transduit par régulateurs ARR1 et ARR12, ce qui active directement la transcription du répresseur
IAA3/SHORT HYPOCOTYL 2 (SHY2), qui entraîne l'atténuation des réponses à l'auxine et diminue
l'expression des transporteurs PIN (à la fois au niveau de la transcription de leurs gènes et par stimulation
de leur endocytose et de leur dégradation), restreignant le transport de l'auxine (Dello Ioio et al., 2008;
Ruzicka et al, 2009).

*Figure 6-101. Les cytokinines diminuent la transcription des gènes codant les transporteurs PIN dans la racine. Des
plants transgéniques avec le gène rapporteur GFP sous le contrôle des promoteurs de PIN1 (D), PIN2 (E) et PIN3 (F)
sont soumis à un traitement dans un solvant (MS) ou en présence de d'une cytokinine (BA = N6-benzyladenine).
Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.0900060106

Ainsi, la balance auxine/cytokinines régule la mise en place du méristème apical racinaire et régule
le nombre de cellules souches avec l'auxine en faveur du méristème et les cytokinines en opposition
par restriction du transport et de l'action de l'auxine.

L'acide abscissique renforce l'action des cytokinines car ses voies de signalisation aboutissent à augmenter
l'activité du facteur de transcription ABI4 qui inhibe également l'expression de PIN1 (Shkolnik-Inbar et al.,
2011).

419
Réception de l'auxine et voies de transduction du signal
La présence de l'auxine est transduite dans le noyau. Dans leur état de repos, les répresseurs
AUX/IAA se lient aux facteurs de réponse à l'auxine (ARF) et répriment leur activité en recrutant les
co-répresseurs TOPLESS (TPL/TPR). On pense que les TPL/TPR agissent en recrutant des histones
désacétylases, conduisant ainsi la chromatine vers un état répressif (Long et al., 2006 ; Szemenyei et al.,
2008). En présence d'auxine, les récepteurs TIR1/AFB se lient aux AUX/IAA et ces derniers sont alors
rapidement ubiquitinés et dégradés, libérant ensuite les ARF qui peuvent activer les gènes cibles de l'auxine
(Mockaitis et Estelle, 2008).
**Figure 6-102. Démonstration que l'auxine se fixe
directement sur TIR1. Des embryons de xénope à deux
cellules ont été injectés avec de l'ARNm codant TIR1-Myc
(Myc est un tag pour pouvoir mieux reconnaitre TIR1).
Les embryons ont été récoltés au stade 13 (fin
gastrulation) et des extraits ont été réalisés pour être
utilisés dans le "pull-down" où on teste l'interaction en
TIR1-Myc et 1-NAA (un analogue d'auxine) ou le 2-NAA
(qui ressemble à la molécule précédente mais qui n'a pas
d'effets biologiques). On récupère la fraction des
protéine TIR1-Myc ayant interagit avec l'un ou l'autre
ligand et on l'analyse par western-blot avec un anticorps
anti-Myc. (a, b) TIR1–Myc exprimé par le xénope
interagit avec 1-NAA (mais beaucoup moins avec 2-NAA)
de manière dose-dépendante. (c) Les lavages avec du 1-
NAA mais pas du 2-NAA des protéines extraites avec le
pull-down augmente la quantité de TIR1–Myc présente
dans la solution de lavage. Source :
https://www.nature.com/articles/nature03542

*Figure 6-103. Activation de la transcription médiée par ARF par l'auxine. La transduction intracellulaire de la
signalisation de l'auxine est coordonnée par le récepteur TIR1/AFB, ainsi que les facteurs AUX/IAA et ARF. L'auxine
agit comme une « colle moléculaire » et facilite l'interaction entre les protéines SCF-TIR1/AFB et Aux/IAA. À de
faibles concentrations d'auxine, le répresseur AUX/IAA se lie au facteur de transcription ARF et forme un dimère qui
recrute le co-répresseur TPL (TOPLESS) ce qui inhibe l'activité ARF et l'expression des gènes cibles de l'auxine.
Lorsque la concentration d'auxine augmente, AUX/IAA se lie au complexe SCF TIR1/AFB et est ubiquitinée puis
dégradée par la protéase 26S. Les facteurs de transcription ARF sont alors libérés pour activer la transcription des
gènes en aval. DBD = domaine de liaison à l'ADN ; MR = région médiane ; PB1 = domaine Phox et Bem 1. Source :
https://www.mdpi.com/2076-3417/12/3/1360

420
Cependant, certaines actions de l'auxine comme l'entrée de Ca 2+ dans le cytoplasme, une hyperpolarisation
membranaire, le contrôle de l'endocytose ou l'activation des GTPases ROP sont trop rapides pour ne
dépendre que du contrôle de la transcription (Dubey et al., 2021). Il existe donc des récepteurs
transmembranaires sensibles à l'auxine extracellulaire et activant des voies de transduction rapides dans
la cellule. En présence d'auxine extracellulaire (apoplastique), les protéines extracellulaires ABL1 et ABL2
forment un complexe avec la protéine transmembranaire TMK ce qui active l'activité kinase à son extrémité
intracellulaire de TMK (Yu et al., 2023).
**Figure 6-104. ABL1 et ABL2 s'associent à TMK1 en
présence d'auxine. L'interaction entre ABL1/2 et TMK1
est montrée par co-immunoprécipitation de plants
d'Arabidopsis exprimant pTMK1 :: TMK1-GFP (TMK1-
GFP) traités avec 200 nM de NAA (une auxine
synthétique) avec différentes durées. Les protéines des
plants TMK1-GFP et BRI1-GFP (BRI1 est un récepteur
aux brassinostéroïdes utilisé ici en tant que contrôle
négatif) ont été immunoprécipitées à l'aide de
d'anticorps anti-GFP et le culot a été analysé par
Western blot en utilisant des anticorps anti-ABL1 ou
anti-ABL2 (panels supérieurs IP). Les quantités dans le
lysat total pour ABL1, ABL2, TMK1-GFP et BRI1-GFP
sont montrés (dans les panels du milieu et du bas
(Input)). On observe qu'au bout de 10 minutes de
traitement avec l'auxine synthétique, une proportion
nettement plus grande d'ABL1 et d'ABL2 est associée à
TMK1. Source :
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-
8674(23)01134-0

L'auxine et les racines secondaires

La phase d'initiation des racines secondaires commence lorsque deux cellules adjacentes du péricycle
commencent à se diviser de manière asymétrique et créent un primordium (Péret et al., 2009). Ce processus
est associé à l'accumulation d'un maximum d'auxine dans les cellules fondatrices du péricycle (Benková et
al., 2003; De Smet et al., 2007).

*Figure 6-105. Distribution de l'auxine dans les ébauches des racines secondaires
Expression de DR5 :: GUS qui dépend de l'activité de la voie de signalisation de l'auxine au cours du développement
de l'ébauche des racines secondaires : le gradient d'activité de l'auxine avec le maximum à la pointe de l'ébauche est
progressivement établi. OL et IL, couches externes et internes. Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-
8674(03)00924-3

Les transporteurs d'entrée (ou d'influx) de l'auxine dans la cellule sont impliqués dans la régulation du
développement des racines secondaires. Par exemple, AUX1 est exprimé dans les cellules du péricycle avant
la première division asymétrique initiale. Le mutant aux1 présente une réduction de 50% du nombre de
racines secondaires (Hobbie et Estelle, 1995; Marchant et al., 2002).

421
 *Figure 6-106. L'expression du transporteur d'influx d'auxine
LAX3 dans les cellules corticales puis dans les cellules
épidermiques faisant face à l'ébauche des racines secondaires
est nécessaire pour faciliter l'émergence de la racine
secondaire (A). LAX3 amplifie le signal de l'auxine par un
mécanisme de boucle de rétroaction positive : l'auxine
déclenche la dégradation de l'inhibiteur IAA14/SLR1 ce qui
permet l'activation l'expression de LAX3 par ARF7/ARF19.
Parce que LAX3 est un transporteur d'influx d'auxine, son
expression se traduit par plus d'auxine entrant dans la cellule.
En conséquence, un ensemble de gènes de remodelage de la
paroi cellulaire (CWR) sont induits par l'auxine
spécifiquement dans ces cellules (B). Ce mécanisme permet
non seulement l'amplification du signal d'auxine mais
également la restriction de l'accumulation d'auxine dans les
cellules de l'ébauche de racine secondaire. Source :
https://academic.oup.com/jxb/article/60/13/3637/53253
1

*Figure 6-107. Auxine et formation des racines

secondaires. Les racines latérales se forment dans le
péricycle profondément à l'intérieur de la racine
primaire et doivent émerger à travers le tissu externe, en
passant par les cellules endodermiques, corticales
(bleues) et épidermiques (A). Mécanisme proposé par
Swarup et al. (2008) décrivant comment l'auxine (IAA)
entrant dans la cellule corticale induit l'expression de
LAX3. Cela génère l'établissement d'une boucle de
rétroaction positive qui déclenche des niveaux élevés
d'auxine et l'induction ultérieure de gènes de
remodelage de la paroi cellulaire (CWR), tels que la
polygalacturonase (PG) (B). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2012.00225/full

L'auxine joue également un rôle dans les cellules endodermiques recouvrant

les ébauches des racines secondaires pour les adapter au passage de ces racines grâce à une perte de volume
contrôlée (Vermeer et al., 2014). La destruction des adhérences cellulaires dans les tissus recouvrant
l'endoderme est également médiée par l'auxine, permettant ainsi à la racine secondaire en croissance de
traverser le cortex et l'épiderme (Swarup et al., 2008).

Lorsqu'il existe un déficit modéré en nitrate dans le sol, Arabidopsis forme des racines avec une quantité
plus importante de racines secondaires. Cela est dû à une plus importante concentration d'auxine dans la
racine par une stimulation du transport de l'auxine des parties aériennes vers les parties racinaires. A
l'inverse, un excès de nitrate inhibe ce transport (Tian et al., 2008). En cas de déficit de nitrates, il y a aussi
une production racinaire plus importante d'auxine par l'augmentation de l'expression de TAR2, une enzyme
intervenant dans sa biosynthèse, dans le péricycle et les éléments vasculaires (Ma et al., 2014).

422
 **Figure 6-108. L'enzyme TAR2 impliquée dans la synthèse
d'auxine est nécessaire à l'augmentation de la production de
racines secondaires en cas de déficit de nitrate. Des plants
d'Arabidopsis sauvages (Col-0) ou mutants perte-de-fonction
tar2-c ont été cultivés en conditions d'abondance de nitrates
(HN) ou de déficit en nitrates (LN). Source :
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tpj.12448

L'auxine et l'expansion de la paroi

Voir page 278 et suivantes.
L'auxine et la dominance apicale
La présence du bourgeon terminal ou apical provoque la dormance des bourgeons axillaires en
dessous. Si on supprime la partie apicale (contenant le bourgeon terminal) alors les bourgeons
axillaires se réveillent et commencent leur croissance. C'est ce que l'on appelle la dominance
apicale.

Historiquement, R. Snow en 1925 a montré que le maintien de la dominance apicale nécessite un

signal qui se déplace vers le bas à partir du bourgeon apical. Thimann et Skoog (1933) ont identifié
l'auxine comme le signal inhibiteur descendant. L'élimination de la source d'auxine apicale par
décapitation abolit la dominance apicale, tandis que l'application d'auxine à l'apex de ces plantes
décapitées peut restaurer cette dominance. Cependant, l'effet inhibiteur de l'auxine n'est pas direct.
Il a été démontré que l'application externe d'auxine sur les bourgeons axillaires n'empêche pas leur
croissance et des expériences avec de l'auxine radiomarquée ont révélé que l'auxine dérivée de l'apex ne
pénètre pas dans le bourgeon dormant. De plus, le transport de l'auxine semble être trop lent pour
provoquer un effet direct (Booker et al., 2003). À la suite de ces études, un second messager longue distance
a été recherché.

Les cytokinines sont produites dans les racines et la tige et transportée vers le haut (de manière acropète)
dans le xylème (Nordstrom et al., 2004). Les manipulations de la teneur en cytokinines végétales montrent
des effets clairs sur le contrôle de la croissance des bourgeons, par exemple, l'application de cytokinine
sur les bourgeons axillaires libère la dormance même chez les plantes qui ont un apex intact (Sachs
et Thimann, 1964). Les cytokinines agissent donc de manière antagoniste à l'auxine. L'auxine inhibe
la biosynthèse des cytokinines en diminuant l'expression du gène codant une enzyme de biosynthèse de
la cytokinine ISOPENTENYLTRANSFERASE (IPT) dans la tige (Tanaka et al., 2006) et ce qui est cause en
grande partie la dominance apicale. De plus, il a été montré pour les tiges de pois que l'auxine induit le gène
de la cytokinine oxydase PsCKX2 (Shimizu-Sato et al., 2009). Les cytokinines oxydases inactivent les
cytokinines et, par conséquent, réduisent le pool de cytokinine active.

Même si le bourgeon apical est présent, les bourgeons axillaires à une plus grande distance de lui
peuvent également se réveiller, stimulés par les cytokinines provenant des racines. En fait, tout
dépend du rapport auxine/cytokinines avec un rapport bas pour que les bourgeons axillaires
puissent se développer.

L'auxine et la croissance des fruits

De par ses propriétés activatrices de l'expansion et de la maturation de la paroi, l'auxine est
également impliquée dans la croissance des fruits.

423
 *Figure 6-109. Mise en évidence du rôle de l'auxine lors
du développement de la fraise par l'expérience de Nitsch
(1950). Rappelons que, stricto sensu, le fruit est formé
par les carpelles qui donnent ici des akènes mais ce qui
est appelé communément la fraise est formé par une
hypertrophie du réceptacle floral.

Lors du développement des fruits, des nouveaux éléments de la paroi doivent être ajoutés, notamment des
pectines qui doivent être estérifiées pour jouer leur rôle. L'expression de la pectine estérase FaPE1 est
activée par l'auxine (Castillejo et al., 2004).
*Figure 6-110. Contrôle de l'expression du gène codant
la pectine estérase FaPE1 par l'auxine. Des fraises pas
encore mûres sont traitées ou non avec un analogue de
l'auxine (NAA). Leurs ARNs sont extraits et l'expression
de FaPE1 est étudiée par RT-PCR. Les ARNr servent de
contrôle d'extraction. Source :
https://academic.oup.com/jxb/article/55/398/909/468094

Lors du murissement avancé du fruit, les pectines sont solubilisées et dépolymérisées. A ce moment,
l'auxine n'agit plus et c'est l'éthylène qui participe à ce processus qui peut aboutir au ramollissement et au
pourrissement du fruit.

424
PARTIE 7

Les gènes et les cellules en action au cours du

développement

425
Axe antéro-postérieur chez la drosophile

es insectes sont des organismes segmentés (métamérisés) le long de l’axe antéro-postérieur

L
(AP). Plusieurs segments sont rassemblés en tagmes : tête, thorax, abdomen. Il y a une forte
régionalisation des segments ce qui est évident lorsqu’on observe les appendices spécifiques
pour chacun d’entre eux (antennes, pièces buccales, pattes…). Cette régionalisation se met en
place par une cascade de régulation d’expression génique qui démarre très tôt, avec les premiers
évènements qui ont lieu dès l’ovogenèse.
*Figure 7-1. Embryon de drosophile de stade 13 vu au
microscope électronique à balayage (vue latérale, le côté
antérieur est à gauche, le côté dorsal en haut). À part les
parasegments céphaliques qui sont colorés
artificiellement (Mn = mandibule, Mx = maxilles, Lb =
mabium), les parasegments thoraciques (T) ou
abdominaux (A) ne semblent pas très différenciés les uns
des autres. Pourtant, une cascade de régulations
génétiques est en train de spécifier l'identité de chacun
de ces parasegments. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-022-32408-
8

Au cours du développement précoce de la drosophile, les facteurs de transcription distribués en

gradients dans l’unique cellule aux multiples noyaux servent de morphogènes pour contrôler la
spécification du destin cellulaire en contrôlant l’activité des enhancers, des silencers et des
promoteurs. Il existe aussi un contrôle de la traduction.

Signalons qu’au cours de l’embryogénèse, ce sont les parasegments et non directement les segments
qui sont délimités. Un parasegment comprend la partie postérieure d’un segment n et la partie
antérieure d’un segment n+1.

Bicoid et Nanos
Chez la drosophile, des gradients de protéines établis maternellement tels que celui du facteur de
transcription et de traduction Bicoid (Bcd) et du régulateur de la traduction Nanos définissent les
régions antérieures et postérieures, et activent une cascade complexe de régulation des gènes qui
conduisent finalement à la segmentation et à la spécification régionale de l’axe antéro-postérieur
(AP).

Voir vidéo : https://youtu.be/wZ70G5pSZqs : Embryon de drosophile exprimant Histone-RFP (pour

voir tous les noyaux, en haut) et Bicoid-GFP (en bas). On observe le gradient de Bicoid selon l'axe
antéro-postérieur (côté antérieur à gauche). La coloration Bicoid disparait au moment des mitoses.

426
 *Figure 7-2. Le positionnement de l’ARNm bicoid est un élément fondamental pour la mise en place de l’axe AP chez
la drosophile. Habituellement, l’ARNm de bicoid (bcd) est positionné au futur pôle antérieur de l’embryon. Les
ovocytes et les embryons sans bicoid (issus d’une mère mutante (gène à effet maternel)) ne forment plus de
structures antérieures. L’injection d’un ARNm bcd dans l’ovocyte ou le zygote permet de restaurer le phénotype
sauvage. Cette injection du côté postérieur dans un ovocyte ou un zygote normal provoque une duplication du côté
antérieur en miroir (présence d’un double gradient de Bicoid).

Cependant, chez d’autres Arthropodes, comme les coléoptères, les millepattes et les araignées, ainsi que
chez les Vertébrés, la segmentation AP est causée par un mécanisme d’oscillation semblable à une horloge
dépendant de Hairy/Notch/Delta, qui est initié et contrôlé par un gradient de signalisation Wnt (et, dans le
cas des vertébrés, également par la signalisation FGF) à l’extrémité postérieure (Chipman et Akam, 2008 ;
El-Sherif et al., 2012 ; Gomez et al., 2009 ; Schönauer et al., 2016). Étonnamment, le régulateur du
développement crucial Bicoid s’est avéré être une innovation évolutive au sein des Diptères (l’Ordre des
Insectes qui comprend la drosophile) résultant de la duplication et de la divergence de l’homologue du gène
de la famille Hox zerknüllt (Stauber et al., 2002). Tout ce qui va suivre est donc spécifique aux Diptères et
pas généralisable à l’ensemble des Insectes et encore moins à l’ensemble des animaux.

L’ARNm bicoid (bcd) est exprimé par la mère et contient des séquences de localisation dans son
3’UTR qui aboutissent à la concentration des transcrits au pôle antérieur de l’ovocyte puis des
embryons de drosophile. Lors de la fécondation, la traduction de ces transcrits localisés aboutit à
un gradient de protéine le long de l’axe AP (découvert par Driever et Nüsslein-Volhard en 1988). La
synthèse dans le pôle antérieur est suivie de la diffusion, ainsi que du transport « de retour » vers le
côté antérieur ou de la dégradation des protéines, ce qui affine la forme du gradient Bcd (Durrieu et
al., 2018).
*Figure 7-3. Distribution des protéines Bcd
dans des embryons précellulaires sauvages et
mutants. L’anticorps anti-Bcd détecte la
protéine Bcd (fluorescence rouge) dans les
embryons du cycle nucléaire 4-14 sauvages
(WT) et mutants exu et stau qui sont déficients
pour des protéines importantes pour la
localisation antérieure de l’ARNm de bcd
comme vous pouvez le constater sur les
premières lignes. Les noyaux sont en
prophase, le côté dorsal en haut et le côté
antérieur à gauche. Les images sont des
composites de projection à partir de coupes
optiques en série de microscopie confocale (46
à 50 par embryon, s’étendant de la surface
dorsale à la surface ventrale). La fluorescence
est plus intense à l’extrémité antérieure. Dans
les embryons mutants, elle s’étend plus
postérieurement que dans le WT. La
fluorescence est concentrée dans les noyaux
des embryons du cycle nucléaire 6-14. Source
: https://elifesciences.org/articles/13222

Une fois le gradient formé, la protéine Bcd, un facteur de transcription à homéodomaine, se lie à des
motifs de séquence d’ADN spécifiques et active de manière différentielle les gènes le long de l’axe
AP (Struhl et al., 1989).

427
 *Figure 7-4. Homéodomaine de Bicoid accroché à sa
séquence cible sur l'ADN. Bicoid est représenté en vert.
La séquence consensus ciblée par Bicoid est TAATCC.
Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Bico%C3%AFd_%28g%C3%A8ne%29#/media/
Fichier:PyMOL_rendering_of_Bicoid_homeodomain_bound_to_its_consensus_site.png

Bcd peut affecter l’expression de gènes cibles, bien sûr dans les régions antérieures où il est le plus
concentré mais aussi dans les régions postérieures, où le gradient est plus diffus, en formant des centres
locaux dans les noyaux qui sont suffisamment concentrés pour rendre possible la liaison du Bcd aux
enhancers (Mir et al., 2017). De plus, malgré le court laps de temps pendant lequel les molécules Bcd sont
liées à l’ADN (Mir et al., 2018), cet apport se traduit par des régulations d’expression génique précises et
rapides, à l’échelle de quelques minutes (Desponds et al., 2020).

Ensemble, ces mécanismes qui régulent la distribution de Bcd dans l’embryon et son interaction
avec les enhancers cibles déterminent la capacité de ce morphogène à affecter différemment
l’expression des gènes à travers l’axe AP.

L’un des gènes cibles de Bcd est hunchback. L’étude de l’enhancer proximal hb (hunchback), une région
de 750 pb régulée par Bicoid démontre qu’avec le promoteur associé, P2, il est suffisant pour récapituler
correctement la dynamique spatio-temporelle d’établissement de l’expression de Hunchback (Lucas et al.,
2018). Cependant, dans ce cas particulier, la modélisation mathématique suggère que les six sites de liaison
Bcd présents dans cette séquence activatrice sont insuffisants pour soutenir dans le temps une expression
qui est aussi précise que l’expression réelle du gène hb. Une régulation supplémentaire doit être à l’œuvre.
Des sites supplémentaires cryptiques, notamment de faible affinité de liaison de Bcd et/ou d’autres facteurs
de transcription distribués en gradients pourraient également contrôler le maintien de l’expression et la
délimitation de la frontière du domaine d’expression de hb. Par exemple, la protéine Hb maternelle est
également présente dans un gradient antéro-postérieur et soutient l’expression zygotique de hb en
facilitant l’expression à un seuil de concentration de Bcd inférieur (Porcher et al., 2010). Bien que Bcd active
plus de 40 gènes cibles pour initier la formation de l’axe AP d’une manière apparemment dépendante de la
concentration, il est reconnu que l’apport d’autres facteurs est nécessaire pour soutenir l’expression
appropriée des gènes cibles (Briscoe et Small, 2015).

Bcd a également un rôle de répresseur de la traduction avec le même homéodomaine avec lequel il
se fixe sur l’ADN et contrôle la transcription. Sa principale cible est l’ARNm de caudal qui est
uniformément réparti dans le cytoplasme. L’homéodomaine de Bcd se fixe sur une séquence du
3’UTR de l’ARNm de caudal et empêche la fixation correcte du complexe d’initiation de la traduction.
Cette fonction nécessite l’activité de Bin3, une ARN méthyltransférase qui méthyle l’ARN 7SK qui est
impliqué dans le complexe répresseur de la traduction initié par Bcd (Singh et al., 2011). Ainsi, malgré la
présence d’ARNm caudal uniforme dans l’embryon, y compris dans la partie antérieure, la protéine
Caudal ne sera présente que dans la partie postérieure. Caudal est nécessaire à la formation de
l’abdomen.

On l’a vu, la localisation antérieure de l’ARNm de bcd est fondamentale et elle dépend de la protéine
Staufen. Chez le mutant perte de fonction staufen (stau), le gradient n’est pas visible comme on peut
le constater sur la Figure 7-2. L’ARNm de bcd est synthétisé dans les cellules nourricières qui
appartiennent à la lignée germinale. Les ARNm passent entre cellules nourricières puis vers
428
l’ovocyte grâce à des ponts cytoplasmiques. Les cellules nourricières se trouvent du côté du pôle
antérieur de l’ovocyte, ainsi l’ARNm de bcd est spontanément localisé antérieurement dans un
premier temps. Mais sans Staufen, les phénomènes de diffusion aboutissent à une uniformisation du
gradient de l’ARNm de bcd.

La région 3’UTR de l’ARNm de bcd présente une séquence particulière qui provoque une structure
secondaire remarquable de l’ARN. Cette structure avec des tiges et des boucles est reconnue par
Staufen, lequel forme un complexe avec le moteur moléculaire dynéine. Dans l’ovocyte, le réseau de
microtubules est orienté de telle manière que le pôle négatif des microtubules est orienté du côté
du futur pôle antérieur de l’embryon. Ainsi, même si l’ARNm de bcd tend à diffuser postérieurement,
il est sans arrêt ramené vers la région antérieure par la dynéine qui se déplace vers le pôle négatif
des microtubules.

La segmentation postérieure est contrôlée par Nanos (Nos), qui est traduit à la fin de l’ovogenèse à
partir du sous-ensemble d’ARNm nos synthétisé par la mère et localisé dans le pôle plasmique du
cortex postérieur de l’ovocyte. La localisation postérieure de l’ARNm de nanos dépend d’Oskar qui
est lui-même localisé à ce pôle postérieur où il a non seulement un rôle dans la mise en place de l’axe
AP mais aussi dans la mise en place du plasme germinatif d’où émergeront les cellules germinales
primordiales.

Le transport de l’ARNm osk dans l’ovocyte dépend de réseaux de microtubules polarisés dont les extrémités
positives sont enrichies au pôle postérieur. Une fois localisé, l’ARNm osk produit 2 isoformes, Osk long et
court, grâce à des utilisations alternatives de 2 codons d’initiation dans le même cadre de lecture. L’Osk long
partage l’intégralité de la fraction Osk court, mais ils ont des fonctions distinctes. Osk court initie
l’assemblage de plasme germinatif en recrutant des composants tels que Vasa (Vas), Tudor (Tud) et
Aubergine (Aub), ainsi que des ARNm qui codent des facteurs impliqués dans l’établissement de cellules
germinales. En revanche, le long Osk n’a pratiquement aucune activité pour recruter les composants du
plasme germinatif mais est indispensable pour les ancrer au cortex de l’ovocyte. Dans les ovocytes
dépourvus d’Osk long, les composants du plasme germinatif, y compris l’Osk court, rediffusent dans le
cytoplasme de l’ovocyte. La défaillance de l’ancrage du plasme germinatif au cortex entraîne une réduction
drastique du nombre de cellules polaires formées au pôle postérieur. Les 2 isoformes d’Osk diffèrent
également par leurs distributions subcellulaires : l’Osk court est situé sur les granules polaires, des
complexes ribonucléoprotéiques dans le plasme germinatif, tandis que l’Osk long est présent à la surface
des endosomes.

Revenons à Nanos. Il est un répresseur qui régule la segmentation en bloquant la traduction de

l’ARNm hunchback (hb) maternel (Cho et al., 2006). En plus de cette fonction au début du développement
embryonnaire, Nanos joue de nombreux autres rôles dans l’organisme, notamment la régulation de
plusieurs aspects du développement des cellules germinales primordiales, le maintien du destin des cellules
souches dans le germe ovarien, la régulation du développement et de l’activité neuronale, et la protection
des cellules contre la perte d’activité de la protéine du rétinoblastome (Rb). Des études sur des cellules de
mammifères et des souris ont révélé que les fonctions de tampon Rb et de maintien des cellules germinales
de Nanos sont conservées au cours de l’évolution.

Nanos ne reconnaît pas les ARNm cibles à lui seul ; des expériences sur trois cibles de Nanos bien étudiées
– hb, bcd et CycB – ont montré que Nanos se lie conjointement avec Pumilio (Pum) à des éléments de
séquence conservés dans chaque 3′-UTR. Pumilio est une protéine de liaison à l’ARN de haute spécificité qui
est uniformément distribuée dans l’embryon précoce. Pumilio reconnaît 8 nucléotides, un avec chacune des
8 répétitions qui constituent son domaine Puf de liaison à l’ARN. En revanche, Nanos n’a essentiellement
aucune spécificité de liaison propre, mais peut être recruté spécifiquement pour les complexes Pumilio-
ARN. Des études structurelles ont montré que la queue C-terminale de Nanos interagit avec le domaine Puf
de liaison à l’ARN de Pumilio pour modifier sa conformation, permettant aux deux protéines de se lier de
manière coopérative à des sites qui fonctionnent in vivo en tant qu’éléments régulateurs Nanos (NRE)
(Weidmann et al., 2016).

429
 ***Figure 7-5. Complexe ternaire Nanos, Pumilio et
ARNm de hunchback. Structure cristalline d’un complexe
ternaire Nanos(Nos)-Pumilio(Pum)-Nanos-Response
Element de l’ARNm de hunchback(hb). Pum est
représenté sous forme de diagramme en ruban (jaune),
Nos est représenté sous forme de surface (bleu) et
l’ARNm hb est représenté sous forme de modèle en bâton
coloré par type d’atome. Les extrémités N- et C-
terminales des protéines et les extrémités 5′ et 3′ de
l’ARN sont marquées. Les répétitions Pum R1 à R8 et les
pseudo-répétitions R1′ et R8′ sont indiquées. Source :
https://elifesciences.org/articles/17096

Au cours du développement embryonnaire précoce, les régions activatrices doivent devenir exemptes de
nucléosomes, afin d’être accessibles à la liaison des facteurs de transcription morphogènes. Ce processus
est soutenu par une classe particulière de facteurs de transcription appelés facteurs pionniers. Les pionniers
sont les premiers facteurs de liaison à l’ADN spécifiques à la séquence à engager des sites cibles dans la
chromatine au cours du développement. Un facteur pionnier peut se lier aux activateurs cibles dans la
chromatine «fermée» ou inaccessible et faciliter les processus de remodelage de la chromatine, ce qui
permet à d’autres facteurs de transcriptions de se lier ultérieurement aux activateurs pour contrôler
l’activité du gène cible (Zaret et Carroll, 2011). Au stade précoce du blastoderme, Zelda (Zld) déposé par la
mère agit comme un facteur pionnier crucial pour augmenter l’accessibilité de la chromatine en soutenant
le déplacement local des nucléosomes, l’effet dépendant du nombre et de la position des motifs Zld (Li et al.,
2014; Schulz et al., 2015; Sun et al., 2015). En outre, Zld fonctionne comme un activateur global pour initier
l’expression génique zygotique, y compris des gènes impliqués dans la mise en place de l’axe antéro-
postérieur chez les embryons (Harrison et al., 2011; Nien et al., 2011).

Bcd devient inutile à la fin de la cycle nucléaire 14. À ce stade, les limites d’expression de nombreuses cibles,
notamment hb, knirps (kni) et Krüppel (Kr), sont maintenues par la régulation croisée des gènes gap qui
fonctionnent comme des répresseurs (Jaeger et al., 2004; Liu et al., 2013; Manu et al., 2009).

Un exemple de gène gap précoce : hunchback

Les gènes gap sont activés ou réprimés par les gènes à effet maternel, et sont exprimés dans un ou
deux domaines larges le long de l’axe antéro-postérieur.

Le gène gap hunchback (hb) (pour bossu) est essentiel pour la régionalisation de l’axe antéro-
postérieur lors de l’embryogenèse de la drosophile, principalement par l’établissement des limites
d’expression génique d’autres gènes gap par répression transcriptionnelle. Les embryons
présentant une perte complète de la fonction hb sont dépourvus de segments mandibulaire et
thoracique, présentent une polarité inversée des deux ou trois premiers segments abdominaux et
une fusion des septième et huitième segments abdominaux (Lehmann et Nusslein-Volhard, 1987;
Margolis et al., 1995).

430
 *Figure 7-6. Phénotype du mutant hunchback.
Préparations cuticulaires de larves de premier stade de
drosophile sauvage (A) ou mutante perte-de-fonction hb
(B). On observe une délétion du troisième segment
gnathal jusqu’au troisième segment thoracique, une
délétion entre la septième et la huitième ceinture de
denticules abdominales, entraînant leur fusion (indiquée
par “a7/8”) et une réduction du filzkörper, un tube
filtrant que relie les trachées respiratoires à l’extérieur.
Source : http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.830.629&rep=rep1&type=pdf

hb est exprimé maternellement et zygotiquement. L’ARNm hb exprimé maternellement est uniformément

distribué dans l’embryon, mais sa traduction est réprimée dans la partie postérieure par Nanos avec l’aide
de Pumilio, Brain Tumor et eIF4EHP (Cho et al., 2006; Sonoda et Wharton, 1999).

L’expression de l’hb zygotique est dynamique. hb est d’abord transcrit dans un large domaine antérieur dans
des embryons du cycle nucléaire 11, en réponse au gradient de Bicoid (Driever et Nüsslein-Volhard, 1989).
À partir du cycle nucléaire 14, les transcrits de hb s’accumulent dans une bande positionnée à la limite
postérieure du domaine antérieur de l’expression de hb, à environ 50% de la longueur de l’embryon, ainsi
que dans la région postérieure de l’embryon (Margolis et al., 1995). À ce moment, le large domaine antérieur
de l’ARNm hb s’est désintégré de sorte que seules deux bandes plus faibles d’ARNm sont détectables dans
la partie antérieure, en plus de la bande centrale nouvellement activée.

Vidéo de l’expression d’un gène rapporteur GFP sous le contrôle de séquences régulatrices de Hunchback
au cours du développement de la drosophile : https://elifesciences.org/articles/07956#media1

La distribution de la protéine Hb reflète celle du modèle d’ARNm zygotique décrit précédemment, sauf que
la protéine persiste dans toute la moitié antérieure des embryons après le cycle nucléaire 14, probablement
en raison d’une dégradation plus lente de la protéine que de l’ARNm (Perry et al., 2012; Wu et al., 2001). Le
domaine Hb antérieur présente une frontière abrupte de la protéine Hb au centre de l’embryon.

Des gènes gap aux gènes homéotiques

D’autres gènes gap que hb interviennent dans la délimitation de larges régions le long de l’axe AP.
Par exemple, Krüppel est exprimé dans les parasegments 4 à 6, au centre de l’embryon.

Une sensibilité plus importante des méthodes de détection a permis de montrer que l’activation de la
transcription de certains gènes zygotiques étaient plus précoces que ce que l’on pensait et se déroule avant
la transition mi-blastuléènne qui a lieu au cycle nucléaire 14. Le gène gap Krüppel fait partie des gènes dont
la transcription démarre dès le cycle nucléaire 7 alors même que l’embryon n’est pas encore cellularisé (Ali-
Murthy et al., 2016).

431
 **Figure 7-7. Détection in situ de transcrits de Krüppel (Kr) dans des embryons précellulaires. L’hybridation in situ a détecté l’ARN
Kr (rouge) dans les embryons du cycle nucléaire 7-13 qui ont été produits par des femelles avec deux (deux colonnes à gauche) ou
six (deux colonnes à droite) copies du gène bcd. Les embryons sont au stade de la prophase, le côté dorsal est en haut et le côté
antérieur à gauche. Les images d’embryons sont des composites de projection à partir de coupes optiques en série au microscope
confocal; les images à fort grossissement montrent des noyaux avec des points fluorescents rouges. Le nombre de noyaux avec des
points rouges et l’intensité des points augmentent à chaque cycle successif. Deux points sont visibles dans la plupart des noyaux ;
certains n’en ont qu’un mais aucun n’en a trois. Les points jaunes dans les embryons du cycle nucléaire 7-9 indiquent des points
trop pâles pour être visibles à faible grossissement. La largeur de la bande des noyaux exprimant Kr était approximativement la
même dans les deux génotypes ; sa position s’est déplacée « plus postérieurement » dans les embryons avec un excès de Bcd, ce qui
est attendu (les embryons sont antériorisés donc l’expression de Kr est repoussée vers une position qui semble plus postérieure).
Source : https://elifesciences.org/articles/13222

*Figure 7-8. Expression de gènes gap le long de l’axe antéro-postérieur de la drosophile. Les courbes sont produites à partir de
l’intensité de marquages en immunofluorescence d’une dizaine d’embryons pour chaque protéine. Vous noterez des écarts types
parfois importants qui montre une certaine variabilité. Le côté antérieur est vers la gauche, le côté postérieur vers la droite. Source
: https://www.nature.com/articles/ncomms10031

Des niveaux élevés de Bicoid et de Hunchback induisent l’expression de giant, tandis que la transcription
de krüppel apparaît sur la région où Hunchback commence à baisser. Des niveaux élevés de Hunchback (en
absence de Bicoid) empêchent également la transcription des gènes gap postérieurs (tels que knirps et
giant) dans la partie antérieure de l’embryon (Struhl et al. 1992). Un gradient de la protéine Caudal, plus
élevé au pôle postérieur, est responsable de l’activation des gènes gap abdominaux knirps et giant dans la
partie postérieure de l’embryon. Le gène giant a donc deux modes d’activation (Rivera-Pomar 1995; Schulz

432
et Tautz 1995) : une pour sa bande d’expression antérieure (via Bicoid et Hunchback) et une autre pour sa
bande d’expression postérieure (par Caudal).

Vidéo de l’expression d’un gène rapporteur GFP sous le contrôle de séquences régulatrices de knirps au
cours du développement de la drosophile : https://elifesciences.org/articles/07956#media2

Une fois établis, les patrons d’expression des gènes gap sont maintenus par des régulations croisées entre
eux : par exemple Giant et Krüppel inhibent mutuellement l’expression de leur gène. L’expression des
différents gènes gap par ailleurs peut être partiellement chevauchante : par exemple, Krüppel et Hunchback
sont exprimés ensemble sur une épaisseur de 8 noyaux environ le long de l’axe AP.

Une segmentation plus fine est mise en place grâce aux gènes pair-rule qui commencent à être
exprimés au cycle nucléaire 13 alors que l'embryon se prépare à être cellularisé. Les gènes pair-rule
sont exprimés dans un parasegment sur deux. Cela donne des patrons d'expression avec 7 bandes.
*Figure 7-9. Expression de l'ARNm du gène gap even-
skipped. Une hybridation in situ avec une sonde
reconnaissant l'ARNm even-skipped a été réalisée sur
deux embryons de drosophile à 2 stades différents. On
observe la mise en place du patron d'expression typique
dans un parasegment sur deux (7 parasegments sur 14).
Even-skipped est exprimé dans les parasegments
impairs. Source :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0194865

La distance entre les bandes est précisément déterminée par les différents gradients des gènes gap et même
une modification du nombre de noyaux ne perturbe pas cet agencement (Day et Lawrence, 2000).
*Figure 7-10. Un changement du nombre de noyaux ne
perturbe pas la spécificité du patron d'expression du
gène pair-rule fushi-tarazu. Chez un mutant de
drosophile qui contient deux fois moins de noyaux
qu'habituellement (A) ou deux fois plus (B), le patron
d'expression de fushi-tarazu (points jaunes représentant
les noyaux où son gène est exprimé) est le même.
Normalement, les bandes dans lesquelles il est exprimé
ont une épaisseur moyenne de 3,3 noyaux. Chez le
mutant A, cette épaisseur est ajustée à une moyenne de
1,7 noyaux et chez le mutant B, elle est ajustée à 5,7
noyaux.
Source : https://cob.silverchair-cdn.com/cob/content_public/journal/dev/127/14/10.1242_dev.127.14.2977/1/2977.pdf

Les promoteurs et enhancers des gènes gap sont modulaires, c’est-à-dire qu’ils présentent des
séquences discrètes qui contrôlent leur expression dans une ou deux bande.s en particulier. Quand
on mute l’une de ces séquences régulatrices, une bande d’expression de gène pair-rule disparaît
mais les autres restent normales. Ce sont des combinaisons de protéines codés par les gènes gap qui
interviennent principalement pour activer (ou réprimer) l’expression des gènes pair-rule.

433
 *Figure 7-11. Les modules de régulation de la transcription de even-skipped (eve), un gène pair-rule, dans les
différentes bandes (stripes) le long de l’axe antéro-postérieur. La bande 1 est la plus antérieure. L’expression dans
les bandes est contrôlée par l’activité largement indépendante de cinq enhancers distincts qui activent l’expression
d’eve dans des bandes individuelles (les enhancers des bandes 1, 2 et 5) ou dans des paires de bandes (les enhancers
des bandes 3/7 et des bandes 4/6). Ces enhancers répondent de manières différentes aux facteurs maternels Bicoid
(Bcd) et Caudal (Cad), et aux produits des gènes gap Hunchback (Hb), Giant (Gt), Krüppel (Kr), Knirps (Kni) et Sloppy
Paired 1 (Slp1), entre autres. Par exemple, l’enhancer de la bande 2 est activé dans la partie antérieure par Bcd et Hb,
et réprimé par Gt et Kr, et s’exprime finalement dans une bande de noyaux qui se situent entre les domaines occupés
par ces deux répresseurs. Un enhancer appelé “late element” contrôle l’expression d’eve dans une phase plus tardive.
Source : https://elifesciences.org/articles/61635

Une première génération de pair-rule active une seconde génération de pair-rule puis ce sont les
gènes de polarité segmentaire qui sont activés. L’embryon est maintenant cellularisé et il n’est plus
question pour les facteurs de transcription de passer d’un noyau à l’autre. Des signaux paracrines
intercellulaires se mettent en place.

Les gènes de polarité segmentaire codent des protéines qui sont des constituants de la voie de
signalisation Wnt (ou Wg = wingless chez la drosophile) et de la voie de signalisation Hedgehog
(Ingham 2016). Des mutations dans ces gènes entraînent des défauts dans la segmentation générale
et dans la polarité AP de chaque parasegment (voir la Figure 6-26).

En temps normal, une seule rangée de cellules dans chaque parasegment exprime la protéine
Hedgehog, et une seule rangée de cellules dans chaque parasegment exprime la protéine Wingless.
Le gène engrailed est exprimé dans les cellules les plus antérieures de chacun des 14 parasegments ce qui
correspond aux cellules juste postérieures par rapport à celles qui vont exprimer Wingless. Son expression
est contrôlée par une combinaison activatrice et inhibitrice de protéines codées par les gènes pair-rule.

*Figure 7-12. Spécification de la polarité des

segments/parasegments par Engrailed et la
signalisation Hedgehog et Wingless. Source :
https://fr.m.wikipedia.org/wiki/Fichier:Wingless_and_Hedgehog_reciprocal_signaling_during_segmentation_of_Drosophila_embryos.svg

434
Les gènes homéotiques
Dans l’évolution des insectes, il est largement admis que le dernier ancêtre commun de tous les
insectes volants était à quatre ailes (une paire sur le 2ème segment thoracique + une paire sur le 3ème
segment thoracique; le premier segment thoracique ne porte jamais d'ailes), comme en témoigne
les archives fossiles, avec l’ordre des Diptères à deux ailes auquel appartient la drosophile
apparaissant plus tard (Carroll et al., 1995). À la place de la 2ème paire d’ailes sur le 3ème segment
thoracique les diptères présentent une paire de structures rudimentaires appelées «haltères», qui
sont des organes d’équilibration pendant le vol. Cette transformation évolutive d’aile en haltère est
considérée comme un exemple d‘«homéose» [vient du terme grec signifiant «remplacement»; terme
inventé par William Bateson en 1894] et la découverte des mutants classiques du complexe bithorax
(BX-C) par Calvin Bridges ont été les premiers exemples de transformation “homéotique” (Bridges,
1944). Dans le cas de la mutation perte-de-fonction ultrabithorax, les haltères sont transformés en
ailes, et donc le 3ème segment thoracique devient une réplique du 2ème segment thoracique.
*Figure 7-13. Phénotype du mutant perte-de-fonction
ultrabithorax avec 2 paires d'ailes au lieu d'une seule.
Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/gen-
dros.htm

De même, des mutations homéotiques affectant la région antérieure ont été caractérisées telle la
mutation Antennapedia (Antp) où des pattes se développent à la place des antennes.
*Figure 7-14. Phénotype de la mutation gain-
de-fonction antennapedia qui présente des
pattes à la place des antennes. Source :
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/gen-
dros.htm

Les gènes impliqués ont été caractérisés en détail par Ed Lewis (Lewis, 1963, 1978, 1998). Il se trouve
que ces gènes codent des facteurs de transcription qui se fixent à l’ADN par un homéodomaine
auquel ils ont donné leur nom. Mais il y a d’autres facteurs de transcription à homéodomaine qui
n’appartiennent pas aux complexes des gènes Hox (par exemple la famille des Pax ou encore bicoid).

Les gènes se trouvent positionnés dans deux complexes différents : le complexe ANT-C (qui fait 400
kilobases de long) et le complexe BX-C (qui fait 350 kilobases de long). Ils se trouvent sur 2 portions
assez éloignées du chromosome 3 chez la drosophile (mais ce n'est pas le cas général chez les
insectes où ils sont plus souvent contigus). Signalons que Bcd que nous avons vu agir très tôt au cours
du développement précoce de la drosophile pour la mise en place de l'axe AP se trouve localisé dans
le complexe ANT-C sans faire partie formellement dans ce que l'on appelle les gènes Hox.

435
 *Figure 7-15. HOM-C = ANT-C + BX-C. Les deux
complexes sont sur le même chromosome chez la
drosophile mais séparés par une région de 10 Mb (10
millions de bases).

lab = labial palps; pb = proboscipedia; Dfd = Deformed;

Scr = Sex combs reduced; Antp = Antennapedia; Ubx =
Ultrabithorax; abdA = abdominal A; AbdB = Abdominal B.

La position des gènes dans les complexes n’est pas anodine. Plus ils se trouvent en 3′ plus ils sont
exprimés antérieurement (et plus précocement). C’est la règle de colinéarité.
*Figure 7-16. Homéodomaine (rose fuschia) de la
protéine codée par le gène Antennapedia de Drosophila
melanogaster lié à un fragment d’ADN. L'homéodomaine
est composé de 3 hélices alpha. Il y a interactions de
l’hélice de reconnaissance (hélice 3) et de l’extrémité N-
terminal avec respectivement le grand sillon (ou sillon
majeur) et le petit sillon (ou sillon) mineur de la double
hélice d’ADN. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Bo%C3%AEte_hom%C3%A9otique#/media/Fichier:ADN_et_hom%C3%A9odomaine.png

Le mutant Antp avec les pattes à la place des antennes, s’est révélé être une mutation gain-de-
fonction à cause d’une inversion dans le génome qui a mis le gène codant Antp sous l’influence d’un
promoteur exprimé dans la tête.

Au sein du BX-C, Ultrabithorax (Ubx) est le gène homéotique clé orchestrant la transformation de
l’aile en haltère. Les mutations perte-de-fonction dans Ubx modifient l’identité d’un segment entier,
à savoir la transformation du 3ème segment thoracique (qui porte normalement une paire
d’haltères) en un 2ème segment thoracique dupliqué et donc avec une paire d’ailes. Ubx est fortement
exprimé dans le troisième segment thoracique tout au long du développement, en commençant dans
l’embryon lors de la subdivision de l’axe corporel AP, où il influence la structuration segmentaire des
ceintures denticulaires cuticulaires de la larve (Crocker et al., 2015). Il existe également une expression
d’Ubx dans les segments abdominaux, où il coopère avec deux autres facteurs de transcription du complexe
BX-C abd-A et Abd-B pour modifier le motif de la ceinture denticulaire et réprimer la formation d’appendices
dans l’abdomen (Castelli-Gair et al., 1995; Gebelein et al., 2002).

Pour voir une vision en 3D du patron d’expression d’Ubx (et également d’Engrailed, un gène de polarité
segmentaire), voir ce lien : https://www.sdbcore.org/object?ObjectID=346&SubTopicID=17

436
 *Figure 7-17. Expression de abd-A et Abd-B dans l'abdomen d'un embryon de drosophile. Les abdomens d'embryons
de stade 13 ont été ouverts dorsalement dans le sens de la longueur puis aplatis. Une immunofluorescence avec des
anticorps reconnaissant abd-A (rouge) et Abd-B (vert) a été réalisée. Le côté antérieur est vers le haut. On constate
que, suivant la règle de la colinéarité, l'expression de Abd-B (qui est le plus en 5' dans le complexe) est plus
postérieure que l'expression de abd-A. PS = parasegment. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2014.00096/full

Figure 7-18. Modules régulateurs de

l’expression de Ubx et abd-A. A. Carte de la
région génomique des gènes Ubx et abd-A et
quatre de leurs régions régulatrices
associées. Les coordonnées de la carte sont
en kb. En dessous de la carte se trouvent
quatre fragments d’ADN testés qui contrôlent
chacun le gène rapporteur LacZ dans 4
lignées différentes. Les embryons
transgéniques résultant ont été soumis à une
double immunohistochimie avec des
anticorps contre la -galactosidase (bleu) et
contre Engrailed (marron). Les marges
antérieures des domaines d’expression
d’Engrailed délimitent les limites des
parasegments. Les chiffres indiquent les
parasegments individuels. On constate que
chaque séquence régulatrice contrôle
l’expression du gène rapporteur dans
plusieurs parasegments bien définis. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC552165/pdf/emboj00239-0142.pdf

Dans le 3ème segment thoracique, l’expression d’Ubx conduit à la transformation de la 2ème paire d’ailes en
balanciers, mais a des effets plus subtils sur le développement des pattes, qui sont relativement similaires
entre les segments à l’exception des différences de taille et des dispositions des soies (Davis et al., 2007;
Rozowski et Akam, 2002).

L’expression initiale d’Ubx est activée par le produit du gène pair-rule Fushi tarazu (d’ailleurs Ubx a très
transitoirement un patron d’expression de gène pair-rule lui-même). Elle est réprimée par Hunchback. Une
fois l’expression d’Ubx établie, sa frontière postérieure est maintenue par une répression d’abd-A. Ubx lui-
même réprime Antp et maintient la frontière postérieure d’expression de celui-ci. Ainsi, on voit que de
proche en proche les gènes du complexe contrôlent la frontière d’expression de leur voisin plus antérieur.
C’est la règle de dominance postérieure. Cette règle de dominance postérieure doit être nuancée dans le cas
de l’inhibition d’abdominal-A (abd-A) par Abdominal-B (Abd-B). Les animaux dépourvus d’Abd-B
présentent une expression ectopique d’abd-A dans l’épiderme du 8ème segment abdominal, mais pas dans le
système nerveux central. La répression dans ces cellules neuronales est accomplie non pas par Abd-B mais
437
par un ARN non codant de 92 kb, transcrit à partir d’un locus situé entre ceux d’abd-A et d’Abd-B. Cet « ARN
iab-8 » produit un microARN qui réprime la traduction d’abd-A, mais agit également par un deuxième
mécanisme de répression redondant, sans doute une interférence transcriptionnelle avec le promoteur de
abd-A.

Comme le gène Ubx est exprimé dans des régions homologues à la fois chez la drosophile et les
insectes à quatre ailes, tels que les papillons, c’est l’acquisition évolutive de nouveaux gènes cibles
de Ubx qui est responsable de la perte de la deuxième paire d’ailes dans les diptères tels que la
drosophile. Les recherches visant à identifier les gènes cibles de Ubx responsables de la transformation
d’une aile en haltères révèlent que de nombreux gènes jouent un rôle important dans la régulation de la
croissance et de l’organisation des ailes. Ubx modifie notamment l’expression de dpp (l’orthologue des BMP
chez la drosophile) qui est un morphogène important pour le développement des ailes (Agrawal et al., 2011;
Crickmore et Mann, 2007; Makhijani et al., 2007; Pavlopoulos et Akam, 2011).
**Figure 7-19. Action de Ubx sur l’expression de Dpp et
de dally dans le 3ème segment thoracique lors de la
formation des haltères. dally code un glypicane de la
matrice extracellulaire important pour la morphogenèse
qui est fortement exprimé dans les ailes et moins
fortement dans les haltères. Dans l’aile, parce que les pics
de signalisation Dpp et Hh se produisent dans les cellules
voisines, les niveaux de dally sont élevés en raison de
l’activation de Hh, mais sont plus faibles dans les cellules
voisines en raison de la répression par Dpp. Dans
l’haltère du 3ème segment thoracique, Ubx décale
l’expression de Dpp et maintenant les pics de Dpp et de
Hh coïncident dans les mêmes cellules. Ces deux entrées
conflictuelles (une activatrice, une répressive)
entraînent des niveaux d’expression intermédiaire
de dally. De plus, dally est fortement réprimé dans les
cellules du compartiment postérieur à côté de la limite
antéro-postérieure en raison de l’expression d’Ubx
combinée à celle de Dpp. A = compartiment antérieur ; P
= compartiment postérieur. Source
: https://journals.biologists.com/dev/article/134/2/327/53090/Hox-control-of-morphogen-
mobility-and-organ

Le remodelage protéolytique de la matrice extracellulaire dans les disques imaginaux est crucial pour la
morphogenèse de l’aile, et ce processus est réprimé par Ubx dans les haltères (Diaz-de-la-Loza et al., 2018).
Ubx agit en réprimant directement l’expression de deux gènes codant pour des protéases dégradant
l’ECM: Stubble (Sb) et Notopleural (Np) et en induisant l’expression d’un troisième gène codant pour Timp,
un inhibiteur des protéases Mmp1/2 (Diaz-de-la-Loza et al., 2020).

438
*Figure 7-20. Modélisation de l’action répressive d’Ubx
sur l’aile de drosophile. On réprime par interférence ARN
l’expression des gènes Notopleural (Np) et Stubble (Sb)
au cours du développement de l’aile du 2ème segment
thoracique. Ces gènes sont habituellement réprimés
dans le 3ème segment thoracique par Ubx. On voit que
leur absence combinée (double interférence ARN en bas)
produit une aile très atrophiée qui tend à ressembler à
une haltère. Source
: https://journals.biologists.com/dev/article/147/5/dev184564/223119/Control-of-tissue-
morphogenesis-by-the-HOX-gene

439
 **Figure 7-21. Transformation d’une aile en
haltère par Ubx par inhibition de la dégradation
de la matrice extracellulaire (ECM). Source
: https://journals.biologists.com/dev/article/147/5/dev184564/223119/Control-of-tissue-morphogenesis-by-the-HOX-gene

Signalons que dans le premier segment thoracique des insectes, l'absence d'ailes n'est pas dûe à Ubx (qui
n'y est pas exprimé) mais à l'action d'une autre protéine codée par le complexe homéotique Scr (Sex combs
reduced) qui inhibe l'expression de Nubbin qui est nécessaire à la production des ailes (Prud'homme et al.,
2011).

Les protéines des complexes Hox contiennent un homéodomaine (HD) qui permet la reconnaissance
de l’ADN, déterminant la spécificité tissulaire en régulant l’expression des gènes cibles. Mais, à
l’exception d’Abd-B qui possède l’un des homéodomaines les plus divergents et une préférence pour les
séquences TTAT ou TTAG, toutes les protéines Hox se lient à la même séquence centrale TAAT. Étant donné
que les HD sont ainsi hautement conservés avec des propriétés de liaison à l’ADN qui se chevauchent, il n’est
pas clair comment les protéines Hox instruisent la morphogenèse différentielle, ce qui constitue le «
paradoxe de la spécificité des Hox ». La solution à ce paradoxe vient probablement du fait que les protéines
Hox, à travers différentes régions, se lient à l’ADN avec des cofacteurs supplémentaires et peuvent
également interagir avec des facteurs de régulation transcriptionnelle (notamment Extradenticle (Exd) et
Homothorax (Hth)), des ARN non codants et des complexes de remodelage de la chromatine variés. Tout
cela amène à la notion d’interactome Hox avec une multiplicité d’interactions. Les interactions avec Exd et
Hth sont particulièrement importantes car elles étendent la séquence cible sur l’ADN à 12 paires de bases

440
et permet de révéler une spécificité de chaque protéine Hox pour des séquences particulières (Slattery et
al., 2011).

Dans ces interactions, la relation entre les protéines Hox et la machinerie de transcription générale est très
importante pour la régulation transcriptionnelle. La première preuve d’une protéine Hox établissant un
contact fonctionnel avec un facteur de transcription général est l’interaction entre le motif YPWM
d’Antennapedia (Antp) et BIP2 (TAF3), un composant associé à la protéine de liaison à la boîte TATA de
TFIID. De plus, la sous-unité Med19 du complexe MED, le composant majeur de la machinerie de l’ARN
polymérase II, interagit avec Proboscipedia (Pb), Deformed (Dfd), Antp, Ultrabithorax (Ubx), Abdominal A
(AbdA) et Abdominal B (AbdB). Les protéines Hox sont également impliquées dans les mécanismes de pause
de l’ARN polymérase II, interagissant avec le facteur de pause de transcription M1BP, modifiant l’état de la
chromatine et améliorant l’efficacité de la transcription. Un criblage d’interactome Hox de 35 facteurs de
transcription a révélé que TFIIEβ interagit avec Scr, Antp, Ubx, AbdA et AbdB dans l’embryon de drosophile.
Une interaction physique directe de TFIIEβ avec deux positions d’acides aminés de l’hélice 2 de
l’homéodomaine de Antp est nécessaire pour la fonction d’Antp.

Une fois activée, l’expression (ou la non-expression) des gènes du complexe Hox doit être maintenue
alors que les facteurs de transcription qui ont induit (ou inhibé) leur expression ne sont plus
exprimés. Ce contrôle se fait par des modifications épigénétiques stables. Les protéines d’identité
cellulaire appartenant aux groupes “Polycomb” (PcG) et “Trithorax” sont des familles qui ont été
découvertes chez la drosophile et qui sont capables de remodeler la structure de la chromatine et
de moduler ainsi l’expression des gènes du développement. Ces protéines s’associent à l’ADN ainsi
qu’à des facteurs de transcription responsables de la régulation des gènes du développement.
Polycomb et Trithorax ont des rôles antagonistes : les protéines Polycomb maintiennent les gènes
homéotiques Hox « éteints », alors que les protéines Trithorax les maintiennent actifs. C’est un
équilibre variable entre ces deux états qui détermine l’identité et la place de la cellule dans l’organe et
l’organisme. Le premier complexe PcG identifié, nommé Polycomb Repression Complex 1 (PRC1), agit
comme une histone H2A ubiquitine E3 ligase et est également capable de modifier l’architecture de la
chromatine par compactage local et interactions à longue distance. PRC1 peut également inhiber
directement la transcription et déstabiliser les complexes de pré-initiation de la transcription in vitro. PRC2,
un autre complexe protéique PcG, méthyle l’histone H3 sur la lysine 27 (H3K27me), une activité essentielle
à la fonction PcG (Poynter et Kadoch, 2016). Le complexe PcG est capable de s'associer à des séquences
cibles qui peuvent aller jusqu'à 1500 pb : des PRE (Polycomb Response Elements) (Chan et al., 1994; Zink
et Paro, 1995).
**Figure 7-22. La répression transcriptionnelle par le
complexe répresseur polycomb 1 (PRC1) et le complexe
répresseur polycomb 2 (PRC2) (a) PRC1 mono-
ubiquitine l’histone 2A à la lysine 119 (H2AK119Ub1) au
niveau des gènes ciblés pour la répression
transcriptionnelle. En l’absence de marques de méthyle
d’histone (c’est-à-dire H3K27me3), PRC1 peut se lier à
l’ADN via RYBP, YAF2 et d’autres facteurs auxiliaires afin
de propager la répression H2AK119Ub1. (b) La sous-
unité catalytique de PRC2, EZH2, est capable de mono-,
di- et tri-méthylation de H3K27, la marque triméthyle
étant la marque stable de la formation
d’hétérochromatine et de la répression
transcriptionnelle. Source
: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5518792/

441
 **Figure 7-23. Un même complexe Polycomb peut réprimer l'expression de plusieurs gènes Hox. On observe un
noyau d'une cellule céphalique d'embryon de drosophile (head) ou une celui d'une cellule de la région abdominale
postérieure de l'embryon (posterior). L'ADN est révélé avec du DAPI. On réalise un FISH avec une sonde
reconnaissant les séquences génomiques d'Abd-B ou de Antp et une immunofluorescence avec un anticorps
reconnaissant un membre du complexe Polycomb. On constate que dans la tête où ni Abd-B, ni Antp ne s'expriment,
les séquences génomiques des 2 gènes sont dans le même complexe Polycomb alors que dans la région abdominale
postérieure, où Abd-B s'exprime mais pas Antp, seule la séquence d'Antp se trouve associée au complexe alors que la
séquence Abd-B se retrouve en dehors. Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(10)01485-6

Les complexes Trithorax comprennent une histone méthyl transférase qui triméthyle l’histone H3 lysine 4,
une modification épigénétique associée avec les promoteurs de gènes activement transcrits. Ils
comprennent également Brahma qui appartient à la famille de protéines SWI/SNF qui remodèlent la
chromatine de manière ATP-dépendante (Tamkun et al, 1992). Ces protéines sont capables de se lier à la
fois aux histones des nucléosomes et à l’ADN et de faire glisser les nucléosomes le long de l’ADN permettant
de rendre accessible des séquences importantes pour des facteurs de transcription.

Précisons que les protéines Polycomb et Trithorax ont des cibles bien plus larges que juste les gènes du
complexe HOM-C.

Mise en place des axes chez les Vertébrés

es Vertébrés font partie des Bilatériens et ils ont à ce titre trois axes : antéro-postérieur (AP),

L
dorso-ventral (DV) et droite-gauche (DG). Ils font partie des Chordés, donc ce sont des
Épineuriens : leur système nerveux central est entièrement dorsal et formé à partir d'un tube
neural produit au cours de la neurulation. Tout comme le corps en entier, ce tube neural est lui aussi
polarisé selon les 3 axes.

La structure fondamentale qui coordonne la mise en place des axes des vertébrés s’appelle
l’organisateur de Spemann qui correspond à la lèvre dorsale du blastopore chez les Amphibiens et
au nœud de Hensen chez les Amniotes. Il a souvent été présenté dans son rôle de mise en place de
l’axe DV mais il est également important pour l’axe AP et l’asymétrie droite/gauche (Harland et
Gerhart, 1997 ; De Robertis et al., 2000).

Nous allons développer essentiellement l’exemple des amphibiens avant d’explorer d’autres modèles.

Mise en évidence de l’organisateur de Spemann

L’expérience de Spemann et Mangold réalisée en 1924 est une des expériences fondatrices de la
biologie du développement. Elle consiste en la greffe de la lèvre dorsale du blastopore d’une jeune
gastrula d’amphibien sur la région ventrale d’un autre amphibien. On obtient alors un embryon puis
une larve qui possède deux axes dorsaux c’est-à-dire deux tubes neuraux, deux cordes, deux séries
de somites.

442
 *Figure 7-24. Expérience de Spemann et
Mangold (1924). Les cellules du greffon (lèvre
dorsale du donneur) et leurs cellules
descendantes sont indiquées en rouge.

Quand on distingue ce qui provient du donneur et ce qui provient du receveur (Spemann et Mangold
ont pu le faire car le donneur et le receveur appartenaient à deux espèces de triton avec une
pigmentation différente), on constate que la quasi-totalité du tube neural et des somites
supplémentaires proviennent du receveur et que la corde provient du donneur. Donc, tandis que la
lèvre dorsale du blastopore greffée s’est développée en corde, elle a induit les tissus ventraux
alentour à donner du tissu nerveux et des somites. Sans ces signaux, les tissus ventraux auraient
donné de l'épiderme et du mésoderme ventral (cellules sanguines par exemple). Des signaux
inducteurs ont donc été envoyés de la lèvre dorsale du blastopore vers l’ectoderme ventral pour
changer sa destinée d’épiderme en tissu neural et vers le mésoderme ventral pour changer sa
destinée en mésoderme dorsal.

De la rotation corticale à l’organisateur de Spemann chez les Amphibiens

60 ans après l’expérience de Spemann et Mangold, Gimlich et Gerhart ont montré en 1984 qu’on
pouvait reproduire la production d’un deuxième axe dorsal en greffant un macromère végétatif
dorsal (une cellule destinée à donner de l'endoderme dorsal) du côté ventral d’un embryon au stade
32 cellules.

443
 *Figure 7-25. Expérience de Gimlich et Gerhart. La
transplantation d’un macromère dorsal (D1) vers la
région ventrale d’un embryon de xénope de 32 cellules
qui conserve son blastomère dorsal (D1′) provoque une
duplication d’axe dorsal comme lors de la greffe de
l’organisateur de Spemann. Source
: http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/CoursPCEMDEUG/Fig106.htm

Cela montre que les évènements qui mènent à la formation de l'organisateur de Spemann sont à
l'œuvre très tôt dans l'embryon. Ces évènements sont liés à la rotation corticale qui suit la
fécondation où le cytoplasme du zygote juste sous la membrane plasmique se déplace d'un angle de
30° vers le point d'entrée du spermatozoïde. En effet, si on empêche la rotation corticale (par une
irradiation aux UV du pôle végétatif qui désorganise les microtubules qui s'y trouvent), il n'y a pas
d'axes formés mais on peut sauver ces embryons en greffant le macromère dorsal D1 : on obtient
alors des embryons normaux avec le côté dorsal situé du côté où on a greffé D1.

À la suite de la fécondation et de la réorganisation du cytosquelette provoqué par le centriole du

spermatozoïde, la rotation corticale entraîne un déplacement de certaines protéines vers le futur
côté dorsal (voir Figures 3-23 et 3-24).

L’une d’elle est Dishevelled qui est déplacée, accrochée à des vésicules transportées le long de
faisceaux parallèles de microtubules. Ces vésicules se déplacent très vite, à la vitesse de 25–40 μm/min
(Rowning et al., 1997). Dishevelled protège du côté dorsal la β-caténine de la destruction induite par
GSK3β (voir le chapitre consacré aux voies de signalisation Wnt). Le ligand Xwnt11 est également
nécessaire à cette étape pour renforcer la protection de la β-caténine (Kofron et al., 2007) ainsi que la
protéine Huluwa qui dégrade Axine1, une protéine qui facilite la dégradation de la β-caténine (Yan et al.,
2018).

β-caténine s’accumule alors sur la face dorsale de l’embryon et entre dans le noyau au stade 16
cellules (Schneider et al., 1996). Elle s’associe aux facteurs de transcription LEF/TCF. Le
gène Siamois qui code un facteur de transcription à homéoboîte et qui est impliqué dans la
spécification de la région dorsale, est une cible du complexe β-caténine/TCF et est exprimé dans la
région où β-caténine atteint des niveaux nucléaires élevés.

444
 *Figure 7-26. De la rotation corticale jusqu’à la mise en place de l’organisateur de Spemann. L'organisateur de
Spemann se met en place à la convergence entre deux voies de signalisation complémentaires : la voie de la β-
caténine qui est activée dans la région dorsale par la rotation corticale et la voie Nodal (ou Xnr chez le xénope) dont
l'expression des ligands est activée dans l'endoderme par le facteur de transcription VegT. Une forte concentration
en Xnr est nécessaire pour induire du mésoderme dorsal (et donc un organisateur de Spemann). Cette forte
concentration est permise par la voie de la β-caténine qui agit ainsi via deux séries de cibles en aval qui finissent par
converger.

Les effets dorsalisants de la β-caténine peuvent être observés lorsqu’elle est injectée dans les
cellules du côté ventral. Cela provoque la formation d’un deuxième axe du corps avec deux têtes et
deux tubes neuraux. Le doublement ne concerne cependant que la partie antérieure. Des expériences de
lignage ont montré que la future région dorsale correspond aussi à la future région antérieure. A ce stade
précoce du développement, les deux axes ne sont pas encore bien séparés.

L’incubation d’embryons dans une solution de chlorure de lithium (LiCl) au stade 32 cellules a des
effets dorsalisants (et antériorisants). LiCl inhibe en effet l’activité enzymatique de GSK3
aboutissant à une accumulation et à une entrée généralisée dans le noyau de la β-caténine.

L’expression de Siamois associé avec une activité Nodal élevée (les ligands sont Xnr1/2/4/5/6) sur
la face dorsale induit la formation de l’organisateur de Spemann qui est caractérisé par l’expression
du gène goosecoid.
*Figure 7-27. Expression différentielle des gènes Xnr entre les blastomères végétatifs
ventraux et dorsaux. Des blastomères végétatifs dorsaux et ventraux ont été isolés,
leurs ARNm extraits et une analyse par RT-PCR de l'expression des gènes indiqués a
été réalisée. Les gènes Xnr sont plus exprimés du côté dorsal que ventral générant un
gradient de ce morphogène. La région de la zone marginale proche des blastomères
végétatifs dorsaux reçoit plus de Xnr et sont induits en mésoderme dorsal, qui donne
naissance à l'organisateur de Spemann. Les blastomères végétatifs qui expriment le
plus de Xnr correspondent au centre de Nieuwkoop, un centre caractérisé par sa
capacité à induire un organisateur de Spemann. Les blastomères végétatifs ventraux
qui secrètent moins de Xnr induisent du mésoderme ventral (et donc pas
l'organisateur de Spemann). Source : https://ressources.unisciel.fr/biodudev/co/grain_5_6_10.html

445
L’expression élevée des Xnr du côté dorsal de l’endoderme est contrôlée par la β-caténine qui œuvre ainsi
également dans la formation de l’organisateur de Spemann via l’endoderme alors qu’elle agit déjà plus
directement dans le mésoderme dorsal avec l’activation de l’expression de siamois.
*Figure 7-28. L'activation de l'expression de Xnr5 et de
Xnr6 dans l'endoderme dorsal (centre de Nieuwkoop)
est dépendante de la rotation corticale. On retire les deux
tiers inférieurs du cytoplasme végétatif d'un zygote
avant la rotation corticale. Les composants qui sont
habituellement déplacés par la rotation corticale vers le
futur côté dorsal ne peuvent pas le faire. Dans ce cas, on
observe par RT-PCR que l'expression de Xnr5 et de Xnr6
dans l'endoderme dorsal qui correspond au centre de
Nieuwkoop n'est pas activée. ODC est un gène de ménage
pour la normalisation des expressions. D'autres
expériences montrent que c'est l'absence d'entrée de la
β-caténine dans le noyau du côté dorsal qui est à l'origine
de l'absence d'activation de l'expression de Xnr5 et de
Xnr6. Par ailleurs, VegT est également impliqué dans
l'activation de l'expression de ces gènes. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/127/24/5319/41043/Two-novel-
nodal-related-genes-initiate-early

Formation de l’organisateur de Spemann dans d’autres modèles que les Amphibiens

Les Amphibiens constituent un modèle particulier et la rotation corticale qui suit la fécondation
n’est pas du tout un cas généralisé chez les Vertébrés.

Chez le poisson-zèbre, l'organisateur de Spemann est le bouclier embryonnaire.

*Figure 7-29. Le bouclier embryonnaire (=organisateur de
Spemann) de l'embryon du poisson-zèbre. Il est indiqué sur
une vue latérale (A) ou une vue depuis le pôle animal (B) par
deux têtes de flèches. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/132/11/2503/52334/Structure-and-function-of-the-
notochord-an

La β-caténine maternelle joue un rôle important dans la formation du bouclier et de l'axe DV chez le poisson
zèbre. Par exemple, les mutants ichabod ont une mutation dans la région du promoteur β-caténine. Cette
mutation provoque une diminution de l'expression de la β-caténine et entraîne de graves défauts dans
l'établissement de l'axe DV (Sasai et al., 1994 ; Zhang et al., 1998). La β-caténine maternelle active la
transcription de gènes spécifiques dorsaux, notamment squint, goosecoid, bozozok et chordin (chd),
induisant ainsi la formation de l'organisateur de Spemann (Schier et Talbot, 2001). Contrairement au
xénope, ce n'est pas Wnt11 mais Wnt8a qui contribue à activer la voie Wnt/β-caténine du côté dorsal (Lu
et al., 2011). L'initiateur de toute la cascade est cependant la protéine transmembranaire Huluwa (que l'on
retrouve aussi chez le xénope) qui dégrade l'axine et protège ainsi la β-caténine de la dégradation du côté
dorsal (Yan et al., 2018).

Chez les embryons de poulet, les signaux qui induisent le nœud de Hensen (=l’organisateur de Spemann des
Amniotes) sont actifs assez longtemps, car on peut enlever un nœud de Hensen et un autre se développera
à la place (Joubin et Stern, 1999). Le nœud de Hensen correspond plus à une zone qui est traversée par des
populations de cellules au cours de la gastrulation et qui est constamment induite par un centre inducteur
situé au milieu de la ligne primitive et qui le nœud de Hensen mais si le nœud est enlevé, cette source de
ADMP se tarit et les signaux inducteurs peuvent fonctionner à nouveau pour régénérer un nouveau nœud.

Chez la souris, le nœud de Hensen est induit par une combinaison de signaux Wnt et activine ce qui revient
à une induction par β-caténine et la signalisation SMAD similaire à ce qui est observée chez le xénope.

446
On peut différencier un organisateur de Spemann à partir de cellules souches pluripotentes humaines en
présence de Wnt et d’activine. Cet organisateur, greffé sur l’ectoderme d’un embryon de poulet est capable
de réaliser une induction neurale, comme l’atteste l’activation de l’expression de Sox2 dans l’épiblaste de
poulet adjacent au greffon (Martyn et al., 2018).
*Figure 7-30. Un “nœud de Hensen humain” induit
du tissu neural dans l’ectoderme d’un embryon de
poulet. Des cellules ES humaines ont été soumises à
un protocole permettant d’induire des gènes
spécifiques du nœud de Hensen puis elles ont été
greffées sur l’ectoderme d’un embryon de poulet qui
donne habituellement du tissu extraembryonnaire.
27 heures après la greffe, on réalise une
immunofluorescence avec un anticorps dirigé
contre la protéine HNA humaine (rouge, juste un
marqueur de cellules humaines) et un anticorps
dirigé contre Sox2 (vert, un marqueur de tissu
neural précoce). On constate que les cellules
humaines ont induit l’expression de Sox2 dans les
cellules du poulet. Source : https://www-ncbi-nlm-nih-
gov.insb.bib.cnrs.fr/pmc/articles/PMC6077985/

Action de l’organisateur de Spemann

À la surprise générale, la découverte des molécules sécrétées par l’organisateur de Spemann a révélé
que c’est une structure qui inhibe toute une série de signaux inducteurs (BMP, Wnt et Nodal). Mais
inhiber un signal inducteur est aussi une instruction qui change la destinée d’une cellule et donc
aussi une induction ! Un inhibiteur de morphogène peut aussi être considéré comme un
morphogène.

Ainsi, l’organisateur de Spemann sécrète des antagonistes de BMP tels que Chordine et Noggin, des
antagonistes de Wnt tels que Dkk1, Frzb1 et Crescent, et des inhibiteurs multivalents comme Cerberus.
*Figure 7-31a. Expression de chordine dans la lèvre
dorsale du blastopore (= organisateur de Spemann) au
début de la gastrulation chez le xénope. Une hybridation
in situ a été effectuée avec une sonde reconnaissant
l’ARNm de chordine sur des embryons de xénope au
stade 10,5. Vue du pôle végétatif. On voit le blastopore en
forme de anse de panier en train de se former sous la
zone d’expression. Source
: https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)35330-
8/fulltext

447
 *Figure 7-31b. Chordine est exprimée dans la corde
lorsqu'elle se forme à la gastrulation. Coupe transversale
d'une gastrula âgée de xénope traitée en hybridation in
situ avec une sonde reconnaissant l'ARNm de chordine.
La lèvre dorsale du blastopore (=organisateur de
Spemann) donne en effet naissance à la corde. Le côté
dorsal est vers le haut. La cavité sous la corde est
l'archentéron. Les espaces dans l'endoderme en dessous
sont des artefacts de coupe. La neurulation débute à
peine donc il n'y a pas encore de tube neural dorsalement
à la corde. Source : Compte Twitter @ailencervino

*Figure 7-32. L’injection de l’ARNm de chordine rétablit les axes d’un embryon traité aux UV, sans rotation
corticale. À gauche, un embryon de xénope ventralisé, sans axe précis, à cause d’un traitement aux UV au pôle
végétatif qui a perturbé l’organisation des microtubules et empêché la rotation corticale. Un tel embryon peut être
sauvé si on lui injecte de l’ARNm de chordine (à droite). Le côté dorsal se forme du côté où cet ARNm a été injecté.
Source : https://www.nature.com/articles/35042039

Lorsque l’ARNm de Chordine est injecté dans une cellule ventrale de l’embryon de xénope, il
récapitule l’expérience de Spemann et Mangold avec la formation d’un deuxième tube neural, des
somites et même une deuxième cavité intestinale (Sasai et al., 1994).

Juste avant la gastrulation, l’activité BMP (qui peut s’observer en étudiant la phosphorylation des
transducteurs de sa voie Smad1, Smad5 et Smad8) établit un gradient ventral haut à dorsal bas, et une faible
activité BMP sur la face dorsale permet aux cellules ectodermiques d’acquérir un destin neural, tandis que
les autres cellules ectodermiques prennent le destin de l’épiderme (Schohl et Fagotto, 2002). Si on prélève
une calotte animale et qu’on la cultive isolée, on obtient un épiderme cilié. Mais si on dissocie les cellules,
on obtient du tissu neural car on aura dilué BMP (signalons que la dissociation cellulaire provoque aussi
une activation soutenue de la voie de signalisation MAPK, qui est nécessaire à la différenciation neurale).
L’addition de BMP sur ces cellules dissociées permet de former à nouveau de l’épithélium cilié.
*Figure 7-33. Détermination dans la
calotte animale en fonction de BMP4.
La coiffe animale exprime
naturellement BMP4, mais si on
dissocie les cellules, la concentration
de BMP4 devient trop faible pour
induire la formation d'un épiderme
cilié.

De même, dans le mésoderme, la faible activité BMP spécifie des destinées dorsales (somites par
exemple) alors qu’une haute activité BMP spécifie des destinées ventrales (lames latérales par
exemple). Il s’agit typiquement là de l’action d’un morphogène. La phosphorylation de Smad1/5/8

448
leur permet d’interagir avec Smad4, de rentrer dans le noyau et d’activer la transcription de gènes
cibles (voir Figures 6-49 et 6-50).

Chordine sécrétée par l’organisateur de Spemann s’oppose à l’activité BMP4 en se liant aux BMP et
en les empêchant d’atteindre leur récepteur ce qui favorise les destins dorsaux et
neuraux. Chordine et BMP diffusent dans l’espace extracellulaire et forment des gradients d’activité
opposés dans l’embryon (De Robertis et Kuroda, 2004 ; Piccolo et al., 1996).

Cependant Chordine a un effet positif sur la signalisation BMP dans la région ventrale grâce au navettage de
BMP qu’elle réalise. Lorsque Chordine attrape BMP, elle continue à diffuser ramenant BMP vers sa région
ventrale d’origine. Une enzyme nommée Tolloid, exprimée dans la région ventrale clive Chordine et libère
BMP qui se trouve donc plus concentré dans la région antérieure (voir Figure 2-25).

Chordine peut être déplétée dans les embryons de xénope à l’aide d’injections d’oligos morpholino (MO)
antisens. L’épuisement de Chordine produit des embryons qui se développent avec des têtes et des tissus
dorsaux plus petits et des structures ventrales élargies (Oelgeschläger et al., 2003). Cependant, un axe
embryonnaire est encore formé. Il faut un épuisement combiné de Chordine, Noggin et Follistatine pour
entraîner une perte généralisée de tous les tissus dorsaux (Khokha et al., 2005). De même, chez la souris
double knock-out de Chordine et Noggin, le cerveau antérieur, le mésencéphale et la notocorde sont perdus
(Bachiller et al., 2000). Ainsi, les antagonistes des BMP sécrétés par le tissu organisateur sont capables de
se compenser les uns les autres. Cependant, malgré cela, réaliser la greffe de Spemann-Mangold avec un
organisateur sans Chordine dans la région ventrale ne produit pas d'induction neurale et même aboutit à
transformer l'organisateur en épiderme. La concentration de BMP4 dans la zone ventrale de greffe est
tellement forte que l'absence de Chordine n'est plus compensable par les 2 autres inhibiteurs dans ce cas.

**Figure 7-34. Chordine est nécessaire pour s'opposer à l'action épidermalisante de BMP4 dans les greffes de
Spemann-Mangold. On greffe des explants d'organisateur de Spemann d'embryons de xénope pigmentés sur des
embryons receveurs albinos. En haut, les organisateurs sont normaux; en bas, ils proviennent d'embryons déplétés
en Chordine par traitement morpholino. On constate que sans Chordine, le greffon n'est pas internalisé
(contrairement au greffon sauvage qui est internalisé (pointillés blancs en C)) et devient une partie de l'épiderme. Il
n'y a pas d'induction neurale. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580702004045

À cela s’ajoute la protéine morphogénétique anti-dorsalisante (ADMP), un ligand de type BMP exprimé
dorsalement, qui stimule également la phosphorylation de Smad1/5/8 pour étendre le gradient de BMP
(Dosch et Niehrs, 2000 ; Joubin et Stern, 1999 ; Reversade et De Robertis, 2005 ; Willot et al., 2002). Cette
situation peut paraître paradoxale mais il fait partie des modulateurs qui évite que le domaine d’action de
l’organisateur ne s’étende trop loin et il limite aussi directement l’étendue de l’organisateur lui-même
(Leibovitch et al., 2018).

449
 **Figure 7-35. ADMP limite la taille du domaine de l’organisateur de Spemann. La surexpression d’ADMP a été
induite par l’injection de quantités croissantes d’ARNm codant ADMP (100 pg/embryon) dans les embryons au stade
2 cellules soit du côté dorsal (d,h), soit du côté ventral (e, i). Les embryons ont été fixés au début du stade gastrula et
traités hybridation in situ avec des sondes chordin (c–f) et goosecoid (gsc) (g–j) pour déterminer l’effet sur leur
domaine d’expression. L’arc relatif du domaine d’expression a été déterminé. f, j Graphiques résumant toutes les
mesures des tailles relatives (%) des domaines d’expression. Source :
https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-018-0483-x

L’inhibition des BMP ne suffit cependant pas pour réaliser l’induction neurale. Il faut aussi activer
la voie FGF à un stade précoce dans les cellules de l’ectoderme (Delaune et al., 2005).
*Figure 7-36. La voie de signalisation FGF est nécessaire
pour l’induction neurale (et aussi pour la formation des
muscles). (A) Les embryons de xénope sont incubés dans
des concentrations croissantes (de cI à cV) de SU5402, un
inhibiteur de la signalisation FGF, depuis le stade 4
cellules. (B-C) Pour certains des stades indiqués avec les
mêmes légendes qu'en A, on réalise une
immunohistochimie avec un anticorps 12.101
reconnaissant un antigène musculaire (B) et avec un
anticorps anti-NCAM qui est exprimé dans le tissu neural
(C). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/132/2/299/42857/Neural-
induction-in-Xenopus-requires-early-FGF

La signalisation FGF peut contribuer à inhiber les SMAD en aval du récepteur des BMP par phosphorylation.
Via ERK, elle peut aussi directement activer l’expression des gènes impliqués dans la formation de la plaque
neurale tels que Sox2 et Zic3 (Marchal et al., 2009).

Des mécanismes similaires à ceux du xénope ont été découverts chez le poisson-zèbre avec quelques
différences toutefois (Tuazon et Mullins, 2015; Zinski et al., 2017). Chez le poisson zèbre, le bouclier
embryonnaire est un tissu équivalent à la lèvre dorsale du blastopore de l’embryon de Xenopus. La
transplantation du bouclier embryonnaire dans la face ventrale d’un embryon de poisson zèbre entraîne
également la formation d’un axe dorsal secondaire avec une structure de tête complète (Saude et al., 2000).
Dans la blastula de poisson zèbre, les membres de la sous-famille BMP, BMP2b, BMP4, BMP7a et Spinhead
sont exprimés dans la face ventrale. BMP4 n’est pas nécessaire pour le développement ventral, tandis que
450
les trois autres membres BMP sont essentiels pour un développement correct de l’axe DV. La signalisation
de la β-caténine et la signalisation nodale (Ndr1 / Ndr2) agissent ensemble pour activer l’expression des
antagonistes à BMP comme chordine et noggin dans la marge dorsale, ce qui empêche les ligands BMP d’agir
du côté dorsal. La signalisation FGF réprime l’expression des gènes BMP et augmente l’expression de
Chordine et de Noggin. Admp et BMP2b sont également exprimés dans la marge dorsale, neutralisant ainsi
les Chordine et Noggin locaux (Xue et al., 2014; Yan et al., 2019). On se retrouve avec un système avec de
multiples régulations croisées qui permet d’apporter de la robustesse à cette étape cruciale du
développement.
***Figure 7-37. Régulations croisées pour mettre en
place l’axe dorso-ventral chez le poisson-zèbre. Pinhead
est un ligand des récepteurs BMP exprimé ventralement
(mais il n’est pas piégé par Chordine contrairement aux
ligands BMP classiques). L’expression de Pinhead et
ADMP est réprimée l’une par l’autre et par les voies
BMP/Smad. La boucle de rétroaction négative entre les
signaux Pinhead/ADMP et BMP joue un rôle important
comme un tampon contre les fluctuations de la
signalisation BMP dynamique pendant la formation de
l’axe DV. Par exemple, si BMP baisse, l’expression de
Pinhead et de ADMP va augmenter et contenir l’action de
Chordine. Source
: https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aau6455

Le gène orthologue de Chordine chez la drosophile s’appelle short gastrulation (sog) (Biehs et al.,
1996). L’injection de l’ARNm de sog induit du tissu neuronal à la fois dans les embryons de xénope
et de même pour la surexpression de Chordine chez la drosophile (Holley et al., 1995). Sog s’oppose
à l’action de Dpp qui est l’orthologue de BMP chez la drosophile. La mise en place de l’axe DV a donc
été conservée au cours de l’évolution et était présente chez l’ancêtre commun entre la Protostomiens
et les Deutérostomiens.

La signalisation Wnt/β-caténine joue un rôle clé dans la structuration antéro-postérieure (AP) de la

plaque neurale du xénope où un gradient de signalisation favorise le destin postérieur lorsque la
signalisation est forte. Lorsque des constructions d’ADN Wnt8 qui sont exprimés uniquement dans la
gastrula sont injectées dans des embryons, les structures céphaliques sont réduites. Une forte activité Wnt
inhibe donc le développement de la tête (Kiecker et Niehrs, 2001), un rôle conservé au cours de l’évolution
(Niehrs, 2010). Toute une batterie d’antagonistes de Wnt ou d’inhibiteurs de Wnt liés à la membrane
sont exprimés dans l’organisateur de Spemann et/ou le neuroectoderme potentiel lui-même pour
favoriser la fonction d’organisateur et pour régionaliser la plaque neurale. Le facteur de
transcription Goosecoid qui est un marqueur classique de l’organisateur de Spemann inhibe
directement l’expression de XWnt8 (Yao et Kessler, 2001).

451
 *Figure 7-38. Goosecoid (Gsc) stimule la formation de la
tête en agissant en tant que répresseur de la
transcription. (A) Schéma des constructions de fusion de
Gsc. Une région C-terminale de Gsc (résidus 128-244),
contenant l’homéodomaine (HD), a été fusionnée au
répresseur Engrailed (résidus 1-298) (Eng-Gsc) ou à
l’activateur VP16 (résidus 410-490) (VP16-Gsc). Au
stade de quatre cellules, un blastomère ventral (C,E,G) ou
deux blastomères dorsaux (B,D,F,J,K) ont été injectés
avec 150 pg d’ARNm de Gsc (B,C), 150 pg d’ARNm de
Eng-Gsc (D,E) ou 500 pg d’ARNm de VP16-Gsc (F,G,J,K).
Une hybridation in situ pour Otx2 (H,J) ou En2 (I,K) et
une immunohistochimie avec l’anticorps musculaire
12/101 (H,J) ou l’anticorps contre un marqueur de la
notochorde Tor 70 (I,K) ont été réalisées pour évaluer le
développement axial et neural des embryons injectés ou
non injectés (contrôle) de VP16-Gsc. Les pointes de
flèches blanches indiquent un axe secondaire partiel
(C,E) ou une glande cémentaire (structure la plus
antérieure de la tête) (B,D). Les pointes de flèches noires
indiquent la coloration des muscles (H,J) ou de la
notochorde (I,K). Les flèches noires indiquent la
coloration liée à l’expression d’Otx2 (H) ou d’En2 (I,K).
Barre d’échelle : 0,5 mm. Source
: https://journals.biologists.com/dev/article/128/15/2975/41259/Goosecoid-promotes-head-
organizer-activity-by

Il y a aussi activation de l’expression de protéines qui inhibent la voie Wnt. Citons Cerberus, Frzb,
Dkk1, Shisa, Tiki, Notum, Angptl4, et Bighead (Cruciat et Niehrs, 2013 ; Zhang et al., 2015, Kirsch et al.,
2017, Ding et al., 2018). L’action de ces inhibiteurs est nécessaire pour former les parties les plus
antérieures du cerveau (télencéphale et diencéphale).
*Figure 7-39. La protéine Cerberus inhibe trois voies de
signalisation. Nommée d’après le chien à trois têtes qui
gardes les Enfers selon la mythologie gréco-romaine
pour sa capacité à former des têtes ectopiques lorsqu’elle
est surexprimée, cette protéine inhibe trois voies de
signalisation : Wnt, BMP et Nodal.

452
 *Figure 7-40. Chordine et Cerberus sont nécessaires
pour la formation de la tête. Des embryons de xénope
sont injectés avec des morpholinos (MO) qui inhibent la
production de Chordine (Chd-MO) ou de Cerberus (Cer-
Mo). On les laisse se développer jusqu'au stade bourgeon
caudal. Chordine et Cerberus sont chacun nécessaires
pour la formation de la tête. L'absence des deux aboutit
à des embryons sans axes définis. Le côté antérieur est à
gauche. Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.0020092

La surexpression des gènes comme Cerberus, Dkk1 ou Frzb aboutit à des têtes hypertrophiées ou même à
des têtes ectopiques. Dkk1 ou Dickkopf-1 est un ligand de haute affinité pour LRP6, le co-récepteur de Wnt
(aux côtés de Frizzled). La fixation de Dkk1 empêche Wnt d’interagir avec LRP6 et donc Dkk-1 est un
antagoniste de la voie Wnt (Bafico et al., 2001).

Régionalisation le long de l’axe antéro-postérieur

Nous venons de voir que l’inhibition de la voie Wnt était nécessaire pour former la partie antérieure de la
tête. Sans cette inhibition, l’expression du gène Otx2 qui marque les structures les plus antérieures du tube
neural n’est pas activée.

L’activation de la voie Wnt pour former des structures plus postérieures est requise. Notamment, la
signalisation Wnt stimule l’expression de Gbx2 qui inhibe l’extension de Otx2 et le cantonne dans
les régions les plus antérieures (Li et al., 2009; Inoue et al., 2012). Mais la signalisation Wnt n’est pas
suffisante. Il faut aussi que les FGF puissent agir. Des calottes animales de xénope donnent du système
nerveux plutôt antérieur si on les incube avec des inhibiteurs de la voie BMP et il faut les incuber en plus
avec des FGF pour obtenir des structures postérieures. Les FGF agissent en tant que morphogènes : plus
leur concentration est élevée, plus les structures induites sont postérieures.
*Figure 7-41. FGF est un morphogène
postériorisant. Des calottes animales de xénope sont
dissociées pour induire des structures neurales et
ensuite soumises à différentes concentrations de bFGF
(=FGF2). Les ARNm sont extraites des calottes et
soumises à une RT-PCR pour les gènes indiqués (dont le
patron d’expression sur l’axe AP est indiqué en A)
: XeNK-2, En-2 (=Engrailed-2), XlHbox1 (=Hoxc6),
XlHbox6 (=Hoxc9). EF1alpha est utilisé comme contrôle.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/121/9/3121/38848/bFGF-as-a-
possible-morphogen-for-the

On constate que des doses moyennes et fortes induisent l’expression des gènes Hox. Pour ce faire, la
signalisation FGF active l’expression des gènes de la famille Cdx.

L’acide rétinoïque agit également et postériorise les structures en activant aussi des gènes Hox.

453
 *Figure 7-42. Régionalisation antéro-postérieure du
tube neural. Embryon de poulet au stade 8 somites. Le
domaine d’expression du marqueur antérieur Otx2 et le
domaine d’expression de Gbx2 sont précisés. La voie Wnt
est activée dans le cerveau postérieur (mais son action
est inhibée dans le cerveau antérieur). L’acide rétinoïque
est actif dans la région la plus postérieure du cerveau et
la partie antérieure de la moelle épinière. Les FGF
forment un gradient avec une plus forte expression dans
la région postérieure. Ils sont cependant présents dans la
région la plus antérieure (l’ANR ou Apical Neural Ridge)
et régionalisent localement le télencéphale et aussi
présents à la frontière entre le mésencéphale et le
rhombencéphale mais là aussi leur action est locale.
Inspiré de Millet et al., 1996.

Le contrôle par les gènes Hox de l’identité des segments le long de l’axe AP a été mis en évidence
chez la drosophile et les gènes orthologues ont été découverts chez les Vertébrés. Mais entre
l’ancêtre commun des Vertébrés et des Protostomiens, il y a eu une double duplication du génome
dans la branche qui mène aux Vertébrés. Là, où il y a un gène chez la Drosophile, il y en a
(théoriquement) 4 chez les Vertébrés. A cause des redondances fonctionnelles, certains des gènes
issus de ces duplications ont été délétés ou transformés en pseudogènes.

*Figure 7-43. Complexes homéotiques chez la drosophile et chez les Mammifères. Les gènes orthologues sont
indiqués de la même couleur. Le gène orthologue à Abd-B des Deutérostomiens a eu de multiples duplications avant
la double duplication du génome des Vertébrés qui a affecté l’ensemble des gènes Hox.
D’après https://www.hindawi.com/journals/bmri/2014/591374/

454
Les redondances résiduelles rendent aussi plus difficiles les analyses fonctionnelles et il faut
souvent avoir recours à des doubles ou à des triples mutants pour obtenir un phénotype
significatif (Wellick et Capecchi, 2003).
*Figure 7-44. Les triples mutants Hoxa10-/-;Hoxc10-/-
;Hoxd10-/- et Hoxa11-/-;Hoxc11-/-;Hoxd11-
/- présentent des antériorisations de l’identité des
vertèbres. Dans le premier cas, toutes les vertèbres
lombaires sont transformées en vertèbres sacrées
et dans le deuxième cas, toutes les vertèbres
sacrées sont transformées en vertèbres lombaires.
D’après https://www.science.org/doi/10.1126/science.1085672

La même règle de colinéarité que chez la drosophile s’applique chez les Vertébrés. Plus le gène est
en 5′ dans le complexe, plus son domaine d’expression est postérieur.
*Figure 7-45. Expression de deux gènes Hox lors de la
mise en place de l'axe antéro-postérieur lors de la
gastrulation du poulet. Un embryon de poulet est
électroporé avec des constructions permettant
d'exprimer le DsRed (rouge) sous le contrôle du
promoteur du gène Hoxb1 et la GFP (vert) sous le contrôle
du promoteur du gène Hoxb9. On observe la fluorescence
en cours de gastrulation. L'axe antéro-postérieur est
vertical avec l'extrémité antérieure vers le haut. Les
pointillés montrent la délimitation de la ligne primitive et
HN désigne le noeud de Hensen. On constate que la
plupart des cellules où le promoteur de Hoxb1 est activé
sont positionnés plus antérieurement que les cellules où
le promoteur du gène Hoxb9 est activé. Hoxb9 est
positionné plus en 5' dans le complexe que Hoxb1. La
coloration jaune vient de la superposition des cellules
avec des fluorescences différentes (elles ne sont pas dans
le même plan). Source :
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1440-
169X.2007.00928.x

455
 *Figure 7-46. Règle de colinéarité : Activation successive et régionalisée des gènes Hox de plus en plus en 5' dans le
complexe au fur et à mesure de la gastrulation chez un embryon d'Amniote. On prend l'exemple de deux gènes Hox
du même complexe B. L'axe AP est vertical sur le schéma et le côté antérieur est en haut. Le gène dont l'expression
est montrée en vert est juste plus en 5' dans le complexe que le gène dont l'expression est montrée en rose.
L'expression rose est plus précoce et avec les mouvements de la gastrulations, elle finit par être plus antérieure que
l'expression verte. Source : https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1440-169X.2007.00928.x

**Figure 7-47. Application de la règle de colinéarité lors

de la spécification de l’identité des rhombomères dans le
rhombencéphale. Vue sagittale du cerveau postérieur
subdivisé en 12 segments transversaux : territoires de
l’isthme et du r1 (r0-r1), 5 rhombomères
morphologiquement distincts (r2-r6), et 5 crypto-
rhombomères (r7-r11) le long de l’axe AP. En dessous,
profil d’expression des gènes Hox corrélé aux limites
intersegmentaires et aux limites transversales des
noyaux des nerfs crâniens. V, noyau moteur du trijumeau
; VII, noyau moteur du visage ; VIII, noyaux
vestibulocochléaires ; VIIIn, VIIIe nerf crânien ; X, noyau
moteur vagal dorsal ; XII, noyau moteur hypoglosse ;
Amb, noyau moteur ambigu ; AP, Area postrema ; AVCN,
Anteroventral cochlear nucleus ; DCN, noyau cochléaire
dorsal ; dcn, noyaux de la colonne dorsale ; DLL, noyau
dorsal du lemniscus latéral ; ILL, noyau intermédiaire du
lemniscus latéral ; PVCN, noyau cochléaire
postéroventral ; RAmb, noyau rétroambigu ; SOC,
complexe olivaire supérieur ; VLL, noyau ventral du
lemniscus latéral. Source
: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncir.2017.00018/full

Chez les Vertébrés, l'expression des gènes Hox posent des frontières conservées au cours de
l'évolution. Par exemple, la limite d'expression antérieure de Hoxc6 correspond à la transition entre
les vertèbres cervicales et les vertèbres thoraciques, quel que soit le nombre de vertèbres cervicales
ou thoraciques chez les différentes espèces (Böhmer, 2017). Cette limite d'expression est notamment
nettement plus postérieure chez les Oiseaux que chez les Mammifères, les Oiseaux ayant en général deux
fois plus de vertèbres cervicales que les Mammifères.

L'action des gènes Hox sur l'identité des vertèbres se passe très tôt. Les vertèbres dérivent du
sclérotome en provenance des somites mais la détermination de l'identité des vertèbres a lieu dans
le mésoderme pré-somitique, avant même la formation des somites. En effet, si on transplante le
mésoderme présomitique qui donne normalement des vertèbres thoraciques dans la région du
mésoderme présomitique d'un autre embryon qui donne des vertèbres cervicales, le greffon
donnera toujours des vertèbres thoraciques, même dans ce nouvel environnement (Kieny et al.,
1972). C'est le signe que la détermination a déjà eu lieu.

Comme chez la drosophile, des gains-de-fonction des gènes Hox postériorisent les structures et les
perte-de-fonction les antériorisent. Dans le rhombencéphale, si on élimine toute l’action des gènes Hox

456
en réalisant une perte-de-fonction de Pbx qui est un partenaire essentiel pour que les protéines Hox
trouvent leur séquence cible sur l’ADN, tout le rhombencéphale ressemble au rhombomère 1, qui est le
rhombomère par défaut (Waskiewicz et al., 2002). La spécification des rhombomères plus postérieurs
nécessite le bon fonctionnement des facteurs de transcription Hox.

A cela s’ajoute chez les Vertébrés une colinéarité temporelle, plus le gène est en 5′ dans le complexe
plus il est exprimé tardivement. Chez la souris, les premiers gènes Hox (en 3′ du complexe) sont exprimés
à partir de E7 et les derniers (en 5′ du complexe) sont exprimés à partir de E9. Cette activation séquentielle
doit être coordonnée avec la production elle aussi séquentielle de nouvelles structures telles que les somites
à partir du mésoderme présomitique (Noordermer et al., 2014).

Les gènes Hox des groupes de paralogie 1 à 8 spécifient les régions qui ont été directement affectées par la
ligne primitive alors que les gènes Hox des groupes de paralogie 9 à 13 spécifient les régions qui sont
dépendantes des progéniteurs neuromésodermiques bipotents (NMP) du bourgeon caudal qui “terminent”
la croissance de l’axe dans la région la plus postérieure de l’embryon après la gastrulation. Les NMP peuvent
adopter un destin neural en inhibant l’expression de Brachyury et en maintenant l’expression de Sox2. À
l’inverse, les NMP acquérant le destin du mésoderme conservent l’expression de Brachyury, et inhibent
l’expression de Sox2, tout en augmentant l’expression de Tbx6 et Msgn1, devenant des cellules progénitrices
mésodermiques. Cette deuxième partie de l’élongation de l’embryon le long de l’axe AP montre un
ralentissement par rapport à la première partie et les gènes Hox paralogues 9 à 13 sont responsables de ce
ralentissement qui aboutit au bout du compte à l’arrêt de la croissance en longueur. Ces gènes Hox inhibent
avec de plus en plus de force l’activité de la voie Wnt qui est postériorisante. Cela aboutit à l’extinction de
l’expression de Brachyury (Denans et al., 2015).

Lin28a est une protéine qui se fixe sur des ARN et qui, notamment, empêche la maturation du microARN Let-
7. Chez la souris, Lin28a est nécessaire pour que les gènes Hox postérieurs ne soient pas activés trop tôt.
Chez la souris Lin28a-/-, parmi d’autres gènes Hox, le gène Hoxc13 est exprimé trop tôt, ce qui résulte en un
arrêt prématuré de la croissance de l’axe AP. L’activation plus précoce d’autres gènes Hox provoquent des
postériorisations de vertèbres typiques des gains de fonctions de gènes Hox.
**Figure 7-48. Postériorisation de l’axe AP chez le
mutant Lin28a-/- chez qui les gènes Hox sont exprimés
plus précocement. Vertèbres C = cervicales, T =
thoraciques, L = lombaires, S = sacrées, Ca = caudales.
Source : https://elifesciences.org/articles/53608

Lin28a agit via la répression de Let-7 qui selon des voies encore inconnues aboutit à ce que les protéines
PRC1 du complexe répresseur Polycomb ne soient pas aussi présents que les séquences régulatrices des
gènes Hox, aboutissant à leur expression plus précoce (Sato et al., 2020). Le complexe Polycomb PRC1 et
aussi le complexe PRC2 ont également pour rôle de maintenir réprimé à long terme l'expression des gènes
Hox "inappropriés" pour une région donnée de l'embryon puis après l'éclosion/la naissance. Le modèle
457
classique d'inhibition de la transcription par les complexes Polycomb implique le recrutement initial de
PRC2, qui dépose méthyle triplement H3K27, suivi du recrutement de PRC1 via sa sous-unité de liaison à
H3K27me3, conduisant à l'ubiquitylation de H2A qui est une marque épigénétique répressive (Wang et al.,
2004).

***Figure 7-49. Principaux composants des complexes Polycomb PRC1 et PRC2. Le complexe répressif PRC1
comprend des paralogues interchangeables pour les quatre sous-unités principales : 3 de Polyhomeotic (PH), 5 de
Polycomb (PC), 2 de Sex Comb Extra (SCE) et 6 de Posterior Sex Comb (PSC). Ensemble, les sous-unités SCE et PSC
correspondent au complexe catalytique de type ubiquitine ligase E3 de PRC1 (bord pointillé). Le complexe répressif
PRC2 se compose des sous-unités centrales EZH1/2, SUZ12, EED et RbAp46/48, avec EZH1/2 (bord pointillé)
possédant l'activité catalytique méthyltransférase de PRC2. Source : https://www.mdpi.com/1422-
0067/22/6/2976

Tout ce qui vient d'être expliqué pour la mise en place des axes est mis en application lorsqu'il s'agit de
différencier des cellules in vitro à partir de cellules souches pluripotentes telles que les cellules iPS. La
succession des molécules de signalisation ajoutés dans les milieux est inspirée des signaux présents dans
l'embryon (Petros et al., 2011).
**Figure 7-50. Voies de signalisation successivement activées
ou inhibées pour obtenir des neurones d'un type précis à partir
de cellules souches pluripotentes. On commence d'abord par
inhiber les BMP pour mimer l'induction neural dans un
contexte avec peu de signalisation Wnt et en présence de FGF.
Puis les progéniteurs neuraux obtenus sont soumis à des
protocoles de régionalisation avec une inhibition des BMP et
des Wnt pour produire des neurones antérieurs, avec l'addition
de FGF8 pour produire des neurones proches de la frontière
mésencéphale/métencéphale (isthme) et avec l'addition
d'acide rétinoïque pour produire des neurones des régions
postérieurs. Ensuite, Shh est ajouté si on souhaite obtenir des
neurones ventraux. La cyclopamine inhibe la signalisation Shh
pour obtenir des neurones dorsaux (nécessaire seulement que
pour obtenir des neurones dorsaux télencéphaliques). α = anti-
. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2011.00030/full

L’axe droite-gauche
Dans l’embryon de souris, la rupture de la symétrie gauche-droite (GD) est déclenchée à 7,75 jours après la
fécondation (E7.75) par un écoulement du liquide extracellulaire vers la gauche dans le nœud de Hensen,
une cavité embryonnaire sur la ligne médiane. Le flux de fluide vers la gauche, appelé flux nodal est généré
par un mouvement de rotation dans le sens des aiguilles d’une montre des cils nodaux (il y en a 200
environ). Ils sont inclinés vers le côté postérieur et effectuent des mouvements dits efficaces vers la gauche
et de récupération vers la droite, entraînant un flux net vers la gauche. L'orientation particulière de ces cils
est la conséquence de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans les cellules épithéliales qui les portent,
causée par la distribution de Vangl1 et Prickle au pôle antérieur des cellules et de Dvl au pôle postérieur
(Antic et al., 2010).

458
 **Figure 7-51. Nœud de Hensen d’un embryon de souris
vu en microscopie électronique à balayage. Notez les cils
sur les cellules. Barre d’échelle : 20 μm. Source
: https://www.nature.com/articles/ncomms1624

**Figure 7-52. Distribution de la vitesse du flux nodal

dans les embryons de souris aux stades EHF (pour early
headfold, apparition du repli de la tête) à E7,5 et au
stade 2 somites (2-soms) à E7,75. Les flux sont observés
grâce au déplacement de microbilles fluorescentes d’un
diamètre de 0,2 μm. Le côté gauche est à droite sur la
représentation. Source
: https://www.nature.com/articles/ncomms1624

Deux hypothèses principales pour le mécanisme d’action du flux dans la détermination de GD dans
l’embryon de souris ont été proposées. Le modèle à deux cils suggère que deux populations de cils nodaux
existent dans le nœud de Hensen: les cils mobiles au centre génèrent le flux vers la gauche, tandis que les
cils immobiles dans la région périphérique détectent le flux par stimuli mécaniques (Shinohara et al., 2012).
L’autre modèle propose que le flux vers la gauche transporte des vésicules submicrométriques (NVP) qui
contiennent Sonic hedgehog et de l’acide rétinoïque, qui activent des gènes spécifiques du côté gauche. Quel
que soit le mécanisme, il s’ensuit que la voie de signalisation Nodal est activée spécifiquement à gauche.
Dans les cellules de ce côté du nœud de Hensen, il y a une entrée de Ca 2+ dans le cytoplasme qui active une
cascade de transduction aboutissant à l’inhibition de l’inhibiteur de la voie Nodal, Dand5 (aussi appelé
Cerl2). Les ARNm de Dand5 sont dégradés plus rapidement sous le l’action de la protéine Bicc1 activée par
le Ca2+ (Nakamura et al., 2012, Maerker et al., 2021). La voie de signalisation Nodal peut ainsi agir et activer
la transcription de Pitx2 (Yoshioka et al., 1998).

459
 **Figure 7-53. Signalisation spécifique à gauche chez l’embryon de souris. A quelques petites variations près, le
réseau est similaire dans d’autres modèles. Sous l’influence de Sonic Hedgehog qui est transporté à gauche,
l’expression du Nodal y est activée qui active à son tour l’expression de Pitx2 dans le mésoderme des lames latérales
gauches. Nodal active l’expression de Lefty-1 dans le tube neural qui est capable de séquestrer Nodal et de l’empêcher
de diffuser vers la droite. N = nœud de Hensen. Source : https://www.mdpi.com/2308-3425/4/4/16/htm

Environ 50% des patients atteints de dyskinésie ciliaire primaire (défaut de motilité des cils)
d'origine génétique présentent un situs inversus, c'est-à-dire une distribution des organes inversés
par rapport à l'axe droite-gauche, montrant le lien entre les mouvements ciliaires et la mise en
place de cet axe.

La formation des somites

Deux vidéos à regarder en ouverture : Elongation de l'axe antéro-postérieur et formation des

somites chez l'embryon de poulet : https://doi.org/10.7554/eLife.04379.003

et formation des somites chez le poisson-zèbre : https://youtu.be/RMCVdhK85mc

Les somites sont des segments transitoires du mésoderme paraxial qui donnent naissance aux
vertèbres, aux muscles du dos et des membres et au derme.

*Figure 7-54. Ajout progressif de somites à partir du mésoderme présomitique chez l'embryon de poulet. Une paire
de somites est ajoutée toutes les 90 minutes. Source : https://elifesciences.org/articles/04379

460
Le long du corps de l'embryon qui s'allonge, la somitogenèse forme séquentiellement et
périodiquement des boules épithéliales paires (somites) à partir de tiges bilatérales de cellules
mésenchymateuses appelées mésoderme pré-somitique (PSM). Il s'agit d'une transition
mésenchymato-épithéliale (TME). Au fur et à mesure que les cellules quittent l'extrémité
rostrale/antérieure (tête) du PSM pour former chaque somite, de nouvelles cellules se déplacent
continuellement du bourgeon caudal pour rejoindre le PSM à l'extrémité caudale/postérieure (queue) de
l'embryon.
*Figure 7-55. Somitogenèse chez un
embryon de poulet de stade HH 10 coloré
avec l'agglutinine-FITC de Lens culinaris qui
se lie à la membrane plasmique. (B) Image
en microscopie de contraste du même
embryon. (C) Coupe coronale d'une seule
bande du PSM et des somites les plus
récents. Le PSM est relativement plat à
l'extrémité postérieure et devient
progressivement plus épais vers l'extrémité
antérieure. La ligne médiane du PSM est
soulignée de jaune en (C). Dans toutes les
images, la partie antérieure est en haut, la
partie postérieure en bas. Barres d'échelle =
40 µm. Source : https://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.1002155

Lors de la somitogenèse, les cellules s'épithélialisent progressivement avant même que les segments ne se
séparent les uns des autres. Les cellules du PSM augmentent progressivement leur densité de molécules
d'adhérence cellule-cellule (Duband et al., 1987) et diminuent leur motilité (Mongera et al., 2018). Les
cellules PSM dorsales subissent une maturation précoce, formant une monocouche épithéliale le long de la
limite de l'ectoderme, commençant bien avant la formation des somites. Cet épithélium pré-somitique
montre également des signes de pré-segmentation, avec des amas de cellules formant des segments de tissu
arqués d'environ la longueur d'un diamètre de somite.

Les derniers somites (les plus postérieurs) ne se forment pas tout à fait selon les mêmes modalités
que les premiers somites (les plus antérieurs). Après la formation des somites les plus antérieurs,
la suite de l’allongement de l'axe est alimentée par un pool de progéniteurs neuromésodermiques
(NMP), qui donnent naissance à des composants neuronaux de la moelle épinière ainsi qu'au tissu
mésodermique des somites (Tzouanacou et al., 2009). Les NMP sont caractérisés par la co-
expression de facteurs de transcription associés à la gastrulation, au développement
mésodermique et neural, notamment Brachyury (T), Sox2 et Nkx1.2 (Henrique et al., 2015;
Steventon et Martinez Arias, 2017). La détermination du mésoderme (et par conséquent du
mésoderme pré-somitique) et du tube neural se fait ensuite par des inductions différentielles :
FGF/Wnt en faveur du mésoderme, acide rétinoïque en faveur du tube neural (Sambasivan et
Steventon, 2021). Le facteur de transcription Mésogénine-1 (Msgn1) est ensuite essentiel pour
orienter des cellules vers un destin de mésoderme pré-somitique (Chalamalsetty et al., 2014).
461
 **Figure 7-56. Des progéniteurs neuromésodermiques à leurs dérivés. Les cellules souches NMP bipotentielles,
définies par l'expression de Sox2 et T (Brachyury), génèrent les progéniteurs de la moelle épinière du tronc (NPC,
cellules progénitrices neurales) et des somites (MPC, cellules progénitrices mésodermiques). Wnt3a maintient à la
fois la cellule souche NMP et le MPC. La voie Wnt3a/β-caténine active ensuite les gènes cibles T et Msgn1 pour
spécifier le destin du mésoderme paraxial présomitique. Msgn1 initie les programmes génétiques qui définissent
l'identité du mésoderme pré-somitique (PSM) et son comportement cellulaire en activant l'expression des
régulateurs principaux : Snail1 pour la motilité et Tbx6 pour la suppression neurale, entre autres. L'expression de
Msgn1 et Tbx6 doit ensuite être inhibée pour que les cellules du mésoderme pré-somitique deviennent des somites.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/141/22/4285/46492/Mesogenin-1-is-a-master-regulator-of-paraxial

La somitogenèse est étonnamment robuste aux perturbations (à la fois spatiales et temporelles). Les
modifications du nombre total de cellules embryonnaires ou de la rapidité d'ajout de nouvelles cellules à
l'extrémité caudale du PSM entraînent des modifications compensatoires de la taille et du moment de la
formation des somites, de sorte que l'embryon produit finalement le même nombre final de somites que
normalement. Une augmentation proportionnelle de la taille du somite avec la vitesse de la position de
déplacement caudale du front de détermination ou avec la vitesse à laquelle les cellules rejoignent
l'extrémité caudale du PSM est sans doute à l'œuvre.

Actuellement, le modèle le plus largement accepté pour expliquer la formation des somites est le mécanisme
« horloge et front d'onde », qui combine un front de détermination et de différenciation qui progresse vers
la région postérieure avec un oscillateur intracellulaire qui détermine le destin cellulaire en fonction de sa
phase au moment de la détermination. Suite à l'identification des premiers transcrits oscillants (hairy1 et
hairy2) dans le PSM (Palmeirim et al., 1997), de nombreuses simulations informatiques de complexité
variable ont mis en œuvre différents modèles "horloge et front d'onde" (Hester et al., 2011; Tiedemann et
al., 2012 ; Baker et al., 2006).

Chez les Vertébrés, les gènes avec un motif oscillatoire au sein du PSM incluent ceux codant des composants
ou des cibles des voies de signalisation FGF, WNT et Notch (Hubaud et Pourquié, 2014; Krol et al., 2011;
Dequéant et al., 2006).

Cependant, les gènes individuels qui oscillent diffèrent selon les espèces, à l'exception des facteurs de
transcription HES/HER sensibles à Notch, ce qui suggère que la signalisation Notch est au cœur de l'horloge
de la somitogenèse (Krol et al., 2011). Soutenant cette idée, des manipulations génétiques et
pharmacologiques démontrent que l'oscillation de la voie Notch dans l'embryon de souris est essentielle
pour la somitogenèse (Ferjentsik et al., 2009).

462
**Figure 7-57. Réseaux comparatifs de gènes cycliques chez la souris, le poulet et le poisson zèbre. Description
schématique d'une cellule PSM interagissant avec sa voisine, montrant les gènes cycliques candidats dans les voies
de signalisation Notch, FGF et Wnt identifiés chez (A) la souris, (B) le poulet et (C) le poisson zèbre. Les ARNm et
protéines cycliques sont codés par couleur en fonction de leur association avec les voies de signalisation Notch (bleu),
FGF (orange) et Wnt (magenta). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/138/13/2783/44467/Evolutionary-plasticity-of-segmentation-clock

463
 *Figure 7-58. L'activation de Notch est nécessaire à la
formation de somites. La préséniline est le composant
catalytique du complexe γ-sécrétase responsable du
clivage du récepteur Notch et de la libération du domaine
intracellulaire de Notch (NICD) qui peut agir dans le
noyau. Les souris sans préséniline Psen1-/-;Psen2-/- ne
peuvent plus cliver et libérer NICD. Sur ces vues latérales
d'embryons de souris à E9,5, on constate l'absence de
somites chez les doubles mutants perte-de-fonction (B)
alors que l'activité du produit d'un allèle fonctionnel
Psen1 suffit à obtenir des somites (A, montrés par des
traits). Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000662

Chez la souris, les ondes oscillatoires du récepteur Notch1 et l'expression du ligand Delta-like 1 (Dll1), ainsi
que du récepteur Notch activé (le domaine intracellulaire clivé, NICD) parcourent le PSM de l'arrière vers
l'avant, où les oscillations s'arrêtent (Bone et al., 2014, Shimojo et al., 2016).
*Figure 7-59. Oscillation de l'activité Notch dans le
mésoderme pré-somitique. Immunofluorescence sur la
partie postérieure d'un embryon de souris au stade 6
somites (vue dorsale) avec un anticorps reconnaissant le
domaine intracellulaire de Notch lorsqu'il est clivé (voie
Notch active). On voit les oscillations dans le PSM. La
région antérieure est vers la gauche. Source :
https://elifesciences.org/articles/55608

**Figure 7-60. Horloge de segmentation et front de formation des somites chez les Vertébrés. Chez les vertébrés, le
front d'onde (ligne pointillée rouge) est influencé par les gradients de signalisation FGF et Wnt provenant de
l'extrémité postérieure et par un contre-gradient d'acide rétinoïque (RA) provenant des somites formés
précédemment. Au fur et à mesure que le nouveau somite se forme et que l'axe s'allonge, le front d'onde se déplace
de concert vers la partie postérieure. Lorsque les vagues d'expression cyclique des gènes Hes/Her (couleur bleue
dans le PSM) traversent le front d'onde, l'oscillation s'arrête et une nouvelle limite de somite se forme. Plusieurs
paramètres mesurables sont essentiels pour analyser le modèle d'horloge et de front d'onde, à savoir : S, la longueur
du segment ; v, la vitesse du front d'onde ; e, le taux d'élongation de l'axe. La période de segmentation TS est mesurée
par la durée de formation de chaque paire de somite. En mesurant l'expression de Hes/Her en temps réel à
l'extrémité antérieure ou postérieure du PSM au fil du temps (cercles en pointillés jaunes dans le PSM), l'oscillation
464
 peut être révélée (encart en pointillés jaunes sur le panneau de droite) et la période antérieure TA et la période
postérieure TP peuvent être mesurées. Notez que TA peut être différente de TP. Source :
https://europepmc.org/article/pmc/5446262

Ces oscillations sont établies par des boucles de rétroaction négative des composants de Notch tels que le
répresseur transcriptionnel HES7 (Niwa et al., 2011), et la glycosyltransférase Lunatic Fringe (LFNG)
(Morimoto et al., 2005), qui sont tous deux codés par des gènes oscillants sous le contrôle de la voie Notch.
**Figure 7-61. Contrôle de l'expression de Hes7. Dans le
PSM, l'expression de Hes7 est activée par Tbx6 (qui se
fixe sur des éléments régulateurs T-box de ses séquences
régulatrices) et Msgn1 (qui se fixe sur des régulateurs E-
box de ses séquences régulatrices) et la voie Notch qui
provoque l'oscillation de l'expression de Hes7. Une fois,
les cellules sorties du PSM pour donner des somites, il n'y
a plus de facteurs de transcription activateurs. Tbx6 est
piégé par Ripply2 qui provoque sa dégradation et Tbx18
réprime l'expression de Hes7. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)31399-
5/fulltext

Se pose aussi la question de savoir si l'horloge moléculaire est une propriété intrinsèque des cellules du
PSM ou seulement une propriété émergente du tissu. Dans des cellules isolées du PSM, l'expression de
certains gènes continue à osciller mais ces oscillations ne sont pas stables et finissent par se perdre
(Masamizu et al., 2006, Webb et al., 2016) ce qui indique que des interactions cellulaires sont nécessaires
pour le maintien de l'horloge.

Les oscillations de Notch s'arrêtent dans le PSM antérieur, où le NICD coopère avec TBX6 pour activer
périodiquement l'expression de Mesp2 (Oginuma et al., 2008). MESP2 régule ensuite la formation du somite
naissant, notamment la transition mésenchyme-vers-épithélium qui l'accompagne ainsi que sa
structuration rostro-caudale. Cette polarité est essentielle pour la formation normale de la colonne
vertébrale et la migration des cellules de crêtes neurales à travers le somite. MESP2 réalise cette fonction
en activant (entre autres) directement l'expression des récepteurs éphrines (tels que Eph-A4 dans la région
antérieure du somite naissant) (Nakajima et al., 2006). Signalons que MESP2, par rétrocontrôle négatif,
inhibe la voie de signalisation Notch dans la partie antérieure du somite où l'expression de MESP2 finit par
se restreindre (Morimoto et al., 2005). Dans la partie postérieure du somite, la voie de signalisation Notch
active l'expression de Uncx4.1 qui contribue à mettre en place l'identité postérieure du somite (Takahashi
et al., 2007).

**Figure 7-62. Mesp2 inhibe l'expression du ligand de Notch Dll1 dans la partie antérieure des somites et
(indirectement) limite l'expression de Uncx4.1 à la moitié postérieure des somites. La région postérieure de souris
sauvages ou homozygotes pour une mutation perte-de-fonction de Mesp2 est traitée en hybridation in situ avec des
sondes reconnaissant les ARNm de Dll1 ou Uncx4.1. Source :
https://anatomypubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/dvdy.21178
465
La vitesse des oscillations et donc le rythme de production des somites varient selon les espèces. Une
nouvelle paire de somites est générée toutes les 90 minutes chez l'embryon de poulet et toutes les 50
minutes chez l'embryon de xénope. Chez le python, une nouvelle paire de somites est produite toutes les 25
minutes, ce qui peut expliquer que les serpents ont un axe antéro-postérieur très allongé avec un nombre
de vertèbres dépassant souvent la centaine.

*Figure 7-63. Comparaison de la somitogenèse chez la souris et chez un serpent. Les oscillations de l'expression des
gènes impliqués dans l'horloge somitique comme ici Lunatic fringe ont une fréquence plus importante dans le PSM.
Les somites produits sont nombreux mais plus petits. Source :
https://www.wikiwand.com/en/Snake#Media/File:Comparative_somite_creation.jpg

Des mutations dans presque tous les gènes de la voie Notch mentionnés plus haut ont été identifiées chez
des patients humains avec des défauts vertébraux qui prennent leur origine dans une somitogenèse
défectueuse (Giampietro et al., 2009). Par exemple, des mutations récessives dans DLL3, HES7, MESP2 et
LFNG et une mutation dominante dans TBX6 (Sparrow et al., 2013) ont été identifiées chez des patients
atteints de dysostose spondylocostale (SCDO), caractérisée par des malformations vertébrales sévères qui
incluent des hémivertèbres, une perte vertébrale et une fusion le long de l'axe (Takeda et al., 2018). Alors
que la SCDO est relativement rare, la scoliose congénitale, définie comme une courbure latérale de la
colonne vertébrale supérieure à 10 %, est beaucoup plus fréquente, avec une fréquence de 1:1000, ce qui
est suspecté d'être une sous-estimation car les individus asymptomatiques ne recherchent pas soins
médicaux. Les allèles mutés de HES7, LFNG, MESP2 et TBX6 sont tous associés avec la scoliose congénitale.

La position dans le PSM antérieur où les oscillations de Notch s’arrêtent et où l'expression de Mesp2 établit
la future frontière somite est appelée le front de détermination (Morimoto et al., 2005 ; Saga et al., 1997 ;
Dubrulle et al., 2001). Cette région est également la limite antérieure du front d'onde dans le modèle
classique "horloge et front d'onde" proposé il y a près de 50 ans pour expliquer la formation périodique de
segments dans le PSM (Cooke et Zeeman, 1976). Dans ce modèle, l'activité du front d'onde empêche le PSM
de répondre à l'horloge de segmentation ; par conséquent, les somites ne se forment qu'en avant, là où le
front d'onde se termine. Dans les embryons de poulet ou de poisson zèbre, la protéine FGF ajoutée de
manière exogène ou l'inhibition pharmacologique de la signalisation FGF déplace le front de détermination
respectivement vers l'avant ou vers l'arrière. Chez la souris, l'inactivation médiée par Cre de Fgf4 et Fgf8
spécifiquement dans le PSM entraîne une expansion initiale de l'expression de Mesp2, suivie de l'expression
prématurée de marqueurs de somites dans tout le PSM (Naiche et al., 2011). On considère que la baisse de
la signalisation FGF est nécessaire et suffisante pour que les cellules du PSM acquièrent une compétence à
former un somite (et elles formeront un somite à condition que les gènes oscillants selon l'horloge soient
bien exprimés).

La signalisation canonique WNT est également impliqué dans le front d'onde, principalement parce que
l'activation ectopique de la β-caténine dans le PSM entraîne une expansion de ce tissu et un déplacement

466
vers l'avant de l'expression de Mesp2 (Aulehla et al., 2008). Cependant, cette expansion observée chez les
mutants « gain de fonction » de la β-caténine nécessite une activité FGF4 et FGF8.

La signalisation FGF est également impliquée dans la régulation des composants clés de la voie Notch qui
jouent un rôle dans l'horloge de segmentation. L'inhibition pharmacologique du FGF perturbe les
oscillations de Notch (Wahl et al., 2007 ; Niwa et al., 2007). Dans les embryons de souris avec une perte du
récepteur FGF dans le PSM, ou de Fgf4 et/ou Fgf8, l'expression des gènes de la voie Notch tels que Hes7 est
abaissée, bien que cette analyse puisse être compliquée en raison de la perte de tissu PSM dans ces mutants
(Naiche et al., 2011; Niwa et al., 2007).

En plus du modèle génétique et paracrine, des mécanismes biomécaniques sont à l'œuvre. La tension
appliquée le long de l'axe antéro-postérieur peut induire la formation de frontières intersomitiques dans
des emplacements non spécifiés par la signalisation (Nelemans et al., 2020), suggérant que des mécanismes
mécaniques peuvent être importants dans la génération de frontières intersomitiques. La voie de
signalisation Hippo/YAP est sans doute impliquée dans le processus (Hubaud et al., 2017).

Le développement des muscles striés squelettiques

Introduction
La musculature des membres humains matures a été bien décrite depuis la fin du XV ème et le début du XVIème
siècle. Léonard de Vinci et Vésale ont réalisé des dessins anatomiques complexes qui ont contribué,
parallèlement à de nombreuses années de dissections de cadavres, à faire la description détaillée de la
musculature du membre supérieur.

Le muscle strié squelettique est un tissu contractile qui occupe environ 40 % du poids corporel d'un humain
et qui est distribué dans tout le corps. Chez l'homme, une fonction musculaire dysfonctionnelle entraîne une
grande variété de troubles physiologiques, allant des crampes musculaires courantes aux myopathies
sévères (par exemple voir Savarese et al., 2020). Le muscle squelettique a des propriétés fonctionnelles
hétérogènes qui sont spécifiques pour un type de muscle. Les muscles des membres et du tronc
interviennent dans la posture du corps, la locomotion et la respiration ; tandis que les muscles craniofaciaux
contrôlent principalement l'expression faciale, la parole, l'activité alimentaire et le mouvement des yeux.

La plupart des muscles squelettiques du tronc et des membres sont dérivés de cellules précurseurs
myogéniques ou myoblastes qui migrent à partir des somites au cours du développement
embryonnaire tandis que la musculature de la tête, provient principalement du mésoderme
céphalique et aussi des cellules de crêtes neurales (il n’y a de toute manière pas de somites dans la
tête). Au cours de la différenciation, les myoblastes s'alignent et fusionnent en une unité
fondamentale : la fibre musculaire. Les fibres musculaires individuelles sont de très longs syncytia
pouvant atteindre plusieurs centimètres.
*Figure 7-64. Du mésoderme aux cellules
musculaires striées squelettiques :
déterminations successives puis
différenciation finale.

467
La musculature du corps (en excluant la tête) est constituée d'une composante épaxiale et hypaxiale. La
composante épaxiale est composée des muscles profonds du dos qui proviennent uniquement du myotome.
La composante hypaxiale comprend les muscles de la paroi ventrolatérale du corps, des ceintures, des
membres et de la langue. Les cellules des muscles des membres et de la langue et des muscles latéraux de
la ceinture scapulaire sont dérivées des myoblastes qui ont migré à partir du somite. En revanche, les
muscles de la paroi corporelle ventrolatérale (muscles intercostaux et abdominaux) et les muscles de la
ceinture scapulaire médiale sont formés directement à partir du myotome, sans migration. Signalons qu'une
partie des muscles de la ceinture scapulaire, le trapèze et le muscle sternocleidomastoideus, proviennent
du mésoderme des lames latérales.

*Figure 7-65. Observation histologique de la coupe longitudinale d'une portion d'un muscle strié squelettique. On
observe la double striation des myofibres (strie fine = disque Z et strie épaisse = bande A, voir explications plus loin).
Source : https://histologique.univ-lille.fr/cours/co/00_tissus_animaux_23.html

La base du mécanisme d'action des muscles squelettiques est la conversion de l'énergie chimique
en énergie cinétique grâce à l'interaction actine-myosine.

La machinerie contractile des cellules musculaires striées est basée sur un impressionnant réseau
de filaments minces (à base d'actine) et épais (à base de myosine), disposés en unités répétitives,
les sarcomères qui font 2 µm de longueur environ. Un contrôle rigoureux de la disposition de ces
systèmes de filaments est nécessaire pour une conversion efficace de la force produite par
l'interaction myosine-actine en contraction au niveau macroscopique (voir la Figure 5-16 pour voir
l’organisation d’un sarcomère). Chez les patients atteints de la myopathie de Duchenne, les
sarcomères ne sont pas bien alignés ce qui contribue à rendre dysfonctionnelle la contraction
musculaire.

Chaque sarcomère peut être divisé axialement en différentes zones en fonction de son ultrastructure : la
bande I (isotrope) où seuls des filaments fins d'actine sont présents, la bande A (anisotrope) qui contient
des filaments d'actine et les filaments épais de myosine qui se chevauchent, le disque Z qui borde le
sarcomère à ses extrémités, ancrant les extrémités barbelées (+) des filaments d'actine, et la bande H au
centre, où seuls les filaments de myosine sont présents et réticulés. Les filaments minces sont réticulés de
manière antiparallèle au niveau des disques Z par de multiples interactions moléculaires. En fait, plus de 50
protéines peuvent être associées à des disques Z matures, et elles sont considérées comme l'une des
structures macromoléculaires les plus complexes dans les organismes vivants. Les disques ne jouent pas
uniquement un rôle dans le maintien de l'architecture des myofibrilles, mais jouent également un rôle dans
la signalisation, la mécanodétection et la mécanotransduction. Les protéines du disque Z ont récemment été
identifiées comme étant la cible de multiples phosphorylations, modulant ainsi directement les interactions
et la dynamique des protéines.

La détermination, la prolifération et la migration des myoblastes

Peu de temps après leur formation, les somites se subdivisent en sclérotome mésenchymateux
ventral (qui donne les vertèbres) et en dermomyotome épithélial dorsal. Ce dernier compartiment
contient des progéniteurs des cellules musculaires striés squelettiques, les myoblastes (aux côtés du
derme et de la graisse brune) et maintient l'expression de Pax3 (Lepper et Fan, 2010) contrairement au
sclérotome (qui se met à exprimer Pax1).

468
Signalons que se forme entre le dermomyotome et le sclérotome, une petite population de cellules formant
le syndétome, exprimant le gène Scleraxis et qui donne naissance aux tendons, fonctionnellement
importants pour la fonction des muscles (Brent et al., 2003).

Peu de temps après sa formation, le dermomyotome se divise en un domaine épaxial dorsal et hypaxial
ventral. La myogenèse primaire y commence lorsque les cellules dermomyotomales activent
l'expression du facteur myogénique Myf5. L'expression d'un autre facteur myogénique, MyoD, est
activée un peu plus tardivement. Ces cellules myogéniques précoces se délaminent du dermomyotome
et contribuent à la formation des premiers muscles embryonnaires, les myotomes (Denetclaw et al., 1997).
Ces myofibres primaires servent de base à la formation des muscles matures.

La structuration appropriée des somites et du dermomyotome puis du myotome repose sur

plusieurs voies de signalisation telles que FGF, WNT et SHH qui ont été identifiées dans des études
complémentaires réalisées sur des embryons de souris, de poulet et de poisson zèbre (Groves et al., 2005;
McDermott et al., 2005 ; Hamade et al., 2006 ; Brunelli et al., 2007). Ces voies de signalisation convergent
pour faire exprimer Pax3 et ensuite pour enclencher le programme myogénique. Notamment, Wnt1
et Wnt3a, produits dans le tube neural dorsal, adjacent au site de la myogenèse épaxiale, activent
préférentiellement l'expression de Myf5 tandis que Wnt7a et Wnt6, produits dans l'ectoderme dorsal,
induisent préférentiellement l'expression de MyoD (Ikeya et Takada, 1998, Brunelli et al., 2007). Wnt1 et
Wnt3a agissent via la voie de signalisation canonique β-caténine alors que Wnt6 et Wnt7a agissent via une
voie non canonique (impliquant PKC).
*Figure 7-66. L'expression de Myf5 dans le
dermomyotome dépend de l'action de Wnt1 et de
Wnt3a. Vues latérales d'une partie du tronc
d'embryons de 9,5 jours de souris sauvage (A) ou
double knock-out Wnt1-/-;Wnt3a-/- (B) traités en
hybridation in situ avec une sonde reconnaissant
l'ARNm de Myf-5. Des simples knock-out Wnt1-/- et
Wnt3a-/- ne montrent pas une telle réduction de
l'expression de Myf-5 indiquant une redondance
fonctionnelle entre les deux signaux. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/125/24/4969/40057/Wnt-signaling-from-the-
dorsal-neural-tube-is

Les cellules de crêtes neurales qui migrent à proximité du dermomyotome (notamment sa partie épaxiale)
produisent également Wnt1 et cette contribution est nécessaire à une bonne myogenèse (Serralbo et
Marcelle, 2014).

Wnt6 produit par l'ectoderme active aussi l'expression de Paraxis dans le dermomyotome ce qui lui permet
de conserver pendant un moment une structure épithéliale, contrairement au sclérotome donnant les
vertèbres, dont les cellules subissent rapidement une transition épithélio-mésenchymateuse sous
l'influence de Shh produit par la chorde (Linker et al., 2005). Néanmoins, l'action d'une faible concentration
de Shh est nécessaire pour activer correctement l'expression de Pax3 dans le dermomyotome (Cairns et al.,
2008).

Ce qui vient d'être décrit est valable uniquement pour les précurseurs des muscles striés squelettiques
provenant des somites. Dans la tête, où il n'y a pas de somites, les cellules musculaires proviennent du
mésenchyme céphalique et les signaux inducteurs sont différents. Les Wnt sont des inhibiteurs de la
détermination musculaire et ils doivent être inhibés par Frzb (qui capture les Wnt avant qu'ils ne puissent
atteindre leur récepteur) pour que les muscles se développent (Tzahor et al., 2003).

Les embryons mutants perte-de-fonction Pax3 présentent un phénotype musculaire sévère dans le
tronc et les membres (Relaix et al., 2003).

469
 *Figure 7-67. La réduction de l'expression de Pax3 entraîne de graves anomalies musculaires des membres.

On étudie les nouveau-nés âgés de 2 jours de souris témoins et de souris Pax3neo/Paxneo qui sont homozygotes pour
un allèle qui réduit la quantité de Pax3 fonctionnel produit. (A) Les souriceaux Pax3neo/Pax3neo se distinguent
facilement de leurs congénères de type sauvage (+/+) par des membres sous-dimensionnés et gravement malformés
et le manque de lait ingéré (astérisque). (B–E) Analyse par hybridation in situ de l'expression de MyoD dans les
membres antérieurs de type sauvage E15.5 (B,D) et Pax3neo/Pax3neo (C,E) au niveau du cubitus (u)/radius (r)
(indiqué via * en B,C) et des os des phalanges (indiqué par * en D,E). Notez que la plupart des masses musculaires
MyoD-positives sont absentes dans les membres antérieurs réduits. Les astérisques indiquent les os servant de
référence pour montrer des niveaux de section comparables. (F, G) Immunomarquage reconnaissant une actine
musculaire à divers niveaux sur une section médiale-latérale le long des membres antérieurs et postérieurs de type
sauvage (F) et Pax3neo/Pax3neo (G) à E13.5 jours de développement. Les embryons mutés sont déjà anormaux à ce
stade de développement précoce et les masses musculaires αSMA-positives sont soit très réduites (membres
postérieurs) soit complètement absentes (membres antérieurs) dans les embryons hypomorphes. Abréviations : f,
péroné ; t, tibia. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2292838/#!po=23.6842

En revanche, les embryons mutants Pax7 ne présentent pas de défauts myogéniques au cours du
développement (Relaix et al., 2004). Ceci est cohérent avec l'expression retardée de Pax7 dans les cellules
exprimant Pax3 dans l'embryon de souris, et des activités redondantes à ce stade entre ces deux facteurs de
transcription qui sont évolutivement proches (Soleimani et al., 2012). L'exigence de Pax3 pour le bon
développement du dermomyotome est associée à son rôle pour assurer la survie cellulaire. En effet, en
l'absence de Pax3, les cellules du dermomyotome subissent une apoptose (Mansouri et al., 2001 ; Zhou et
al., 2008).

470
 **Figure 7-68. Développement de dermomyotome et détermination des muscles squelettiques. A : Un schéma
illustrant les différents degrés de maturation des somites, avec le dermomyotome. B : Cascades de signalisation
opérant au niveau des domaines dermomyotomaux épaxial et hypaxial, qui activent l'expression des MRF (facteurs
de régulations myogéniques) : MyoD, Myf5 et Mrf4. Source :
https://cellregeneration.springeropen.com/articles/10.1186/s13619-021-00093-5

Des lignées de souris génétiquement modifiées contenant différents allèles de Pax3 ont permis de
comprendre le rôle de Pax3 dans la myogenèse et de découvrir certains de ses gènes cibles directs.
L'allèle gain de fonction Pax3 Pax3-FKHR qui code une protéine de fusion, comprenant le domaine de liaison
à l'ADN de Pax3 et le domaine d'activation transcriptionnelle de FOXO1, sauve le phénotype mutant Pax3
montrant que Pax3 fonctionne comme un activateur transcriptionnel (Relaix et al., 2003). La
modulation de l'expression des gènes opérant en aval de Pax3 selon son activité transcriptionnelle en
présence de chacun de ces allèles, a permis l'identification de gènes cibles directs de Pax3 comme Myf5,
Fgfr4, Itm2a, Dmrt2 et c-Met (Bajard et al., 2006 ; Lagha et al., 2013 ; Sato et al., 2010).
*Figure 7-69. Pax3 se fixe directement sur un fragment
de 145 pb du promoteur de Myf5. Autoradiographie
d'une expérience EMSA montrant la liaison d'une
protéine Pax3 à une sonde d'ADN longue de 145 pb
radiomarquée incluant le site putatif de fixation de Pax3
(1), avec des doses croissantes de sonde non marquée
(2-4) qui entrent en compétition avec la sonde
radiomarquée, ou de sonde avec le site putatif de fixation
de Pax3 muté (ΔPax3) (5–7) ou avec un anticorps contre
Pax3 (8) ou contre Pax7 (9). Les bandes indiquées entre
parenthèses représentent probablement des
interactions entre la sonde et les produits de traduction
Pax3 incomplets qui contiendraient la séquence 5' avec
le domaine de liaison à l'ADN mais pas la séquence 3' qui
est reconnue par l'anticorps. Source :
http://m.genesdev.cshlp.org/content/20/17/2450.long?view=long&pmid=16951257

Il y a aussi des régulations génétiques secondaires qui renforcent et stabilisent les niveaux d'expression.
Par exemple, Dmrt2 est nécessaire à la bonne activation de Myf5, bien que Dmrt2 et Myf5 soient des cibles
directes de Pax3 (Sato et al., 2010).

471
 **Figure 7-70. Contrôle direct et indirect de l'expression
de Myf5 par Pax3.

En plus de son rôle de facteur de transcription, Pax3 est impliqué dans le remodelage de l'accessibilité de la
chromatine au niveau des loci myogéniques (Magli et al., 2019). Cela se produit en coopération avec Six4 et
le membre de la famille de domaines TEA 2 (TEAD2).

Il existe des réseaux génétiques distincts dans les progéniteurs pré-myogéniques entre ceux de la tête et
ceux des muscles du tronc/des membres au cours du développement embryonnaire. Le facteur de
transcription Pax3 régule la myogenèse des membres, tandis que le facteur de transcription T-box Tbx1, le
facteur de transcription à homéodomaine Pitx2 et Tcf21 jouent un rôle important dans la spécification des
cellules progénitrices des muscles de la tête.

Le développement du lignage musculaire est ensuite contrôlé par les MRF ou les facteurs de
régulations myogéniques incluant Myf5, MyoD, myogénine (MYOG) et MRF4 (également connu sous
le nom de Myf6). Ils font partie de la famille des facteurs de transcription hélice-boucle-hélice, qui
se lient aux séquences spécifiques appelées boîtes E (E-box) trouvés dans de nombreux promoteurs
de gènes impliqués dans la myogenèse. Les MRF sont connus pour leur capacité à convertir les
cellules non myogéniques en cellules musculaires en activant l'expression des gènes spécifiques du
muscle. Par exemple, l'expression ectopique de MyoD ou de Myf5 dans la moitié gauche du tube
neural d'un embryon de poulet (introduction de l'ADN exogène par électroporation in ovo) aboutit
à la formation de cellules musculaires à l'intérieur du tube neural !
*Figure 7-71. Expression de MyoD dans un embryon de
souris à E12 (vue latérale). L'embryon a été traité en
hybridation in situ avec une sonde reconnaissant l'ARNm
MyoD. Notez l'expression dans les myotomes, dans les
myoblastes en migration dans les bourgeons de membre
mais aussi dans les futurs muscles céphaliques non dérivés
des somites. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580709004444

Voir Figure 4-14, la structure d’un dimère de MyoD accrochée sur une séquence cible de l’ADN.

MyoD ne se trouve pas tout seul ses cibles d'ADN. Dans les myoblastes, MyoD est associé avec Mef2 et KAP1.
KAP1 sert d'échafaudage et recrute les coactivateurs p300 et LSD1, en plus de plusieurs corépresseurs dont
G9a et l'histone déacétylase HDAC1. La conséquence de ce recrutement mélangeant
coactivateur/corépresseur est de réduire au silence les régions promotrices sur les gènes musculaires. Ce
n'est que lorsque la kinase MSK1 phosphoryle KAP1 que les corépresseurs précédemment liés à
l'échafaudage sont libérés, permettant à MyoD et Mef2 d'activer la transcription (Singh et al., 2015).
L'expression de MyoD n'est donc pas suffisante pour faire se développer une cellule musculaire. Il faut aussi
que le contexte cellulaire aboutisse à le laisser agir.

472
Myf5 et MyoD et dans une moindre mesure Mrf4 sont des facteurs importants pour la détermination
myogénique, tandis que la myogénine est induite plus tard dans la différenciation et est nécessaire
au développement du muscle mature. Les animaux MyoD-/- ont un muscle squelettique normal et la
perte de MyoD est compensée par une expression prolongée de Myf5 (Megeney et al., 1996). Les
animaux Myf5-/- meurent peu après la naissance d'une insuffisance respiratoire due à une cage
thoracique mal formée, mais de manière similaire aux animaux MyoD-/-, ils ont un muscle
squelettique relativement normal avec une expression inchangée de MyoD, myogénine et Mrf4. Les
souris myogénine-/- meurent périnatalement d'une insuffisance respiratoire due à une réduction
sévère de tous les muscles squelettiques, caractérisée par une abondance de myoblastes mais des
myofibres rares, avec une incapacité à induire la chaîne lourde de la myosine musculaire (MyHC),
suggérant que ces myoblastes sont engagés dans la lignée myogénique mais ne parviennent pas à se
différencier et à former des myofibres.

Une fois déterminés, les myoblastes doivent proliférer et pour certains d'entre eux migrer sur une
longue distance. Chez l'embryon humain, les myoblastes migrent dans le bourgeon du membre supérieur
à la septième semaine de gestation. L'étude des myoblastes apporte un éclairage intéressant sur les
choix entre différents processus cellulaires : proliférer ou migrer ? Proliférer ou se différencier ?
Migrer ou se différencier ?

La différenciation des cellules musculaires striées squelettiques a été beaucoup étudiée in vitro dans les
myoblastes de souris C2C12. En présence de FGF dans leur milieu de culture, ces cellules prolifèrent et
restent indifférenciées. Si on enlève le FGF, la prolifération s’arrête et les cellules fusionnent pour former
des myotubes.

*Figure 7-72. Séquence d'évènements menant à la différenciation des lignées de myoblastes C2C12 lorsqu'on enlève
les facteurs de croissance (notamment les FGF) du milieu de culture. Cette séquence suit les mêmes évènements
cellulaires et moléculaires qu'in vivo. MHC = chaîne lourde de la myosine. Source :
https://rupress.org/jcb/article/159/3/419/32812/Mutant-DMPK-3-UTR-transcripts-disrupt-C2C12

Le FGF maintient l’expression du répresseur transcriptionnel Msx1 qui inhibe la myogenèse. La voie de
signalisation FGF aboutit également à la phosphorylation de MyoD ce qui inhibe sa capacité à activer la
transcription des gènes impliqués dans la différenciation. L'expression du récepteur aux FGF, FGFR4 est
activée in vivo directement par Pax3 qui est au sommet de la cascade génétique lors de la détermination des
myoblastes dans le somite et aussi directement par MyoD (Lagha et al., 2008).

473
 **Figure 7-73. Contrôle de l'expression de FGFR4 dans
les myoblastes. Le gène rapporteur LacZ est mis sous le
contrôle des 559 pb proximaux du promoteur de Fgfr4
sauvage (A,B, E, F) ou mutés sur des sites consensus de
fixation de MyoD (et de Myf5) appelés E-box (EboxMUT)
(C,D). Des embryons aux stades E11,75 et E12,5 sont
fixés puis colorés grâce au X-gal. On constate que
l'absence de sites de fixation sur le promoteur de Fgfr4
pour MyoD et Myf5 aboutit à une forte réduction de
l'expression du gène rapporteur dans le dermomyotome
(il reste une expression dans les bourgeons de membre
notamment). Des expériences d'immunofluorescence
avec des anticorps anti-MyoD (rouge) et anti-βGal (vert)
montrent une coexpression (partielle) de MyoD et de la
βGal dans les myoblastes du tronc ou du membre
antérieur. Source : http://genesdev.cshlp.org/content/22/13/1828.long

Un autre interrupteur est celui évoqué plus haut lors de la présentation de MyoD : dans les myoblastes
prolifératifs, MyoD est associé avec Mef2 et KAP1. KAP1 sert d'échafaudage et recrute les coactivateurs
p300 et LSD1, en plus de plusieurs corépresseurs dont G9a et l'histone déacétylase HDAC1. La conséquence
de ce recrutement mélangeant coactivateur/corépresseur est de réduire au silence les régions promotrices
sur les gènes musculaires. Au moment de la fin de la phase de la prolifération et le début de la différenciation,
la kinase MSK1 phosphoryle KAP1 et les corépresseurs précédemment liés à l'échafaudage sont libérés,
permettant à MyoD et Mef2 d'activer la transcription de leurs gènes cibles différenciateurs (Singh et al.,
2015).

Ces régulations sont essentielles car au cours du développement, il faut laisser le temps aux myoblastes
de proliférer suffisamment pour fournir assez de "matière première cellulaire" avant d'engager
l'étape suivante qui est la fusion des myoblastes. De même, une différenciation trop précoce ne
laisse pas le temps aux myoblastes de migrer correctement dans le bourgeon de membre.

De nombreuses voies de signalisation régulent le timing de la différenciation myogénique. Deux membres

de la superfamille des facteurs de croissance transformants β (TGFβ), le TGFβ et la myostatine (aussi connue
sous le nom de GDF8) sont des inhibiteurs puissants de la prolifération (Liu et al., 2020). TGFβ et myostatine
activent les facteurs de transcription SMAD2 et SMAD3 par phosphorylation dépendante du récepteur de
leurs extrémités C-terminale, favorisant leur interaction avec SMAD4. S'ensuit une translocation nucléaire
et l'interaction avec les éléments de réponse dans les promoteurs et les enhancers des gènes cibles. La
myostatine fait aussi baisser la phosphorylation de la sérine 473 sur Akt. Cette phosphorylation est
habituellement stimulatrice de la prolifération donc l'effet de la myostatine aboutit bien à inhiber la
prolifération (Liu et al., 2020).

Une famille a été découverte dans laquelle des individus sur quatre générations avaient une mutation du
site d'épissage dans le gène codant la myostatine. Beaucoup des membres de la famille étaient des athlètes
professionnels et un enfant de 4 ans était capable de tenir deux haltères avec ses bras complètement
étendus. La mutation dans le site d'épissage laisse un intron qui contient un codon STOP aboutissant à une
myostatine tronquée, non fonctionnelle. Ainsi, la prolifération des myoblastes a été plus importante et plus
longue que d'habitude au cours du développement, générant des muscles plus gros (Schuelke et al., 2004).
Dans le cas de la race ovine Texel, c'est une mutation dans le 3'UTR de l'ARNm de la myostatine qui le fait
reconnaitre par des microARN exprimés dans les myoblastes (miR1 et miR206), ce qui aboutit à l'inhibition
de sa traduction et à une masse musculaire plus importante que d'habitude.
474
 *Figure 7-74. Brebis de la race Texel qui sont
particulièrement musclées à cause d'une déficience en
myostatine. Au cours de leur développement
embryonnaire, les myoblastes prolifèrent plus
longtemps générant plus de cellules capables de former
des fibres musculaires. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Texel_(race_ovine)#/media/Fichier:Texelschafe.jpg

La voie de signalisation activée par c-Met, un récepteur tyrosine kinase, est essentielle pour la prolifération
et la migration des myoblastes, notamment dans le bourgeon de membre. Son ligand HGF est exprimé dans
le mésenchyme des membres. Plusieurs voies de signalisation peuvent être activés en aval de c-Met : la voie
MAPK (ERK, JNK et p38 MAPK), l'axe PI3K-AKT, la voie STAT et la voie IB-NFB. Le rôle de c-Met dans le
développement musculaire est ainsi multiforme. Une mutation nulle de c-Met aboutit à ce que les
précurseurs musculaires restent dans le dermomyotome mais cela n'affecte pas leur prolifération, tandis
qu'une mutation qui perturbe la liaison de c-Met à l'un de ses effecteurs, GRB2, inhibe la prolifération des
myoblastes seulement après leur migration dans le membre en développement. Ainsi, c-Met a des effets
différents sur le développement musculaire en fonction du contexte cellulaire et de la voie effectrice en aval
de son activation.

*Figure 7-75. c-MET joue un rôle dans la morphologie cellulaire, la distance parcourue et la vitesse pendant la
migration des myoblastes.

A) Séquence de microscopie à images de contraste montrant des myoblastes vivants exprimant (control) ou
n'exprimant pas (mutant) c-Met, dans des milieux de migration. Des images des mêmes cellules ont été capturées
toutes les 4 minutes pendant 68 minutes (flèches, lamellipodes dans la cellule témoin ; pointes de flèches, saillies
membranaires dans la cellule mutante ; barre d'échelle = 20 µm. B) Traces montrant les chemins migratoires de 15
myoblastes sauvages (avec c-Met) ou mutants (sans c-Met). Positions des cellules enregistrées toutes les 4 minutes
pendant 6 h (Axes = ± 300 µm). C) Vitesses moyennes des myoblastes dans les milieux de migration sans ou avec

475
 supplément de HGF, le ligand de c-Met, à 4 ng/ml. Les images ont été prises toutes les 4 minutes, les mesures de
vitesse ont été enregistrées sur 6h.

Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0081757

En tout cas, en aval de c-Met, la protéine de signalisation intracellulaire BRAF est indispensable au bon
développement des myoblastes car si on délète son gène spécifiquement dans les cellules ayant activé Pax3
(ce qui inclue les myoblastes), les bourgeons de membres se retrouvent sans myoblastes.
**Figure 7-76. B-Raf est nécessaire à la migration des
myoblastes dans le bourgeon de membre. Hybridation in
situ montrant l'expression de Pax3 dans des embryons
de souris sauvages (WT) ou mutants où le gène codant
BRAF a été délété dans les myoblastes. NT = tube neural;
dm = dermomyotome; fl = bourgeon de membre
antérieur. Source :
https://doi.org/10.7554/eLife.18351.001

Autre facteur contrôlant la migration des myoblastes : le ligand SDF1 et son récepteur CXCR4 (Vasyutina et
al., 2005).
*Figure 7-77. Des cellules COS exprimant SDF1 attirent
les myoblastes dans les bourgeons de membre
d'embryons de poulet. Les bourgeons d'aile d'embryons
de poulet ont été greffés au stade HH 19-20 avec des
cellules COS transfectées avec un vecteur permettant
d'exprimer le ligand SDF1 (B, E, H). Au stade HH25, les
embryons sont fixés et des hybridations in situ sont
réalisées avec des sondes reconnaissant les ARNm
codant le récepteur de SDF1, CXCR4 (A,B), Pax3 (D,E) et
MyoD (G,H). On montre le côté contralatéral non greffé
des embryons comme contrôle (A, D, G). L'emplacement
des cellules greffées est indiqué par une flèche noire.
Notez que la nouvelle source de SDF1 non seulement
détourne les myoblastes de leur destination habituelle
mais aussi inhibe l'expression de MyoD. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1221889/

Lors de la fin de la phase de migration et de prolifération, MyoD devient actif comme nous l'avons
vu. Parmi ces cibles, notons p21 qui éteint l'activité des kinases dépendantes des cyclines et sort
définitivement les cellules musculaires du cycle cellulaire (Guo et al., 1995). La transition vers la phase
de différenciation est aussi marquée par l'augmentation de l'activité de p38, une sérine/thréonine kinase
de la famille MAPK. Elle phosphoryle de multiples cibles qui aboutissent à remodeler la chromatine (via le
complexe SWI/SNF), à potentialiser l'action de MyoD en phosphorylant son co-facteur Mef2, à éteindre
l'expression des gènes précoces du lignage musculaire tel Pax7 en phosphorylant Ezh2 et à faire sortir la
cellule du cycle cellulaire via son action inhibitrice sur JNK et cycline D1 (Padilla-Benavides et al., 2020).

476
 ***Figure 7-78. p38 a des effets pléiotropes pour initier la différenciation des muscles squelettiques. La
phosphorylation des facteurs de transcription protéine E et Mef2 et de la sous-unité SWI/SNF BAF60c par p38
permet l'expression de gènes myogéniques et la différenciation. La phosphorylation d'Ezh2 (qui appartient à la
famille des répresseurs Polycomb) éteint l'expression de Pax7. p38 induit également le retrait du cycle cellulaire en
activant la kinase c-Jun N-terminale (JNK) et la cycline D1. Source : https://www.mdpi.com/2079-
7737/9/7/152/htm#B87-biology-09-00152

L'étape suivante : la fusion des myoblastes peut commencer.

La fusion des myoblastes

La fusion de myoblastes isolés en fibres multinucléées est une étape cruciale dans la formation, la
croissance et aussi la réparation des muscles squelettiques. C'est un processus hautement
dynamique, dans lequel les cellules subissent une reconnaissance, une adhésion, une formation de
pores, un échange de matériel cytoplasmique et enfin une fusion membranaire.

L'adhérence initiale des myoblastes avant la fusion dépend de la M-cadhérine (Zeschnigk et al., 1995).

477
 *Figure 7-79. Inhibition de la formation de myotubes de myoblastes L6 par des peptides synthétiques de M-
cadhérine bloquant les interactions homophiliques M-cad/M-cad. (A) Myoblastes L6 confluents conservés dans un
milieu de croissance au lieu d'un milieu de différenciation. (B) Formation de myotubes de cellules L6 cultivés dans
un milieu de différenciation en l'absence de peptide ou (C) en présence de peptide contrôle D559/M qui ne perturbe
pas les interactions dépendantes de M-cad. (D) Myoblastes L6 induits à la formation de myotubes en présence du
peptide synthétique de M-cad qui bloque les interactions homophiliques M-cad/M-cad. Les cultures ont été colorées
au Giemsa 4 jours après l'induction de la différenciation. Source : https://www.researchgate.net/publication/14663937_Involvement_of_M-
cadherin_in_terminal_differentiation_of_skeletal_muscle_cells/figures?lo=1

La fusion de myoblastes de mammifères nécessite la fusion de deux bicouches lipidiques apposées et

implique plusieurs classes de protéines fortement exprimées, incluant le cytosquelette, des récepteurs de
phagocytose et des protéines de réparation membranaire détectant le calcium. Myomaker (Millay et al.,
2013) et Myomerger sont des protéines membranaires essentielles à la fusion des myoblastes. Myomaker
est requis par les deux cellules de fusion, tandis que le besoin de Myomerger n'est qu'unilatéral (Quinn et
al., 2017).
**Figure 7-80. Myomerger est essentiel pour la fusion
des myoblastes au cours du développement
embryonnaire. Immunofluorescence anti-myosine sur
les muscles du tronc d'embryons de souris E15.5. Des
myofibres multinucléées (les flèches de la même couleur
montrent des noyaux dans une même myofibre) sont
dans les coupes sauvages (WT). Les myofibres des souris
sans Myomerger (knock-out) sont myosine+ avec des
sarcomères mais restent mononucléés. Source :
https://www.nature.com/articles/ncomms15665

Signalons que Myomaker a la propriété remarquable de favoriser la fusion des cellules hétérologues aux
cellules musculaires in vitro, c'est-à-dire qu'il suffit de faire exprimer Myomaker a des cellules
n'appartenant pas au lignage musculaire pour les faire fusionner avec des myoblastes matures.

Des mutations dans les gènes codant Myomaker et Myomixer sont la cause du syndrome de Carey-Fineman-
Ziter caractérisé par des faiblesses musculaires ou des paralysies (entre autres).

De fines projections remplies d'actine ont été observées lors de la fusion des myoblastes chez le poisson
zèbre ou chez la drosophile. Ces structures semblent être des filopodes, qui sont de fines projections de
faisceaux d'actine entourées d'une membrane qui sont importants pour les comportements cellulaires tels
que la recherche de chemins pendant la migration, l'interaction avec la matrice extracellulaire et la
communication de cellule à cellule. La participation à la fusion des myoblastes serait donc un nouveau rôle
pour les filopodes. La présence de Myomaker et Myomerger a été observée dans ces filopodes musculaires.

L'intégrine beta1 participe à la fusion des myoblastes et à l'assemblage du cytosquelette des myofibres au
cours de la myogenèse embryonnaire. L'analyse de la myogenèse du poulet et de la souris a montré que
l'intégrine α3 joue aussi un rôle important dans la mise en place des myofibrilles.

478
*Figure 7-81. La baisse de l'expression de l'intégrine α3 réduit la fusion des myoblastes.
A) Coloration de Pappenheim des myoblastes en fusion. B) nombre total de noyaux calculé au jour 12 de la culture des
myoblastes. C) indice de fusion analysé au jour 12 de la culture dans les myoblastes témoins et expérimentaux indiqués
en pourcentage de noyaux de myotubes sur le nombre de tous les noyaux. D) proportion de myotubes à 2 à 4, 5 à 7, 8 à
10 et > 11 noyaux par au nombre de tous les myotubes. NT – myoblastes de contrôle non transfectés, TR – myoblastes
de contrôle cultivés dans un milieu additionné de réactif de transfection, siRNA-cont – myoblastes de contrôle
transfectés avec siRNA contrôle (séquence aléatoire), siRNA- α3 – myoblastes transfectés avec siRNA qui baisse
l'expression de l'intégrine α3. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0061760

Étant donné que le dimère d'intégrine α3β1 est capable de former des complexes avec les tétraspanines
CD9 et CD81, la fonction de ces protéines a également été suivie. Il a été montré que CD9 et CD81 participent
à la fusion des myoblastes C2C12, de même qu'un autre ligand d'intégrine, ADAM12. Signalons que l'autre
nom de CD9 est Juno et nous l'avons rencontré impliqué dans la fusion entre l'ovocyte et le spermatozoïde
lors de la fécondation. Il s'agit de la même fonction mais dans un autre contexte.

La fusion dépend aussi du facteur de transcription NFAT2C car la déplétion de ce facteur donne naissance
à des souris avec des muscles plus petits avec moins de noyaux par cellule. C'est également le cas en absence
de myogénine (MyoG), l'un des MRF (Ganassi et al., 2020).

479
 *Figure 7-82. La myogénine est nécessaire pour obtenir des cellules musculaires de la bonne taille et avec un nombre
de noyaux normal

(A) Schéma du traitement des muscles du tronc pour l'analyse, le rose représente le muscle du poisson-zèbre où
l'étude a été menée. Les couleurs identifient les échantillons des souches (myogkg125/+, bleu) ou myog-
/- (myogkg125, rouge) dans toute la figure. (B) L'analyse RT-qPCR montre une diminution de la quantité des ARNm
myog, mymk, mymx et mrf4 chez l'adulte myog-/-. Les formes des symboles désignent des échantillons appariés sib
et myog-/-. (C) Schéma de l'isolement des myofibres pour l'analyse morphométrique (en haut) et des images
représentatives (en bas) montrant des myofibres myog-/- plus petites (parenthèses rouges) par rapport à la fratrie
du même âge. Barre d'échelle = 100 µm. (D) Mesure de la longueur absolue des myofibres (E) Images représentatives
et mesure de la longueur du sarcomère non modifiée sur des myofibres fraîchement isolées. Barre d'échelle = 10 µm.
(F) Des images représentatives de myofibres adultes isolées montrent une réduction de la taille de myog-/-
(parenthèses rouges). Barre d'échelle = 100 µm. (G–J) Quantification du nombre de noyaux/100 µm (G), du nombre
absolu de noyaux par myofibre (H), du diamètre de la myofibre (I) et de la taille du domaine nucléaire (volume de
myofibre par noyau) (J) montrant des changements significatifs dans myofibres des stades juvénile (Juv, 1 mois) et
adulte (Ad, 8 mois) au sein des génotypes (p coloré) ou parmi (p noir). (K) La relation entre le nombre de noyaux et
la loge (surface) indique un mode de croissance différent entre le groupe contrôle et le groupe myog-/- (c. p) (L)
L'augmentation de la surface (SA) du stade juvénile au stade adulte (=Ad_SA - Juv_SA) indique un taux de croissance
réduit dans les myog-/-. Source : https://elifesciences.org/articles/60445

Différenciation finale
Le sarcomère est l'unité fondamentale des fibres musculaires, et médie la contraction dépendante
de l'ATP et le relâchement. Alors que les composants des sarcomères sont bien compris, la mécanique et
la séquence de leur mise en place reste en débat. Un processus clé dans la myofibrillogenèse est la
polymérisation de l'α-actinine dans les disques Z qui flanquent la bande A contenant de la myosine.

Au cours de la maturation des fibres musculaires, l'expression de la chaîne lourde de la myosine

embryonnaire passe le relais à l'expression des isoformes de la chaîne lourde de la myosine adulte. Elles

480
participent à des fibres musculaires avec un profil spécifique : soit un profil oxydatif, à contraction lente ou
soit un profil glycolytique, à contraction rapide (Khodabukus, 2021).

Les stades finaux de la myogenèse sont contrôlés par TGFβ, le facteur de croissance des hépatocytes (HGF),
WNT (van der Velden et al., 2006) et la signalisation du facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF)
(Chargé et Rudnicki, 2004).
***Figure 7-83. IGF-I et le chlorure de lithium (LiCl, qui
inhibe GSK3β et active la voie canonique Wnt/β-
caténine) augmentent l'activité de la créatine kinase
musculaire (MCK). Cette enzyme catalyse la conversion
de la créatine et utilise l'adénosine triphosphate (ATP)
pour créer la phosphocréatine et l'adénosine
diphosphate (ADP). Elle est très exprimée dans les
cellules musculaires différenciées. Des myoblastes ont
été cultivés in vitro en présence ou en l'absence d'IGF-I
ou de LiCl. Après 72 h, des lysats ont été préparés pour la
détermination de l'activité MCK et de la quantité de
protéine totale, exprimée en activité enzymatique
spécifique (U/mg protéine) (A) ou séparément en
pourcentage du contrôle pour l'activité MCK non
corrigée (U/ml) ou protéine totale (mg/ml) (B). En effet,
il faut normaliser l'activité de MCK avec la quantité de
protéine totale car l'augmentation de cette activité
pourrait être juste le reflet de l'augmentation générale
de la quantité de protéine. Ici, on observe que
l'augmentation de la MCK avec les doses croissantes est
plus importante que celle de la quantité totale de
protéines donc c'est bien spécifique. Source :
https://journals.physiology.org/doi/full/10.1152/ajpcell.00068.2005

Les facteurs de transcription impliqués sont notamment Myf5, MyoD, Myomaker et MyoG pour faciliter la
fusion des cellules progénitrices musculaires, l'hypertrophie des myofibres et l'innervation par les
motoneurones ce qui génère une cellule musculaire complètement fonctionnelle (Zhang et al., 2020).

Les chaperons moléculaires, qui contrôlent la conformation des protéines lors de leur maturation ont
récemment été impliqués dans la myofibrillogenèse. Le chaperon spécifique au muscle unc45b chez
Caenorhabditis elegans coopère avec hsp90 pour plier le domaine moteur globulaire N-terminal (S1) des
myosines sarcomériques. La déplétion de son orthologue chez le poisson zèbre entraîne l'absence
d'intégration de la myosine dans le sarcomère. Des études in vitro dans des myoblastes de mammifères
cultivés ont confirmé ce rôle. Chez Xenopus tropicalis, la mutation dicky ticker cause un phénotype alliant
défaut dans la structure musculaire de la queue mais aussi une absence de battement cardiaque. Il s'avère
que ce mutant présente une mutation faux sens dans le gène codant la protéine chaperon unc45b.

La myoglobine musculaire est une protéine essentielle des cellules musculaires striées (squelettiques mais
aussi cardiaques) qui permet de stocker localement de l'O2 qui peut ainsi être mobilisé rapidement.

481
 *Figure 7-84. Activation de l'expression de la
myoglobine lors de la différenciation
musculaire. (A,B) Des myoblastes C2C12 sont
cultivés en milieu de différenciation pendant
quelques jours (D = jour). On observe sur un
western-blot l'augmentation de l'expression de
la myoglobine (Mb) et de la chaîne lourde de la
myosine musculaire (MHC). Une
immunofluorescence est réalisée à jour 4 avec
un anticorps reconnaissant la myoglobine (les
noyaux sont marqués par l'iodure de
propidium). (C) Le promoteur du gène codant la
myoglobine est présenté avec les facteurs de
transcription intervenant dans son activation
ainsi que leurs séquences cibles. MEF2, myocyte
enhancer factor-2; NFAT, nuclear factor of
activated T-cell; NRE, NFAT response element.
Source : https://journals.biologists.com/jeb/article/213/16/2741/9848/Regulation-of-myoglobin-expression

La différenciation d'une cellule musculaire striée squelettique n'est complète que si elle forme une
synapse fonctionnelle avec un motoneurone.

**Figure 7-85. Présentation schématique d'une jonction neuromusculaire (JNM) et des molécules impliquées dans
son développement. (A) Il y a une spécialisation locale dans la terminaison nerveuse motrice présynaptique où les
vésicules fusionnent avec la membrane terminale et libèrent le neurotransmetteur acétylcholine (ACh) dans la fente
synaptique. L'organisation postsynaptique dans la membrane du muscle squelettique comprend plusieurs replis
avec des récepteurs ACh (AChR en rouge) au niveau de la crête et des canaux sodiques voltage-dépendants (Nav1.4
en marron) dans les creux des replis. La localisation et la concentration élevée d'AChR et de Nav 1.4 sont importantes
pour une transmission neuromusculaire efficace. L'ensemble du complexe de protéines associé aux AChR sont
représentés sous forme de pentagone bleu et détaillés en B. (B) Le complexe agrine-Lrp4-MuSK est essentiel pour la
formation de la JNM. L'agrine neurale se lie à Lrp4 induisant l'activation par phosphorylation du récepteur tyrosine
kinase spécifique du muscle (MuSK, flèche rouge). Le complexe AChE-ColQ est localisé dans la lame basale synaptique
et est essentiel pour l'inactivation de l'ACh. ColQ lie également MuSK et le perlecan en participant à la stabilisation
de la matrice extracellulaire (ECM). Une fois activé, MuSK se lie à la rapsyne (flèche bleue) qui à son tour relie les
AChR et le dystroglycane. L'ensemble de la structure est finalement attaché au cytosquelette d'actine (pour simplifier
la figure, la flèche orange représente le réseau de protéines et de voies responsables de cette interaction) formant le
radeau lipidique au sommet des replis membranaires musculaires. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2016.00160/full

482
 **Figure 7-86. Le récepteur nicotinique à l'acétylcholine. Présent dans la partie musculaire (post-synaptique) de la
jonction neuromusculaire, c'est un complexe protéique essentiel à la fonction des cellules musculaires striées
squelettiques différenciées. Source : IJsbrand Kramer - Université Bordeaux 1
https://ressources.unisciel.fr/biocell/chap2/co/module_Chap2_9.html

L'innervation des fibres musculaires induit la formation d'amas denses de récepteurs à l'acétylcholine AChR
formant des jonctions neuromusculaires (JNM) stables dans la région médiane des fibres musculaires. On
estime que la membrane plasmique musculaire des JNM contient entre 10.000 et 20.000 récepteurs AChR
par µm2 tandis que le reste de la membrane plasmique en contient 10/µm 2.

L'agrine est une protéine secrétée par le cône de croissance axonal. Son récepteur est Lrp4 à la surface des
cellules musculaires et cette interaction permet d'activer MuSK, un récepteur tyrosine kinase. Les souris
avec une déplétion du gène codant l’agrine (agrin–/–) sont incapables de former des JNM ; cependant, ces
souris peuvent former des amas d'AChR non situés en face d'un axone (appelés amas aneuraux) avant
l'innervation (Lin et al., 2001). À l'inverse, les amas aneuraux ne se forment pas chez les souris Lrp4-/- ou
MuSK–/–, et leurs fibres musculaires présentent une distribution uniforme des AChR avec une région
d'innervation plus large contenant des terminaisons des motoneurones hautement ramifiées (Choi et al.,
2013). L'agrine neuronale n'induit pas de clusters AChR dans les cellules musculaires MuSK–/–. Cependant,
la sensibilité à l'agrine peut être restaurée par l'expression de MuSK de type sauvage (Zhou et al., 1999).
Fait intéressant, la formation de synapses peut être sauvée chez les souris agrin–/– avec une surexpression
ectopique de MuSK (Kim et Burden, 2008). Ensemble, cela suggère l'importance de MuSK pour la
préparation des clusters de AChR avant l'innervation, tandis que l'agrine est nécessaire pour le clustering
AChR neuronal et la formation de JNM.

La formation de la jonction neuromusculaire est également influencée par d’autres composants

extracellulaires. Par exemple, MuSK possède un domaine riche en cystéine (CRD) qui partage une homologie
avec le récepteur WNT, Frizzled. En conséquence, les protéines WNT se lient et activent MuSK avant
l'innervation, lorsque l'agrine neurale est absente. Cette signalisation peut réguler le guidage axonal et
induire la formation d'amas AchR aneuraux.
**Figure 7-87. Wnt4 et Wnt11 augmentent de manière
coopérative le nombre de clusters de récepteurs à
l'acétylcholine sur des cellules musculaires en
différenciation. Exemples de myotubes témoins ou
traités avec Wnt4 et/ou Wnt11 (10 ng/ml) colorés grâce
à la alpha-bungarotoxine (BTX), un peptide qui reconnait
spécifiquement les récepteurs nicotiniques à
l'acétylcholine. Source : https://hal.sorbonne-
universite.fr/hal-01542853/document

De plus, les voies WNT canoniques et non canoniques sont affectées chez des souris transgéniques avec des
délétions du domaine CRD de MuSK qui ne peuvent plus se lier à Wnt (Messeant et al., 2017).
483
De nombreux composants de la matrice extracellulaire (MEC) ont des rôles régulateurs importants dans la
myogenèse et la synaptogenèse. Au sein de la lame basale synaptique, les molécules de la MEC aident à
guider le processus d'innervation et sont essentielles à la formation de la densité post-synaptique ainsi qu'à
l'organisation et au maintien des appositions fonctionnelles des éléments pré- et post-synaptiques. Le
complexe glycoprotéique associé à la dystrophine (DGC), à travers sa sous-unité α-dystroglycane, organise
un échafaudage fonctionnel dans la lame basale comprenant du perlecan, de l'acétylcholinestérase/ColQ et
de la laminine qui stabilise les clusters AChR (Jacobson et al., 2001). La DGC relie en outre des réseaux de
laminines et de collagènes entre eux et les ancre à la membrane plasmique musculaire par le sous-complexe
sarcoglycane-sarcospan et au cytosquelette intracellulaire par la dystrophine (Jacobson et al., 2001). Les
souris dépourvues de ColQ, de collagène XIII, de collagène IV ou de collagène VI présentent également des
terminaisons nerveuses et/ou des JNM immatures (Sigoillot et al., 2016). Les patients atteints de la
myopathie de Duchenne ont des mutations dans le gène codant la dystrophine qui est sur le chromosome X
(ce qui explique que les garçons qui n'ont qu'un seul chromosome X sont nettement plus affectés que les
filles).

Les cellules souches musculaires adultes : les cellules satellites

Les cellules souches musculaires résidentes, également appelées cellules satellites, sont situées
entre la lame basale et la membrane plasmique des myocytes différenciés. Les cellules satellites
fournissent des noyaux pour la croissance musculaire postnatale et l'hypertrophie, la réparation et
la régénération dans le muscle adulte.

*Figure 7-88. Position des cellules satellites d'une fibre musculaire striée squelettique. Les cellules satellites se
trouvent entre la lame basale entourant la fibre musculaire et sa membrane plasmique (=sarcolemme). D'après
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2017.00046/full

484
 *Figure 7-89. Analyse histologique d'un muscle de souris
après une blessure. Des coupes du muscle
gastrocnémien avant (A) et après une blessure, colorées
au bleu de toluidine révèlent une invasion de cellules
mononucléées après 1 jour (B) et une régénération
importante après 4 jours (C). 10 jours après la blessure
(D), la régénération est presque terminée et plusieurs
fibres régénérées sont visibles. Le grossissement est de
200×. (E) Analyse de l'expression de la myogénine
montrant les niveaux d'expression les plus élevés après
4 jours de blessure.
Source : https://bmcmolcellbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2121-12-26

Durant le développement embryonnaire des muscles, un sous-ensemble de cellules progénitrices Pax7+ se

localise sous la lame basale où elles finissent par devenir des cellules satellites (Dumont et al., 2015). Le
facteur de transcription Pax7 est considéré comme un marqueur canonique des cellules satellites
quiescentes chez plusieurs espèces de Vertébrés et son expression est maintenue pendant la
progression vers l'activation et la prolifération, avant une baisse d'expression au début de la
différenciation myogénique (Berberoglu et al., 2017 ; Chen et al., 2006 ; Hammond et al., 2007 ; Seger et
al., 2011 ; Zammit et al., 2006). Des mutations nulles pour Pax7 affectent gravement le maintien de cellules
satellites et la régénération musculaire chez les amniotes, les amphibiens et les téléostéens (Berberoglu et
al., 2017 ; Oustanina et al., 2004 ; Relaix et al., 2006). La voie de signalisation BMP est essentielle pour le
maintien de l'expression de PAX7 dans les cellules satellites et dans les précurseurs musculaires en
prolifération et pour empêcher l'engagement vers la différenciation (Friedrichs et al., 2011).

*Figure 7-90. BMP7 maintient l'expression de Pax7 dans les cellules satellites. Les cellules satellites ont été cultivées
sur des myofibres pendant 18 heures dans des conditions standard (A-D) ou sans sérum (SR) (E-L). (A-D)
485
 Smad1/5/8 phosphorylé, p-Smad1/5/8 (par la voie BMP) est détecté par immunofluorescence et colocalise avec le
signal d'une immunofluorescence Pax7 dans un milieu standard. (I-L) Dans les cultures sans sérum, le traitement
Bmp7 induit une phosphorylation p-Smad1/5/8 dans les cellules Pax7-positives. Dans les cultures non traitées, p-
Smad1/5/8 ne peut pas être détecté (E-H). L'absence de p-Smad1/5/8 provoque une sévère baisse d'expression de
Pax7. Les noyaux sont colorés avec du DAPI. Le grossissement est de 400×. (M) L'analyse de l'intensité de
fluorescence moyenne du signal Pax7 dans les cellules satellites a révélé une baisse de 50% en l'absence de
traitement BMP7. Le grossissement est de 400×. SR = remplacement du sérum. Source :
https://bmcmolcellbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2121-12-26

La différenciation des cellules est activée par Chordine qui empêche BMP4 d'agir sur son récepteur (comme
lors de l'induction neurale !). L'augmentation des taux de BMP4 dans la dystrophie musculaire de Duchenne
(DMD) peut exacerber la maladie car pas assez de cellules se différencient pour compenser la perte des
cellules à cause de la maladie (Shi et al, 2013).

Dans les cellules satellites, Pax7 se lie à sa séquence de reconnaissance d'ADN et y est stabilisé par une
histone H3 avec une lysine 4 (H3K4) diméthylée. Il recrute alors l'histone méthyltransférase qui convertit
H3K4 diméthylée en H3K4 triméthylée ce qui lui permet de passer à une phase de transcription active
(McKinnell et al. 2008).

**Figure 7-91. L'immunocomplexe contenant Pax7 a une activité histone-méthyl-transférase (HMT) et

s'associe à des sites de méthylation H3K4. (a) Les protéines immunoprécipitées Pax7 ou IgG (contrôle)
provenant de myotubes différenciés (Pax7 négatif) ou de myoblastes primaires (Pax7 positifs) ont été
incubés avec des histones et des méthyltransférases SAM marqués au tritium 3H. Les immunocomplexes
contenant Pax7 des myoblastes primaires ont un niveau nettement plus élevé de méthylation des
histones que les contrôles IgG. (b) La fluorographie des histones incubées avec des immunocomplexes
Pax7 provenant de myoblastes primaires indique que l'activité méthyltransférase associée à
l'immunocomplexe Pax7 est dirigée vers l'histone H3. (c) L'analyse Western blot avec des anticorps
dirigés contre le H3K4 diméthylé (H3K4-2me) et le H3K4 triméthylé (H3K4-3me) indique que les
histones incubées avec les immunocomplexes Pax7 montrent un niveau nettement accru de H3K4-3me,
avec une augmentation simultanée mais moindre de H3K4-2me. (d) L'analyse IP-western blot révèle que
Pax7 est fortement associé à la chromatine isolée des myoblastes primaires en utilisant des anticorps
reconnaissant H3K4-2me et H3K4-3me, mais pas du tout avec la chromatine isolée avec des anticorps
contre H3K9 diméthylé (test de spécificité). Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2739814/

L'acétylation de Pax7 sur ses lysines 105 et 193 stimule ses capacités à activer la transcription des gènes
cibles et notamment de Myf5 dont l'expression est augmentée dans les précurseurs musculaires alors que
486
dans les cellules souches son expression est très faible. L'acétylation de Pax7 est éliminée dans les cellules
satellites capables d'autorenouvellement par SIRT2 mais dans les précurseurs musculaires qui perdent leur
caractère de cellules souches, MYST1 acétyle Pax7 sans que SIRT2 ne puisse éliminer cette modification
post-traductionnelle, ce qui aboutit à l'activation de l'expression de Myf5 (Sincennes et al., 2021).

**Figure 7-92. L’acétyltransférase MYST1 et la désacétylase SIRT2 régulent l’expression des gènes cibles
de PAX7 et l’auto-renouvellement des cellules souches musculaires. Au cours de l’auto-renouvellement
de la cellule souche musculaire (cellule satellite), PAX7 est désacétylé par SIRT2, ce qui empêche sa
liaison à l’ADN. Dans la cellule déterminée vers la lignée myogénique, MYST1 acétyle PAX7, ce qui
entraîne sa liaison à l’ADN et l’expression de gènes cibles tels que Myf5. Source :
https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2022/06/msc220062/msc220062.
html

Les cellules satellites quiescentes ont peu de mitochondries activées et génèrent de faibles niveaux d'ATP
(Rocheteau et al., 2012; Rodgers et al., 2014). Pour gérer les ressources énergétiques disponibles, les
cellules satellites quiescentes maintiennent probablement de faibles taux de synthèse des protéines, médiée
en partie par la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF2α (Zismanov et al., 2016). La
phosphorylation de la sous-unité eIF2α du complexe eIF2 transforme eIF2 en un inhibiteur compétitif du
facteur d'échange de nucléotides guanine eIF2B ce qui empêche le recyclage du complexe ternaire
méthionyl-ARNt initiateur eIF2-GTP (eIF2-GTP-tRNAMet) nécessaire pour délivrer le premier acide aminé
au ribosome. L'inactivation génétique de la phosphorylation de eIF2α (P-eIF2α) dans les cellules satellites
conduit à une augmentation de la synthèse protéique globale, à l'activation du programme myogénique et
à l'échec de l'auto-renouvellement.

***Figure 7-93. Des cellules satellites incapables

de phosphoryler eIF2a entrent précocement
dans le programme myogénique in vivo. Une
mutation de sérine à alanine à la position 51
(S51A) dans la séquence d'eIF2a empêche sa
phosphorylation. Grâce au système Cre/Lox
inductible par le tamoxifène, cette forme
mutante se substitue à la forme normale dans
les cellules exprimant Pax7 chez l'adulte (les
cellules satellites). (I) Immunomarquage MyoD
(rouge) et GFP (vert) sur des coupes
transversales du muscle transverse abdominal
après traitement au tamoxifène (tmx). Les
panneaux de droite sont des images fusionnées
avec DAPI, superposées sur fond clair pour
montrer les myofibres.
(J) Fraction des cellules GFP+ qui sont MyoD+ en
(I). Western-blot contre Myf5 et la beta-tubuline
à partir de lysats cellulaires de cellules GFP+
triées à partir de souris exprimant la GFP dans

487
 les cellules satellites de souris sauvages ou
mutantes comme précédemment après
injection au tamoxifène. Les niveaux relatifs de
Myf5 normalisés à la β-tubuline sont indiqués.
Source : https://www.cell.com/cell-stem-
cell/fulltext/S1934-5909(15)00458-0

L'inhibition pharmacologique de la déphosphorylation de eIF2α avec la petite molécule sal003 maintient

de faibles niveaux de synthèse protéique et permet l'expansion ex vivo de cellules satellites en culture qui
conservent leur potentiel régénératif (Zismanov et al., 2016).

Tout en maintenant de faibles niveaux de synthèse des protéines, les cellules satellites au repos répriment
également la traduction de facteurs de transcription spécifiques qui maintiennent les cellules satellites
«amorcées» pour activer le programme myogénique et le cycle cellulaire. Les transcrits Myf5 sont réprimés
par miR-31 et s'accumulent dans des granules d'ARN cytoplasmique (Crist et al., 2012), qui nécessitent par
ailleurs P-eIF2α pour leur assemblage et leur maintenance (Zismanov et al., 2016). Les transcrits MyoD
(Myod1) sont réprimés par l'activité des protéines de liaison à l'ARN TTP (ZFP36; Hausburg et al., 2015) et
STAUFEN 1 (STAU1; de Morrée et al., 2017), et les facteurs nécessaires pour activer le cycle cellulaire,
comme Dek, sont réprimés par miR-489 (Cheung et al., 2012).

Les cellules satellites sont au repos mitotique (quiescence) et activent le programme myogénique
et le cycle cellulaire en réponse à une lésion musculaire. L’expression de MyoD qui n’était pas
présente dans les cellules satellites est alors activée dans les nouveaux myoblastes en prolifération.

La MEC joue un rôle dans le réveil des cellules souches musculaires quiescentes en G0 et leur ré-entrée dans
le cycle cellulaire. Par exemple, les lésions des muscles squelettiques (mêmes distantes) induisent la
libération du facteur de croissance des hépatocytes (HGF) de la MEC environnante, ce qui amorce la
prolifération des cellules souches musculaires (Rodgers et al., 2017) (voir la Figure 5-68). Notez que HGF
est le ligand du récepteur c-Met et nous avions vu plus haut qu'il était aussi important pour le
développement des myoblastes.

Les cellules satellites activées présentent aussi des cils primaires réduits par rapport aux cellules satellites
quiescentes. Cela module le contrôle du facteur de transcription GLI3 sous sa forme répressive qui est peu
abondant dans les cellules activées alors qu'il est très abondant dans les cellules quiescentes. Cette baisse
de quantité de la forme répressive de GLI3 permet d'activer à un haut niveau la voie de signalisation
mTORC1 ce qui active la synthèse protéique et le métabolisme des cellules satellites activées.
**Figure 7-94. La variation de la taille du cil primaire lors
de l'activation des cellules satellites active la voie pro-
proliférative mTORC1 via la régulation de GLI3
répresseur. Dans la cellule satellite quiescente,
différentes enzymes dans le cil primaire permettent la
modification post-traductionnelle de GLI3 et sa
transformation en répresseur transcriptionnel (GLI3R).
GLI3R inhibe la signalisation mTORC1, ce qui permet de
maintenir la cellule dans un état quiescent. Au moment
de l’activation de la cellule satellite, la résorption du cil
primaire empêche la modification post-traductionnelle
de GLI3, ce qui réduit considérablement l’expression de
GLI3R. La signalisation mTORC1 est alors activée, ce qui
contribue à sortir la cellule satellite sort de sa quiescence
et à proliférer .
Source : https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2023/04/msc230045/msc230045.html

488
Les cellules satellites activées présentent une capacité proliférative remarquable et permettent
d'augmenter rapidement la population de progéniteurs myogéniques nécessaires pour régénérer
efficacement le muscle. De plus, cette phase proliférative est marquée par des divisions cellulaires
symétriques, qui entraînent l'expansion du pool de cellules satellites, et des divisions cellulaires
asymétriques, médiées en partie par une voie de signalisation EGFR-AuroraA kinase, qui assurent juste
l'auto-renouvellement des cellules satellites sans expansion (Wang et al., 2019).

Des protéines impliquées dans la régulation du cytosquelette peuvent aussi être impliqués dans le
développement des cellules satellites. La cofiline est une protéine modulatrice de l'actine intracellulaire qui
se lie et dépolymérise l'actine F filamenteuse et inhibe la polymérisation de l'actine G monomère d'une
manière dépendante du pH. Le gène CFL2 code une isoforme de la cofiline spécifique du muscle squelettique
localisée dans les filaments minces, où il exerce son effet sur l'actine, en partie par le biais d'interactions
avec les tropomyosines. Son expression est modulée par la méthylation de son promoteur au cours du
développement musculaire. Elle est exprimée dans les cellules satellites quiescentes, éteintes lors de la
prolifération des cellules satellites activées puis réexprimées par la suite lors de la différenciation. Une
étude in vitro sur des cellules satellites du poulet montre que son inhibition forcée dans les cellules satellites
active leur prolifération et inhibe l'apoptose (Ran et al., 2021).

**Figure 7-95. La cofiline CFL2 inhibe la prolifération des cellules satellites du muscle squelettique du poulet. (A)
Détection de l'expression de l'ARNm de CFL2 après transfection de l'ARNsi de CFL2. (B) Les cellules musculaires
positives à la coloration EdU après la déplétion de CFL2. (C) Taux de prolifération cellulaire après déplétion de CFL2.
(D) L'état de prolifération cellulaire a été détecté dans les 48 h à 450 nm avec le réactif CCK-8 après la déplétion de
CFL2. (E) Le niveau d'expression de l'ARNm des gènes liés à la prolifération cellulaire (PCNA, CDK2 et cyclinD1) a été
détecté par qRT-PCR après la déplétion de CFL2. (F) Le niveau d'expression de protéines liées à la prolifération
cellulaire (PCNA et CDK2) a été détecté par western blot. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2021.697121/full

Des études récentes ont révélé que les cellules satellites sont une population fonctionnelle hétérogène dans
différents muscles et dépendant non seulement des types de fibres mais aussi de l'origine embryonnaire.
Ainsi, les cellules satellites isolées du muscle extensor digitorum longus (EDL), qui proviennent du somite,
sont différentes dans leur détermination, de leur différenciation et leur auto-renouvellement par rapport
aux cellules satellites du muscle masséter (MAS) qui proviennent du mésoderme crânien. Les cellules
satellites du muscle nasopharyngien de la tête prolifèrent constitutivement et contribuent au
renouvellement myonucléaire sans lésion musculaire, alors que ces phénomènes sont rarement observés

489
dans les muscles des membres. L'hétérogénéité de la population de cellules satellites parmi les muscles peut
donc être à l'origine de phénotypes physiopathologiques spécifiques régionaux des maladies musculaires
où certains muscles sont plus rapidement affectés que d'autres.

La base de ces différences de comportement réside dans des programmes génétiques légèrement différents
selon la localisation et l'origine du muscle. Par exemple, Hoxa10 est exprimé dans les cellules satellites des
membres mais pas dans les cellules satellites de la tête. Le gène Hox exprimé dans les cellules satellites
correspond bien au gène Hox exprimé dans les cellules musculaires différenciées voisines ce qui permet aux
cellules satellites de garder la mémoire de leur position et des caractéristiques des muscles qu'elles vont
régénérer (Yoshioka et al., 2021).

***Figure 7-96. L'information de position dans les cellules satellites est codée grâce à l'expression des gènes Hox.

(A) Schéma des muscles de la tête dérivés du mésoderme crânien et des muscles des membres dérivés des somites
chez la souris adulte. La carte thermique (heatmap) générée à partir de l'analyse des puces à ADN montre les patrons
d'expression des gènes de cluster Hox-A et Hox-C. (B et C) Analyse RT-qPCR des gènes Hoxa5-13 exprimés dans les
tissus musculaires (B) et les cellules satellites en culture (C) chez des souris adultes. (D) Analyse RT-qPCR de
l'expression du gène Hoxa10 dans les tissus musculaires, y compris la tête, les membres antérieurs, les membres
postérieurs, le tronc et d'autres organes de souris adultes. a.u., unités arbitraires. (E) Analyse RT-qPCR de
l'expression du gène Hoxa5-13 dans la mâchoire inférieure, les membres antérieurs et postérieurs à E15.5. Les
muscles adultes et leurs cellules satellites conservent des identités régionales basées sur l'expression des gènes Hox
dont la distribution récapitule presque leur origine embryonnaire, que nous appelons « mémoire positionnelle ». (F)
Illustration schématique du test de transplantation. Des homogénats de muscle TA (donneur : souris Pax7-YFP) ont
été greffés dans du muscle MAS (hôte : souris WT) pré-blessé avec une injection de CTX. Image
immunohistochimique représentative des sections transversales MAS pour la laminine, YFP (Pax7) et DAPI. Barre
d'échelle, 50 µm. Une image représentative d'une électrophorèse sur gel d'agarose contenant des produits PCR des
gènes Hoxa10 et 18S 14 jours après la transplantation. (G) Illustration schématique du test de transplantation. Des
tissus musculaires TA (hôte : souris WT) ont été localement exposés à 18 Gy d'irradiation et injectés de CTX avant la
transplantation d'homogénats de tissus musculaires MAS ou TA (donneur : souris Pax7-YFP). Barre d'échelle, 50 µm.
Des cellules satellites YFP+ greffées ont été re-triées à partir de muscles TA de souris hôtes 14 jours après la
transplantation. Analyse qPCR pour l'expression du gène Hoxa10 (n = 4 souris). Dans tous les cas de transplantation,

490
 les cellules satellites maintiennent leur identité régionale montrant que le programme génétique régionalisé est
définitivement déterminé. Source : https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abd7924

Signalons que les cellules satellites dépendent pour leur développement d'autres cellules de leur niche. Un
type de cellule mésenchymateuse appelé progéniteur fibroadipogénique (FAP) dans le tissu musculaire
squelettique et qui génère des cellules graisseuses blanches semble important pour maintenir les capacités
des cellules satellites dans le temps, sans doute via un effet paracrine (Formicola et al. 2014). La présence
accrue de FAP dans la niche des cellules satellites a des effets anti-épuisements de ces cellules souches et
elle réduit les effets des dystrophies musculaires de Duchenne (Formicola et al. 2014). Justement dans de
nombreuses maladies musculaires, telles que la dystrophie musculaire de Duchenne et lors de la sarcopénie
qui accompagne le vieillissement, l'abondance et la capacité de régénération des cellules satellites sont
diminuées, ce qui entraîne une altération de la régénération musculaire et une perte nette de la masse
musculaire (Brack et Muñoz-Cánoves, 2016). Tout mécanisme permettant de freiner cette évolution est
donc d'un intérêt thérapeutique important.
**Figure 7-97. Baisse avec l'âge du nombre de cellules
satellites par fibre chez la souris. Notez la différence
significative entre les souris mâles et femelles à 3 mois et
1 an. La durée de vie d'une souris de laboratoire est de 2
ans à 2 ans et demi. Source :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0037950

Un point intéressant sur l'évolution des muscles chez l'Homme

La formation de chaque muscle individuel est étroitement réglementée et, en général, se produit avec
un haut degré de fidélité. Cela se reflète dans la symétrie miroir des muscles formés sur les côtés
gauche et droit du corps. Cependant, des variations peuvent survenir et les muscles peuvent être
absents ou il peut y avoir des variations mineures de la taille des muscles et/ou des sites d'insertion,
non seulement entre les individus mais aussi au sein d'un individu, entre les côtés droit et gauche du
corps. L'un des muscles les plus variables, le fléchisseur de l'avant-bras, le long palmaire (PL), est
absent chez 15% de la population. Il est intéressant de noter que cette incidence varie selon les
ethnies, chez les femmes et dans l'avant-bras gauche par rapport à droite. Chez les animaux
tétrapodes, le PL est impliqué dans la mise en charge des membres supérieurs lors des déplacements
à quatre pattes, rôle qui est réduit chez les Homo sapiens bipèdes. L'état sous-développé ou l'absence
du PL chez l'homme correspond probablement à la régression progressive d'un organe vestigial. D'un
point de vue développemental, on ne sait pas si l'absence de PL est causée par la régression d'un
faisceau musculaire naissant ou si un précurseur du muscle mature ne se forme jamais.

La production de cellules musculaires striées à partir de cellules souches induites

Les dérivations de cellules musculaires striées squelettiques à partir des cellules iPS humaines
relèvent généralement de l'une des deux approches suivantes : l'utilisation de transgènes dans
lesquelles les iPS sont directement reprogrammées dans des cellules progénitrices myogéniques
par surexpression de facteurs de transcription spécifiques au muscle (Kodaka et al., 2017) ou
l'administration de petites molécules, telles que des inhibiteurs de FGF2 et de GSK3β, qui activent
ou inhibent les voies de signalisation myogéniques (Jiwlawat et al., 2018).
491
Les approches basées sur les transgènes génèrent des progéniteurs myogéniques à partir des iPS ou de leurs
dérivés mésodermiques par surexpression transitoire ou constitutive de gènes-maîtres régulateurs de la
myogenèse, tels que PAX7 ou MYOD1. La surexpression de gènes myogéniques exogènes a été réalisée par
transfection d'ARNm, ainsi que par transduction avec des adénovirus ou des lentivirus. Grâce à ces
méthodes, jusqu'à 90 % des cellules s'engagent dans une identité myogénique et peuvent se différencier en
cellules progénitrices des cellules musculaires striées. L'utilisation de gènes rapporteurs de fluorescence
co-exprimés avec des facteurs de transcription peut permettre une purification supplémentaire des cellules
par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (Rao et al., 2018). Alternativement, l'activation de facteurs
de transcription endogènes (par exemple, PAX7) à l'aide de la méthodologie CRISPR/Cas9 peut conduire à
une reprogrammation épigénétique stable des iPS et à la génération de cellules progénitrices myogéniques
(Kwon et al., 2020). Les progéniteurs résultants dérivés à l'aide d'approches basées sur les transgènes
survivent et sont fonctionnels lorsqu'ils sont implantés dans des souris immunodéprimées (Kwon et al.,
2020), tandis que les tissus modifiés en 3D générés à partir de ces cellules peuvent devenir des muscles
fonctionnels avec la capacité de survivre et de se contracter in vivo (Rao et al., 2018). Néanmoins, ces
méthodes de différenciation ne reflètent pas un développement normal et malgré la capacité d'obtenir un

grand nombre de progéniteurs myogéniques humains, les préoccupations réglementaires concernant la

modification génétique des cellules peuvent limiter leur utilisation thérapeutique potentielle (Jiwlawat et
al., 2018).

Une deuxième approche, connue sous le nom de différenciation dirigée, imite le développement
myogénique par l'ajout séquentiel de petites molécules pour activer ou supprimer des voies de signalisation
spécifiques. Par exemple, CHIR-99021 active la signalisation WNT via l'inhibition de GSK3β, LDN-193189
inhibe la signalisation BMP, et HGF et IGF1 activent leurs voies de signalisation respectives (Chal et al.,
2016).
***Figure 7-98. Comparaison du développement précoce et de la différenciation des cellules iPS en muscle squelettique. (A) Le
développement caudal-rostral des muscles striés se produit bilatéralement le long du tube neural et de la chorde (NC). De la zone
progénitrice, les cellules migrent vers le mésoderme présomitique postérieur (pPSM) avec un gradient décroissant de signaux FGF et
WNT. Ils traversent ensuite le front de détermination pour pénétrer dans le mésoderme présomitique antérieur (aPSM). Avec
l'augmentation du gradient d'acide rétinoïque (RA), la formation de somite commence. Au fur et à mesure que les cellules continuent
de se déplacer à l'avant, le dermomyotome (DT), le sclérotome et le myotome (MT) se forment, initiant la myogenèse primaire. (B) La

492
différenciation des cellules iPS en muscle squelettique commence par l'activation de WNT et de FGF, induisant un changement dans
les progéniteurs neuromésodermiques (NMP), puis les cellules progénitrices musculaires (MPC) exprimant les facteurs de
transcription T, Tbx6 et Msgn1. La perte subséquente de l'expression de T conduit à la formation de cellules mésodermiques paraxiales
ressemblant aux progéniteurs du muscle squelettique de pPSM. Grâce à l'activation de la voie de l'acide rétinoïque, ces progéniteurs
musculaires commencent à exprimer les marqueurs de cellules souches musculaires Pax3 et Pax7 et finissent par se différencier en
myoblastes exprimant les marqueurs myogéniques précoces Myf5, MyoD et Mrf4. Les myoblastes peuvent fusionner en myotubes qui
expriment le marqueur de différenciation musculaire tardive MyoG. Des couleurs distinctes sont utilisées pour indiquer une
correspondance approximative entre les étapes de différenciation des cellules iPS dans le panneau (B) et le développement
embryonnaire dans le panneau (A). Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.764732/full

Les protocoles de différenciation dirigée nécessitent un temps de culture beaucoup plus long et présentent
des rendements considérablement plus faibles et une plus grande hétérogénéité des cellules myogéniques
par rapport aux méthodes basées sur les transgènes (Kodaka et al., 2017; Jiwlawat et al., 2018). La pureté
des progéniteurs myogéniques peut être augmentée en triant les cellules à l'aide de marqueurs de surface
cellulaire tels que CDH13 (Nalbandian et al., 2021), FGFR4 (Nalbandian et al., 2021), ERBB3 et NGFR.
Cependant, l'utilisation de FACS diminue encore le rendement cellulaire. Des protocoles récents pour
l'expansion et la cryoconservation de progéniteurs myogéniques dérivés de iPS triés par FACS peuvent
offrir des moyens d'obtenir des quantités de cellules nécessaires pour des applications thérapeutiques (van
der Wal et al., 2018).

*Figure 7-99. Expansion, différenciation et maturation in vitro de cellules progénitrices myogéniques purifiées
produites à partir d'iPS.

(A) Courbes de prolifération de progéniteurs myogéniques dérivés de 15 lignées iPS dérivées de témoins sains ou de
patients atteints de la maladie de Pompe (une maladie métabolique musculaire), cultivés dans un milieu de
prolifération. Une ligne de tendance exponentielle a été tracée et un R2 a été calculé à partir de tous les points de
données, qui ont montré des taux de prolifération similaires pour toutes les lignées cellulaires.
(B) Récupération des progéniteurs myogéniques de contrôle de la congélation. Les données sont des moyennes ± SD
de trois cultures indépendantes.
(C) Durée moyenne du cycle cellulaire de toutes les lignées cellulaires indiquées en (A). Les données sont des
moyennes ± SD de toutes les lignées cellulaires indiquées en (A).
(D) Après expansion pour le nombre de jours indiqué sur l'axe X, la différenciation des muscles squelettiques a été
induite pendant 4 jours en passant au milieu de différenciation. L'indice de fusion a été quantifié après coloration
pour le CMH et le Hoechst. Les valeurs individuelles des champs aléatoires par lignée cellulaire sont représentées
sous forme de symboles. Les valeurs moyennes de toutes les lignées cellulaires par période d'expansion sont
493
 indiquées sous forme de lignes horizontales. (E) Au jour 8 de différenciation, les myotubes ont encore maturé comme
indiqué par l'immunomarquage du MHC (chaine lourde de la myosine), de la titine et de l'alpha-actinine, ainsi qu'un
motif strié caractéristique et des contractions spontanées (visibles sur des vidéos). Les noyaux colorés au Hoechst
sont en bleu. Source : https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711(18)30154-1

Des analyses transcriptomiques ont montré que les progéniteurs myogéniques dérivés de iPS sont
immatures sur le plan du développement et arrêtés entre les stades des cellules souches musculaires
embryonnaires et fœtales (Nayak et al., 2021). Néanmoins, ils peuvent fusionner avec succès dans des
myotubes qui présentent des comportements fonctionnels clés des cellules différenciées, y compris la
génération de flux transitoires de calcium et de force contractile et une réponse robuste à l'acétylcholine
(Skoglund et al., 2014; Rao et al., 2018), bien qu'à des niveaux inférieurs par rapport aux myotubes humains
primaires (Rao et al., 2018). De nouvelles avancées dans la maturité des cellules musculaires striées
squelettiques dérivées des iPS conduiront à une meilleure modélisation des maladies humaines in vitro.

Des start-ups de biotechnologies se sont lancées dans la production de viande in vitro à partir de cellules
souches bovines (voir ici un exemple : https://mosameat.com/). La faisabilité est démontrée mais le défi
reste la production à grande échelle et le coût (le premier burger avec du steak haché entièrement
développé en laboratoire avait coûté 300.000 $ en 2013). Il reste que c'est une solution pour lutter contre
la production de gaz à effet de serre qui est problématique dans l'élevage bovin.

LA CARTE MENTALE

494
Les cellules des crêtes neurales

*Figure 7-100. Cellules des crêtes neurales entre le futur épiderme et le tube neural. Notez la matrice extracellulaire
qui entoure les cellules des crêtes neurales. Image d'une coupe transversale d'embryon de poulet vue en microscopie
électronique à balayage donnée par Eric Thévenau, CBI Toulouse

En 1868, Wilhelm His a décrit une bande étroite de cellules, initialement situées du côté dorsal entre le tube
neural et le futur épiderme. Il avait remarqué que ces cellules donnent naissance aux ganglions rachidiens.
His avait raison mais il a largement sous-estimé la diversité des cellules que peuvent produire ces cellules
des crêtes neurales (CCN).

En effet, les CCN peuplent diverses régions de l'embryon au cours du développement et contribuent
à la formation de multiples tissus et organes. Les CCN peuvent se différencier en une variété de
lignées : en mélanocytes, en ostéocytes et chondrocytes du squelette céphalique, en muscles lisses
des vaisseaux partant du cœur, en neurones et cellules gliales (cellules de Schwann) du système
nerveux périphérique (comportant le système nerveux entérique, sympathique et
parasympathique), en cellules endocrines de la médullosurrénales (et cette liste n'est pas
exhaustive).
*Figure 7-101. Les cellules de Schwann sont un des
dérivés des cellules des crêtes neurales et forment des
gaines de myéline autour des neurones dans le système
nerveux périphérique. Elles ont des propriétés
différentes par rapport aux oligodendrocytes qui ne
sont pas dérivées des CCN (mais dérivées des cellules
souches neurales restées dans le tube neural) et qui
forment des gaines de myéline dans le système nerveux
central. Source :
https://www.tumblr.com/blog/view/celluloyd

La diversité des structures produites ainsi que le fait que ces types cellulaires proviennent
habituellement de 2 feuillets embryonnaires (ectoderme et mésoderme) indique clairement que les
CCN sont des cellules multipotentes (Ishii et al., 2012). On peut même les considérer comme un quatrième
feuillet spécifique des Vertébrés qui est le seul phylum où on peut les trouver (même si on trouve des
cellules apparentées chez les Cordés non vertébrés).

495
 *Figure 7-102. Multipotence d'une population de CCN céphaliques (A) On prélève la tête d'embryons de souris Wnt1-
Cre;R26R-GFP à E8,5 qui expriment la GFP sous le contrôle du promoteur de Wnt1 qui est, à ce stade, exprimé dans
les CCN juste avant leur migration. On dissocie les cellules et après une période de culture in vitro de 3 jours, les
cellules fluorescentes sont sélectionnées par FACS et mises à cultiver sur des boîtes de Pétri recouvertes de Matrigel
avec un milieu basal. (D–G) La CCN céphalique se différencie en plusieurs lignées cellulaires : en ostéoblastes
(coloration au rouge alizarine). (D), chondrocytes (coloration au bleu alcian) (E), cellules musculaires lisses (F) et
cellules gliales (G) (immunofluorescence avec les anticorps contre les protéines indiquées). Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3495126/

Outre leur multipotence, les CCN présentent aussi des propriétés d'auto-renouvellement ce qui
permet de les ranger dans la catégorie des cellules souches (Trentin et al., 2004, Thomas et al., 2008).
Des protocoles ont été développés pour maintenir ces capacités de cellules souches (et la multipotence)
dans des CCN en culture (voir par exemple Keruoso et al., 2015).

**Figure 7-103. Production et maintien in vitro de crestosphères. Des régions dorsales de tubes neuraux (avant que
les CCN n'émigrent) sont disséquées à partir d'embryons de poulet et placées dans un milieu qui favorise le
développement de CCN en suspension et qui forment des sphères (crestosphères). Elles peuvent être aussi obtenues
à partir de cellules ES (ou iPS) humaines que l'on fait se développer en CCN à la suite d'un protocole particulier. Les
crestosphères peuvent être maintenues in vitro sur plusieurs semaines et elles expriment des marqueurs

496
 "classiques" de CCN (en bleu clair). On peut ensuite les faire différencier in vitro ou in vivo en divers dérivés des CCN.
Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213671115002519

Historiquement, quatre sous-populations de CCN ont été identifiées selon leur localisation initiale
le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon :

• céphalique (en amont des somites)

• vagal (somites 1 à 7),

• troncal (somites 8 à 28 chez le poulet et 8 à 24 chez la souris)

• sacré (postérieur à somites 28 chez le poulet et 24 chez la souris)

A part les mélanocytes qui sont générés quel que soit le niveau de l'axe antéro-postérieur, les CCN
ne donnent pas les mêmes dérivés selon leur position. Par exemple, seules les CCN céphaliques
donnent naissance à du tissu osseux et cartilagineux et seules les CCN vagales (et pour une petite
part les CCN sacrées) donnent naissance au système nerveux entérique.
*Figure 7-104. Carte des dérivés de la crête
neurale selon leur position sur l'axe antéro-
postérieur. Les différents types cellulaires
produits par les CCN à différents niveaux
antéropostérieurs sont représentés dans des
embryons de poulet au stade 7 somites (à
gauche) et 28 somites (à droite), car les CCN
céphaliques émergent plus tôt au cours du
développement que les CCN plus postérieures.
La région qui donne naissance au
mésectoderme (vert) (notamment les tissus
cartilagineux et osseux de la tête) s'étend du
niveau du diencéphale moyen jusqu'au
rhombomère (r) 8 (correspondant au 4ème
somite (S4). Les mélanocytes (gris) sont
produits sur toute la longueur de l'axe. Les
ganglions parasympathique (jaune) dérivent de
la CN mésencéphalique. Les ganglions
entériques (orange) proviennent de la CN
vagale (S1-S7) et lombosacrée (postérieure à
S28). Postérieurement à S4, la CN du tronc
produit les ganglions sympathiques (rouge),
tandis que les ganglions sensoriels (bleu foncé)
sont générés par la CN mésencéphalique et par
la CN des niveaux rhombencéphaliques
postérieurs à lombosacré. Les cellules
endocrines (violet) proviennent des CN des
niveaux S2-S4 et S18-S24.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/131/19/4637/42419/Neural-crest-cell-plasticity-and-its-limits

Signalons que parmi les CCN initialement désignées comme vagales, se trouvent une sous-population
particulières appelées CCN cardiaques. Ces cellules apparaissent depuis le niveau de la vésicule otique
jusqu'au niveau du 3ème somite et constituent la seule sous-population de la crête neurale qui contribue au
système cardiovasculaire. Ces cellules migrent dans les arcs pharyngiens 3, 4 et 6, à partir desquels un sous-
ensemble de cellules migre dans la voie d'éjection cardiaque, au sein de laquelle elles se condensent pour
former le septum aortico-pulmonaire (Snider et al., 2007). Elles participent à la formation de certaines
valves cardiaques (Odelin et al., 2018). Certaines cellules migrent encore plus loin dans les ventricules et
forment certains cardiomyocytes (Tang et al., 2019).

497
 *Figure 7-105. Des cellules de crêtes neurales
deviennent des cardiomyocytes dans le ventricule chez
la souris. Le ventricule de souris transgéniques Wnt1-
mGFP exprimant la GFP sous le contrôle des séquences
régulatrices de Wnt1 (outil permettant de marquer les
CCN) a été analysé en fluorescence après un
immunomarquage avec un anticorps reconnaissant la
troponine T (TropT), un marqueur de cardiomyocyte. Le
DAPI marque les noyaux. Source :
https://elifesciences.org/articles/47929

La comparaison de l'expression des gènes dans les CCN céphaliques et troncales de la lamproie,
qui est un vertébré sans mâchoires parasite, avec celle d'embryons de poulet a montré qu'alors
que le poulet possède un sous-réseau de régulation génétique pour les CCN céphaliques qui est en
bonne partie spécifique par rapport aux CCN troncales, les CCN céphaliques de la lamproie n'ont
pas ce réseau céphalique et ressemblent plus aux CCN troncales du poulet (Martik et al., 2019).
Fait intéressant, le réseau de régulation génétique céphalique semble avoir été progressivement
enrichis en gènes et en complexité à mesure que les vertébrés ont évolué. Cela suggère que la crête
neurale ancestrale des vertébrés sans mâchoire existe dans un état ressemblant à un tronc primitif
et que l'ajout progressif de nouveaux gènes et la complexification du réseau au niveau céphalique
au cours de l'évolution des vertébrés a graduellement conféré à la crête neurale la capacité de
former l'os et le cartilage de la mâchoire inférieure.

Le développement des CCN est contrôlé par de nombreux événements fondamentaux : la

détermination du territoire multipotent crête neurale au sein de la bordure neurale, la transition
épithélio-mésenchymateuse (EMT), la restriction de la multipotence, la prolifération, la survie, la
migration et la différenciation. Comment tous ces processus cellulaires sont-ils coordonnés dans le
temps et aussi dans l'espace de l'embryon que les CCN envahissent ?

Des anomalies du développement des CCN, d'origine génétique et/ou environnementales, aboutissent aux
neurocristopathies, aussi diverses que peuvent l'être les dérivés des CCN (Etchevers et al., 2019).

Développement de la bordure neurale et émergence des CCN en son sein

Lors de la neurulation, l’ectoderme se sépare en différentes parties : une partie neurale, une partie
épidermique et chez les Vertébrés, une partie intermédiaire entre les deux appelée la bordure
neurale. La partie neurale devient le tube neural générant la moelle épinière et le cerveau et la
bordure neurale donne naissance aux cellules de crêtes neurales et aux placodes (Pla et Monsoro-
Burq, 2018).

La détermination de ces structures dans l'ectoderme provient du contrôle de l'activité de la voie

BMP dans ses cellules : une forte activité de la voie BMP aboutit à la formation d'épiderme, une
activité intermédiaire à la formation de la bordure neurale et une activité faible à la formation du
tube neural. Le contrôle de la voie BMP provient essentiellement de la capture des ligands BMP
(produits essentiellement ventralement) par des protéines secrétées provenant de l'organisateur
de Spemann/nœud de Hensen qui est dorsal : chordine, noggin et follistatine (Marchant et al., 1998).
D'autres voies de signalisation sont également nécessaires, notamment Wnt en provenance du mésoderme
paraxial et de l'ectoderme non neural et les FGF exprimés dans le mésoderme paraxial (Pla et Monsoro-
Burq, 2018).
498
 *Figure 7-106. La signalisation BMP, Wnt et FGF à
l'origine de l'induction de la bordure neurale.
D'après https://journals.biologists.com/dev/article/139/22/4220/45624/BMP-Wnt-and-FGF-
signals-are-integrated-through

Zic1 et Msx1 (Baker et al. , 1997; Marchant et al., 1998; Pla et Monsoro-Burq, 2018). Une fois que les gènes
sont activés par les voies de signalisation, ils renforcent mutuellement leurs expressions. Par exemple,
l'expression de Tfap2a et de Pax3 est activée directement par la voie canonique Wnt mais Tfap2a peut aussi
activer directement l'expression de Pax3 et peut compenser une inhibition de la voie Wnt (de Crozé et al.,
2011).

La co-immunolocalisation de marqueurs de la plaque neurale (Sox2), de la bordure neurale (Pax7), de la

bordure neurale et de l'ectoderme non-neural (Tfap2a, Msx1/2) et des progéniteurs de la placode (Six1) a
montré que ces marqueurs se chevauchent largement dans les cellules de la bordure neurale chez le poulet
(Roellig et al., 2017). Cette co-expression de plusieurs marqueurs est maintenue du début de la neurulation
jusqu'à la fermeture du tube neural. En supposant que l'expression de chacun de ces marqueurs permet de
prédire fidèlement les destins cellulaires, cette étude indique que la bordure neurale n'est pas divisée en
régions à destins bien définis avant la fermeture du tube neural. Ce n'est qu'après que les différents
territoires se définissent précisément. Néanmoins, un biais dans les compétences existe assez précocement
et les cellules dorsales dans la bordure neurale ont tendance à devenir des CCN et les cellules ventrales (ou
latérales) dans la bordure neurale donnent plutôt des placodes (Pieper et al., 2012).

**Figure 7-107. Expression de gènes sélectionnés au cours du développement précoce de la bordure neurale du
xénope. Expression de certains des marqueurs les plus couramment utilisés pour l'ectoderme non-neural, la bordure
neurale et le tube neural. Rangée supérieure : vues dorsales d'embryons de xénope au stade de la plaque neurale
499
 (stade 14, Nieuwkoop et Faber, 1994), traités par hybridation in situ : Pax3, Zic1 et Msx1 sont exprimés à la bordure
neurale, l'expression de Six1 délimite l'ectoderme préplacodal qui donne naissance aux placodes, Sox2 est exprimé
dans la plaque neurale et Epk marque l'ectoderme non neural. Notez le chevauchement partiel entre Pax3 et Sox2
dans la plaque neurale latérale correspondant à la future partie dorsale du tube neural ; et aussi le chevauchement
de Zic1 et Six1 dans l'ectoderme préplacodal. Barre d'échelle : 500 µm. Rangée inférieure : Coupes transversales
d'embryons de xénope au stade 14 traités par hybridation in situ pour les gènes indiqués. Pax3, Zic1 et Hes4 sont
exprimés dans la bordure neurale, Sox2 est exprimé dans la plaque neurale avec une chevauchement partiel avec
Pax3 dans la plaque neurale latérale et Epk est exprimé dans l'ectoderme non neural. Barre d'échelle : 100 µm. Source
: Pla et Monsoro-Burq, 2018

L'induction des crêtes neurales à partir des cellules de la bordure neurale passe pas un bon dosage entre
Pax3 et Zic1 (trop de Pax3 donne du neurectoderme et trop de Zic1 donne des placodes).
*Figure 7-108. Induction de l'expression de Snail2 (ou
Snai2), un marqueur de crêtes neurales, grâce à la co-
expression de Pax3 et de Zic1 dans la calotte animale
d'embryons de xénope. Des ARNm codant des formes
inductibles par la dexaméthasone des facteurs de
transcription Pax3 et de Zic1 sont injectés ou non dans
des embryons de xénope au stade 2 cellules. Au stade
blastula âgé, la calotte animale de ces embryons est
excisée (sans intervention, elle donne normalement de
l'épiderme). On ajoute de la dexaméthasone et 8h plus
tard, on extrait les ARN et on étudie l'expression de Snai2
par RT-qPCR. On constate que c'est la combinaison Pax3
et Zic1 qui permet une induction optimale (Pax3 seul
peut induire plus faiblement l'expression). Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006291X17325275

Elle implique aussi un renforcement de la signalisation BMP. Cela est rendu possible par une interaction
entre les SMAD en aval du récepteur aux BMP et FHL3, protéine à domaines LIM, qui augmente l'activation
de la transcription de Wnt8 en aval des SMAD (Alkobtawi et al., 2021). Cet apport de signalisation Wnt
autocrine augmente la production de CCN.

Une nouvelle série de gènes est activée dans l'étape suivante du réseau de régulation génétique des CCN. Ils
sont nommés les spécificateurs de CN. Il s'agit par exemple de Snail2, FoxD3 et Sox9. Snail2 est le principal
chef-d'orchestre de la transition épithélio-mésenchymateuse qui fera émerger les CCN de l'épithélium qui
les abrite (voir plus loin).

FoxD3 a un rôle dans le maintien des caractères de cellules souches des CCN, c'est-à-dire leur capacité à
s'autorenouveler.

500
 *Figure 7-109. Réduction de l'auto-renouvellement dans les CCN sans Foxd3 (A-D) Des NC vagales et troncales
dissociées de souris ont été cultivées à une densité clonale (une cellule donne une neurosphère) dans des conditions
non adhérentes pendant 10 jours. Des neurosphères primaires de CCN normales (A) ou mutantes (perte de fonction
homozygote de FoxD3 dans les CCN) (B) sont montrées. La quantification du diamètre relatif des neurosphères (C)
et du pourcentage de cellules dissociées qui ont formé des neurosphères primaires (D) démontrent des défauts dans
les CCN sans Foxd3. (E-H) L'auto-renouvellement a été mesuré en dissociant les cellules des neurosphères et en les
remettant dans des conditions où elles peuvent faire des neurosphères (E) et cette expérience a été refaite en mettant
la même densité cellulaire pour le sauvage et le mutant pour compenser le fait que les neurosphères mutantes étaient
plus petites (F, G, H). Il y a une nette perte de capacité à générer à nouveau des neurosphères signant des pertes de
capacités d'auto-renouvellement chez les CCN sans FoxD3. Barres d'échelle : 50 μm. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/138/4/641/44927/Neural-crest-stem-cell-multipotency-requires-
Foxd3

Sox9 se charge d'inhiber tout programme neurogénique. Quand on l'exprime ectopiquement dans le tube
neural, il est capable d'inhiber l'expression de Pax6, Nkx6, Irx3, Olig2 et Nkx2.2, qui sont des gènes impliqués
dans la détermination neuronale (Cheung et Briscoe, 2003). En parallèle, il active l'expression de marqueurs
de crêtes neurales dont HNK-1.
*Figure 7-110. L'expression ectopique de Sox9 dans le tube
neural y provoque la formation excessive de crêtes
neurales. Des tubes neuraux d'embryons de poulet sont
électroporés avec un vecteur permettant la co-expression
de Sox9 et de GFP. On suit l'expression de la GFP 6, 12 et 24
heures après électroporation (vert) et on réalise une
immunomarquage anti-HNK1 qui est un marqueur de
crêtes neurales (rouge). Seul le côté droit du tube neural
exprime la GFP (et Sox9) et on y constate une expression
ectopique massive de HNK1. Sur le côté gauche, on observe
la crête neurale "normale". Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/130/23/5681/52295/Neural-
crest-development-is-regulated-by-the

La spécification des CCN est aussi limitée dans l'espace. Par exemple, dans la partie la plus antérieure du
tube neural appelé ANR (pli neural antérieur), Tcf7l1 inhibe la voie Wnt nécessaire à l'activation du réseau
de régulation génétique des CCN (Masek et al., 2016).

Dans toute cette cascade de régulation génique, l'expression des gènes est sous le contrôle de modifications
épigénétiques sur les promoteurs et les enhancers (Strobl-Mazzulla et al., 2010; Bajpai et al., 2010).
**Figure 7-111. Exemple de modifications
épigénétiques sur la chromatine lors de l'induction de
la bordure neurale (NPB) en cellules des crêtes
neurales céphaliques (CNC). JmjD2A agit pour lever la
marque répressive H3K9me3 sur les promoteurs de
certains gènes précoces codant des facteurs de
transcription nécessaires à la spécification des crêtes
neurales céphaliques (notamment Sox10). Le
complexe de type SWI/SNF Chd7/PBAF s'associe aux
marqueurs permissifs H3K4me1 et remodèle la
chromatine par glissement de nucléosomes. Ces
enhancers passent à un état actif avec un
enrichissement de H3K27ac et H3K4me1. Ces
enhancers sont liés par AP2α et NRF2F1/2, qui
activent l'expression de gènes en aval. Source : Cox et
Crump, 2015

501
Transition épithélio-mésenchymateuse et migration des CCN
Avant de lire cette partie, vous pouvez (re)voir des aspects fondamentaux de la transition épithélio-
mésenchymateuses et de la migration à la page 294.

Les CCN sont les cellules des embryons de Vertébrés où la transition épithélio-mésenchymateuses
(EMT) et la migration ont été les plus étudiées (Thevenau et Mayor, 2012).

Le chef d'orchestre de l'EMT est le facteur de transcription Snail2. Il est activé par les facteurs de
transcription qui spécifient la crête neurale que nous avons vu précédemment (Sakai et al., 2006).
*Figure 7-112. Sox9 est nécessaire pour activer
l'expression de Snail2 dans les CCN. On électropore des
embryons de poulet avec un vecteur d'expression de la
GFP seule (à gauche) ou de la GFP avec Sox9-En-nuc qui
est une forme répressive dominante-négative du facteur
de transcription Sox9. On contrôle avec la fluorescence
GFP quel côté de l'embryon a été électroporé et
l'efficacité de la technique. On effectue ensuite une
hybridation in situ avec une sonde reconnaissant
l'ARNm de Snail2. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/133/7/1323/43528/Cooperative-action-of-Sox9-Snail2-and-PKA

L'expression de Snail2 est aussi contrôlée au niveau traductionnel avec le microARN miR-203 qui inhibe sa
traduction dans les CCN pré-migratrices (Sanchez-Vasquez et al., 2019).
**Figure 7-113. Contrôle de la traduction de Snail2 par
un miR-203 dans les CCN de poulet. Durant la
spécification des CCN et avant leur migration, miR-203
réprime directement la traduction de l'ARNm de Snail2
et aussi de l'ARNm de PHF12 (PHF12 est une protéine
associée à la chromatine qui régule la transcription). Un
peu avant l'EMT, cette inhibition est levée, permettant à
Snail2 (et à PHF12) d'inhiber la transcription du gène
codant la cadhérine 6B, une étape importante de l'EMT.
Également, Snail2 induit une méthylation de la
chromatine dans les séquences régulatrices de la
transcription du gène codant miR-203 aboutissant à la
répression de son expression. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/7/dev171017/49068/Epigenetic-inactivation-of-
miR-203-as-a-key-step

La transition épithélio-mésenchymateuse est déclenchée par un sursaut d'activité BMP et a besoin d'un
cycle cellulaire fonctionnel car les CCN délaminent durant la phase S (Burstyn-Cohen et Kalcheim, 2002).

502
 **Figure 7-114. Le délamination des CCN induite par
BMP4 à partir de tubes neuraux explantés est inhibée par
la mimosine, un bloqueur de la transition G1/S. (A)
Contrôle et (B) 600 µM de mimosine, (C) 100 ng/ml
BMP4 et (D) traitement mimosine + BMP4. Les cellules
ont été aussi incubés avec du BrdU, un analogue de base
qui s'incorpore dans l'ADN lors de la réplication de la
phase S. Les panneaux de gauche sont des images en
contraste de phase et les panneaux de droite
représentent une immunofluorescence anti-BrdU. (E)
Quantification des données. Barre d'échelle : 75 µm.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/131/21/5327/42378/Canonical-Wnt-
activity-regulates-trunk-neural

Cela est sans doute lié à la migration nucléaire qui accompagne le cycle cellulaire dans un neuroépithélium.
Le noyau des cellules se trouve proche du pôle apical (c'est-à-dire proche du canal de l'épendyme ou la
partie la plus interne du tube neural) durant la grande majorité du cycle, sauf lors de la phase S où le noyau
se déplace vers le pôle basal des cellules, c'est-à-dire plus proche de la lame basale. Ce mouvement doit
faciliter la sortie du neuroépithélium pour les CCN.
**Figure 7-115. Liens entre le cycle cellulaire et l'EMT
des CCN.

D'après https://www.cell.com/developmental-
cell/fulltext/S1534-5807(02)00221-6

Le contrôle temporel de l'EMT est apporté par Noggin qui s'oppose à l'action des BMP tant que les CCN ne
sont pas prêtes. L'expression de Noggin dans le tube neural dorsal est contrôlée par un signal en provenance
des somites et ainsi la maturation des somites et l'EMT et le début de la migration des CCN est coordonné
(Sela-Donenfeld et Kalcheim, 2000). C'est un point important car une vaste majorité des CCN (sauf au niveau
céphalique) va migrer à la surface ou même à travers les somites.

A l'inverse de BMP, la signalisation Wnt doit être inhibée pour que l'EMT ait lieu. Chez le xénope et le poulet,
cette inhibition est réalisée par Dact1 et Dact2 qui empêchent la β-caténine d'interagir avec le facteur de
transcription TCF (Rabadan et al., 2016).

503
 *Figure 7-116. Dact1, un inhibiteur de la voie Wnt, est
nécessaire et suffisant pour limiter l'EMT et la migration
des CCN. On injecte dans 2 cellules d'un embryon de
xénope à 8 cellules soit un morpholino qui bloque la
traduction de l'ARNm de Dact1 (DACT1 LOF), soit un
ARNm permettant de surexprimer Dact1 (DACT1 GOF).
L'autre côté de l'embryon sert de témoin non injecté
(contrôle). On compare l'état de délamination et de
migration des CCN par une hybridation in situ avec une
sonde reconnaissant l'ARNm de Twist. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/143/12/2194/47382/Delamination-of-neural-crest-
cells-requires

Au cours de l’EMT, Snail2, Foxd3, Sox9 et Sox10 coopèrent pour orchestrer des changements dans
l'expression des cadhérines. Chez l'embryon de poulet, l'expression de la N-cadhérine et de la cadhérine
6B est remplacée par celle de Cadhérine-7 et de Cadhérine-11 (Chalpe et al., 2010 ; Nakagawa et Takeichi,
1998).
*Figure 7-117. Snail2 favorise l'EMT en inhibant
l'expression de la cadhérine-6B dans les CCN troncales
du poulet. Explant et culture de bordures neurales de
poulet électroporés in vivo avec un morpholino (MO, un
inhibiteur de la traduction) anti-Snail2 avec un MO de
contrôle (A) ou avec un MO anti-Cad6B (B). Les cellules
électroporées expriment un gène rapporteur codant un
fluorophore rouge. (C) Diagramme montrant les
résultats des expériences. L'analyse statistique montre
une réduction significative du nombre de CCN subissant
une EMT en présence du MO Snail2 par rapport au MO
Snail2 avec le MO Cad6B. Cela démontre que l'EMT de la
crête neurale se produit via un mécanisme qui implique
la répression de Cad6B par Snail2. D'autres expériences
montrent que la répression de la transcription de Cad6B
par Snail2 est directe. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/134/8/1481/53069/Snail2-directly-represses-
cadherin6B-during

Non seulement la transcription du gène codant la N-cadhérine est diminuée mais en plus la partie
extracellulaires des protéines encore présentes est clivée par la métalloprotéinase ADAM10 (Shoval et al.,
2007).

Les jonctions serrées sont aussi éliminées lors de l'EMT des CCN. Si on inhibe l'expression de la Claudine-1,
il y a une migration plus précoce des CCN et si on force le maintien de l'expression de la Claudine-1, on
inhibe l'EMT (Fishwick et al., 2012).

Les protéines contrôlant l'EMT activent également l'expression de l'intégrine β1 (Cheung et al., 2005).
L'extinction de l'expression de la N-cadhérine n'est cependant pas universelle car chez le xénope, son
expression est même augmentée au moment de l'EMT par une voie de signalisation impliquant les
récepteurs PDGF et PI3K/Akt (Bahm et al., 2017).

504
La fin de la production et de l'EMT des CCN est causée par une extinction de la signalisation BMP sous le
contrôle de l'acide rétinoïque produit dans le neural tube dorsale. La partie la plus dorsale du tube neural
forme alors le toit (Rekler et Kalcheim, 2022).

**Figure 7-118. L'acide rétinoïque (RA) est responsable de la perte de sensibilité des progéniteurs dorsaux du tube
neural à BMP lors du passage de la production de CCN à la détermination du toit du tube neural. (A-D')
Immunomarquage pour pSmad1/5/8 (voie BMP active). Les embryons de poulet à E2.5 (27-28 somites) ont été co-
électroporés avec RARα403 (qui code une forme dominante-négative du récepteur à RA), Cyp26A1 (qui code une
enzyme qui dégrade RA) ou avec un vecteur pCAGG contrôle, avec GFP, et analysés au stade 35 somites (contrôle
uniquement, stade NC) et à E4 (stade ou le toit (RP) se forme). Notez la présence d'activité BMP dans le NC
prémigratoire (A) et son absence dans le RP des embryons témoins (B-B '). Alors que seuls les interneurones dorsaux
dl1 situés un peu plus ventralement sont positifs pour pSmad1/5/8 dans les embryons témoins, le domaine du toit
(RP) est positif dans les embryons électroporés RARα403 et Cyp26A1 (C-C', D-D'). Barre d'échelle = 50 μm. Source :
https://elifesciences.org/articles/72723

Une fois l'EMT réalisée, les CCN migrent selon des voies précises, formant des flux denses de cellules.

Sur cette vidéo, une partie de la bordure neurale de la tête d'un embryon de poulet a été
électroporée avec un vecteur d'expression de la GFP : https://youtu.be/mw4icMs68sE

Pour trouver leur chemin de migration, les CCN détectent et répondent à différents stimuli extracellulaires.
Les gradients de chimioattractants, tels que SDF1 (également connu sous le nom de Cxcl12), sont exprimés
le long des voies de migration des CCN et favorisent la formation de protrusion via l'activation de la petite
GTPase Rac1 (Theveneau et al., 2010 ; Belmadani et al., 2005; Shellard et al., 2018).
*Figure 7-119. Le récepteur CXCR4 stimule la
migration des CCN. Les tubes neuraux d'explants
d'embryons de poulet sont marqués avec le DiI (une molécule
lipophile fluorescente qui imprègne la membrane plasmique)
avant que les CCN ne se délaminent. Le DiI ne marque pas
toutes les cellules. Ces tubes neuraux ont été électroporés
avec un shRNA CXCR4 qui produit un ARNi bloquant la
production de la protéine. La séquence ADN codant le shRNA
se trouvait sur un même plasmide qui permet d'exprimer la
GFP (les cellules GFP+ sont des cellules ayant été
électroporées et co-expriment très probablement shRNA
CXCR4). 18h après l'électroporation, les embryons sont
extraits des œufs et observés au microscope confocal. On filme
le déplacement des cellules pendant plusieurs minutes. Le
contour des tissus est indiqué en pointillé. En A-E, on voit une
cellule GFP+ (donc sans doute sans CXCR4) qui se fait
dépasser par une cellule marquée par le DiI mais sans GFP. (F)
La vitesse des cellules des différentes catégories est
quantifiée. (G) Certaines cellules atteignent GS, le ganglion
sympathique, dont le centre (core) neuronal est
immunomarqué par Ben (rouge). Les CCN sont
immunomarquées par l'anticorps HNK1 (vert). On constate
que sans CXCR4, les cellules restent en majorité à la périphérie
du ganglion et n'arrivent pas à atteindre le centre. Source :
https://www.jneurosci.org/content/30/39/13078

505
La sensibilité différentielle aux signaux chémoattractants est un paramètre important de la
migration différentielle des différents types de CCN. Par exemple, dans l’embryon de poulet, les
précurseurs des ganglions sympathiques expriment beaucoup de CXCR4 et sont donc attirés par le
mésenchyme autour de l'aorte dorsale qui exprime SDF1, contrairement aux précurseurs des ganglions
rachidiens qui n'expriment pas CXCR4 et qui restent en position plus dorsale (Kasemeier-Kulesa et al.,
2010).

Les signaux chémoattractants sont concurrencés par des répulsifs de migration, tels que les
sémaphorines (Sema), les éphrines et Slit/Robo (Theveneau et Mayor, 2012), qui s'expriment aux
frontières des voies de migration des CCN et empêchent l'invasion des CCN dans les tissus environnants.
Ces signaux répulsifs inhibent en général l'activité de Rac1, ce qui conduit à l'effondrement des protrusions
migratoires (Bajanca et al., 2019).

La signalisation éphrine évite que les CCN ne pénètrent dans la partie postérieure des somites et
restreignent leur migration dans la partie antérieure.
*Figure 7-120. Les cellules de crêtes neurales ne migrent
que dans la moitié antérieure des somites. Vue latérale
de la région troncale d'un embryon de poulet
immunomarqué avec l'anticorps HNK-1 qui reconnait les
CCN. La partie dorsale est vers le bas. On constate que les
CCN, bien qu'elles sortent uniformément le long de l'axe
antéro-postérieur du tube neural, migrent uniquement
dans la partie antérieure des somites. Photo : Patrick Pla.

Les ligands éphrine (surtout des éphrines-B) sont exprimés à la surface des cellules somitiques et les
récepteurs Eph à la surface des CCN. Si on empêche cette interaction, les CCN envahissent la région
postérieure des somites. Il en résulte notamment un mauvais développement des ganglions rachidiens qui
n'ont plus leur aspect segmenté habituel.
**Figure 7-121. Structure des éphrines et de leur
récepteur Eph. Leur interaction constitue une
communication juxtacrine. Un récepteur Eph a trois
régions distinctes : la région extracellulaire constituée
d'un domaine de liaison au ligand (LBD), d'un domaine
riche en cystéine (CRD) et deux domaines de type
fibronectine-III (FN1 et FN2), le région
transmembranaire (TMD) et la région intracellulaire
constituée de la région membranaire juxta (JM), du
domaine kinase (KD), du motif alpha stérile (SAM) et un
motif de liaison PDZ (PDZ BM). Les ligands ephrinA sont
ancrés à la membrane par glycophosphatidylinositol
(GPI) et ephrinB est transmembranaire. Le terme de
ligand et de récepteur est communément utilisé mais la
signalisation se fait dans les deux sens entre les deux
cellules interactantes. Source :
https://www.mdpi.com/1422-0067/22/16/8593/htm

Les ligands éphrines A ou B ne sont pas passifs et ils peuvent activer une signalisation dans les cellules qui
les expriment. La protéine TBC1d24 est un partenaire de la partie intracellulaire de l'éphrine B2 et il est
indispensable à la migration des CCN céphaliques (Yoon et al., 2018).

506
 **Figure 7-123. L'interaction EphrinB2-TBC1d24 régule la migration des CCN céphaliques chez le xénope. a) Patrons
d'expression de Twist (un marqueur des CCN) ephrinB2 et TBC1d24 étudiés en hybridation in situ d'embryons au
stade 24. Vue latérale, la partie antérieure est à droite. b) Hybridation in situ utilisant la sonde Twist dans des
embryons injectés avec un morpholino (MO) contrôle ou un MO anti-TBC1d24 seule ou avec un ARNm de TBC1d24
résistant au MO. La ligne rouge pointillée indique la distance de migration des CCN du côté injecté de l'embryon au
stade bourgeon caudal. Vue antérieure/dorsale. c) Hybridation in situ utilisant la sonde Twist dans les embryons
injectés avec un ARNg ciblant TBC1d24 et/ou la protéine Cas9. La ligne rouge en pointillé indique la distance de
migration des CCN. d) Le tissu d'explant de crête neurale marqué à la fluorescéine dextran verte (GFD) provenant
d'embryons témoins ou dépourvus d'éphrineB2 ou de TBC1d24 a été échangé avec le tissu d'explant de crête neurale
normal provenant d'embryons marqués à la fluorescéine dextran rouge (RFD) au stade 20 comme indiqué dans le
schéma (gauche). Au stade bourgeon caudal (à droite), on observe que la déplétion de l'ephrineB2 ou de TBC1d24
entraîne des défauts de migration des CCN de manière cellulaire-autonome. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-018-05924-9

L'interaction éphrine B2/TBC1d24 est déclenche une voie de signalisation qui est nécessaire à l'inhibition
de la locomotion par contact que nous verrons plus loin.

La signalisation Slit/Robo empêche spécifiquement les CCN troncales d'entrer dans l'intestin tout en
permettant aux cellules NC vagales (qui donnent le système nerveux entérique) de le faire (De Bellard et al.,
2003). On voit donc l'importance de la régionalisation pour les voies de migration. Chez l'embryon de
poulet, lorsqu'un récepteur Robo dominant négatif est surexprimé dans les cellules NC, il y a une invasion
prématurée des CCN sur la voie de migration dorso-latérale. Slit/Robo empêche donc les premières CCN
sorties du neuroépithélium à entrer dans la voie dorso-latérale, sous l'épiderme, qui est une voie réservée
aux mélanoblastes qui émergent un peu plus tard et patientent dans une zone d'attente, collée contre le
tube neural (Jia et al., 2005). Pour rentrer dans la voie dorso-latérale, les CCN de poulet doivent activer la
signalisation médiée par le récepteur B2 aux endothélines qui est spécifiquement exprimé par les CCN
migrant sur la voie dorso-latérale (Pla et al., 2005). Les autres CCN qui migrent sur la voie ventrale
expriment le récepteur B1 aux endothélines.

Outre les interactions à base de cadhérine, les CCN céphaliques migratrices établissent des jonctions
communicantes (Bannerman et al., 2000; Huang et al., 1998; Waldo et al., 1999) dont la présence influence
leur polarité et leur survie. Tout comme les contacts dépendant de la N-Cadhérine améliorent la réponse à
Sdf1 chez le xénope, les jonctions communicantes affectent la capacité des CCN à polariser et à lire les
signaux externes tels que les sémaphorines (Xu et al., 2006). Cela suggère que, dans les groupes de cellules,
la compétence pour répondre aux signaux externes est contrôlée grâce à des interactions étroites entre les
cellules.

507
Pour leur migration, les CCN sont aussi être sensibles à des signaux mécaniques. Piezo1 est un canal à Ca 2+
mécanosensible et dans les CCN en migration, il contrôle Rac1 et limite la dynamique des points focaux
d'adhésion et la formation des lamellipodes (Canales Coutigno et Mayor, 2021).
*Figure 7-124. Piezo1 inhibe la formation de
lamellipodes dans des CCN en culture sur
fibronectine. (A, B) Des CCN de xénope sont
cultivées sur fibronectine, et expriment LifeAct-
Ruby (LifeAct est un petit peptide qui s'accroche aux
microfilaments d'actine, et il est couplé ici à une
protéine fluorescente Ruby). Les CCN ont été
transfectées avec un morpholino contrôle MO (A) et
ou dirigé contre Piezo1 (Piezo1 MO) (B). Les cellules
sont filmées pendant 20 minutes. Les lamellipodes
sont plus abondants avec Piezo1 MO par rapport au
MO témoin. (C) Quantification de la durée de vie des
lamellipodes en minutes. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/148/23/dev200001/273600/The-mechanosensitive-channel-Piezo1-cooperates

Les signaux mécaniques et biochimiques doivent s'intégrer ensuite en une réponse cohérente. Le
mécanorécepteur Piezo1 est par exemple indispensable à l'action répulsive des sémaphorines Sema3A et
Sema3F.
**Figure 7-125. Intégration de signaux biomécaniques et
biochimiques lors de la migration des CCN. Vue latérale
d'un embryon de xénope avec les flux de CCN migrantes
dans les arcs branchiaux dessinés en rose. En bordure
des zones de migration, les sémaphorines inhibent
l'activité de Rac1. Le canal mécanosensible Piezo1
augmente cette inhibition et les CCN n'étendent plus de
protrusions. En absence de Piezo1, les sémaphorines
n'inhibent pas suffisamment Rac1 et les CCN rentrent
dans le territoire "interdit". Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/148/23/dev200001/273600/The-mechanosensitive-channel-Piezo1-cooperates

Les CCN ne reçoivent pas que des signaux de migration de leur environnement mais échangent aussi des
signaux entre elles. Ce n'est pas étonnant car elles migrent en groupe assez serré. L'une des propriétés mises
en évidence est l'inhibition de la locomotion par contact. Lorsqu'une CCN entre en contact avec une autre
CCN, elle change de direction.

508
 *Figure 7-126. Inhibition de la locomotion par contact.
D'après https://journals.biologists.com/dev/article/144/13/2456/48131/PDGF-controls-
contact-inhibition-of-locomotion-by

Cette propriété est liée à la polarité planaire et le récepteur Frizzled associé à cette voie est rapidement
déployé aux zones de contact entre les cellules et active la petite GTPase RhoA qui agit sur ROCK qui
réorganise le cytosquelette (Carmona-Fontaine et al., 2008). La N-cadhérine qui est exprimée dans les CCN
de xénope est aussi impliquée (Scarpa et al., 2015), ce qui n'est pas forcément le cas dans d'autres modèles
comme le poulet où la N-cadhérine est réprimée lors de la migration initiale des CCN. Le rôle de la polarité
planaire a aussi été remis en cause chez les Mammifères (Pryor et al., 2014). Il semble donc que le détail des
mécanismes des CCN soit très dépendant du modèle et aussi du stade et de l'environnement de la migration.
**Figure 7-127. Présence ou non de hiérarchie frontale
des CCN au cours de leur migration chez l'embryon de
poisson-zèbre. Chez ces deux modèles, les CCN troncales
ont une cellule leader bien identifiée lors de leur
migration et son ablation par un laser abolit la
directionalité du mouvement de tout le groupe de
cellules tandis que les CCN céphaliques ont plusieurs
cellules qui peuvent se trouver au front de migration et
ces cellules peuvent échanger leur position avec d'autres
cellules au cours du temps. Source :
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-
1247(16)30511-3

La présence et l'importance de cellules leader dans certains cas a été soulignée par des études de
transcriptomiques où les gènes transcrits dans les cellules leader présentent des spécificités notables par
rapport aux gènes transcrits dans les cellules plus en arrière. Cela peut provenir autant de propriétés
intrinsèques des cellules que par le fait qu'elles se trouvent dans des environnements différents (McLennan
et al., 2015)

Différentes modélisations ont été faites pour comparer les capacités de migration de groupes de cellules
avec des fractions variées de cellules qui peuvent devenir leaders : voir cette vidéo : https://static-movie-
usa.glencoesoftware.com/mp4/10.1242/330/196dd4165a2eb67140a99087d48da1666f1f037f/DEV117
507-Video1.mp4

Chez le poisson-zèbre, l'assignation des cellules en position leader ou en position "suiveur" dépend de la
voie Notch : une forte signalisation Notch détermine les leaders et une faible signalisation Notch détermine
les cellules "suiveur" (Alhashem et al., 2022).

La position de leader et de suiveur peut avoir un impact sur le devenir des cellules. Par exemple, dans les
NCC troncales du poisson-zèbre, les cellules leaders deviennent toujours les dérivés les plus distaux (les

509
neurones du système sympathique exprimant Phox2b) tandis que des dérivés proximaux tels que les
ganglions rachidiens dérivent entièrement des cellules suiveuses (Alhashem et al., 2022).

Durant leur migration, les CCN peuvent aussi envoyer des signaux dans leur environnement et influencer le
développement des tissus aux alentours. En effet, si par exemple, on enlève les CCN céphaliques, on observe
bien sûr une absence de leurs dérivés mais aussi de graves défauts d'organisation du cerveau. Les CCN
migrantes céphaliques sécrètent Gremlin et Noggin qui inhibent les BMP. Cette inhibition est nécessaire à
l'activation de l'expression de FGF8 tout à l'avant du tube neural dans une région organisatrice pour le
cerveau antérieur appelé ANR (pour Anterior Neural Ridge) (Ohkubo et al., 2002).

Multipotence et détermination des CCN

Les cellules des crêtes neurales sont considérées comme multipotentes car elles sont capables de
générer de multiples types cellulaires mais de manière plus restreinte que les cellules
pluripotentes. Dans le cas des CCN céphaliques, elles sont tout de même capables de générer des
dérivés typiquement mésodermiques (cartilage, os) en plus de dérivés ectodermiques. Elles
réactivent pour ce faire transitoirement l'expression du gène de pluripotence Oct4 (Zalc et al., 2021).
Cependant, elles ne donnent pas de dérivés endodermiques donc le terme de multipotence
s'applique tout de même.

*Figure 7-128. Le développement des cellules des crêtes neurales céphaliques remis dans le contexte du diagramme
de Waddington. Grâce à une expression transitoire de Oct4, les cellules de crêtes neurales céphaliques regagnent en
potentialités et peuvent générer des cellules mésodermiques. Source :
https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.abb4776

510
 **Figure 7-129. Rôle de CHD7 et des facteurs de multi/pluripotence Oct3/4, Sox2 et Nanog sur l'expression de Sox10
et FoxD3 dans des cultures de cellules de la crête neurale du tronc de souris. (A) Après leur sortie de tubes neuraux
troncaux de souris en culture, les cellules de la crête neurale ont été exposées à BMP2 et Wnt3a des jours 2 à 6 en
culture. Les siARN indiqués ou le vecteur permettant l'expression de CHD7 (une ADN-hélicase capable de remodeler
la chromatine) a été ajouté aux cultures du jour 2 à 3 de culture. (B-F) Immunofluorescence avec des anticorps anti-
FoxD3 et Sox10 ainsi qu'un marquage DAPI des cellules après 6 jours de culture. Les cellules co-expriment FoxD3 et
Sox10 comme des cellules de crêtes neurales in vivo. (G-I) Pourcentage de cellules exprimant FoxD3 et/ou Sox10 par
rapport au nombre total de cellules dans les conditions indiquées en abscisses. Le traitement BMP2+Wnt3a
augmente la proportion de cellules de crêtes neurales co-exprimant FoxD3 et Sox10 mais en l'absence des facteurs
de pluri/multipotence Oct3/4, Sox2, Nanog ou aussi de l'hélicase CHD7, le niveau de crêtes neurales FoxD3 +/Sox10+
revient à un niveau basal. Source : https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/febs.13843

Le développement de CCN est classiquement considéré comme une série d'étapes de décisions binaires sur
le destin des cellules (Dupin et al., 2018). Quand et comment les NCC franchissent ces étapes de
détermination et de pertes de potentialité successives est une question déterminante. Les premières études
sur les embryons de xénope et de poulet ont suggéré que les CCN en migration sont multipotentes,
nécessitant des signaux de l'environnement migratoire pour initier la différenciation (Bronner-Fraser et
Fraser, 1989; Collazo et al., 1993). D'autres études sur le poisson zèbre, la caille et le poulet ont suggéré que
les potentialités des CCN sont souvent restreintes avant la migration, et donc que les réseaux de régulation
génique dans le tube neural doivent spécifier les CCN vers différentes lignées avant que les cellules ne
deviennent migratrices (Henion et Weston, 1997 ; Schilling et Kimmel, 1994; Krispin et al., 2010).

511
 **Figure 7-130. Des CCN, qui migrent habituellement ventralement, détournées vers la voie de migration des
mélanoblastes gardent leur spécification neurale. Les expériences sont faites à E3, à un stade de l'embryon de poulet
où les CCN qui émergent du tube neural ne migrent que sur la voie ventrale et donnent des cellules nerveuses dont
des précurseurs neuronaux exprimant Cash1, Islet-1, FoxD3 et TrkC (I-L). HNK-1 marque les CCN. On électropore les
CCN avec un vecteur d'expression de EdnRB2 qui oriente la migration des CCN vers la voie dorso-latérale
(habituellement empruntée uniquement par les mélanoblastes). Les CCN électroporées continuent néanmoins à
activer l'expression des quatre gènes exprimés dans les précurseurs neuronaux. Cela montre que leur détermination
neurale a déjà été effectuée avant d'emprunter une voie de migration. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/137/4/585/44210/Evidence-for-a-dynamic-spatiotemporal-fate-
map-and

Jusqu'à récemment, la compréhension des changements transcriptionnels associés aux différentes étapes
du développement de la CCN reposait sur l'analyse de l'expression des gènes dans des tissus entiers et des
expériences de gain et de perte-de-fonction qui modifient l'expression des gènes "en masse" (Simoes-Costa
et al., 2014). Cependant, les tissus en développement sont souvent hétérogènes sur le plan transcriptionnel,
un fait clairement en évidence par les récents développements dans le séquençage de l'ARN sur cellule
unique (scRNA-seq) (Briggs et al., 2018; Farnsworth et al., 2020; Chong-Morrison et Sauka-Spengler, 2021
; Soldatov et al., 2019 ; Zalc et al., 2021; Lencer et al., 2021). De plus, comme les cellules dans les tissus sont
souvent à différents stades de spécification, le scRNA-seq a le potentiel d'exposer des changements
transcriptionnels associés à la détermination qui auraient été manqués jusque-là. Par exemple, chez le
poulet, des études scRNA-seq de CCN céphaliques en migration ont identifié des signatures
transcriptionnelles uniques associées à une population de cellules au bord des flux de migration que rien
morphologiquement ne distinguaient des autres (Morrison et al., 2021). Tout modèle de développement
des CCN doit tenir compte de cette hétérogénéité.

Développement d’une sélection de lignages

> Ganglions de la racine dorsale

*Figure 7-131. Dissection de la grenouille mettant en évidence quelques nerfs rachidiens (le nerf brachial (nerf II) et
le nerf sciatique (nerf IX)). La grenouille a 10 nerfs rachidiens au total dont la composante sensorielle est formée par
des neurones et des cellules gliales dérivés des cellules de crête neurale. La composante motrice de ces nerfs (les
axones des motoneurones) ne provient pas des cellules de crêtes neurales : les motoneurones sont en effet générés
directement à partir du tube neural. Photo : Patrick Pla à partir d'une dissection faite par les étudiants de la
Préparation à l'Agrégation SV-STU de l'Université Paris-Saclay.

512
 *Figure 7-132. Organisation des nerfs rachidiens à proximité de la moelle épinière. D'après
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/2-organos-a/guiada_o_a_01medula.php

*Figure 7-133. Coupe de ganglion de la racine dorsale de

rat (coloration trichrome Mallory). On observe une
grande densité de corps cellulaires de neurones. Source
: https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/a-
imagenes-grandes/nervioso_ganglio.php

Les nerfs rachidiens sont des nerfs mixtes avec des voies sensitives afférentes à la moelle épinière
et des voies motrices efférentes partant de la moelle épinière. Les deux types de neurones qui
génèrent les dendrites et les axones dans les deux cas n'ont pas du tout la même origine
embryologique. Les neurones sensitifs ont pour origine les CCN tandis que les neurones moteurs (ou
motoneurones) proviennent de progéniteurs déterminés dans la région ventrale du tube neural
(sous l'influence du morphogène Shh).

Les corps cellulaires des neurones sensitifs se trouvent dans les ganglions de la racine dorsale ou
ganglions spinaux. Ces ganglions sont répétés le long de l'axe antéro-postérieur car, malgré une
délamination des CCN du tube neural répartie également, les CCN migrent seulement à travers
antérieure des somites, repoussés de la partie postérieure par la signalisation éphrine et
sémaphorine.

Les neurones sensoriels des DRG se caractérisent selon trois modalités perceptives, proprioceptive,
mécanoréceptif et (thermo-)nociceptif. Les neurones de grand diamètre comprennent des propriocepteurs
qui sont sensibles aux mouvements et à la position des membres, et les mécanorécepteurs qui transmettent
des sensations mécaniques. Les récepteurs nociceptifs ont un petit diamètre et répondent aux stimuli
thermiques et de douleurs.

513
 *Figure 7-134. Un corpuscule de Meissner, un
mécanorécepteur de la peau dérivé des CCN. Il se trouve
dans une papille dermique. C'est un mécanorécepteur à
adaptation rapide qui est sensible au toucher léger. Il est
très répandu dans les zones très sensibles tels que les
doigts, les lèvres et la langue. Il est constitué d'une
disposition en spirale des terminaisons de six axones
myélinisés qui se terminent entre des couches de cellules
de Schwann spécialisées, très fines et aplaties, appelées
cellules lamellaires. Toutes ces cellules sont des dérivées
de CCN. Source : https://fr.wikipedia.org/wiki/Corpuscule_de_Meissner#/media/Fichier:WVSOM_Meissner's_corpuslce.JPG

Chaque type neurone sensoriel exprime un patron spécifique de caractéristiques moléculaires comprenant
des canaux ioniques, des récepteurs aux facteurs neurotrophiques, des neurotransmetteurs entre autres.
Dans le DRG, les neurones nociceptifs sont dans la région dorso-médiale tandis que les neurones
proprioceptifs et mécanoréceptifs sont situés dans la région latéro-ventrale. Il est à noter qu'il existe des
différences importantes entre les espèces : par exemple, une sous-population importante de neurones qui
co-expriment TrkA et RET est observée dans les DRG humains, mais est absente des DRG de souris (Rostock
et al., 2018).

Chez la souris, la délétion homozygote du gène codant la Neuropiline-1, le récepteur de la sémaphorine 3A

qui s'exprime dans la partie postérieure des somites, aboutit à des ganglions rachidiens fusionnés (Schwarz
et al., 2009).
*Figure 7-135. La signalisation Sémaphorine
3A/Neuropiline 1 est nécessaire pour que les ganglions
rachidiens soient segmentés. Vue dorsale d'embryons de
souris sauvages et knock-out Nrp1-/- (n'exprimant pas la
Neuropiline-1) traités en hybridation in situ avec une
sonde reconnaissant l'ARNm de Brn3a, un marqueur de
neurones sensoriels. Source :
https://www.pnas.org/content/106/15/6164.long

La migration des CCN qui donnent les neurones des ganglions rachidiens dépend de SDF-1 reçu par le
récepteur CXCR4 exprimé par les CCN (Belmadani et al., 2005).

Sox10 est exprimé de manière transitoire dans le lignage des neurones sensitifs et active l'expression du
gène proneural Neurogénine-1 (Ngn1) (Carney et al., 2006). Chez l'embryon de poulet, lorsqu'on surexprime
Ngn1, on retrouve une grande partie des cellules infectées dans les DRG et si on fait une surexpression plus
tardive, les cellules dans les ganglions sympathiques se mettent à exprimer des marqueurs habituellement
trouvés dans les DRG, et dans les nerfs en développement, des CCN qui auraient donné des cellules gliales
expriment des marqueurs de neurones sensoriels des DRG (Perez et al. 1999).

514
 *Figure 7-136. Expression ectopique de marqueurs de
neurones sensoriels induite par Neurogénine-1 dans des
dérivés de crêtes non sensorielles.
Les embryons de poulet ont été infectés avec RCAS-
mNGN-1 (m pour mouse (souris) pour la distinguer de
l'expression de la neurogénine-1 endogène) par
injection virale dans la voie de migration ventrale des
CCN à HH 13-15. Les embryons sont fixés au stade HH27
et coupés et traités en hybridation in situ avec les sondes
adéquates. (A,B) Coupes adjacentes d'un animal
présentant une infection dans les ganglions
sympathiques (SG, flèches). (A) Les ganglions
sympathiques sont détectés par le marqueur pan-
neuronal SCG10. (B) L'expression ectopique du
marqueur sensoriel, NSCL-2, est observée du côté infecté
de l'embryon. (C-F) Coupes adjacentes d'un embryon
présentant une infection des cellules gliales le long du
nerf périphérique. (C) Le nerf est détecté par la
coloration TuJ1 et entouré d'une ligne discontinue. Les
cellules associées au nerf expriment de façon ectopique
le marqueur panneuronal SCG10 (D) et les marqueurs
des neurones sensoriels, NeuroD-L (E) et NSCL-2 (F).
Source : Perez et al., 1999

La perte-de-fonction de Ngn1 chez le poisson-zèbre aboutit à la disparition des neurones sensoriels

montrant qu'il est nécessaire à leur développement. Un autre lignage nerveux dérivés des crêtes neurales
comme le système nerveux autonome n'est pas affecté (Cornell et Eisen, 2002).

*Figure 7-137. Neurogénine 1 (ngn1) est nécessaire au développement des neurones sensitifs. Des embryons de
poisson-zèbre de 4 jours sont observés en vue latérale et traités en immunohistochimie avec un anticorps anti-
αHu qui reconnait les neurones. Chez des embryons non injectés (à gauche) on observe bien les ganglions
rachidiens répétés le long de l'axe antéro-postérieur alors que dans des embryons injectés avec 1,5 ng d'un
morpholino inhibant la production de Neurogénine-1, les ganglions ne sont plus présents. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/129/11/2639/41672/Delta-Notch-signaling-promotes-formation-
of

Ngn2 est exprimé de manière précoce par les CCN chez la souris qui sont fortement biaisées vers un destin
de neurones sensoriels ou des glies associées par comparaison avec les neurones sympathiques. Malgré
cela, les NCC exprimant Ngn2 ne sont pas engagés dans un destin neuronal, elles peuvent générer à la fois
des neurones et de la glie (Zirlinger et al., 2002), contrairement à Ngn1 qui oriente vers un destin neuronal.
En absence de Ngn2, certaines cellules qui auraient dû faire partie du système nerveux somato-sensoriel
viennent participer à la deuxième vague de production de mélanoblastes qui migrent vers l'épiderme à
partir de structures profondes (voir la partie sur les mélanocytes).

515
 *Figure 7-138. En absence de Neurogénine-2, il y a
plus de mélanocytes produits par les CCN. (H-K)
Hybridations in situ pour Mitf sur des embryons WT
(H et J) et Neurog2-/- (I et K) sur des coupes
transversales de DRG thoracique (H et I) ou sur des
embryons entiers en vue latérale (J et K) à E11.5. Source
: https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(19)31473-1

Entre les deux neuropilines, Nrp1 et Nrp2, qui sont des récepteurs de sémaphorines, Nrp2 est spécifique
des NCC troncs qui vont générer les neurones DRG (Lumb et al., 2014).

**Figure 7-139. Les CCN troncales exprimant Neuropiline2 donnent très préférentiellement des neurones des DRG.
Une méthode de traçage de lignage utilisant un système CreLox inductible impliquant le promoteur du gène codant
la Neuropiline-2 (Nrp2-CreERT2/Kikume X R26R) a été mise en œuvre chez la souris. Les cellules exprimant la
Neuropiline-2 expriment aussi la beta-galactosidase. Coupes transversales d'embryons de souris à E11,5 colorées
avec le X-gal (vu en microscopie classique, BF) et traitées en immunofluorescence avec un anticorps reconnaissant
Tuj1 (neurones sensoriels du DRG entre autres) et TH (exprimé dans le système nerveux sympathique). En E, F, les
pointillés entourent le DRG et en G-I, ils entourent des ganglions sympathiques. Source :
https://neuraldevelopment.biomedcentral.com/articles/10.1186/1749-8104-9-24

La majorité des CCN migrantes et post-migratoires dans le DRG expriment le récepteur au NGF de faible
affinité p75 (Hapner et al., 1998). Chez la souris, les NCC co-expriment p75 et Sox10 pendant le
développement précoce du DRG. Au fur et à mesure que le développement progresse, à partir du jour
embryonnaire E10, les cellules gliales conservent l'expression de Sox10 alors que les neurones expriment
uniquement le récepteur p75 (Sonnenberg-Riethmacher et al., 2001).

Outre p75, les CCN en migration expriment le récepteur tyrosine kinase au BDNF, TrkC, qui est maintenu à
la fois dans les neuroblastes en prolifération et les neurones postmitotiques (Henion et al., 1995; Rifkin et
al., 2000). Le BDNF accroit plus de 20 fois a production de neurones sensoriels dans des cultures in vitro de
CCN (Sieber-Blum, 1991).

De manière assez surprenante, la moitié des nocicepteurs (les neurones "récepteurs de la douleur") chez
l'embryon de poulet provient de CCN contralatérales, c'est-à-dire qui effectuent leur EMT et se déplacent
d'abord un peu d'un côté du tube neural puis migrent dorsalement passant par-dessus le tube dorsal et
arrivent dans le DRG de l'autre côté par rapport à leur délamination (George et al., 2007).

Les premiers NCC post-migratoires activent l'expression du facteur de transcription forkhead Foxs1 qui est
nécessaire pour une différenciation neuronale sensorielle. Brn3a est aussi un marqueur spécifique. Les
premiers neurones sensoriels sont positionnés dans la partie ventrolatérale du DRG, tandis qu'à partir de
E10.5, des CCN deviennent des neurones dans la partie dorso-médiale. Les neurones ventrolatéraux ont une
516
plus grande taille tandis que ceux situés dans la région dorso-médiale sont plus petits et ont un cytoplasme
dense. Ces deux populations sont séparées par une limite assez nette. À E12,5, l'activité mitotique cesse
dans le domaine ventrolatéral, mais elle reste présente dans le domaine dorso-médial.

Une population particulière contribue à une dernière vague de prolifération/différenciation dans les DRG :
les cellules de la cap (ou coiffe) qui sont des CCN qui forment des amas à la surface du tube neural, aux
points d'entrée et de sortie des racines nerveuses périphériques. Ces cellules sont les seules au niveau
troncal à exprimer Krox20. Les cellules de la coiffe migrent le long des axones périphériques et colonisent
les racines des ganglions et des nerfs rachidiens. Tous les précurseurs de cellules de Schwann occupant les
racines dorsales sont dérivés de ces cellules. Dans le DRG, les cellules dérivées de la coiffe sont des
progéniteurs à la fois de neurones, principalement nociceptifs (contribuant à 5% des neurones nociceptifs
totaux) et des cellules gliales satellites (aussi appelées amphicytes et qui entourent le corps cellulaire des
neurones dans les ganglions) (Maro et al., 2004).
**Figure 7-140. Cellules gliales satellites entourant les
corps cellulaires de neurones sensoriels dans un
ganglion rachidien. Ces cellules dérivent de CCN
particulières appelées cellules de la coiffe. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Satellite_glial_cell#/media/File:1318b_DRG.jpg

À partir de E11,5 pour les neurones ventrolatéraux et à partir de E12,5 pour les neurones dorsomédians
commencent l'apoptose qui élimine l'excès de neurones produits par sélection.

Bien que les neurogénines puissent initier des programmes pan-neuronaux, elles ne peuvent pas préciser
davantage les sous-types neuronaux dans la lignée sensorielle. Les premiers marqueurs des neurones
sensoriels sont les récepteurs transmembranaires tyrosine-kinase TrkA, TrkB et TrkC (Huang et Reichardt,
2003). De plus, d'autres récepteurs de la tyrosine kinase peuvent être détectés lors de la neurogenèse dans
le DRG notamment le récepteur Ret (Bourane et al., 2009).

Le récepteur TrkA est exprimé par des neurones nociceptifs de petite taille (50 % des neurones DRG), TrkB
est exprimé par les mécanorécepteurs intermédiaires ou de taille moyenne (38-40%) et TrkC par les grands
neurones proprioceptifs (10-12%). De plus, certains d'entre eux peuvent transitoirement exprimer
plusieurs Trk. Par exemple, au stade précoce du développement, quelques neurones TrkA+ expriment
transitoirement TrkB ou TrkC (Zou et al., 2012) tandis qu'un groupe de neurones TrkB+ peut également
être transitoirement TrkC+. La population des cellules hybrides TrkA/TrkC ont un diamètre plus grand que
les neurones TrkA+ (McMahon et al., 1994).

Ces récepteurs tyrosine kinase transduisent la signalisation de neurotrophines spécifiques : NGF se fixe sur
TrkA; BDNF et la neurotrophine-4/5 (NT-4/5) sont les ligands de TrkB, (c) la neurotrophine-3 (NT-3) se lie
à TrkC et la famille des facteurs neurotrophiques dérivés des cellules gliales (GDNF) se lient au récepteur
Ret (Bourane et al., 2009; Huang et Reichardt, 2001 ; Luo et al., 2009 ; Marmigère et Ernfors, 2007). De plus,
le récepteur à faible affinité p75 est exprimé par presque tous les neurones sensoriels Trk+ (Wright et
Snider, 1995), et il module la signalisation des neurotrophines, en concentrant les neurotrophines à
proximité de récepteurs tyrosine kinases ou en améliorant le transport des neurotrophines (Lee et al., 1994;
Verdi et al., 1994).

517
 **Figure 7-141. Liaison des neurotrophines à leurs récepteurs. Toutes les neurotrophines se lient avec une faible
affinité au récepteur p75NTR. NGF se lie avec une haute affinité à TrkA, et BDNF se lie avec une haute affinité à TrkB.
La neurotrophine-3 (NT-3) se lie avec une haute affinité à TrkC et peut se lier avec une faible affinité à TrkA ou TrkB
selon le contexte cellulaire. CR : domaine de répétition riche en cystéine, C : cluster riche en cystéine, LRR : domaine
de répétition riche en leucine, Ig : domaine de type immunoglobine. Les lignes pleines indiquent une liaison de haute
affinité, les lignes pointillées indiquent une liaison de faible affinité. Source : https://www.mdpi.com/1422-
0067/18/3/548

La signalisation résultant de l'activation de ces récepteurs par la liaison des neurotrophines est cruciale
pour la prolifération et la survie cellulaires, la croissance des axones et des dendrites et la formation des
synapses. Les souris knock-out pour les différents récepteurs et leurs différents ligands présentent des
pertes de populations de neurones sensoriels qui correspondent au patron d'expression. Par exemple, les
souris TrkA-/- ou NGF-/- n'ont plus de petits neurones nociceptifs.

Le régulateur de la transcription PRDM12 qui a une activité histone méthyltransférase est co-exprimé avec
TrkA dans les précurseurs nociceptifs et contrôle le développement des neurones correspondants. Des
patients atteints d'une mutation perte-de-fonction dans le gène Prdm12 présentent une insensibilité
congénitale à la douleur (Chen et al., 2015).

*Figure 7-142. PRDM12 est nécessaire au bon développement des nocicepteurs. (L) Membres antérieurs
immunomarqués avec un anticorps reconnaissant la périphérine (PERIPH) dans des embryons de souris à E14.5 qui
révèle une diminution générale de l'innervation des membres (les têtes de flèche pointent vers le même nerf dans
les embryons Prdm12+/+ et Prdm12-/-). Dans les encarts, les pointes de flèches indiquent une ramification nerveuse
réduite dans les embryons Prdm12-/-. Barre d'échelle = 100 μm.
(M) Immunomarquages TrkA (nocicepteurs dans le DRG et neurones de ganglions sympathiques) et NeuN (tous les
neurones différenciés) sur des coupes transversales d'embryons Prdm12+/+ et Prdm12-/- à E18,5. Alors que les
neurones TrkA+ dans le DRG et leurs projections dans la moelle épinière (SC) sont absents dans les embryons
Prdm12-/-, l'expression de TrkA dans les ganglions sympathiques (SG) n'est pas affectée. Barre d'échelle = 200 μm.
Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124719302840

518
 > Le système nerveux entérique

Le bon fonctionnement du tractus gastro-intestinal repose sur de nombreux types de cellules spécifiques à
des endroits précis travaillant ensemble de manière étroitement coordonnée. Les neurones entériques et la
glie du système nerveux entérique sont organisés en deux plexus nerveux concentriques et interconnectés
noyés dans la paroi intestinale : le plexus submucosal et le plexus myentérique. Dans chaque plexus, les
neurones entériques et la glie sont disposés en grappes appelées «ganglions», qui sont liés par des faisceaux
de fibres interganglionnaires pour former un réseau caractéristique en forme de maillage. Ce vaste réseau
neuronal innerve toute la longueur du tractus gastro-intestinal, allant de l'œsophage, de l'estomac, de
l'intestin grêle (c.-à-d. duodénum, jéjunum et iléon) et du caecum (ou appendice chez l'homme), jusqu'à
l'extrémité du gros intestin.

Le réseau du système nerveux entérique contrôle l'activité musculaire qui permet de faire avancer
le contenu de la lumière intestinale à travers le tractus. Le système nerveux entérique est la division
la plus grande et la plus complexe du système nerveux périphérique comprenant des millions de
cellules nerveuses et glies qui lui permettent de détecter et d'intégrer des informations et d'exercer
un contrôle moteur approprié (Fung et Vanden Berghe, 2020).
**Figure 7-143. Composants neuronaux du circuit
entérique. Les neurones sensoriels forment des
réseaux interconnectés englobant la circonférence de
la paroi intestinale et assurent une innervation
étendue de l'épithélium muqueux. Dans le plexus
myentérique (PM), les interneurones forment des
chaînes le long de l'intestin, les interneurones
ascendants se projetant vers la bouche et les
interneurones descendants se projetant vers l'anus.
Les motoneurones myentériques excitateurs et
inhibiteurs innervent le muscle circulaire (CM) et le
muscle longitudinal (LM), tandis que les neurones
sécrétomoteurs du plexus sous-muqueux (SMP) se
projettent vers la muqueuse. Source :
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00018-020-03543-6

***Figure 7-144. Fonctionnement du circuit entérique

lors du réflexe péristaltique. Les neurones sensoriels
intrinsèques sont connectés avec les interneurones
ascendants et descendants qui forment des chaînes le
long de l'intestin, ainsi qu'avec les motoneurones
excitateurs et inhibiteurs. Les interneurones innervent
également des motoneurones qui alimentent à leur tour
les muscles circulaires et longitudinaux (musculature
représentée par des lignes grises ; notez que les
différentes couches musculaires et leur innervation ne
sont pas dessinées). Lors de la détection d'un stimulus
dans la lumière intestinale, l'activation des
interneurones ascendants connectés aux motoneurones
excitateurs provoque une contraction du côté oral,
tandis que l'activation des interneurones descendants
connectés aux motoneurones inhibiteurs provoque une

519
 relaxation du côté anal pour propulser le contenu. La glie
entérique qui provient également des cellules de crêtes
neurales joue aussi un rôle actif dans la régulation de la
motilité intestinale. Source :
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00018-020-03543-6

Il est essentiel que l'innervation intestinale se développe correctement. Dans les cas extrêmes, les
progéniteurs neuraux ne colonisent pas l'intégralité de l'intestin provoquant une aganglionose,
dans laquelle la partie la plus distale du gros intestin est laissée sans innervation (Lake et Heuckeroth,
2013). Cela provoque la maladie de Hirschsprung potentiellement mortelle, qui survient dans environ une
naissance sur 5000 (Heanue et Pachnis, 2007; Lake et Heuckeroth, 2013). Néanmoins, même lorsque des
ganglions entériques se développent, des erreurs dans leur assemblage peuvent encore avoir des
conséquences graves, telles qu'une pseudo-obstruction intestinale idiopathique chronique (Gershon, 2009;
Rao et Gershon, 2018). En outre, des défauts de développement subtils dans les circuits peuvent également
avoir des implications significatives sur la fonctionnalité du tractus gastro-intestinal (Sasselli et al., 2013).

Chez la souris, les CCN vagales pénètrent d'abord dans l'intestin antérieur lors du jour
embryonnaire E9,5 et migrent vers la région postérieure. Elles prolifèrent et se différencient en
neurones et cellules gliales derrière le front d'onde migratoire (Young et al., 1998). Au fur et à mesure que
l'intestin s'allonge, il forme un coude à ∼E11, de sorte que l'intestin moyen est brièvement apposé
étroitement à l'intestin postérieur. Entre E11 et E12, certaines CCN traversent directement le mésentère de
l'intestin moyen à l'intestin postérieur, en contournant le caecum. Ces CCN «transmesentériques» donnent
naissance au moins aux deux tiers distaux du système nerveux entérique de l’intestin postérieur, la moitié
distale étant presque exclusivement issue de cette population (Nishiyama et al., 2012). À mesure que les
CCN vagales arrivent, l'intestin postérieur augmente également en longueur. À E13,5, un plus petit groupe
de CCN sacrées pénètrent dans l'intestin postérieur et migrent vers l’avant (Wang et al., 2011). Les CCN
vagales atteignent alors l'extrémité de l'intestin à environ E14,5.
*Figure 7-145. Migration des cellules de crêtes
neurales vagales le long de l'intestin chez la souris.
Notez aussi la présence de quelques cellules de crêtes
neurales sacrales dans la partie la plus postérieure
qui contribuent également au système nerveux
entérique. Source : doi:10.1242/dev.182543

À cette période, les neurites myentériques de l'intestin grêle commencent à se projeter radialement vers la
muqueuse (Hao et al., 2020). Bien que l'activité électrique et les oscillations spontanées des concentrations
d'ions Ca2+ soient détectées dans le système nerveux entérique en développement dès E11.5 (Hao et al.,
2011), l'activité motrice neurogène n'est observée qu'à partir de E18.5 dans le duodénum (Roberts et al.,
2010) et à partir de P10 dans le côlon (Roberts et al., 2007). Les propriétés électrophysiologiques du
développement des neurones entériques continuent de maturer après la naissance (Foong et al., 2012). La
période entre le début de l'activité électrique et la pleine fonctionnalité du système nerveux entérique est
probablement une période importante pendant laquelle se produit la formation de connexions synaptiques
entre différents neurones et leurs diverses cibles cellulaires (Hao et al., 2013).

Le développement du système nerveux entérique humain se produit à travers une colonisation similaire,
dans lequel les CCN empruntent une voie migratoire similaire à celle des embryons de souris et de poulet
entre la 4ème et la 7ème semaine embryonnaire (Fu et al., 2003; Wallace et Burns, 2005; Obermayr et al.,
2013). Par la suite, le développement des ganglions myentériques se produit à partir des semaines 7 et 14
et coïncide avec la différenciation des muscles lisses. Le système nerveux entérique humain affiche des
520
réponses Ca2+ évoquées électriquement à la semaine 16, et ce moment coïncide avec l'expression de
neurotransmetteurs clés et de protéines synaptiques (McCann et al., 2019).

La migration des CCN dans l'intestin et leur développement sont influencés par le nombre de cellules,
l'interaction cellule-cellule médiés par les molécules d'adhésion cellulaire, les interactions avec la MEC et
les facteurs sécrétés par le mésenchyme (Young et al., 2004). Deux voies de signalisation, GDNF et son
récepteur/co-récepteur RET/GFRα1 et l'endothéline-3 (EDN3) et son récepteur de type B de l'endothéline
(EDNRB), sont considérées comme les plus importantes dans ce contexte (Heuckeroth et al., 1998; Young
et al., 2001; Gianino et al., 2003; Uesaka et al., 2013; Bondurand et al., 2018). Les mutations dans l'une ou
l'autre de ces voies convergent vers un phénotype pathologique de syndrome de Hirschsprung (HSCR) avec
le dernier segment du tractus gastro-intestinal vide de neurones entériques (Puffenberger et al., 1994;
Romeo et al., 1994; Schuchardt et al., 1994; Amiel et al. , 1996; Shimotake et al., 2001).

RET est un membre de la superfamille des récepteurs transmembranaires tyrosine kinases, et il est présent
dans tous les CCN entériques lorsqu'ils migrent à travers l'intestin. L'activation du RET par le GDNF est
cruciale pour la survie des précurseurs (Heuckeroth et al., 1998; Taraviras et al., 1999), la prolifération
(Heuckeroth et al., 1998; Gianino et al., 2003), la migration (Natarajan et al., 2002), la différenciation et la
croissance des neurites (Young et al., 2001).
*Figure 7-146. Les CCN entériques en culture nécessitent
la présence de GDNF ou de nerturine (NTN, un autre
ligand de RET) pour survivre et se différencier. Les
cellules RET+ ont été isolées de l'intestin d'embryons de
rat et placées dans un milieu déterminé en culture haute
densité (en haut) ou basse densité (en bas). En l'absence
de facteurs neurotrophiques, toutes les cellules des
cultures à haute densité sont mortes à la fin du troisième
jour. En présence de GDNF ou de NTN, les cellules ont
survécu pendant au moins 10 jours. Les photos ci-dessus
montrent de telles cultures à haute densité qui ont été
fixées et marquées par immunofluorescence avec des
anticorps reconnaissant Tuj1 (spécifique aux neurones;
vert) et S100 (spécifique aux cellules gliales; rouge) le
9ème jour. La viabilité globale des cultures à faible densité
était réduite par rapport à leurs homologues à haute
densité et elles n'ont donc été conservées que pendant 3
jours. Dans les panneaux du bas, on voit des cellules
RET+ cultivées en l'absence de facteurs neurotrophiques
(D) ou en présence de GDNF (E) ou de NTN (F) et vue
après immunohistochimie avec un anticorps anti-Tuj1.
Notez l'effet spectaculaire des deux facteurs sur
l'étendue de la croissance axonale. Les pointes de flèches
indiquent les neurones Tuj1+ alors que les flèches
blanches indiquent des cellules non neurales. Source :
Taraviras et al., 1999

La perte de la fonction RET provoque une aganglionose intestinale dans tout l'intestin de souris RET-/-
(Schuchardt et al., 1994; Shimotake et al., 2001), et des mutations similaires ont été décrites chez des
patients (Amiel et al., 2008). Outre RET lui-même, le co-récepteur GFRα1 et le ligand GDNF sont également
nécessaires pour activer la voie RET au cours du développement fœtal. Les mutations inactivantes de cette
voie sont responsables de la majorité des cas de HSCR familiaux et sporadiques (Romeo et al., 1994; Angrist
et al., 1996). À l'inverse, la suractivation de cette voie, par exemple par des mutations de gain de fonction
telles que RET-C618F, conduit à une hyperganglionose (Okamoto et al., 2019). In vitro, la capacité des
progéniteurs neuronaux entériques à générer un système nerveux entérique est renforcée par le GDNF
(McKeown et al., 2017). Un certain nombre de facteurs de transcription, notamment SOX10, RARB, GATA2
et PHOX2B, sont tous essentiels pour réguler l'expression de RET (Chatterjee et al., 2017, 2019), et en tant
que tels, ils jouent également un rôle crucial dans le développement du système nerveux entérique. De plus,
Sprouty2 (un inhibiteur de la signalisation du récepteur tyrosine kinase) et la kinésine Kif26A servent de
régulateurs négatifs de la signalisation RET (Taketomi et al., 2005; Zhou et al., 2009). Enfin, la perturbation

521
de l'expression de Hoxb5 entraîne une baisse de l'expression de Ret, une altération de la migration des CCN
et une hypo/aganglionose chez la souris (Lui et al., 2008; Carter et al., 2012; Kam et al., 2014; Kam et Lui,
2015), indiquant une clé rôle de HOXB5 dans le développement des CCN entériques.

La voie de signalisation EDNRB est un autre élément crucial dans le contrôle de la prolifération, de la
différenciation et de la migration des CCN entériques (Bondurand et al., 2018). De nombreuses mutations
causales de la maladie de Hirschsprung proviennent de membres de la voie EDNRB. L'EDNRB est un
récepteur couplé à une protéine G exprimé à la surface des CCN entériques. L'enzyme de conversion de
l'endothéline (ECE) et le ligand EDN3 sont exprimés dans le mésenchyme intestinal pendant le
développement du système nerveux entérique. EDN3 peut également affecter indirectement les CCN
entériques en potentialisant les effets du GDNF. La signalisation EDNRB maintient les CCN entériques dans
un état non differencié, prolifératif et apte à la migration. En son absence, les CCN entériques se différencient
trop vite et il n'y a plus suffisamment de précurseurs pour migrer jusqu'au bout du tube digestif (Lahav et
al., 1998; Bondurand et al., 2006; Nagy et Goldstein, 2006).
**Figure 7-147. EDN3 contribue au maintien des
progéniteurs non différenciés lors de la migration des
CCN entériques le long de l'intestin. Des souris
transgéniques sont créés exprimant la recombinase Cre
sous le contrôle du promoteur de Wnt1 qui cible (entre
autres) son expression dans les CCN. Les cellules qui
activent Cre se mettent à exprimer YFP et l'allèle sauvage
de Edn3 peut être remplacé par l'allèle muté perte-de-
fonction End3ls (soit à l'état hétérozygote, soit à l'état
homozygote). On réalise ensuite une
immunofluorescence avec un anticorps anti-SOX10 qui
reconnait les précurseurs non différenciés. On voit que la
proportion de ces précurseurs baisse parmi les CCN
lorsque l'Edn3 n'est pas produite de manière
fonctionnelle. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/133/10/2075/37569/Maintenance-of-mammalian-
enteric-nervous-system

L'expression du gène codant EDNRB est étroitement régulée car son expression inhibe la différenciation
pendant la phase de migration mais cette expression doit être à son tour inhibée pour que la différenciation
finale ait lieu. Ce sont les facteurs de transcription SOX10 et ZEB2 qui contrôlent directement l'expression
de EDNRB (Watanabe et al., 2017).

La migration des CCN entériques repose également sur leur expression de l'intégrine β1. La délétion
homozygote de cette intégrine dans les CCN entériques arrête leur migration dans l'intestin postérieur
proximal, conduisant à une aganglionose distale (Breau et al., 2009; Gazquez et al., 2016).

522
 *Figure 7-148. Analyse des trajectoires des CCN
entériques dans le cæcum en présence ou absence
d'intégrine β1. (A,B) Exemples de trajectoires
individuelles des CCN entériques au front
migratoire pour l'intestin de souris témoins (A) et
mutantes Itgβ1-/- (B) à E11.5. Les trajectoires
recouvrent la première image du suivi vidéo, les
positions initiales des cellules étant indiquées par
des cercles. Les limites du tissu intestinal sont
indiquées par des lignes pointillées. Les
astérisques indiquent les globules rouges
autofluorescents. (C, D) Directionnalité moyenne
des CCN entériques témoins (C) et mutants (D)
suivis, évaluée en mesurant l'angle entre l'axe
antéro-postérieur de l'intestin et la ligne droite
séparant les positions initiale et finale de la
cellule. Les couleurs des flèches correspondent
aux couleurs des trajectoires en A et B. (E, F)
Vitesse moyenne (E) et persistance (F) des CCN
entériques leaders. La vitesse de chaque cellule a
été calculée en divisant la longueur totale de sa
trajectoire par le temps. La persistance a été
obtenue en divisant la distance entre ses positions
initiale et finale par la distance totale parcourue
par la cellule. Mes = mésentère. Barre d'échelle :
50 μm. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/136/16/2791/65224/1-
integrins-are-required-for-the-invasion-of-the

EDN3/EDNRB agit directement sur les cellules mais influence aussi la matrice extracellulaire. Les souris
déficientes en endothéline 3 (Edn3−/−) ou en récepteur de l'endothéline B (Ednrb−/−) ont une expression
accrue de laminine, de collagène IV (Col4), de perlecan (également connu sous le nom de HSPG2) et d'autres
protéoglycanes qui sont normalement présents dans des zones sans ganglions. Les CCN entériques se
retrouvent donc dans un milieu hostile à leur migration chez les mutants.

La signalisation via c-Jun (JNK) et l'AMPc agit en aval de la signalisation GDNF/RET et EDN3/EDNRB. Des
agents pharmacologiques qui stimulent ou inhibent la signalisation intracellulaire de JNK ou de l'AMPc ont
été utilisés pour identifier les déterminants potentiels de la vitesse et de la directionnalité des CCN
entériques individuelles dans l'intestin de souris E12.5 (Hao et al., 2019). La vitesse de migration est
modulée par la signalisation JNK et AMPc, tandis que la directionnalité et l'adhésion sont régulés par la
signalisation AMPc, mais pas par JNK, ce qui suggère que ces propriétés migratoires des CCN entériques
sont régulées séparément.

Outre les voies de signalisation GDNF/RET et EDN3/EDNRB, un certain nombre d'autres molécules jouent
également un rôle crucial, ou ont un rôle de raffinement, dans la façon dont le système nerveux entérique
est établi. Notamment, Sox10 est un facteur de transcription clé avec des rôles cruciaux dans le maintien de
l'état progéniteur des CCN entériques et dans le développement glial (Bondurand et Sham, 2013).
L'expression de Sox10 est maintenue dans les cellules gliales, alors qu'elle est diminuée lorsque les
progéniteurs se différencient en neurones entériques (Hao et al., 2017).

523
 **Figure 7-149. Différenciation des progéniteurs entériques. Les
cellules progénitrices CCN entériques Sox10+ se divisent puis
déterminent en précurseurs neuronaux et gliaux. Les précurseurs
gliaux et la glie entérique elle-même restent prolifératifs, tandis que
la prolifération des précurseurs neuronaux est limitée. L'expression
de la S100B marque la différenciation des précurseurs gliaux en glie,
mais la façon dont la différenciation des sous-types gliaux se produit
reste inconnue. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5322270/

> Les mélanocytes

La mélanine qui pigmente plus ou moins notre peau est produite par des cellules appelées
mélanocytes, qui se trouvent dispersées dans la couche basale de l'épiderme (vous pouvez trouver
une reconstitution 3D interactive de l'épiderme sur ce site). La mélanine est transférée dans les
kératinocytes par une vésicule cellulaire appelée mélanosome. Ce transfert est facilité par la
morphologie dendritique des mélanocytes avec des prolongements qui s'insinuent vers les couches
sus-jacentes à la couche basale.
*Figure 7-150. Les mélanocytes à l'origine de la
pigmentation de notre peau. La coloration relative de la
peau dépend de la quantité de mélanine produite par les
mélanocytes de la couche basale et de la quantité qui est
absorbée par les kératinocytes.

524
 La mélanine se présente sous deux formes : l'eumélanine noire ou brune et la phéomélanine
orange. Leur voie de biosynthèse est commune de la tyrosine jusqu'à la DOPAquinone, puis elles
sont produites par des réactions différentes (la synthèse d'eumélanine nécessite les enzymes
Trp1 et Trp2). Les personnes à la peau foncée produisent plus de mélanine que celles à la peau
claire. L'exposition aux rayons UV du soleil entraîne la fabrication et l'accumulation de mélanine
dans les kératinocytes, car l'exposition au soleil incite les kératinocytes à sécréter des substances
chimiques qui stimulent les mélanocytes, notamment l'α-MSH. L'accumulation de mélanine dans
les kératinocytes entraîne un assombrissement de la peau, ou un bronzage. Cette accumulation
accrue de mélanine protège l'ADN des cellules épidermiques contre les dommages causés par les
rayons UV et la dégradation de l'acide folique, une vitamine nécessaire à notre santé et à notre
bien-être. À l'inverse, une trop grande quantité de mélanine peut interférer avec la production de
vitamine D, un nutriment important impliqué dans l'absorption du calcium. Ainsi, la quantité de
mélanine présente dans notre peau dépend d'un équilibre entre la lumière solaire disponible et
la destruction de l'acide folique, et la protection contre les rayons UV et la production de vitamine
D.

*Figure 7-151. Les voies de signalisation activées par les UV dans les mélanocytes via la sécrétion d'α-MSH par les
kératinocytes. Source : https://www.mdpi.com/1422-0067/23/3/1358/htm

Les mélanocytes de la peau peuvent donner naissance à des mélanomes qui sont parmi les plus
cellules tumorales les plus invasives lorsqu'elles forment des métastases (25% de survie à 5 ans chez
les patients avec métastases contre 99% si le mélanome reste in situ). C'est parce qu'elles réactivent des
réseaux génétiques proches de ceux des crêtes neurales.
*Figure 7-152. Deux exemples de mélanomes.
Source : https://openstax.org/books/anatomy-
and-physiology/pages/5-4-diseases-disorders-
and-injuries-of-the-integumentary-system

On trouve également des mélanocytes à la base des poils ou des plumes (qui sont des phanères, c'est-à-dire
des productions épidermiques kératinisées) et également dans l'iris. Des mélanocytes sont présents dans
la stria vascularis de l'oreille moyenne et sont essentiels pour la production de l'endolymphe nécessaire à
l'audition. Ainsi les syndromes de Waardenburg associent une surdité congénitale à des défauts de

525
pigmentation. Des mélanocytes sont également présents sur les valves cardiaques. Leur densité est en
corrélation avec la rigidité et les propriétés mécaniques des valves, ce qui suggère que les mélanocytes
soutiennent leur bon fonctionnement (Nasim et al., 2021). Certaines cellules pigmentées ne proviennent
pas des CCN telles les cellules de l'épithélium pigmenté rétinien qui dérivent directement du tube neural.

Signalons que beaucoup d'animaux dont le poisson-zèbre possèdent une diversité de cellules pigmentées
dans l'épiderme : les mélanophores, les xanthophores et les iridophores.

**Figure 7-153. Pigmentation du poisson-zèbre (Danio rerio) et d'une espèce proche, Danio albolineatus (ou Danio
perlé, (pearl)). A gauche, vue latérale des poissons. Sur les photos de droite, la peau a été traitée à l'adrénaline pour
faire converger les mélanosomes et les xantosomes au centre des mélanophores (noir) et des xanthophores (jaune).
Barre d'échelle : à gauche = 5 mm; à droite = 50 µm. Source : https://elifesciences.org/articles/12401

Les précurseurs des mélanocytes dérivés des CCN, les mélanoblastes, migrent sur la voie dorso-
latérale, sous l'ectoderme non neural qui devient de l'épiderme (migration à partir de E8,5 chez la
souris). Une analyse plus fine de l'origine embryonnaire des mélanocytes cutanés a révélé qu'ils
proviennent aussi de précurseurs multipotents des cellules de Schwann (SCP) résidant à la surface
des fibres nerveuses en développement. Cette deuxième vague de production de mélanoblastes est
particulièrement importante pour les espèces qui ont une grande surface de peau ou de phanères (poils,
plumes...) à colorer. A E14,5 chez la souris, les mélanoblastes pénètrent dans l'épiderme et dans les follicules
pileux et s'y différencient.

*Figure 7-154. Les mélanocytes issus des précurseurs multipotents des cellules de Schwann (SCP) colonisent
essentiellement le côté ventral de l'embryon (hypaxial). Hybridation in situ avec une sonde reconnaissant l'ARNm
d'Ednrb2 (un marqueur de mélanoblastes/mélanocytes) d'embryons de poulet contrôle (à gauche) ou dont le tube
neural a été cautérisé après le départ des cellules de crêtes neurales qui produisent les SCP et avant le départ des
cellules de crêtes neurales qui produisent directement les mélanocytes (à droite). EN = indentation épidermique qui
permet de séparer le domaine épaxial (dorsal) et hypaxial (ventral). SC = moelle épinière. Barre d'échelle = 40 µm.
Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1306287110

Presque tous les aspects de la biologie des mélanocytes, de la détermination à la différenciation

jusqu'à l'éventuelle tumorigenèse, sont contrôlés par le facteur de transcription MITF (Kawakami et
Fisher, 2017). La mutation mi ou microphtalmia a été découverte par Paula Hertwig en 1942 dans la
descendance de souris irradiées aux rayons X. Le phénotype associait des petits yeux (d'où le nom), une
perte de pigmentation, une surdité (à cause de l'absence de mélanocytes dans la stria vascularis de l'oreille
526
interne) et aussi des défauts dans les mastocytes et les ostéoclastes car MITF joue aussi un rôle dans ces
cellules qui ne dérivent pas des CCN.
*Figure 7-155. Une souris homozygote pour une
mutation perte-de-fonction de MITF, avec le phénotype
microphtalmia. Cette souris appartient à une lignée qui a
normalement un pelage coloré. Source :
https://genesdev.cshlp.org/content/33/15-
16/983.long

En 1993, le gène codant MITF a été trouvé par une mutagénèse par transgénèse insertionelle et il a été
montré que des patients atteints du syndrome de Waardenburg de type II (yeux réduits, surdité et défauts
de pigmentation) ont une mutation perte-de-fonction dans ce gène (Tassabehji et al., 1994). C'est également
le cas des patients atteints du syndrome de Tietz qui associe également défaut de pigmentation (très
prononcé, type albinisme) et surdité mais sans changement de la taille des yeux.

MITF est un facteur de transcription de type bHLH-Zip (hélice-boucle-hélice basique-Leucine

Zipper) qui se fixe sur des séquences consensus appelées boîte E : CA(T/C)GTG. Il en existe plusieurs
isoformes en fonction du premier exon utilisé. C'est l'isoforme M qui est la plus exprimée dans les
mélanoblastes et les mélanocytes et spécifiques de ces cellules.

Son expression est activée par les facteurs de transcription Pax3 et Sox10.
*Figure 7-156. SOX10 agit en synergie avec PAX3 sur
le promoteur de MITF. (A) L'expression du gène
rapporteur de la luciférase est sous le contrôle du
promoteur MITF normal (pMITF) ou muté avec une
délétion ponctuelle (pMITFdel1718 et pMITFdel2061)
et avec ou sans six sites potentiels de liaison SOX10
supprimés (pMITFdel1718SOX) ou les 2 sites de
liaison PAX3 supprimés ainsi que les 6 sites SOX10
(pMITFdel1718 SOX+P1+P2). Ces constructions ont
été transfectées dans des cellules HeLa en
combinaison avec des vecteurs d'expression contrôles
et des vecteurs permettant d'exprimer PAX3 et/ou
SOX10 (barres noires, gris clair et gris foncé
correspondant aux divers scénarios). Les données de
toutes les transfections sont présentées sous forme de
facteur d'induction au-dessus des niveaux de base.
Source : https://academic.oup.com/hmg/article/9/13/1907/627353

Le rôle de Sox10 dans le lignage mélanocytaire est conservé, ce que souligne le mutant colourless chez le
poisson-zèbre qui correspond à une mutation perte-de-fonction de sox10 et qui ne possède pas de cellules
pigmentées dérivées des cellules de crêtes neurales (Dutton et al., 2001).

527
 *Figure 7-157. Effet de la mutation colourless (cls) chez le poisson-zèbre. Il s'agit d'une perte-de-fonction de sox10.
Notez l'absence de cellules pigmentées le long du corps (dérivées de la crête neurale) mais la pigmentation de l'œil,
qui ne provient pas de cellules pigmentées dérivées de la crête neurale, est maintenue. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/123/1/369/39335/Zebrafish-pigmentation-mutations-and-the-
processes

Le variant d'histone H2A.Z joue aussi un rôle important dans la détermination des CCN en mélanocytes. Ce
variant occupe le promoteur de Mitf et contrôle l'activation de l'expression de Mitf par les signaux
appropriés (Raja et al., 2019). Les facteurs YAP65/TAZ (inhibés par la voie Hippo) doivent aussi être
présent pour que Pax3 puisse correctement activer l'expression de Mitf (Manderfield et al., 2014).
**Figure 7-158. YAP et TAZ sont nécessaires pour activer
l'expression de MITF. Grâce à la technique Cre/Lox, les
gènes codant YAP et TAZ sont délétées spécifiquement
dans les cellules exprimant Wnt1 ce qui correspond au
niveau et au stade étudié aux cellules de crêtes neurales.
Cette délétion est soit hétérozygote (A), soit homozygote
(B). Les cellules où la Cre a été active se mettent à
exprimer tdTomato (fluorophore rouge). Images sous
fluorescence de coupes transversales d'embryons E10.5
immunomarquées pour Mitf (vert) et tdTomato (rouge).
(A) Les cellules marquées adjacentes à l'ectoderme de
surface où se trouvent normalement les mélanoblastes
migrateurs sont indiquées par des pointes de flèche. (B)
Les cellules migratrices de la crête neurale près de
l'ectoderme qui n'expriment pas Mitf mais expriment
tdTomato dans les embryons doublement mutants sont
indiquées par des pointes de flèche. Barres d'échelle =
100 μm. Source : https://www.cell.com/cell-
reports/fulltext/S2211-1247(14)00930-9
Le facteur de transcription FoxD3, en tant que gardien de la multipotence des CCN, s'oppose à l'activation
de l'expression de Mitf. L'expression de FoxD3 doit être réprimée et cela nécessite la présence de HDAC1 et
donc des désacétylations d'histones (Ignatius et al., 2008).

MITF est considéré comme un régulateur principal de la détermination des mélanoblastes mais il ne peut
induire une différenciation complète sans la présence de Sox10. C'est seulement ensemble que Sox10 et
MITF induisent pleinement l'expression de Dct et de Tyrosinase, deux enzymes nécessaires à la synthèse des
mélanines (signalons que Dct est exprimé très tôt, dès le stade mélanoblaste, bien avant qu'il y ait de la
pigmentation). Une troisième protéine est nécessaire, BRG1 qui fait partie du complexe SWI/SNF de
remodelage de la chromatine (Marathe et al., 2017).

528
 **Figure 7-159. MITF, Sox10 et BRG1 sont nécessaires pour une pleine activation de l'expression des gènes codant
les enzymes des mélanocytes Dct, Tyrp1 et Tyr. On fait exprimer dans des cellules non pigmentées MITF, Sox10 et de
manière inductible par la tétracycline (Tet) une forme inductible de BRG1. On étudie ensuite par RT-qPCR
l'expression de Dct, Tyrp1 et Tyr. On constate que MITF ou Sox10 seuls n'activent que peu l'expression des gènes
mais qu'ils ont ensemble une action synergique sur l'expression de Dct. Mais l'expression maximale des gènes cibles
n'est obtenue qu'en présence de BRG1. Source : https://academic.oup.com/nar/article/45/11/6442/3744533

MITF contrôle également l'expression de PMEL17 qui est impliqué dans la formation des mélanosomes
(Berson et al., 2001) et aussi l'expression de Rab27A et de la myosine 5A qui jouent un rôle dans le transport
des mélanosomes (Alves et al., 2017). MITF joue aussi un rôle dans la survie des mélanoblastes et des
mélanocytes, notamment par son activation de la transcription du gène codant la protéine anti-apoptotique
Bcl-2 (McGill et al., 2002). En ce qui concerne la prolifération, MITF joue un rôle différent selon le niveau de
son activité : une activité intermédiaire stimule la prolifération, une activité forte stimule la différenciation
et l'arrêt du cycle cellulaire, une activité faible provoque une dédifférenciation, une capacité migratoire plus
importante (une situation qu'on retrouve dans les mélanomes) et quand l'activité devient trop faible, cela
aboutit à la sénescence et à la mort. C'est ce que l'on appelle le modèle du rhéostat MITF (Goding et
Arnheiter, 2019).

Le ligand EDN3 et son homologue récepteur de l'endothéline B (EDNRB) régulent l'expansion des
mélanoblastes et affectent leur différenciation en mélanocytes matures. Chez les oiseaux, les mélanoblastes
expriment un récepteur spécifique, EDNRB2, qui orientent leur migration sur la voie dorso-latérale (Pla et
al., 2005). Les autres CCN expriment EDNRB et migrent sur la voie ventrale donnant d'autres dérivés. Ce
système n'existe pas chez les Mammifères car le gène Ednrb2 a été délété. Il semble que la migration dorso-
latérale des mélanoblastes soit dans ce cas sous l'influence de SCF (Stem-Cell Factor) et de son récepteur
tyrosine-kinase c-kit (alors qu'il n'a qu'un rôle plus tardif chez les oiseaux). Chez la souris, l'expression
renforcée de SCF dans l'épiderme sous le contrôle du promoteur de la kératine 14 provoque une entrée plus
importante de mélanocytes dans l'épiderme entre les poils alors que d'habitude les mélanocytes se logent
surtout dans les follicules pileux chez ces animaux. L'expression des cadhérines a aussi son importance : les
mélanocytes qui se trouvent dans l'épiderme expriment préférentiellement la E-cadhérine tout comme les
kératinocytes qui les entourent puis expriment majoritairement la P-cadhérine dans les follicules pileux ce
qui est aussi les cas des kératinocytes locaux.

529
 **Figure 7-160. Patron d'expression des cadhérines dans
les mélanoblastes et les mélanocytes chez la souris. Les
mélanoblastes expriment cad6 au cours de leur
migration précoce par la voie dorso-latérale. Puis les
mélanoblastes commencent à exprimer E-cad et P-cad
dans le derme, avant d'envahir l'épiderme. À la
naissance, les mélanoblastes se différencient en
mélanocytes dans trois endroits principaux de la peau.
Les mélanocytes de l'épiderme, les mélanocytes des
follicules pileux (ou de la matrice du poil) et les
mélanocytes du derme. Les mélanocytes dermiques
expriment N-cad, et se lient aux fibroblastes
environnants via la N-cad. Les mélanocytes de
l'épiderme et des follicules pileux expriment à la fois E-
cad et P-cad. Le rapport relatif de ces deux cadhérines est
inversé : les mélanocytes épidermiques expriment plus
de E-cad et moins de P-cad que les mélanocytes des
follicules pileux. L'interaction de ces mélanocytes avec
les kératinocytes environnants est médiée par ces deux
cadhérines. Source : Pla et al., 2001

Les étapes de la différenciation des mélanocytes nécessitent à la fois la signalisation WNT/β-caténine

(Rabbani et al., 2011) et SCF/c-Kit (Botchkareva et al., 2001; Liao et al., 2017).

L'activité d'activation transcriptionnelle de MITF dépend de sa phosphorylation sur la sérine 298 (Takeda
et al., 2000) et certains patients atteints du syndrome de Waardenburg ont une mutation ponctuelle
aboutissant à un autre acide aminé non phosphorylable à cette position.
*Figure 7-161. Importance de la sérine 298 sur l'activité
de MITF. Des cellules NIH3T3 sont transfectées avec des
constructions comportant le gène codant la luciférase
sous le contrôle du promoteur du gène codant la
tyrosinase, une enzyme de synthèse de la mélanine. Les
cellules sont transfectées avec un vecteur permettant
d'exprimer la forme sauvage ou l'une des formes
mutantes de MITF où des sérines et des thréonines sont
remplacées par des alanines (non phosphorylables). Le
remplacement de la Ser298 par une alanine a inhibé la
capacité à transactiver le promoteur du gène codant la
tyrosinase. Les protéines MITF mutantes sont exprimées
dans l'extrait nucléaire à un niveau équivalent à celui de
MITF de type sauvage, comme en témoigne l'analyse par
immunoblot (données non montrées). Source :
https://academic.oup.com/hmg/article/9/1/125/2356072

MITF est phosphorylé sur la sérine 298 par GSK3β. L'α-MSH qui est un peptide secrété qui stimule la
mélanogenèse active une voie de signalisation qui augmente l'AMPc qui inhibe la voie PI3K/Akt. Or Akt
inhibe GSK3β, donc l'α-MSH favorise la phosphorylation sur la sérine 298 de MITF et augmente ses capacités
d'activateur transcriptionnel (Khaled et al., 2002). L'AMPc agit également en stimulant la PKA qui augmente
l'activité de CREB qui augmente la transcription de MITF.

530
 **Figure 7-162. Voies de signalisation impliquées dans la mélanogénèse induite par α-MSH. α-MSH active
l'adénylcyclase ce qui aboutit à l'élévation de la concentration en AMPc intracellulaire. Cela conduit à l'activation de
la PKA et à la stimulation de la transcription de MITF entraînant une stimulation de l'expression de la tyrosinase.
L'AMPc, indépendamment de la PKA, active également la cascade Ras, B-Raf, MEKK, ERK et Rsk-1. La phosphorylation
de MITF sur la sérine 73 et la sérine 409 par respectivement ERK et Rsk-1, favorise sa dégradation constituant un
mécanisme de rétrocontrôle qui empêche une production excessive de synthèse de mélanine. Enfin, l'AMPc, via un
mécanisme indépendant de la PKA, inhibe PI3K et AKT et favorise une activation de GSK3β. GSK3β, en phosphorylant
MITF sur la sérine 298, augmente sa liaison à la boîte M du promoteur du gène codant la tyrosinase, conduisant à
une stimulation de l'expression de ce gène. GSK3β agit aussi sur Tau et pourrait avoir un rôle dans la formation des
dendrites des mélanocytes. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925820742511

Parmi les cibles de MITF on trouve le gène codant Bcl2, un inhibiteur de l'apoptose et aussi CDK2 qui stimule
l'avancée dans le cycle cellulaire. Cela permet d'expliquer l'importance de MITF dans la survie et la
prolifération des mélanoblastes.

Les cellules souches mélanocytaires chez l'adulte

Les cellules souches mélanocytaires (McSC) sont des cellules souches non pigmentées, dérivées de la crête
neurale qui cohabitent avec les cellules souches épithéliales du follicule pileux (HFSC) dans une structure
anatomique appelée le renflement du follicule pileux (Nishimura et al. 2002). Les McSC génèrent et
reconstituent le pool de mélanocytes du follicule pileux producteurs de pigments qui donnent leur couleur
aux poils des Mammifères (Lin et Fisher, 2007).
**Figure 7-163. Cycle du poil. Plusieurs étapes se
succèdent : croissance (anagène), régression médiée par
l'apoptose (catagène) et repos (télogène). La durée du
cycle pilaire varie selon les espèces, mais sa durée
relativement courte (∼3 semaines) chez la souris,
combinée à une accessibilité, a fait du follicule pileux un
système attrayant pour les études sur les cellules
souches.

Le renflement du follicule pileux est une niche de cellules souches dynamiques où les HFSC alimentent des
épisodes de production de poil active (anagène), suivis d'une phase destructrice (catagène) dans laquelle la
majeure partie de la partie régénérée du follicule pileux dégénère, et enfin, une période de repos (télogène)
au cours de laquelle aucune régénération ou destruction tissulaire ne se produit. Pour générer des
mélanocytes uniquement lorsque cela est approprié, les McSC quiescents (qMcSC) doivent coordonner leur
activité avec le cycle capillaire (Nishimura, 2011). En synchronisant leur brève fenêtre d'activation avec les
HFSC au début de chaque cycle capillaire, les McSC sont capables de générer une progéniture proliférative

531
au début de l'anagène qui mature et produit et transfère de la mélanine aux cellules qui se différencient
dans le bulbe pileux. Tout en alimentant ce processus, le renflement doit supporter un nombre suffisant de
McSC et de HFSC pour se lancer dans les cycles ultérieurs de croissance des poils.

Lors du télogène, les BMP régulent la quiescence des HFSC (Infarinato et al., 2010), tandis que le TGF-β
contrôle la quiescence des McSC (Nishimura et al. 2010). Au début de l'anagène, la signalisation WNT/β-
caténine stimule l'activation à la fois des HFSC et des McSC à la base du renflement (Rabbani et al. 2011).
Les HFSC activées par WNT produisent des endothélines qui stimulent davantage l'expansion de McSC qui
expriment le récepteur EDNRB (Rabbani et al., 2011; Takeo et al., 2016). On retrouve donc les mêmes
acteurs que lors du développement embryonnaire.
**Figure 7-164. EDNRB est nécessaire à la régénération
des mélanocytes lors de la formation de nouveaux poils.
Grâce au système Cre/Lox, des mutants sont créés dans
lesquels le gène codant EDNRB est délété de manière
contrôlée par injection de tamoxifène. Les souris
expriment aussi le gène rapporteur LacZ sous le contrôle
du promoteur de Dct (qui marque les mélanoblastes et
les mélanocytes). On observe en coupe la base des poils
après la seconde phase télogène après la délétion
induite, la 3ème puis la 4ème dans des souris contrôles ou
mutantes. Source : https://www.cell.com/cell-
reports/fulltext/S2211-1247(16)30405-3

Une fois activés, les HFSC génèrent des progéniteurs qui prolifèrent et enveloppent la papille dermique pour
former un bulbe pileux à partir duquel les poils émergent. Des précurseurs mélanocytaires issus des McSC
viennent les rejoindre. Là, ils mûrissent en mélanocytes producteurs de mélanine en même temps que les
cellules se différenciant au cœur du bulbe pileux. L'activité des mélanocytes se poursuit jusqu'à ce que le
catagène s'ensuit, lorsque la descendance différenciée de McSC subit une apoptose aux côtés de la
descendance de HFSC.

La plupart des études sur les cellules souches adultes mélanocytaires ont été effectuées chez la souris qui
est un organisme très poilu alors que chez l'humain, l'essentiel des mélanocytes se distribue entre les poils
(dans l'épiderme interfolliculaire). Des précurseurs mélanocytaires pas pigmentés caractérisés par leur
expression de CD90, de MITF, de TRP-2 en absence d'expression de c-kit, de tyrosinase ou de TRP-1
pourraient constituer une réserve de mélanocytes, prêts à proliférer et à se différencier si besoin (Michalak-
Micka et al., 2022). Il n'est pas encore clair si ces cellules ont des caractères de cellules souches.

BRAF est l'un des gènes les plus souvent mutés dans les mélanomes, le pourcentage de mélanomes
avec des mutations dans ce gène allant de 40 à 60 % selon les données. 80% de ces mutations BRAF
sont en position V600E (Fedorenko et al., 2015). BRAF code une sérine/thréonine protéine kinase
qui régule la voie de signalisation MAPK/ERK, impliquée dans la régulation de la prolifération, de la
différenciation et de la survie cellulaire. La mutation V600E la rend constitutivement active.

532
 > Le squelette cranio-facial

**Figure 7-165. Morphogenèse de la face d'un embryon de poulet. Reconstructions 3D à partir de mesures prises sur
des embryons. La période ici correspond à la 6-7ème semaine de développement chez l'humain. e = œil; fnm = masse
fronto-nasale; md = proéminence mandibulaire; mxp = proéminence maxillaire; np = fosses nasales. Barre d'échelle
= 500 µm. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/148/9/dev193755/237764/Symmetry-and-
fluctuation-of-cell-movements-in

Le façonnement de la forme de la tête et de ses structures est un apport majeur des CCN au
développement des Vertébrés par rapport aux Cordés non vertébrés qui n'ont pas de véritables CCN.
Le développement de la mâchoire et donc de la prédation au sein des Vertébrés est un apport
évolutif fonctionnel majeur. Les CCN contribuent essentiellement au squelette cranio-facial ventral.
Dans la partie dorsal, le mésoderme céphalique forme quelques pièces squelettiques.

**Figure 7-166. Migration des CCN céphaliques et contribution au squelette cranio-facial. Pendant l'embryogenèse,
le cerveau est divisé en 3 vésicules : prosencéphale (subdivisé ensuite en télencéphale et en diencéphale),
mésencéphale et rhombencéphale (subdivisé en rhombomères puis ensuite en métencéphale et myélencéphale). Les
couleurs mettent en évidence les régions du visage en développement qui correspondent à des populations de CCN
d'origines axiales différentes. La proéminence faciale et les arcs pharyngés subissent ensuite une morphogenèse
complexe pour former les structures de la face. Les structures squelettiques laissées en gris proviennent du
mésoderme céphalique. AS, os alisphénoïde, F, os frontal, FEZ, zone ectodermique frontonasale, FNP, proéminence
frontonasale, H, os hyoïde, I/S, marteau et enclume (2 des 3 osselets de l'oreille moyenne), M, mandibule, MX,
maxillaire, N, os nasal, PA, arcades pharyngiennes, r, rhombencéphale, S, squamosal, Z, os zygomatique. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.644410/full

533
 ***Figure 7-167. Exemple de contribution des CCN et du mésoderme paraxial céphalique au crâne chez la souris. Les
cellules de CCN donnent naissance à l'os frontal, le mésoderme paraxial céphalique à l'os pariétal. Entre les deux os,
se met en place la suture coronale. Source : https://www.mdpi.com/2221-3759/8/3/18/htm

Les CCN qui contribuent au squelette cranio-facial colonisent le premier arc pharyngien (ou branchial) et le
processus frontonasal. Les marquages par greffe caille-poulet ont permis de montrer que les CCN qui
migrent du diencéphale postérieur se retrouvent dans le bourgeon naso-frontal, les CCN qui migrent du
mésencéphale antérieur se retrouvent dans le processus maxillaire et dans la région rétro-oculaire, les CCN
qui migrent du mésencéphale postérieur et des 2 premiers rhombomères se retrouvent dans l'arc
mandibulaire (Couly et al., 1996). Les CCN qui migrent à partir du rhombomère 4 forment l'arc hyoïde (l'arc
pharyngien 2) et des neurones du ganglion crânien facial VII.
*Figure 7-168. Migration segmentée des CCN
céphaliques et signaux qui la contrôlent. Migration
segmentaire des CCN céphaliques dans un embryon de
vertébré. Les flèches jaunes représentent les flux de
migration des CCN diencéphaliques (di-),
mésencéphaliques antérieures et postérieures (mes-), et
rhombencéphaliques dans le processus frontonasal
(FNP) et les arcs pharyngés 1-4 (PA1-4). Les CCN
migrent en trois flux individuels : S1, S2 et S3. Les CCN
provenant du mésencéphale postérieur, du rhombomère
1 (r1) et du r2 remplissent le premier arc pharyngé
(PA1), tandis que les NCC provenant du r4 remplissent le
deuxième arc pharyngé (PA2). Dans le cerveau
postérieur post-otique, les CCN de la région r6-r8
colonisent indifféremment PA3-6, PA3 étant
principalement formés par les CCN de r6. Certains des
mécanismes moléculaires impliqués dans
l'établissement et le maintien de la migration des flux de
534
 CCN sont également présentés. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/137/16/2605/43879/Molecular-mechanisms-of-cranial-neural-crest-cell

Chez les Mammifères, les trois osselets de l'oreille moyenne (marteau, enclume, étrier) sont évolutivement
issus des arcs pharyngiens et donc des CCN céphaliques. Ce sont des signaux provenant de l'endoderme
adjacent (Shh et BMP4) qui contrôlent leur spécification et leur différenciation (Ankamreddy et al., 2019).

Durant leur migration, les CCN céphaliques doivent aussi proliférer pour coloniser de vastes territoires.

**Figure 7-169. Traçage génétique des cellules de la crête neurale et de leurs descendances clonales induites à E8.5
dans des embryons Sox10-CreERT2/R26Confetti et analysées à E9.5 à E10. (A) Tête de l'embryon E10 avec un seul
clone YFP+. Notez la structure compacte du clone. (B) Plusieurs clones séparés dans différentes régions du visage de
l'embryon. Les pointes de flèches jaunes et bleues indiquent l'orientation de migration des groupes cellulaires. (C)
Exemple de plusieurs clones qui se chevauchent dans le visage en développement précoce. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.1600060

Les CCN céphaliques doivent acquérir une information de position pour migrer correctement et se
différencier en structures adéquates. Elles sont régionalisées entre autres par les gènes Hox. Les CCN
les plus antérieures jusqu'au rhombomère 2 inclus n'expriment pas de gène Hox tandis que les CCN
plus postérieures en expriment. Cela a un impact sur leur détermination. Seules les CCN qui
n'expriment pas les gènes Hox peuvent donner du tissu osseux (Creuzet et al., 2005). Si on force
l'expression de gènes Hox dans les CCN les plus antérieures, elles perdent leur capacité à former du
tissu osseux.

La migration en flux bien distincts et définis, sans mélange, entre les différents niveaux de l'axe AP permet
de préserver ces identités spécifiques des CCN et de les "transporter avec elles" vers leurs tissus de
destination. Cependant, ces derniers peuvent dans une certaine mesure influencer le devenir des cellules et
des régions du mésoderme céphalique peuvent induire des destinées nouvelles dans des CCN greffées
ectopiquement, surtout si celles-ci sont en petit nombre (Trainor et Krumauf, 2000). Il y a ainsi mise en
évidence d'un effet de communauté où de grandes populations de CCN ont une plasticité moindre que des
petites populations isolées où la détermination n'est pas aussi fermement établie.

Un code impliquant une combinaison des gènes Dlx permet de spécifier les structures dérivées des CCN du
premier arc branchial : Dlx1 et Dlx2 sont exprimés dans les processus mandibulaire et maxillaire, Dlx5 et
Dlx6 uniquement dans le processus mandibulaire et Dlx3 et Dlx4 que dans la région la plus distale du
processus mandibulaire (Minoux et Rijli, 2010).

535
 *Figure 7-170. Un code Hox combiné à un code Dlx
spécifie l'identité positionnelle des CCN céphaliques.
Les schémas correspondent à des têtes d'embryon de
souris à E10.5. (A) Le code Hox confère une identité
spatiale (identité inter-arche) le long de l'axe AP
(antéro-postérieur) aux CCN céphaliques colonisant les
arcs pharyngés (PA). Chaque PA est représenté par une
couleur différente représentant son code d'expression
Hox spécifique. PA1 est dépourvu d'expression de
gènes Hox. Chez la souris, l'expression de Hoxb2 est
inhibée dans les CCN post-migratoires de PA2, et Hoxb3
et Hoxd3 ne sont que faiblement exprimés dans PA3. (B)
Le code Dlx fournit une identité spatiale (identité intra-
arche) aux CCN céphaliques le long de l'axe DV
(dorsoventral, proximodistal) des PA. md, processus
mandibulaire de PA1 ; mx, processus maxillaire de PA1.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/137/16/2605/43879/Molecular-mechanisms-of-cranial-
neural-crest-cell

Les facteurs de transcription de type hélice-boucle-hélice basique Hand1 et Hand2 jouent un rôle essentiel
dans le développement des crêtes neurales céphaliques. La délétion spécifique de Hand2 dans les CCN
aboutit à la quasi-disparition de la mâchoire inférieure et de la langue (Barron et al., 2011). Un phénotype
important des mutations perte-de-fonction de Hand1 n'apparait que si on les met dans un contexte
hétérozygote pour Hand2, montrant une compensation fonctionnelle partielle (Barbosa et al., 2007). Non
seulement, l'expression de ces facteurs de transcription est importante mais aussi leur phosphorylation sur
des sérines/thréonines (Firulli et al., 2014). Des formes déphosphorylées favorisent les formations
d'homodimères alors que les formes phosphorylées favorisent les formations d'hétérodimères (comme
Hand1/Hand2 par exemple) et les cibles génétiques activées entre ces deux formes ne sont pas les mêmes.

***Figure 7-171. L'état de phosphorylation de Hand1 est important pour la morphogenèse cranio-faciale. Images en
microtomographie des crânes de souris P0 sauvages et mutantes. Les allèles codant la thréonine 107 et la sérine 109
de Hand1 ont été remplacés soit par des alanines, un acide aminé non phosphorylable (PO4−) ou par des acides
aspartiques, un acide aminé qui mime une phosphorylation par sa charge négative (PO4+). L'allèle fx correspond à
une totale perte de fonction. Vue latérale droite (K), dorsale (L) et ventrale (M) des crânes. Abréviations pour la ligne
K : i, os interpariétal (turquoise); p, os pariétal (vert clair); f, os frontal (rouge); n, os nasal (vert); carré, os squamosal
(violet clair) ; pm, prémaxillaire (violet foncé); j, os jugal (rouge foncé); mx, maxillaire (bleu) ; md, mandibule
(bronze); ty, os tympanique (non coloré). Abréviation de la ligne L : i, incisives (magenta, indiquées par une flèche
blanche). Abréviations pour la ligne M : pl, os palatins (jaune); bs, phenoïde (non coloré); pt, os ptérygoïdes (non
colorés). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/141/15/3050/46274/Hand1-phosphoregulation-within-the-distal-arch

536
Les mutations du facteur de transcription TWIST1 chez l'homme sont associées à la craniosynostose (El
Ghouzzi et al., 2000) et à des anomalies vasculaires cérébrales (Tischfield et al., 2017). La craniosynostose
est la fusion prématurée des sutures crâniales. Elle concerne 1 naissance sur 2000. Les mutations perte-de-
fonction de TWIST1 constituent la deuxième cause de craniosynostose et prennent phénotypiquement la
forme du syndrome de Saethre-Chotzen.
***Figure 7-172. Suivi temporel de la fermeture de la
suture coronale chez les souris Twist1+/−, un modèle
du syndrome de Saethre-Chotzen. Au jour p11, la
coloration au pentachrome révèle la présence de
cartilage (coloration en bleu) entre les plaques osseuses
de la suture COR des souris Twist1+/-, alors qu'aucun
cartilage n'est présent chez les souris de type sauvage.
Au jour p13, la fermeture pathologique de la suture COR
est observée chez les souris Twist1+/-. Les lignes
pointillées indiquent les plaques osseuses. Barre
d'échelle : 50 µm. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2011.00037/full

Les analyses phénotypiques de la souris knock-out conditionnelle Twist1 ont révélé que TWIST1 est
nécessaire dans les CCN pour la formation du squelette facial, la voûte crânienne antérieure et la
structuration des nerfs crâniens (Soo et al., 2002; Ota et al., 2004; Bildsoe et al., 2009; Bildsoe et al., 2016).

Twist1 a été impliqué dans l'activation de la migration des CCN. Il active l'expression de gènes nécessaires
à cette migration en recrutant notamment des modificateurs de la chromatine tels que les hélicases à
chromodomaine Chd7 et Ched8 ainsi que l'histone-méthyltransférase Whsc1 (Fan et al., 2021).

**Figure 7-173. Rôle de Twist1 et de ses interactants lors de tests de migration d'un modèle de CCN. Des cellules
neuroépithéliales provenant de souris sauvages ou mutées sont cultivées en agrégat dans des conditions où
habituellement certaines cellules de ces agrégats se mettent à migrer sur le substrat : ces cellules expriment de
marqueurs des CCN. On constate que l'absence d'un allèle fonctionnel de Twist1 (ce qui est le cas chez les patients
atteints du syndrome de Saethre-Chotzen) altère fortement la migration des cellules et que cet effet est renforcé en
combinant cette mutation avec les mutations de ses interactants qui modifient la chromatine (Chd7, Chd8 et Whsc1).
Des mutations perte-de-fonction dans le gène codant Chd7 provoquent le syndrome CHARGE où le développement
de nombreux tissus (dont certains dérivés des CCN) est affecté. Source : https://elifesciences.org/articles/62873

Le développement des CCN céphaliques est bien sûr influencé par des molécules de signalisation produites
dans leur environnement. Par exemple, Sonic Hedgehog (Shh) est exprimé dans la zone épidermique fronto-
nasale (FEZ) et il contrôle notamment la prolifération. Une inhibition de l'action de Shh aboutit à une figure
étroite et tronquée alors qu'une suractivation de la voie de signalisation Shh produit une mâchoire
supérieure très large (Hu et Marcucio, 2009).
537
 **Figure 7-174. Courbe dose-réponse de la taille
du milieu de la face en fonction de l'activité de la
voie de signalisation Shh. On greffe dans la
région céphalique frontale d'embryons de
poulet des billes diffusant différentes doses de
Shh (Shh-N) ce qui active plus ou moins la voie
de signalisation Shh ou on injecte différentes
concentrations de cellules produisant des
anticorps monoclonaux 5E1 anti-Shh qui
diminuent plus ou moins l'activité de cette voie
de signalisation. Après 72 heures, on fixe les
embryons et la morphologie de leur face est
numérisée et mesurée. En ordonnées, PC1 est un
mélange normalisé de plusieurs valeurs de
distance entre différents points de la face. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/137/20/3405/43926/Quantitative-analyses-link-modulation-of-sonic

Shh a été directement impliqué dans le développement de la lèvre supérieure et du palais, ce qui en fait une
des voies de signalisation qui peut être perturbée en présence d'une fente labiale et d'une fente palatine
("bec-de-lièvre") (1 naissance sur 1000 environ).
*Figure 7-175. Shh et la morphogénèse de la lèvre
supérieure et du palais. (A) La formation de la lèvre
supérieure (panneaux supérieurs) et du palais
secondaire (panneaux inférieurs) se produit par
excroissance et fusion du processus nasal médian
(MNP) et du processus maxillaire (MXP). Ces tissus
sont constitués d'un mésenchyme dense recouvert
d'épithélium ectodermique. (B) Shh est produit dans
l'ectoderme épithélial et agit sur les cellules
mésenchymateuses sous-jacentes (dérivées des CCN).
Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.621442/full

Les facteurs BMP interviennent également. Une déficience en BMP4 entraîne des anomalies cranio-faciales,
telles qu'une fente labiale et palatine, chez la souris comme chez l'homme (Liu et al., 2005; Suzuki et al.,
2009). BMP4 régule la configuration proximodistale et le moment de la différenciation osseuse dans le
mésenchyme mandibulaire (Liu et al., 2005; Merrill et al., 2008). Par exemple, l'une des cibles directes de la
voie BMP est le gène Satb2 codant un facteur important pour le développement des ostéoblastes. Le gène
Hand1 est également une des cibles directes (nous avons vu l'importance de ce gène plus haut) (Bonilla-
Claudio et al., 2012). Des changements dans la signalisation BMP4 jouent un rôle significatif dans l'évolution
comme le montre l'exemple des pinsons de Darwin (Abzhanov et al., 2004; Wu et al., 2004) ou celui des
poissons cichlidés (Albertson et al., 2005).

Des facteurs environnementaux tératogènes peuvent affecter le développement des CCN céphaliques. Le
plus répandu d'entre eux est l'alcool (l'éthanol) qui cause le syndrome d'alcoolisation fœtale qui touche
environ 0,5 % des nouveaux nés et s'accompagne de déficiences mentales et de malformations
craniofaciales (milieu de la figure plus aplati, nez plus petit, philtrum (sillon entre l'axe du nez et la lèvre
supérieure) réduit...) Ces dernières ont été reliés à des défauts de survie d'une fraction des CCN céphaliques.
538
 **Figure 7-176. Mécanismes reliant un excès
d'éthanol avec la mort cellulaire d'une fraction
de CCN céphaliques. FA = acide folique. Source
: https://www.mdpi.com/2076-
3425/3/2/964

Des mutations dans le gène Vangl2 dont le produit est impliqué dans la voie de polarité planaire Wnt
rendent plus sensibles à l'alcool un modèle de poisson-zèbre de syndrome d'alcoolisation fœtale, montrant
les interactions entre facteurs génétiques et facteurs environnementaux (Sidik et al., 2021).

Également, une partie d'une des anomalies congénitales les plus fréquentes, la présence d'une fente labiale
et d'une fente palatine ("bec-de-lièvre") (1 naissance sur 1500 environ) est causée par l'exposition à des
facteurs tératogènes environnementaux (alcool, fumée de cigarette, dioxine, dexaméthasone, métaux
lourds) (Buser et Pohl, 2015 ; Carlson et al., 2022). Des mutations sont aussi associées avec ce phénotype
(au moins une cinquantaine de loci ont été impliqués) et des interactions complexes
environnement/génotype sont à l'origine de ce type d'anomalies (Beaty et al., 2016).
*Figure 7-178. Enfant avec une fente labiale (et palatine,
mais non visible sur ce cliché).
Source : https://fr.m.wikipedia.org/wiki/Fichier:Cleftlipandpalate.JPG

Différenciation in vitro des cellules de crêtes neurales à partir de cellules pluripotentes humaines
Les neurocristopathies sont des maladies liées à des défauts de développement des crêtes neurales. Pour
mieux comprendre l'enchaînement des évènements qui mènent de la ou des mutation(s) jusqu'à la
malformation, la culture de cellules de crêtes neurales humaines in vitro est un grand atout. De nombreuses
équipes ont mis au point divers protocoles pour produire des CCN à partir de cellules ES ou de cellules iPS
humaines. Les protocoles sont inspirés de l'enchaînement de l'activation des voies de signalisation dans
l'embryon. Les CCN sont obtenus avec une activation modérée de la voie BMP (mimant ce qu'il se passe dans
la bordure neurale) et la voie WNT doit être activée. Il s'agit non seulement d'obtenir des CCN mais aussi
des CCN du bon niveau antéro-postérieur (céphalique, vagal, troncal...). L'activation de la voie de
signalisation FGF est utilisée pour postérioriser des CCN qui, par défaut dans les protocoles utilisés, sont
plutôt céphalique. Cette même modulation peut être obtenue dans d'autres protocoles avec un
renforcement de la voie WNT. L'acide rétinoïque peut également être utilisé pour postérioriser des CCN et
obtenir des CCN vagales et cardiaques.

539
**Figure 7-179. Régionalisation antéro-postérieure de CCN obtenues in vitro à partir de cellules ES ou iPS humaines.
Des traitements sont appliqués avec une activation modérée de la voie BMP et une activation de la voie Wnt. On
obtient des CCN céphaliques. L'application d'acide rétinoïque (RA) permet d'obtenir des CCN vagales/cardiaques.
Un traitement avec du FGF permet d'obtenir des CCN troncales. A droite, sont représentés les différents gènes Hox
activés au cours des protocoles et leur position sur l'axe antéro-postérieur avec un code couleur qui indique leur
expression dans les dérivés obtenus à partir des cellules ES et iPS. Source : https://elifesciences.org/articles/35786

540
Le développement des bourgeons de membre

Figure 7-180. Embryon humain à 33 jours de

développement (stade Carnegie 14) où on observe les
bourgeons de membre (8 et 9). Source :
https://embryology.ch/fr/embryogenese/periode-
embryonnaire/stades-carnegie/14-16.html

es bourgeons de membre chiridien se développent à partir d'expansions latérales du corps. Ils

L
apparaissent entre la 4ème et la 5ème semaine de développement chez l'embryon humain. Ils
donnent les os, les tendons et l'épiderme du membre, mais d'autres cellules migrent dans le
bourgeon et participent à son organogenèse.
*Figure 7-181. Le membre chiridien : une assemblée de
cellules d'origine hétéroclite.

*Figure 7-182. Migration des myoblastes dans le

bourgeon de membre. Hybridation in situ montrant
l'expression de Pax3 dans des embryons de souris
sauvages (WT) ou mutants où le gène codant BRAF a été
délété dans les myoblastes. Pax3 marque le tube neural
dorsal, le dermomyotome et les myoblastes en
migration. NT = tube neural; dm = dermomyotome; fl =
bourgeon de membre antérieur. Source :
https://doi.org/10.7554/eLife.18351.001

Ce sont donc des cellules de différentes origines qui vont devoir former une structure fonctionnelle et
correctement régionalisée selon plusieurs axes : l'axe proximo-distal (la succession stylopode-
zeugopode-autopode), l'axe antéro-postérieur (visible sur les doigts : le pouce est le doigt le plus
antérieur, le petit doigt est le plus postérieur) et l'axe dorso-ventral (bien visible en regardant la
différence entre le dos et la paume de la main). Etudier le développement du bourgeon de membre peut
permettre une approche plus simple que pour un embryon entier pour comprendre comment une structure
tridimensionnelle se met en place.

541
Contrôle de la position des bourgeons de membre sur l'axe antéro-postérieur de l'animal
Le bourgeon de membre antérieur se forme dans une zone où l'acide rétinoïque (RA) a une activité
importante. La mutation de gène codant la rétinaldehyde déshydrogénase-2 (Raldh2), l'enzyme clé de la
synthèse de RA, abolit la formation des nageoires pectorales et des bourgeons de membre antérieurs chez
le poisson-zèbre et la souris (Begemann et al., 2001, Niederreither et al., 1999). Des expériences classiques
ont montré que la mise en place d’une barrière imperméable entre les somites et les lames latérales à un
moment critique abolit l’induction des bourgeons de membre. L’acide rétinoïque est justement produit par
les somites. Il s’oppose notamment à l’action du FGF8 qui est exprimé dans le cœur et dans les régions plus
postérieures et il induit l’épaississement localisé de la lame latérale externe (la somatopleure) qui est la
première étape de la formation du bourgeon de membre.
*Figure 7-183. Modèle d'induction de la formation du
bourgeon de membre antérieur. L'acide rétinoïque (RA)
en provenance des somites et du mésoderme latéral ainsi
que les gènes Hox et la voie de signalisation Wnt/β-
caténine permettent d'établir l'expression de Tbx5 dans
la région de la somatopleure où va se former le bourgeon
de membre antérieur. Tbx5 active FGF10 qui induit FGF8
dans l'AER et une boucle de régulation positive entre les
2 FGF se met en place. Source :
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-
1247(15)00706-8

L'induction du développement du bourgeon de membre par l'acide rétinoïque mais aussi par Wnt2b qui est
exprimé dans les somites et dans la partie médiale des lames latérales (Ng et al., 2002) induit l'expression
de Tbx5 qui active ensuite FGF10 dans le mésenchyme. Dans le bourgeon de membre postérieur, c'est Tbx4
qui joue le rôle de Tbx5.
*Figure 7-184. Expression de Tbx5 et de Tbx4 dans des
embryons de souris à E9,5 (vues latérales). L'expression du
gène rapporteur LacZ sous le contrôle du promoteur de
Tbx5 (A) ou de Tbx4 (B) a été mise en évidence par
coloration Xgal. fl = bourgeon de membre antérieur; hl =
bourgeon de membre postérieur. Source :
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.091015310
6

Figure 7-185. Tbx5 est nécessaire à l'initiation du

développement du bourgeon de membre antérieur.
Images de microscopie électronique à balayage
d'embryons de souris de 9 jours de développement
(vues latéro-dorsales) sauvages (A) ou mutées perte-
de-fonction sur les deux allèles de Tbx5 (B). La flèche
blanche indique l'emplacement du bourgeon de
membre antérieur. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/130/3/623/42069/Tbx
5-is-essential-for-forelimb-bud-initiation

542
 **Figure 7-186. L'expression de Tbx5 dépend de la
signalisation WNT/β-caténine et est nécessaire pour
activer l'expression de FGF10. (A,B) Des adénovirus
exprimant Axin et EGFP ont été co-injectés dans les
lames latérales d’embryons de poulet de stade 8. La
surexpression de Axin inhibe β-caténine. Au stade 15,
l’expression de l’EGFP marque la distribution spatiale de
l’adénovirus et l’intégrité du tissu injecté (B, flèche).
L’expression de Tbx5 est étudiée par hybridation in situ.
Elle est abaissée du côté injecté (A, flèche). A et B sont
des images du même embryon. (C) Un vecteur
d’expression RCAS avec un mutant dominant-négatif de
Tbx5 tronqué de sa partie N-terminale (Tbx5ΔN) a été
injecté dans la région de l’aile présomptive des
embryons de stade 8. Chez les embryons de stade 16
injectés avec RCAS-Tbx5ΔN, l’expression de Fgf10
étudiée par hybridation in situ est abaissée du côté
injecté (flèche). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/129/22/5161/51934/The-limb-
identity-gene-Tbx5-promotes-limb

FGF10 active FGF8 dans l'ectoderme qui s'épaissit et forme l'AER (pour Apical Ectodermal Ridge ou crête
apicale ectodermique).
*Figure 7-187. Expression de FGF8 (G) et de FGF10 (M) vue en
hybridation in situ dans un bourgeon de membre postérieur de souris
à E10.5. On remarque que FGF10 est exprimé dans le mésenchyme
alors que FGF8 est exprimé à l'extrémité distale du bourgeon de
membre dans ce qui va devenir l'AER. Source :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0037826

C'est ensuite la boucle de régulation positive entre FGF10 mésenchymateux et FGF8 de l'épiderme qui
pousse à la croissance du bourgeon. On remarque que d'un signal inhibiteur initial, FGF8 devient un signal
activateur, un exemple de plus pour démontrer qu'une molécule de signalisation ne porte pas d'instructions
en soi et que tout dépend du contexte.

Le thalidomide, un médicament qui a été largement prescrit dans les années 1950 et 1960 avant d'être
interdit aux femmes enceintes, cause des raccourcissements et des malformations des membres au cours
du développement, en inhibant notamment l'expression de FGF10 et de FGF8 (Ito et al., 2010).

543
 *Figure 7-188. Niko von Glasow, un réalisateur allemand
né en 1960, victime du thalidomide. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Niko_von_Glasow#/media/Fichier:Niko_von_Glasow.jpg

Les gènes Hox ont bien entendu leur mot à dire sur le positionnement des bourgeons de membre le long de
l'axe AP. Par exemple, les bourgeons de membres antérieurs ne sont induits que dans une région qui
exprime Hoxb5 mais pas Hoxc6 et Hoxc8. C'est par modification de l'expression de ces deux derniers gènes
que les serpents ont perdu leur capacité à former des membres antérieurs. L'expression de Hoxc6 et Hoxc8
remonte bien plus antérieurement chez l'embryon du python comparé à l'embryon de poulet et la région
où le bourgeon de membre antérieur pourrait se former n'existe plus d'un point de vue de la détermination
génétique.
*Figure 7-189. Comparaison de l'expression de
gènes Hox chez l'embryon de poulet et du python.
Le python possède un membre postérieur vestigial
mais le membre antérieur a complètement disparu.

L'axe proximo-distal et son contrôle

Le plan d’organisation du membre chiridien des tétrapodes se compose de trois segments
principaux séparés par des articulations. Selon l'axe proximo-distal, depuis la paroi corporelle
jusqu'à la pointe distale, il s’agit du stylopode (bras, cuisse), du zeugopode (avant-bras, mollet) et
de l’autopode (main, pied). Le stylopode et le zeugopode contiennent respectivement un et deux
éléments squelettiques, tandis que le segment distal ou autopode contient les multiples éléments
squelettiques de la main et du pied, carpes/tarses, métacarpes/métatarses et phalanges. Cette
organisation morphologique est hautement conservée chez les Tétrapodes malgré une variation
évolutive considérable liée à des adaptations à des locomotions variées (course, saut, vol…).

Les bourgeons s’agrandissent et les éléments cartilagineux du futur squelette et les masses musculaires se
mettent progressivement en place. À l'extrémité des membres chiridiens, les doigts sont initialement
liés par une zone interdigitale où les cellules sont finalement éliminées par apoptose. Des différences
notables sont observées entre certaines espèces comme par exemple entre la souris et la chauve-souris.
Chez les bourgeons de membre antérieurs de la chauve-souris, la zone interdigitale ne meurt pas et permet
de générer la surface portante de ce Mammifère volant.

L’axe proximo-distal est contrôlé par un épaississement du l’épiderme distal appelé AER (pour
Apical Ectodermal Ridge ou crête apicale ectodermique), un épithélium épaissi qui borde le bord

544
distal du bourgeon de membre en croissance. Son ablation entraîne un membre tronqué de sa partie
distale. L’AER produit des facteurs de croissance (famille des FGF) indispensable à la croissance du
bourgeon de membre.
*Figure 7-190. AER vu en microscopie électronique à
balayage. Source : https://www.sdbcore.org/object?ObjectID=322&SubTopicID=25

L'AER se caractérise par l'expression de plusieurs membres de la famille des facteurs de croissance
des fibroblastes (FGF), dont FGF8 est le plus important. La fonction cruciale de l'AER a été révélée
pour la première fois par les expériences classiques d'ablation réalisées sur l'embryon de poulet
par Saunders et ses collaborateurs. L’ablation de l'AER produit des membres atrophié de leur partie
distale où le niveau tronqué était précisément corrélé avec le stade où l'AER avait été retiré. Ces
expériences ont révélé pour la première fois que les segments de membre se forment
progressivement, dans une séquence proximo-distale et ont établi le l'AER en tant que tissu
inducteur essentiel au développement des membres, contrairement à l'hypothèse courante à
l'époque selon laquelle l'ectoderme n'était qu'une structure passive et protectrice.

Afin de tenir compte des résultats des expériences d'élimination de l'AER et ainsi d'expliquer comment
diverses cellules mésodermiques acquièrent leur propre information proximo-distale, Wolpert et ses
collègues ont proposé le « modèle de la zone de progression ». Ce modèle postule que les cellules
mésodermiques distales, sous-apicales dans la zone de progression (ZP) acquièrent progressivement des
valeurs positionnelles plus distales selon le temps passé sous l'influence de l'AER. Cependant, l'épaisseur
de la ZP n'a pas été définie avec précision et, bien que plusieurs gènes présentent des domaines d'expression
rappelant la ZP, parmi lesquels Msx1, N-myc et Tfap2a, un marqueur de ZP fiable n’a pas été identifié.

Le modèle ZP a été réévalué à plusieurs reprises et les mécanismes et modèles par lesquels les cellules
progénitrices des membres mésenchymateux acquièrent progressivement des destins plus distaux est
encore un sujet de recherche actif. Des études sur des embryons de poulet soutiennent un « modèle signal-
temps » où la spécification du segment de membre proximal dépend de signaux en provenance du tronc de
l’embryon, tandis que la spécification des segments distaux dépend de l'activation d'un programme de
synchronisation intrinsèque qui commence une fois que les progéniteurs du membre distal sont exempts
de signaux proximaux en raison de la croissance du bourgeon. Ce programme intrinsèque implique la
transition progressive d'un mode proximal à un mode distal d'expression des gènes Hox qui sont régulés
par un gradient proximo-distal des facteurs de transcription Meis sous le contrôle de la signalisation FGF
provenant de l'AER.

La perte génétique conditionnelle de Meis1/2 dans le membre de la souris entraîne des défauts de
structuration proximodistale.

545
 *Figure 7-191. Meis1 et Meis2 sont nécessaires pour le
développement des structures proximales du bourgeon
de membre. Préparations squelettiques de mutants Meis
et d'embryons WT colorés au bleu alcian/rouge alizarine
à E18,5. Les mutants sont des embryons avec le système
de délétion conditionnelle Cre/Lox où on restreint les
mutations au bourgeon de membre postérieur (HL). Les
bourgeons de membre antérieurs (FL) ne sont pas
affectés et servent de témoin. Dll1Cre;Meis1+/f;Meis2f/f
(M1HT;M2KO) exprime plus de Meis2 mais a un allèle
fonctionnel de Meis1 et Dll1Cre;Meis1f/f;Meis2f/f
(M1M2DKO) n'exprime plus ni Meis1, ni Meis2. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aaz0742

L'application d'acide rétinoïque (RA) peut favoriser les destins proximaux (Tamura et al., 1997).
L'implantation de billes chargées de RA dans les bourgeons des membres active l'expression
des régulateurs transcriptionnels Meis. Meis1 et Meis2 sont d'abord exprimés dans tout le mésenchyme du
bourgeon de membre naissant et leur expression se restreint de manière proximale au cours de la
croissance du bourgeon. L'expression ectopique de Meis1 dans les bourgeons des membres de poulet et de
souris provoque des transformations de structures distales en structures proximales, tandis que
l'implantation de billes chargées de FGF8 dans le mésenchyme proximal inhibe l'expression
de Meis (Capdevila et al., 1999; Mercader et al., 2000). Ces résultats ont conduit au modèle à deux signaux
pour la structuration de l'axe proximo-distal, avec RA provenant du flanc de l'embryon et la signalisation
FGF venant de l'AER qui s'opposent pour spécifier les identités des membres proximale et distale,
respectivement (Mercader et al., 2000).

Comme l'AER ne se forme qu'après la formation du membre proximal, retardant ainsi la production de FGF
distaux jusqu'après l'initiation du bourgeon de membre, cela entraîne une expression précoce de Meis1/2
dans tout le membre. Une fois l'AER établi, l'expression de Meis1/2 est réprimée par les FGF distaux, créant
ainsi une limite d'expression de Meis1/2 qui la laisse dans une position proximale alors que le membre distal
continue de croître sans expression de Meis1/2.

L'axe proximo-distal du bourgeon de membre est aussi sous le contrôle d'une partie des complexes
des gènes Hox (les complexes A et D avec les parties les plus en 5' du complexe incluant les gènes
Hoxa9 à Hoxa13 et Hoxd9 à Hoxd13). La règle de colinéarité que l'on observe pour les complexes Hox
et l'axe antéro-postérieur s'applique ici sur l'axe proximo-distal : les gènes les plus en 3' spécifient
les parties les plus proximales (humérus ou fémur) et les gènes les plus en 5' spécifient les parties
les plus distales (les doigts). De nombreuses malformations congénitales des doigts sont associées à des
mutations dans HOXD13.

546
 *Figure 7-192. Patron d'expression de Hoxd13 au cours
du développement du bourgeon de membre antérieur de
la souris. Etude en hybridation in situ. Notez l'expression
exclusivement distale dans les doigts. Barres d'échelle =
0,5 mm. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-021-25330-
y

*Figure 7-193. Effet des mutations des groupes

paralogues de gènes Hox sur le membre chiridien.
Lorsqu'on réalise l'invalidation des gènes Hox du
groupe de paralogie 10 chez la souris, le stylopode
est très réduit. C'est le zeugopode qui est réduit
après invalidation des gènes Hox du groupe de
paralogie 11. Les doigts à l'extrémité de l'autopode
ne se développent pas après invalidation des gènes
Hox du groupe de paralogie 13. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/6/dev159830/48898/Regulatory-
integration-of-Hox-factor-activity-with

D’un côté du groupe de gènes Hox, une série d’enhancers (dans le domaine chromatinien appelé T-DOM)
contrôlent l’expression proximale de Hoxd9 à Hoxd11 et de l’autre côté, une série d’enhancers (dans le
domaine chromatinien appelé C-DOM) contrôlent l’expression distale de Hoxd10 à Hoxd13 (Montavon et
al., 2011 ; Andrey et al., 2013). Une frontière de TAD (domaine d’activation topologique) avec des protéines
CTCF attachées dessus entre les gènes Hoxd11 et Hoxd12 assurent une relative imperméabilité entre les
deux séries d’enhancers, empêchant par exemple Hoxd13 d’être exprimé dans la région proximale
(Rodriguez-Carballo et al., 2017).

**Figure 7-194. Les domaines chromatiniens autour du locus HoxD. Schéma du locus HoxD montrant le groupe de
gènes (au centre) entouré d'enhancers de membres (cercles bleus et jaunes) et de gènes voisins (boîtes grises). Le
positionnement des protéines CTCF accrochées à l'ADN est montrée, ainsi que l'orientation de leurs sites de liaison
(pointes de flèches bleues et rouges). Les domaines de régulation C-DOM (bleu) et T-DOM (vert, divisé en deux sous-
TAD) sont représentés par des triangles. Sur la gauche, un diagramme de membre de souris à E12.5 montre le tissu
où C-DOM et T-DOM sont actifs (même code couleur). Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2015083117

547
L'axe antéro-postérieur et son contrôle
L’axe antéro-postérieur est contrôlé par la ZPA, qui est une région dans la partie postérieure du
bourgeon de membre. Sa greffe dans la région antérieure d’un bourgeon de membre receveur
entraîne une duplication des doigts avec un patron en miroir.
*Figure 7-195. Greffe d’une ZPA dans un bourgeon de
membre receveur normal. Au bout de quelques jours on
observe le squelette du membre obtenu (f) à comparer
avec un squelette normal (c). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2017.00014/full

La greffe d’une ZPA de souris dans la partie antérieure d’un bourgeon de membre de poulet
provoque également une duplication en miroir des doigts (dont les cellules seront formées à partir
des cellules de poulet et non de souris, ce qui démontre une fois de plus l’induction). Cela démontre
que le signal en provenance de la ZPA est conservé chez tous les Vertébrés.

Il s'est écoulé 25 ans entre la découverte de l'activité ZPA par Saunders et Gasseling en 1968 et la preuve
formelle que c'est Shh qui est le morphogène impliqué que la ZPA produit (Riddle et al., 1993). Un
dosage de la Shh dans des portions de bourgeons de membre à partir d’un test biologique a montré qu’il y
a 5 fois plus de Shh dans les tissus postérieurs d’un bourgeon de membre que dans les tissus antérieurs.

L'expression de Shh dans la ZPA est contrôlée par un enhancer de 800 pb, la ZRS, qui se trouve 1 Mb (1
million de paires de bases) en amont du site de démarrage de la transcription de Shh. Des mutations
ponctuelles dans cet enhancer provoque des malformations des doigts chez l'Homme comme la polydactylie
préaxiale de type 2, la syndactylie de type IV ou le syndrome mésomélique de Werner syndromes (Lettice
et al., 2003, 2008; Farooq et al., 2010; Furniss et al., 2008; Gurnett et al., 2007; Semerci et al., 2009;
Wieczorek et al., 2010). Les limites du domaine d'expression de Shh sont contrôlées au cours du
développement du bourgeon par les facteurs de transcription Ets Etv4 et Etv5 (Lettice et al., 2012). Si on
mute leurs sites de liaison dans la ZRS, une expression ectopique de Shh apparaît dans la région antérieure
du bourgeon, ce qui aboutit à des malformations digitales. GATA6 intervient également pour éviter une
expression antérieure de Shh (Kozhemyakina et al., 2014).

548
 **Figure 7-196. Action inhibitrice de GATA6 sur l'expression de Shh dans la région antérieure du bourgeon de
membre postérieur. GATA6 est exprimé dans la partie antérieure du bourgeon du membre postérieur de la souris
en développement (en haut) et réprime spécifiquement la polydactylie (PD) dans le membre postérieur en bloquant
directement l'expression antérieure de Shh (avec l'aide des cofacteurs transcriptionnel FOG). GATA6 réprime ainsi
l'expression des deux cibles transcriptionnelles directes de Shh (Gli1 et Grem1) dans le mésenchyme du bourgeon
de membre antérieur et des cibles indirectes (FGF4/8) dans l'AER antérieur. Dans les bourgeons des membres
postérieurs sans GATA6 (en bas), l'expression ectopique de Shh dans le mésenchyme antérieur induit l'expression
de Gli2/3 sous leur forme activatrice de la transcription et aussi l'expression de Gli1. Ensemble, ils activent
l'expression de l'antagoniste de BMP Grem1, protège l'expression de FGF4/8 dans la région antérieure de la crête
ectodermique apicale de l'influence inhibitrice de BMP. En conséquence, les membres postérieurs de ces animaux
présentent une polydactylie préaxiale. Les gènes exprimés sont indiqués par une police noire ; les gènes éliminés ou
réprimés sont indiqués en gris. Source : Kozhemyakina et al., 2014

Cette région antérieure qui s'oppose à l'expression de Shh est mise en place par Irx3/5 au début du
développement du bourgeon de membre (Li et al., 2014).

Des 2 transducteurs nucléaires de Shh, Gli3 a la plus forte activité de répresseur en absence de Shh et Gli2
est l’activateur le plus puissant en présence de Shh (Sasaki et al., 1999). Gli1 n’est pas régulé par la
protéolyse lors de la voie de transduction Shh comme Gli2 et Gli3, mais est lui-même une cible
transcriptionnelle directe de la voie de signalisation Shh ainsi qu’un activateur transcriptionnel des cibles
de Shh (Bai et al., 2002, Sasaki et al., 1999). Gli1 est en grande partie inutile pour le développement normal
des membres, bien que des phénotypes de malformations subtiles des doigts se produisent chez les mutants
nuls Gli1 dans le contexte d’autres mutations affectant la voie de signalisation (Park et al., 2000). Des
analyses de mutants de souris ont démontré que Gli3 joue le rôle principal dans le membre, alors que Gli2
joue un rôle mineur (Bowers et al., 2012). La perte de Gli3 entraîne une polydactylie et une perte partielle
de la régionalisation antéro-postérieure, suggérant qu’un gradient de Gli3 répresseur (Gli3R) peut à la fois
restreindre le nombre de doigts et réguler leur identité AP (Wang et al. , 2000). De plus, Gli3 est épistatique
à Shh. Le knock-out composé Shh-/-;Gli3-/- a un phénotype de membre polydactyle identique au
mutant Gli3-/- seul, indiquant que le rôle majeur de Shh dans l’autopode est d’inhiber la formation de Gli3R
(Litingtung et al., 2002; Welscher et al., 2002).

549
 ***Figure 7-197. La signalisation Shh dans le bourgeon de membre régule l'acétylation de H3K27 dans un sous-
ensemble de régions auxquelles se lie GLI.
(A) Schéma expérimental permettant d'identifier différentes catégories de régions liées aux facteurs GLI (GBR). On
compare les régions liées à GLI dépendant ou indépendant de la présence de Shh, en comparant les résultats des
immunoprécipitations avec un anticorps reconnaissant la marque épigénétique H3K27 de bourgeons de membre de
souris sauvage (WT) ou sans Shh (Shh-/-). Les bourgeons de membre utilisés proviennent de souris de E10,5. (B)
Heatmap illustrant l'enrichissement différentiel en H3K27ac dans les bourgeons des membres WT et Shh-/- pour les
GBR sensibles et insensibles ("stable") à Shh. (C) Classification des catégories de GBR selon leur réponse obtenue en
B (D-F) L'enrichissement en H3K27ac dans les bourgeons de membre WT et Shh -/- est montré dans une région
génomique représentative près d'un GBR insensible (D) et des GBRs connus comme répondant à Shh : un GBR de
GRE1 codant Gremlin1 (E) et un GBR de Ptch1 (F). Source : https://elifesciences.org/articles/50670

Les souris Shh-/- présentent des bourgeons de membre tronqués, réduits à leur partie proximale.
C’est la conséquence du fait que SHH a également un rôle de maintien de l’AER et de sa sécrétion de
FGF et en retour, les FGF de l’AER sont nécessaires au maintien de la ZPA et de sa sécrétion de SHH.
Le tout constitue une boucle de rétrocontrôle positive. Le mécanisme par lequel Shh maintient FGF dans
l'AER implique le contrôle par Shh des interactions entre la protéine Gremlin et les BMP. L'expression de
Gremlin est initialement activée par le facteur de transcription bHLH dHand (ou Hand2) (te Welscher et al.,
2002) mais c'est la voie de signalisation Shh qui le maintient. Gremlin empêche les BMP produits dans le
mésenchyme mésodermique d'inhiber l'expression de FGF dans l'AER.

La manipulation de l’AER en conjonction avec une exposition à Shh ou Fgf4 exogène chez l’embryon de
poulet a établi que l’AER est nécessaire pour induire l’expression de Shh. Une ablation de l’AER peut être
compensée par l’ajout de Fgf4 (Laufer et al., 1994, Niswander et al., 1994). Shh, à son tour, induit
l’expression de Fgf4 dans l’AER postérieur, formant une boucle de rétroaction positive entre ZPA et AER. La
suppression des deux Fgf4;Fgf8 chez la souris a définitivement montré que les AER/FGFs sont essentiels
pour l’initiation de l’expression de Shh dans le membre (Sun et al., 2002). Les facteurs de transcription de
la famille Ets, effecteurs nucléaires des signaux FGF, sont des régulateurs clés de l’enhancer du membre ZRS
de Shh (Lettice et al., 2012).

Des études génétiques chez la souris ont révélé que la cible mésodermique Shh, Gremlin (Grem1), un
antagoniste sécrété des BMP, initialement caractérisé par la mutation de déformation des membres qui
perturbe la fonction d'un enhancer de membre à longue portée de Grem1 (Zuniga et al., 2004), relaie le Shh
signal à l'AER en modulant les effets négatifs des Bmps sur le maintien de l'AER (Zuniga et al., 1999). La
caractérisation de l'enhancer Grem1 a révélé une régulation complexe par la voie Shh, impliquant un rôle
potentiel pour GliA en plus d'un effet majeur de dérépression Gli3R (Benazet et al., 2009, Li et al., 2014,
Nissim et al., 2006, Vokes et al., 2008, Zuniga et al., 2012).

550
 **Figure 7-198. L'activité de l’enhancer de GRE1
nécessite une signalisation Shh. (A-E′) Les membres
antérieurs de souris transgéniques GRE1LacZ+/−
exprimant LacZ sous le contrôle d'un enhancer de
Gremlin1 ont été cultivés dans des milieux de contrôle
contenant le solvant (A-E) tandis que leurs membres
antérieurs controlatéraux ont été cultivés dans de la
cyclopamine (A′-E′), un inhibiteur de la signalisation
Shh, comme le montre le schéma (B). Le stade des
bourgeons des membres au début de l'expérience est
indiqué sur la gauche. (C″-E″) Graphiques indiquant la
taille du domaine mesurée par le rapport de la surface
colorée à la β-galactosidase à la surface totale des
bourgeons des membres pour les bourgeons des
membres témoins (noirs) ou traités à la cyclopamine
(rouges). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/141/9/1906/19387/A-Gli-silencer-is-required-for-
robust-repression

BILAN :
*Figure 7-199. Maintien mutuel de l'AER et de la ZPA. Le
long de l'axe antéro-postérieur, le gradient de Shh se
traduit essentiellement par un gradient opposé de
l'activité répressive de Gli3R. D'après
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/07/Limb_bud_early_signals.p
ng

Au fur et à mesure que le bourgeon de membre s'allonge, la ZPA (et l'expression Shh) persiste distalement
dans le mésenchyme postérieur sous-jacent à l'AER. L’expression de Shh dans les cellules mésodermiques
postérieures plus proximales diminue à mesure que les cellules se déplacent au-delà de l'influence des FGF
sécrétés par l’AER. Chez le poulet, FGF2, FGF4 ou FGF8 sont suffisants pour sauver l'expression de SHH en
l'absence d’AER. Lhx2 est l’intermédiaire activé par les FGF et qui contrôle l'expression de SHH.

La boucle de régulation de maintien mutuel entre les FGF et Shh se termine lorsque le facteur de
transcription Tbx2 inhibe l'expression de Gremlin (Farin et al., 2013).

551
 *Figure 7-200. Tbx2 réprime directement l'expression
de Grem1 dans le mésenchyme postérieur des
bourgeons de membre matures.
(A–F) Analyse en hybridation in situ de l’expression
de Tbx2 et de Grem1 dans les membres postérieurs
d’embryons à E12.0 et E11.5 sauvages ou Tbx2−/−. Les
flèches (C, F) indiquent l’expansion postérieure de
l’expression de Grem1 dans les bourgeons Tbx2−/−. Des
lignes pointillées blanches délimitent la limite
antérieure de l’expression de Tbx2. (G–I) Analyse
comparative de l’expression de cre, contrôlée par les
régions régulatrices de Tbx2, et de Grem1 par
hybridation in situ sur des sections sagittales
adjacentes des membres postérieurs d’embryons
E11.5 Tbx2cre/+ (contrôle) et Tbx2cre/cre (mutant).
Les plans de coupe sont indiqués par des lignes noires
en E et F. Les pointes de flèches marquent la limite
antérieure de l’expression cre (en vert) et la limite
postérieure de l’expression Grem1 (en rose). Les
superpositions de fausse couleur dans (I) montrent
l’expansion postérieure de Grem1 dans les membres
postérieurs de Tbx2−/−. (J–K) Analyse en ChIP
(immunoprécipitation de la chromatine) utilisant la
chromatine des moitiés antérieure ou postérieure des
membres postérieurs de type sauvage E11.5. Le schéma
(J) montre l’expression de Tbx2 (bleu) exclusivement
dans la moitié postérieure du membre. (K) Détection
par ChIP-PCR des régions d’ADN liées à Tbx2. L’ADN
génomique total a été utilisé comme témoin positif.
Dans les moitiés postérieures des membres, Tbx2 se lie
à l’enhancer qui contrôle l’expression dans le membre
de Grem1 mais pas aux autres régions génomiques qui
servent de contrôle. Source :
https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1003467

Les cibles de la voie Shh dans le membre ont été identifiées d'une part à partir d'une analyse à l'échelle du
génome des sites de liaison directs de Gli3 dans les bourgeons de membre de souris par ChIP avec un
transgène Gli3 marqué avec un tag (Vokes et al., 2008) et d'autre part à partir de plusieurs analyses
d'expression génique à la suite d'activations et inhibitions de la voie Shh (Lewandowski et al., 2015, McGlinn
et al., 2005, Probst et al., 2011). L'identification des sites de liaison des Gli in vivo a révélé plus de 200 gènes
cibles avec des séquence de liaison aux Gli (GBR) ainsi qu'un ensemble de cibles tout aussi large dépourvu
de GBR, qui restent moins bien caractérisés (Vokes et al., 2008). La majorité des gènes cibles GBR+ qui sont
exprimés dans un domaine postérieur sensible à Shh sont régulés principalement par la dé-répression
(c'est-à-dire la libération de Gli3R du site).

Les cibles Shh comprennent trois classes fonctionnelles principales : 1) les cibles qui fournissent
directement des informations de position conduisant à des identités spécifiques et/ou à des relais d'indices
de position (par exemple, les différentes zones antéro-postérieures) vers d'autres signaux en aval ; et 2) des
cibles jouant un rôle dans l'expansion des bourgeons des membres – qui comprend à la fois des cibles
directes agissant dans le mésoderme et des relais vers l'ectoderme pour moduler la fonction de l'AER et des
FGFs qu'il produit. Un troisième groupe est constitué de cibles directes impliquées dans la transduction ou
la régulation de la voie Hh elle-même, contribuant à de vastes circuits de rétroaction interconnectés. La
régulation croisée et de rétroaction élaborée entre Shh lui-même, l'expression de Gli3 et les cibles « en aval »
a rendu difficile la séparation nette des contributions fonctionnelles des différents composants du réseau
de régulation génique. Ces cibles incluent plusieurs régulateurs de l'expression de Shh tels que Prdm1
(Robertson et al., 2007).

552
 **Figure 7-201. Les membres antérieurs déficients en Prdm1 ne parviennent pas à maintenir la ZPA. Comparaison
des bourgeons de membres antérieurs (FL) et postérieurs (HL) de type sauvage (A,C,E,G,I,K,M,O,Q) et mutant
(B,D,F,H,J,L,N,P,R) en hybridation in situ. (A-C) L'activation de l'expression de Shh, un marqueur de la ZPA, se déroule
normalement à E10,5 dans les bourgeons des membres postérieurs sans Prdm1, mais est nettement réduite dans le
bourgeon des membres antérieurs (B). En E11,5, l'expression de Shh est confinée à une petite parcelle de
mésenchyme distal dans les membres antérieurs mutants (D). (H) Les membres mutants sans Prdm1 expriment Fgf4
dans l'AER en formation à E10.5. En revanche, par E12.5, Fgf8 est absent du membre proximal postérieur mutant (J),
en raison de la perte de l'AER et du mésenchyme sous-jacent. L'expression de Lmx1 montre une structuration D-V
normale dans le membre antérieur (K,L). L'étude de l'expression de Tbx2 (N) et de Gli1 (P) dans les bourgeons des
membres antérieurs déficients en Prdm1 mettent en évidence la perte rapide de tissu postérieur. Grem1 (Gremlin)
est exprimé dans les bourgeons des membres mutants bien qu'à des niveaux inférieurs (R). Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7116377/#!po=20.5000

Parmi les cibles de la voie de signalisation Shh potentiellement régulatrices de l'identité des doigts, les gènes
de la partie 5' des complexes Hoxd et Hoxa ont été les plus fortement impliqués sur la base des phénotypes
des mutants simples et composés (Davis et Capecchi, 1996, Zakany et al., 1997). Cependant, il n'y a pas de
« code Hox » ; leurs cibles sont encore mal comprises et les mécanismes par lesquels ils transmettent des
indices de position précoces restent peu caractérisés.

Polarité dorso-ventrale du bourgeon de membre

La polarité dorso-ventrale correspond par exemple à la différence entre le dos et la paume de la
main. C'est l'ectoderme qui contrôle l'identité dorso-ventrale du mésenchyme mésodermique du
bourgeon de membre car si, avec des excisions et des greffes, on inverse les positions de l'ectoderme
dorsal et de l'ectoderme ventral, l'ensemble du membre aura une polarité inversée. Cela amène à
penser qu'un signal inducteur est envoyé de l'ectoderme au mésoderme sous-jacent. Ce signal
inducteur a été identifié comme Wnt7a et il est sécrété par les cellules de l'ectoderme dorsal (et pas
les cellules de l'ectoderme ventral). Il induit l'expression du facteur de transcription Lmx1b dans le
mésoderme dorsal.

553
Les souris knock-out Lmx1b-/- présentent des membres avec uniquement des structures ventrales. Des
patients avec des mutations perte-de-fonction de LMX1B n'ont pas d'ongle à leurs doigts et pas de rotule à
leur genoux (ongles et rotules sont typiquement des structures dorsales).

Les structures ventrales ne sont cependant pas produites par défaut. Elles nécessitent l'expression
de Engrailed-1 dans l'ectoderme ventral. Cette expression est induite par des BMP en provenance
du mésenchyme mésodermique.
*Figure 7-202. La régionalisation dorsoventrale du
bourgeon de membre est altérée par la perte ou le gain
de fonction de BMP. Des coupes présentent (A-C) un
bourgeon de membre (bdm) contrôle de stade 20 (D-G)
un bdm de même stade infecté par des rétrovirus
permettant d'exprimer Noggin, un inhibiteur des BMP et
(H-K) un bdm infecté avec un rétrovirus permettant
d'exprimer BmpRIB activé de manière constitutive. La
surexpression de Noggin entraîne des membres
dorsalisés en raison de la perte d'EN1 et de l'expression
ectopique de Wnt7a et Lmx1 sur la face ventrale
(marquée par des astérisques dans D-F), tandis que la
surexpression de BmpRIB constitutivement activé
ventralise le membre en raison de l'expression ectopique
de EN1 et de l'inhibition de l'expression de Wnt7a et de
Lmx1 sur le côté dorsal (marqué par + dans H-J). A noter
qu'en H-K, il n'y a pas d'AER morphologique. (G, K)
Anticorps anti-GAG pour révéler la distribution du
rétrovirus. (L-M) Double hybridation in situ pour Fgf8
dans l'AER et Shh dans le mésenchyme. (L) Contrôle, (M)
bdm infecté surexprimant Noggin, (N) bdm infecté
surexprimant Lmx1. La ligne blanche marque la ligne
médiane de l'AER et de l'interface DV. Après la
dorsalisation des membres due à une surexpression de
Noggin ou Lmx1, l'expression de Shh est élargie
ventralement. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/128/22/4463/41557/BMP-controls-
proximodistal-outgrowth-via-induction

Comme nous l'avons vu avec la coordination entre le développement de l'axe proximo-distal et

antéro-postérieur, l'axe dorso-ventral ne se met pas en place de manière isolée. Par exemple,
l'absence de Wnt7a aboutit non seulement à des membres ventralisés mais aussi à un manque de
doigts postérieurs. Cela vient du fait que Wnt7a participe au maintien de l'expression de Shh dans
la ZPA en synergie avec FGF4 venant de l'AER.

Contrôle de l'apoptose interdigitale

L'apoptose dans le mésenchyme interdigital est indispensable à la morphogenèse des doigts. Elle
est induite par les BMP.

554
 *Figure 7-203. Les BMP sont nécessaires à l'apoptose
interdigitale. Coloration à l'acridine orange (points
jaunes) d'extrémités de bourgeons de membre
postérieur d'embryons de souris à E15.5 sauvages (E, G)
ou avec une délétion conditionnelle des gènes codant
BMP2 et BMP4 Bmp2C/C;Bmp4C/C;Prx1::cre (F, H). Source
: https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.0020216

L'un des gènes cibles de la voie BMP dans la zone interdigitale pour le déclenchement de l'apoptose est celui
codant le facteur de transcription Msx2.
**Figure 7-204. La voie de signalisation BMP active
l'expression de Msx2 dans la zone interdigitale grâce à un
fragment de 52 pb du promoteur de Msx2. Une souris
transgénique est réalisée avec le gène LacZ sous le
contrôle d'un promoteur minimal et d'un fragment de 52
pb du promoteur de Msx2 comportant des séquences de
fixation de SMAD4, le facteur de transcription activé par
la voie BMP4. On observe que le gène rapporteur est bien
activé dans la zone interdigitale dans un bourgeon de
membre d'une souris transgénique à E13,5. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/131/20/5153/52406/A-
phylogenetically-conserved-cis-regulatory-module

Les doigts sont protégés de l'action des BMP par l'expression de Noggin (Merino et al., 1998).

Dans la future aile de la chauve-souris ainsi que dans la future patte postérieure de canard, on
n'observe pas d'apoptose contrairement aux futures pattes de la souris ou du poulet.
*Figure 7-205. Apoptose réduite dans la patte
postérieure du canard par rapport à celle de poulet. Un
marquage de l'apoptose est réalisé grâce à un anticorps
anti-caspase 3 clivé. Source :
https://grupos.unican.es/apoptosis/pagina3.htm

Les mécanismes moléculaires de ces différences ont été étudiés. Dans la zone interdigitale de la future aile
de la chauve-souris ainsi que de la future patte postérieure de canard, un ligand Gremlin est produit et
inhibe l'action des BMP. Dans la future aile de la chauve-souris des ligands FGF agissent en complément
pour maintenir en vie les cellules de la zone interdigitale et en plus activer leur prolifération ce qui permet
de créer la grande surface portante interdigitale.

La régénération des bourgeons de membre

Les Amphibiens Urodèles et tout particulièrement les salamandres et les axolotls ont d'excellentes
capacités de régénération des membres et sont devenus des organismes modèles. La régénération
implique non seulement le remplacement des tissus excisés (avec notamment une bonne
régionalisation proximo-distale) mais aussi une bonne intégration avec les tissus restants.

555
Les membres d'axolotl sont composés de nombreux types de cellules différentes provenant de lignées
neurales, myogéniques, épidermiques et de tissu conjonctif. Lors de l'amputation d'un membre, les cellules
situées à proximité du plan d'amputation (jusqu’à 1 mm de profondeur) s'accumulent dans un tissu
distinctif appelé blastème, qui sert de source de cellules progénitrices pour construire le nouveau membre.
*Figure 7-206. Coupes proximo-distales de membres
d'axolotl en régénération, 10, 20 ou 30 jours après
l'amputation colorées avec de l'hématoxyline/éosine
(colorants histologiques généraux) et du bleu alcian
(colore les cartilages en bleu). L'os du moignon est
indiqué (stump bone). La ligne noire correspond à la
ligne où a été réalisée l'amputation. On voit qu'à 10 jours,
le blastème s'est mis en place et qu'à 20 jours la
croissance du cartilage est bien entamée. A 10 jours, on
observe en superficie l'épithélium de cicatrisation (WE)
formé par des kératinocytes qui ont migré pour refermer
la blessure. Barre d'échelle = 1 mm. Source :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0133375

La source des cellules du blastème est locale. Si, par une irradiation aux rayons X, on détruit les cellules juste
derrière la cicatrice, le membre ne régénère pas alors qu’il régénère si on irradie des cellules plus éloignées.

Les souches d'axolotl transgéniques dans lesquelles les descendants de types cellulaires adultes distincts
peuvent être marqués, suivis et isolés au cours du processus de régénération permettent de comprendre
comment des lignées cellulaires particulières se développent pendant la formation du blastème et la
régénération ultérieure des membres. La combinaison de ces souches d'axolotl transgéniques avec le
séquençage d'ARN en cellules isolées (scRNA-seq) permet le suivi de types cellulaires individuels, ainsi que
la reconstruction des étapes moléculaires (Gerber et al., 2018). Les cellules du tissu conjonctif, descendantes
du mésoderme des lames latérales, sont la lignée la plus abondante contribuant au blastème (40% environ)
et régénèrent les os et le cartilage, les tendons, le périsquelette et les fibroblastes dermiques et interstitiels.
Les restrictions de lignage sont plus marquées pour les autres cas : les nouvelles cellules musculaires
proviennent seulement de cellules musculaires, les nouvelles cellules de Schwann proviennent uniquement
des cellules de Schwann et ainsi de suite.

Le manchon épidermique qui recouvre le blastème produit du FGF qui est essentiel pour la prolifération
des cellules du blastème, ce qui rappelle les fonctions de l’AER avec le mésenchyme sous-jacent durant le
développement normal. On retrouve également l’expression de Shh dans la région postérieure. Les gènes
Hox sont aussi activés précocement avec Hoxa9 et Hoxa13 exprimés dans tout le blastème puis
progressivement l’expression caractéristique « en nid » des gènes Hox se met en place comme lors du
développement normal.

Chez les mammifères, les capacités de régénération sont très modestes comparées à l'axolotl et limitées au
tiers distal du troisième segment phalangien (l'élément terminal). Cette réponse régénérative est spécifique
du niveau d'amputation : l'amputation du tiers distal du segment phalangien terminal peut se régénérer,
alors qu'une amputation du segment phalangien moyen forme seulement un cal hypertrophique de l'os
(Han et al., 2008).

556
 *Figure 7-207. Régénération de la partie distale de la dernière phalange chez la souris. A gauche, on observe la
dernière phalange avant amputation. L'amputation se fait au jour 0 (D0) et on suit la régénération jusqu'au jour 42
(D42). Coloration histologique trichrome Masson. Source : https://elifesciences.org/articles/71542

Aspects Evo/Dévo
Le développement de nageoires latérales ou de membres chiridiens chez les Vertébrés utilise une cascade
de régulation génétique dont certains éléments sont présents chez les Cordés non-Vertébrés qui ne forment
pourtant pas de nageoires latérales ou de membres. Par exemple, le gène Tbx4/5 du Céphalocordé
Amphioxus est capable de sauver le développement du bourgeon de membre antérieur d'une souris Tbx5-/-
(Minguillon et al., 2009). Le gène Tbx4/5 ne s'exprime cependant pas dans le flanc de l'Amphioxus (mais
dans le cœur). On pense que le gène Tbx4/5 ancestral des Cordés s'est dupliqué chez les Vertébrés en Tbx4
et Tbx5 et que l'expression de ces gènes a été modifiée au cours de l'évolution ce qui a permis leur
expression régionalisée dans le flanc, permettant aux nageoires paires et aux membres chiridiens de se
développer.
**Figure 7-208. Modèle d'évolution de Tbx4 et de
Tbx5 chez les Cordés. Le gène ancestral Tbx4/5 est
exprimé dans le cœur (H) puis après duplication
génique, Tbx4 et Tbx5 sont en plus exprimés dans le
mésoderme des lames latérales (LPM) à partir
duquel se développe les nageoires paires et les
membres chiridiens. Il y a également une
régionalisation de l'expression (Tbx5 antérieur et
Tbx4 postérieur) qui n'est pas représentée ici. Source :
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.0910153106

La transition nageoire-membre est une étude de cas classique de l'évolution morphologique. Cette
évolution a eu lieu au Dévonien parmi un groupe de Sarcoptérygiens (qui ont des muscles dans leurs
nageoires paires contrairement au Actinoptérygiens) à partir des nageoires paires (pectorales pour
les membres antérieurs et pelviennes pour les membres postérieurs). Les membres de Tétrapodes
ont d'abord évolué dans des organismes exclusivement aquatiques et ce n’est qu'après qu'ils ont
permis la sortie de l'eau par exaptation.

Les gènes du développement des nageoires paires du dipneuste (des Sarcoptérygiens très proches des
Tétrapodes) ont fait récemment l'objet d'une étude poussée. 330 enhancers ou éléments de régulations
transcriptionnels ont été comparés dans les génomes d'Actinoptérygiens, du Dipneuste et de Tétrapodes. Il
en découle que 113 de ces enhancers sont présents chez les Actinoptérygiens, 31 de plus sont présents chez
les Sarcoptérygiens et 9 de plus sont présents chez les Tétrapodes.

557
 **Figure 7-209. Comparaison des enhancers impliqués
dans l'expression des gènes contrôlant le
développement des nageoires paires ou des membres
chiridiens chez les requins (shark), les Actinoptérygiens
(ray-finned fish), les Sarcoptérygiens (lobe-finned fish)
et les Tétrapodes. Source
: https://www.nature.com/articles/s41586-021-
03198-8

On en déduit que l'essentiel du réseau de régulation génique des membres chiridiens est déjà présent chez
les Sarcoptérygiens et que la formation des membres chiridiens n'a tenu qu'à l'ajout de 9 enhancers (et à
des modifications chez quelques autres enhancers). C'est une vision sans doute réductionniste mais cela
confirme la profondeur évolutive du réseau génétique qui façonne les membres chiridiens des Tétrapodes.

Nous avons vu que les membres des Tétrapodes sont composés de trois modules : le stylopode, le zeugopode
et l'autopode, qui sont ordonnés de manière proximale à distale. En revanche, les nageoires de poisson sont
souvent subdivisées en différents modules anatomiques le long de l'axe antéro-postérieur : le propterygium,
le mesopterygium et le métaptérygium. L'autopode (poignet et doigts) semble être la nouveauté
morphologique la plus apparente au cours de la transition nageoire-membre (Clack, 2009), bien que cette
différence ait été exagérée par le passé en se concentrant sur le poisson-zèbre, un organisme modèle qui a
des nageoires assez modifiées par rapport à la situation ancestrale. Plusieurs études ont en effet révélé que
la régulation spécifique de Hoxa13 et Hoxd10-13, qui contrôlent la formation des autopodes, est également
conservée chez les vertébrés non tétrapodes (Tanaka et al., 2016; Freitas et al., 2007; Gehrke et al. 2014),
sauf que les domaines d'expression de Hoxa13 et Hoxa11 s'excluent mutuellement dans les membres de
souris et de poulet tout en se chevauchant dans les bourgeons de nageoires de poisson examinés.
**Figure 7-210. Des enhancers contrôlant l'expression
des gènes HoxA et HoxD 5' chez un poisson activent
l'expression d'un gène rapporteur dans l'autopode
chez la souris. Des souris transgéniques sont produites
où divers enhancers contrôlant l'expression des gènes
HoxD 5' (Island I, CsB) ou des gènes HoxA 5' (e16) d'un
Lepisostéidé (bar) ou du poisson-zèbre contrôlent
l'expression du gène rapporteur LacZ. On constate que
ces éléments sont actifs dans l'autopode de souris pour
les 3 éléments provenant du Lepisostéidé avec des
patrons qui rappellent les gènes HoxA/D de la souris.
En revanche, l'orthologue Island 1 en provenance du
poisson zèbre n'est pas activé, ce qui montre que des
structures homologues à l'autopode existent chez les
poissons mais que le poisson-zèbre les a perdus.
Source : https://www.pnas.org/content/pnas/112/3/803.full.pdf

Bien que plusieurs différences de régulation des gènes aient été proposées pour expliquer la différence
anatomique entre les nageoires et les membres, ces propositions ont été exclusivement axées sur les gènes
Hox (Kherdjemil et al., 2016 ; Nakamura et al., 2016 ; Sheth et al., 2012 ; Woltering et al., 2014) et il y a sans
doute beaucoup de choses intéressantes à découvrir avec l'étude des autres gènes impliqués.

Signalons qu'une transition membre chiridien-nageoire (donc inverse de celle qui a eu lieu au Dévonien) a
eu lieu lors de l'évolution des Cétacés pour le membre antérieur il y a environ 50 millions d'années. Cela
s'est accompagné par un prolongement du fonctionnement de l'AER (et de la sécrétion des FGF) ce qui a
permis de générer une structure plus longue, notamment de longues phalanges qui sont les principales
structures portantes des nageoires antérieures des Cétacés. L'apoptose interdigitale a été bloquée en
558
inhibant l'action des BMP par Gremlin (comme dans la patte postérieure de canard) (Cooper et al., 2004).
Dans la patte postérieure des Cétacés qui a régressé et est devenu un organe vestigial, l'activité de la ZPA
s'éteint très tôt ce qui provoque l'arrêt du fonctionnement de l'AER et l'arrêt prématuré du développement
du membre (Thewissen et al., 2006).

Pour en savoir plus : voir https://youtu.be/PN3fbmiNI-M

Le développement du cortex

*Figure 7-211. Coupe de cortex de souris avec la

coloration de Golgi. Photo : Patrick Pla à partir de
la collection histologique de la Préparation à
l'Agrégation SVTU, Université Paris-Saclay

Le néocortex cérébral se développe dans la zone la plus superficielle dorsale du télencéphale des
mammifères. Le télencéphale est l'une des 5 vésicules céphaliques et c'est la plus antérieure. Il se
scinde en deux hémisphères qui se creusent chacune d'une cavité : le ventricule I et le ventricule II.

*Figure 7-212. Développement de l'encéphale et notamment du télencéphale à partir duquel se développe (entre
autres) le néocortex. D'après
https://en.wikipedia.org/wiki/Brain_vesicle#/media/File:1302_Brain_Vesicle_DevN.jpg

Le néocortex est constitué de deux classes principales de neurones : les neurones glutamatergiques
(excitateurs) et les interneurones GABAergiques (inhibiteurs). Les cellules glutamatergiques
représentent 70 à 80 % des neurones qui peuplent le néocortex humain. La plupart d'entre eux sont
des neurones pyramidaux, caractérisés par leur morphologie : un corps cellulaire conique, des arborisations
dendritiques apicales et basales qui portent des épines dendritiques comme principales structures
postsynaptiques excitatrices, et un axone se projetant généralement vers des cibles à longue distance. Les
neurones pyramidaux qui peuplent chacune des 6 couches corticales présentent des patrons

559
uniques d'expression génique, de morphologie et de connexions. Schématiquement, les neurones
pyramidaux plus profonds (couches corticales V et VI) se projettent principalement vers les structures sous-
corticales, et les neurones pyramidaux supérieurs (couches corticales II et III) se projettent principalement
vers d'autres zones corticales (projections cortico-corticales), tandis que les neurones de la couche IV
constituent la principale entrée d'informations en provenance des régions sous-corticales.

Les interneurones inhibiteurs GABAergiques, qui n'envoient généralement que des projections axonales
locales, constituent environ 25 % des neurones du cortex humain et sont subdivisés en de nombreux types
selon l'expression des gènes, la morphologie, la connectivité et les propriétés physiologiques. Ces
interneurones ne sont pas générés sur place, contrairement aux neurones excitateurs. Ils sont
générés ventralement à partir des éminences ganglionnaires médiales et leurs précurseurs migrent
ensuite dans le cortex.
*Figure 7-213. Coupe transversale de télencéphale de
souris à E12,5 montrant les origines des neurones
glutamatergiques excitateurs (orange) et des neurones
GABAergiques inhibiteurs (jaune). LGE = éminence
ganglionnaire latérale; MGE = éminence ganglionnaire
médiane.

Enfin, le néocortex est morcelé en de nombreuses aires corticales, chacune spécialisée dans des
fonctions spécifiques, liées à leur connectivité entre elles et avec le reste du cerveau. Les neurones
de différentes zones corticales présentent également des patrons distincts d'expression génique et de
morphologie, ainsi que des proportions spécifiques de classes neuronales.

Des cellules souches neurales aux neurones

Les neurones (puis les cellules gliales, nous le verrons plus loin) sont générés à partir de cellules
souches neuronales qui sont en fait des cellules de la glie radiaire qualifiée de apicale car leur
prolongement est en contact avec la partie apicale du neuroépithélium (du côté du ventricule, c'est-
à-dire de la lumière du tube neural).

Ces cellules souches peuvent subir une division symétrique qui génère deux cellules souches
(expansion) ou une division asymétrique où l'une des cellules reste cellule souche (auto-
renouvellement) et l'autre devient un précurseur qui peut proliférer mais qui finira par se
différencier (en neurone ou en cellule gliale). La régulation entre division symétrique ou asymétrique
dépend de nombreux paramètres, notamment de l'orientation du fuseau mitotique et, étonnamment, de la
taille des mitochondries (les cellules qui gardent des caractères de cellule souche ont de longues
mitochondries tubulaires, les cellules qui perdent ces caractères ont des mitochondries plus nombreuses
mais plus petites) (Iwata et al., 2021).
***Figure 7-214. La dynamique des mitochondries
régule la neurogenèse pendant une période critique
postmitotique. Les cellules de la glie radiaire (ou cellules
souches neurales (NSC) du cortex possèdent des
mitochondries tubulaires pendant l'interphase qui
subissent une fission mitochondriale pendant la mitose.
Après la mitose, les deux cellules filles présentent des
mitochondries fragmentées. Cependant, les cellules qui
subissent une fusion mitochondriale dans les prochaines
heures resteront des NSC, tandis que celles qui
conservent des mitochondries fragmentées deviendront
des neurones. Au cours de cette période critique le sort
des cellules peut être modifié en manipulant la
560
 dynamique des mitochondries. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095943882100057X

Les cellules de la glie radiaire ont un cil primaire qui baigne dans le liquide céphalo-rachidien. Des études
de protéomique ont montré que ce liquide a une composition qui varie au cours du temps : il est d'abord
enrichi en Sonic Hedgehog (à partir de E10,5 chez la souris) puis sa concentration diminue tandis que la
concentration en acide rétinoïque augmente (vers E14,5) (Chau et al., 2015). L'auto-renouvellement et la
prolifération des cellules souches neurales sont dépendants de molécules présentes dans le liquide céphalo-
rachidien.
**Figure 7-215. L'activation de la voie Shh
élargit la population de cellules souches, en
présence d'une activation de la voie Notch. (A)
Les souris Ptc1Lox/Lox;NestinCre (n = 10)
présentent une activité Sonic Hedgehog élevée
et constitutive dans les cellules souches
neurales car on y a délété le gène codant
Patched1 qui est un inhibiteur de cette voie. On
génère des neurosphères à partir du cortex de
ces souris (et de témoins ainsi que de souris
RbpjLox/Lox;NestinCre qui ne peuvent plus
activer la voie Notch dans les cellules souches
neurales). La suractivation de la voie Shh
aboutit à une augmentation de 8 fois du
nombre de colonies de neurosphères primaires
par cellule ensemencée par rapport aux
témoins de la même portée. Cependant la voie
Notch doit concomitamment être
fonctionnelle. (B) Expansion clonale des
neurosphères dérivées de cortex à E14.5. Le
nombre de cellules obtenues à chaque passage
a été transformé en LOG et une analyse de
régression linéaire a été effectuée sur les
courbes résultantes. Le taux d'expansion
clonale des neurosphères est représenté par la
pente de la ligne. Le nombre de cellules
souches est significativement plus élevé dans
les neurosphères Ptc1Lox/Lox;NestinCre par
rapport aux neurosphères Ptc1Lox/Lox.
Cependant, une fois de plus, la voie Notch doit
pouvoir être activée. Source :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/ ournal.pone.0014680
j

La prolifération des cellules de la glie radiaire est aussi sous le contrôle de la signalisation calcique
(McKinney et al., 2022).
***Figure 7-216. Régulation dépendante du calcium
de la prolifération des cellules de la glie radiaire au
cours de la corticogenèse. L'imagerie calcique et les
enregistrements électrophysiologiques effectués
sur des cultures de tranches corticales d'embryons
de rongeur montrent que les cellules gliales radiales
(RGC) dans la zone ventriculaire (VZ) présentent
des augmentations de concentrations de Ca2+
spontanées et induites. La signalisation
purinergique via les récepteurs métabotropiques
P2Y1 initie des augmentations de concentration
calcique transitoires qui se propagent à travers les
cellules de la VZ grâce à des jonctions gap. IP3 est
nécessaire au déclenchement de ces augmentations.
Les cils primaires des RGC font saillie dans les
ventricules, où ils sont exposés à des facteurs de
croissance diffusibles dans le liquide céphalo-

561
 rachidien. Ces facteurs initient des augmentations
de concentration en Ca2+ et influencent également la
division des RGC. Enfin, la dépolarisation médiée
par le GABA et le glutamate agissant respectivement
sur les GABAR et les AMPAR, contrôle la
prolifération en induisant des augmentations de
concentration calcique via les VGCC (canaux
calciques voltage-dépendants). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/149/17/dev198853/276624/Calcium-and-activity-dependent-
signaling-in-the

Le néocortex des Mammifères possède 6 couches avec des types neuronaux bien précis dans
chacune des couches.
*Figure 7-215. Des exemples de marquage spécifique
dans les couches corticales de neurones.
Immunofluorescence pour marquer les neurones des
couches II – IV (anticorps anti-CUX1), les neurones des
couche V/VI (anticorps anti-CTIP2) et les neurones à
projection calleuse (anticorps anti-SATB2) dans des
coupes cérébrales coronales de souris P14. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925817483414

Les 6 couches sont générées de manière inversée. Les neurones les plus précoces occupent les
couches les plus profondes et les derniers neurones produits occupent les couches les plus
superficielles. Les neurones se développent par vagues de neurogenèse, migration radiale et
différenciation à partir des progéniteurs gliaux radiaux de la zone ventriculaire et des cellules progénitrices
intermédiaires de la zone sous-ventriculaire.

562
 *Figure 7-216. Mise en évidence de l'ordre de production des neurones dans les couches du cortex. Les études de
suivi de cohortes de prolifération marqués à des temps différents démontrent le schéma intérieur-extérieur du
développement cortical cérébral. Des rats femelles gestantes reçoivent des injections de thymidine tritiée ( 3H) à des
stades de plus en plus avancés de la gestation (E11, E13, E15). La thymidine tritiée s'incorpore dans l'ADN des
cellules qui sont en réplication à ce moment-là. Lorsque les petits sont nés, on leur permet de survivre jusqu'à la
maturité, puis leurs cerveaux sont traités pour révéler les cellules marquées. Les neurones qui sont issus de la
prolifération au 11ème jour embryonnaire se trouvent principalement dans la sous-plaque (la matière blanche sous-
corticale), tandis que les neurones issus de la prolifération au jour E13 se trouvent dans les couches corticales
profondes, c'est-à-dire les couches V et VI. Les neurones issus de prolifération au jour E15 se trouvent dans les
couches corticales plus superficielles, c'est-à-dire IV, III et II. B. Des résultats similaires ont été obtenus chez le singe
avec une chronologie plus lente ce qui permet de mieux distinguer les cohortes de nouveaux neurones.
D'après https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2019.00576/full

La vitesse de prolifération des cellules souches et des précurseurs tend à ralentir au cours du temps durant
le développement du cortex. Si on abolit l'expression du gène p27 qui est un inhibiteur de CDK qui "freine"
la progression dans le cycle cellulaire, on obtient des couches corticales II-IV qui possèdent plus de neurones
et qui sont plus épaisses (Caviness et al., 2003).
*Figure 7-217. L'absence d'un inhibiteur de CDK
aboutit à des couches corticales plus épaisses.
Développement du cortex à E14 (A) et P21 (B) chez
des souris p27-/- (A) Photographies du cerveau
antérieur d'une souris sauvage (à gauche) et d'une
souris knockout p27-/- (à droite) à E14 ; la zone du
cortex dorsomédial où toutes les analyses ont été
effectuées est entourée d'un rectangle et est montrée
à plus fort grossissement en dessous. (B)
Photographies du néocortex dorsomédial mature à
P21 montrant le cortex relativement plus épais chez
la souris knockout p27-/- (à droite) et l'augmentation
de l'épaisseur des couches supragranulaires (II-IV).
Source : https://academic.oup.com/cercor/article/13/6/592/360927

Durant tout le processus, le maintien des cellules souches neurales est crucial. Les progéniteurs
neurogéniques intermédiaires expriment Delta-like 1 (Dll1) et activent la voie Notch dans les cellules
souches ce qui inhibe leur différenciation et les maintient dans un état de cellule souche (l'importance de
cette signalisation a déjà été mise en évidence dans les expériences en parallèle avec la voie Shh plus haut).

563
Cette communication Dll1/Notch juxtacrine se passe grâce à de longs prolongements avec lesquels les
progéniteurs et les cellules souches entrent en contact (Nelson et al., 2013).

*Figure 7-218. Les cellules gliales radiaires

fonctionnent à la fois comme la source et le support des
neurones nouveau-nés dans le cortex en
développement. Les cellules gliales radiaires apicales
(aRG) ont un processus apical qui atteint la surface
ventriculaire, où elles exposent leur cil primaire, ainsi
qu'un processus basal qui atteint la surface corticale.
Les cellules gliales radiaires basales (bRG) ont leurs
corps cellulaires situés dans des zones plus basales de
la paroi corticale. Les processus apicaux et basaux de
ces cellules (bleu) établissent un échafaudage à travers
toute la paroi corticale. Les RG subissent une division
cellulaire, donnant naissance à une cellule fille qui peut
être soit une autre RG (division apicale ou basale -
symétrique), soit un progéniteur basal (division
asymétrique, les progéniteurs intermédiaires sont
représentés en orange). Ces cellules donnent naissance
à des neuroblastes migrateurs (en vert) qui se
déplacent le long des processus basaux des RG pour
atteindre leur position finale dans les couches
corticales. Les neurones des couches profondes sont
d'abord générés, puis les neurones des couches
supérieures voient le jour. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.578341/full

**Figure 7-219. Différents mécanismes qui contrôlent la

migration radiale des nouveaux neurones dans le cortex.
Les neurones changent séquentiellement leurs modes de
migration. Tout d'abord, dans la zone d'accumulation de
précurseurs (MAZ), ils présentent une migration
multipolaire, où ils étendent et rétractent plusieurs
protrusions de manière dynamique. Les cellules
multipolaires prennent ensuite une morphologie
bipolaire via l'activation de la N-cadhérine. La régulation
du cytosquelette d'actine médiée par la N-cofiline est
ensuite impliquée dans la migration radiaire des
neurones dans la zone intermédiaire (IZ) puis dans la
plaque corticale (CP) en utilisant les fibres gliales
radiaires comme échafaudage. Enfin, lorsqu'ils arrivent
dans la région la plus externe de la CP, ils passent en
mode de translocation terminale, dans lequel les corps
cellulaires se déplacent rapidement de manière
indépendante des fibres gliales radiaires pour terminer
leur migration. La signalisation de la reeline active
l'intégrine α5β1 dans les neurones en migration, ce qui
les fait adhérer à la fibronectine localisée dans la zome
marginale superficielle (MZ) où se trouvent les cellules
de Cajal-Retzius (CR cells). Les interactions LIMK1/N-
cofiline et intégrine α5β1/fibronectine favorisent
l'ancrage des protrusions à la MZ. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5410752/

Les neurones migrent d'abord de manière multipolaire avant de prendre une forme bipolaire et de migrer
le long de la glie radiaire. La transition entre ces deux phases dépend du récepteur Unc5D des neurones qui
interagit avec le Glypican3 (ou GPC3), une protéine extracellulaire attachée à la membrane plasmique par
une ancre GPI (Akkermans et al., 2022) et qui est exprimée par la glie radiaire. Les patients avec des
mutations dans le gène codant GPC3 présentent des anomalies du squelette mais aussi des malformations
des couches corticales dûes à un retard de migration des futurs neurones.
564
La migration radiale des nouveaux neurones est réalisée par la succession de plusieurs cycles de formation
d'une protrusion frontale suivie par une nucléokinèse, c'est-à-dire le déplacement du noyau à l'intérieur du
cytoplasme. Tous ces mouvements dépendent d'une importante coordination entre la dynamique des
microfilaments et des microtubules.
**Figure 7-220. Nucléokinèse lors de la migration radiale
des nouveaux neurones corticaux. La flèche rouge
montre l'élargissement du cytoplasme qui précède la
déformation et le déplacement du noyau. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2015.00394/full

Des protéines contrôlant le cytosquelette tels que les petites GTPases Rho, Rac et Cdc42 sont importantes
pour la migration radiale des nouveaux neurones (qu'ils soient excitateurs ou inhibiteurs). Par exemple,
Rac1 est exprimé à l'avant de ces neurones et sa fonction est contrôlée par la protéine de type GAP (GTPase-
Activating Protein) ARHGAP15 qui inhibe Rac1. En absence d'ARHGAP15, les futurs neurones ont une
migration qui n'est pas seulement radiale mais multidirectionnelle ce qui les amène à des destinations non
conformes. ARHGAP15 agit en limitant la capacité de Rac1 à produire des prolongements cellulaires
exploratoires, ce qui aboutit à une meilleure directionalité de la migration (Liaci et al., 2022).

**Figure 7-221. La directionalité de la migration des nouveaux neurones est compromise dans le cortex en absence
de contrôle de la petite GTPase Rac1 par ARHGAP15. (A) Cortex de souris à E17.5 GAD67-eGFP (pour marquer par
l'expression de la protéine rapportrice GFP les neurones inhibiteurs à GABA dont la migration est suivie ici) et
Arhgap15LacZ/LacZ ; GAD67-eGFP. Les panneaux inférieurs montrent un grossissement plus élevé de la région dans la
boîte en pointillés. Barres d'échelle : 100 µm. (B) Représentation schématique des critères utilisés pour faire la
distinction entre les neurones à migration tangentielle et radiale. Les prolongements principaux formant un angle
supérieur à 25° avec la ligne pointillée sont classés comme neurones à migration tangentielle, tandis que ceux
formant un angle inférieur (ou égal à) 25° sont classés comme neurones à migration radiale. (D) Rapport moyen
entre le chemin et la distance linéaire radiale parcourue par les neurones GAD67-eGFP et les neurones
Arhgap15LacZ/LacZ ; GAD67-eGFP. Au moins 50 neurones de 3 souris différentes ont été analysés pour chaque génotype.
MZ, zone marginale ; CP, plaque corticale ; ZI, zone intermédiaire ; SVZ, zone sous-ventriculaire, VZ, zone
ventriculaire. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.875468/full

Chez le mutant de souris reeler, les nouveaux neurones sont incapables de passer par-dessus les autres pour
générer des couches plus externes du cortex comme c'est le cas habituellement. La mutation a été isolée
565
dans le gène codant la Reeline, une large glycoprotéine de plus de 3.000 acides aminés. Elle est secrétée par
les cellules les plus superficielles du cortex : les cellules de Cajal-Retzius. La Reeline est perçue par les
nouveaux neurones grâce à deux co-récepteurs ApoER2 (ou LRP8) et VLDLR et contrôle leur migration
(Feng et al., 2007).

Les nouveaux neurones en migration présentent des oscillations de concentration intracellulaire en Ca 2+

qui sont nécessaires à cette migration. Ces oscillations sont activées en partie par, d'une part, la liaison du
facteur neurotrophique BDNF sur son récepteur TrkB (via IP3) et d'autre part, par la liaison du glutamate
sur les récepteurs NMDA (via l'ouverture de canaux calciques voltage-dépendants) (McKinney et al., 2022).

Chez l'Homme, des mutations dans de nombreux gènes affectant la migration neuronale aboutissant à des
défauts plus ou moins prononcés de la morphologie et de l'anatomie du cortex ont été caractérisées.

**Figure 7-222. Anomalies du cortex et mutations associées chez l'Homme. Les gènes indiqués sont impliqués dans
la migration des précurseurs neuronaux mais peuvent aussi jouer un rôle dans d'autres étapes de leur
développement. La lissencéphalie correspond à l'absence de circonvolutions (gyri), la polymicrogyrie est
caractérisée par un cortex plus épais avec trop de circonvolutions. L'hétérotopie périventriculaire correspond à la
présence de neurones qui n'ont pas migrer dans les couches supérieures du cortex mais qui sont restés proches des
ventricules latéraux. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/1/dev163766/48766/Neuronal-
migration-in-the-CNS-during-development

Pour les progéniteurs qui deviennent post-mitotiques, il s'agit ensuite de se différencier dans le sous-type
de neurone adéquat en fonction de la couche corticale occupée et de se brancher correctement de manière
à établir des synapses fonctionnelles. FEZ Family Zinc Finger 2 (Fezf2) est un régulateur et sélecteur
transcriptionnel requis pour la spécification des sous-types de neurones de projection corticospinale qui se
trouvent dans la couche V (Molyneaux et al., 2005). Fezf2 active l'expression du récepteur de guidage axonal
EphB1 et du transporteur vésiculaire du glutamate 1 (vGlut1) dans les neurones de projection
corticospinale. Fezf2 est également nécessaire pour le développement dendritique de ces neurones. Pour
ce faire, il active l'expression d'une batterie de microARN. Le cluster miR-193b et miR-365 est exprimé de
manière différentielle durant le développement des neurones de projection corticospinaux en comparaison
avec les neurones calleux, et ce cluster réprime l'expression de MAPK8 qui est exprimé dans les neurones
projetant vers le corps calleux (Lyer et al., 2021). Le gain de fonction des miARN miR-193b et miR-365
contrôle la ramification dendritique dans les neurones de projection corticale et phénocopie la perte de
fonction de MAPK8. Dans la couche V, Fezf2 inhibe également l'expression de Tbr1 qui est nécessaire pour
la détermination des neurones corticothalamiques (qui se développent dans la couche VI) et celle de Satb2
qui est nécessaire pour la détermination des neurones qui projettent vers le corps calleux (Chen et al.,
2008). A l'inverse, Tbr1 et Sox5 sont tous deux exprimés à des niveaux élevés dans les neurones de
projection corticothalamiques dans la couche VI. Ils favorisent ce destin neuronal en réprimant directement
l'expression de Fezf2 dans cette couche (Han et al., 2011; McKenna et al., 2011).
566
Des études in vitro et in vivo ont montré que le gène Arx code un facteur de transcription généralement
répresseur qui joue un rôle important pour le développement du cerveau (Seufert et al., 2005). Parmi les
rôles de ce gène figurent la régionalisation du cerveau, la prolifération des progéniteurs corticaux, la
migration des interneurones inhibiteurs à GABA et l'engagement des futurs neurones cholinergiques dans
leur voie de différenciation (Colombo et al., 2004; Marsh et al., 2016; Friocourt et Parnavelas, 2010). De
nombreuses mutations du gène ARX ont été signalées dans plus d'une douzaine de troubles neurologiques
précoces différents, où des déficiences intellectuel sont associées parfois à des crises d'épilepsie
(notamment le syndrome XLAG qui comporte une lissencéphalie (=absence de circonvolutions)).

Aspects évo-dévo

**Figure 7-223. Comparaison du développement néocortical des rongeurs et des primates. Les progéniteurs sont
désignés par leur emplacement dans le cortex. Les gliales radiales apicales (aRG) localisées dans la zone ventriculaire
(VZ) peuvent subir des divisions symétriques et asymétriques pour s'auto-renouveler ou produire des neurones
directement ou indirectement en produisant des progéniteurs intermédiaires (IPC) dans la zone sous-ventriculaire
(SVZ). Les neurones nouveau-nés migrent à travers la zone intermédiaire (IZ) et arrivent à la plaque corticale (CP),
les premiers neurones étant situés plus profondément et les neurones tardifs situés superficiellement. Dans le
cerveau en développement des primates, l'expansion de la SVZ conduit à une nouvelle zone germinale, la zone sous-
ventriculaire externe (OSVZ), qui comprend des CPI prolifératives et des cellules gliales radiales basales (bRG).
L’expansion des progéniteurs basaux, à son tour, conduit à davantage de neurones des couches supérieures
(principalement des couches II/III) dans le néocortex des primates. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S095943882100132X

Avec plus de 80 milliards de neurones, l'humain est l'une des espèces de Mammifères possédant le plus
grand nombre de neurones cérébraux (bien qu'il soit nettement inférieur en nombre à celui des éléphants
et des baleines), et le néocortex affiche le plus grand nombre de neurones corticaux (environ 16 milliards)
par rapport à la masse cérébrale, ainsi que par rapport à d'autres espèces de primates et de cétacés. Parmi
les primates, le cortex humain contient de loin le plus grand nombre de neurones, avec environ deux fois
plus de neurones que le cortex de chimpanzé et plus de dix fois plus que le cortex de macaque. Le plus
frappant est que le cortex humain affiche également le nombre relatif et absolu le plus élevé de neurones
pyramidaux des couches supérieures (couches II et III) par rapport aux autres espèces. Cette expansion des
couches supérieures est déjà présente chez les singes et est encore élargie chez les Hominidés. Cette
expansion est probablement importante dans l'évolution des circuits corticaux humains, car les neurones
de la couche supérieure sont principalement impliqués dans les projections intracorticales. Leur nombre
plus élevé contribue donc à des niveaux plus élevés de connectivité entre les zones corticales.

Des études utilisent actuellement des comparaisons d'organoïdes corticaux produits à partir de cellules
souches humaines et des cellules souches de singe pour comprendre les origines développementales des
différences spécifiques à la lignée humaine. Le développement du cortex humain est plus lent mais la densité
en dendrites des neurones produits est plus importante. Des études complémentaires ont montré que cela
567
est sans doute dû à la présence de 4 gènes SRGAP2 dans la lignée humaine au lieu d’un seul chez les singes
proches (Schmidt et al., 2019). Également, les gènes Notch2NL, issus de duplications génétiques de Notch2
spécifiques à l'homme, augmentent le nombre de progéniteurs corticaux et augmentent la production
neuronale lorsqu'ils sont surexprimés au cours du développement du cortex chez la souris (Fiddes et al.,
2018).

Le développement des cellules gliales

Les cellules souches neuronales corticales donnent naissance tant aux neurones, qu'aux
oligodendrocytes (qui forment les gaines de myéline dans le système nerveux central), et aux
astrocytes. Les cultures de ces cellules montrent qu'elles possèdent une horloge interne qui contrôle
le temps pendant lequel elles produisent des progéniteurs de neurones, puis des progéniteurs de
cellules gliales (Qian et al., 2000; Shen et al., 2006). Ainsi, chez la souris, en moyenne, une cellule de la glie
radiaire se divise asymétriquement 8 à 9 fois pour former des précurseurs neuronaux puis environ 1/6 ème
de ces cellules de la glie radiaire se mettent à produire des cellules gliales (Beattie et al., 2017). Les autres
meurent ou se différencient.

Des cellules souches neurales avec une triple potentialité puis une bipotence transitoire ont pu être
cultivées : NA (neurones + astrocytes), NO (neurones + oligodendrocytes) et AO (astrocytes-
oligodendrocytes). Des ligands orientant vers l'une ou l'autre voie ont été identifiés. Par exemple, le CNTF
oriente fortement le destin des progéniteurs générés vers la voie astrocytaire et stimule également la
prolifération des progéniteurs astrocytaires (Ravin et al., 2008). CNTF active le facteur de transcription
STAT3 qui se fixe directement sur les promoteurs des gènes GFAP et S100, qui sont des gènes exprimés dans
les cellules gliales. Dans les progéniteurs générés tôt dans le développement, l'ADN du promoteur de GFAP
est méthylé, ainsi STAT3 ne peut pas déterminer les cellules en glie et ce sont des neurones qui sont d'abord
produit avant que cette marque épigénétique inhibitrice soit enlevée (Fan et al., 2005). L'absence de l'ADN
méthyltransférase de maintenance DNMT1 dans les précurseurs neuronaux aboutit à leur différenciation
en astrocytes.
**Figure 7-224. Différenciation astrocytaire précoce
dans le cortex de souris Dnmt1-/- (qui ne maintiennent
pas la méthylation de leur ADN). Immunomarquage
GFAP (rouge, flèches) de la zone ventriculaire et sub-
ventriculaire corticale de souris sauvage (gauche) ou
Dnmt1-/- (droite) à E18.5 dans des coupes coronales
(LV, ventricule latéral ; D/M, dorsal/médial ; V/L,
ventral/latéral).

568
 **Figure 7-225. Passage de la neurogenèse à la gliogenèse par remodelage de la chromatine des gènes gliaux. La
méthylation de l'ADN est l'un des mécanismes clés qui bloquent l'activation et l'action de la voie JAK-STAT et la
différenciation du lignage des cellules gliales pendant la période neurogène. Grâce à un processus de déméthylation
de l'ADN régulé par le développement et de remodelage actif de la chromatine, la voie JAK-STAT est induite et peut
agir sur l'expression des gènes astrocytaires spécifiques qui deviennent sensibles à la signalisation STAT, ce qui
marque l'initiation de l'astrocytogenèse. Dans les mutants Dnmt1-/-, l'hypométhylation conduit à une activation
accélérée de la voie JAK-STAT et à une chromatine des promoteurs des gènes astrocytaires favorable à une activation,
raccourcissant le temps nécessaire pour atteindre le seuil d'activité STAT pour la différenciation des astrocytes,
conduisant à une astrocytogenèse précoce. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/132/15/3345/52492/DNA-methylation-controls-the-timing-of

Le timing du passage de la production de neurones à la production de cellules gliales est donc étroitement
régulé et a lieu 7 jours après la naissance chez la souris et 6 mois après la naissance chez les humains. Ce
changement est dépendant aux facteurs évoqués ci-dessus mais aussi à l'activation de l'expression du gène
NFIA qui code un facteur de transcription. Lors de la différenciation de cellules pluripotentes humaines
(cellules ES ou iPS), l'expression transitoire de NFIA d'origine exogène accélère rapidement la production
de cellules gliales (Tchieu et al., 2019).

Lors de la transition de la fin de la neurogenèse au début de la gliogenèse, les complexes répresseurs

transcriptionnels Polycomb PRC1 et PRC2 sont nécessaires pour favoriser l'astrogliogenèse. La suppression
des sous-unités centrales des complexes Polycomb : Ring1B, Ezh2 ou Eed dans les progéniteurs corticaux
de souris prolonge la neurogenèse et retarde l'entrée dans la phase astrogénique. Notamment, les protéines
du complexe Polycomb répriment l'expression du facteur de transcription neurogénine 1 (Ngn1), un
suppresseur connu de l'astrogliogenèse. La mise sous silence de l'expression de Ngn1 est une condition
préalable essentielle à la transition des progéniteurs neuraux vers le destin glial (Sun et al., 2001).

569
 *Figure 7-226. Neurogénine-1 (Ngn1) favorise la neurogenèse et inhibe la différenciation des astrocytes dans les
progéniteurs corticaux embryonnaires de rat. Des cultures primaires de cortex de rat au stade E14 ont été infectées
par des rétrovirus permettant d'exprimer Ngn1 ou un gène contrôle (con). Quatre jours après mise en
culture/infection, les cellules ont été fixées et soumises à une immunofluorescence pour les marqueurs de
différenciation neuronale (TuJ1) et astrocytaire (GFAP). Les cellules infectées étaient positives pour la GFP (A et C).
En (C), mais pas en (A), les cellules ont été traitées avec du CNTF pendant quatre jours pour favoriser la
différenciation des astrocytes. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867401002240

Signalons que la maturation du cortex est très lente notamment chez l'Homme et que la myélinisation, qui
permet d'accélérer la conduction nerveuse au moins 20 fois, se développe jusqu'à la fin de l'adolescence
pour certaines régions corticales. Le maximum de synapses est atteint vers 5 ans et le nombre de synapses
décroit ensuite (Liu et al., 2012).

Régionalisation au sein du cortex

Il existe des différences régionales au sein du cortex qui sont fonctionnellement importantes car les
différentes aires générées ont des connectivités et des fonctions spécifiques. Les différences peuvent
même s'observer à l'échelle de la cytoarchitecture. Par exemple, les régions consacrées au traitement de
l'information sensorielle, comme le cortex visuel, ont un nombre relativement important de cellules de la
couche IV, qui forment la couche d'entrée d'informations tandis que les régions importantes pour la "sortie"
de l'information du cortex, comme le cortex moteur primaire, ont un grand nombre de neurones
pyramidaux de la couche V et relativement peu de cellules de la couche IV.

La spécification des différentes régions du cortex est sous le contrôle d'une cascade de régulations géniques
avec à leur tête des gradients de morphogène comme les FGF.

570
 **Figure 7-227. FGF8 agit comme un morphogène pour spécifier les aires corticales. Schémas de l'hémisphère témoin
de souris à E10.5 (A) et des hémisphères électroporés in utero avec un vecteur d'expression de Fgf8 postérieurement
(B) ou en position latéral-médiane (C). La source endogène de FGF8 est antérieure (vert clair) au niveau de l'ANR
(Anterior Neural Ridge); le site d'électroporation est en rouge. A, cortex témoin avec polarité antéro-postérieure
normale (=rostro-caudale, RC). B, le FGF8 ectopique postérieur génère un nouvel axe R/C opposé à la polarité
normale [R/C puis C/R (RCCR)]. Les zones natives Fr, S1 et V1 (Fr1, S11, V11) sont présentes, et les zones secondaires
Fr2, S12 et V12 ont été induites. Toutes les zones dupliquées sont orientées vers le nouvel axe R/C, le plus évident
étant S12. C, une forte source médiane-latérale de FGF8 génère un sulcus (une invagination alors qu'habituellement
la surface du cortex est lisse chez la souris). Un nouveau domaine rostral (domaine Fr2/3) est induit de chaque côté
du sulcus (RCCR/RC). Le domaine rostral du sulcus est constitué des domaines natifs Fr1 et S11, et d'un duplicat, le
S12 inversé. La partie caudale du sulcus contient Fr3, S13, V12 et A12. On déduit de ces expériences que FGF8 agit
comme un morphogène et qu'une forte concentration induit des structures corticales antérieures tandis qu'une
faible concentration induit des structures corticales postérieures. Fr = cortex frontal; S = cortex somato-sensoriel; V
= cortex visuel; A = cortex auditif. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3466079/

Les FGF sont produits dans la région la plus antérieure du système nerveux qu'on appelle l'ANR (pour
Anterior Neural Ridge) (Eagleson et al., 2002). Cette région est induite chez la souris par l'endoderme
viscéral antérieur (AVE), une structure extraembryonnaire qui produit aussi des FGF.

A partir de l'ANR, FGF diffuse dans le futur cortex induisant des structures antérieures à forte concentration
et des structures postérieures à faible concentration.

Ces gradients de morphogène se traduisent ensuite en gradients d'expression de facteurs de transcription

: un gradient de Pax6 qui spécifie plutôt les régions antérieures et un gradient de Emx2 qui spécifie plutôt
les régions postérieures. Les souris mutantes Pax6-/- présentent une hypertrophie des régions corticales
postérieures au détriment des régions antérieures alors que c'est l'inverse pour les souris mutantes Emx2-
/- (Muzio et Mallamaci, 2003).

*Figure 7-228. Expressions complémentaires de Pax6 et de

Emx2 au cours du développement du cortex. Source :
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2006-7-1-202

Des études de transcriptomique et de ChiPseq ont permis de révéler les réseaux de régulation génétiques à
l'œuvre dans les cellules souches neurales de différentes régions du cortex (Ypsilanti et al., 2021).

Mise en place, maintien et modifications des connexions

Une fois les neurones générés et leur identité précisée, l'arborisation dendritique et la croissance axonale
se mettent en place. Une page spéciale sur la croissance axonale sera bientôt publiée.

Une proportion importante de progéniteurs neuronaux (les estimations varient entre 20 et 60%) meurt par
apoptose durant le développement embryonnaire. Des souris n'exprimant pas Apaf-1 ou la caspase 9 qui
sont des activateurs de l'apoptose présentent des zones progénitrices élargies (Yoshida et al., 1998). Dans
les premiers jours après la naissance, des neurones en train d'être incorporés dans les circuits meurent
également (autour de 30% des neurones). Le taux d'apoptose varie selon les régions corticales, avec plus
de mort cellulaire dans le cortex moteur que dans le cortex somatosensoriel par exemple (Blanquie et al.,
2017).

571
 *Figure 7-229. Exemple de quantification d'apoptose par
immunofluorescence anti-caspase 3 activée (c'est-à-dire
sa forme clivée) dans le cortex somatosensoriel de souris
entre les jours post-nataux 2 à 10. Source :
https://elifesciences.org/articles/27696

Ensuite, durant toute la vie post-embryonnaire, ce sont les synapses qui se font et se défont au gré des
stimuli nerveux. Ces mécanismes contribuent à la plasticité du système nerveux. De manière plus subtile,
des synapses peuvent se renforcer ou au contraire s'affaiblir.

Un exemple bien étudié d'affinement post-natal des connexions neuronales est constitué par les colonnes
de dominance oculaire de la couche IV du cortex visuel. Les axones qui arrivent dans cette couche du cortex
et qui apportent les informations en provenance de l'un ou de l'autre œil sont mélangés à la naissance.
Progressivement, ces axones se séparent en territoires précis. Des expériences de suture d'un seul œil après
la naissance chez le chat ou le singe ont montré que ce sont les stimuli en provenance de la rétine qui sont
légèrement différents d'un œil à l'autre qui territorialisent les projections. Quand un œil est suturé, les
projections axonales qui transmettent ces informations au cortex se réduisent tandis que celles en
provenance de l'autre œil sont maintenues donc finissent par être relativement plus grandes. Ces
expériences ont aussi mis en évidence l'existence d'une période critique. Ces réarrangements de projection
axonale et de synapse n'ont lieu de manière significative que sur une période assez courte. Après, des
réarrangements peuvent avoir lieu mais sur une échelle plus petite. Au niveau moléculaire, les
réarrangements impliquent des sécrétions différentielles de facteurs neurotrophiques tels le BDNF et des
expressions différentielles de molécules impliquées dans l'adhérence ou la communication juxtacrine telle
les éphrines.

A un niveau d'intégration inférieur, le nombre de synapses connectées à un neurone peut changer, ce qui se
traduit par une augmentation du nombre de ses épines dendritiques, c'est-à-dire les éléments post-
synaptiques. La force des synapses peut être modulée ce qui peut se traduire morphologiquement par des
changements de la forme des épines dendritiques. Au niveau moléculaire, par exemple, les quantités de
récepteurs de neurotransmetteurs peuvent être modifiées.

Bien que des modifications aient lieu toute la vie, elles ralentissent fortement à partir de la puberté.
Certaines régions du cerveau hors cortex restent néanmoins assez "plastiques", notamment l'hippocampe
impliqué dans la mémorisation.

572
 L'édition de la séquence des ARNm et tout particulièrement des transitions de A (adénosine) à I
(inosine) est un phénomène courant pour des gènes impliqués dans le neurodéveloppement et la
physiologie neuronale (Ekdahl et al., 2012: Mehler et al., 2007). Elle se produit au niveau
d'adénosines isolées uniques ou sur de nombreuses adénosines voisines dans une région étendue
et est catalysée par une famille d'adénosine désaminases appelée ADAR. L'édition de A à I dans
les régions codantes pour les protéines peut conduire à substitutions d'acides aminés ou si elle a
lieu dans les 3'UTR peut modifier la fixation de microARN. Ces modifications sont des
contributeurs majeurs à la diversité globale des séquences d'ARN dans le cerveau humain et
amplifient la fonctionnalité de nombreuses protéines exprimées dans les neurones, notamment
celles impliquées dans la transmission synaptique et les voies de signalisation neuronales. Elles
régulent étroitement la perméabilité au Ca 2+, et remodèlent le cytosquelette d'actine au niveau
des synapses excitatrices, entre autres fonctions. Des milliers d'éditions A à I ont pu être
caractérisés durant les phases de neurodéveloppement et leurs fonctions sont en cours
d'investigation (Cuddleston et al., 2022).

Produire in vitro des neurones corticaux à partir de cellules souches

De nombreux protocoles existent pour différencier des neurones corticaux à partir de cellules ES ou iPS. Ils
s'appuient sur la signalisation qui se déroule lors du développement embryonnaire normal : il s'agit d'abord
d'induire du tissu neural (donc de bloquer la signalisation BMP pour mimer l'effet de l'organisateur de
Spemann), puis d'induire la régionalisation antérieure. Selon les besoins, on peut manipuler la signalisation
qui permet la régionalisation dorso-ventrale (par exemple stimuler la voie de signalisation Shh si on
souhaite obtenir des interneurones inhibiteurs à GABA qui sont d'origine ventrale).

**Figure 7-230. Génération de neurones corticaux dérivés de cellules iPS humaines. (A) Schéma expérimental de
différenciation neuronale des cellules iPS (NBM, Neural Basal Medium, SB431542 inhibe la signalisation Nodal et la
dorsomorphine inhibe la signalisation BMP, BDNF et GDNF sont des facteurs neurotrophiques et la forskoline stimule
la production d'AMPc qui est importante pour l'expression de canaux voltage-dépendants nécessaire à la
différenciation neuronale). (B) Immunofluorescence réalisée avec différents marqueurs protéiques dans les hiPSC
(à gauche), les cellules souches neurales dérivées des iPS (NSC, au milieu) et les neurones dérivés des iPS (à droite).
Barre d'échelle = 100 μm. Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2001906117

Les organoïdes sont des cultures agrégées auto-organisées dérivées de cellules souches (notamment
humaines) qui génèrent des types de cellules et des propriétés organisationnelles reflétant un organe en
573
développement. Des organoïdes corticaux ont pu être générés à partir de la fin des années 2010 avec des
protocoles de plus en plus performants et leur développement suit remarquablement bien la séquence
d'évènements qui ont lieu in vivo. Par exemple, les organoïdes corticaux sont d'abord composés de cellules
progénitrices multipotentes précoces : cellules neuroépithéliales et cellules gliales radiaires (Subramanian
et al. 2017). Les cellules progénitrices prolifèrent de manière robuste et utilisent des programmes de
division qui sont très similaires au développement cortical endogène au niveau transcriptionnel (Pollen et
al. 2019, Velasco et al. 2019). Des neurones excitateurs répartis en plusieurs couches et des astrocytes ont
pu être obtenus (Velasco et al. 2019) de même que des oligodendrocytes qui ont formé des gaines de
myéline autour des axones (Marton et al., 2019). Cependant, il existe des différences avec ce qu'il se passe
in vivo. Par exemple, certains types de neurones excitateurs dérivés d'organoïdes ont une expression réduite
de certains gènes marqueurs tel que SATB2 pour les neurones des couches supérieures. Autre problème, la
taille des organoïdes est limitée par une mauvaise oxygénation des régions profondes où il y a hypoxie et
nécrose.

Ces outils sont étudiés pour comprendre l'origine de malformations ou de maladies cérébrales mais aussi
dans un objectif évo-dévo par exemple en comparant le développement d'organoïdes issus de cellules
souches de chimpanzé, de gorille et d'humains (Pollen et al., 2019; Benito-Kwiecinski et al., 2021).

EN DIRECT DES LABOS :

Effets des résidus médicamentaux sur le développement du cerveau – INRAE

Mécanismes physiologiques et pathologiques du développement cortical - IGBMC

La neurogénèse chez les mammifères adultes

La neurogénèse chez l'adulte est chose courante chez les téléostéens comme le poisson-zèbre, et une
douzaine de zones neurogéniques existent.

Chez les mammifères, la très grande majorité des neurones du système nerveux central est générée
au cours du développement embryonnaire, et la neurogenèse postnatale est limitée à quelques
régions cérébrales. C’est à la fin des années 1960 que Altman découvre qu’il existe de la neurogénèse dans
la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus denté de l’hippocampe et dans la zone subventriculaire (SVZ) des
ventricules latéraux chez les rats adultes (Kriegstein et Alvarez-Buylla, 2009). Cela correspond à la
production de 30.000 neuroblastes par jour pour la zone subventriculaire et de 10.000 neuroblastes par
jour pour le gyrus denté. D'autres régions sont suspectées d'abriter également de la neurogenèse chez
l'adulte, par exemple les amygdales (Roeder et al., 2022).

Les cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) sont des progéniteurs proliférants reconnaissables à leur
expression de NG2, qui résident dans de vastes zones du SNC, avec une densité cellulaire d'environ 50% plus
élevée dans la substance blanche par rapport à la substance grise (Dawson et al. 2003). En dehors des régions
neurogènes établies, les OPC forment la principale population de cellules en division active dans le cerveau
adulte, les OPC de substance blanche ayant des temps de cycle cellulaire plus rapides. La prolifération des OPC
entraîne un auto-renouvellement ainsi qu'à des cellules-filles donnant naissance à des oligodendrocytes
myélinisants (Bergles and Richardson, 2016).

Neurogénèse adulte dans la SVZ

Les cellules issues des cellules souches de la SVZ prolifèrent en tant que progéniteurs puis migrent dans le
bulbe olfactif où ils se différencient essentiellement en neurones GABAergiques et aussi en neurones
glutamatergiques (Brill et al., 2009 ; Tufo et al., 2022).

574
 *Figure 7-231. Production de nouveaux neurones dans le
bulbe olfactif à partir de précurseurs provenant de la
SVZ. Les neurones du bulbe olfactif (OB) nés après la
naissance sont générés dans la zone sous-ventriculaire
(SVZ) tapissant le ventricule latéral, puis migrent
tangentiellement le long du flux migratoire rostral (RMS)
pour atteindre le bulbe olfactif, avant de migrer
radialement hors du RMS pour s'intégrer dans la couche
cellulaire granulaire et la couche glomérulaire du bulbe
olfactif. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/149/3/dev200210/274348/Development-of-the-
mammalian-main-olfactory-bulb

**Figure 7-232. Remplacement progressif des cellules

de la couche granulaire du bulbe olfactif par des
nouveaux neurones. Grâce au système inductible
Cre/Lox inductible par le tamoxifène, on fait exprimer
LacZ dans les cellules souches neurales à partir de 2
mois (témoin négatif à gauche, on injecte que le solvant
du tamoxifène (oil)). On réalise une coloration X-gal sur
des coupes de bulbe olfactif 1, 3, 6, 12, 15 et 18 mois
après l'injection de tamoxifène. On observe une
augmentation de la proportion de cellules LacZ+ dans la
couche granulaire. Source :
https://www.nature.com/articles/nn.2185

Ces nouveaux neurones contribuent au recâblage des circuits neuronaux existants, ainsi qu'aux fonctions
cognitives et comportements innés associés (Bond et al., 2015). Chez les jeunes animaux, des neuroblastes
peuvent aussi migrer dans d'autres régions du cortex, dans le striatum et dans le noyau accumbens (Inta et
al., 2008).

La plupart des cellules souches neurales adultes dans la paroi latérale de la SVZ sont dérivées d'une sous-
population de cellules souches neurales embryonnaires en quiescence ou à division lente (tandis que la
sous-population à division rapide donne naissance à des neurones et des cellules gliales qui peuplent le
cerveau pendant le développement embryonnaire ou juste après la naissance) (Fuentealba et al., 2015). Une
expression élevée de l'inhibiteur de CDK (CKI) p57 dans la sous-population à division lente inhibe la
prolifération et la différenciation neurale et est nécessaire à la genèse des cellules souches neurales adultes
(Furutachi et al., 2015). La voie Notch a été impliquée dans cette régulation (Harada et al., 2021).
***Figure 7-233. Une plus haute activité de la voie Notch
active l'expression de Hey1 qui maintient les cellules
souches neurales embryonnaires avec une fréquence
faible de division et les oriente à devenir des cellules
souches neurales adultes. A droite : Notch et son
effecteur Hey1 forment un module qui est activé par la
faible activité mitotique de certaines cellules souches
neurales embryonnaires. Contrairement à l'expression
oscillatoire des effecteurs Notch Hes1 et Hes5 dans les
progéniteurs à cycle cellulaire rapide (à gauche), Hey1
présente une expression stationnaire non oscillatoire et
contribue au maintien à long terme des cellules souches
neurales en maintenant le faible taux de division
cellulaire. L'expression d'Ascl1 est activé dans les
cellules qui commencent leur neurogénèse. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-021-26605-0

Les cellules souches neurales adultes dans la SVZ sont dites de type B. A division lente, elles produisent par
division asymétrique des cellules de type C qui produisent à leur tour des neuroblastes de type A (exprimant
la doublecortine (DCX)), et ceux-ci migrent en avant le long du flux migratoire rostral (RMS), se différenciant
finalement en neurones qui s'intègrent dans les circuits du bulbe olfactif (Alvarez-Buylla et al., 2001).
575
La structure 3D de la niche des cellules souches neurales adultes (les cellules de type B) commence à être
comprise. La zone germinale, qui n'a qu'environ 50 µm d'épaisseur, est prise en sandwich entre couches :
du côté basal, la SVZ est délimitée par un vaste réseau planaire de vaisseaux sanguins, le plexus SVZ, et du
côté apical (ventriculaire), par une couche de cellules épendymaires ciliées (Kazanis et al., 2008; Mirzadeh
et al., 2008; Tavazoie et al., 2008). Une sous-population de cellules de type B a des prolongements apicaux
qui pénètrent dans la couche épendymaire, et certains d'entre eux ont également un prolongement basal se
projetant sur les vaisseaux sanguins du plexus SVZ (Mirzadeh et al., 2008). Ainsi, en interagissant avec la
couche épendymaire, les prolongements apicaux des cellules de type B pourraient servir d'ancrage pour
fournir une intégrité structurelle à la niche, et ils sont parfaitement positionnés pour détecter les
changements de signaux dans le liquide céphalo-rachidien.

La protéine d'adhérence cellulaire VCAM-1 est impliqué dans le maintien des cellules souches neurales dans
la zone sous-ventriculaire du télencéphale. Lorsqu'avec une micropompe, on injecte en continu pendant 6
jours des anticorps bloquant anti-VCAM dans la zone sous-ventriculaire d'une souris, la couche des cellules
épendymaires qui constitue une partie de la niche des cellules souches neurales est désorganisée (Kokovay
et al., 2012). Cela aboutit à augmenter la prolifération des cellules souches neurales dont une grande partie
est habituellement quiescente. Dans ce système, VCAM-1 est exprimé par les cellules souches neurales. Son
partenaire sur les cellules épendymales n'a pas été encore trouvé.

La voie BMP est produit par les cellules endothéliales dans la région basale de la niche alors que les cellules
de l'épendyme dans la région apicale produisent Gremlin et Noggin.
**Figure 7-234. Les cellules de l'épendyme adulte expriment
Noggin à proximité des cellules souches neurales et des
précurseurs neuronaux. Les souris ont un allèle sauvage de Noggin
remplacé par un allèle codant une protéine fusion Noggin-β-
galactosidase. Une coupe de cerveau est réalisée puis soumise à une
coloration Xgal. On observe la coloration bleu clair dans les cellules
de l'épendyme (e) mais pas dans les cellules souches neurales et les
progéniteurs neuronaux à côté (vers la gauche). LV : ventricule
latéral. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627300001483

BMP pousse les cellules à perdre leur caractère de cellules souches et à devenir des cellules gliales. La niche
des cellules souches neurales se trouve accolée aux cellules de l'épendyme donc elles sont protégées de
l'influence de BMP par Gremlin et Noggin qui sont sécrétés localement (Lim et al., 2000). Cependant, si une
cellule fille quitte la région apicale et se rapproche des cellules endothéliales de la région basale, elle subit
l'influence des BMP et sera déterminée en cellule gliale.

Les précurseurs neuronaux en migration sécrètent la neurotransmetteur GABA ce qui leur permet d'activer
une boucle rétroaction négative sur les cellules progénitrices en atténuant leurs taux de prolifération. En
opposition à cette action, les cellules B sécrètent un inhibiteur du GABA, DBI (pour Diazepam Binding
Inhibitor) pour augmenter la prolifération dans la niche (Alfonso et al. 2012).

Durant la migration dans le RMS (flux migratoire rostral) vers le bulbe olfactif, la protéine associée aux
microtubules DCX (doublecortine) est importante pour maintenir la forme bipolaire des cellules et pour
que la translocation nucléaire liée à la migration se réalise (Koizumi et al., 2006). Les neuroblastes sont
entourés par des astrocytes particuliers qui forment des tubes gliaux indispensables à leur bonne migration
(Sun et al., 2010). La migration de la SVZ vers le bulbe olfactif dure entre 2 et 6 jours (James et al., 2011).

576
Chez l’Homme, où l’olfaction a un rôle nettement moins important que chez les Rongeurs, il n’y a
plus de neurogénèse dans la SVZ après 18 mois.

Il faut signaler que les cellules souches neurales de la SVZ de souris donnent aussi naissance à un petit
nombre de cellules gliales : des oligodendrocytes du corps calleux et des progéniteurs d'oligodendrocytes
qui restent à proximité (Delgado et al., 2021). L'expression du cluster de microARN miR-17-92 dans les
cellules souches neurales sorties de leur quiescence est nécessaire pour que la majorité des précurseurs
générés donnent naissance à des neurones et pas à des cellules gliales (Favaloro et al., 2022).

Neurogénèse dans la SGZ de l'hippocampe

*Figure 7-235. Dessin d'observation d'hippocampe par

Ramon y Cajal (1852-1934). Quelques neurones
seulement sont dessinés.

*Figure 7-236. Coupe d'hippocampe de souris. La zone

sous-granulaire (SGZ) où se déroule la neurogénèse chez
l'adulte se trouve dans le gyrus denté (ou dentelé)
(dentate gyrus). Source :
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/2-organos-
a/guiada_o_a_01palio.php

La neurogénèse se poursuit dans l’hippocampe durant toute la vie, y compris chez l'Homme
(contrairement à dans la SVZ). Grâce à des mesures dans les neurones de l’hippocampe du 14C produit par
les essais nucléaires et incorporés dans l’ADN au moment de la réplication des cellules souches, on a pu
démontrer que 700 nouveaux neurones sont produits chaque jour dans l’hippocampe humain, mais leur
durée de vie est 10 fois plus courte que celle des neurones qui sont déjà présents à la naissance.

Les cellules progénitrices neurales de la SGZ sont classées en différents stades de développement qui
peuvent être identifiées par l'expression de marqueurs spécifiques. Les cellules souches neurales de type
glie radiale de type 1 ont le potentiel de s'auto-renouveler et restent pour la plupart quiescentes. Ces cellules
expriment la protéine de liaison aux lipides du cerveau (BLBP), la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et
la nestine. Un autre marqueur de cellules souches neurales largement utilisé est Sox2, un facteur de
transcription essentiel au maintien de la pluripotence des cellules souches. Les cellules souches quiescentes
de type 1 peuvent soit disposées radialement, soit horizontales.

Les cellules de type 1 subissent une division cellulaire asymétrique pour générer des cellules progénitrices
neurales de type 2a hautement prolifératives, qui sont doublement positives pour Sox2 et Tbr2. Les cellules
de type 2a génèrent ensuite des cellules progénitrices neurales de type 2b qui expriment Tbr2 et la
doublecortine (DCX) (Gonçalves et al., 2016; Ming et Song, 2011 ; Spampanato et al., 2012). Les cellules de
type 2b présentent un potentiel mitotique limité (Gonçalves et al., 2016), et après 2 à 5 cycles de mitose, ces
cellules progénitrices se différencient en neurones immatures. Après maturation, ces nouveaux neurones
granulaires s'intègrent dans les circuits.

577
 **Figure 7-237. Neurogenèse dans l'hippocampe adulte. Une population de cellules radiales dans la SGZ correspond
à des cellules souches neurales quiescentes (cellules de type 1). Elles coexistent avec des cellules progénitrices
(cellules de type 2) en prolifération active qui génèrent à la fois des astrocytes et des neuroblastes. Les neuroblastes
migrent dans la couche de cellules granulaires (GCL) et se différencient en cellules granulaires dentées (DGC). Les
nouvelles DGC développent progressivement des arborisations dendritiques dans la couche moléculaire (Mol) et
reçoivent des entrées du cortex entorhinal et se projettent sur les neurones pyramidaux CA3 (rouge) ainsi que sur
les interneurones hilaires (bleu). Source :
https://molecularneurodegeneration.biomedcentral.com/articles/10.1186/1750-1326-6-85

Dans la SGZ adulte, les neurones granulaires nouvellement générées contribuent à la formation de la
mémoire (Sahay et al., 2011, Lazarov et Hollands, 2016), tout particulièrement la mémoire spatiale (Kee et
al., 2007, Clelland et al., 2009) qui peut se tester chez la souris avec le dispositif de la piscine de Morris.

La neurogenèse dans la SGZ est également importante pour le contrôle de l'anxiété. Lorsque la maturation
des nouveaux neurones est perturbée par une diminution de la sécrétion du facteur neurotrophique BDNF
ou par une mutation perte-de-fonction dans le récepteur TrkB sur les nouveaux neurones, les souris sont
plus anxieuses dans les tests comme le labyrinthe en croix surélevé (Bergami et al., 2008; Pla et al., 2013).

**Figure 7-238. L'anxiété est augmentée lorsqu'il y a un défaut de neurogenèse adulte dans la SGZ de l'hippocampe.
Des souris mutantes sont générées où la huntingtine n'est plus exprimée dans les neurones matures de l'hippocampe.
Cela entraîne un défaut de sécrétion du facteur neurotrophique BDNF. Panels du haut : Les nouveaux neurones en
maturations sont reconnus en immunohistochimie avec l'anticorps anti-DCX. On voit leur arborisation dendritique.
Panel en bas à gauche : Une analyse de Sholl de l'arborisation dendritique montre le nombre d'intersections par les
neurites de cercles de diamètre de plus en plus grand centrés sur le corps cellulaire. (Panel en bas à droite) Les souris
ont été soumises à un test du labyrinthe en croix surélevé où moins elles passent de temps dans les bras ouverts
(open arms), plus elles sont anxieuses (contrôle : barre blanche; mutant : barre noire).
Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0073902

578
Contrairement aux précurseurs des cellules souches adultes dans la SVZ, les précurseurs des cellules
souches adultes de la SGZ ne sont pas clairement « mis de côté », au repos pendant le développement
embryonnaire/périnatal, mais semblent plutôt être actifs puis passer à un état de quiescence après la
première postnatale où elles connaissent un pic d'activité. La suppression conditionnelle de Sufu (qui
provoque une réduction de la signalisation Shh) altère la capacité des cellules souches à se développer au
cours de la première semaine postnatale, ce qui entraîne l'entrée prématurée de ces cellules dans l'état de
quiescence (Noguchi et al., 2019). Ces données montrent que la voie de signalisation Shh doit être
maintenue en permanence pour favoriser l'expansion de cellules souches de la SGZ après la naissance. Sans
cela, le pool de cellules souches est plus faible que la normale chez l'adulte.

**Figure 7-239. La signalisation Shh est nécessaire pour avoir un pool suffisant de cellules souches neurales dans
l'hippocampe adulte. Un knock-out conditionnel est réalisé chez la souris via le système CreLox dans les cellules qui
expriment GFAP c'est-à-dire les cellules de la glie radiaire qui sont les cellules souches neurales dès l'embryogenèse.
On le fait dans un contexte sauvage ou dans un contexte hétérozygote pour Gli1 (Gli1LacZ/+). Gli1 est à la fois une
cible de la signalisation Shh et un de ces effecteurs. On observe ensuite les cellules souches neurales GFAP+Sox2+
dans la SGZ chez la souris adulte. On observe une baisse du nombre de cellules souches neurales quand on diminue
la signalisation Shh (graphique de gauche). Mais les nouveaux neurones générés se différencient normalement
(graphique de droite). Source : https://elifesciences.org/articles/42918

Les inhibiteurs des CDK ont des rôles importants dans le maintien de la quiescence des cellules souches de
la SGZ. Parmi eux, citons la famille Cip/Kip qui comprend p21Waf/Cip1 (appelée p21), p27Kip1 (appelée
p27) et p57Kip2 (appelée p57). p27 est exprimé dans les cellules souches de type 1 et dans les souris
mutantes perte-de-fonction p27 ou chez des animaux porteurs d'une perturbation dans le domaine
d'interaction avec cycline-CDK de p27, il y a une augmentation de la prolifération des cellules souches
adultes (Andreu et al., 2015). On ne sait pas cependant si cela entraîne l'épuisement des cellules souche avec
le temps. De même, p57 est exprimé dans les cellules souches quiescentes et sa délétion spécifique dans ces
cellules termine leur quiescence et active leur prolifération (Furatachi et al., 2013). Cela conduit à une
augmentation du nombre de nouveaux neurones, mais à long terme (chez des animaux de 2 ans), cela
conduit à une réduction excessive des cellules souches et de la neurogenèse dans l'hippocampe.

La première marque de sortie de quiescence des cellules souches neurales est l'augmentation de
l'expression de gènes qui codent des protéines ribosomiques et qui participent donc à la biosynthèse des
protéines. En effet, la surexpression lentivirale de certaines protéines ribosomiques est suffisante pour
induire la prolifération des cellules souches adultes dans le SGZ (Mukherjee et al., 2016). L'augmentation
de l'expression des gènes ribosomiques est suivie d'un changement des gènes du métabolisme énergétique
de la glycolyse à la phosphorylation oxydative mitochondriale (Llorens-Bobadilla et al., 2015; Shin et al.,
2015). Le métabolisme des acides gras est un régulateur important de l'activité des cellules souches et la

579
lipogenèse de novo réalisée par l'acide gras synthase est nécessaire à leur prolifération (Knobloch et al.,
2013).

L'analyse transcriptomique de Shin et al. (2015) a révélé environ 80 facteurs de transcription dont
l'expression est modifiée au cours des premiers stades de la neurogenèse hippocampique adulte. Sox9, Id4
ou Id3 semblent associés à l'état de quiescence dans l'hippocampe, tandis que l’expression de Sox4 et Sox11
augmente pendant l'activation. Ce sont les mêmes profils que l'on retrouve dans la SVZ révélant la présence
d'un programme génétique commun malgré les différences d'origine entre les cellules souches (Llorens-
Bobadilla et al., 2015). Ascl1 est aussi un acteur majeur en commun présent dans les cellules en division
(Andersen et al., 2014 ; Llorens-Bobadilla et al., 2015). Son activité est modulée par l'E3-ubiquitine ligase
Huwe1 qui déstabilise la protéine Ascl1 empêchant l'accumulation de cyclines et ramenant les cellules à
l'état de quiescence si besoin (Urban et al., 2016). Soutenant le rôle pivot d'Ascl1, les oscillations de son
expression, qui à leur tour dépendent des oscillations de Hes1, régulent l'activation de cellules souches,
tandis qu'une expression élevée de Hes1 et la suppression de Ascl1 qui en résulte favorisent la quiescence
des cellules souches neurales (Sueda et al., 2019).

La neurogenèse dans l'hippocampe est modulée par le comportement et les pathologies d'un
individu. L'exercice physique augmente cette neurogenèse tout comme les crises d'épilepsie (Lugert et al.,
2010). Dans le cas de l'exercice physique, il y a une amélioration de la prolifération des cellules progénitrices
et de la survie des nouveaux neurones qui dépend de la signalisation PI3kinase-Akt (Bruel-Jungerman et al.,
2009).

**Figure 7-240. Effet de l'exercice physique et de l'inhibition de la voie de signalisation PI3K-Akt sur la neurogenèse
du gyrus denté. A – C, coupes montrant la distribution des noyaux immunoréactifs au BrdU (marquant la
prolifération) dans le gyrus denté de rats sans exercice (A), avec exercice physique (une course forcée dans une roue
pendant 1 heure 2 fois par jour au cours d'une semaine) avec microinjection du solvant DMSO (B) ou microinjection
de l'inhibiteur de PI3kinase LY294002 (sgz, zone sous-granulaire ; gcl, couche de cellules granulaires). D – F,
grossissement plus élevé. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0007901

La prise d'anti-dépresseur tel que le Prozac (fluoxétine) augmente la neurogenèse adulte dans l'hippocampe
(Micheli et al., 2018) et celle-ci est indispensable pour que l'effet anti-dépresseur soit maximal. La fluoxétine
inhibe la recapture de la sérotonine de la synapse et des neurones sérotonergiques projettent dans le gyrus
dentelé de l'hippocampe où a lieu la neurogenèse adulte. Les neurones matures expriment les récepteurs
5-HT1A et 5-HT4 qui activent des voies de signalisation aboutissant à la stimulation de la neurogenèse des
cellules voisines et aussi à une "dématuration" des neurones matures qui gagnent sans doute en plasticité
neuronale (Segi-Nichida, 2017). Par ailleurs, les traitements anti-dépresseurs stimulent la production de
BDNF et l'activation des voies de signalisation en aval du récepteur TrkB ce qui favorise la survie des
nouveaux neurones dans la SGZ et contribue à l'amélioration des symptômes (Castren et al., 2010).

Lors du vieillissement, il y a une diminution de la production de nouveaux neurones par les cellules souches
neurales et une proportion plus importante de cellules gliales qui est générée.

580
 **Figure 7-242. Diminution de la neurogenèse et augmentation de la gliogenèse liée à l'âge dans la SGZ de
l'hippocampe. (C) Images en microscopie confocale d'hippocampe de souris de 2 ou 6 mois, marquée avec DAPI et
un immunomarquage anti-Nestin (haut) ou DAPI, et un immunomarquage anti-Dcx et anti-Mcm2 (bas). Barre
d'échelle = 100 µm (D) Quantification des cellules souches neurales radiales Nestin+ (en haut), des neuroblastes
proliférants Dcx+/MCM2+ (au milieu) et des neurones immatures Dcx+/MCM2− (en bas) chez des souris âgées de 2
ou 6 mois. (E) Images en microscopie confocale d'hippocampe de souris de 2 ou 6 mois, immunomarquées avec anti-
GFAP et anti-BrdU. Les souris ont reçu six injections intrapéritonéales quotidiennes de BrdU (50 mg/kg), un
analogue de nucléotides qui s'insère dans l'ADN lors de la réplication, 30 jours avant la mise à mort. Quantification
du pourcentage d'astrocytes GFAP+/BrdU+ sur le total des cellules BrdU+ dans SGZ (têtes de flèches = astrocytes ;
ligne blanche en pointillés = SGZ). Barre d'échelle = 10 µm; s'applique également à F. (F) Images en microscopie
confocale d'hippocampe de souris de 2 ou 6 mois, immunomarqués avec anti-s100β et anti-BrdU ( gauche). Les souris
ont été traitées comme dans E. Quantification du pourcentage d'astrocytes s100β+/BrdU+ sur le total des cellules
BrdU+ dans la SGZ (ligne pointillée blanche = SGZ). Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2007439117

La neurogénèse dans l'hippocampe adulte est encore plus altérée lors de la maladie d'Alzheimer. La
formation de plaques amyloïdes caractéristiques de la maladie perturbe la prolifération des
précurseurs et la différenciation des nouveaux neurones (Walgrave et al., 2021).

581
Croissance et guidage axonal
La croissance et le guidage des axones sont des étapes essentielles pour la mise en place des réseaux
neuronaux. L'identité d'un neurone dépend fondamentalement à quelle cible il est connecté. Les axones ont
une épaisseur comprise entre 0,1 et 15 µm mais peuvent avoir une longueur qui dépasse le mètre, ce qui
implique un important contrôle de leur croissance sur un trajet qui peut être très long. L'étude de ces
processus peut être aussi utile pour pouvoir stimuler la régénération axonale après une blessure.

Rôle du cytosquelette
Les signaux qui contrôlent croissance et guidage des axones activent des cascades de signalisation
qui mènent très souvent à des modifications du cytosquelette. Le guidage axonal peut être considéré
comme un cas particulier de migration avec le corps cellulaire qui ne bouge pas et seulement l'avant
de l'axone qui se déplace (cône de croissance). C'est pourquoi on trouve de nombreuses structures
cellulaires ou acteurs moléculaires en commun entre croissance axonale et migration cellulaire
(dont le cytosquelette et les protéines associées).

L'extrémité des axones forme des cônes de croissance, soutenus par un réseau dynamique de
microfilaments et de manière plus limitée, de microtubules. La polymérisation et la dépolymérisation
cycliques des filaments d'actine dans le cône de croissance sont nécessaires pour générer la force
mécanique qui provoque l'allongement axonal. Les cônes de croissance présentent une structure
similaire aux lamellipodes des cellules migrantes avec également des filopodes (voir Figure 5-29).

La stabilisation des microfilaments d'actine dans les filopodes est un élément essentiel qui va faire
"tourner" le cône de croissance vers un signal attractif. Les microtubules locaux doivent aussi être
stabilisés car leur fonction de "rails" pour le transport permet d'apporter les éléments nécessaires à la
réponse du cône de croissance à son environnement. L'importance de la stabilisation des microtubules est
aussi montrée par le fait que de faibles doses de molécules stabilisatrices comme le taxol ou les épothilones
facilitent la régénération axonale et la restauration fonctionnelle dans un modèle de blessure à la moelle
épinière chez le rat. L'inhibition de la fidgétine qui est une enzyme qui détruit les microtubules a le même
effet (Matamaros et al. 2019).

Les deux réseaux cytosquelettiques sont coordonnés par des protéines comme la Formine-2 qui stimule la
polymérisation de l'actine, tout en stabilisant les microtubules dans les cônes de croissance. La Formine-2
y interagit à la fois l'actine et avec les tubulines et cette interaction est importante pour des changements
de direction des cônes de croissance (Kundu et al., 2021). Des mutations perte-de-fonction du gène codant
la Formine-2 sont associées à des retards mentaux et des déficiences sensoriels, probablement en
association avec cette fonction coordinatrice (Law et al., 2014, Marco et al., 2018).
*Figure 7-243. Réseaux de microfilaments et de
microtubules dans un filopode d'un cône de
croissance. La Formine-2 (Fmn2) fait le lien entre
les deux réseaux. Source
: https://journals.biologists.com/jcs/article/134/13/jcs252916/270838/Coupling-of-dynamic-microtubules-to-F-
actin-by

La croissance axonale ne doit pas non plus être trop excessive car les axones ne doivent pas "dépasser" leurs
cibles et ne pas former trop de branchements. Par exemple, la protéine Efa6 inhibe la formation des
microtubules et est nécessaire à ce que les axones aient une bonne longueur (Qu et al., 2019).

582
 *Figure 7-244. Efa6 régule la longueur des axones dans des cultures de neurones primaires de drosophile.
Exemples de neurones primaires de drosophile cultivés 6 heures in vitro (A–C), observés en immunofluorescence
pour l'actine (magenta) et la tubuline (vert) ; les neurones sont soit des témoins de type sauvage (A), soit déficients
en Efa6 (B), soit exprimant Efa6-FL :: GFP ce qui correspond à une surexpression (C) ; les astérisques indiquent les
corps cellulaires, les flèches pointent vers les extrémités des axones ; Barre d'échelle en C = 10 µm. Quantification
des longueurs d'axones (D). Les différents génotypes sont codés par couleur : gris, témoins de type sauvage ; bleu,
différentes conditions de perte de fonction Efa6 ; vert, neurones surexprimant Efa6. Source
: https://elifesciences.org/articles/50319

En amont des éléments du cytosquelette et tout particulièrement des microfilaments d'actine, on

retrouve les petites GTPases Rho, Rac et Cdc42. Récemment, une forme photoactivable de Rac a pu être
exprimée in vivo dans des cônes de croissance de motoneurones de poisson-zèbre et la croissance des
axones correspondants a pu être contrôlée par la lumière. La photoactivation de Rac a même permis de
surmonter des signaux répulsifs et de faire passer des axones par des régions où ils ne peuvent pas pénétrer
habituellement (Harris et al., 2020).

Une intégration de signaux attractifs et répulsifs

Les cônes de croissance peuvent recevoir des instructions attractives ou répulsives :

* par paracrinie (ligands solubles) : par exemple, la nétrine-1, agissant par l'intermédiaire des
récepteurs de la famille DCC, favorise la croissance des axones et médie l'attraction; les protéines
Slit, d'autre part, sont des signaux répulsifs qui agissent à travers les récepteurs de la famille Robo
(Robo1 et Robo2; Notez que Robo3 est une forme particulière qui ne se lie pas à Slit et qui agit comme un
dominant-négatif sur les 2 autres récepteurs Robo, c'est-à-dire qu'il inhibe la répulsion (Sabatier et al.,
2004)).

* par juxtracrinie (ligands transmembranaires) : Par exemple, les interactions impliquant les
éphrines (voir Figure 7-121).

583
 **Figure 7-245. La formation de la carte rétinotopique
est régulée par les interactions des gradients d'éphrine
A/EphA. Pour préserver l'information spatiale reçue
dans la rétine (cercle jaune), les axones des cellules
ganglionnaires rétiniennes (RGC) se projettent vers la
zone terminale (TZ, cercle bleu) de leur cible (ovale
violet) de façon topographique pour former la carte
rétinotopique. Chez les mammifères, la cible est le
colliculus supérieur (SC), alors que chez le xénope, le
poussin et le poisson zèbre, c'est le tectum optique (OT).
La carte rétinotopique se forme via l'interaction
répulsive de l'éphrine A, qui est exprimée dans la
structure cible, et des récepteurs EphA, qui sont
exprimés sur les axones RGC en croissance. Comme le
montrent les gradients de gauche, les EphA sont
exprimées dans un gradient nasal-temporal (N-T)
croissant dans la rétine, tandis que les ligands d'éphrine
A sont exprimés dans un gradient antéro-postérieur (A-
P) croissant dans la cible. D'autres gradients de
signalisation, y compris la signalisation inverse de
l'éphrine A/EphA (côté droit), ainsi que l'éphrine
B/EphB (en haut et en bas), sont également présentés ici
et contribuent à la ramification des axones RGC. Source
: https://journals.biologists.com/dev/article/138/2/183/44798/Developmental-regulation-of-axon-branching-in-the

Les sémaphorines sont également impliquées dans le guidage axonal par juxtacrinie, même si certaines
formes peuvent être secrétées et participer à la signalisation paracrine. Elles peuvent en effet être
transmembranaires, ou associées à la membrane par une queue de glycosylphosphatidylinositol (GPI) mais
aussi solubles.
**Figure 7-246. Structure des différentes sémaphorines
chez les Mammifères. Source :
https://www.nature.com/articles/ejhg2015211

Les sémaphorines se lient aux protéines transmembranaires plexines et neuropilines. La signalisation

activée par les sémaphorines au cours du développement est fondamentale pour la formation et
l'organisation des circuits neuronaux. En effet, son dérèglement est lié à des maladies du développement du
système nerveux telles que l'autisme et la schizophrénie (Gilabert-Juan et al., 2015, Mosca-Boidron et al.,
2015).

Prenons un exemple avec un ligand soluble (paracrinie). Nell2 (neural epidermal growth factor (EGF)-like-
like 2, initialement identifiée chez le poussin et nommée « Nel ») est une glycoprotéine extracellulaire qui
présente des similitudes structurelles avec la thrombospondine 1 et qui est principalement exprimée dans
le système nerveux. Nell2 est exprimé dans la région dorso-médiale du dLGN, qui correspond au territoire
du thalamus recevant les axones RGC ipsilatéraux (c'est-à-dire dont le corps cellulaire est du même côté
(côté droit par exemple)). Des analyses de traçage d'axones in vivo ont montré que le régionalisation
spécifique de la projection des RGC est perturbée chez les souris Nell2 knock-out (Nell2−/−) : les axones RGC
controlatéraux envahissaient anormalement le domaine ipsilatéral du dLGN, alors que les axones
ipsilatéraux se terminaient par des plaques partiellement fragmentées, formant ainsi un motif en mosaïque
de zones de terminaison d'axones controlatéraux et ipsilatéraux. In vitro, Nell2 induit un effondrement du
cône de croissance et provoque une répulsion dans les axones RGC controlatéraux, mais pas ipsilatéraux.

584
Cette inhibition spécifique de l'axone controlatéral a été observée à la fois dans les RGC de type sauvage et
Nell2-/-. Ces résultats prouvent que Nell2 agit comme une molécule de guidage inhibitrice spécifique des
axones RGC controlatéraux et les empêche d'envahir le territoire ipsilatéral du dLGN (Nakamoto et al.,
2019).
*Figure 7-247. Nell2 inhibe la croissance des axones et
induit l'effondrement du cône de croissance
spécifiquement dans les RGC à projection controlatérale.
(A-E) Tests de croissance axonale. Des explants de rétine
ventrotemporale (VT ; contenant des RGC à projection
ipsilatérale) (A, C) et ventronasale (VN ; RGC à projection
contralatérale) (B, D) ont été préparés à partir
d'embryons de souris E15.5 et cultivés pendant 72 h sur
un substrat enduit de Nell2-AP (AP est un tag alcaline
phosphatase) (A, B) ou AP (C, D), et la croissance des
axones a été quantifiée (E) (n = 4 pour chaque condition).
Nell2-AP a significativement inhibé la croissance des
axones rétiniens VN (contralatéraux) mais pas VT
(ipsilatéraux). Barres d'échelle : 100 μm. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/4/dev170704/49006/Nell2-
regulates-the-contralateral-versus

Un même récepteur peut être capable d'intégrer des signaux attractifs et répulsifs. Néogénine (NEO1), un
récepteur à un domaine transmembranaire de la superfamille des Ig, est capable de se lier à la Nétrine-1
(qui est généralement attractrice) et à RGM (qui est répulsive). L'interaction RGM/NEO1 aboutit à
l'activation de la petite GTPase Rho et à la rétraction du cône de croissance. En présence des 2 ligands, il se
forme un trimère Nétrine-1/RGM/NEO1 ce qui a pour conséquence d'inhiber les effets de chacun des
ligands (Robinson et al., 2021).

Une partie des molécules de guidage axonal, notamment la Nétrine-1, la sémaphorine-3A et des éphrines,
nécessite des radeaux lipidiques pour attirer ou repousser les axones. Les radeaux lipidiques sont des
microdomaines hautement ordonnés et dynamiques de la membrane plasmique qui sont enrichis en
cholestérol, en sphingolipides et en gangliosides, et sont essentiels pour un large éventail de voies de
signalisation. Par exemple, les éphrines de type A nécessaires au développement de la rétinotopie
(organisation spatiale des projections axonales en provenance de la rétine), induisent une réduction de la
concentration d'AMPc spécifiquement à proximité des radeaux lipidiques dans les cônes de croissance des
cellules ganglionnaires rétiniennes. La rétraction des axones nécessite en revanche une forte signalisation
AMPc à proximité des radeaux lipidiques. Tout dépend de l'adressage ou de l'exclusion des sous-types
d'adénylyl cyclase des radeaux lipidiques (Averaimo et al., 2016).

585
 **Figure 7-248. L'éphrine-A5 induit une baisse de l'AMPc
à proximité des radeaux lipidiques dans des cônes de
croissance d'axones de cellules ganglionnaires de la
rétine. Un système de FRET (fluorescence resonance
energy transfer) sensible aux quantités d'AMPc soit à
proximité des radeaux lipidiques (Lyn-H147), soit à
distance des radeaux lipidiques (H147-Kras) a été utilisé
sur des axones en croissance en présence ou en absence
d'éphrine-A5. Plus les couleurs virent vers le rouge, plus
la concentration d'AMPc est importante. Source :
https://www.nature.com/articles/ncomms12896

Les facteurs attracteurs ou répulsifs peuvent agir sur les interactions cône de croissance-matrice
extracellulaire (MEC) qui sont importants pour la croissance et le guidage axonal. Par exemple, la Sémaphorine-
3A (sema3A) qui agit via des récepteurs Neuropiline/Plexine peut diminuer l'état d'activation de l'intégrine β1 (c'est-
à-dire diminuer ses capacités à interagir avec la MEC) et promouvoir le désassemblage des points focaux d'adhérence
contenant la paxilline (Bechara et al., 2008). Ces points focaux sont des éléments essentiels de la motilité où la cellule
prend appui sur la MEC pour avancer. Leur désassemblage constitue donc un frein majeur à la croissance axonale dans
une région où il y a de la Sémaphorine-3A.

*Figure 7-249. La présence de Sémaphorine-3A aboutit à la

disparition des points focaux d'adhérence contenant de la
paxilline. Des cultures primaires de neurones corticaux de
souris nouveaux nés sont mises en présence ou non (cont) de
Sémaphorine-3A pendant 20 minutes. Puis après fixation, une
coloration phalloïdine-RFP (rouge) permettant de mettre en
évidence les microfilaments d'actine et une
immunofluorescence anti-paxilline (vert) est effectuée. Source :
https://www.embopress.org/doi/full/10.1038/emboj.2008.86

Les molécules intervenant dans la polarité planaire (PCP) peuvent également intervenir :

* soit de manière cellulaire-autonome comme dans le cas des neurones commissuraux où Frizzled3 et
Vangl2 (deux membres de la voie Wnt/PCP) sont nécessaires dans les axones pour qu'ils tournent
antérieurement après avoir atteint la région médiane sagittale (Lyuksyutova et al., 2003; Schafer et al.,
2011).

586
 *Figure 7-250. Voie Wnt/PCP et guidage axonal.
Représentation de la distribution asymétrique de
Frizzled3 (Fzd3) dans les cônes de croissance en raison
de la localisation asymétrique de Vangl2 au niveau des
filopodes. Ici, Vangl2 favorise l'endocytose de Fzd3 et la
signalisation PCP dans certains filopodes pour assurer
une signalisation asymétrique dans le cône de croissance
en réponse aux gradients Wnt. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.692888/full

* soit de manière non cellulaire-autonome où c'est l'environnement des axones en croissance qui doit avoir
une polarité planaire correcte (cas des axones des neurones du ganglion spiral de type II dans la cochlée)
(Ghimire et al., 2018).

*Figure 7-251. Un défaut de polarité cellulaire planaire (PCP) dans l'environnement des neurones du ganglion spiral
de type II dans la cochlée affecte le trajet de leurs axones. Le gène contrôlant la PCP Vangl2 a été délété
spécifiquement dans les cellules cochléaires grâce au système Cre/Lox sous le contrôle du promoteur de Emx2. Le
trajet des axones (où Vangl2 n'est pas délété) est suivi grâce à une immunofluorescence anti-NF200. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/12/dev159012/48441

> Un exemple classique : les neurones commissuraux lors du développement de la moelle épinière

Par définition, les neurones commissuraux ont leur axone qui passe du côté contralatéral. La classe
la plus dorsale des neurones commissuraux de la moelle épinière, les neurones dI1, a été largement
étudiée en ce qui concerne le guidage de leur axone vers la région la plus ventrale du tube neural :
la plaque du plancher. Ces axones traversent ensuite la ligne médiane et tournent vers l'avant à la
sortie de la plaque du plancher du côté controlatéral. Pour cette population particulière d'axones,
des molécules de guidage et des récepteurs contrôlant toutes les étapes de ce processus de
navigation ont été identifiés et comprennent des attractifs et des répulsifs à longue portée, ainsi que
des éléments de guidage à courte portée.

587
 *Figure 7-252. Guidage axonal des neurones commissuraux
dans la moelle épinière en développement. Le schéma de gauche
indique les trois étapes de la détermination du chemin des
axones commissuraux : (1) extension vers la plaque du
plancher ; (2) franchissement de la ligne médiane ; et (3) virage
vers les régions antérieures. Les mécanismes moléculaires
impliqués dans les trois étapes sont résumés à droite. Aux
premiers stades (1), les axones commissuraux (bleu) sont
subdivisés en six sous-populations dorsales (dI1-dI6) et
étendent leurs axones vers la plaque du plancher. Ils sont guidés
par des répulsifs dérivés de la plaque de toit (rouge ; BMP7 et
Draxin). De plus, la plaque du plancher exprime des molécules
attractives à longue portée : nétrine, Shh et VEGF. La nétrine
dérivée de la plaque du plancher (vert foncé), mais pas des
cellules précurseurs de la zone ventriculaire ventrale (vert
clair), est indispensable pour la croissance des axones
commissuraux jusqu'à la plaque du plancher. Une fois que les
cônes de croissance dI1 ont atteint la plaque du plancher (2), ils
y pénètrent à la suite de l'interaction de Cntn2 exprimé par le
cône de croissance avec NrCAM dans la plaque du plancher (non
illustré). L'activation de l'expression de Robo1 assure alors le
croisement de la plaque du plancher et les axones sont expulsés
de cette région par les interactions Slit-Robo1. De plus,
l'interaction cis entre la plexine A2 et Sema6B sur les axones de
pré-croisement empêche la réactivité aux sémaphorines
répulsives de classe 3 (Sema3) exprimées par la plaque du
plancher; cette interaction cis n'existe plus sur les axones post-
croisement, où la plexine A2 forme maintenant un complexe
avec la neuropiline 2 (Npn-2), rendant ainsi les axones post-
croisement sensibles à la répulsion par Sema3. Shh contribue
également à l'induction de la réactivité médiée par Npn-2 aux
sémaphorines de classe 3 (non illustré). En atteignant la
bordure controlatérale de la plaque du plancher (3), les axones
tournent rostralement (vers l'avant) en réponse à des gradients
opposés de Wnt (qui a un effet attractif) et Shh (qui a un effet
répulsif). Shh agit comme attractif pour les axones de pré-
croisement exprimant les récepteurs Ptc et Boc, et induit
l'expression de Hhip, son récepteur, sur les axones en post-
croisement. En plus de son effet répulsif direct sur les axones
post-croisement, Shh module l'activité Wnt en façonnant le
gradient d'activité Wnt d'une manière dépendante de Sfrp et en
régulant l'expression de surface de Fzd3 d'une manière
dépendante de Shisa2. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/10/dev151415/48515/Understanding-axon-guidance-are-we-nearly-there

Traduction locale et stabilité protéique dans les cônes de croissance

La production locale de protéine par une traduction d'ARNm spécifiques transportés dans les cônes
de croissance est un élément essentiel.
*Figure 7-253. Ribosomes dans le cône de croissance
d'un axone vu en microscopie électronique à
transmission. PM = membrane plasmique. Source :
https://elifesciences.org/articles/48718

Du réticulum endoplasmique est aussi transporté vers les cônes de croissance et les ribosomes peuvent
s'accrocher dessus pour la traduction de protéines transmembranaires ou sécrétées. Par exemple, dans les
motoneurones en développement, la traduction locale aux cônes de croissance est stimulée par des facteurs
neurotrophiques comme le BDNF (qui agit via son récepteur TrkB) (Deng et al., 2021).

588
 **Figure 7-254. Une stimulation par BDNF induit l'assemblage des ribosomes dans les cônes de croissance des
motoneurones. (A) Images représentatives de cônes de croissance de motoneurones stimulés par le BDNF colorés
en immunofluorescence anti-RPL24 (qui est une protéine de la sous-unité 60S des ribosomes) et anti-RPS6 (qui est
une protéine de la sous-unité 40S des ribosomes). Quand il y a colocalisation, c'est que les 2 sous-unités sont
ensemble (et sans doute participent à la traduction d'un ARNm). Le coefficient de Pearson sur la figure C permet
d'estimer les colocalisations. En présence du bloqueur de polymérisation d'actine cytochalasine D, il n'y a plus de
colocalisation induite par le BDNF. Les carrés blancs indiquent les régions d'intérêt montrées dans les images
agrandies du cône de croissance sur la droite. Source : https://journals.biologists.com/jcs/article/134/22/jcs258785/273453/Dynamic-remodeling-
of-ribosomes-and-endoplasmic

Des signaux attracteurs tels que la nétrine-1 (via le récepteur DCC), le BDNF (via le récepteur TrkB) et le
NGF (via le récepteur TrkA) induisent la synthèse locale de composants cytosquelettiques tels que la β-
actine (Leung et al. 2006, Willis et al. 2007, Yao et al. 2006). En revanche, des signaux répulsifs tels que
Sema3A (via les récepteurs Nrp1/PlexinA) et Slit2 (via le récepteur Robo2) induisent la traduction de
régulateurs négatifs du cytosquelette tels que RhoA et la cofiline, entraînant un effondrement du cône de
croissance (Piper et al. 2006).

La synthèse mais aussi la dégradation des protéines est un paramètre important pour la croissance et le
guidage axonal. Le système ubiquitine-protéasome permet de diminuer rapidement la quantité d'une
protéine donnée dans le cône de croissance, ce qui permet de répondre rapidement à des signaux. Par
exemple, une activité normale du protéasome dans les axones en croissance de cellules ganglionnaires
rétiniennes est nécessaire pour que la nétrine puisse repousser ces axones (Campbell et Holt, 2001).
L'ubiquitine ligase Cdh1-APC qui est connue pour jouer un rôle lors de la mitose (et notamment le
déclenchement de l'anaphase) joue un rôle important dans la croissance axonale (Konishi et al., 2004). Elle
agit non seulement dans le cône de croissance mais aussi dans le noyau où elle cible SnoN, un co-répresseur
transcriptionnel (Stegmüller et al., 2006). SnoN stimule la croissance axonale dans les cellules granulaires
du cervelet et donc l'action de Cdh1-APC module et limite la croissance axonale de ces neurones.

589
 *Figure 7-255. Le co-répresseur transcriptionnel SnoN stimule la croissance axonale. Des cultures primaires de
neurones du cervelet sont transfectées avec un vecteur contrôle U6 ou avec un vecteur permettant de synthétiser un
ARNi inhibant l'expression de SnoN (U6/snon). La croissance des axones est suivie deux jours après la mise en
culture et la transfection pendant 48 heures. Source : https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(06)00256-X

Le développement des organes génitaux et des cellules germinales

*Figure 7-256. Cellules somatiques et cellules germinales chez l'être humain.

Le concept d’hérédité est au cœur de la logique du vivant et ce sont les cellules germinales qui
permettent de transmettre l’information génétique à la génération suivante.

Quel que soit l'organisme concerné, les cellules germinales ne naissent pas dans les gonades mais
sont spécifiées très tôt dans le développement embryonnaire bien avant que les gonades ne se
forment. Elles sont mises à part rapidement et ne participent pas aux feuillets embryonnaires,
ectoderme/mésoderme/endoderme. Elles migrent ensuite pour atteindre les gonades (Richardson
et Lehmann, 2010).

Bien que les mécanismes de détermination des cellules germinales ont varié au cours de l'évolution, certains
acteurs sont remarquablement conservés tels que les protéines Vasa ou Nanos qui lient des ARN (Tanaka
et al., 2000 ; Juliano et al., 2010).

590
Le développement des organes génitaux

*Figure 7-257. Du sexe génotypique au sexe

phénotypique chez l'être humain.

Le développement des organes génitaux est en grande partie déterminé par les gènes, même si
l'environnement peut jouer un rôle plus ou marqué selon les cas. Chez les Mammifères, les organes
génitaux sont déterminés par les chromosomes sexuels (XX = femelle; XY = mâle) et c'est la présence
du chromosome Y qui est déterminante, même s'il n'est pas le seul à intervenir. Les oiseaux ont un
système opposé : les mâles ont deux chromosomes sexuels similaires (ZZ, le nom des chromosomes est pure
convention) et les femelles ont deux chromosomes sexuels différents (ZW). Dans ce cas, le sexe est
déterminé par la quantité produite de DMRT1 dont le gène est porté par le chromosome Z (Smith et al.,
2009). Chez la drosophile, le chromosome Y est présent en unique exemplaire chez le mâle mais il
ne joue pas de rôle dans la détermination du sexe et ce qui compte, c'est le nombre de chromosome
X (un chez les mâles, deux chez les femelles). Chez d'autres insectes, notamment les abeilles
(Hyménoptères), c'est la ploïdie générale qui compte : les mâles sont haploïdes, issus d'une parthénogenèse
alors que les femelles sont diploïdes.

Signalons que dans certains cas, le sexe peut être déterminé par l'environnement, notamment la
température pendant le développement des œufs chez les tortues. Chez eux, l'expression de l'histone H3
déméthylase KDM6B est activée par les températures qui aboutissent à la formation de mâles. L'inhibition
forcée de son expression aboutit à la formation de femelles, même si ce n'est pas la bonne température pour
leur développement. L'activité de KDM6B permet l'activation de l'expression de Dmrt1 dont le produit
dirige le développement des organes génitaux mâles (Ge et al., 2018).

> Chez les Mammifères

RAPPEL : Vidéo sur la dissection de l'appareil génital mâle et femelle chez la souris.

Les crêtes génitales sont une structure mésodermique (originaire du mésoderme dit intermédiaire
et associée au mésonéphros) à partir de laquelle les gonades (ovaires ou testicules) se développent.
Les précurseurs des cellules qui peuplent les crêtes génitales dérivent de cellules multipotentes qui peuvent
donner soit les gonades, soit les cellules de la corticosurrénale (Neirijnck et al., 2023). Ces deux types
cellulaires sont déterminés et se séparent vers E10,5.

591
 **Figure 7-258. Origine commune au cortex surrénalien et aux gonades. Les cellules multipotentes du primordium
adrénogonadal se séparent en 2 populations vers E10,5 chez la souris, permettant le développement des crêtes
génitales om se développent les gonades et du la glande cortico-surrénale (adrenal cortex). Source :
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)00202-4

Des cellules prolifèrent dans les crêtes génitales chez la souris à partir de E10,5 et chez l'Homme à partir de
la 4ème semaine depuis la fécondation. Les cellules germinales qui ont été générées à un autre endroit
migrent vers ces structures (voir plus loin). C'est après E10,5 que cette gonade bi-potentielle se
différencie en testicule ou en ovaire. Les cellules de soutien deviennent soit des cellules de Sertoli,
soit des cellules folliculaires. Les cellules endocrines produisant des hormones stéroïdes
deviennent soit des cellules de Leydig, soit des cellules de la thèque.

*Figure 7-259. Développement embryonnaire du testicule chez la souris. Entre le jour embryonnaire (E) 8,75 et E9,5,
les cellules germinales migrent dorsalement vers la crête génitale en développement. Le facteur de transcription SRY
active l'expression de Sox9 ce qui entraîne la détermination des cellules de Sertoli (en bleu) à partir de E10.5. Les
cellules de Sertoli en prolifération commencent à se compartimenter pour former des cordons testiculaires autour
de E12.5. Après la prolifération des cellules de Sertoli, les cellules de Leydig fœtales (violet) et les cellules myoïdes
péritubulaires (vert) se différencient. À E15.5, la majorité des cellules testiculaires se sont différenciées. Les cellules
de Sertoli et les cellules myoïdes péritubulaires sécrètent diverses protéines de la matrice extracellulaire pour
former la lame basale, qui entoure les cordons testiculaires et maintient leur structure. Les cordons testiculaires sont
composés de cellules germinales en quiescence entourées de cellules de Sertoli, avec une couche externe de cellules
myoïdes péritubulaires et de matrice extracellulaire. L'espace interstitiel comprend des cellules de Leydig fœtales
stéroïdogènes, du mésenchyme et une vascularisation sanguine importante. D'après https://www.mdpi.com/2073-
4425/12/4/486/htm

La détermination des cellules de Sertoli dépend du gène SRY (pour Sex-determining Region of Y
chromosome) qui code un facteur de transcription qui active l'expression de Sox9 (voir Figure 4-19).
SRY provoque également la production de prostaglandine D2 qui est nécessaire pour qu'un nombre
suffisant de cellules soit déterminé en cellules de Sertoli (Wilhelm et al., 2005). Ces cellules prolifèrent
abondamment, faisant quadrupler de volume la gonade jusqu'à E13,5. Les cellules de Sertoli s'agrègent
ensuite pour former les cordons séminifères (à 7 semaines de développement chez l'Homme) (Ungewitter
et Yao, 2013). Elles sécrètent en coopération avec les cellules myoïdes péritubulaires une lame basale
autour des cordons séminifères, créant une compartimentation essentielle à l'intérieur du testicule.

Les cordons restent pleins jusqu'à la puberté. Ils se creusent alors d'une lumière et deviennent des tubes
séminifères.

En dehors des gonades, se développent les canaux nécessaires au fonctionnement de l'appareil

génital. Le canal de Wolff est initialement le canal du mésonéphros qui constitue le rein embryonnaire.

592
 **Figure 7-260. Position du canal de Wolff (ici écrit
Wolf) sur une coupe transversale d'embryon de poulet
à 4 jours de développement. Source : Christian Champy,
Manuel d'embryologie, Ed. Masson (1921)

Ce rein disparaît à la fin du 2ème mois du développement embryonnaire chez l’Homme, ne laissant qu'une
partie du canal de Wolff qui donne naissance à l'épididyme, aux canaux déférents et aux vésicules
séminales sous l'influence de la testostérone produite par les cellules de Leydig dans les testicules.
Par ailleurs, la testostérone fait différencier la partie pelvienne du sinus urogénital en prostate.

*Figure 7-261. Développement des voies génitales mâles

et femelles chez les Mammifères. D'après
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e3/2915_Sexual_Differentation-02.jpg

Les expériences de Jost réalisées dans les années 1940 ont été une étape importante pour
comprendre les mécanismes mis en jeu.

Chez le mâle, le canal de Müller régresse sous l'action de l'hormone anti-Müllerienne (AMH)
produite par les cellules de Sertoli. Sox9 se fixe directement sur le promoteur du gène codant AMH
et active sa transcription (De Santa Barbara et al., 1998). SOX9 n'est pas le seul facteur de transcription à
se fixer sur ce promoteur : il y a aussi SF-1 et GATA4.

L'AMH est une protéine de la famille des ligands TGFβ et elle agit non pas directement sur les canaux
de Müller mais sur le mésenchyme autour qui envoie ensuite des signaux aux canaux qui induisent
leur apoptose.

593
 *Figure 7-262. Expériences de Jost. Elles ont été réalisées sur des fœtus de lapin de 20 jours. A) Si on enlève les
gonades que ce soit chez un fœtus mâle ou un fœtus femelle, les canaux de Wolff régressent, les canaux de Müller se
maintiennent. B) Si on greffe un testicule sur un fœtus femelle, les canaux de Müller régressent et les canaux de Wolff
se maintiennent => ce sont les testicules qui sont responsables de la régression des canaux de Müller et du maintien
des canaux de Wolff chez les mâles. C) Ajout d'un cristal de testostérone dans un fœtus femelle qui diffuse de la
testostérone dans le sang. La testostérone seule permet le maintien des canaux de Wolff mais n'est pas responsable
de la régression des canaux de Müller. Une autre hormone produite par le testicule (cf. expérience B) doit avoir ce
rôle. Source : http://svtfenelon.free.fr/articles.php?lng=fr&pg=568

Chez le mâle, le canal de Müller régresse sous l'action de l'hormone anti-Müllerienne (AMH)
produite par les cellules de Sertoli. Sox9 se fixe directement sur le promoteur du gène codant AMH
et active sa transcription (De Santa Barbara et al., 1998). SOX9 n'est pas le seul facteur de transcription à
se fixer sur ce promoteur : il y a aussi SF-1 et GATA4.
*Figure 7-263. Expérience d'empreinte à la DNAse I avec
un promoteur du gène codant l'AMH en présence ou en
absence de SOX9. Un fragment du promoteur du gène
codant l'AMH est marqué radioactivement à une
extrémité puis on l'incube avec une solution témoin
(GST) ou avec une solution contenant SOX9 (GST-SOX9).
Puis on fait agir de manière mesurée l'endonucléase
DNAse I et on fait migrer les fragments obtenus sur un
gel à électrophorèse. La portion d'ADN protégée par la
fixation de SOX9 (et qui génère un déficit de fragments
d'une certaine taille) est ainsi mise en évidence (SOX9-
BS). Les chiffres à gauche correspondent à la position par
rapport au site de démarrage de la transcription. Source
:
https://journals.asm.org/doi/10.1128/MCB.18.11.6653

L'AMH est une protéine de la famille des ligands TGFβ et elle agit non pas directement sur les canaux
de Müller mais sur le mésenchyme autour qui envoie ensuite des signaux aux canaux qui induisent
leur apoptose.

594
La migration des testicules de l'abdomen vers le scrotum se fait entre le 7 ème et le 8ème mois de grossesse.
L'absence de descente testiculaire appelée cryptorchidie (2% des naissances) provoque une stérilité car la
spermatogenèse ne peut se faire à la température du corps mais à une température légèrement inférieure.
Les mécanismes à l'œuvre sont en cours d'étude. Par exemple, le microARN miR-210 qui a son expression
augmentée chez les patients atteints de défauts de maturation de spermatozoïdes a aussi son expression
fortement augmentée chez des patients atteints de cryptorchidie (Duan et al., 2016). Signalons que la
migration testiculaire définitive dans le scrotum ne concerne que les Primates, les Ongulés et les
Marsupiaux. Chez les Rongeurs, les Insectivores et les chauves-souris, les testicules peuvent remonter dans
la cavité abdominale.

On voit que l'expression du gène SRY induit une cascade d'évènements qui aboutit au phénotype
génital mâle. Il n'y a pas d'effets de dosage comme chez d'autres organismes. Les patients atteints
du syndrome de Klinefelter sont XXY. Malgré la présence de 2 chromosomes X, le chromosome Y
assure que les patients ont des organes génitaux mâles normaux jusqu'à la puberté où les testicules
deviennent plus petits que la normale et où la spermatogénèse ne se fait pas correctement. Les
patients sont stériles. Mais en ce qui concerne le développement embryonnaire, tout se passe bien.
*Figure 7-264. Caryotype d'un patient atteint du syndrome de
Klinefelter. Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Klinefelter_syndrome#/media/File:Human_chromosomesXXY01.png

A partir de la gonade bipotentielle, les ovaires se développent avec un programme génétique précis
chez les embryons sans chromosome Y. Les cordons de cellules en formation au centre de la gonade
dégénèrent et ce sont des cordons de cellules à la périphérie qui se développent, donnant les cellules
folliculaires. Les cellules les plus proches des ovocytes deviennent les cellules de la granulosa tandis que les
cellules les plus éloignées deviennent les cellules de la thèque. Ces processus de développement dépendent
de l'expression de Wnt4 et la R-spondine qui accentue son effet : ensemble, ils activent fortement la voie
canonique Wnt/β-caténine (Boyer et al., 2010, Chassot et al., 2014). Cette voie aboutit à l'inhibition de
l'expression de Sox9 qui ne peut plus agir pour faire produire des testicules (Kim et al., 2006).
**Figure 7-265. Une quantité normale de Wnt4 est
nécessaire pour éviter que FGF9 induise l'expression de
SOX9 dans des gonades de souris XX.
L'immunofluorescence de SOX9 (rouge) montre que
l'ajout de FGF9 active l'expression de SOX9 dans les
gonades hétérozygotes des Wnt4+/− XX (G), mais pas
dans les gonades Wnt4+/+ XX (F). L'immunofluorescence
anti-PECAM (vert) marque les cellules germinales et les
cellules endothéliales. Barres d'échelle = 50 µm. Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.0040187

Une quantité trop forte de la voie de signalisation canonique Wnt/β-caténine peut aboutir à un
développement d'ovaires chez des patients XY. Cela peut être provoqué par une duplication d'une région
du chromosome 1 qui contient les gènes WNT4 et R-SPONDINE (Jordan et al., 2001).

595
En parallèle de la voie Wnt/β-caténine, le gène Foxl2 codant un facteur de transcription à boîte Forkhead
voit son expression activée dans les ovaires et il est essentiel pour la mise en place de l'organisation des
cellules folliculaires autour des ovocytes. Si on le délète chez l'adulte, les cellules folliculaires changent
d'aspect et présentent des caractères rappelant les cellules de Sertoli avec l'expression de Sox9 qui est
activée (Uhlenhaut et al., 2009). Foxl4 est donc un facteur essentiel au maintien de l'identité féminine des
structures ovariennes car il empêche leur transdifférenciation en structures masculines (Georges et al.,
2014). La répression qu'exerce Foxl2 sur l'expression de Sox9 se fait de manière conjointe avec le récepteur
alpha aux œstrogènes ESR1. Foxl2 a aussi d'autres actions qui potentialisent les œstrogènes. Il augmente la
transcription d'un gène codant une enzyme impliquée dans la synthèse des œstrogènes, l'aromatase
Cyp19a1. Il stimule aussi la transcription du récepteur aux œstrogènes ESR2 (Georges et al., 2014).
**Figure 7-266. Multiples rôles de FOXL2 dans l'ovaire
en relation avec la signalisation oestrogénique. Source :
https://elifesciences.org/articles/04207

*Figure 7-267. Séquence consensus reconnue par les

récepteurs aux œstrogènes (ESR) sur les promoteurs
et/ou enhancers de leurs gènes-cibles. Cette séquence
s'appelle un ERE (= estrogen response element). Source
: https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-
8674(05)00453-8

Les canaux de Müller sont maintenus car, en absence de cellules de Sertoli, il n'y a pas de production
d'hormone anti-müllerienne. Sous l'action des œstrogènes, les canaux de Müller donnent les
oviductes, l'utérus et la partie haute du vagin. Les canaux de Wolff qui ont besoin de recevoir de la
testostérone pour survivre meurent par apoptose. Signalons qu'avant de disparaitre, les canaux de
Wolff envoient des signaux qui sont nécessaire au bon développement des canaux de Müller (Atsuta et al.,
2016).
*Figure 7-268. Appareil génital de la femme

Alors que pour le développement des ovaires, la voie Wnt/β-caténine est cruciale, elle est en revanche
inhibée lors du développement des autres organes génitaux femelles. Dickkopf, un inhibiteur de la voie Wnt
est exprimé dans le tubercule génital qui finit par donner le clitoris et les grandes lèvres sous l'influence des
œstrogènes. Chez le mâle, un dérivé de la testostérone (la DHT) inhibe l'expression de Dickkopf ce qui
permet à la voie Wnt d'agir et de transformer le tubercule génital en pénis et en scrotum (Miyagawa et al.,
2009).

596
 *Figure 7-269. Développement des organes génitaux externes. Le tubercule génital donne le gland et le prépuce du
pénis ou du clitoris. Le renflement labio-scrotal donne le scrotum et les grandes lèvres. Le bourrelet latéral donne le
corps du pénis ou du clitoris. Signalons que le corps du clitoris est interne et nettement plus grand que ce qu'on
pensait il y a quelques décennies. Le sillon uro-génital donne les petites lèvres et le raphé. D'après Olin E. Nelsen,
Comparative Embryology of the Vertebrates.

Le développement (et notamment la croissance) des organes génitaux mâles se termine à la puberté. A
partir de 10 ans, la kisspeptine dans l'hypothalamus augmente la sécrétion de GnRH ce qui induit en cascade
l'augmentation de la production de LH et de FSH dans l’adénohypophyse puis de testostérone dans les
testicules (Terasawa et al., 2013).

Le développement des cellules germinales

*Figure 7-270. Dessin par Anton von Leeuwenhoek

(1632-1723) de spermatozoïdes de lapin et de chien.
Grâce à ses travaux pionniers d'observations avec un
microscope rudimentaire, von Leeuwenhoek a été le
premier humain à observer des spermatozoïdes. Source
: https://lensonleeuwenhoek.net/

A la fin du XIXème siècle, Auguste Weissmann proposa sa théorie du plasma germinatif où il distingue
les cellules germinales, qui assurent la pérennité de l’espèce à travers la continuité de la
descendance des individus, des cellules somatiques, responsables de la construction d’un individu
mais par définition « mortelles ». Les cellules germinales gardent aussi leur totipotence,
contrairement aux cellules somatiques qui la perdent au cours de leur différenciation. En règle
générale, cette totipotence ne peut s'exprimer qu'en cas de fécondation mais des cas de
parthénogenèse où l'ovocyte se développe seul en embryon existent dans divers groupes de
Métazoaires.

Dans de nombreux organismes, la lignée germinale est parmi les premiers types de cellules à être
mis de côté. Une lignée germinale séparée tôt du reste des cellules empêche la transmission de
mutations somatiques aux générations futures, ce qui peut être un avantage. Les cellules germinales
précoces, appelées cellules germinales primordiales (PGC), sont spécifiées par des facteurs
597
maternels ou par des signaux inductifs (Lawson et al., 1999). Une fois spécifiées, les PGC ignorent les
programmes de différenciation somatique et migrent vers le site dans lequel se forme la gonade
(Braat et al., 1999; Gross-Thebing et al., 2017; Extavour et Akam, 2003; Marlow, 2015). Là, les PGC
prolifèrent, entrent en méiose (avec un délai plus ou moins long) et se différencient pour produire
les gamètes : spermatozoïdes chez les mâles et ovocytes chez les femelles.

Les animaux dit clonaux tels que les Cnidaires ne séparent pas une lignée germinale pendant
l'embryogenèse. Au lieu de cela, ils possèdent des cellules souches adultes qui contribuent aux tissus
somatiques, mais aussi aux gamètes. Ce sont des animaux qui ont en général de très bonnes capacités de
régénération. Ainsi, toute partie du corps possédant ces cellules souches peut régénérer un individu qui
pourra produire des cellules germinales et transmettre ses gènes à une nouvelle génération. Le facteur de
transcription AP2 (Tfap2), un régulateur de la lignée germinale chez les Mammifères, est nécessaire et
suffisant pour engager les cellules souches adultes, appelées cellules i, à devenir des cellules germinales
chez le cnidaire Hydractinia symbiolongicarpus.

On pense qu'une lignée germinale non séparée à l’état embryonnaire est un trait ancestral chez les
Métazoaires. Dans cette hypothèse, un évènement clé dans l'évolution des lignées germinales aura été le
décalage du programme d'induction de cellules germinales depuis les adultes vers l'embryon.

La définition clinique de l'infertilité est définie comme l'incapacité des couples à concevoir un
enfant après 18 mois de rapports sexuels réguliers non protégés. Selon les statistiques de
l'Organisation Mondiale de la Santé, l'infertilité affecte environ 12 à 15 % des couples dans le
monde (American Society for Reproductive Medicine, 2015). Les facteurs masculins sont
responsables de 50 % des cas d'infertilité, parmi lesquels 20 % à 30 % sont dus uniquement à des
facteurs masculins et 20 à 30 % sont dus à des facteurs affectant les deux partenaires (Tournaye et
al., 2017). La prévalence de l'infertilité masculine a augmenté de 0,291 % par an de 1990 à 2017
dans le monde, et pourrait approcher la limite de 50 %. L'étude du développement des cellules
germinales et de leur physiologie sert aussi à trouver des solutions pour les patient.e.s infertiles.

> Chez Caenorhabditis elegans

Chez le nématode, la lignée germinale est mise en place à la fin de la quatrième division de clivage. Toutes
les cellules germinales sont dérivées du blastomère P1. L'ovocyte contient des granules P dans son
cytoplasme qui au cours de divisions asymétriques successives finissent dans les cellules P. Un composant
de granule P, le produit du gène pgl est nécessaire pour le développement des cellules germinales, et régule
certains aspects du métabolisme des ARNm. Le facteur de transcription à doigts de zinc PIE-1, produit par
la mère, est impliqué dans le maintien des propriétés de cellules germinales dans les blastomères dérivés
de P. En effet, chez les mutants pie-1, la lignée germinale se différencie en cellules intestinales
surnuméraires (Mello et al., 1992). Alors que la transcription est activée dans les cellules somatiques au
stade 3-4 cellules, PIE-1 réprime la nouvelle transcription des gènes zygotiques dans ces blastomères
jusqu'à ce qu'il disparaisse aux alentours du stade 100 cellules. Cette répression générale protège les
cellules germinales des actions de facteurs de transcription qui favorisent le développement en cellules
somatiques (Nakamura et Seydoux, 2008).
**Figure 7-271. Répression généralisée de la
transcription par PIE-1 dans les cellules germinales lors
des premiers stades du développement de C. elegans.
Dans les blastomères P2, P3 et P4, PIE-1 interagit avec la
sous-unité Cycline T de P-TEFb, bloquant son interaction
avec le domaine CTD de l'ARNpolymérase II et la
phosphorylation sur la sérine 2 qui est nécessaire au
passage à la phase d'élongation de la transcription. PIE-
1 inhibe également la phosphorylation d'autres sérines
sur le CTD par un mécanisme inconnu. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/135/23/3817/64833/Less-is-more-
specification-of-the-germline-by

598
Une caractéristique commune des cellules germinales est la présence de granules germinaux (nous venons
de voir les granules P chez C. elegans). Il s'agit de compartiments cytoplasmiques sans membrane qui se
forment par séparation en phase liquide-liquide (LLPS) à partir du cytoplasme (Brangwynne et al., 2009).
Riches à la fois en ARN et en protéines de liaison à l'ARN, les granules germinaux contiennent un grand
nombre de molécules ayant des rôles dans la régulation post-transcriptionnelle de l'ARN et la préservation
de l'intégrité du génome. Ces assemblages complexes de ribonucléoprotéines (RNP) sont importants pour
la spécification, la maintenance et le développement normal de la lignée germinale (Knutson et al., 2017).

***Figure 7-272. La protéine PIWI est ségrégée très tôt dans les cellules qui vont donner la lignée germinale chez
Caenorhabditis elegans. Immunofluorescence contre la protéine PIWI (vert) qui est une protéine de la famille
Argonaute qui se fixe aux ARN. On la voit, dès le stade zygotique, se localiser à une extrémité (le futur côté postérieur).
Elle sera héritée uniquement par le blastomère P. Ensuite, elle est ségrégée uniquement dans une cellule. Au stade
100 cellules, elle est héritée par 2 cellules pour la première fois. Immunofluorescence contre la protéine CSR-1 qui
fait partie de la même famille Argonaute et qui finit par être présente uniquement dans la lignée germinale, mais
avant, elle a une répartition plus généralisée que PIWI. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-
21691-6

La spécification des PGC nécessite l'activité de régulateurs de la chromatine qui induisent des changements
à l'échelle du génome dans l'expression des gènes. Chez C. elegans, la méthyltransférase MES-4 et le
Polycomb Repressive Complex (PRC2, comprenant MES-2, 3 et 6) coopèrent pour ajouter des modifications
épigénétiques sur les histones favorables à la transcription sur les gènes spécifiques de la lignée germinale
(pour MES-4) et répressives pour les gènes de la lignée somatique (pour PRC2) (Gaydos et al., 2012).

L'activation dépendante de MES-4 des gènes de la lignée germinale est antagonisée dans les lignées
somatiques par un groupe de régulateurs transcriptionnels (Curran et al., 2009 ; Petrella et al., 2011 ;
Unhavaithaya et al., 2002). Parmi ceux-ci, DRM et LIN-15B répriment les gènes de détermination de la lignée
germinale dans les cellules somatiques (Petrella et al., 2011). La perte de facteurs DRM ou LIN-15B
provoque une activation ectopique des gènes de la lignée germinale dans les cellules somatiques.
***Figure 7-273. LINA5-B réprime la détermination
germinale dans les cellules somatiques.
Immunofluorescence avec un anticorps reconnaissant
PGL-1 (rouge) et PGL-3 (vert) dans des larves L1
sauvages (WT) ou mutantes perte-de-fonction lin-15B.
Les L1 sauvages ont une fluorescence uniquement dans
les deux cellules germinales primordiales (PGC) Z2 et
Z3 (pointes de flèche), tandis que les mutants
présentent en plus une forte expression ectopique dans
les autres cellules. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/138/6/1069/44868/synMuv-B-proteins-antagonize-germline-fate-in-the

L'inactivation de MES-2/-3/-4/-6 supprime l'expression du gène de la lignée germinale ectopique des

mutants lin-15B à 26°C. Ces observations suggèrent que les facteurs DRM et LIN-15B antagonisent l'activité
du MES dans les lignées somatiques pour empêcher les gènes de la lignée germinale de s'exprimer.

> Chez les Mammifères

599
Chez l'embryon de souris à E7,25, il y a apparition de 15 à 100 cellules germinales primordiales
(PGC) dans l'endoderme du sac vitellin et dans la région de l'allantoïde proche de la ligne primitive.
Elles ont été identifiées initialement par l'activité importante de leur alcaline phosphatase (Ginsburg et al.,
1990).
*Figure 7-274. Activité alcaline phosphatase des
premières cellules germinales primordiales chez un
embryon de souris de E7,25 (en gastrulation). Les
cellules germinales primordiales sont ici désignées par
APc. Le côté postérieur est vers la droite. a = amnios; al=
allantoïde en début de croissance; ec = exocoelome.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/110/2/521/37081/Primordial-germ-cells-in-the-mouse-
embryo-during

Les PGC sont spécifiés au même endroit chez l'embryon humain à la fin de la 2 ème semaine après la
fécondation (Chen et al., 2019).

Contrairement à beaucoup d'autres modèles, chez les Mammifères, les PGC ne se forment pas par
héritage de matériel cytoplasmique mais par induction. Les souris Bmp4-/- ne forment pas de cellules
germinales et l’expression ectopique de BMP4 dans un épiblaste compétent peut induire des cellules
germinales ectopiques. On en déduit que le destin des cellules germinales est induit dans l'épiblaste vers le
jour embryonnaire E6 par BMP4 produit dans l'ectoderme extra-embryonnaire (Lawson et al., 1999). En
réponse au BMP4, les cellules induites en PGC activent l’expression de Oct4 et de Sox2 qui codent des
facteurs de transcription impliqués dans la pluripotence et le profil de méthylation de l’ADN de ces cellules
change. Blimp1 (Prdm1) et Prdm14 sont des régulateurs transcriptionnels critiques pour le devenir des
PGC (Kurimoto et al., 2008, Ohinata et al., 2005, Vincent et al., 2005, Yamaji et al., 2008), de même que AP2γ
(codé par Tfap2C) qui agit en coordination avec d'autres facteurs de transcription, tels que PAX5 et SOX17.
La spécification des PGC nécessite l'activité de régulateurs de la chromatine qui induisent des changements
à l'échelle du génome dans l'expression des gènes. Par exemple, chez la souris, le répresseur
transcriptionnel Blimp1 (Prdm1) initie la spécification des PGC en bloquant l'expression d'un programme
mésodermique qui reste actif dans les cellules somatiques voisines sans Blimp1 (Ohinata et al., 2005). Le
génome devient globalement hypométhylé, une caractéristique qui rapproche les PGC des cellules
pluripotentes telles que les cellules de la masse cellulaire interne, les cellules ES et les cellules iPS.

Malgré le fait que les PGC des Mammifères sont spécifiés par des signaux inductifs et non pas par héritage
maternel comme dans beaucoup d'autres animaux, leur profil transcriptomique est assez similaire : par
exemple, 80% des transcrits sont similaires entre les cellules germinales humaines et celles du xénope
(Butler et al., 2018).

Les PGC migrent dans l'épithélium endodermique de l'intestin postérieur où 170 à 350 PGC se
trouvent au jour 9 du développement chez la souris, puis le long du mésentère dorsal vers les crêtes
génitales situées dans le toit du cœlome qui est le site du développement des gonades (Molyneaux et
al., 2001). Durant cette migration, les PGC sont entourées de cellules sécrétant SCF (pour Stem Cell Factor)
qui est indispensable pour leur survie et leur migration (Yan et al., 2000). Le récepteur de SCF est une
tyrosine-kinase transmembranaire, c-kit. Les PGC ont aussi besoin du ligand SDF-1 pour migrer
correctement et elles expriment son récepteur CXCR4 (Ara et al., 2003). Les PGC migrent aussi durant une
partie de leur trajectoire dans le mésentère dorsal le long de fibres nerveuses du système nerveux
autonome, et des échanges de signaux sont possibles entre les deux populations (Mollgard et al., 2010).

600
 *Figure 7-275. La signalisation SDF-1/CXCR4 est nécessaire pour la migration ordonnée des cellules germinales
primordiales chez le poisson-zèbre. La fonction de guidage des PGC par SDF-1/CXCR4, présente chez les Mammifères
est conservée chez les Vertébrés, comme on peut le constater ici chez le poisson-zèbre. Ses cellules germinales ont
pu être suivies chez le sauvage et le mutant cxcr4b-/- car les poissons portent un transgène où le gène codant Cherry
(une protéine fluorescente qui émet dans le rouge) est sous le contrôle d'un promoteur spécifique des cellules
germinales. Barre d'échelle : 100 μm. Source : https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abc5546

Il ne semble pas y avoir de signaux chémoattracteurs à distance en provenance de la destination des PGC,
c'est-à-dire les crêtes génitales, car dans des souris mutantes où les crêtes génitales sont absentes, les PGC
migrent quand même dans la bonne direction. Ce n'est alors que la toute dernière phase de migration (et de
prolifération) qui est affectée (Chen et al., 2013).

Il y a environ 5 000 PGC dans les embryons de souris de 11 à 12 jours et plus de 20 000 PGC au
moment où les crêtes génitales sont complètement colonisées aux jours 13-14. Chez l'humain, les
crêtes génitales sont colonisées au cours de la 5ème semaine après la fécondation. Ces PGC sont la
seule source de cellules germinales adultes. Ce n'est qu'une fois arrivées dans les crêtes génitales que
les PGC activent l'expression de Dazl (une protéine se liant aux ARN) et qu'ainsi leur devenir est totalement
restreint à la production de gamètes (des études récentes ont montré que les PGC en migration gardent des
potentialités différentes (Nicholls et al., 2019).

L'origine et la migration des PGC vers les crêtes génitales sont les mêmes chez les mâles et les
femelles. Ces cellules sont bipotentielles, c'est-à-dire qu'elles peuvent donner des ovocytes ou des
spermatozoïdes. La différenciation sexuelle des gonades, en testicules ou en ovaires, se produit dans
l'embryon de 12 à 13 jours. C'est cet environnement qui va orienter la différenciation des PGC en
ovocytes ou en spermatozoïdes (Nicholls et al., 2019).

Ovogenèse et folliculogenèse

L'embryon femelle de souris de 13 jours possède un ovaire différencié avec toutes les PGC converties en
ovogonies en division active. Dès le 12ème jour de l'embryogenèse, quelques ovogonies entrent dans la
première prophase méiotique. Au jour 14, à peu près la moitié des cellules germinales sont entrées en
méiose. Au jour 15, l'ovaire ne contient que des ovocytes à divers stades de la prophase I de méiose
(cela correspond à la 9ème semaine du développement chez l'Homme). C'est une très grande
différence avec le développement des cellules germinales mâles qui n'entrent en méiose qu'à la
puberté. Cette entrée précoce en méiose des ovogonies est sous le contrôle de la protéine Stra8 (Baltus et
al., 2006).

601
 **Figure 7-276. Stra8 est nécessaire pour l'entrée en
méiose des ovogonies dans les ovaires embryonnaires.
Coupes d'ovaires de souris sauvages (WT) ou mutantes
homozygotes perte-de-fonction pour Stra8 (Stra8-/-) à
différents stades. A E14,5, on observe des chromosomes
en phase leptotène de méiose I dans les souris WT et à
E16,5, des chromosomes en phase zygotène et pachytène
de méiose I. Rien de tel n'est visible en absence de Stra8.
Source : https://www.nature.com/articles/ng1919

L'expression de Stra8 est activée par l'acide rétinoïque secrété par le mésonéphros juste à côté. Dans les
testicules en développement, l'acide rétinoïque ne peut pas agir car les cellules y produisent Cyp26b1 qui
est une enzyme qui dégrade l'acide rétinoïque (Saba et al., 2014). Au moment de la puberté chez le mâle, les
cellules de Sertoli commencent à produire de l'acide rétinoïque et l'expression de Cyp26b1 baisse, ce qui
permet à Stra8 d'être activé et à des cellules germinales mâles de commencer leur méiose.

Il faut environ 4 jours aux ovocytes pour réaliser les recombinaisons homologues des crossing-overs, et au
jour 18, certains ovocytes ont atteint le stade diplotène de la première prophase méiotique. Au jour 5 après
la naissance, presque tous les ovocytes sont arrêtés au stade diplotène tardif où ils restent jusqu'à ce qu'ils
soient stimulés pour reprendre la méiose au moment de l'ovulation. On considère qu'à ce stade, il n'y a plus
de cellules souches germinales (Lei et Spradling, 2013).

Près de la moitié de la population d'ovocytes de souris est perdue au cours des 2 à 3 premières semaines
après la naissance ; une perte d'ovocytes encore plus importante se produit chez la femme qui passe
de 7 millions d'ovocytes à 6 mois de développement à 1 million autour de la naissance et à 400.000
au début de la puberté.

602
 *Figure 7-277. Évolution du nombre de cellules
germinales (ovogonies puis ovocytes) chez la femme au
cours de la vie.

Les ovocytes sont contenus dans des follicules primordiaux qui se structurent autour des ovocytes d'abord
par des couches simples de 4 à 6 cellules de type épithéliales aplatie. Puis les trois couches de cellules de
forme cubique de la granulosa se mettent en place au moment où les ovocytes ont terminé leur phase de
croissance. Les follicules primordiaux produits chez le fœtus sont très stables et ont une demi-vie d'environ
10 mois à l'âge adulte chez la souris et de plusieurs décennies chez la femme (Lei et Spradling, 2013).

Le maintien et la survie de ces follicules primordiaux sont importants pour la fertilité et certaines femmes
peuvent avoir une fertilité diminuée à cause d'une diminution de la réserve ovarienne en follicules. Les
mécanismes en sont encore peu connus mais une étude récente a montré une augmentation de l'expression
d'un microARN, miR-484 dans les cellules folliculaires des patientes atteintes de diminution de la réserve
ovarienne. Ce miR-484 a pour cible YAP1 un co-facteur de transcription qui stimule l'expression de
protéines importantes pour la prolifération et l'inhibition de l'apoptose dans les cellules folliculaires (Li et
al., 2022).

**Figure 7-278. Une dérégulation de l'expression de miR-484 aboutit à une diminution de la survie des cellules
folliculaires (ici de la granulosa) et à une diminution de la réserve ovarienne. Source :
https://www.ijbs.com/v18p1008.htm

603
 *Figure 7-279. Vue générale de l'ovogenèse et notamment des différents blocages de la méiose chez la femme. Le
passage de la prophase I à la métaphase II a lieu lors de l'ovulation. Source : https://openstax.org/books/anatomy-
and-physiology/pages/27-2-anatomy-and-physiology-of-the-female-reproductive-system

Les ovocytes sont bloqués en prophase I de méiose et entrent en quiescence. C'est un cas
exceptionnel car habituellement la quiescence concerne des cellules en G0 et ici, les cellules sont en
méiose. Cet état de quiescence peut persister des décennies chez la femme (Kim and Kurita, 2018).
PTEN, un inhibiteur de la PI3kinase (car il reconvertit PIP3 en PIP2) a été impliqué dans le maintien de cette
quiescence.
**Figure 7-280. La voie de signalisation PI3K et la
maturation des ovocytes de Mammifère. PI3Kinase
phosphoryle PIP2 pour produire PIP3 au niveau de la
partie intracellulaire de la membrane plasmique, tandis
que PTEN empêche la conversion de PIP2 en PIP3.
Quand PIP3 s'accumule, il stimule l'activité d'Akt, une
sérine/thréonine kinase qui phosphoryle le facteur de
transcription FOXO3 ce qui l'exclut du noyau, où il
activait des gènes inhibiteurs de la maturation
ovocytaire. Par conséquent, quand la PI3Kinase est
activée et PTEN inactif, la maturation ovocytaire se
déclenche. La petite GTPase Cdc42 peut activer la voie
de signalisation PI3K en diminuant l'expression de
PTEN et en activant directement PI3K. PI3K =
phosphoinositide 3-kinase; PIP2 = phosphatidylinositol-
4,5-bisphosphate; PIP3 = phosphatidylinositol-3,4,5-
triphosphate. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.575706/full

Également, l'inactivation de mTORC1, une sérine/thréonine kinase par le complexe TSC1/TSC2 assure le
maintien de l'arrêt de la méiose. Chez les souris Tsc1-/-, tous les follicules primordiaux sont activés à la
puberté aboutissant à une déplétion prématurée du stock conservé depuis la naissance (Adhikari et al.,
2010).

L'activation physiologique des follicules primordiaux a lieu à partir de la puberté et concerne une cohorte
d'un nombre variable de follicules selon les espèces. Dans les ovocytes correspondants, la voie PI3K/Akt
n'est plus freinée par PTEN et Akt phosphoryle FOXO3, le principal facteur de transcription responsable de
l'arrêt de la maturation. FOXO3 ne peut alors plus entrer dans le noyau (John et al., 2008). Dans des modèles
murins d'endométriose, la voie PI3K/Akt/FOXO3 est trop activée et aboutit à une activation excessive des
follicules primordiaux (Takeuchi et al. 2019).

604
 *Figure 7-281. Coupe d'ovaire de lapine. La zone des
follicules primordiaux est délimitée par les points noirs.
Les autres follicules plus internes sont à différents stades
de développement. Source :
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/2-organos-
a/imagenes-grandes/reproductor-foliculos.php#n

Lorsque les follicules sont activés, les cellules folliculaires prennent d'abord un aspect cuboïdal (stade
follicule primaire) et leur nombre augmente jusqu'à > 50. 000 dans les follicules de De Graaf (provient de
Regnier De Graaf, un physiologiste néerlandais du XVIIème siècle qui a découvert ces follicules). Chez la
femme, le diamètre du follicule de De Graaf atteint 22 mm (donc bien visible à l'oeil nu) (voir Figures 3-6 et
3-7). Le follicule en développement est un syncytium de cellules reliées par des canaux cytoplasmiques
intercellulaires appelés jonctions communicantes ou jonction gap et cela inclut également l'ovocyte et les
cellules qui l'entourent (Kidder et Mahwi, 2002; Wassarman, 2002).
*Figure 7-282. Folliculogenèse anormale dans les
ovaires sans connexin43 (Cx43) qui forme les jonctions
gap. En l'absence de Cx43 (en bas), le développement
folliculaire s'arrête à un stade préantral précoce
reflétant l'échec de la population des cellules de la
granulosa à se développer. Les ovaires sauvages
contiennent des follicules antraux d'apparence normale.
a : antre ; cg : couche de cumulus granulosa ; mg, couche
de granulosa murale ; o : ovocyte. Source :
https://rep.bioscientifica.com/view/journals/rep/123/5/613.xml

La communication entre l'ovocyte et les cellules folliculaires est bidirectionnelle ; les cellules folliculaires
régulent la croissance des ovocytes et les ovocytes régulent le développement folliculaire. Les follicules
présentent un antre naissant lorsqu'ils ont plusieurs couches cellulaires d'épaisseur et, à mesure que l'antre
se dilate, les ovocytes prennent une position acentrique entourés de deux ou plusieurs couches de cellules
du cumulus oophorus. Les cellules du cumulus oophorus les plus proches de la zone pellucide en
développement de l'ovocyte forment la corona radiata (et seront expulsées de l'ovaire avec l'ovocyte lors
de l'ovulation).

À chaque cycle chez la femme, une cohorte de 5 à 10 follicules tertiaires de 5 mm de diamètre sont
recrutés (ils ont commencé leur maturation 3 mois avant). Un seul appelé follicule dominant va
complètement se développer (jusqu'à atteindre 22 mm de diamètre) et participer à l'ovulation. Il y

605
a en effet une compétition entre les follicules pour les hormones qui stimulent leur développement.
Les autres follicules dégénèrent.

*Figure 7-283. Cycle hormonal féminin. La FSH et la LH sont produites dans l'adénohypophyse et sont secrétées dans
le sang où elles circulent jusqu'aux ovaires. Ce sont des hormones peptidiques (deux sous-unités chacune dont une
sous-unité alpha commune). L'œstradiol et la progestérone sont produites par les cellules folliculaires (ou les cellules
du corps jaune qui sont issues des cellules folliculaires après l'ovulation) et sont des hormones stéroïdes dérivées
du cholestérol. Ces hormones exercent un rétrocontrôle négatif sur la production de LH et de FSH (sauf dans le cas
des œstrogènes avant l'ovulation où le rétrocontrôle devient positif).

L'ovulation est déclenchée par un pic de concentration de LH produite par l'adénohypophyse : elle
est due à une augmentation de la pression du liquide folliculaire (antral) concomitamment avec la
contraction des muscles lisses de la thèque externe qui entourent le follicule, à la lyse de la paroi du follicule
par du plasminogène qui active des collagénases, et au dépôt de glycosaminoglycanes (GAG) entre les
cellules de la corona radiata qui vont être expulsés avec l'ovocyte et les autres cellules folliculaires (qui
restent dans l'ovaire et forment le corps jaune après l'ovulation). Des bouleversements importants ont
lieu dans l'ovocyte lui-même : il y a une reprise de la méiose qui était bloquée en prophase I
(quelques fois depuis des décennies chez la femme). La méiose avance jusqu'en métaphase II où il y
a un nouveau blocage.

Chez les Amphibiens, où la reprise de la méiose a été très étudiée comme un modèle de contrôle du cycle
cellulaire c'est la progestérone qui a un rôle prépondérant :

606
 ***Figure 7-284. Modèle de libération du blocage de
prophase I dans les ovocytes de Xénope. Le récepteur
GPR185 couplé au Gαs constitutivement actif maintient
une activité élevée de l'AMPc et de la PKA, assurant
l'arrêt de la prophase (voie rouge à droite). Le déblocage
de la méiose (voie verte à gauche) est déclenché par les
hormones stéroïdes, principalement la progestérone,
avec la contribution potentielle de IGF-1 et son récepteur
(IGF-1R). La progestérone interagit avec son récepteur
nucléaire canonique (iPR) mais aussi avec un récepteur
lié à la membrane plasmique (mPR). En se liant à la
progestérone, ces récepteurs inhibent la voie GPR185
et/ou inhibent indépendamment l'adénylate cyclase en
recrutant Gαi et en inhibant GαS. Ils pourraient aussi agir
indépendamment de la voie de blocage. Ces cascades
convergent vers la synthèse de nouvelles protéines
nécessaires à l'activation du MPF. Source :
https://www.mdpi.com/2073-4409/9/5/1150

**Figure 7-285. Reprise de la méiose ovocytaire chez le xénope. Les ovocytes arrêtés en G2 (ou en prophase de
méiose) contiennent du pré-MPF, c'est-à-dire des complexes Cdk1-cycline B inactifs dans lesquels Cdk1 est inhibé
par la phosphorylation de T14 et Y15. La progestérone initie une voie de signalisation qui conduit à la
déphosphorylation de T14 et de Y15 de Cdk1. Le MPF favorise la rupture de l'enveloppe nucléaire (GVBD pour
Germinal Vesicle Breaking, identifié par une tache blanche au pôle de l'hémisphère animal) et la formation du fuseau
en métaphase I. Après expulsion du premier globule polaire, le fuseau de la métaphase II s'organise et l'ovocyte
s'arrête à ce stade, jusqu'à la fécondation. En haut : deux photos d'ovocytes de Xenopus, arrêt G2 (à gauche) et GVBD
(à droite). Source : https://celldiv.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13008-020-00065-2

Les cellules germinales où le contrôle du cycle cellulaire est altéré peuvent former des cellules
tumorales qui donnent des tératomes : des tumeurs où des dérivés cellulaires variés se côtoient
(contenant des poils, des dents, des bouts de cartilage, d'intestins, des cellules musculaires, des
mélanocytes...). Cette caractéristique témoigne de la nature pluripotente (voire totipotente) des
cellules germinales altérées. Elles sont plus fréquentes dans les ovaires que dans les testicules, et sont
le plus souvent bénignes.

607
Spermatogenèse

Une fertilité réussie nécessite une grande quantité de spermatozoïdes normaux. Afin de répondre à la
norme de fertilité minimale, la concentration en spermatozoïdes doit être supérieure à 15 millions par ml,
dont au moins 40 % doivent être de motilité normale et au moins 4 % avec une morphologie normale selon
les critères pour l'examen en laboratoire du sperme humain paramètres de l'Organisation Mondiale pour la
Santé (OMS, 2010).

*Figure 7-286. Valeurs de référence du spermogramme et pathologies associées aux anomalies. Source : Thèse de
Chloé Baron (2021), Université de Montpellier

La génération de spermatozoïdes dépend d'un processus de différenciation cellulaire dynamique

dans les tubules séminifères du testicule, appelé spermatogenèse (Griswold, 2016). Ce processus
commence par l'auto-renouvellement et la différenciation des spermatogonies. L'auto-
renouvellement et la différenciation de ces cellules doivent pouvoir s'équilibrer pour maintenir les
populations de cellules souches tout en formant des spermatozoïdes. Les caractéristiques de cellules
souches des spermatogonies sont maintenues par le répresseur transcriptionnel Plzf (Costoya et al., 2014)
et par la protéine liant les ARN Nanos2. La perte localisée de Nanos2 aboutit à une perte du pool de
spermatogonies qui se différencient sur place de manière ectopique (Sada et al., 2009). Nanos2 agit
notamment en réprimant la traduction de protéines qui déclenchent habituellement la méiose. Il se localise
dans les corps P, un centre de dégradation des ARNm où il est associé avec des enzymes qui éliminent la
queue polyA des ARNm, ce qui les amène à être dégradés (Saga, 2010).

Les cellules de Sertoli sont les cellules épithéliales de soutien des tubes séminifères, dont la
principale fonction est d'assister et de nourrir les cellules germinales. Ce sont les premières cellules
mâles spécifiques à se différencier dans la gonade fœtale et, conjointement avec les cellules germinales, elles
subissent une morphogenèse tubulaire pour former des cordons testiculaires (Svingen et Coopman, 2013),
qui sont les unités structurelles et fonctionnelles du testicule. Ces cordons donnent naissance ensuite aux
tubules séminifères adultes. Au fur et à mesure que le testicule se développe, les cellules de Sertoli subissent
des changements importants dans leur comportement cellulaire. Du stade fœtal jusqu'à environ 10 à 14
jours après la naissance chez les rongeurs, les cellules de Sertoli se divisent activement, augmentant le
diamètre des tubes séminifères et le nombre de niches potentielles des spermatogonies dans les testicules
(Oatley et al., 2011). À la fin de cette période, les cellules de Sertoli quittent le cycle cellulaire et restent au
repos tout au long des stades juvéniles et adultes. GATA1 est initialement exprimé dans les cellules de Sertoli
postnatales immatures, puis à la maturation, son expression est augmentée uniquement dans un sous-
ensemble de tubules séminifères d'une manière dépendante des stades spécifiques des cellules germinales
dans le tubule (Yomogida et al., 1994). Le récepteur aux androgènes (AR), c'est à dire le récepteur de la

608
testostérone (produite par les cellules de Leydig), est transféré du cytoplasme des cellules de Sertoli au
noyau lors de la maturation (Sharpe et al., 2003).
*Figure 7-287a. Coupe de testicule de chat.

*Figure 7-287b. Coupe de tube séminifère de rat. Photo : Patrick Pla, à partir de la collection de lames histologiques
de la Préparation à l'Agrégation SV-STU, Université Paris-Saclay

*Figure 7-287c. Coupe de la paroi d'un tube séminifère.

De leur côté, les spermatogonies prolifèrent et s'auto-renouvellent pour maintenir leur population, tandis
qu'un sous-ensemble de ces cellules se transforment en progéniteurs spermatogoniaux indifférenciés
amplificateurs transitoires (spermatogonies indifférenciées de type A). Ces progéniteurs prolifèrent pour
former des chaînes spermatogonales, puis procèdent à un programme de différenciation lancé en réponse
609
à l'acide rétinoïque (RA). Les spermatogonies de type B qui en résultent initient ensuite la méiose et passent
par plusieurs stades "spermatocytes". Après la fin de la méiose, les stades spermatide ronds et spermatides
allongés se succèdent avant de finalement devenir des spermatozoïdes différenciés (Griswold, 2016; Oatley
et Brinster, 2012). Au cours de toutes ces étapes, les cellules de Sertoli nourrissent les cellules germinales
au fur et à mesure qu'elles prolifèrent et se différencient pour donner naissance aux spermatozoïdes.

*Figure 7-288. Spermatogenèse.

Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2019.00388/full

Au cours de la spermatogenèse adulte à l'état d'équilibre, la polarisation des cellules de Sertoli est
essentielle pour soutenir les différentes étapes de la spermatogénèse et pour compartimenter ses fonctions,
notamment le maintien des cellules souches/progénitrices germinales dans le compartiment basal du
tubule séminifère tout en favorisant simultanément la spermiogenèse dans le compartiment luminal apical
(Oatley et Brinster, 2012).

610
 *Figure 7-289. Les niveaux d'hormones reproductives masculines de la période fœtale à la période adulte. Au début
du stade fœtal, le déclenchement de la sécrétion d'hormones testiculaires est indépendant de l'hormone lutéinisante
(LH) et de l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Puis à partir du deuxième et du troisième trimestre, la LH et la FSH
sont les principaux régulateurs de la production hormonale des cellules de Sertoli et de Leydig. Pendant environ 6
mois après la naissance, les taux de LH, FSH et d'hormones testiculaires restent élevés. Ensuite, pendant la petite
enfance et l'enfance, les taux de gonadotrophines, de testostérone (T) et du facteur 3 analogue à l'insuline (INSL3)
diminuent, tandis que ceux de l'hormone anti-müllérienne (AMH) et de l'inhibine B restent élevés. Pendant la
puberté, la FSH, la LH, la testostérone et l'INSL3 augmentent à nouveau pour atteindre les niveaux adultes. L'AMH
est inhibée par la testostérone, et l'inhibine B est stimulée par la FSH. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2020.00211/full

*Figure 7-290. Contrôle de la spermatogenèse

par l'axe hypothalamo-hypophysaire et
rétrocontrôle négatif. L'hypothalamus et
l'hypophyse régulent la production de
testostérone dans les cellules de Leydig et
l'activité des cellules de Sertoli. La GnRH active
l'hypophyse antérieure pour produire de la LH
et de la FSH, qui stimulent à leur tour
respectivement les cellules de Leydig et les
cellules de Sertoli. Le système est une boucle de
rétroaction négative car les produits finaux de la
voie, la testostérone et l'inhibine, interagissent
avec l'activité de la GnRH pour inhiber leur
propre production. Source :
https://openstax.org/books/anatomy-and-
physiology/pages/27-1-anatomy-and-
physiology-of-the-male-reproductive-system

La spermatogenèse est bien entendu sous le contrôle d'hormones. Le récepteur de la FSH (une
hormone produit dans l'adénohypophyse sous le contrôle de l'hypothalamus) est principalement
exprimé sur les cellules de Sertoli. La FSH contrôle la maturation, la prolifération et la fonction des
cellules de Sertoli (Abel et al., 2008). Des mutations de la FSH ou de son récepteur ont été associées à une
diminution du nombre de cellules de Sertoli et du nombre de spermatozoïdes (Tapalainen et al., 1997). Sous
le contrôle de la FSH, les cellules de Sertoli sécrètent du GDNF qui est un facteur essentiel de maintien des
spermatogonies (Kubota et al., 2004). Le récepteur au GDNF, Gfrα1 est exprimé dans les spermatogonies
(Uchida et al., 2016). Egalement, la fonction de la petite GTPase Cdc42 est nécessaire dans les cellules de
Sertoli pour le maintien des caractères de cellules souches des spermatogonies (Heinrich et al., 2021).
Cdc42 agit pour établir et maintenir la polarité des cellules de Sertoli et cette polarité est essentielle pour
envoyer les bons signaux aux spermatogonies d'un côté (basal) et aux spermatides en cours de
différenciation de l'autre côté (apical). Toute perte de polarité provoque un envoi de signaux
incorrectement adressé qui aboutit à la perte des cellules souches.
**Figure 7-291. La déplétion de Cdc42 spécifiquement
dans les cellules de Sertoli aboutit à la disparition
complète des cellules germinales dans le testicule de
souris adulte. Images d'immunofluorescence des
testicules P60 adultes témoins Dhh-Cre;Cdc42flox/+ (F)
et mutés Dhh-Cre;Cdc42flox/flox (G), montrant l'absence
de cellules germinales TRA98+ dans les testicules Dhh-
Cre;Cdc42flox/flox. (F') est une image à plus fort
grossissement des régions encadrées dans (F). Les
lignes pointillées indiquent les limites des tubules.
Barres d'échelle = 100 µm. Source :
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-
1247(21)01355-3

611
Le récepteur au LH est exprimé sur les cellules de Leydig et la fixation du ligand a pour effet de
stimuler la production de testostérone (Narayan, 2015).
**Figure 7-292. L'expression d'un récepteur constitutif
à la LH provoque une hyperplasie des cellules de
Leydig. Coupes de testicule de souris de 12 semaines
exprimant une forme mutée du récepteur à la LH,
D582G, qui est constitutivement actif et qui se retrouve
chez des garçons qui ont une puberté précoce. On
observe une hyperplasie des cellules de Leydig (visibles
en rose entre les tubes séminifères) qui suit une
maturation plus précoce de ces cellules. D'autres
analyses montrent des taux de testostérone très élevés
dans le sang. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2015.00152/full

De manière plus surprenante, une hormone produite par les ostéoblastes (l'ostéocalcine, un peptide de 49
acides aminés) est aussi nécessaire pour une bonne production de testostérone par les cellules de Leydig
(Oury et al., 2011). L'ostéocalcine se lie au récepteur GPRC6a et augmente la concentration d'AMPc dans les
cellules de Leydig, ce qui stimule le facteur de transcription CREB qui augmente l'expression de plusieurs
enzymes impliquées dans la synthèse de testostérone.

Les fonctions de la testostérone sont médiées par le récepteur aux androgènes (AR). Le récepteur aux
androgènes est exprimé dans les cellules de Sertoli, les cellules de Leydig et le muscle lisse des artérioles
des testicules, mais pas dans les cellules germinales (Smith et Walker, 2014). La testostérone est cruciale
pour le maintien du nombre de spermatogonies, l'intégrité de la barrière hémato-testiculaire, l'achèvement
de la méiose, la maturation des spermatides et l'achèvement de la spermiation (O'Hara et Smith, 2015).
*Figure 7-293. Fonctionnement du récepteur aux
hormones androgènes (AR)/testostérone. La
testostérone (T) pénètre dans la cellule (son
hydrophobie permet la traversée de la membrane
plasmique). La 5α-réductase la convertit en
dihydrotestostérone (DHT). Lors de la liaison avec son
ligand, le récepteur aux androgènes (AR) subit un
changement de conformation, n'interagit plus avec des
protéines de choc thermique (hsp70) et est phosphorylé.
L'AR peut alors pénétrer dans le noyau où se produisent
la dimérisation, la liaison à l'ADN sur une séquence ARE
et le recrutement de coactivateurs transcriptionnels. Les
gènes cibles sont transcrits (ARNm) et traduits en
protéines. Source :
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_androgen_receptor_and_androgen_binding.svg

Contrairement à ce que l'on pourrait penser, la spermatogenèse a également besoin d'œstrogènes.

L'enzyme aromatase qui convertit les androgènes en œstrogènes est exprimée dans les testicules et les
œstrogènes sont essentiels pour de nombreuses fonctions, notamment la prolifération des spermatogonies,
et la différenciation des spermatozoïdes via les récepteurs traditionnels ESR mais aussi via un récepteur
membranaire couplé à une protéine G appelé GPER (Chimento et al., 2020).

L'activation de la méiose dans la lignée germinale mâle est sous le contrôle du ligand SCF (Stem Cell Factor)
et de son récepteur tyrosine-kinase c-kit sur les spermatocytes primaires. Une entrée retardée en méiose
est observée chez les souris haplodéficientes en c-kit et des études transcriptomiques ont montré que des
spermatogonies isolées de testicules après une mise en présence de SCF activent l'expression de nombreux
gènes impliqués dans les phases précoces de la méiose, notamment Dmc1 qui code une protéine impliquée
dans les crossing-overs (Cardoso et al., 2014). Le niveau d'expression de Stra8 (qui déclenche aussi la
méiose dans les ovocytes) augmente fortement.

Lors de la première division cellulaire méiotique, le spermatocyte primaire produit deux

spermatocytes secondaires, qui entrent ensuite dans la deuxième division méiotique et se divisent

612
en quatre spermatides rondes qui contiennent chacun soit un chromosome X ou un chromosome Y.
Enfin, les spermatides rondes haploïdes se différencient en spermatides allongés et finalement en
spermatozoïdes par le processus de spermiogenèse (Hendriksen, 1999). Pendant tout ce processus,
les cellules migrent de la membrane basale vers le centre du tube séminifère et sont libérées dans
la lumière. La cytokinèse n'est pas complète pendant les divisions mitotiques et méiotiques de ces
processus (Hendriksen, 1999). En effet, maillage d'actomyosine du corps central est stabilisé pour bloquer
l'abscission et maintenir l'anneau contractile de sorte que des canaux annulaires se forment entre les
cellules connectées et les cellules sont reliées par des ponts intercellulaires qui persistent jusqu'à la fin de
la spermatogenèse (Braun et al., 1989). Ce pont intercellulaire permet une libre communication
cytoplasmique entre les cellules de génotypes différents. Étant donné que les ions et les molécules (dont
des protéines) traversent facilement ces ponts intercellulaires, les cellules mûrissent de manière synchrone
(Braun et al., 1989; Jasin et Zalamea, 1992).

La spermiogenèse représente une étape tardive de la spermatogenèse, au cours de laquelle les

spermatides rondes post-méiotiques se différencient en spermatozoïdes matures par condensation
de l'ADN et formation de la tête et de la queue des spermatozoïdes (O'Donnell, 2014). Une structure
cytosquelettique transitoire appelée manchette apparaît parallèlement à l’élongation du noyau des
spermatides. Elle est composée de réseaux parallèles de microtubules alignés avec le long axe du noyau et
d'un anneau périnucléaire en forme de ceinture constitué d'actine. À mesure que les spermatides se
différencient, la structure microtubulaire et l'anneau périnucléaire se déplacent vers le pôle postérieur du
noyau des spermatides, "sculptant" le noyau en une morphologie en fuseau.

Les spermatozoïdes sont ensuite libérés dans la lumière des tubules séminifères, dans un processus appelé
spermiation, qui implique le remodelage et la réduction du cytoplasme (França et al., 2016).

Pour la structure d’un spermatozoïde : voir la Figure 3-18.

Durant la spermiogenèse, l'appareil de Golgi forme l'acrosome à l'avant du noyau. Le flagelle

commence à croître à partir d'un centriole. Le noyau prend une forme aplatie et effilée et la
chromatine se condense. Elle échange 90% de ses histones contre des protamines. Riches en arginine et
en cystéine, les protamines sont capables d’établir entre elles des ponts disulfures et contribuent ainsi à une
forte condensation de la chromatine. La transcription s'éteint complètement en conséquence. Les CTCF qui
bornent les domaines TAD (les domaines topologiques d'association) restent présents et organisent la
chromatine de manière similaire à celle des cellules souches pluripotentes (Balhorn, 2007; Hammoud et al.,
2009; Jung et al., 2017).
**Figure 7-294. Protamines accrochées à l'ADN. Les
molécules de protamine se lient au grand sillon de l'ADN,
rendent neutre le squelette phosphodiester (alors qu'il
est habituellement chargé négativement) et provoquent
l'enroulement des molécules d'ADN en structures
toroïdales. Le modèle montre comment deux molécules
de protamine (atomes bleus) s'enroulent autour de
l'hélice d'ADN (atomes blancs). Source :
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2007-8-9-227

Certaines histones restent néanmoins en place à des positions "stratégiques" avec des modifications
épigénétiques (méthylations, acétylations...) qui sont cruciales pour la régulation de la spermatogenèse et
le début du développement embryonnaire (Luense et al., 2016 ; Lambrot et al., 2021).

Une partie du cytoplasme est éjecté sous la forme de corps résiduels qui sont phagocytés et éliminés
par les cellules de Sertoli.

613
Toutes ces modifications permettent d'obtenir une cellule la plus "légère" et la plus mobile possible
et également d'avoir un paysage chromatinien qui ressemble déjà à celui d'un embryon en
développement précoce.

Le système ubiquitine protéasome (UPS) joue un rôle important dans la spermatogenèse (Richburg et al.,
2014). En effet, l'ubiquitination et la dégradation des protéines sont nécessaires lors de la différenciation
finale des spermatozoïdes qui doivent se débarrasser de toutes les protéines qui avaient été nécessaires à
leur développement mais qui ne sont plus utiles. La voie UPS dépend de manière critique des ligases
d'ubiquitine E3, qui fournissent une spécificité de substrat en sélectionnant des protéines cibles pour
l'ubiquitination (Metzger et al., 2014). RLIM, une E3 ubiquitine ligase joue un rôle important. Sans
l'élimination des protéines qu'elle permet, une partie du cytoplasme ne peut être éliminée et les
spermatozoïdes résultants sont peu mobiles (voir Figure 7-295).

Le passage des spermatogonies à des spermatozoïdes matures prend 65 jours chez l'Homme (34,5
jours chez la souris). Les spermatozoïdes poursuivent ensuite leur maturation dans l'épididyme où ils
passent quelques jours chez l'Homme (2 semaines chez la souris) (Cornwall, 2009). Notamment, les
spermatozoïdes acquièrent des protéines nécessaires à leur motilité et aussi des ARN en fusionnant avec
des vésicules extracellulaires appelées épididymosomes qui sont libérées de l'épithélium épididymaire
(Sullivan, 2015 ; Sharma et al., 2018).

***Figure 7-295. RLIM, une E3 ubiquitine ligase est exprimée à des stades précis de la spermiogenèse (et dans les cellules de
Sertoli). (A) Des coupes tissulaires de testicules de souris ont été traitées en immunohistochimie avec un anticorps anti-RLIM. Les
zones encadrées sont affichées avec un grossissement plus élevé. Coloration DAB (substrat d'immunohistochimie) des coupes de
testicules générées à partir de mutants Rlim cKO/YSox2-Cre et de contrôles fl/Y, des mâles de même portée mais où un allèle de
Rlim est toujours fonctionnel. Les flèches rouges (boîte 1) et les flèches jaunes (boîte 2) pointent respectivement vers les cellules
germinales plutôt proches de la lumière du tube séminifère (donc des spermatides) et les cellules situées à la périphérie des tubules
séminifères qui présentent une coloration RLIM élevée. Notez en A à gauche que les spermatides ne sont pas présents dans tous les
tubes séminifères : seules les cohortes qui sont presque arrivés au bout de la spermatogenèse sont visibles. Panneaux de droite :
cKO/Y mâle. Barres d'échelle = 150 micromètres. (B) Immunofluorescence sur testicule fl/Y avec des anticorps contre RLIM (vert)
et PNA (rouge) pour déterminer les étapes de différenciation des cellules germinales dans les tubules séminifères car PNA marque
l'acrosome. Barre d'échelle = 60 micromètres. (C) Immunofluorescence sur testicule fl/Y avec des anticorps contre RLIM (vert) et
GATA1 (rouge), un marqueur des cellules de Sertoli. Une analyse plus poussée de la morphologie des spermatozoïdes (non montrée
ici) indique que sans RLIM, les spermatozoïdes sont mal formés car ils ne perdent pas assez de cytoplasme. Les cibles de RLIM ne
sont pas encore connues. Barre d'échelle = 25 µm. Source : https://elifesciences.org/articles/63556

614
 **Figure 7-296. Transfert de différents types d'ARN
dans les spermatozoïdes par des épididymosomes. Des
spermatozoïdes issus de testicules de souris mais qui
ne sont pas passés par l'épididyme sont mis en
présence d'épididymosomes produits par la tête
(caput) de l'épididyme (ou région proximale) pendant
2 heures. Les ARN sont extraits avant et après cette
incubation et analysés. On constate une augmentation
de la présence d'ARNm, de tRF (ARN qui sont des
fragments d'ARNt) et de microARN. Cela correspond à
la composition en ARN des épididymosomes. En
revanche, ces derniers ne contiennent pas de piARN
(ARN interagissant avec Piwi) et il est logique que leur
proportion diminue dans les spermatozoïdes incubés.
Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580718305409

Le nombre de spermatozoïdes par éjaculat a diminué de moitié dans les pays occidentaux au cours
des 40 dernières années. Les facteurs environnementaux ont été mis en cause. Les produits
chimiques peuvent altérer les gamètes à différents stades de développement, c'est-à-dire à la
spermatogenèse, lors de la maturation épididymaire et lors de la composition du sperme. Les
produits chimiques peuvent être d'origine naturelle, comme les mycotoxines et les métaux, ou
d'origine humaine, comme les produits pharmaceutiques et les pesticides. De nombreux produits
chimiques fabriqués par l'homme sont considérés comme des perturbateurs endocriniens tels
que les phtalates, les polychlorobiphényles (PCB) et le bisphénol A (BPA). Les effets indirects
comprennent une stéroïdogenèse altérée peuvent modifier les niveaux d'hormones, notamment
de testostérone. Par ailleurs, les effets sur la reproduction peuvent être plus indirects et n'être
révélés qu'à la génération suivante : l'exposition paternelle à certains produits chimiques
environnementaux tels que le BPA et le DDT produit des effets épigénétiques sur l'embryon en
développement (Komski-Elbaz et al., 2021).

EN DIRECT DES LABOS :

Décrypter le rôle de l'épigénétique dans la fertilité masculine (Institut Curie, Paris)

Hématopoïèse et développement des cellules du système immunitaire

615
 *Figure 7-297. Composition du sang. Source
: https://microbiologynotes.org/

L'hématopoïèse est la formation de cellules sanguines. Les premières étapes sont communes aux
globules rouges et aux cellules du système immunitaire mais pour les étapes tardives nous nous
intéresserons essentiellement à ces dernières.

Le système immunitaire permet la protection de l'individu contre les éléments étrangers et

notamment les pathogènes que ce soit des petits virus, des bactéries ou des grands vers parasites.

Nous nous restreindrons au système immunitaire des Mammifères.

Bien que présenté habituellement dans des livres spécialisés en immunologie, le développement des
diverses cellules du système immunitaire n'en reste pas moins un problème de développement : les cellules
acquièrent une identité, prolifèrent, migrent et se différencient.

L'hématopoïèse embryonnaire
L'hématopoïèse embryonnaire chez les Mammifères se déroule à différents endroits et se produit en
trois étapes successives ("vagues"). Les deux premières vagues ont lieu dans le sac vitellin extra-
embryonnaire (à partir de 16 jours après la fécondation chez l'Homme et E7,5 chez la souris), avec la
formation de populations hématopoïétiques transitionnelles (hématopoïèse mégaloblastique). Certaines
cellules apparentées aux macrophages formées lors de cette vague sont maintenues chez l'adulte dans des
tissus qu'elles colonisent lors du développement embryonnaire (cellules microgliales dans le système
nerveux central, cellules de Langerhans dans la peau et cellules de Kupffer dans le foie) (Mirshekar et al.,
2014).

La troisième vague apparaît à l'intérieur de l'embryon dans la région de l'aorte-gonade-mésonéphros

(AGM) (à partir du 21ème jour post-fécondation chez l'Homme et E10,5 chez la souris). Elle est à l'origine de
l'hématopoïèse adulte (hématopoïèse normoblastique), entraînant la formation de cellules souches
hématopoïétiques (HSC) qui fournissent à l'organisme une production continue de cellules sanguines.

616
 *Figure 7-298. Succession de modalités différentes de production de cellules hématopoïétiques au cours du
développement embryonnaire. Source : https://www.mdpi.com/1422-0067/22/17/9231/htm

Lors de la première vague d'hématopoïèse, trois types de cellules sanguines sont produites : les
érythrocytes primitifs exprimant des globines embryonnaires, les mégacaryocytes et les
macrophages.

Dans les deuxième et troisième vagues embryonnaires, des cellules multipotentes définitives sont
formées : des progéniteurs érythromyéloïdes (EMP) dans les îlots sanguins du sac vitellin et des
cellules souches hématopoïétiques (HSC) dans l'aorte dorsale. Dans ces vagues, un type d'endothélium
hautement spécialisé appelé endothélium hémogénique se forme. Les précurseurs hématopoïétiques sont
alors générés par une transition endothéliale à hématopoïétique.

*Figure 7-299. Hématopoïèse embryonnaire dans l'aorte dorsale au niveau de la région AGM (Aorte-Gonades-
Mésonéphros). À E10.5, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sont générées à partir de l'endothélium
hémogénique dans l'aorte dorsale, qui est situé dans l'AGM (montré en vue agrandie), entre le tissu mésenchymateux
(M) qui donne naissance aux gonades (G) et au mésonéphros (Me). L'image agrandie (à droite) montre une coupe
transversale de l'aorte dorsale, dans laquelle les cellules stromales et les catécholamines, libérées à partir du système
nerveux sympathique, contribuent à la niche des HSC embryonnaires. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/2/dev139691/48796/The-hematopoietic-stem-cell-niche-from-
embryo-to

Dans l'aorte dorsale, la niche où sont produites les HSC est générée sous le contrôle des signaux BMP
produits par le mésenchyme sous-aortique. Une population de cellules endothéliales de l'aorte dorsale
dérivant des somites (endotome) et exprimant le gène Meox1 produit également des signaux nécessaires à
la genèse de cette niche (Nguyen et al., 2014). La région hématopoïétique est néanmoins restreinte à la
moitié ventrale de l'aorte dorsale par la présence de Noggin (un inhibiteur de BMP) qui est produit par les

617
somites en position dorsale par rapport à l'aorte. Les catécholamines (probablement la noradrénaline)
produites par les neurones sympathiques qui se trouvent à proximité sont également importantes pour la
formation et le maintien de la niche des HSC (Fitch et al., 2012).

La voie NOTCH intervient ensuite : la signalisation DLL4/NOTCH1 active le programme endothélial, tandis
que la signalisation JAG1/NOTCH1 le bloque pour déclencher la spécification hémogénique.

Les cellules endothéliales du sac vitellin et de l'aorte dorsale expriment les gènes Tek ou Ly6a. La formation
à la fois d'EMP dans le sac vitellin et de HSC dans l'aorte dorsale nécessite la participation du facteur de
transcription Runx1 et de son partenaire, CBFb. De plus, l'expression du facteur de leucémie hépatique
(HLF) marque spécifiquement le développement des HSC dans l'embryon et n'est pas exprimé dans les EMP.
HLF reste un marqueur important des HSC par la suite, y compris chez l'adulte (Lehnertz et al., 2021).

Parmi les nombreux facteurs de transcription impliqués dans le système hématopoïétique, TAL1/SCL est
un régulateur essentiel. Cette protéine hélice-boucle-hélice basique est non seulement au sommet de la
hiérarchie des facteurs de transcription impliqués dans la spécification hématopoïétique, mais est
également essentielle pour la fonction des cellules souches hématopoïétiques adultes et pour la maturation
terminale des lignées individuelles de différenciation hématopoïétique. Les embryons avec knock-out SCL
meurent au 9,5ème jour de développement en raison de l'absence d'érythropoïèse primitive et de
myélopoïèse dans le sac vitellin (Robb et al., 1995). L'expression d'un autre facteur de transcription, Runx1,
joue un rôle important dans l'embryogenèse, en particulier au moment de la formation des premières
cellules sanguines, son expression précédant légèrement leur apparition (Nottingham et al., 2007).

L'entrée dans la circulation des HSC leur permet de migrer vers les futurs sites hématopoïétiques (Horton
et al., 2021). Après une brève période d'expansion des HSC dans le placenta (Gekas et al., 2005), le foie
fœtal devient le site principal de l'hématopoïèse définitive jusqu'à ce que les HSC migrent vers la
rate (Christensen et al., 2004) et la moelle osseuse juste avant la naissance. L'hématopoïèse splénique
reste active jusqu'à environ 2 semaines après la naissance. Puis ensuite, la moelle osseuse est le siège
primaire des HSC et de l'hématopoïèse (Rowe et al., 2016).
*Figure 7-300. Succession de la localisation de
l'hématopoïèse au cours du développement de la souris.
Il faudrait ajouter aussi le placenta entre E12,5 et E13,5.
Yolk sac = vésicule vitelline; AGM = aorte près de la
gonade et du méso néphros; liver = foie; spleen = rate;
marrow = moelle osseuse. Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.0020075

618
L'hématopoïèse post-natale

*Figure 7-301. Schéma général de l'hématopoïèse dans la moelle osseuse.

Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2019.00204/full

Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) soutiennent la production de sang tout au long de la
vie et sont les unités fonctionnelles lors de la greffe de moelle osseuse. L'énorme quantité de cellules
sanguines produites chaque jour chez l'homme (environ un milliard) repose sur un nombre suprenamment
petit de HSC (quelques dizaines à quelques centaines de milliers chez l'Homme selon diverses estimations).
Les HSC sont capables de s'auto-renouveler pour maintenir leur pool tout en produisant toutes les
cellules sanguines matures par différenciation en progéniteurs multipotents (MPP) et en cellules
progénitrices hématopoïétiques (HPC) avec des potentiels de différenciation plus limités. La
population HSC est fonctionnellement hétérogène en termes de cinétique du cycle cellulaire (avec certaines
HSC se divisant seulement 5 fois durant les 2 ans de vie d'une souris (Cabezas et al., 2017)), de capacité
d'auto-renouvellement et de potentiel de différenciation, et ces sous-types peuvent être distingués par des
marqueurs tels que CD229 et le facteur von Willebrand.

Chez les adultes, les HSC sont essentiellement quiescentes et leur nombre est étroitement régulé dans
des conditions d'équilibre, consistant en <0,01 % des cellules de la moelle osseuse chez la souris. En réponse
aux demandes hématopoïétiques aiguës telles qu'une grande perte de sang, une myéloablation, une
infection ou une grossesse, les HSC modifient deux aspects de leurs comportements à l'état d'équilibre afin
d'augmenter la production des cellules hématopoïétiques nécessaires (Wilson et al., 2008). Premièrement,
les HSC quiescentes réintègrent le cycle cellulaire pour proliférer ou se différencier par des divisions
cellulaires symétriques ou asymétriques, et deuxièmement, elles se déplacent de la moelle osseuse vers les
tissus extramédullaires, tels que la rate. L'acide rétinoïque s'oppose à cette activation des HSC (Cabezas et
al., 2017).

Si trop de ces HSC sortent de quiescence, leur population diminue après une phase d'expansion initiale car
de la différenciation précoce est induite. Des études d'ablation génique chez la souris ont montré que les
inhibiteurs du cycle cellulaire, en particulier les inhibiteurs des CDK, à savoir p21, p27 et p57, sont essentiels
au maintien des HSC adultes (Cheng et al., 2000; Zou et al., 2011). La kinase dépendante des cyclines CDK6
est également impliquée : les HSC en quiescence profonde n'expriment pas CDK6, contrairement aux HSC
capables de se remettre à proliférer plus rapidement lors d'une stimulation mitogène. L'expression forcée
de CDK6 dans les HSC à quiescence profonde raccourcit leur temps de sortie de quiescence (Laurenti et al.,
2015). Le facteur de transcription Prdm16 a aussi été impliqué dans ce contrôle car sa perte dans les HSC
adultes entraîne une sortie de quiescence et une perte progressive des cellules au fil du temps (Gumundsson
et al., 2020).

619
 **Figure 7-302. La perte de Prdm16 dans les cellules
souches hématopoïétiques adultes aboutit à un
appauvrissement du pool de ces cellules. (A) Schéma de
l'induction de la suppression de Prdm16 dans les cellules
souches hématopoïétiques chez les souris adultes
Prdm16cko/cko;Mx1-Cretg/+ (cette dernière construction
assurant que la Cre qui catalyse la délétion du gène n'est
exprimée que dans les cellules souches
hématopoïétiques de manière inductible (production
d'interféron suite à l'injection d'un immunostimulant,
l'acide polyinosinique–polycytidylique (pIpC)). (B)
Analyse FACS représentative des compartiments LSK,
comprenant les sous-populations LT-HSC (LT, les HSC
généralement quiescentes), ST-HSC (ST, les HSC
proliférantes qui servent de précurseurs "immédiats"
aux cellules hématopoïétiques) et MPP (progéniteurs
multipotents) dans la moelle osseuse des souris à 2 mois
après les injections de pIpC. On constate une forte baisse
de la population LT en absence de Prdm16. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2017626117

Les HSC doivent aussi exprimer le facteur de transcription Bmi-1. En absence de ce facteur, les souris
meurent en 2 mois faute d'avoir renouvelé leurs globules rouges et blancs. Les fonctions de PTBP1, une
protéine se liant aux ARN et importante pour l'épissage et la biogenèse des ribosomes sont également
indispensables au maintien des HSC (Rehn et al., 2022).

Les HSC ont des taux de synthèse protéique inférieurs à ceux des progéniteurs aux potentialités plus
restreintes qu'elles génèrent. Les HSC sont particulièrement sensibles aux altérations de la synthèse des
protéines et une augmentation même modeste de la synthèse des protéines entraîne une altération de
l'auto-renouvellement (Signer et al., 2016). Cela vient notamment d'une hypophosphorylation des facteurs
d'initiation de la traduction 4E-BP1 et 4E-BP2.

Le maintien de la capacité d'auto-renouvellement des HSC nécessite que de multiples paramètres

soient maintenus dans leur niche. L'auto-renouvellement et l'homéostasie des HSC repose ainsi
notamment sur la liaison de la cytokine thrombopoïétine à son récepteur Mpl (Tong et al., 2007). La
thrombopoïétine nécessaire est produite localement dans la moelle osseuse mais aussi plus à distance dans
le foie (Decker et al., 2018).
**Figure 7-303. Diminution du maintien des cellules
souches hématopoïétiques en absence de récepteur Mpl
fonctionnel. Les souris Δ60 expriment une forme tronquée
du récepteur Mpl à la thrombopoïétine où il manque 60
acides aminés dans le domaine intracellulaire et les souris
KP Mpl-/- n'expriment plus aucun récepteur. Des cellules de
moelle osseuse de souris de type sauvage (WT), Δ60 et Mpl-
/- ont été mélangées à un rapport de 9:1 avec des cellules

compétitrices sauvages et transplantées dans des souris

receveuses irradiées. Le chimérisme des souris
transplantées a été mesuré 1, 4 et 8 mois après la
transplantation. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301472X07003190

Mpl est dépourvu de toute activité kinase et recrute en présence de thrombopoïétine la kinase Jak2 pour
activer plusieurs cascades intracellulaires (voies Mapk, Akt et Stat) (Bersenev et al., 2008). L'inactivation
620
génétique de Mpl (Kimura et al., 1998), Jak2 (Akada et al., 2014) et Stat5 (Wang et al., 2009) entraîne une
altération de l'homéostasie des HSC et une défaillance progressive de l'hématopoïèse.

*Figure 7-304. La voie JAK/STAT qui est impliquée dans le contrôle de l'hématopoïèse et de nombreuses autres
étapes du développement et de la physiologie du système immunitaire. Un ligand extracellulaire (jaune) se lie à un
récepteur de cytokine transmembranaire (vert), qui n'a pas d'activité kinase intrinsèque et s'associe plutôt de
manière constitutive aux protéines JAK (gris). La liaison du ligand aux récepteurs provoque un changement de
conformation, conduisant à l'activation de JAK par trans-phosphorylation. Les JAK activés (roses) phosphorylent
ensuite le récepteur sur les résidus tyrosine dans le domaine cytoplasmique. Les dimères STAT inactifs (violets) sont
recrutés sur le récepteur au niveau de ces sites phosphotyrosine et sont phosphorylés par les JAK activés. Les
dimères STAT phosphorylés (pSTAT) (bleu) prennent une conformation de dimère activé, se transloquent vers le
noyau, se lient à des séquences d'ADN spécifiques dans les gènes cibles [séquence consensus TTC(N) 2–4GAA] et
modifient l'expression des gènes. Les gènes SOCS, qui sont des cibles de la voie JAK/STAT, codent pour des protéines
inhibitrices (noires) qui favorisent la dégradation du récepteur des cytokines et des JAK, fournissant ainsi une boucle
de rétroaction négative. Les événements de phosphorylation de la tyrosine sont indiqués par des halos jaune. Source
: https://journals.biologists.com/dev/article/146/2/dev167643/20523/JAK-STAT-signaling-in-stem-cells-and-
regeneration

En plus de ces signaux activateurs, Jak2 est également inhibé par les protéines Socs (Kershaw et al., 2013)
et Lnk. L'inactivation de Lnk augmente l'activité de Jak2 et la taille du pool de HSC dans le moelle osseuse
(Bersenev et al., 2008). En conclusion, Jak2 joue un rôle central dans la régulation de la taille du pool de HSC
et un équilibre des régulateurs positifs et négatifs de l'activité de Jak2 contrôle l'homéostasie des HSC dans
la moelle osseuse.

La voie Notch qui est active dans les HSC est nécessaire pour maintenir leur capacité d'auto-
renouvellement et éviter une différenciation trop importante (Duncan et al., 2005). On retrouve pour
Notch le même rôle que dans les cellules souches neurales.
**Figure 7-305. Activation de la voie Notch dans les
cellules souches hématopoïétiques. On réalise des souris
transgéniques exprimant la GFP sous le contrôle d'un
promoteur activé par la voie Notch. Des coupes sont
réalisées dans la moelle osseuse et une
immunofluorescence avec un anticorps anti-c-Kit (un
marqueur de HSC) est réalisée. On observe de
nombreuses cellules qui co-expriment la GFP et c-Kit
(pointes de flèche, jaune). Source :
https://www.nature.com/articles/ni1164

621
Les cellules souches hématopoïétiques interagissent aussi avec les cellules stromales voisines et les
intégrines participent à ces jonctions (voir figure 5-114).

Si on utilise des anticorps bloquant l'interaction intégrine α4β1/VCAM-1, les cellules souches
hématopoïétiques finissent par s'échapper dans la circulation sanguine (Papayonnoupoulou et al., 1995).
L'interaction entre l'intégrine α4β7 et MadCam-1 est essentielle pour le recrutement des cellules souches
hématopoïétiques dans la moelle osseuse soit au cours du développement, soit au cours de transfusions
(Katayama et al., 2004). Chez les patients atteints de leucémie myéloïde aigue, l'interaction intégrine
α4β1/VCAM-1 est un élément important de la résistance à la chimiothérapie parce que cette interaction
active la signalisation NF-kB dans les cellules stromales qui en retour envoient des signaux favorisant la
survie des cellules tumorales (Jacamo et al., 2014).

Il existe aussi des mécanismes rétroactifs de contrôle de la quiescence des HSC. Les mégakaryocytes (les
cellules qui génèrent les plaquettes) ont un effet stimulant sur cette quiescence via des sécrétions de CXCL4,
de TGFβ1 ou de thrompoïétine. Si on déplète la population de mégakaryocytes dans la moelle osseuse, il y
a réveil des HSC avec une prolifération aboutissant à leur expansion (Zhao et al., 2014; Nakamura-Ishizu et
al., 2015).

La population de HSC, malgré leur apparente homogénéité phénotypique, est néanmoins

hétérogène et constituées de cellules biaisées en différenciation lymphoïde ou myéloïde.

Fait intéressant, les lignées hématopoïétiques diffèrent par leur sensibilité au stress génotoxique. Dans
plusieurs lignées de souris présentant des déficiences dans les enzymes de réparation de l'ADN, les lignées
hématopoïétiques sont globalement épuisées, mais les progéniteurs myéloïdes restent dans des
proportions plus élevées que leurs homologues lymphoïdes. Après irradiation γ ou raccourcissement des
télomères, l'épuisement global des HSC et la plus grande réduction des progéniteurs lymphoïdes sont
causés par le facteur de transcription BATF. Lors de l'activation des médiateurs du point de contrôle de la
phase G1 / S, BATF provoque la spécification et la différenciation lymphoïde, réduisant ainsi les pools de
HSC auto-renouvelées biaisées vers les lymphoïdes (Wang et al., 2012). Cela préserve des HSC à biais
myéloïdes, maintenant ainsi un pool de cellules souches qui peuvent produire des érythrocytes et des
plaquettes essentiels. Tout en éliminant les cellules souches qui pourraient être entrées dans les premiers
stades de la tumorigénèse lymphoïde (mais au prix de l'épuisement de la réponse immunitaire adaptative).

Les ostéocytes peuvent également intervenir dans l'hématopoïèse. Ils régulent le développement des
neutrophiles par sécrétion de facteurs solubles comme IL19 (Xiao et al., 2021) et ils peuvent également
réguler la myélopoïèse (Fulzele et al., 2013). La diminution forcée de la population d'ostéocytes chez la
souris par l'expression d'une toxine diphtérique dans leur lignage aboutit à une quantité de progéniteurs
myéloïdes plus importante au détriment des progéniteurs lymphoïdes (Ding et al., 2022).

Il existe un dimorphisme sexuel en ce qui concerne l'hématopoïèse adulte. Chez les souris, les HSC des
femelles se divisent plus fréquemment et s'auto-renouvellent plus efficacement que les HSC des mâles. Les
femmes ont une incidence plus faible de cancers hématologiques que les hommes. Les patientes
pédiatriques et les jeunes femmes atteintes de leucémie myéloïde aiguë ont une survie plus importante que
les hommes. De plus, les patientes atteintes de leucémie ont montré une meilleure récupération après une
greffe de HSC. Les œstrogènes jouent un rôle dans la régulation de l'hématopoïèse féminine et sont en partie
responsables de la division plus fréquente des HSC chez les femmes (Nakada et al. 2014, Heo et al., 2015).
Cela joue un rôle important lors de la grossesse. Il existe aussi des réponses immunitaires spécifiques au
sexe dans lesquelles les femmes ont tendance à avoir une réaction immunitaire plus forte.

Au fil du temps, les HSC perdent progressivement leur capacité de régénération et présentent un potentiel
lymphoïde atténué, contrebalancé par un potentiel myéloïde accru. Cela contribue à la réduction des cellules
immunitaires adaptatives et à l'immunosénescence chez les personnes âgées (de Haan et al., 2018).

Signalons que, remarquablement, les HSC injectées dans la circulation sanguine peuvent coloniser les
compartiments du stroma de la moelle osseuse que l'on a déplété en HSC précédemment, permettant des
thérapies contre les tumeurs lymphoïdes et des études expérimentales sur les HSC.

Signalons que certaines cellules immunitaires ne sont pas dérivées des HSC de la moelle osseuse, y 622
compris chez l'adulte et se maintiennent indépendamment d'elles : c'est le cas des cellules
microgliales du cerveau, des cellules de Langerhans dans la peau et des cellules de Kupffer dans le
foie (Mirshekar et al., 2014), ainsi que d'une bonne partie des lymphocytes B de type B-1a dans les
cavités pleurales et péritonéales et qui proviennent des phases embryonnaires de l'hématopoïèse
et persistent chez l'adulte (Kobayashi et al., 2023).
Les cellules NK
Les cellules tueuses naturelles (NK) font partie du système immunitaire dit inné composé de cellules
qui ne subissent pas de sélection clonale et de réarrangements génomiques contrairement aux
lymphocytes B et T. Les cellules NK sont équipées d'une large gamme de récepteurs de surface
activateurs ou inhibiteurs, leur permettant de reconnaître et de tuer les cellules tumorales ou
infectées grâce à la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Elles
détectent notamment les cellules qui présentent une expression altérée du CMH de classe I (MHC-I). Elles
ont également un récepteur NKG2D qui reconnait le ligand NKG2D-L dont la présence à la surface des
cellules est augmentée si elles sont infectées ou tumorales (également plus exprimée dans les cellules
sénescentes). Le virus SARS-CoV-2 (Covid-19) est capable d'échapper aux cellules NK en inhibant
l'expression de NKG2D-L à la surface des cellules qu'il a infectées (Lee et al., 2022).

De plus, les cellules NK contribuent également à l'initiation et au développement de la réponse immunitaire

adaptative, sécrétant plusieurs classes de cytokines, notamment l'IFN-γ pro-inflammatoire. Les cellules NK
peuvent même maintenir une forme de mémoire immunologique (Bautista De Sanctis, 2022). La réponse
fonctionnelle des cellules NK est précisément régulée par un équilibre entre les signaux d'activation et
d'inhibition et par leur "éducation" au cours du développement.

Les cellules NK se développent à partir de cellules progénitrices lymphoïdes communes (CLP) dérivées de
cellules souches hématopoïétiques CD34+. Les CLP sont les précurseurs communs des NK, des lymphocytes
T et B et d'autres cellules lymphoïdes. Elles expriment différents marqueurs, notamment CD38, CD7, CD10,
CD127 et CD122. L'expression de CD122 (IL-2Rβ/IL-15R) marque la détermination des CLP en cellules NK.
Cette détermination dépend de l'expression de Eomesodermine et de T-bet (Daussy et al., 2014) ainsi que
de Id2 qui réprime l'action des protéines E, notamment Socs3, E2A, E2-2 et HEB (en se dimérisant avec eux
et en les empêchant de se fixer sur des séquences de type boîte E (CANNTG) sur l'ADN). Ces protéines
auraient déterminé les cellules en lymphocytes B ou T, et stimule l'expression des récepteurs à l'IL-15
activant une voie de signalisation essentielle pour la survie des NK (Delconte et al., 2016). Cette voie
maintient l'expression de la protéine anti-apoptotique MCL1 et inhibe l'expression de la protéine
apoptotique BIM (Huntington et al., 2007).

623
 **Figure 7-306. Développement et différenciation terminale des cellules NK humaines. Le développement de cellules
NK humaines à partir d'un progéniteur lymphoïde commun en des précurseurs de cellules NK puis en des cellules
NK différenciées en phase terminale est représenté de gauche à droite. L'acquisition et la perte des marqueurs de
surface sont indiquées. Les niveaux d'expression des protéines sont représentés en noir pour une expression élevée
et en blanc pour aucune expression, le gris indique des niveaux intermédiaires. Les propriétés fonctionnelles sont
indiquées en conséquence. Abréviations : progéniteur lymphoïde commun (CLP), moelle osseuse (BM), sang
périphérique (PB), organes lymphoïdes secondaires (SLO). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2013.00499/full

IL-15 joue un rôle crucial dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules NK
(Huntington et al., 2008).
*Figure 7-307. Un agoniste des récepteurs à IL-15
stimule la différenciation des cellules NK. RLI est un
agoniste des récepteurs à IL-15. Il est injecté dans des
souris (ou c'est le solvant PBS qui est injecté en tant que
témoin). Au bout de quelques jours, les cellules
provenant de différents organes (BM = moelle osseuse)
sont analysées par FACS. CD16 est un marqueur de NK
matures (c'est un récepteur qui se lie à la partie Fc des
anticorps IgG, ce qui active alors la cytotoxicité à
médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC)
de NK). Source : https://rupress.org/jem/article/206/1/25/54173/IL-15-trans-
presentation-promotes-human-NK-cell

Lors des infections virales, l'activation des cellules NK cytotoxiques et sécrétoires est stimulée par des
cytokines spécifiques dont l'expression est activée lors de la réplication virale. Par exemple, les interférons
de type I (IFN-α/β), sécrétés par les cellules infectées, induisent la cytotoxicité des cellules NK dites à CD56
faible; l'expression d'IL-12 (interleukine-12) stimule la sécrétion d'IFN-γ (interféron-γ) par les cellules NK
dites à CD56 fort mais il faut la présence concomitante d'IL-15 ou d'IL-18 (Fehninger et al., 1999).

624
 **Figure 7-308. Comparaison de la production de
protéines IFN-γ par des cellules NK humaines au repos
en réponse à une stimulation avec IL-18 ou IL-15 en
combinaison avec IL-12. Comparaison de l'action de l'IL-
18, de l'IL-15 et de l'IL-12 sur la capacité à stimuler la
production d'IFN-γ par des sous-populations de cellules
NK humaines au repos. Des nombres égaux de cellules
NK CD56fort et CD56faibles triées par FACS ont été
stimulées avec 100 ng/ml d'IL-18 ou d'IL-15 et IL-12 et
la production d'IFN-γ dans le milieu a été mesurée par
ELISA. Source :
https://journals.aai.org/jimmunol/article/162/8/4511/69453

L'IFN-γ peut activer plusieurs voies importantes associées à des fonctions antivirales directes et/ou des
effets immunorégulateurs sur la réponse immunitaire en aval. Pendant ce temps, les cellules NK peuvent
également produire du TNF-α qui médie les effets antiviraux et immunorégulateurs.

*Figure 7-309. Activation des cellules NK au cours d'une infection virale. Le virus peut induire la production d'IFN-
α/-β (interféron-α/-β) et d'IL (interleukine)-2, IL-12, IL-15 et IL-18 par les cellules infectées, qui stimulent
respectivement la cytotoxicité des cellules NK et l'activation de l'immunité adaptative. Les cellules NK CD56dim (CD56
faible) ont une fonction cytotoxique qui peut être médiée par la production de Granzyme-B, l'interaction Fas/FasL
(ligand Fas) et la liaison de CD16 avec le Fc (fraction constante) des anticorps. La modulation adaptative de
l'immunité est médiée par les cellules NK CD56bright (CD56 fort) via la sécrétion d'IFN-γ (interféron-γ)/TNF-α
(facteur de nécrose tumorale-α), qui influencent les cellules T et B. Source : https://www.mdpi.com/2673-
5601/1/3/21/htm

Les cellules NK peuvent agir comme un pont entre l'immunité innée et adaptative, car elles peuvent
interagir avec les cellules T et B via leurs ligands costimulateurs, tels que CD40L et OX40L, qui favorisent la
différenciation des cellules NK.

ADAM17 est une métalloprotéinase qui est capable de cliver CD16 de la surface des NK et ainsi de modérer
leur activation (Romee et al., 2013). Des souris sans ADAM17 résistent mieux aux infections bactériennes.

Macrophages et monocytes
Il s'agit de cellules phagocytaires qui résident dans la majorité des tissus dont ils maintiennent
l'homéostasie en éliminant les cellules mortes (par efferocytose) et les débris et dont ils assurent
l'intégrité en éliminant les pathogènes. Ce sont à la fois des sentinelles et des effecteurs. Ils se
déplacent dans les tissus et émettent de longs prolongements qui explorent leur environnement. L'identité
et la fonction spécifiques d'un macrophage dépendent à la fois de son origine et des signaux qu'il reçoit du
tissu où il est en résidence. Ces facteurs entraînent une large hétérogénéité de macrophages, souvent avec
des réponses et des activités spécifiques aux tissus (Bleriot et al. 2020).

Les macrophages dans les tissus ont deux origines possibles : soit ils développent au cours du
développement embryonnaire (notamment dans la vésicule vitelline ou sac vitellin), soit ils se
développent plus tard à partir de monocytes issus de l'hématopoïèse dans la moelle osseuse. La
625
première population se développe à E7,5-E8,5 chez la souris. Certaines de ces cellules pénètrent dans le
cerveau à E9,5 et deviennent des microglies. D'autres maturent en dehors du cerveau (devenant CD206 +)
mais certaines d'entre elles forment une deuxième population de microglies vers E12,5 après entrée dans
le système nerveux via les ventricules cérébraux (et redeviennent CD206 -) (Hattori et al., 2023). Ces
macrophages se développent et se maintiennent indépendamment de la moelle osseuse, ce qui peut se
montrer chez les souris mutantes perte-de-fonction pour le gène codant le facteur de transcription Myb qui
est indispensable au développement des macrophages issus des monocytes mais par pour le
développement des macrophages d'origine embryonnaire (Schulz et al., 2012). Selon les tissus, les
proportions des macrophages des deux origines varient.
*Figure 7-310. Origines variables des macrophages selon
la localisation. Les macrophages dits tissus résidents ont
une origine indépendante de la moelle osseuse et
proviennent de cellules souches hématopoïétiques
embryonnaires. Les macrophages dérivés des
monocytes proviennent des cellules souches
hématopoïétiques de la moelle osseuse. Signalons que
les macrophages résidents dans le système nerveux
central (CNS) constituent la microglie. LC = cellules de
Langerhans résidants dans l'épiderme. LP = lamina
propria. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2014.00514/full

Les monocytes constituent une population hétérogène de cellules immunitaires innées circulant dans le
sang, peuvent être recrutés à partir du système sanguin et se différencier en macrophages (Italiani et al.,
2014). Les monocytes pro-inflammatoires classiques CD14+ (qui constituent 90% des monocytes) roulent
le long des endothéliums activés avant leur émigration dans les sites des tissus en inflammation. Les
monocytes non classiques CD16+ rampent constamment le long de l'endothélium vasculaire dans des
conditions d'état d'équilibre. De ce fait, ils présentent un comportement de patrouille qui est essentiel pour
leur rôle de piégeage des microparticules de la surface luminale des vaisseaux sanguins (Auffray et al. 2007,
Carlin et al. 2013). Les monocytes qui n'ont pas été recrutés au bout de 2 jours environ meurent par
apoptose.

Les étapes de détermination successives dans la moelle osseuse pour obtenir des monocytes et des
macrophages comprennent les progéniteurs myéloïdes communs (CMP), les précurseurs des granulocytes-
macrophages (GMP) et les progéniteurs des macrophages/cellules dendritiques (MDP). Le progéniteur
déterminé des monocytes se reconnait à sa perte du marqueur CD135 (Hettinger et al., 2013).

Le contrôle homéostatique du développement des monocytes/macrophages est principalement influencé

par le CSF-1 (également connu sous le nom de M-CSF), produit par les cellules stromales dans les tissus. Les
macrophages matures expriment à leur tour un excès de récepteurs du CSF-1 (CSF-1R) et éliminent le CSF-
1 circulant, permettant une boucle de rétroaction qui cause d’une diminution de la prolifération des
monocytes (Bartocci et al., 1987).

626
 *Figure 7-311. Contrôle homéostatique de la quantité de
macrophages dérivés des monocytes dans les tissus. Les
cellules stromales des tissus expriment le facteur CSF-1
qui favorise la prolifération et la différenciation des
monocytes en macrophages. Ces derniers expriment de
fortes concentrations de récepteurs au CSF-1 qui le
capturent et le rendent moins disponibles.

Les macrophages expriment un ensemble diversifié de récepteurs de type PRR (pour Pattern Recognition
Receptors) qui reconnaissent des molécules "étrangères" (comme le LPS (LipoPolySaccharides) de la paroi
bactérienne) qui leur permettent de déclencher une réponse inflammatoire appropriée (Fitzgerald et al.,
2020). La stimulation de ces PRR, tels que les récepteurs de type Toll (TLR), conduit à l'activation des
macrophages et à la production de cytokines pro-inflammatoires dépendantes de NF-κB et AP1 comme le
TNF-α, l'IL-6 et l'IL-12.

Alors que dans un premier temps, les macrophages activés stimulent l'inflammation, ils modifient leur
fonction pour limiter l'inflammation pendant la cicatrisation des plaies et se concentrent plutôt sur
l'élimination des débris et l'assistance à une cicatrisation efficace (Das et al., 2015). Les macrophages dans
cet état expriment des molécules telles que l'arginase-1 (ARG1) et Krüppel like factor-4 (KLF4), qui
contribuent à leur fonction : ARG1 est une enzyme qui peut supprimer la formation d'oxyde nitrique et est
nécessaire pour fournir des métabolites essentiels à une cicatrisation efficace des plaies, tandis que KLF4
est un facteur de transcription qui stimule l'expression d'ARG1 et d'autres gènes réparateurs, comme
CD206 (Liao et al., 2011).

*Figure 7-312. Contrôle des macrophages par les voies de signalisation activées par les récepteurs TLR. La liaison de
LPS bactériens au TLR conduit à l'activation de NF-κB qui aboutit à la production de cytokines inflammatoires.
L'activation de TLR active également PI3K-AKT via la protéine BCAP. AKT activé phosphoryle ses cibles en aval
FOXO1 et GSK3β pour limiter l'inflammation. L'activation de AKT améliore également la glycolyse, ce qui conduit à
l'accumulation de sous-produits métaboliques comme le lactate. Ce métabolite est utilisé pour favoriser la lactylation
des histones, qui est importante pour l'activation de la transcription des gènes "réparateurs" assistant la cicatrisation
627
 et permet ainsi la transition des macrophages d'une phase inflammatoire à une phase réparatrice. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2009778117

Les lymphocytes T
Les lymphocytes T sont des cellules du système immunitaire adaptatif qui combattent les menaces
externes (infections) et internes (tumeurs). Contrairement aux lymphocytes B, les lymphocytes T ne
terminent pas leur maturation dans la moelle osseuse mais se déplacent via la circulation sanguine
dans le thymus où ils trouvent un microenvironnement adéquat. Le thymus est ainsi considéré comme
un organe lymphoïde primaire, tout comme la moelle osseuse.

Le thymus est nécessaire au bon développement des lymphocytes T comme le montre l'exemple des
souris nude. Il s'agit d'une lignée comportant une délétion du gène Foxn1 qui aboutit à un thymus très
malformé ou absent. Les souris ne présentent également presque pas de poils, ce qui explique leur nom.
Elles n'ont pas de lymphocytes T et donc ne peuvent rejeter des greffes. Elles sont donc utilisées comme
modèle pour des greffes de cellules humaines, notamment tumorales et le test de leur capacité à proliférer
et à former des métastases.
*Figure 7-313. Une souris nude, sans thymus, qui ne
produit pas de lymphocytes T. La mutation spontanée
menant à ce phénotype a été découverte en 1962 dans
un laboratoire de Glasgow, Ecosse. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Nude_mouse#/media/File:Nacktmaus_01.jpg

Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ expriment le récepteur des lymphocytes T (TCR) qui reconnaît les
antigènes présentés par les cellules présentatrices d'antigène (APC) exprimant respectivement
CMH‐II ou CMH‐I. Généralement, les molécules de CMH-II présentent des antigènes d'origine externe
à la cellule présentatrice d'antigènes (dérivant de bactéries extracellulaires par exemple) et les
molécules de CMH-I des antigènes d'origine interne (dérivant de bactéries internes ou de virus ou
d'anomalies tumorales). Certaines exceptions ont été caractérisées : des lymphocytes T CD4+ peuvent
exprimer des TCR qui reconnaissent des antigènes présentés sur du CMH-I et inversement des lymphocytes
T CD8+ peuvent exprimer des TCR qui reconnaissent des antigènes présentés sur du CMH-II (Singh et al.,
2022).

Les TCR sont très sélectifs et très sensibles : on estime qu'entre 1 et 10 exemplaire(s) de l'antigène est
capable d'activer un lymphocyte T et avec une affinité à peine supérieure à des molécules qui ne suscitent
pas ou peu de réponses des cellules (Sykulev et al., 1996; Huang et al., 2013).

Au cours de leur développement, les lymphocytes T (tout comme les lymphocytes B) qui
reconnaissent les molécules du CMH du soi sont conservés mais ceux qui reconnaissent en plus des
antigènes du soi sont éliminés. Cette série de sélection a lieu dans le thymus pour les lymphocytes T
encore immatures appelés thymocytes. Puis une fois cette étape terminée, les lymphocytes qui
rencontrent l'antigène correspondant à leur récepteur TCR (pour les lymphocytes T) et BCR (pour
les lymphocytes B) sont "activés" et font l'objet d'une sélection clonale positive qui mène à leur
amplification par prolifération et à leur différenciation complète.

628
 *Figure 7-314. La double sélection au cours du développement des
lymphocytes. Une cellule souche hématopoïétique (1) subit une
différenciation et un réarrangement génomique pour produire des
lymphocytes immatures diversifiés (2) qui présentent ensemble un
très grand répertoire de récepteurs antigéniques différents. Ceux qui
se lient aux antigènes des propres tissus du corps (3) sont éliminés
(sélection négative), tandis que les autres se transforment en
lymphocytes inactifs (4). La plupart d'entre eux ne rencontrent jamais
un antigène étranger (5) correspondant à leur récepteur, mais ceux
qui le font sont activés et prolifèrent (sélection positive, expansion
clonale) et se différencient en lymphocytes actifs (6). Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Clonal_selection#/media/File:Clonal_
selection.svg

*Figure 7-315. Différenciation des lymphocytes T dans le thymus. Les lymphocytes immatures (thymocytes) arrivent
par voie sanguine depuis la moelle osseuse et sont doublement négatives (DN). Elles interagissent avec les
macrophages, les cellules épithéliales du cortex thymique (cTEC) et les fibroblastes mésenchymateux et activent
l'expression de CD4 et de CD8 (stade doublement positif). Ces cellules migrent dans la partie plus médullaire du
thymus où elles se différencient en lymphocytes T CD4+ ou CD8+ (simples positifs, SP) en interaction avec les cellules
dendritiques et les cellules épithéliales du thymus médullaire (mTEC). Source : https://www.spandidos-
publications.com/10.3892/mmr.2017.7525

Les cellules du thymus créent un microenvironnement favorable à la sélection positive des

lymphocytes T. Les cellules épithéliales du cortex thymique (cTEC) expriment par exemple des
composants particuliers du protéasome ce qui leur permet de présenter sur leur CMHI des peptides
différents de ceux habituellement présentés par les autres cellules. Ainsi, la sous-unité β5t du protéasome,
qui n'est exprimé que dans les cTEC, est nécessaire à l'obtention de lymphocytes T CD8+ en quantité
suffisante (Murata et al., 2007).

Des facteurs de transcription spécifiques orientent la différenciation des thymocytes vers un profil
CD4+ ou CD8+. Par exemple, l'expression du facteur de transcription ThPOK favorise la
différenciation en lymphocytes CD4+.

629
 **Figure 7-316. ThPOK est nécessaire au
développement des lymphocytes T CD4+. Analyse
FACS de l'expression de CD4 (en ordonnées) et de
CD8 (en abscisse) dans les cellules du sang
périphérique de souris hétérozygotes ou
homozygotes pour la mutation HD (= helper
deficient, mutation spontanée découverte dans
une lignée de souris vers la fin des années 90. La
mutation récessive correspond à un allèle perte-
de-fonction du gène codant ThPOK. Notez
l’absence de lymphocytes CD4 chez les souris
mutantes homozygotes (HD-/-). Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5323
29/

Les TCR sont composés de sous-unités αβ présentant des domaines variables de type immunoglobuline et
sont associés au complexe CD3 formé par les sous-unités γ, δ, ε et ζ.

**Figure 7-317. Complexe TCR-CD3 et activation de voies de signalisation en aval. Les sous-unités α et β de TCR sont
représentées ainsi que les sous-unités γ, δ, ε et ζ de CD3. La liaison de TCR-CD3 à la suite de la reconnaissance d'un
complexe antigène-CMH induit des changements conformationnels qui permettent le recrutement de protéines de
transduction qui activent diverses voies de signalisation. Le recrutement de la tyrosine kinase ZAP-70 est sans doute
le plus important pour l'activation des lymphocytes, leur prolifération et leur différenciation. La protéine Numb peut
être associée au CD3ε pour réguler la dégradation du TCR conduisant à une diminution de la signalisation du TCR.
Source : https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/imm.12809

Lors de l'activation des lymphocytes T via le TCR des modifications importantes de l'expression des
gènes ont lieu. Par exemple, l'expression du microARN miR-125b est diminuée alors qu'il a un rôle dans le
maintien des lymphocytes T dans un état naïf (Rossi et al., 2011). Le microARN miR-150 voit son expression
également diminuée en relation avec une baisse d'expression des facteurs de transcription RFX qui sont
nécessaires pour son expression (Chiricella et al., 2022). Les cibles de ce microARN, MYB (un facteur de
transcription) et PDAP1 (une protéine se liant à des ARN) voient logiquement leur expression augmenter
lorsque les lymphocytes T sont activés. L'expression de MYB est nécessaire à la prolifération des
lymphocytes T. L'expression de miR-150 est largement diminuée dans les lymphomes (Ito et al., 2014).

630
 **Figure 7-318. MYB et PDAP1 activent la prolifération des lymphocytes T tandis que miR-150 s'y oppose. Des
cultures primaires de lymphocytes T mémoires sont transfectés avec un système CRISPR/Cas9 pour causer des
mutations perte-de-fonction dans les gènes MYB, PDAP1 ou miR-150. Les clones sont sélectionnés et comparés pour
leur prolifération (après incubation dans du BrdU) à des clones contrôles. Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3001538

L'activation des cellules T auxiliaires naïves CD4+ nécessite la présentation de l'antigène par des
cellules présentatrices d'antigène (APC) exprimant le CMH-II, et aboutit à leur différenciation en
plusieurs sous-ensembles effecteurs qui ont des fonctions spécifiques et complémentaires. La
différenciation dans chaque sous-ensemble T auxiliaire est principalement contrôlée par les cytokines
présentes dans leur microenvironnement. Ces sous-ensembles d'auxiliaires CD4+ sont les suivants : Th1
sous l'influence de IL-12 ; Th2 sous l'influence de IL-4 ; Th9 sous l'influence de IL-4 et de TGF-β ; Th17 sous
l'influence de IL-6 et de TGF-β ; Th22 sous l'influence de IL-6 et de IL-23 ; et Treg sous l'influence de TGF‐β
et de IL‐2.
*Figure 7-319. Détermination et différenciation des
différents types de lymphocytes T. Elles ont lieu grâce
à la présentation de l'antigène et de la stimulation par
les cytokines produites localement. Cela active les
facteurs de transcription indiqués dans le noyau des
cellules et active la production de cytokines ou de
molécules effectrices spécifiques (en bas). Source :
https://www.mdpi.com/2073-4409/11/19/3116

Les cytokines qui interviennent dans la différenciation des lymphocytes T auxiliaires activent les voies de
signalisation en aval et conduisent à l'activation de l'expression d'un facteur de transcription maître. Chacun
de ces facteurs maîtres de transcription est responsable de la définition des programmes de transcription
pour chaque sous-ensemble T auxiliaire et affine l'expression des cytokines appropriées pour contrôler la
réponse immunitaire. Par exemple, T-bet contrôle la différenciation des cellules Th1 en activant
l'expression d'IFNγ tout en supprimant l'expression des cytokines typiques de Th2, tels que IL4 (Szabo et
al., 2000).

631
 **Figure 7-320. T-bet active l'expression du gène IFNγ et
réprime celle du gène IL-2 dans les cellules EL4 (cellules
de thymome de souris) (A) Sites de boîte T (sites de
fixation putatifs de T-bet) dans les gènes IL-2 et IFNγ par
rapport à une séquence de boîte T consensus. (B) Schéma
de la construction du rapporteur de la transcription de
IFNγ (le gène rapporteur est la luciférase). (C) Analyse de
la transactivation des promoteurs IL-2, IL-4 et IFNγ dans
les cellules EL4. Les plasmides suivants ont été utilisés :
une construction promoteur/rapporteur IL-2 (IL-2.luc,
contenant 22060 à 140 du promoteur IL-2), une
construction promoteur/rapporteur IL-4 (IL-4.luc,
contenant 2760 à 168 du promoteur de IL-4), et la
construction de rapporteur IFNγ décrite ci-dessus
(IFNγ.luc). Les barres rayées correspondent au vecteur
pCDNA vide et les barres pleines au vecteur d'expression
T-bet. Le panneau de gauche correspond aux cellules non
stimulées, et le panneau de droite à une stimulation avec
du PMA et de l'ionomycine pendant 5 heures. Les unités
de luciférase dans les barres marquées d'un astérisque
représentent 1/20 de l'activité réelle. (D) Production
endogène d'IFNγ dans des cellules EL4 transfectées de
manière transitoire avec T-bet. Les barres rayées
correspondent au vecteur pCDNA seul et les barres
pleines correspondent au plasmide d'expression T-bet.
PMA et ionomycine ont été ajoutés 12 h après la
transfection et le niveau d'IFNγ produit à 24, 48 et 72 h
mesuré par ELISA. Source :
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-
8674(00)80702-3

Les lymphocytes T régulateurs (Treg) suppriment l'excès d'immunité contre les antigènes du soi et
les antigènes dérivés des bactéries commensales. Comme les Th, ils expriment CD4 mais ils sont aussi
caractérisés par l'expression du facteur de transcription Forkhead box P3 (Foxp3) (codé par un gène sur le
chromosome X) qui joue un rôle crucial dans la différenciation, le maintien et la fonction des cellules T reg.
Les patients et les modèles animaux qui ont des mutations perte-de-fonction dans Foxp3 succombent à des
maladies autoimmunes (Bennett et al., 2001). Le microARN miR-142 est aussi essentiel à la fonction des
cellules Treg (Wang et al., 2022).

632
 *Figure 7-321. Maladie auto-immune mortelle chez les souris présentant une délétion de miR-142 dans les cellules
Treg. (A) Courbes de survie de Kaplan-Meier des souris Foxp3Cre et Foxp3Cre;miR-142fl/fl (B) Photographie de souris
femelles Foxp3Cre (2 souris en bas) et Foxp3Cre;miR-142fl/fl (2 souris en haut) âgées de 14 semaines. Les souris
Foxp3Cre;miR-142fl/fl sont plus petites et ont une dermatite sévère (C) Comparaison du poids corporel des souris
Foxp3Cre et Foxp3Cre;miR-142fl/fl mâles âgées de 8 à 10 semaines . (D) Images représentatives de la rate et des
ganglions lymphatiques périphériques de souris Foxp3Cre (à gauche) et Foxp3Cre;miR-142fl/fl (à droite). (E) Coloration
hématoxyline-éosine de coupes de tissus du foie, des poumons, de l'estomac et du côlon de souris Foxp3Cre et
Foxp3Cre;miR-142fl/fl. On observe une accumulation massive de leucocytes dans les tissus Foxp3Cre;miR-142fl/fl. Barre
d'échelle = 50 μm. Source : https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3001552

Les lymphocytes Treg développés dans le thymus (tTreg) expriment le facteur de transcription Helios. Ils y
sont sélectionnés selon leur forte avidité de leur TCR pour des antigènes du soi. Les lymphocytes tT reg
subissent une différenciation supplémentaire en lymphocytes T reg effecteurs entièrement suppressifs en
réponse aux signaux du récepteur de l'antigène des lymphocytes T (TCR) et des cytokines. Les lymphocytes
Treg périphériques (pTreg) proviennent de lymphocytes T conventionnels CD4+Foxp3− naïfs à la périphérie
lors de la stimulation antigénique avec une combinaison appropriée de cytokines telles que IL-2 et TGFβ.
Les pTreg sont principalement présents dans l'intestin, notamment en raison de l'expression abondante de
TGFβ et d'acide rétinoïque, et sont considérés comme particulièrement importants dans l'établissement de
la tolérance au microbiote au niveau des sites muqueux. Une sous-population de pTreg est essentielle pour
une bonne tolérance du placenta chez les mammifères placentaires. Le gène FoxD3 est activé par un
enhancer particulier appelé CNS1 dans cette population (Samstein et al., 2012).

Les lymphocytes T CD8 répondent aux antigènes présentés sur les complexes protéiques du CMH de
classe I et se différencient en lymphocytes T cytotoxiques (CTL) qui expriment des protéines
cytolytiques (perforines, granzymes...) et interviennent directement dans l'élimination des cellules
infectées par le virus et des cellules tumorales. Lors de la première division suivant la présentation de
l'antigène, une division asymétrique permet de former un précurseur de CTL et un précurseur de
lymphocytes T mémoire (Chang et al., 2007).

**Figure 7-322. Division asymétrique d'un lymphocyte CD8+ après la présentation de l'antigène. Des lymphocytes T
CD8+ activés par présentation de leur antigène ont été traités par la cytochalasine B pour bloquer la cytodiérèse
après leur première mitose. Une immunofluorescence est réalisée avec un anticorps anti-CD8, anti-PKCζ et anti-
tubuline. L'ADN est reconnu par le DAPI. On observe que CD8 n'est hérité en grande majorité que par une seule des
deux cellules, tandis que PKCζ est hérité par l'autre cellule qui va devenir un lymphocyte T mémoire. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/science.1139393

Les cellules dendritiques (CD) reconnaissent différentes morphologies de pathogènes comme C. albicans et
différencient les sous-ensembles de cellules T auxiliaires (TH) adaptés au contexte pour orchestrer les
réponses immunitaires (d'Ostiani et al., 2000; Kashem et al., 2015). Différentes morphologies de C. albicans
stimulent différents récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) sur les CD (Gantner et al., 2005;
Lowman et al., 2014; Mukaremera et al., 2017), et différents sous-ensembles de CD induisent des sous-
ensembles spécifiques de cellules TH (Igyarto et al., 2011 ; Kashem et al., 2015).

633
 *Figure 7-323. Des formes différentes d'un même pathogène peuvent activer des réponses immunitaires différentes.
Le champignon Candida albicans existe sous forme ellipsoïdale "levure" ou sous une forme plus filamenteuse
"hyphe". Des cultures de PBMC (cellules mononuclées du sang périphérique) sont cultivées en présence de glucanes
de la paroi de C. albicans de la forme "levure" ou "hyphe" et les profils de production de cytokines sont analysés.
Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(19)74734-6/fulltext

Suite à l'expansion puis à la fin des réponses des lymphocytes T, un pool élargi de cellules mémoires est
capable d'initier des réponses puissantes à une infection secondaire grâce à une accessibilité accrue à la
chromatine, à une production rapide de cytokines et à un potentiel prolifératif (Mueller et al., 2013). Les
populations de lymphocytes T CD8+ mémoire se reconnaissent rapidement lors de l'expansion clonale à la
suite de l'activation du TCR car elles expriment fortement le récepteur à l'IL-7 (CD127) et faiblement KLRG1.
C'est l'inverse des lymphocytes T CD8+ qui vont mourir après la fin de la réponse primaire et qui dépendent
d'IL-15 ce qui est insuffisant pour leur survie à long terme (Kaech et al., 2003). Le choix entre lymphocytes
T mémoire ou "éphémères" dépend de la quantité d'IL-12 reçue durant leur développement ce qui se traduit
par une expression plus ou moins forte du facteur de transcription T-bet , codé par le gène Tbx21 (fortement
exprimé dans les lymphocytes T éphémères et faiblement exprimé dans les lymphocytes T mémoire) (Joshi
et al., 2007).
**Figure 7-324. T-bet (Tbx21) est nécessaire à la
formation des lymphocytes T CD8+ éphémères et
s'oppose à la formation des lymphocytes T CD8+
mémoires. Des souris sauvages (WT) ou Tbx21−/− ont
été infectées par le virus LCMV et analysées 7 à 8
jours plus tard pour l'expression de IL-7R et KLRG1
sur les cellules T CD8+ spécifiques de GP33-41, un
antigène de LCMV. Les lymphocytes T CD8+
éphémères (faible expression de IL-7R et forte
expression de KLRG1) sont majoritaires chez les
souris sauvages mais minoritaires chez les souris
Tbx21-/-. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761307003718

Les populations de lymphocytes T mémoire comprennent les lymphocytes T à mémoire effectrice (TEM) et
à mémoire centrale (TCM) qui recirculent dans le sang et à travers les tissus (Masopust et Soerens, 2019).
Les cellules T mémoire résidentes dans les tissus (TRM) se forment également dans de nombreux organes,
notamment la peau, les poumons, les intestins, le foie et le cerveau (Mora-Buch et Bromley, 2020).
Contrairement aux cellules TEM et TCM, les cellules TRM résident pendant de longues périodes, souvent de
634
façon permanente, dans les tissus (Masopust et Soerens, 2019). Les cellules TRM expriment des marqueurs
de surface distincts, dont CD69 et, dans des tissus tels que la peau, l'intégrine CD103 (ou intégrine αEβ7).
Les cellules TRM diminuent l'expression du récepteur S1PR1 et du récepteur CCR7 qui sont nécessaires
pour que les cellules sortent des tissus via les vaisseaux lymphatiques ce qui explique leur longue résidence
dans les tissus (Casey et al., 2012; Mackay et al., 2013; Skon et al., 2013). Les cellules TRM peuvent fournir
une protection supérieure par rapport au pool circulant de cellules T mémoire (Jiang et al., 2012; Shin et
Iwasaki, 2012) et peuvent favoriser un état antiviral par production rapide de cytokines et de chimiokines
qui recrutent des cellules immunitaires dans la circulation (Ariotti et al., 2014; Schenkel et al., 2014). La
formation et le maintien des cellules TRM dans les tissus nécessitent une combinaison de signaux,
notamment l'interleukine-15 (IL-15) et le facteur de croissance TGF-β (Hirai et al., 2021 ; Schenkel et al.,
2016 ; Zhang et Bevan, 2013).

A l'inverse, des facteurs contrôlant la chromatine inhibent cette différenciation en lymphocytes T mémoire
pour ne pas qu'elle se fasse trop précocement, avant la rencontre avec l'antigène. L'histone
méthyltransférase DOT1L qui permet la triple méthylation de H3K79 (une marque épigénétique
d'activation de la transcription) est nécessaire à ce contrôle (Kwesi-Maliepaard et al., 2020).

**Figure 7-325. Des modifications épigénétiques (méthylations sur H3K79) sont nécessaires pour éviter une
différenciation trop précoce des lymphocytes T CD8+ en lymphocytes mémoire. L'analyse des sous-groupes de
lymphocytes T CD8 + dans la rate par FACS révèle que les souris Dot1L-/- (KO) présentent une perte importante de
lymphocytes T CD8 + naïfs (CD44-/CD62L+) et un gain massif du phénotype CD44 +/CD62L+, qui caractérise les
lymphocytes T à mémoire centrale (TCM). Les souris Dot1L+/- (Het) ont un phénotype proche des souris sauvages
(WT). Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1920372117

Le développement des lymphocytes T à proximité de l'intestin peut être influencé par le microbiote
intestinal (Smith et Garrett, 2011). Bacteroides fragilis est un symbiote Gram négatif qui habite le tractus
intestinal inférieur et colonise environ la moitié des humains. La monocolonisation des souris sans bactéries
(GF) avec B. fragilis induit une expansion globale des lymphocytes T CD4 et une augmentation du nombre
de cellules Th1 à des niveaux similaires à ceux des souris élevées normalement. L'effet de B. fragilis est
entièrement dépendant d'un polysaccharide capsulaire zwitterionique, le polysaccharide A (PSA)
(Mazmanian et al., 2005). L'exposition au PSA in vivo et in vitro est suffisante pour induire l'expansion des
populations Th1 et la production de cytokines et les souris GF colonisées par B. fragilis dépourvues de PSA
ne réussissent pas à corriger leur déséquilibre Th1/Th2. Les acides gras à courte chaîne telles l'acétate, le
butyrate et le propionate produits par le métabolisme des microbiotes influence également le
développement du système immunitaire intestinal.

635
 ***Figure 7-326. Des membres du microbiote
intestinal régulent le développement des sous-
ensembles de lymphocytes T CD4 de la lamina
propria. Bacteroides fragilis, des bactéries
filamenteuses segmentées (SFB) et Clostridium
spp. influencent les sous-ensembles de
lymphocytes T CD4 de la lamina propria. Les
cellules brunes sont des cellules dendritiques.
Elles sont stimulées par le polysaccharide A de B.
fragilis (PSA) via le récepteur TLR2 à produire
TGF2 qui favorise la différenciation de
lymphocytes Treg. Source :
frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2011.00111/full

Trois acides gras à chaîne courte, l'acétate, le propionate et le butyrate (qui sont les principaux sous-
produits générés par la fermentation bactérienne de polysaccharides d'origine végétale (tels que la
cellulose) par le microbiote intestinal) régulent l'homéostasie des lymphocytes Treg dans le colon. Le
nombre de Treg et leur sécrétion d'IL-10 est augmentée après un traitement in vitro avec les trois acides
gras à chaîne courte ou après un traitement in vivo après que les bactéries Gram+ aient été préalablement
détruites par un traitement antibiotique. L'effet des acides gras sur les lymphocytes Treg est médiée par le
récepteur GPCR43 (Smith et al., 2013).

**Figure 7-327. Effet des acides gras à courtes chaines sur la population de lymphocytes Treg dans le colon. Analyse
FACS des cellules CD4+ et Foxp3+ (lymphocytes Treg) dans la paroi du colon de souris avec un microbiote intestinal
normal (SPF) ou sans microbiote intestinal (Germ-free), supplémenté ou non dans leur boisson par des acides gras
à courtes chaines (SCFA) (P= propionate, A = acétate, B = butyrate et mix = un mélange des 3). Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3807819/

Les lymphocytes B
Les lymphocytes B sont responsables de l'immunité humorale et de la production des anticorps. Ils
présentent à leur membrane plasmique des récepteurs BCR spécifiques d'un antigène. Chaque
lymphocyte B, produit dans la moelle osseuse, est spécifique à un antigène. La diversité énorme de
ce répertoire à l'échelle d'un individu ne peut être codé directement par le génome mais résulte de
recombinaisons génétiques dans chaque clone de lymphocytes B qui fait jouer une combinaison
d'éléments génétiques. Ces recombinaisons sont qualifiées de somatiques pour les distinguer des
recombinaisons dans les cellules germinales lors de la méiose.

636
 *Figure 7-328. Structure du récepteur BCR à la surface
d'un lymphocyte B. Un récepteur BCR est composé d'un
complexe avec CD79 et une immunoglobuline
(anticorps) sous sa forme transmembranaire. La
membrane plasmique est indiquée par les
phospholipides verts. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/B-
cell_receptor#/media/File:Bcellreceptor.svg

Les séquences codant le domaine variable (V), le domaine de diversité (D) et le domaine de jonction
(J) des anticorps sont représentées en de multiples exemplaires dans le génome et des
réarrangements génomiques permettent de former une combinaison unique à chaque clone de
lymphocyte au cours de leur maturation.
*Figure 7-329. Recombinaison VDJ à l'origine de la diversité
des anticorps (et par extension des BCR). Dans les
lymphocytes B en développement, la première
recombinaison à avoir lieu se fait entre un segment D et un
segment J d’un locus de chaîne lourde (les anticorps sont
formés de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères).
Tout le fragment d’ADN situé entre ces deux segments est
éliminé. Cette recombinaison D-J est suivie par la jonction
d’un segment V venant d’un locus en amont de la séquence
DJ nouvellement formée. Cette fois encore, tout le fragment
situé auparavant entre le segment V et le DJ est éliminé du
génome. L'exon codant le domaine constant (C) de
l'anticorps est adjoint à l'ARNm lors de l'épissage. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Recombinaison_V(D)J#/media/Fichier:VDJ_recombination.png

Les premières étapes de la recombinaison VDJ sont pris en charge par les recombinases RAG1 et RAG2 qui
sont spécifiques des lymphocytes. Elles reconnaissent des séquences spécifiques à la fin de chaque segment
V appelées RSS pour Recombination Signal Sequence.

Une fois qu'une recombinaison aboutit à la production d'une protéine fonctionnelle, le processus est arrêté
sur l'autre chromosome homologue. Un seul allèle fonctionnel est donc présent par clone de lymphocytes
et donc un seul antigène pourra être reconnu (malgré la diploïdie). C'est le phénomène d'exclusion allélique.

En présence d'antigènes et suffisamment stimulés par d'autres signaux, les lymphocytes B sont
activés, prolifèrent et donnent naissance à des plasmocytes producteurs d'anticorps et à des
lymphocytes B mémoire.

637
 **Figure 7-330. Voies de signalisation activées par BCR en présence de l'antigène correspondant. La liaison à
l'antigène provoque rapidement l'agrégation des BCR qui activent les kinases de la famille Src, notamment Blk, LYN
et FYN et les tyrosine kinases SYK et BTK. Cela catalyse la formation d'un « signalosome » qui se compose des tyrosine
kinases susmentionnées, du BCR et des protéines adaptatrices, par exemple, BLNK et CD19, ainsi que des molécules
de signalisation, telles que P13K, PLCy2 et VAV. Cela aboutit à des modifications du cytosquelette et à l'activation de
facteurs de transcription tels que NFAT et NF-kB. Source : https://en.wikipedia.org/wiki/B-
cell_receptor#/media/File:B_cell_signalling.png

Signalons que le virus d'Epstein-Barr (qui infecte 95% de la population et qui peut causer la mononucléose)
et qui reste dormant dans les lymphocytes B mémoire stimule la survie de ces lymphocytes grâce à la
protéine d'origine virale LMP2A qui mime un BCR activé et stimule les voies de signalisation ERK/MAPK et
PI3K (Merchant et al., 2001, Portis et al., 2004, Fish et al., 2020). LMP2A bloque cependant les autres voies
activées par BCR.

Dans la moelle osseuse, l'édition des récepteurs et la suppression clonale empêchent les cellules B
immatures exprimant les récepteurs des cellules B (BCR) réactifs aux auto-antigènes locaux et
systémiques de poursuivre leur développement. Cela constitue le point de contrôle central de la
tolérance (Nemazee, 2017). L'étendue réduite des antigènes contre lesquels les cellules B en
développement sont testées dans la moelle osseuse conduit à la survie et à la libération vers la périphérie
de proportions élevées (≈20%) de cellules B matures, autoréactives et naïves (Wardemann et al., 2003).
L'absence d'interaction avec des lymphocytes T auxiliaires apparentés et/ou la suppression par les
lymphocytes T régulatrices FOXP3 + CD4 + (T reg) empêche l'activation de ces lymphocytes B naïves auto-
réactives à la périphérie. Ce processus est connu sous le nom de « modèle à deux signaux » (Bretscher et
Cohn, 1970). La fréquence des lymphocytes B naïfs autoréactifs est aussi limitée par des mécanismes
cellulaires intrinsèques induits par l'exposition des lymphocytes B aux autoantigènes conduisant à une non-
réactivité fonctionnelle (anergie).

L'activation des lymphocytes B naïfs avec un antigène apparenté combiné aux signaux des
lymphocytes folliculaires auxiliaires (Tfh) CD4+ conduit au développement de plasmablastes qui
sécrètent des anticorps, de cellules mémoire et de cellules B du centre germinatif (GC).

638
 *Figure 7-331. Activation d'un lymphocyte B par un lymphocyte T helper (ou auxiliaire). Lorsque les BCR d'un
lymphocyte B reconnaissent un antigène, celui-ci est internalisé et des fragments en sont présentés sur une molécule
de CMHII. Celle-ci interagit avec CD4 et TCR présents à la surface des lymphocytes T auxiliaires. Ces signaux
provoquent l'émission de cytokines qui agissent de manière paracrine en retour sur le lymphocyte B (IL2, IL4 et IL5)
et l'activent. En parallèle, CD40L est exhibé à la surface du lymphocyte auxiliaire et contribue à l'activation du
lymphocyte B via le récepteur CD40. Source : https://en.wikipedia.org/wiki/T_helper_cell#/media/File:T-
dependent_B_cell_activation.png

*Figure 7-332. Voies de signalisation activées par

l'interaction CD40L/CD40 dans les lymphocytes B. Le
récepteur CD40 activé recrute des protéines de la famille
TRAF qui, à leur tour, activent la voie NF-κB (qui consiste
essentiellement en la dégradation de l'inhibiteur de NF-
κB appelé I-κB permettant à NF-κB d'entrer dans le
noyau et de contrôler la transcription). Une voie menant
à ERK et à p38MAPK est aussi activée et joue un rôle dans
l'activation de la prolifération des lymphocytes B et de la
commutation de classe (voir plus loin), notamment vers
les IgE. La voie de la PI3K est aussi activée et stimule la
survie, la prolifération et la différenciation des
lymphocytes via Akt, mTOR et FOXO1. Source :
https://www.mdpi.com/2077-0383/9/11/3653

En règle générale, la première vague d'anticorps déclenchée contre un agent pathogène se compose
d'immunoglobulines produites par les plasmablastes, des cellules à courte durée de vie. Il n'y a dans ce cas
pas eu d'hypermutations somatiques et les immunoglobulines sont de faible affinité pour les antigènes
(Elsner et Shlomchik, 2020). Les immunoglobulines M (IgM) et les cellules mémoire à longue durée de vie
à commutation de classe apparaissent également aux premiers stades de la réponse (Good-Jacobson et
Tarlinton, 2012; Weisel et al., 2016; Pritchard et Pepper, 2018). En parallèle, les lymphocytes B du centre
germinatif se différencient en des sous-ensembles de lymphocytes B à prolifération rapide et forment des
amas de cellules au centre du follicule ganglionnaire 5 à 7 jours après l'exposition à la stimulation
immunitaire.

639
Les centres germinatifs (GC) de la rate ou des ganglions lymphatiques ou des plaques de Peyer (dans
la paroi intestinale) sont des lieux essentiels dans la production de plasmocytes, les lymphocytes B
producteurs d'anticorps à haute affinité et à longue durée de vie et de lymphocytes B mémoire qui
peuvent ensuite rester des années voire des décennies en quiescence avant d'être stimulés par une
nouvelle rencontre avec l'antigène (cela constitue alors la réponse immunitaire secondaire). La
maturation d'affinité des lymphocytes B se produit par l'acquisition aléatoire d'hypermutations
somatiques dans leurs BCR. L'enzyme cytidine désaminase (AID) induite par l'activation régule ce
processus (Muramatsu et al., 2000; Revy et al., 2000). Indépendamment de son activité mutationnelle, AID
est également essentielle pour la commutation de classe d'immunoglobuline par recombinaison (CSR)
(Shinkura et al., 2004). En effet, les lymphocytes B expriment d'abord des immunoglobulines (Ig) de
type M liés à la membrane, mais d'autres types d'Ig sont plus efficaces pour neutraliser les
pathogènes, notamment des formes secrétées. Il s'agit alors de changer de types d'Ig sans changer
le site de reconnaissance spécifique de l'antigène.

**Figure 7-333. L'enzyme AID est nécessaire à la commutation des classes d'immunoglobuline (Ig) dans les
lymphocytes B. Les niveaux d'Ig des surnageants de culture de cellules spléniques de souris de la même portée âgées
de 5 semaines avec les génotypes AID+/+, AID+/− ou AID−/− ont été mesurés après culture pendant 7 jours en présence
de LPS (cercle fermé), LPS et IL -4 (cercle vide), ou LPS et TGFβ (carré vide). Les taux d'Ig inférieurs à 0,01 μg/ml ont
été tracés sous les lignes en bas. Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(00)00078-7

*Figure 7-334. La commutation de classe d'anticorps dans

les lymphocytes B activés est un processus par lequel la
partie variable des anticorps produits reste la même mais
la partie constante est modifiée (sur le schéma, exemple
du passage de la production d'IgM à la production d'IgG1).
Les nouveaux anticorps produits reconnaissent ainsi
toujours le même antigène mais ils ont des fonctions
différentes. C'est provoqué par des recombinaisons
génétiques, un cas exceptionnel de différenciation par
modification du génome et perte d'information génétique.
Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Immunoglobulin_class_switching#/media/File:Class_switch_recombination.png

Les hypermutations somatiques peuvent entraîner une baisse de l'affinité pour l'antigène et cela aboutit à
des lymphocytes B qui ne vont plus être stimulés et qui meurent par apoptose. Il peut aussi y avoir
émergence d'une auto-réactivité (Tiller et al., 2007), qui est contrôlée par apoptose par un point de contrôle
de tolérance périphérique supplémentaire qui évite la sélection de cellules auto-réactives. L'inhibition de
l'apoptose dépendante de Bax et Bak conduit à une auto-immunité avec développement d'auto-anticorps
(Takeuchi et al., 2005).

640
 **Figure 7-335. La délétion induite des gènes
codant les protéines pro-apoptotiques Bax et Bak
dans les lymphocytes B en maturation entraîne le
développement d'une maladie auto-immune. (A)
Accumulation inductible de globules blancs
périphériques après injection de poly(I:C) chez
des souris MxCre+Baxfl/–Bak–/– (le gène Bak est
déjà délété ainsi qu'un allèle de Bax et l'autre
allèle de Bak est éliminé par la recombinase Cre
dont l'expression est induite par polyIC
uniquement dans les lymphocytes B en
développement). (B) Mortalité chez les souris
MxCre+Baxfl/–Bak–/– (n = 19) et les compagnons
de portée témoins (n = 20) après injection de
polyIC. (C) Test de production d'auto-anticorps.
Des sérums ont été prélevés sur des souris
témoins et MxCre+Baxfl/–Bak–/– injectés par
polyIC à l'âge de 30 semaines. Les niveaux
d'anticorps anti-nucléaires (ANA) et d'anticorps
anti-ADN double brin (dsDNA) ont été
déterminés par ELISA. (D) Analyse histologique
du cortex rénal des souris témoins et
MxCre+Baxfl/–Bak–/– injectées avec polyIC
(coloration hématoxyline/éosine). Les souris
mutantes souffrent de glomérulonéphrite aïgue
et également d'arthrite. Source :
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.0504783102

Enfin, la sélection des cellules B avec des BCR de haute affinité nécessite une migration alternée de la zone
sombre (DZ) vers la zone claire (LZ) du centre germinatif régulée par une série de processus cellulaires
dépendants de l'actine (chimiotactisme, endocytose des BCR, formation de synapses immunitaires,
recyclage du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II). L'importance de ces processus est
mise en évidence par le nombre croissant de déficiences génétiques liées à l'actine associées à une sélection
défectueuse des lymphocytes B dans les centres germinatifs (He et Westerberg, 2019).

*Figure 7-336. Maturation des lymphocytes B dans les centres germinatifs. En haut à gauche : Schéma de la structure
des ganglions lymphatiques. En bas à gauche : Immunohistochimie d'un centre germinatif avec des anticorps
reconnaissant. GL7 (rouge, exprimé dans les lymphocytes B à différents degrés de maturité), CD21/35 (vert, exprimé
par les cellules dendritiques folliculaires (FDC)) et B220 (bleu, exprimé dans les lymphocytes B matures). DZ = zone
sombre; LZ = zone clair. Droite : Les lymphocytes B activés par l'antigène rencontrent les lymphocytes T helper et
pénètrent dans le centre germinatif. Les lymphocytes B dans la zone sombre expriment AID et subissent une
hypermutation somatique. Les clones de lymphocytes B qui ont muté avec succès leur BCR migrent vers la zone
claire, capturent les antigènes déposés à la surface des FDC (cellules dendriques folliculaires) et présentent
l'antigène aux lymphocytes T helper folliculaires (Tfh). Les clones de lymphocytes B sélectionnés positivement

641
 peuvent se différencier en plasmocytes, en cellules mémoire ou migrer vers la zone sombre pour d'autres mutations
et sélections. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.00296/full

Parmi ces troubles figure le syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), une maladie rare liée à l'X présentant une
thrombocytopénie et une susceptibilité variable à l'eczéma, aux infections récurrentes, à l'auto-immunité
et au cancer (Candotti, 2018). Le WAS est causé par une déficience génétique de la protéine WAS (WASp),
le membre fondateur d'une famille de facteurs favorisant la nucléation de l'actine qui traduisent les signaux
de surface en polymérisation de l'actine via le complexe Arp2/3 lié à l'actine (Kelly et al., 2006).

La contribution spécifique des lymphocytes B à l'auto-immunité dans WAS a été étudiée avec des modèles
murins knock-out conditionnels précoces dans lesquels le gène WASp est supprimé dans les précurseurs
des lymphocytes B de la moelle osseuse (Recher et al., 2012). Ces expériences ont montré que les défauts
intrinsèques des lymphocytes B déficientes en WASp entraînent le développement d'auto-anticorps et d'une
auto-immunité qui sont en corrélation avec une fréquence plus élevée de développement incontrôlé dans
les centres germinatifs (Recher et al., 2012; Becker-Herman et al., 2011).

**Figure 7-337. Les cellules B du centre germinatif de souris défectueuses en WASp sont suffisantes pour induire
l'auto-immunité. Les cellules B du centre germinal défectueuses pour WASp montrent un taux d'apoptose plus faible.
Les cellules B défectueuses en WASp acquièrent une auto-réactivité lors de la réaction du centre germinal. Source :
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)00207-8

Les structures du centre germinatif persistent pendant plusieurs semaines à plusieurs mois, selon la nature
de l'agent pathogène ou de la vaccination, et génèrent une mémoire de longue durée et des plasmocytes qui
portent généralement des immunoglobulines issues des hypermutations somatiques et de haute affinité
pour les antigènes (Victora et Nussenzweig, 2012). La régulation de la dichotomie développementale entre
les cellules B des centres germinatifs et les cellules sécrétant des anticorps est largement étudiée (Tellier et
Nutt, 2019).

Les lymphocytes B peuvent maturer et proliférer indépendamment des lymphocytes Th. Dans ce cas, un
acteur essentiel est le récepteur TACI qui est un membre de la superfamille des récepteurs du TNF qui lie
les ligands BAFF et APRIL (un ligand induisant la prolifération) (Bodmer et al., 2002, Mackay et Schneider,
2009). Il est exprimé par les lymphocytes B humains activés, les lymphocytes B de la zone marginale, les
lymphocytes B à mémoire commutée et les plasmocytes. Après la liaison des ligands, le domaine
intracellulaire de TACI interagit avec des molécules de signalisation qui aboutissent à activer NFAT et NF-
642
kB. Cela induit une recombinaison et une différenciation par commutation de classe dans les plasmocytes
(Salzer et al., 2005). Des mutations pertes de fonction dans le gène codant TACI chez des patients humains
provoquent des immunodéficiences, tandis qu'une surexpression du ligand BAFF est à l'origine de certaines
de lupus érythémateux systémique, une maladie auto-immune (Stohl et al., 2003). TACI peut aussi être clivé
par ADAM10, libérant une forme de récepteur leurre soluble (sTACI) qui peut neutraliser les ligands BAFF
et APRIL (Hoffmann et al., 2015). Le nombre élevé de lymphocytes B chez les souris Taci-/- peut ainsi
s'expliquer par le manque d'activité de leurre sTACI (von Bülow et al., 2001). Ainsi, en régulant la
disponibilité et la force des signaux de survie induits par BAFF, TACI peut contrôler la taille des populations
de lymphocytes B.

FOCUS SUR LA SYNAPSE IMMUNITAIRE

Les synapses immunitaires peuvent mettre en jeu des lymphocytes B ou des lymphocytes T. Ici, nous nous
concentrons sur celles impliquant des lymphocytes B.

L'interaction du récepteur des cellules B (BCR) avec l'antigène apparenté présenté par une cellule
présentatrice d'antigène (CPA) déclenche des changements importants dans la physiologie des
cellules B qui favorisent leur activation, la formation de la synapse immunitaire (SI) et les fonctions
effectrices des cellules B (Harwood et Batista, 2011). La SI permet l'échange d'informations entre les deux
cellules par le biais d'événements exocytaires et endocytaires étroitement régulés (Griffiths et al., 2010). La
signalisation et le trafic au niveau de la SI nécessitent des réarrangements profonds des microfilaments
d'actine et des microtubules. L'actine contrôle l'organisation des microclusters contenant des récepteurs
d'antigènes ce qui permet la coordination entre le trafic et la signalisation et aide en outre à générer les
forces mécaniques qui dépendent de la myosine II (Treanor et al., 2011; Kumari et al., 2019; Bolger-Munro
et al., 2019).

***Figure 7-338. Les lymphocytes B génèrent des protrusions dynamiques à base d'actine en réponse aux antigènes
liées aux cellules présentatrices (APC) et forment un cluster de récepteurs attachés à leur antigène. (A) Schéma du
système lymphocyte B-APC. Les cellules COS-7 exprimant un antigène (Ag) mHEL-HaloTag (lysozyme d'œuf)
agissent comme des APC pour les lymphocytes B exprimant des BCR spécifiques de l'antigène. (B) Des lymphocytes
B ont été ajoutées à des cellules COS-7 exprimant mHEL-HaloTag et le site de contact lymphocyte B-APC a été imagé
toutes les 12 s pendant 14 min à l'aide de la microscopie spinning disk (disque tournant). Les pointes de flèches
jaunes indiquent les microclusters BCR-Ag qui se sont formés loin du centre du site de contact. Les temps sont
indiqués en min:s. (C) Des lymphocytes B exprimant F-Tractin-GFP (une protéine qui se fixe à l'actine couplée à la
GFP, vert) ont été ajoutées à des APC COS-7 exprimant mHEL-HaloTag (rouge) et le site de contact cellule B-APC a
été pris en image toutes les 6,6 s pendant 4 min. Les pointes de flèches de différentes couleurs dans les panneaux
supérieurs représentent les protrusions de la membrane qui ont été étendues ou rétractées. Les cercles jaunes dans
les panneaux inférieurs indiquent des microclusters BCR-Ag (rouges) qui se sont formés sur de nouvelles
protrusions d'actine. Source : https://elifesciences.org/articles/44574

643
La SI active un assemblage dynamique des microfilaments initié par la formation d'un réseau d'actine
ramifié dépendant du complexe Arp2/3 au bord externe de la SI (Wang et Hammer, 2020; Song et al., 2014).
Ce réseau d'actine de type lamellipode entraîne l'étalement de la cellule B sur la surface recouverte
d'antigène, favorisant ainsi les interactions BCR/antigène. Un flux centripète ou rétrograde d'actine
entraîne ensuite une clusterisation des complexes BCR/ antigène vers le centre de la SI (Mattila et al., 2016).
Ce processus de centralisation de l'antigène est nécessaire pour une signalisation BCR robuste et est
considéré comme une condition préalable à l'internalisation de l'antigène par les cellules B folliculaires
(Yuseff et al., 2013; Yuseff et Lennon-Duménil, 2015). L'intégrine des lymphocytes B, LFA-1, qui lie la
molécule d'adhésion ICAM-1 présente à la surface des APC sert de co-signal de stimulation (Carrasco et al.,
2004).

Quant à eux, les microtubules contrôlent le recrutement des vésicules au niveau de la synapse immunitaire.
Cela repose sur la réorientation du centrosome, conduisant à la rupture de la symétrie des lymphocytes et
à l'acquisition d'un état cellulaire polarisé (Yuseff et al., 2013).

Les cellules présentatrices d'antigène (APC) telles que les lymphocytes B expriment CD74 qui fonctionne de
manière intracellulaire comme un chaperon pour les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité
(MHC) de classe II (Stumptner-Cuvelette et Benaroch, 2002). Une petite proportion de CD74 subit des
modifications post-traductionnelles par l'ajout de sulfate de chondroïtine (CD74-CS), et cette forme de CD74
est dirigée vers la membrane plasmique (Naujokas et al., 1993). Les ligands naturels du CD74 sont des
membres de la superfamille des cytokines du facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF)
(Leng et al., 2003), qui se lient au CD74 pour induire la formation d'un complexe avec CD44. Ce complexe
de récepteurs est essentiel pour l'initiation d'une cascade de signalisation nécessaire à la régulation du
maintien des lymphocytes B (Gore et al., 2008; Shi et al., 2006) via l'activation de la voie PI3K/AKT. Le
complexe est internalisé dans les compartiments endocytaires où il est clivé, libérant le fragment de
domaine intracellulaire CD74 (CD74-ICD). CD74-ICD se transloque dans le noyau, où il induit la
phosphorylation du domaine d'activation p65 du facteur nucléaire κB (NF-κB) et, avec son co-activateur,
augmente l'expression de TAp63.
**Figure 7-339. Activation de NF-κB par MIF via CD74.
L'activation de NF-κB a été analysée par dosage de la
luciférase dont l'expression est dépendante d'un
promoteur activé par NF-κB. Des cellules HEK293
cellules ont été transfectées avec un vecteur permettant
d'exprimer CD74 ou avec un vecteur vide (Empty). Les
cellules ont ensuite été incubées avec ou sans MIF, et en
présence ou non d'ISO-1, un inhibiteur de MIF. Après
stimulation, les cellules ont été lysées et l'activation de
NF-κB a été déterminée par l'activité luciférase
résultante. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-
9258(20)55528-2/fulltext

Ces événements cellulaires induisent une augmentation des niveaux d'expression de BCL-2 (protéine anti-
apoptotique) et entraînent une régulation transcriptionnelle des gènes qui contrôlent la prolifération et la
survie des cellules B (Gore et al., 2008; Lantner et al., 2007; Starlets et al., 2006).

Les leucémies et les myélomes

La leucémie est le terme désignant les tumeurs des cellules sanguines. Il existe de nombreux types de
leucémie, qui sont classés comme aigus ou chroniques, et selon le type de cellules anormales produites, et
selon l'âge d'apparitions des symptômes (enfant ou adulte). En général, la leucémie se caractérise par une
surproduction de globules blancs immatures. Ces cellules ne peuvent pas remplir leurs fonctions normales,
et le patient devient très sensible aux infections. Comme une plus grande proportion de cellules et de
nutriments sont utilisés par les cellules tumorales, la production des autres cellules sanguines diminue
entraînant un déséquilibre dans l'hématopoïèse. Une anémie sévère est une conséquence de la diminution
de la production de globules rouges, et la tendance à l'hémorragie est le résultat de la diminution du nombre
de plaquettes.
644
La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est la leucémie aiguë la plus courante chez l'adulte et survient de plus en
plus avec l'âge avec des conséquences dévastatrices. La LMA est initiée et entretenue par un petit nombre
de cellules souches leucémiques (LSC) qui s'auto-renouvellent. La thérapie conventionnelle peut détruire la
majeure partie des cellules leucémiques, mais ne parvient pas à éliminer les LSC, qui peuvent initier à
nouveau une tumeur après une période de latence. Les chercheurs souhaitent donc identifier et cibler des
molécules-clés qui régulent spécifiquement l'auto-renouvellement des cellules souches des LMA.

Les myélomes dits multiples sont causés par une prolifération incontrôlée des lymphocytes B produisant
des anticorps (les plasmocytes). Ils ne sont classiquement pas considérés comme faisant partie des
leucémies, car les cellules proliférantes gardent des caractères partiellement différenciés. On peut observer
une immunoglobulémie élevée d'anticorps monoclonaux correspondant au clone dont l'amplification n'est
plus contrôlée. Par rétrocontrôle, la production des autres cellules sanguines est partiellement inhibée,
pouvant causer des anémies et une protection immunitaire moins efficace contre des antigènes non
reconnus par le clone affecté. Ces cellules tumorales secrètent aussi des molécules (notamment IL6) qui
stimulent les ostéoclastes qui déminéralisent la matrice extracellulaire osseuse qui provoque des douleurs
et des fragilités osseuses, ainsi qu'une hypercalcémie. L'exposition à des radiations ou à des pesticides
comme le chlordecone (utilisé pour protéger les bananes dans les Antilles) est un facteur à risque important.
Des études épigénétiques ont montré que les cellules tumorales ont un profil rappelant les cellules souches
indifférenciées plutôt que des cellules différenciées telles que des plasmocytes normaux (Agirre et al.,
2015). Les patients ont souvent des translocations impliquant des fragments du chromosome 14.

La métamorphose chez les Hexapodes et les Amphibiens

La métamorphose correspond à un changement radical de mode et de milieu de vie des animaux

concernés avec parfois des changements importants du plan d'organisation. Par exemple, les
ascidies perdent leur corde et une partie de leur système nerveux. Chez les Echinodermes, la larve
pluteus à symétrie bilatérale devient un adulte à symétrie pentaradiée. Il s'agit d'exemples
frappants où le même génome est capable d'organiser la morphogenèse de deux organismes aux
caractéristiques assez différentes.

Dans ce chapitre, nous allons nous concentrer sur les Insectes et les Amphibiens où la métamorphose a été
particulièrement bien étudiée.

La métamorphose chez les Hexapodes

Nous nous concentrerons sur les Insectes holométaboles qui, après plusieurs stades larvaires
forment une nymphe qui est le stade où se déroule la métamorphose. Après une dernière mue dite
imaginale, l'adulte (ou imago) est capable de se reproduire. Les larves et les adultes ont souvent des
morphologies très différentes avec des modes et des milieux de vie également très différents.
*Figure 7-340. Morphologie d'une chenille
(Macroglossum stellatarum, Lépidoptère de la famille des
Sphingidés): 1, tête, 2, thorax, 3, abdomen, 4, segment, 5,
corne post-abdominale, 6, fausse patte, 7, stigmate, 8,
pattes, 9, pièces buccales (larvaires; les pièces buccales
adultes sont différentes). Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Chenille_(l%C3%A9pidopt%C3%A8re)#/media/Fichier:Caterpillar_morphology.svg

Voir une vidéo sur le cycle de vie du moustique (larves, nymphe, puis émergence de l'imago lors de la
mue imaginale) : https://youtu.be/d1CpWPDjVvU

645
Voir aussi Figure 1-5 le cycle de développement de la drosophile.

De très nombreuses structures sont remaniées lors de la métamorphose, des structures

disparaissent complètement et de nouvelles se développent.

*Figure 7-341 Modifications de l'appareil digestif au cours de la métamorphose de la drosophile. L'épithélium de

l'intestin larvaire dégénère complètement et est remplacé au cours de la période prénymphale et au début de la
phase pupale par des cellules adultes. Les précurseurs de l'intestin adulte (dessinés en bleu foncé ou rouge) sont
intégrés dans l'épithélium de l'intestin larvaire (dessinés en bleu clair ou rose). Ils peuvent déjà être identifiés aux
premiers stades larvaires. Au troisième stade larvaire, les précurseurs de l'intestin antérieur adulte sont concentrés
dans un anneau dit imaginal (imr) situé dans le proventricule (pv). Le pharynx est remplacé par des cellules des
disques imaginaux labiaux (id). Le conduit salivaire adulte (sd) et les glandes (sg) proviennent d'une paire d'anneaux
imaginaux (imr) entourant les extrémités proximales des glandes salivaires larvaires. L'intestin moyen est remplacé
par des histoblastes de l'intestin moyen (mhi) dispersés dans l'épithélium larvaire de l'intestin moyen (mg). Les
précurseurs de l'intestin postérieur adulte (hg) se trouvent dans un anneau imaginal situé à la jonction entre
l'intestin postérieur et l'intestin moyen des larves; l'intestin le plus postérieur est remplacé par des cellules
provenant du disque génital (gd). Les tubules de Malpighi larvaires (mp) persistent chez l'adulte. Source :
https://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/34.htm

➢ Disques imaginaux

Les disques imaginaux sont des structures qui se mettent en place au cours du développement
embryonnaire et qui restent internalisées durant la vie larvaire. Les disques imaginaux ne sont pas
forcément composés de cellules quiescentes et certains disques qui donnent de grandes structures comme
les pattes ou les ailes présentent une prolifération importante durant les stades larvaires.
*Figure 7-342. Disques imaginaux chez la larve de
drosophile (à gauche) et indications des structures
développées à partir d'eux chez la drosophile
adulte (à droite). Redessiné d'après Fristrom et al.,
1969.

Lors de la métamorphose, les disques imaginaux se développent en des structures externes

(éversion) typiquement adultes (antennes, yeux, pièces buccales, pattes, ailes, pièces génitales...).

Ce sont des structures aplaties formées de cellules épithéliales ectodermiques.

646
 *Figure 7-343. Coupe longitudinale de larve (chenille) de Lépidoptère montrant un disque imaginal d'aile. A =
cuticule; B = épiderme; C = disque imaginal d'aile; D = épithélium péripodial (ne participe pas à l'aile proprement
dite mais facilite son éversion lors de la métamorphose); E = hémolymphe. Source : http://collections-biologie.u-
bordeaux.fr/Fiches-lames/chenille-disque-alaire-x2.html

Le disque imaginal d'aile de la drosophile est un modèle classique de développement, notamment pour la
signalisation et pour le rôle des gènes Hox, tout particulièrement Ultrabithorax qui réprime le
développement du disque imaginal de l'aile dans le troisième segment thoracique et qui le transforme en
haltère chez les Diptères. Les axes de polarité des futures structures sont déjà mises en place dans les
disques imaginaux avant la métamorphose.
*Figure 7-344. Expression de protéines clés dans le
disque imaginal de l'aile de la drosophile. (A) L'aile
proprement dite dérive d'une population centrale de
cellules dans le disque imaginal de l'aile qui expriment
Vestigial (Vg, reconnu en rouge par
immunofluorescence), entouré de populations
concentriques de cellules à la base de l'aile. L'ADN est
reconnu par coloration Hoeschst. (B) Expression des
morphogènes Wingless (Wg, l'orthologue des Wnt des
vertébrés) et Decapentaplegic (Dpp, l'orthologue des
BMP des vertébrés). Dans la région de la future aile, ils
forment un patron d'expression en croix avec un
croisement dans la future région distale de l'aile. (C)
Expression de la DsRed sous le contrôle du promoteur
QE (pour Quadrant Enhancer) de Vg et expression de la
GFP sous le contrôle du promoteur BE (pour Boundary
Enhancer) de Vg. On voit ainsi que l'expression de
Vestigial dans ces deux régions complémentaires est
contrôlée par des éléments régulateurs différents. Dpp et
Wg activent le QE. Le BE est activé par la voie de
signalisation Notch. La signalisation Notch réprime le
QE. La croissance de l'aile proprement dite est assurée
par la prolifération quasi uniforme de la population de
cellules exprimant Vg dépendantes de QE (observée par
l'incorporation d'EdU pendant la phase S dans D,
turquoise). Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2018196117

Dans les disques imaginaux des ailes de drosophile, Hh est sécrété dans le compartiment postérieur (P) et
se propage vers le compartiment antérieur (A) (Capdevila et al., 1994 ; Tabata et Kornberg, 1994).

647
 *Figure 7-345. Trois disques imaginaux de pattes de la drosophile traités en immunohistochimie pour révéler la
présence d'Hedgehog. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Imaginal_disc#/media/File:Drosophila_imaginal_discs.jpg

La signalisation Hh ne se produit pas dans les cellules du compartiment P car elles n’expriment pas de
composants critiques de la voie Hh, tels que l’effecteur transcriptionnel Ci qui est l’orthologue des facteurs
de transcription Gli des Vertébrés (Eaton et Kornberg, 1990). En revanche, les cellules du compartiment A
peuvent recevoir et répondre à Hh mais sont incapables de produire Hh. Dans les cellules du compartiment
A situées à proximité de la source de production de ligands Hh à la frontière A/P, la signalisation Hh
déclenche l’activité de la voie et, par conséquent, une augmentation de la transcription des gènes cibles
(Ingham et al., 1991 ; Basler et Struhl, 1994 ; Capdevila et al., 1994 ; Tabata et Kornberg, 1994 ; Chen et
Struhl, 1996).

*Figure 7-346. La surexpression de Hedgehog dans la future région antérieure de l’aile dans les disques imaginaux
provoque une duplication en miroir. Grâce au système UAS-GAL4, l’expression de Hh a été mise indirectement via
GAL4 sous le contrôle du promoteur d’un gène exprimé dans la région antérieure (vers le haut). B est un
agrandissement d’une région de A. La numérotation correspond aux différentes veines. Source
: https://www.embopress.org/doi/epdf/10.1002/j.1460-2075.1994.tb06768.x

Lors de la métamorphose, on parle d'éversion des disques imaginaux, qui permet de déployer les structures
adultes.

648
 **Figure 7-347. Éversion du disque imaginal de l'aile chez la drosophile et rôle de la myosine-II. (a) Au troisième
stade larvaire, les cellules épithéliales cubiques (vert foncé, indiquant des niveaux très élevés de myosine II)
entourent les cellules centrales squameuses de l'épithélium (vert clair). (b) À la fin du troisième stade larvaire, les
cellules centrales commencent à s'étendre pour couvrir la plus grande surface créée après la saillie de la poche alaire.
(c) Au stade prépupe (juste avant la métamorphose), le disque imaginal perd complètement sa forme aplatie. Il y a
expansion des cellules centrales pour couvrir les faces frontale et latérale du disque alaire, en plus de la grande
surface ventrale de l'aile. (d) Le repliement du disque induit par la contraction des bandes de myosine II produit une
expansion supplémentaire des cellules centrales. (e) La dernière étape du dépliage coïncide avec l'expansion
maximale des cellules centrales et la contraction maximale des cellules très riches en myosine-II est maximale (vert
foncé). Source : https://www.nature.com/articles/ncomms2763

➢ Contrôle neurohormonal du déclenchement de la métamorphose

Chez les Insectes, les stades larvaires sont largement consacrés à la nutrition et les phases adultes sont
consacrés à la reproduction, quelquefois même exclusivement. La taille du dernier stade larvaire est donc
déterminante pour la taille de l'adulte, sachant aussi que celui-ci n'aura plus aucune mue. Les mécanismes
neuroendocriniens contrôlant la croissance ont donc un rôle important non seulement dans le
déclenchement des mues mais aussi dans le déclenchement de la métamorphose.

L'ecdysone est impliquée dans le contrôle des mues de manière générale (pas seulement la mue
nymphale). Elle est produite dans la glande prothoracique par une série de réactions médiées par une
oxygénase dite de Rieske appelée Neverland et des enzymes codées par la famille de gènes Halloween qui
comprend plusieurs cytochromes P450 et une déshydrogénase/réductase. Une fois libérée dans
l'hémolymphe, l'ecdysone est absorbée par plusieurs tissus périphériques, notamment l'intestin, le corps
adipeux et les tubules de Malphigi, où elle est convertie en l'hormone active 20-hydroxyecdysone par le
produit du gène shade qui code une enzyme à cytochrome P450 (Petryk et al., 2003). La 20-
hydroxyecdysone circulante induit alors une réponse génétique systémique dans plusieurs tissus en se liant
à un complexe du récepteur de l'ecdysone (EcR) et de l'ultraspiracle, tous deux membres de la famille des
récepteurs nucléaires.

**Figure 7-348. Synthèse de la 20-hydroxyecdysone.

Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC283497/#!po=5.00000

L'histoire de la découverte et de la caractérisation de l'ecdysone : En 1954, Peter Karlson et ses collègues

purifièrent 25 mg de cristaux d'ecdysone à partir de 500 kg (!) de pupes de vers à soie en utilisant le test
biologique Calliphora pour suivre l'activité de l'hormone (Butenandt et Karlson, 1954). Dans une série
d'expériences chimiques et d'analyse des cristaux, l'ecdysone a été caractérisée comme une hormone
stéroïde (Huber et Hoppe, 1965; Karlson, Hoffmeister, Hummel, Hocks, et Spiteller, 1965). La première
preuve que l'ecdysone a un rôle direct dans la régulation de l'expression des gènes était basée sur le
gonflement localisé (appelé puff) des chromosomes polytènes des glandes salivaires. Les puffs sont des
décondensations de la chromatine à des loci spécifiques sur ces chromosomes géants et correspondent à une 649
activité transcriptionnelle locale. En particulier, il a été constaté que certaines de ces puffs étaient induites
rapidement après l'ajout d'ecdysone aux glandes salivaires cultivées du moucheron Chironomus (Clever et
Karlson, 1960) et d'autres sont plus lents à apparaître (puffs tardifs en comparaison des puffs précoces). Un
traitement concomitant avec un inhibiteur de la synthèse protéique aboutit à l'absence des puffs tardifs mais
les puffs précoces se forment. Cela a amené la conclusion que l'ecdysone active d'abord l'expression d'une
première batterie de gènes et que leurs produits activent ensuite une seconde batterie.
Chez la drosophile, une seule impulsion d'ecdysone déclenche chacune des deux premières mues larvaires
(Warren et al., 2006). Au cours du stade terminal du troisième stade larvaire, trois impulsions de bas niveau
suivies d'un pic élevé d'ecdysone initient les changements physiologiques et comportementaux nécessaires
pour transformer une larve à la recherche de nourriture en une pupe immobile qui ne s'alimente plus. Bien
que les rôles des pics initiaux d'ecdysone de bas niveau ne soient pas complètement compris, le dernier pic
important déclenche la nymphose et le début de la métamorphose.

*Figure 7-349. Concentration 20-hydroxyecdysone au cours du troisième stade larvaire chez la drosophile. La
concentration de 20E a été déterminée dans le corps entier en utilisant RIA avec les antisérums SHO3 après
résolution de l'échantillon par RP-HPLC. Sgs3-GFP désigne le temps pendant lequel la protéine de fusion Sgs3-GFP
est d'abord exprimée de manière significative dans les glandes salivaires larvaires (repère temporel). W = début de
la phase d'errance (wandering) ; ~ 50 % WP = environ 50 % des animaux avaient formé des pupes blanches (WP)
44 heures après la mue. Des extraits de larves et de pupes à 44 heures ont été combinés pour cette analyse. (WP +
4), pré-pupes 4 h après formation de pupes blanches. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2613944/

Il existe un lien entre la taille/le poids de la larve et la sécrétion d'ecdysone car le franchissement d'un seuil
de poids aboutit à une mue avec un certain délai, même si on ne nourrit plus la larve après ce franchissement
(Edgar, 2006; Mirth et Riddiford, 2007; Mirth et Shingleton, 201). Le corps gras détecte les conditions
nutritionnelles (notamment le taux d'ATP et la concentration en acides aminés qui activent la voie TOR) et
les communique au système nerveux central (SNC) via un signal dérivé du corps gras (FDS). Ce FDS agit sur
les cellules neurosécrétoires pour réguler la production de peptides analogues à l'insuline de la drosophile
(dILP). Les dILP régulent à leur tour le taux de croissance et la production de l'hormone de mue stéroïde
ecdysone (E) par les cellules de la glande prothoracique. L'augmentation artificielle de dILP dans
l'hémolymphe provoque un pic d'ecdysone et une métamorphose précoce (Walkiewicz et Stern, 2009).

650
 **Figure 7-350. Facteurs et mécanismes moléculaires qui influencent la synthèse d'ecdysone et le moment de
l'atteinte du poids critique. De nombreuses voies sensibles à l'environnement agissent pour réguler la voie de
synthèse de l'ecdysone dans la glande prothoracique. Lorsqu'un signal environnemental est perturbé, une autre voie
peut intervenir et permettre la mue nymphale, mais avec un retard. Par exemple, affamer les larves avant qu'elles
n'atteignent un poids critique provoque un retard car la glande prothoracique doit compter sur d'autres intrants
pour initier la synthèse d'ecdysone. Cependant, une fois que la synthèse d'ecdysone a été initiée, elle est irréversible.
Ainsi, le poids critique représente un changement plutôt que le maintien d'un état. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2012.00049/full#B58

La production d'ecdysone par la glande prothoracique dépend de la maturation de ce tissu avec des cellules
qui doivent devenir polyploïdes grâce à des cycles d'endoréplication. Cette étape est dépendante d'une
histone déméthylase, KDM5, qui active (sans doute indirectement via des régulations de la transcription) la
voie de signalisation MAPK qui est nécessaire à la production d'ecdysone (Drelon et al., 2019).
**Figure 7-351. L'expression de KDM5 est nécessaire
dans la glande prothoracique pour la production
d'ecdystéroïdes. Les niveaux de 20-hydroxyecdysone
(20E) sont mesurés dans des larves après leur deuxième
mue de drosophiles sauvages (WT) ou mutantes perte-
de-fonction kdm5 dans tous les tissus (kdm5 est exprimé
dans la glande prothoracique mais aussi dans d'autres
tissus) (kdm5140). Dans certains de ces mutants, on a
réexprimé kdm5 sous le contrôle de différents
promoteurs (Ubi restaurant une expression ubiquitaire
et Mai60, spok restaurant une expression que dans la
glande prothoracique). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/24/dev182568/223064/The-histone-
demethylase-KDM5-controls

La production d'ecdysone par la glande prothoracique dépend aussi de la PTTH, l'hormone pro-
thoracicotrope, produite par des neurones du cerveau. Si son rôle est majeur dans des modèles de
Lépidoptères comme Manduca sexta, son rôle est moins marqué chez la drosophile où l'abolition de sa
sécrétion ne fait que retarder la métamorphose (Shimell et al., 2018).
**Figure 7-352. PTTH est nécessaire pour que la
métamorphose se déroule au moment normal du cycle de
développement chez la drosophile. L'abscisse représente la
durée en heure depuis la mue de la larve L1 et les ordonnées
le pourcentage de drosophile en train de se métamorphoser
(stade nymphal). La mutation ptth120F2A est une mutation
perte-de-fonction du gène codant la PTTH. ptth WT-attP2 code
une forme sauvage de la PTTH. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/6/dev159699/48902/Prothoracicotropic-
hormone-modulates-environmental

651
La production de la PTTH est dépendante de la photopériode ce qui permet d'ajuster la métamorphose au
rythme des saisons.

PTTH agit sur la production d'ecdysone en se liant à son récepteur Torso à la surface des cellules de la
glande prothoracique. Cela active la voie de signalisation Ras/Raf/ERK. Les dILP agissent en activant la voie
PI3K/ Akt. Akt stimule TOR via l'inhibition de TSC1/2 et TOR est aussi directement activé par les acides
aminés amenés par la nutrition dans la glande prothoracique (McBrayer et al., 2007). Il y a donc là une
boucle d'amplification. Toutes ces voies convergent vers une augmentation de l'expression des gènes
Halloween codant des enzymes de la voie de biosynthèse de l'ecdysone (Keightley, Lou et Smith, 1990; Niwa
et al., 2005; Yamanaka et al., 2007).

Les disques imaginaux sont des structures aplaties dispersées dans la larve et qui assurent la morphogenèse
des organes adultes durant la métamorphose. On sait que la lésion expérimentale de ces disques provoque
un retard de la métamorphose. Il y a donc un signal qui part des disques imaginaux et qui contrôle la
production d'ecdysone. Ce signal a été identifié comme dILP8 qui est un peptide apparenté à l'insuline qui,
contrairement aux autres dILP, inhibe la production d'ecdysone dans la glande prothoracique (Colombani
et al., 2012; Garelli et al., 2012). Il est produit par des disques imaginaux immatures ou qui n'ont pas encore
atteint une taille critique. Il n'agit sans doute pas directement sur la glande thoracique mais via l'inhibition
de la production de PTTH.

La 20-hydroxyecdysone agit sur ces cibles via un récepteur dimérique composé du récepteur à l'ecdysone
EcR et de Ultraspiracle. EcR tout seul ne peut pas activer l'expression de gènes en présence de son ligand
(Billas et al., 2003; Hu et al., 2003). Ultraspiracle est l'orthologue du récepteur RXR à l'acide rétinoïque des
Vertébrés. En présence de 20-hydroxyecdysone, EcR recrute la protéine NURF qui est capable de faire
glisser des nucléosomes le long de l'ADN et ainsi d'activer la transcription (Badenhorst et al., 2005).
**Figure 7-353. NURF est nécessaire à l'action de
l'ecdysone lors de la métamorphose. Nurf3012 est un
allèle perte-de-fonction du gène codant NURF qui
remodèle la chromatine. Les drosophiles homozygotes
pour cette mutation (mais pas hétérozygotes) ne sont
pas capables de former des pupes/nymphes et elles ne
sont pas capables d'activer l'expression du gène
rapporteur codant la GFP sous le contrôle du promoteur
de Sgs3 dans les glandes salivaires (Sgs3 est une cible
directe des récepteurs aux ecdystéroïdes). Source :
http://genesdev.cshlp.org/content/19/21/2540.full

BR-C, E74 et E75 sont des gènes cibles immédiats du dimère EcR/Ultraspiracle, tous codant des facteurs de
transcription. E74 permet de produire 2 isoformes qui partagent un même domaine ETS de fixation à l'ADN.
E74A est produit quand la concentration d'ecdysone est élevée et E74B est produit quand cette
concentration est moyenne ou faible. DHR3 et DHR4 sont aussi des cibles directes mais leur transcription
maximale nécessite la présence au moins d'une des 3 protéines précoces.

Le gène ftz-f1 code un récepteur nucléaire agissant dans la cascade de l'ecdysone et est orthologue au
facteur stéroïdogène 1 des vertébrés (SF-1). Son expression est activée par E75, DHR3 et DHR4. Deux
isoformes de protéines ont été décrites, αFTZ-F1 et βFTZ-F1 qui diffèrent par leur partie N-terminale et
sont générés par un site de transcription différent et un épissage alternatif (Lavorgna et al., 1991; Ueda et
al., 1990). Alors que αFTZ-F1 est fourni par la mère et joue un rôle essentiel dans l'embryogenèse, βFTZ-F1
est exprimé dans les premiers stades de la formation des pupes (Yamada et al., 2000 ; Yu et al., 1997). Des
mutations perte-de-fonction dans βftz-f1 entraînent une létalité juste avant la métamorphose. βftz-f1
fonctionne comme un facteur de compétence pendant le développement prénymphal, garantissant que les
réponses au pulse d'ecdysone larvaire précoce soient différentes du pulse prépupal qui a lieu 12 h plus tard.

652
Parmi les cibles plus tardives de la cascade activée par les ecdystéroïdes, on trouve broad dont le produit
est indispensable à la mue nymphale (mais il est inhibiteur de la mue imaginale et son expression est inhibée
par la suite) (Zhou et Riddiford, 2002; Zhou et al., 2004).

Durant la métamorphose, l'ecdysone inhibe la signalisation des dILP (les protéines apparentées à l'insuline)
qui ont un effet anabolique d'accumulation de réserves. Or la métamorphose est une période d'utilisation
des réserves. L'une des protéines dont l'expression est activée directement ou indirectement par l'ecdysone
(on ne sait pas encore laquelle) bloque la phosphorylation sur des tyrosines qui accompagne habituellement
l'activation du récepteur des dILP.

**Figure 7-354. La 20-hydroxyecdysone (20E) active l'expression de phosphatases qui s'opposent à la voie de
signalisation de l'insuline. La déphosphorylation de l'INSRβ induite par 20E est réprimée par le cycloheximide (un
inhibiteur de la traduction) et un cocktail d'inhibiteurs de la phosphatase. A) Effet du cycloheximide sur la
déphosphorylation induite par 20E de l'INSRβ dans les cellules HaEpi (50 μM pendant 1 h). Ce sont des cellules
épidermiques de l'armigère, un Lépidoptère. Cela montre la nécessité de synthèse de nouvelles protéines en aval de
20E. B) Effet d'un cocktail d'inhibiteurs de la phosphatase sur la déphosphorylation induite par 20E de l'INSRβ dans
les cellules HaEpi (cocktail 1 % A et 1 % B pendant 30 min). C et D) analyse statistique de (A) et (B). Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(21)00088-0/fulltext

On a donc une boucle de rétroaction où les dILP stimulent la production d'ecdystéroïdes durant la phase
larvaire mais une fois arrivé la métamorphose, les ecdystéroïdes s'opposent à l'action des dILP.

Le franchissement du poids critique lors du dernier stade larvaire aboutit à la chute de la concentration
circulante en hormone juvénile qui était toujours présente lors des mues antérieures. Si,
expérimentalement, on ajoute de l'hormone juvénile au dernier stade larvaire, la métamorphose est inhibée
et selon les espèces, soit une nouvelle mue larvaire a lieu, soit le dernier stade larvaire se maintient au-delà
de la période habituelle. Cette hormone sesquiterpénoïde est produite dans les corpora allata. L'ecdysone
elle-même joue un rôle dans le contrôle de sa production avec de faibles concentrations qui stimule la
production d'hormone juvénile et de fortes concentrations qui l'inhibent. Lors du dernier stade larvaire, le
taux d'ecdysone chute a des niveaux extrêmement bas, éteignant la synthèse d'hormone juvénile. Les pics
d'ecdysone suivants ne sont pas suffisants pour redémarrer cette synthèse et le dernier pic a de toute
manière une forte concentration inhibitrice. La production d'hormone juvénile est aussi contrôlée par les
connexions nerveuses vers les corpora allata avec des neurones dopaminergiques inhibant la synthèse au
dernier stade larvaire (Kaneko et Hiruma, 2007). sNPF est un petit peptide qui est synthétisé dans les
corpora cardiaca et transféré dabs les corpora allata au début du dernier stade larvaire et il contribue à
éteindre la synthèse d'hormone juvénile (Yamanaka et al., 2008).

653
L'hormone juvénile inhibe la mue nymphale lors des mues précédentes en agissant via son récepteur, le
facteur de transcription Met. L'inhibition de l'expression de Met aboutit à une métamorphose précoce
(Konopova et Jindra, 2007; Parthasarathy et al., 2008). Met agit sur la transcription en s'associant à la
protéine Taiman (ou SRC). Le complexe active la transcription de Kr-h1 (Krüppel-homolog1) dont le produit
inhibe la transcription de broad qui code une protéine nécessaire à la mue nymphale (Kayukawa et al.,
2012).

Met peut aussi avoir pour ligand des insecticides de synthèse comme le méthoprène ou le pyriproxyfène qui
perturbent le déclenchement de la métamorphose.

➢ Quelques éléments sur le déroulement de la métamorphose

Beaucoup de cellules larvaires subissent une endoréplication où l'ADN est répliqué mais il n'y a pas de
mitose (ce phénomène est plus répandu dans le règne végétal que dans le règne animal). Cela permet aux
cellules d'avoir de multiples copies des différents allèles et de croître en taille rapidement. Ces cellules sont
tuées en priorité lors de la métamorphose et leurs réserves réutilisées.

Beaucoup de tissus spécifiquement larvaires sont détruits durant la métamorphose. L'autophagie joue un
rôle important. La macroautophagie qui est la mieux caractérisée implique la séquestration de composants
cytoplasmiques et de protéines lysosomes pour la dégradation. Au cours de ce processus, une membrane
d'isolement séquestre le matériel cytoplasmique et s'allonge pour former une vésicule à double membrane,
l'autophagosome. L'autophagosome se dirige vers le compartiment lysosomal où sa membrane externe
fusionne avec les lysosomes et libère le contenu interne pour la dégradation. Les perméases lysosomales
recyclent ensuite les produits de dégradation vers le cytoplasme (Mizushima et Komatsu, 2011).

Durant la métamorphose dans l'intestin ou les glandes salivaires de la nymphe, E93 qui figure parmi les
cibles des ecdystéroïdes active l'expression d'une batterie de gènes qui stimulent l'autophagie nommés Atg
(Lee et al., 2002). L'inhibition de l'autophagie par des mutations de perte de fonction dans Atg1, Atg2 ou
Atg18 retarde fortement l'élimination de l'intestin moyen (Denton et al., 2009). De plus, la surexpression
d'Atg1 dans l'intestin moyen des larves est suffisante pour induire l'autophagie et une dégradation
prématurée (Denton et al., 2012).

L'autophagie est accompagnée par l'apoptose dans les glandes salivaires et l'intestin moyen. En plus
d'activer les gènes Atg, les ecdystéroïdes activent l'expression des caspases et de ark qui est l'orthologue de
Apaf-1 chez la drosophile.

Le système nerveux subit un remodelage important. Par exemple, les neurones de "mushroom bodies" qui
reçoivent l'information olfactive dans le cerveau perdent leurs dendrites et leurs axones et en font croître
des nouveaux (Lee et al., 1999), tandis que les neurones sensoriels périphériques C4da ne perdent puis font
recroître que leurs dendrites (Kuo et al., 2005 ; Zhu et al., 2019).
**Figure 7-355. Élimination des dendrites larvaires chez
dans les neurones sensoriels périphériques C4da durant
la métamorphose de la drosophile. Ce processus est
déclenché par les ecdystéroïdes qui activent leur
récepteur (EcR-B1) et Ultraspiracle (Usp) et implique le
système ubiquitinine-protéasome (UPS). Dans un
deuxième temps, ce sont les métalloprotéinases
extracellulaires (Mmp) qui sont impliquées. Source :
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.0507393102

654
La métamorphose chez les Amphibiens

La métamorphose chez les Amphibiens peut prendre plus ou moins d'ampleur selon le groupe considéré.
Les Anoures perdent leur queue au moment du climax de la métamorphose (grenouille, xénope...) tandis
que les Urodèles la conservent (salamandre, triton...). Certains Amphibiens comme les axolotls n'ont pas
véritablement de métamorphose et deviennent sexuellement matures tout en conservant des caractères
larvaires (pédomorphose). Nous verrons pourquoi plus loin.

*Figure 7-356. Comparaison de la morphologie, l'anatomie et la physiologie du têtard et de la grenouille adulte.

*Figure 7-357. Variations du rapport taille de la patte

postérieure/taille du corps et taille de la queue/taille du
corps au cours de la métamorphose de la grenouille.
Source : Frieden and Just, Hormonal responses in
amphibian metamorphosis, in Biological action of
hormones (1970), AP Press.

La métamorphose des Amphibiens est sous le contrôle des hormones thyroïdiennes. La glande
thyroïde est homologue à l'endostyle des Cordés non vertébrés qui secrètent du mucus iodé. La thyroïde
des Vertébrés a conservé un fonctionnement de glande exocrine tout en évoluant en glande endocrine. Les
hormones thyroïdiennes sont produites à partir d'un grand précurseur protéique, la thyroxine, qui est
exocytée au centre d'un groupe de cellules assemblées en acini. Des tyrosines de la thyroxine sont iodées
655
puis clivées pour former les hormones thyroïdiennes qui traversent les cellules acineuses pour être
sécrétées dans le sang.

**Figure 7-358. Synthèse et sécrétion des hormones thyroïdiennes. La thyroglobuline est synthétisée par les
ribosomes du réticulum endoplasmique rugueux et est exocytée vers le lumen du follicule thyroïdien où elle forme
un colloïde. Le symport Na+/I- pompe activement des anions iodure I− depuis le sang à travers la membrane basale
des cellules folliculaires et les accumulent dans leur cytoplasme. Les ions I- passent ensuite dans le colloïde à travers
la membrane apicale des cellules folliculaires à l'aide de la pendrine, qui agit comme un antiport Cl−/I−. Les ions I-
sont oxydés en diiode I2 par la thyroperoxydase. Ce diiode réagit ensuite avec les résidus de tyrosine sur la
thyroglobuline, qui en compte environ 120. Des résidus d'iodotyrosine adjacents sont condensés pour produire des
iodothyronines, parmi lesquelles les hormones thyroïdiennes. Lorsqu'il y a besoin de sécrétions d'hormones
thyroïdiennes dans le sang, la thyroglobuline iodée est absorbée par les cellules folliculaires par endocytose - les
vésicules résultantes fusionnent avec des lysosomes pour libérer les acides aminés et les hormones thyroïdiennes
par protéolyse de la thyroglobuline sous l'effet de peptidases. La thyroxine (T4) et la triiodothyronine (T3) passent
ensuite dans le sans doute par diffusion. Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Hormone_thyro%C3%AFdienne#/media/Fichier:Thyroid_hormone_synthesis.png

Le principal produit de la glande thyroïde est la tétraiodothyronine (thyroxine ; T4) avec des
quantités mineures de triiodothyronine (T3). Coïncidant avec les mesures de l'activité thyroïdienne, la
concentration plasmatique et le contenu du corps entier de T3 et T4 augmentent tout au long de la
prométamorphose et atteignent un pic au climax de la métamorphose (Denver, 2009). Comme chez
les autres Vertébrés, T3 a une plus grande activité biologique que T4 chez les amphibiens en raison
des récepteurs ayant une affinité 10 à 15 fois plus grande pour la T3 que pour la T4. La conversion de
T4 en T3 peut se faire dans les tissus cibles grâce à l'enzyme thyroxine 5′-désiodase ou grâce aux enzymes
iodothyronine deiodinases-1 et -2 (codés par les gènes Dio1 et Dio2). La iodothyronine deiodinase-3 codé
par le gène Dio3 inactive au contraire les hormones thyroïdiennes. Dio3 est exprimé dans la queue du têtard
pendant toute la phase de pré-métamorphose jusqu'au climax où son expression chute, et Dio2 qui code une
enzyme activatrice (convertissant T4 en T3) a le patron d'expression inverse. Cela permet d'éviter une
régression précoce de la queue avant que les pattes ne soient complètement formées. D'ailleurs, la patte
postérieure qui est un des tissus qui répond précocement aux hormones thyroïdiennes pendant la pré-
métamorphose exprime assez tôt l'enzyme activatrice Dio2. Si on inhibe Dio2 par l'acide iopanoïque,
l'activité de T4 est insuffisante pour provoquer le développement de la patte postérieure (Brown, 2005).

656
 *Figure 7-359. Blocage du développement des membres postérieurs chez les têtards de Xenopus laevis en présence
d'un inhibiteur de sécrétion d'hormones thyroïdiennes. On montre un développement de membre postérieur en
absence ou en présence de 1 mM méthimazole (un inhibiteur de la sécrétion d'hormones thyroïdiennes). Le têtard
traité a développé un goitre (flèche). Les numéros NF indiqués sont ceux des stades Nieuwkoop et Faber. Barre
d'échelle : 0,5 mm. Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.0505989102

La sécrétion des hormones thyroïdiennes est sous le contrôle de l'axe hypothalamo-hypophysaire.

Une ablation de l'hypophyse antérieur abolit la métamorphose. Elle peut être restaurée par l'injection de
TSH ou thyréostimuline. Durant la phase larvaire, un peu de TSH est produit et c'est la CRH (et non la TRH)
produite par l'hypothalamus qui stimule cette sécrétion (De Groef et al., 2006). La CRH est plus
généralement connue pour stimuler la sécrétion d'ACTH mais chez les Amphibiens, elle stimule aussi celle
de la TSH. Ces deux actions sont médiées par 2 récepteurs différents présents dans 2 types cellulaires
différents : CRF1 dans les cellules produisant l'ACTH et CRF2 dans les cellules produisant la TSH. La quantité
de récepteurs CRF2 augmente fortement dans l'hypophyse antérieure à l'approche de la métamorphose
(Kaneko et al., 2005). Dans le même temps, les neurones qui secrètent CRH deviennent matures tout comme
les vaisseaux sanguins qui relient l'hypothalamus à l'hypophyse antérieure. Ce sont les taux faibles à moyen
d'hormones thyroïdiennes qui contrôlent cette maturation et donc c'est un rétrocontrôle positif qui va
provoquer la pré-métamorphose puis le climax.
*Figure 7-360. Hormones thyroïdiennes et axe
hypothalamo-hypophysaire. Pituitary = hypophyse
antérieure ou adénohypophyse. Source :
https://www.jstage.jst.go.jp/article/tox/25/1/25_1_1/_pdf/-char/en

Il existe habituellement un rétrocontrôle négatif des hormones thyroïdiennes sur la production de TSH mais
il est moins marqué durant la pré-métamorphose et le climax de la métamorphose, sans doute en liaison

657
avec l'expression accrue de la monodéionidase désactivante Dio3 dans l'hypophyse à ce stade (Sternberg et
al., 2011). Après le climax, le rétrocontrôle redevient actif et la sécrétion d'hormones thyroïdiennes chute.

Chez l'axolotl (Ambystoma mexicanum), la maturité sexuelle est atteinte avec une rétention des
caractères larvaires. L'injection d'hormones thyroïdiennes sous forme de T4 ou de T3 chez ces
animaux est capable de provoquer une métamorphose. L'efficacité de la T4 montre que l'axolotl
exprime les enzymes qui permettent de la convertir en T3, plus active. L'injection de TSH est aussi
capable de provoquer une métamorphose montrant que la glande thyroïde est fonctionnelle.
Naturellement, on trouve peu de TSH dans le sang des axolotls. Au cours de l'évolution, c'est la
libération de TSH par les cellules hypophysaires qui a été abolie.

Voss (1995) a croisé A. mexicanum domestiqué et A. tigrinum (qui réalise une métamorphose) pour créer
des hybrides F1 qu'il a rétrocroisés avec A. mexicanum. Les rapports obtenus entre les métamorphes et les
pédomorphes sont cohérents avec le contrôle du phénotype par un seul locus, soutenant ainsi l'idée
classique d'une mutation unique sous-jacente à l'évolution de la pédomorphose.

Les hormones thyroïdiennes agissent via des récepteurs intracellulaires TRalpha et TRbeta. En pré-
métamorphose, on trouve essentiellement TRalpha qui forme un dimère avec RXR (le co-récepteur à l'acide
nucléique). L'expression de TRbeta est activée par ces complexes TRalpha/RXR et ce sont les dimères
TRalpha/TRbeta qui deviennent majoritaires lors du climax de la métamorphose. Cette succession de
récepteurs pour les hormones thyroïdiennes est importante pour la bonne succession des évènements du
développement post-embryonnaire. En absence de T3, les récepteurs recrutent des co-répresseurs de la
transcription. En présence de T3, les récepteurs recrutent des co-activateurs tels p300 et SRC (Shi et al.,
2012).

*Figure 7-361. Contrôle de la transcription par les récepteurs aux hormones thyroïdiennes. En l'absence de T3, TR
forme des hétérodimères avec RXR (récepteur de l'acide rétinoïque 9-cis) et l'hétérodimère se lie aux éléments de
réponse T3 (TRE) sur les séquences régulatrices des gènes cibles pour réprimer leur expression en recrutant des
complexes corépresseurs tels que N-CoR ou SMRT et HDAC-3. Lorsque T3 est présent, les complexes corépresseurs
sont libérés lors de la liaison de T3 à TR, et des complexes coactivateurs tels que ceux contenant SRC, p300 et PRMT1
sont recrutés. SRC et p300 sont des histones acétyltransférases et PRMT1 est une histone méthyltransférase. Source
: https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/2045-3701-2-42

Signalons que T3 peut également avoir pour récepteur le domaine extracellulaire de l'intégrine alphaVbeta3
et que cette interaction active la voie MAPK (Davis et al., 2005).

En dehors des hormones thyroïdiennes, la corticostérone produite par la glande corticosurrénale joue un
rôle dans la métamorphose des Amphibiens. Elle retarde la croissance et la métamorphose des larves
(Belden et al., 2005) mais une fois la métamorphose déclenchée, elle l'accélère (Darras et al., 2002). La
sécrétion de corticostérone est produite lors d'un stress et on peut interpréter son action de manière
adaptative : la métamorphose est une phase délicate et fragile du cycle de développement et il ne vaut mieux
pas entamer une métamorphose dans un environnement stressant. Et si la métamorphose a été déjà
déclenchée alors que l'environnement devient stressant, il vaut mieux en sortir le plus vite. Il y a néanmoins

658
des exceptions. Par exemple, les têtards Scaphiopus couchii vivent dans des mares qui sont plus éphémères
et sujettes au dessèchement que deux espèces proches. On constate que chez elle, son taux de corticostérone
est constamment élevé (sans doute lié au stress hydrique) et que sa métamorphose se passe rapidement
relativement aux deux autres espèces (Kulkarni et al., 2017).

*Figure 7-362. Milieux de vie, vitesse de développement post-embryonnaire et taux de corticostérone chez trois
espèces de grenouille. Les têtards de Scaphiopus couchii (barres rouges) vivent dans des mares éphémères, tandis
que ceux de Pelobates cultripes (barres jaunes) vivent dans des grands étangs qui ne se dessèchent jamais. Les têtards
de Spea multiplicata (barres bleues) vivent dans des étangs plus petits qui peuvent s'assécher occasionnellement. La
durée de leur stade larvaire est indiquée et les concentrations en corticostérone circulante avant la métamorphose
sont mesurées. Les stades sont définis par la morphologie et non par la temporalité. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-017-00996-5

Le développement accéléré de S. couchii a pour conséquence de donner des grenouilles plus petites avec
des pattes plus courtes et moins de graisse abdominale. Outre l'effet particulier de la corticostérone, S.
couchii a un récepteur aux hormones thyroïdes qui est plus sensible à son ligand que les autres espèces, ce
qui contribue également à l'accélération du déclenchement de la métamorphose.

La première MMP (métalloprotéase matricielle) identifiée, la collagénase, a été trouvée dans la résorption
de la queue des têtards pendant la métamorphose des amphibiens. Son expression est activée par des
hormones thyroïdiennes. D’autres membres de ces endopeptidases ont été impliqués dans la résorption de
la queue au cours de la métamorphose de la grenouille, notamment MMP-2, MMP-9, MMP-11, MMP-13 et
MMP-18.

La métamorphose des Amphibiens est très sensible à la pollution et les mécanismes associés commencent
à être élucidés. Par exemple, les dioxines provoquent une suractivation de l'expression du gène Klf9 qui est
une cible précoce des hormones thyroïdiennes et de la corticostérone au cours de la métamorphose (Han
et al., 2022). Cette suractivation peut provoquer une désynchronisation des différents évènements du
développement post-embryonnaire.

Même s'il n'y a pas de métamorphose chez l'Homme, les hormones thyroïdiennes sont importantes
pour son développement post-embryonnaire. Un manque de T3 (généralement à cause d'une
carence en iode) peut aboutir à ce qui a été appelé le crétinisme : retard mental, défaut de
développement du système nerveux moteur et auditif, arrêt du développement des organes génitaux
et petite taille.

659
Le méristème apical caulinaire en phase végétative et lors de la formation d'une fleur

Généralités et maintien des cellules souches

Les plantes maintiennent une croissance et forment des nouveaux organes tout au long de leur vie.
Cela leur permet notamment de conquérir leur place dans leur environnement et de s'adapter à ses
changements malgré leur vie fixée. L'étude du méristème apical caulinaire permet de comprendre
ce processus (il ne faut pas oublier qu'un deuxième méristème, le méristème racinaire fonctionne pour les
parties souterraines, mais il ne sera pas traité ici).

Le méristème apical caulinaire (MAC) forme une masse bombée à l'apex de la tige et est constitué
d'un ensemble de cellules qui met en place la tige (et assure ainsi la croissance primaire), les feuilles
et ultimement les fleurs des Angiospermes. Il contient des cellules souches qui permettent de
générer en continu de nouvelles cellules. Un centre organisateur régule la quantité de cellules
souches grâce à une boucle de rétroaction négative. De manière itérative, au niveau de structures
appelées nœuds, des feuilles sont générées latéralement avec des dispositions différentes selon les
espèces. Des tiges latérales peuvent aussi être produites. Le maintien du MAC permet à la plante
d'avoir une croissance tout au long de sa vie. La production d'une inflorescence florale signe
cependant la fin de l'activité du MAC pour les tiges concernées.

*Figure 7-363. Coupe histologique de l'extrémité apicale d'une tige feuillée. D'après :
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/1-vegetal/v-imagenes-grandes/meristemo_primario_caulinar.php#n

Le méristème apical caulinaire (MAC) a été formellement identifié pour la première fois en 1759 par Caspar
Friedrich Wolff à l'aide d'un microscope rudimentaire, mais ce n'est qu'en 1858 que Carl Nägeli a pu
observer les cellules méristématiques à l'aide d'un microscope plus performant. Hanstein en 1868 a
découvert que le MAC est organisé en trois couches. Schmidt en 1924 a observé que ces couches peuvent
être associées aux plans de division cellulaire anticlinaux ou périclinaux.
Diverses expériences de marquage (par exemple, avec de la thymidine tritiée) ont confirmé
l'activité proliférative plus élevée de la partie périphérique du MAC. La base génétique de la fonction
du méristème a ensuite été analysée : de nombreux mutants avec un nombre anormal d'organes ou avec
des identités d'organes modifiées ont été caractérisés à partir des années 1980 et étudié à l'échelle
moléculaire par la suite.

660
 *Figure 7-364. Organisation
du méristème apical caulinaire
(MAC) d'Arabidopsis. Le MAC
est constitué de la zone
centrale (CZ), de la zone
périphérique (PZ) et de la zone
médullaire (RZ). Les trois
couches L1–L3 sont indiquées.
Les cellules souches
(représentées en bleu,
exprimant CLV3) et le centre
organisateur (OC ; représenté
en rouge, exprimant WUS)
interagissent dans une boucle
de rétroaction négative. Dans
l'ébauche foliaire, les destins
des cellules adaxiales et
abaxiales sont marqués
respectivement par
l'expression des gènes de la
famille HD-ZIP III et KANADI.
Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2011.00093/full

*Figure 7-365. Orientation des divisions cellulaires dans les couches L1, L2 et L3 du méristème apical caulinaire. Les
cellules des couches L1 et L2 qui donnent naissance aux cellules de l'épiderme et du parenchyme ont des divisions
anticlines (plan de division perpendiculaire à la surface du tissu) alors que les cellules de la couche L3 ont des
divisions périclines (plan de division parallèle à la surface du tissu) en plus des divisions anticlines et donnent
naissance aux tissus vasculaires. Source

La niche des cellules souches dans MAC est contrôlée par l'interaction réciproque de deux groupes
adjacents de cellules. Il s'agit de la zone à l'extrémité du méristème en forme de dôme qui contient
des cellules souches à division lente, et les cellules sous-jacentes du centre organisateur (OC). Lors
de la division asymétrique des cellules souches, les cellules filles qui ne participent pas à
l'autorenouvellement sont déplacées latéralement dans la zone périphérique (ZP), où elles peuvent
entrer dans les voies de différenciation (Reddy et al., 2004 ; Stahl et Simon, 2005). Les cellules de l'OC
expriment le facteur de transcription à homéodomaine WUSCHEL (WUS). La mutation perte-de-
fonction de WUS aboutit à un méristème apical caulinaire réduit et qui n'est pas capable de se
maintenir dans le temps. A l'inverse, des expériences d'expression ectopique de WUS induisent la
formation de cellules souches ectopiques (y compris dans les racines) (Gallois et al., 2004). On en
conclue que WUS est nécessaire et suffisant pour le maintien et la création de cellules souches.
*Figure 7-366. L'expression ectopique de WUS dans les
racines induit l'expression de CLV3, normalement
exprimé dans les cellules souches du méristème apical
caulinaire. Coupes longitudinales de racines traitées en
hybridation in situ avec une sonde reconnaissant
l'ARNm de WUS (révélé en rouge) et l'ARNm de CLV3
(révélé en noir). L'expression ectopique de WUS est
induite par un choc thermique : (G) correspond à une
racine à température normale et (H) à une racine qui a
subi un choc thermique 3 jours plus tôt et qui a induit
661
 l'expression de WUS. Notez que des cellules expriment
CLV3 sans exprimer WUS ce qui montre un effet non-
cellulaire autonome. Source :
http://genesdev.cshlp.org/content/18/4/375.long

Dans le MAC, WUS se déplace à travers les plasmodesmes vers les cellules CZ pour maintenir les
cellules souches et favoriser l'expression du peptide de signalisation sécrété CLAVATA3 (CLV3)
(Brand et al., 2000 ; Daum et al., 2014 ; Müller et al., 2006 ; Schoof et al., 2000 ; Yadav et al., 2011). On dit
que WUS a une action non-cellulaire autonome, c'est-à-dire qu'il est produit dans un groupe de
cellules mais agit sur un autre groupe de cellules.

*Figure 7-367. Comparaison de la distribution de la protéine WUSCHEL et de son ARNm. (A) Marquage
immunohistochimique à l'aide d'un anticorps reconnaissant WUSCHEL. (B) Hybridation in situ avec une sonde
reconnaissant l'ARNm de WUSCHEL. On constate que cet ARNm est exprimé dans le centre organisateur mais que la
protéine a diffusé jusque dans la région au-dessus où se trouvent les cellules souches. Barre d'échelle = 20 µm. Source
: https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1406446111

Signalons que WUS agit de deux manières pour activer l'expression de CLV3 : soit sous forme d'homodimère,
soit sous forme d'hétérodimère avec STM (SHOOTMERISTEMLESS).

WUS agit directement sur des éléments régulateurs de la transcription de CLV3 qui ont été caractérisés.
*Figure 7-368. Caractérisation des séquences
régulatrices nécessaires à la bonne
transcription de CLV3. Des plants
transgéniques exprimant le gène rapporteur
H2bYFP sous le contrôle (WT) ou en absence
(ΔCRM) des séquences régulatrices supposées
de CLV3 (traits bleus avec les nombres
correspondant à la position nucléotidique par
rapport au site du début de la transcription).
On observe la fluorescence de la YFP dans les
MAC de ces plants. Source :
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1607669113

662
 **Figure 7-369. Fixation directe de WUS sur les éléments régulateurs de la transcription de CLV3. Les séquences des
éléments régulateurs mis en évidence dans la figure précédente sont montrées ainsi qu'une forme mutée de ces
séquences (M). On réalise des expériences EMSA (retard de migration sur gel) avec les séquences présentées, en
absence ou en présence de WUS. On constate que WUS crée un retard de migration sur gel des séquences des
éléments régulateurs (et seulement si ceux-ci ne portent pas de mutation). Source :
https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1607669113

Les mutants perte-de-fonction CLV1, CLV2 et CLV3 présentent un MAC hypertrophié. Ce sont donc
des régulateurs négatifs du MAC.

*Figure 7-370. Des mutations perte-de-fonction de clavata 1 (clv1) ou de clavata3 (clv3) aboutissent à des MAC
hypertrophiés. Vue apicale en microscopie électronique à balayage d'extrémités de tige de plants d'Arabidopsis
sauvages (WT) ou mutants perte-de-fonction clv1 ou clv3. Le MAC est hypertrophié car la boucle négative partant
des cellules souches et inhibant l'expression de WUSCHEL ne fonctionne plus. Des analyses complémentaires
montrent que l'expression de WUSCHEL est plus forte et stimule plus la prolifération des cellules souches. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286740080700X

Chez ces mutants, l'expression de WUS est augmentée indiquant que les protéines CLAVATA
inhibent l'expression de ce gène dans l'OC. La liaison du ligand CLV3 aux récepteurs CLV1 localisés
dans la membrane plasmique des cellules OC déclenche une cascade de transduction du signal et
inhibe l'expression du WUS, établissant ainsi une boucle de rétroaction négative (Mayer et al., 1998 ;
Ogawa et al., 2008 ; Yadav et al., 2011).

663
La boucle CLV3-WUS sert à maintenir les tailles relatives de la CZ et de l'OC, et ainsi assure la
croissance du méristème le long de l'axe apico-basal. Cependant, la perte de cellules de la PZ due à la
production d'organes latéraux nécessite une augmentation compensatoire de la taille du domaine des
cellules souches.

Le peptide CLV3 est perçu dans l'OC par un homodimère de récepteur kinase à répétition riche en leucine
(LRR), CLAVATA1 (CLV1), qui interagit avec les corécepteurs CIK1-4 (pour CLAVATA3 INSENSITIVE
RECEPTOR KINASES) (Cui et al., 2018). L'activation du CLV1 provoque l'autophosphorylation et
l'interaction avec des kinases et des phosphatases associées à la membrane et cytosoliques.

Un deuxième complexe de récepteurs est constitué de CLV2, une autre protéine réceptrice de type LRR, et
de CRN (SUPPRESSOR OF LLP1-2 (SOL2)/CORYNE), un récepteur-kinase sans LRR (Kayes et Clark 1998,
Jeong et al. 1999, Müller et al. 2008). CLV2 et SOL2/CRN sont principalement des protéines résidentes du
réticulum endoplasmique (ER) et dépendent l'une de l'autre pour leur localisation dans la membrane
plasmique, où le complexe CLV2-SOL2/CRN reçoit le signal CLV3 extracellulaire (Bleckmann et al. 2010).

Si on surexprime CLV1, on observe qu'une forme facilement observable de CLV3 (la protéine CLV3-GFP)
diffuse moins loin. Ainsi, les récepteurs à CLV3 reçoivent et transduisent le signal bien entendu mais ont
aussi un rôle de piégeage du ligand CLV3 et de limitation de sa diffusion ce qui contribue à préserver un
domaine où WUS peut être exprimé.

Chez Arabidopsis, la sévérité du phénotype du mutant clv1 est modérée par les récepteurs paralogues
BARELY ANY MERISTEM (BAM) via un mécanisme de « compensation active ». Dans la compensation
active, les gènes modifient leur comportement pour compenser une perturbation génétique (comme la
perte d'un paralogue) ou environnementale. Ce cas est à distinguer de la compensation passive où les
paralogues ne changent pas leur comportement en cas de perturbation, et sont plus proches d'être
véritablement redondants. Dans le cas des BAM d'Arabidopsis, leurs niveaux d'expression augmentent
et leurs domaines d'expression changent lorsque la fonction de CLV1 est compromise, compensant
activement la perte de CLV1 (Nimchuk et al., 2015).

De manière intéressante, les espèces réactives de l'oxygène ont été impliqués récemment dans la régulation
des cellules souches du MAC avec les ions superoxides O2.- qui s'accumulent dans les cellules souches et H202
(eau oxygénée) qui au contraire s'accumule dans les cellules qui sortent de l'état de cellules souches et qui
vont se différencier grâce à l'expression de superoxide dismutases (SOD). O2.- et H202 influencent de manière
opposée l'expression de WUS dans le centre organisateur.

664
 **Figure 7-371. Les espèces réactives de
l'oxygène régulent les cellules souches végétales.
L'équilibre entre les ions superoxides O2.- et H2O2
sert d'interrupteur clé pour le maintien des
cellules souches par rapport à la différenciation
en régulant de manière antagoniste l'expression
du facteur de transcription WUSCHEL. O2.-
s'accumule spécifiquement dans les cellules
souches du MAC et maintien leur caractère de
cellules souches. H2O2 est quant à lui enrichi dans
la zone périphérique de différenciation et
favorise la différenciation des cellules souches
végétales. La répression des superoxyde
dismutases (SOD) et l'activation des peroxydases
(PRX) établissent la distribution de O2.- élevé et
de H2O2 faible dans les cellules souches. H2O2
régule négativement l'accumulation des
superoxydes O2.- dans les cellules souches en
inhibant les enzymes clés de l'anabolisme des
superoxydes. L'équilibre superoxyde/H2O2
contrôle le destin des cellules souches en
régulant de manière antagoniste l'expression de
WUSCHEL (WUS). Source :
https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.201695955#

De manière intégrée, le MAC peut répondre à des signaux en provenance d'autres régions de la
plante. Par exemple, l'expression de WUS est stimulée par les cytokinines dont les précurseurs sont
produits par les racines puis transportés dans les parties aériennes par le xylème (Gordon et al.,
2009 ; Osugi et al., 2017). Cela permet de coordonner la croissance de l'appareil aérien avec la
croissance de l'appareil racinaire.
**Figure 7-372. Des composants de la voie de
signalisation des cytokinines sont nécessaires à
l'expression de WUS. Des plants transgéniques
exprimant le gène rapporteur GFP sous le contrôle du
promoteur de WUS produisent également (ou non) des
microARN dont l'expression est inductible par l'éthanol
inhibant l'expression de ARR1/10/12, des facteurs de
transcription activés par les cytokinines. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/1/dev156380/48730/ERECTA-
family-genes-coordinate-stem-cell-functions

SHOOTMERISTEMLESS (STM) qui est important pour le maintien des cellules souches stimule la synthèse
de IPT5 et de IPT7 qui sont des enzymes impliqués dans la biosynthèse de cytokinines (Jasinski et al., 2005),
ce qui indique qu'une source locale de production de cytokinines à proximité du MAC est aussi activée.

665
 *Figure 7-373. La transcription de IPT7 est stimulée par
SHOOTMERISTEMLESS (STM). Niveaux relatifs d'ARNm
d'IPT7, qui code une enzyme impliquée dans la
biosynthèse des cytokinines, quantifiés par RT-qPCR et
présentés sous la forme du rapport entre les niveaux
d'IPT7 et de TUB. Les plantes sont transgéniques pour un
vecteur contrôle (Ler) ou pour exprimer une forme de
STM inductible par les glucocorticoïdes, c'est-à-dire STM
fusionné avec le récepteur aux glucocorticoïdes
(35S:STM-GR). Les ARN ont été extraits 2h (A) ou 24h (B)
après induction ou non par la dexaméthasone (DEX), un
glucocorticoïde. Les données en (A) et (B) proviennent
d'expériences distinctes. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982205008444

Les cytokinines sont des hormones végétales proches de l'adénine (la zéatine est la plus répandue).
Elles sont synthétisées par trois enzymes codées par des familles multigéniques : l'ISOPENTENYL
TRANSFERASE (IPT), la mono-oxygénase du cytochrome P450 (CYP735A) et LONELY GUY (LOG),
qui convertissent les molécules en leur forme active. Les cytokinines se lient aux récepteurs
ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 2 (AHK2)–AHK4 ce qui initie une cascade de signalisation en
plusieurs étapes qui conduit finalement à la phosphorylation et à l'activation des facteurs de
transcription ARR de type B qui activent l’expression de gènes spécifiques. Les ARR de type B
activent l'expression des ARR de type A qui ont un effet inhibiteur créant une boucle de rétroaction
négative.
Le

**Figure 7-374. Voie de signalisation principale activée par les cytokinines. La liaison des cytokinines au domaine
CHASE des récepteurs HK entraîne l'activation du domaine histidine-kinase cytosolique et l'autophosphorylation sur
le résidu histidine (His) conservé, suivi du transfert du groupe phosphate vers un acide aspartique (Asp) conservé
dans le domaine récepteur. Le phosphate est ensuite transféré aux protéines AHP (qui peuvent être inhibées par les
666
 protéines PHP et par la S-nitrosylation dépendante du NO) puis aux protéines RR de type B en aval, ce qui entraîne
un changement transcriptionnel dans le noyau. Les protéines RR de type B sont dégradées par les protéines KMD. Il
y a activation également des protéines RR de type A qui n'ont pas de domaine de fixation à l'ADN et qui exercent un
rétrocontrôle inhibiteur sur la cascade. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/145/4/dev149344/48589/Cytokinin-signaling-in-plant-development

La formation des feuilles

Les feuilles sont des structures généralement aplaties qui constituent le principal organe
photosynthétique des Angiospermes. Elles sont constituées d'un limbe plat (avec des nervures qui
correspondent aux tissus conducteurs) et d'un pétiole qui relie la feuille au nœud de la tige.

Les feuilles se forment à partir de primordia foliaires qui forment des prolongements en forme de
doigt qui se positionnent latéralement au MAC.

*Figure 7-375. Les feuilles se mettent en place sur les

flancs du MAC
(A) Apex végétatif d'Arabidopsis vu en microscopie
électronique à balayage. Le côté adaxial de la feuille
est adjacent au MAC, tandis que le côté abaxial de la
feuille est plus éloigné. L'axe dorso-ventral est établi
au début du développement et est clairement évident
dans la feuille de gauche, qui s'arque sur le méristème
en raison de la croissance différentielle de chaque
côté de la feuille. La barre d'échelle est de 50 μm. (B)
Feuille en développement d'Arabidopsis. Les
trichomes adaxiaux sur la plus grande feuille sont un
marqueur de l'axe dorso-ventral. La barre d'échelle
est de 250 μm. (C) Représentation schématique d'une
coupe transversale de feuille avec l'épiderme externe
adaxial et abaxial et le mésophylle interne légendés.
(D) Coupe transversale de la nervure médiane des
feuilles avec le xylème adaxial et les cellules abaxiales
du phloème. Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.0020089

La production des feuilles se répète de manière cyclique à travers la formation de phytomères par
le MAC (un phytomère est un segment de la tige qui comprend un entre-nœud et un nœud. Ce dernier
porte une ou plusieurs feuilles et éventuellement un ou des bourgeons axillaires).

667
 *Figure 7-376. Architecture générale d'une plante
dicotylédone. D'après
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2015.00233/full

La distribution des organes latéraux le long de la tige, connue sous le nom de phyllotaxie, suit des
schémas réguliers qui peuvent être décrits avec des outils mathématiques.
*Figure 7-377. Disposition des primordia foliaires chez
Arabidopsis thaliana. Image de microscopie électronique
à balayage en vue apicale de l'extrémité d'un plant
d'Arabidopsis thaliana. La taille des points rouge indique
l'ordre de formation des primordia foliaires (plus gros =
plus âgé). Barre d'échelle = 50 μm. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/143/9/1612/47878/Differential-regulation-of-
meristem-size

Un modèle couramment observé est la phyllotaxie en spirale où les organes successifs forment des angles
d'environ 137 ° (qualifiés d'angle d'or). Lorsque deux organes sont initiés simultanément en paire opposée,
décalés de 90° par rapport à la paire précédente, ils forment un motif « décussé ». La phyllotaxie « distique
», telle qu'observée chez le maïs et le riz, est caractérisée par des organes s'initiant séquentiellement à des
angles de 180°.

Cette organogenèse sur les parties latérales du MAC est déclenchée par l'accumulation de la phytohormone
auxine. Sur la base des modèles d'expression des gènes de biosynthèse de l'auxine YUCCA1 (YUC1), YUC2,
YUC4, YUC6 et TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS1 (TAA1), on pense que l'auxine est
produite dans tout le dôme du méristème et redistribuée vers les primordia naissants principalement via le
transporteur d'efflux actif PIN1 (Yoshida et al., 2011). En accord avec cette idée, les transporteurs d'influx
et d'efflux d'auxine sont nécessaires pour un positionnement correct des organes. Les premières
expériences ont démontré que la position des nouvelles ébauches dépend de la position des plus anciennes
conduisant à un modèle d'inhibition latérale de la phyllotaxie dans lequel chaque ébauche d'organe agit
comme un puits d'auxine, épuisant ainsi localement l'auxine et créant un champ inhibiteur où aucun autre
organe peut initier. À l'aide de modèles informatiques, il a été prédit qu'une rétroaction de l'accumulation
ou du flux d'auxine sur l'expression ou la polarité de PIN1 peut expliquer les schémas de phyllotaxie
observés dans la nature.

668
Dans les ébauches foliaires, ASYMMETRIC LEAVES1 et 2 (AS1 et AS2) inhibent l'expression de
SHOOTMERISTEMLESS (STM) ce qui compromet définitivement le maintien des cellules souches.

La lumière jour également un rôle dans l'initiation de la formation des feuilles via la production de
cytokinine (Yoshida et al., 2011).

*Figure 7-378. Rôle de la lumière sur l'initiation des

organes latéraux du MAC. La lumière favorise la
signalisation des cytokinines dans la zone centrale
(étape 1), ce qui soulage l'inhibition médiée par CLV sur
les cellules souches du méristème (étape 2), fournissant
ainsi une source de cellules pour l'organogenèse (Étape
3). Cette croissance du méristème dépendante de la
cytokinine favorise l'initiation des organes de concert
avec la voie de signalisation de l'auxine. La lumière est
également nécessaire pour l'établissement de la boucle
PIN1-auxin (zone rouge), car PIN1 est intériorisé en
l'absence de lumière. (Étape 4) La lumière peut affecter
la signalisation, le transport ou la biosynthèse de l'auxine
directement ou indirectement via l'activation de la voie
cytokinine/cellule souche. (Étape 5) L'auxine peut
exercer une boucle de rétrocontrôle négatif sur la
synthèse de cytokinines. Source :
http://genesdev.cshlp.org/content/25/13/1439.long

La forme des feuilles est sous la dépendance d'un réseau de régulation génique qui fonctionne au niveau
des marges foliaires.
***Figure 7-379. Modèle de régulation de la forme des
feuilles. Au cours du développement des feuilles,
AtHB1 réprime directement l'expression de miR164,
qui est un répresseur de la traduction de CUC2,
favorisant ainsi la dentelure des feuilles. AtHB1 peut
également induire la transcription CUC2 en bloquant
directement la liaison d'un répresseur (indiqué par
des lignes bleues pointillées). Les facteurs de
transcription TCP, dont l'expression est inhibée par
miR319, induisent l'expression de miR164. Source :
https://academic.oup.com/pcp/article/61/3/659/5685818

Induction florale et passage à la production d'une fleur

La fleur est une structure particulière aux Angiospermes, où le gamétophyte femelle reste enfermé
dans les ovules qui se trouvent dans les ovaires, eux-mêmes inclus dans des carpelles. Les fleurs sont
le plus souvent hermaphrodites et donc des pièces florales fertiles mâles, les étamines, produisant
les grains de pollen (qui sont les gamétophytes mâles) sont également présents. Le gamétophyte
mâle, contrairement au gamétophyte femelle, est dispersé (pollinisation par le vent ou les animaux
(très souvent les insectes)). Les pièces fertiles (carpelles et étamines) sont entourées par des pièces
dites stériles (sépales et pétales).

669
 *Figure 7-380a. Vue apicale d'une fleur d'Arabidopsis. On
distingue bien notamment la disposition des étamines
par rapport aux pétales. Les sépales ne sont pas bien
visibles (à part à droite). Source :
https://www.mdpi.com/1422-0067/18/6/1303/htm

*Figure 7-380b. Diagramme floral d'Arabidopsis

thaliana. Source : http://acces.ens-
lyon.fr/acces/thematiques/dyna/dossiers-
thematiques/morphogenese-vegetale/morphogenese-florale

La production d'une fleur est un changement du programme de développement au sein du MAC et

des cellules qui en dérivent. Ce changement est activé par des contrôles internes (âge, nutrition) et
par des facteurs de l'environnement (photopériode, température).

Les plantes annuelles fleurissent une seule fois dans leur cycle de vie, qui se termine en 1 an. Les
plantes bisannuelles, quant à elles, germent et poussent de manière stérile la première année et ne
fleurissent que la seconde année. Les plantes vivaces telles que les buissons et les arbres vivent
plusieurs années et peuvent fleurir une seule fois (monocarpie) ou à plusieurs reprises (polycarpie)
à intervalles d’une ou de plusieurs années. Chez les espèces polycarpiques des milieux tempérés,
l'initiation florale a souvent lieu en automne et le développement des fleurs seulement le printemps suivant.

La capacité des Angiospermes à correctement se reproduire dépend de leur capacité à produire des
fleurs au bon moment de l'année (par exemple lorsque leurs insectes pollinisateurs sont actifs).

Le MAC devient un méristème d'inflorescence et produit les cellules qui donneront les pédoncules
floraux et puis les sépales, les pétales, les étamines et les carpelles. Les cellules souches du
méristème "s'épuisent" lors de la production des carpelles.

> Rôle de la photopériode

La photopériode favorise la floraison en réponse au cycle jour/nuit et représente le signal

environnemental principal de régulation de la floraison. Les plantes qui fleurissent uniquement
lorsque la durée du jour dépasse un minimum critique sont appelées plantes à jours longs (LD) et
les plantes qui fleurissent uniquement lorsque la durée du jour tombe en dessous d'un minimum
critique sont appelées plantes de jours courts (SD). En réalité, c'est plutôt la durée de la nuit qui est
critique pour la floraison dans ce cas et illuminer les plantes seulement pendant quelques minutes durant
la phase obscure suffit à inhiber la floraison. Signalons que certaines plantes sont indifférentes à la

670
photopériode et fleurissent lorsqu'elles arrivent à maturité, quelque soit la durée du jour (tomate, pissenlit,
maïs...).

Arabidopsis est une plante LD facultative qui fleurit au plus vite dans des conditions LD, mais finira par
fleurir également dans des conditions SD non inductives. Dans ce dernier cas, les gibbérellines (GA)
deviennent indispensables à la floraison.

La photopériode est détectée dans les feuilles et provoque les changements dans l'identité du MAC.
Chez plusieurs plantes, telles que Arabidopsis, la tomate, le tabac et le riz, la protéine florigène (FT)
ou ses homologues se déplace des feuilles vers le MAC où elle induit le passage à la floraison.

La photopériode entraîne l'horloge circadienne, qui est un élément essentiel du mécanisme de détection de
la longueur du jour par les plantes. Des études chez Arabidopsis thaliana ont identifié CONSTANS (CO)
comme l'acteur ciblé par l'information photopériodique (Suarez-Lopez et al., 2001) et il est lui-même sous
le contrôle de l'horloge circadienne.

Voir vidéo : https://youtu.be/spkA1f5FmxY : Un plant d'Arabidopsis thaliana de type sauvage (Col-0) (à

gauche) et un plant mutant perte-de-fonction constans (co-101) (à droite) ont été cultivés dans des
conditions de journée longue (16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité) à 22°C.

*Figure 7-381. L'expression de CO est contrôlée par une horloge circadienne. a, b, abondance d'ARNm de CO dans
des plantes cultivées en LD et SD (a). Pour déterminer si les oscillations quotidiennes de l'ARNm du CO sont
contrôlées par l'horloge circadienne, des plantes entraînées sous LD et transférées à la lumière constante (LL) ont
été étudiées. Dans ces conditions, les niveaux d'ARNm de CO ont continué à osciller avec une période de 24 h (b et
e), montrant que l’expression de CO est régulée par l'horloge circadienne. Les échantillons ont été prélevés aux
heures indiquées après l'aube (heure = 0). c – e, quantification de l'ARNm de CO à partir des expériences présentées
au-dessus. Source : https://www.nature.com/articles/35074138

La composante "rythme circadien" de la régulation est médiée par GIGANTEA (GI), CYCLING DOF FACTORS
(CDF) et la protéine F-box FKF1, et régule les profils d'expression quotidiens de CO (Imaizumi et al., 2005 ;
Sawa et al., 2007 ; Fornara et al., 2009).

Comment est perçue la lumière (et donc la photopériode) dans les feuilles ? La perception de la lumière
dépend en partie des phytochromes. Ce sont des chromoprotéines absorbant la lumière rouge
claire/rouge sombre avec un chromophore lié par covalence (Franklin et Quail, 2010). PhyA et phyB sont
les membres les plus abondants et les plus importants de la famille. Dans l'obscurité, les phytochromes sont
présents sous la forme inactive absorbant la lumière rouge clair (Pr), qui est convertie en conformère actif
absorbant la lumière rouge sombre ou rouge lointain (Pfr avec fr pour far-red) lors d'une illumination à la
lumière rouge clair. La forme Pfr est rapidement reconvertie en forme Pr en absorbant la lumière rouge
sombre (photoconversion) ou par un processus plus lent et indépendant de la lumière appelé réversion
sombre (Rockwell et al., 2006). La phosphorylation de phyB sur la sérine 86 accélère la réversion sombre
du récepteur (Medzihradszky et al., 2013).

671
 *Figure 7-382. Contrôle de l'activité du
phytochrome. a) Facteurs contrôlant l'activité
du phytochrome. Les phytochromes existent
sous deux conformations, Pr et Pfr, cette
dernière étant la forme active. Ils existent sous
forme de dimères, donc trois espèces peuvent
être trouvées. Chaque monomère peut être
activé par la lumière rouge (R) et inactivé par la
lumière rouge lointaine (FR) ou par réversion
thermique, un processus qui dépend de la
température (T). Au moins dans le cas de phyB,
Pfr dans les hétérodimères revient beaucoup
plus rapidement à la forme Pr que celui des
homodimères, permettant à phyB de percevoir
la température à la fois pendant la journée et
pendant la nuit. b) Spectres d'absorption des
conformations Pr et Pfr. Dans les semis adaptés
à l'obscurité, les phytochromes sont sous la
forme Pr. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-019-
13045-0

En parallèle, la lumière bleue est perçue dans les feuilles par les cryptochromes (CRY1 et CRY2) et FKF1.

La régulation de l'horloge circadienne de la transcription de CO et la régulation de sa stabilité

protéique par les photorécepteurs limitent l'activité du CO à une fenêtre en fin d'après-midi. Cela
permet au CO de favoriser la floraison en activant directement l'expression du gène florigène
FLOWERING LOCUS T (FT) spécifiquement dans l'après-midi/la soirée de longue journée (LD) (An et
al., 2004). Bien que les transcrits de CO soient exprimés à des niveaux élevés de l'après-midi au petit matin
suivant sous les jours courts (SD) et les LD, la protéine CO ne s'accumule que dans l'après-midi des LD. La
déstabilisation de la protéine CO par ubiquitinylation dans la période d'obscurité est due à l'activité du
complexe CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENEC 1 (COP1)-SUPPRESSOR of PHYA-105 (SPA), qui
empêche la floraison sous SD (Jang et al., 2008, Liu et al., 2008).

672
 *Figure 7-383. COP1 qui participe à la dégradation de CO
est nécessaire à la répression de la floraison en jours
courts (SD). Des plants d'Arabidopsis sont cultivés en
condition LD (16h de lumière) (A) ou SD (8h de lumière)
(B). Les plants sont soit sauvages (Col(WT)), soit
mutants perte-de-fonction pour COP1 (cop1-4), soit
mutants perte-de-fonction pour CO (co-10) ou doubles
mutants. Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2291449/

Les cryptochromes CRY1 et CRY2 interagissent avec SPA1 d'une manière dépendante de la lumière bleue,
ce qui entraîne l'inhibition de l'activité COP1 et l'accumulation de la protéine CO le soir des longues journées
(Lian et al., 2011 ; Zuo et al., 2011).

**Figure 7-384. La suppression par la lumière bleue médiée par CRY2 de l'activité COP1 permet à CO de ne pas être
dégradée et d'activer l'expression de FT. SPA1 (dont on a représenté les 2 domaines : CT509 et NT545) interagit avec
COP1 et augmente son activité d'ubiquitination. Il y a alors dégradation du CO en l'absence de lumière bleue. En
réponse à la lumière bleue, CRY2 photoexcité (dont on a représenté les 2 domaines PHR et CCE2) interagit avec SPA1
ce qui stimule l'interaction CRY2-COP1, entraînant la suppression de l'activité COP1. Il y alors une diminution de la
dégradation du CO et une augmentation de la transcription de FT qui est sa cible directe. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982211003526

Le phytochrome A (phyA) stabilise également CO à ce moment d'une manière dépendante de la lumière

rouge sombre (Valverde et al., 2004) qui implique notamment la désactivation de COP1 par l'interaction
phyA-SPA1 (Sheerin et al., 2015). En revanche, phyB favorise la dégradation du CO dans la première moitié
de la journée de manière dépendante de la lumière rouge (Valverde et al., 2004). La protéine PHL interagit
à la fois avec le phyB sous sa forme Pfr et CO et semble protéger CO des effets du phyB, contribuant ainsi à
l'accumulation de CO le soir (Endo et al., 2013).

673
CO active directement l'expression de FLOWERING LOCUS T (FT), qui à son tour déclenche la floraison
(Samach et al., 2000).

> Rôle de la vernalisation

La vernalisation correspond à une période prolongée de froid qui est nécessaire pour la floraison.
Certaines souches d'Arabidopsis qui fleurissent durant l'été ne connaissent pas de vernalisation (elles vivent
dans les climats plus chauds) tandis que d'autres souches d'Arabidopsis qui vivent sous des climats plus
froids ont besoin de la vernalisation pour fleurir. Cela empêche toute floraison à la fin de l'été et en automne
et restreint la floraison au printemps, période la plus favorable.

L'effet majeur de la vernalisation est la baisse de l'expression du répresseur de la floraison

FLOWERING LOCUS C (FLC) qui est un facteur de transcription à boîte MADS.

*Figure 7-385. La vernalisation induit une baisse de l'expression de FLC. Une fusion traductionnelle composée des
séquences codant pour la β-glucuronidase (GUS) ajoutées en phase avec la séquence de FLC a été réalisée.
L'expression de FLC-GUS est observée dans l'ensemble de la plantule non vernalisée mais limitée à la vascularisation
chez les plantules vernalisées. Source : https://www.nature.com/articles/nature02269

L’expression de FLC est préalablement activée par FRIGIDA (FRI) qui favorise l'insertion du variant
d'histone H3.3 dans les séquences régulatrices de FLC ce qui favorise des modifications de la chromatine
qui stimulent sa transcription (Zhao et al., 2021).

**Figure 7-386. L'activation de l'expression de FLC induite par FRI nécessite le variant d'histone H3.3. A) Phénotype
de floraison de plants d'Arabidopsis surexprimant FRI (à gauche) ou surexprimant FRI et avec une mutation perte-
de-fonction de H3.3 (h3.3kd-1;FRI). On constate que si FRI est surexprimé, Arabidopsis qui devrait fleurir en jours
longs ne fleurit pas mais si il n'y a pas de variants d'histone H3.3 fonctionnels, cet effet de FRI est bloqué. B) La
période de floraison des lignées est indiquée en condition de cultures en jours longs. Le nombre total de rosettes

674
 primaires et de feuilles caulinaires à la floraison a été compté. C) Transcrits relatifs de FLC déterminés par RT-qPCR.
Col est la souche sauvage d'Arabidopsis. Source : https://academic.oup.com/plphys/article/186/4/2051/6273358

La vernalisation doit renverser l'activation de l'expression de FLC (Li et al., 2018). En effet, FLC réprime
directement l'expression de FT et de SOC1 qui sont nécessaires à la transition florale (Helliwell et al., 2006).

*Figure 7-387. Contrôle de l'expression de FT par la vernalisation. (A) FRIGIDA active l'expression du répresseur
floral FLC (pour FLOWERING LOCUS C), qui réprime directement l'expression du gène florigénique FT (pour
FLOWERING LOCUS T) ce qui inhibe la floraison. (B) Après avoir connu le froid hivernal, les plants d'Arabidopsis
fleurissent à la fin du printemps en réponse à l'augmentation de la durée du jour. Le froid hivernal, par la voie de
vernalisation, réprime l'expression de FLC et soulage ainsi la répression de FT. Cela permet l'induction de
l'expression de FT par la voie de la photopériode pendant de longues journées pour favoriser la floraison. Une boucle
de rétroaction par FT réprime l'expression FLC. Source : https://www.cell.com/plant-
communications/fulltext/S2590-3462(19)30008-2

Signalons que les souches d'Arabidopsis qui fleurissent rapidement en été sans besoin de vernalisation
présentent des mutations perte-de-fonction dans le gène codant FRIGIDA et/ou des mutations qui atténuent
la fonction de FLC (Michaels et al., 2003). Lors de la colonisation récente des îles du Cap Vert par des
Arabidopsis, il y a eu une sélection de mutations sur le gène FRIGIDA et FLC qui permettent d'accélérer la
mise à fleur ce qui augmente la fitness de ces plantes dans cet environnement (Fulgione et al., 2022).

La vernalisation provoque une baisse progressive (sur quelques mois) de l'acétylation de l'histone H3 et
provoque la déméthylation progressive de H3K9 par VRN1/VIN3 dans les séquences régulatrices de FLC
(Sung et al., 2004, Song et al., 2013). L'exposition au froid active aussi l'expression du long ARN non codant
(lncARN), COLDAIR qui est codé dans le premier intron de FLC. COLDAIR recrute la protéine PRC2 (de la
famille des gènes Polycomb) qui aboutit à la triple méthylation répressive de H3K27 dans les séquences
régulatrices de FLC (Heo et Sung, 2011). La quantité de H3K27me3 est proportionnelle à la période de froid
que la plante a traversé. Une partie de l'organisation générale de la chromatine change lors de la
vernalisation et on observe les deux allèles de FLC se rapprocher (Zhu et al., 2015).

675
 **Figure 7-388. La vernalisation s'accompagne
d'une remodèlement de la chromatine à l'échelle
du noyau qui rapproche les deux locus de FLC qui
seront inhibés ensemble.
Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283614004707

La mémoire de la vernalisation, c'est-à-dire le maintien à un état silencieux du locus FLC permet aux plantes
de fleurir, mais est réinitialisé ou effacé lors le développement des graines ce qui garantit que chaque
génération doit être vernalisée pour acquérir la compétence de fleurir (Choi et al., 2009 ; Luo et al., 2020).

*Figure 7-389. Expression de FLC au cours du cycle de vie d’une plante, de la germination de la génération n à
l’embryogenèse de la génération n+1, en lien avec la dynamique de déposition et d’élimination de H3K27me3 sur le
locus. Source : Pierre Baduel. https://planet-vie.ens.fr/thematiques/developpement/controle-du-developpement/comprendre-le-role-de-
la-chromatine-dans-la

> Morphogenèse florale et identité des verticilles

Le développement floral peut être divisé en plusieurs stades selon des structures morphologiques
spécifiques. Au cours des stades 1 et 2, un groupe de cellules commence à former le méristème floral
hémisphérique qui augmente progressivement sa taille. Au stade 3, des ébauches des sépales apparaissent,
qui s'allongent pour générer des structures dépassant partiellement le méristème floral au stade 4.

676
 **Figure 7-390. Divisions et croissance au début
de la morphogenèse florale. Micrographies
électroniques à balayage lors du développement
d'un méristème floral (A,B) et cartographie de
taux de croissance (C, D). 23h séparent les photos
A et B (et l'analyse C et D). Les primordiums
floraux (P1–3) sont numérotés du plus jeune
primordium observé dans la séquence au plus
ancien. Les traits croisés tracés sur les
micrographies pointent vers les directions de
courbure, la longueur des bras est proportionnelle
à la valeur de courbure dans cette direction. Le
bras apparaît en rouge si, dans cette direction, la
surface est concave (courbure négative). Le bras
noir pointe vers les directions convexes (courbure
positive). Les taux de croissance surfaciques sont
indiqués pour les cellules sur le tracé des contours
cellulaires tels qu'ils sont apparus au début (C) et
à la fin (D) de l'intervalle de temps considéré. La
carte des couleurs pour les tracés du taux de
croissance représente le taux de croissance
surfacique. Les bras transversaux sont orientés
selon les directions principales du taux de
croissance. Leur longueur est proportionnelle à la
valeur du taux de croissance principal
correspondant. Les bras apparaissent en rouge si
un taux de croissance négatif, c'est-à-dire une
contraction, a eu lieu dans leur direction. Barres =
15 μm. Source :
https://academic.oup.com/jxb/article/57/3/571/510668
Au stade 5, les ébauches d'étamines et de pétales apparaissent sur les flancs du méristème floral. Au stade
6, les sépales recouvrent complètement les structures internes. En parallèle, le méristème floral subit une
différenciation terminale et les carpelles se différencient au niveau de la zone centrale. Au cours des stades
7 à 9, le développement des organes floraux se poursuit et le stigmate apparaît au sommet du gynécée. Au
cours des stades 10 à 12, tous les organes floraux, en particulier les pétales et les étamines, s'allongent
rapidement, ce qui donne des pétales de longueur similaire à celle des étamines. Au stade 13, les étamines
s'allongent plus rapidement que le gynécée pour atteindre le sommet du stigmate ce qui permet
l'autopollinisation et la fécondation réussie des ovules. Au cours des stades 14 à 19, les siliques et les graines
se développent pour devenir matures, et les pétales et les sépales se flétrissent progressivement
(Kwiatkowska, 2006).

La production réussie d'organes floraux (nombre approprié d'organes floraux disposés dans des positions
normales) nécessite un maintien et une régulation stricts du méristème floral. Aux stades 1 à 2 du
développement floral, le méristème floral utilise des mécanismes de régulation similaires à ceux du MAC.
Les gènes affectant la taille du MAC affectent généralement la taille du méristème floral. Les mutants clv1
présentent des méristèmes floraux élargis, entraînant une augmentation du nombre d'organes dans les
quatre verticilles floraux et même des verticilles supplémentaires (Clark et al., 1993).

677
 *Figure 7-391. Fleurs d'Arabidopsis sauvage et mutantes
perte-de-fonction clavata1. Voici des photos de
Landsberg de type sauvage (A), un allèle clavata1 faible,
clv1-6 (B), et un allèle clavata1 fort, clv1-4 (C). Toutes les
plantes portaient la mutation erecta. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article-
pdf/119/2/397/1124578/397.pdf

Les mutants clv3 présentent des défauts du méristème floral similaires à clv1, suggérant que CLV3
fonctionne avec CLV1 pour maintenir l'identité du méristème floral à travers la même boucle de rétroaction
CLV-WUS que dans le MAC (Sun et Ito, 2010).
Après le stade floral 3, le mécanisme moléculaire régulant le méristème floral devient différent de celui du
MAC. Au cours du stade floral 3 à 6, WUS favorise l'expression d'AGAMOUS (AG), spécifique des pièces
fertiles de la fleur (Lenhard et al., 2001; Lohmann et al., 2001). Avec le développement floral, AG et le
complexe répressif polycomb 1 (PRC1) commencent ensemble à inhiber l'expression de WUS (Liu et al.,
2011). En parallèle, AG commence à induire progressivement l'expression de KNUCKLES (KNU), un
répresseur à doigts de zinc de type C2H2 qui recrute davantage PRC2 pour inhiber l'expression de WUS
(Sun et al., 2009, Sun et al., 2014, Sun et al., 2019).

*Figure 7-392. Rôle de AGAMOUS et de la protéine du complexe PRC2 CLF (CURLY LEAF) dans la terminaison de
l'activité du méristème floral. On observe des fleurs de plants sauvages (Ler) ou de simples ou doubles mutants perte-
de-fonction d'AGAMOUS (ag-10) ou de CURLY LEAF (clf-47) ainsi que des coupes longitudinales. Les simples mutants
ont des pistils élargis, ce qui est encore plus spectaculaire dans le double mutant. Les coupes révèlent dans les pistils
la présence de structures surnuméraires (flèches rouges en E) montrant que l'activité du méristème se poursuit
anormalement. Source : https://academic.oup.com/plcell/article/23/10/3654/6098222

678
 *Figure 7-393. Expression de WUS et de KNU lors de la morphogenèse florale. Des plants transgéniques exprimant
le gène rapporteur GUS soit sous le contrôle des séquences régulatrices de WUS (D-F), soit sous le contrôle des
séquences régulatrices de KNU (G-I) sont observés en coupe aux stades floraux 6 précoce (D, G), 6 tardif (E, H) et 7
(F, I). Barre d'échelle = 100 micromètres.
Source : https://academic.oup.com/plcell/article/31/7/1488/5985709?login=true

L'action de KNU et des complexes PRC2 aboutit à l'accumulation de triméthylation sur la lysine 27 de
l'histone H3 (H3K27me3) qui est une marque épigénétique répressive de la transcription sur les séquences
régulatrices de WUS (Sun et al., 2019).

Enfin, lorsque la fleur se développe jusqu'au stade 6, le méristème floral est différencié en phase terminale
et les carpelles commencent à se développer. Une étude récente a montré que KNU peut inhiber directement
l'expression de CLV1 et CLV3 lors de la détermination du méristème floral. De plus, KNU peut interagir avec
WUS pour inhiber l'expression de CLV3 dans la zone centrale, et l'interaction KNU-WUS interrompt les
homodimères WUS et les hétérodimères WUS-HAIRYMERISTEM 1, entraînant la terminaison du méristème
floral (Shang et al., 2021).

679
 **Figure 7-394. Rôle de KNUCKLES (KNU) dans l'extinction du méristème floral (FM). Le rôle de KNU est mis en
valeur mais d'autres protéines interviennent en parallèle. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2102826118

L'identité des verticilles floraux (sépales, pétales, étamines, carpelles) est contrôlée par un réseau
de régulation génique appelé modèle ABCE. Chaque verticille est spécifié par une combinaison de
facteurs de transcription codés par les gènes de classe A, B, C et la présence des produits des gènes
de classe E est indispensable pour tous les verticilles (en l'absence de tous les gènes de classe E (ou
de tous les gènes de classe A,B,C) , il n'y a plus de verticilles floraux mais des feuilles qui sont
produites, ce qui indique d'ailleurs que les pièces florales sont des feuilles modifiées).

Les protéines en question font partie de la famille des facteurs de transcription à boîte MADS, du
nom de leur domaine de fixation à l'ADN (de 56 acides aminés qui se trouve plutôt dans la partie N-
terminale). Les mutations des gènes correspondant provoquent des mutations homéotiques (un
verticille transformé en un autre) mais ce ne sont pas des gènes codant des facteurs de transcription
à homéoboîte comme les gènes Hox des animaux !

Le domaine MADS de ces facteurs de transcription se fixe sur des séquences spécifiques de l'ADN appelées
"boîtes CArG" avec pour séquence consensus 5′-CC(A/T)6GG-3′.

Chaque verticille est spécifié par un complexe de 4 facteurs de transcription MADS (quartet) : au
moins un facteur de classe E est toujours présent. Dans les régions donnant naissance aux sépales,
il y a expression de facteurs de classe A, dans celles donnant naissance aux pétales, il y a expression
de facteurs de classe A et de classe B, dans celles donnant naissance aux étamines, il y a expression
de facteurs de classe B et de classe C et dans celles donnant naissance aux carpelles, il y a expression
de facteurs de classe C. Chaque combinaison se fixe sur des sites de fixation de l'ADN qui sont en
grande partie différents et donc activent des gènes cibles différents (Smaczniak et al., 2017).

*Figure 7-395. L'identité des verticilles floraux est déterminée par l'expression d'une combinaison de facteurs de
transcription (modèle ABCE ici étendu aux ovules => modèle ABCDE). Les gènes de classe A (APETALA1 (AP1) chez
Arabidopsis) sont nécessaires à la formation des sépales, les gènes de classe B (APETALA3 (AP3) et PISTILLATA (PI)
chez Arabidopsis), ainsi que les gènes de classe A, sont nécessaires pour la détermination des pétales. Les gènes de
classe B, ainsi que ceux de la classe C (AGAMOUS (AG) chez Arabidopsis), sont nécessaires à l'établissement des
étamines, et les gènes de la classe C seuls sont nécessaires à la formation des carpelles. Le modèle ABC a été
progressivement élargi pour inclure les gènes de fonction de classe D et E, nécessaires respectivement aux ovules et
à la stabilisation des verticilles floraux. Les gènes de classe D chez Arabidopsis comprennent SEEDSTICK (STK) ainsi
680
 que SHATTERPROOF1 et SHATTERPROOF2 (SHP1 et SHP2). La fonction E au sens large nécessite au moins un des
quatre gènes SEPALLATA (SEP1, SEP2, SEP3 et SEP4). Source :
https://www.researchgate.net/publication/329035681_When_Bs_Are_Better_than_As_the_Relationship_between_B-Class_MADS-
Box_Gene_Duplications_and_the_Diversification_of_Perianth_Morphology

Les gènes de classe A sont APETALA1 (AP1) et APETALA2 (AP2), les gènes de classe B sont
APETALA3 (AP3) et PISTILLATA (PI), le gène de classe C est AGAMOUS (AG). Les gènes de classe E sont
SEPALLATA1 (SEP1), SEP2, SEP3 and SEP4. Ces gènes de classe E ne sont pas complètement redondants
avec SEP3 qui semble jouer un rôle plus important que les autres.

Il n'y a pas de gènes de classe D impliqués dans le développement des verticilles floraux au sens strict mais
ils sont impliqués dans le développement des ovules à l'intérieur des carpelles d'où le modèle complet
ABCDE.

L'expression ectopique du gène de classe E SEP3 avec des gènes de classe B et C dans des feuilles aboutit à
des organes qui ressemblent à des étamines ce qui montre que les gènes BCE ne sont pas seulement
nécessaires à la formation de pièces florales mais également partiellement suffisants pour transformer un
organe végétatif en un organe reproducteur (Honma et Goto, 2001). De même l'expression ectopique de
SEP3 et des deux gènes de classe B AP3 et PI aboutit à transformer les feuilles en structures ressemblant à
des pétales.
*Figure 7-396. L'expression ectopique d'un gène de
classe E (SEP3) et de deux gènes de classe B (AP3 et PI)
aboutit à transformer les feuilles en structures
pétaloïdes. Plante 35S::PI;35S::AP3;35S::SEP3 âgée de
trois semaines. Les cotylédons (C) sont plutôt normaux,
mais les feuilles se transforment en organes pétaloïdes
(il ne devrait y avoir à ce stade qu'une rosette de feuilles
vertes). Les nombres indiquent l'ordre de
développement des feuilles. Des étamines (S) se forment
au sommet (sans doute dû à l'activation du gène de classe
C AGAMOUS). Barre d'échelle = 1 mm. Source :
https://www.nature.com/articles/35054083

Les composants d'un complexe de facteur de transcription MADS voient leur expression activée
indépendamment mais ensuite dans une rétroaction positive de renforcement, le complexe lui-même active
l'expression de ses composants.
**Figure 7-397. Rétrocontrôle positif de l'expression des
gènes B, C et E au cours du développement des étamines.
Au cours du développement des étamines, les
expressions de AG, AP3, PI et SEP3 sont initialement
activées indépendamment (flèches grises). LEAFY (LFY)
est responsable de l'activation initiale d'AG, alors que
l'activation précoce d'AP3/PI se produit dans les zones
du méristème qui expriment à la fois LFY et UFO. Les
protéines AG, AP3, PI et SEP3 (cercles) fonctionnent
ensemble dans un complexe pour favoriser le
développement des étamines et aussi pour amplifier et
maintenir leur propre expression. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/132/3/429/43070/Transcriptional-program-controlled-by-the-floral

681
Les gènes de classe A répriment l'expression des gènes de classe C et inversement. Ainsi, en cas de
perte-de-fonction des gènes de classe C, l'expression des gènes de classe A s'étend sur tous les
verticilles et de manière symétrique c'est le cas pour les gènes de classe C en cas de perte-de-
fonction des gènes de classe A.

AGAMOUS est indispensable à la formation des grains de pollen car il active l'expression de
SPOROCYTELESS (SPL) qui est nécessaire à cette formation (Ito et al., 2004). Le développement des
nectaires qui sont des glandes sécrétrices de nectar qui attirent les insectes est aussi dépendant de
AGAMOUS qui active l'expression de CRABS CLAW (CRC) qui dirige leur formation (Morel et al., 2018). En
revanche, AGAMOUS inhibe l'expression des gènes qui permettent le développement des trichomes (des
structures typiquement foliaires) ou qui sont impliqués dans la photosynthèse (O'Maoiléidigh et al., 2013;
O'Maoiléidigh et al., 2018).

Le modèle ABCE a permis d'interpréter correctement les fleurs avec des structures moins classiques que
celles d'Arabidopsis. Par exemple, les aristoloches ont des fleurs formées d'un périanthe en forme de trompe
et d'un gynostemium considéré comme la fusion entre les étamines et la région stigmatique des carpelles.
L'analyse génomique et transcriptomique d'une aristoloche a confirmé une expression généralisée des
gènes de classe B (AP3 et PI) confirmant la nature pétaloïde du périanthe et la fusion des verticilles
étamines/carpelles (Qin et al., 2021).

682
Partie 8

DU DEVELOPPEMENT AUX PATHOLOGIES

Les cellules tumorales

Chez les organismes adultes, les tissus sont maintenus par un équilibre entre mort cellulaire et
régénération. Cette homéostasie cellulaire est contrôlée par un ensemble de régulations croisées
complexes entre les composants du cycle cellulaire, les molécules de signalisation et la matrice
extracellulaire. Il arrive parfois que des cellules échappent à ces contrôles et se mettent à proliférer
de manière incontrôlée. Ce dysfonctionnement se met en place progressivement, par accumulation
de mutations et sélection des cellules les plus efficaces à échapper aux contrôles de leur
prolifération.

*Figure 8-1 Caractéristiques des cellules tumorales. Les cellules tumorales échappent notamment aux contrôles qui
freinent le cycle cellulaire (icone STOP), maintiennent de manière anormale des voies de signalisation intracellulaire
favorables à la prolifération et peuvent se répliquer "à l'infini". C'est pourquoi l'étude du cycle cellulaire est
importante non seulement en biologie du développement mais aussi en cancérologie. Les cellules tumorales
échappent aussi à l'apoptose et aux cellules immunitaires. Elles modifient à leur profit leur micro-environnement,
par exemple en favorisant la vascularisation. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2021.661583/full

Un contrôle de l'intégrité du génome déficient

L'ADN génomique est soumis à des modifications d'origine interne (dépurinations, actions des
espèces réactives de l'oxygène générées par le métabolisme...) et externe (radiations, molécules
génotoxiques telles que le benzopyrène qu'on trouve dans la fumée du tabac,...). Les mécanismes de
réparation de l'ADN sont dans ce contexte essentiels au maintien de l'intégrité des cellules.
Cependant, les cellules tumorales sont issues de l'accumulation de mutations. Les enzymes de
réparation de l'ADN y sont souvent défectueuses et en parallèle les mécanismes qui provoquent
l'apoptose des cellules où trop d'anomalies génétiques se sont accumulées sont inhibés.

Des mutations ponctuelles peuvent s'accumuler mais des modifications de plus grande ampleur
peuvent aussi être observées. Les fusions de gènes, résultant de réarrangements chromosomiques,
sont des facteurs causatifs importants dans un large éventail de cancers. Ils représentent des
indicateurs de première ligne pour le diagnostic, le pronostic et les biomarqueurs de sous-types de cancer,
et servent de cibles pour le développement de médicaments. Actuellement, plus de 25.000 fusions ont été
identifiées dans 33 types de cancer qui correspondent à 16,5 % de cas de cancer (Gao et al., 2018). Dans les
683
tumeurs d'origine hématologiques, on peut citer les fusions BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chronique,
PML-RARA dans la leucémie promyélocytaire aiguë, RUNX1-RUNX1T1 dans la leucémie myéloïde aiguë et
SIL-TAL1 dans la leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T pédiatrique.

La fusion BCR-ABL est causée par une une translocation qui provoque échange de fragments d'ADN
entre le chromosome 9 et le chromosome 22. Le chromosome 22 altéré possède alors les séquences
codantes de deux gènes (BCR et ABL) côte à côte alors que normalement elles sont bien séparées
(ABL sur le chromosome 9 et BCL sur le chromosome 22).
*Figure 8-2. Translocation entre les chromosomes 9 et 22
créant le gène chimérique BCR-ABL dont l'expression
provoque la leucémie myéloïde chronique. Source :
https://www.hindawi.com/journals/isrn/2014/59648
3/

Vidéo sur pourquoi la protéine fusion BCR-ABL qui résulte de cette translocation est oncogène :
https://youtu.be/KJpp1jRuAPs

Les mutations génétiques peuvent s'accumuler graduellement mais aussi de multiples mutations peuvent
avoir lieu simultanément comme lors de la chromothripsis qui est caractérisée par de multiples cassures
double brin dans une région chromosomique. Ces fragments de chromosomes sont ensuite "racolés"
ensemble par les protéines de réparation de l'ADN mais pas forcément dans le bon ordre. Cela concerne 2-
3% des tumeurs (et 25% des tumeurs osseuses) (Stephens et al., 2011).
**Figure 8-3. La chromothripsis. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867410013772

L'accumulation d'anomalies génétiques à différentes échelles que nous avons vu dans les exemples
précédents provient de défauts dans les systèmes de réparation de l'ADN. Normalement, un dommage à
l'ADN (cassure simple ou double brin, dimère de thymine induit par les UV...) est détecté et une voie de
signalisation est activée provoquant l'intervention d'enzymes de réparation. Par exemple pour les cassures
double brins :

684
*Figure 8-4. Réponse de la cellule aux cassures double-brin de l'ADN. Les cassures double-brin sont reconnues par
des protéines capteurs telles que le complexe Mre11. Cela conduit à l'activation d'ATM et des kinases apparentées
qui favorisent les modifications post-traductionnelles rapides (PTM) sur de nombreuses protéines et le remodelage
de la structure de la chromatine autour des sites de rupture. Les protéines effectrices telles que les kinases Chk1 et
Chk2 amplifient le signal et les cellules peuvent alors activer les points de contrôle du cycle cellulaire, réguler la
transcription, la traduction et le métabolisme et activer les processus de réparation de l'ADN appropriés. Dans
certains contextes cellulaires, ou face à des lésions irréparables, les cellules peuvent activer l'apoptose ou la
sénescence. Le résultat général est la prévention de l'instabilité génomique et des résultats pathologiques qui
l'accompagnent. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2013.00037/full

ATM contrôle les réponses aux dommages de l'ADN lors de la formation d'une cassure double brin de
l'ADN. Il phosphoryle les histones de type H2AX sur la sérine 139 pour former γ-H2AX. Cette forme
d'histone permet d'obtenir de l'ADN moins condensé ce qui facilite le recrutement des enzymes de
réparation (Paull et al., 2000). La perte d'activité de la kinase ATM ou l'hétérozygotie pour les variants
pathogènes du gène ATM augmentent les risques de cancer (Choi et al., 2016).

Parmi les protéines impliquées dans la réparation de l'ADN, il faut mentionner BRCA1 et BRCA2
dont des mutations des gènes sont impliquées dans 50% des cancers du sein et dans 75% des
cancers de l'ovaire d'origine familiale. Ils participent aux recrutements des nucléases (telle que
Mre11) et des recombinases (tel que Rad51) qui interviennent lors de la réparation de l'ADN.

*Figure 8-5. Interactions de BRCA1 et de BRCA2 avec la recombinase RAD51. (A) En réponse à des lésions de
l'ADN, BRCA1 facilite le transport de RAD51 du cytoplasme vers le noyau. (B) Dans le noyau, BRCA2 aide RAD51
à se positionner correctement pour garantir une réparation de l'ADN sans erreur par recombinaison homologue.
HR = recombinaison homologue. Source :
https://www.researchgate.net/publication/221754538_The_relevance_of_BRCA_genetics_to_prostate_cancer_pathogenesis_and_treatment

685
Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie héréditaire rare (2,3/1 000 000 naissances en Europe
occidentale) avec une pénétrance de 100 %, autosomique récessive, caractérisée par un défaut enzymatique
dans la voie de réparation de l'ADN appelée réparation par excision de nucléotide (NER).
Les patients XP présentent généralement une sensibilité extrême à l'exposition aux UV (avec pour
conséquence des coups de soleil douloureux), une sécheresse cutanée (également appelée xérose), des
anomalies pigmentaires progressives ressemblant à des taches de rousseur (comme le suggère le terme
"pigmentosum") et une incidence accrue de tumeurs malignes de la peau au niveau du visage et du cou
(Piccione et al., 2021).
*Figure 8-6. Réparation défectueuse des dimères de
thymine induits par les UV chez les patients atteints de
xeroderma pigmentosum. Chez ces patients, il existe des
mutations perte-de-fonction de l'un ou plusieurs des
gènes codant les protéines XPC, XPE, XPA, XPG et XPB qui
participent à la reconnaissance des dommages à l'ADN
et au déroulement local de l'ADN qui sont nécessaires
pour la réparation. Source :
https://www.mdpi.com/2075-4426/11/11/1146

Pour laisser le temps à la cellule de réparer son ADN, le cycle cellulaire doit être stoppé avant la
réplication. C'est ce que réalise p53, un facteur de transcription. Habituellement, il est dégradé après
ubiquitinylation à la suite de son association avec MDM2. MDM2 provoque aussi une inactivation des
capacités de p53 à activer la transcription et stimule son export du noyau.

*Figure 8-7. L'activité inhibitrice de MDM2 sur p53. Dans des conditions cellulaires normales, sans stress particuliers,
MDM2 provoque l'inactivation et la dégradation de p53 de multiples manières. Source :
http://perspectivesinmedicine.cshlp.org/content/7/5/a026245.full.pdf
686
Lorsque des lésions endommagent l'ADN, les voies de signalisation activées inhibent MDM2 permettant à
p53 d'agir en stoppant le cycle cellulaire. Si p53 n'est pas fonctionnelle (comme c'est le cas dans 50%
des tumeurs), les cellules endommagées continuent à se répliquer, propageant à la génération
suivante des mutations non réparées.

L'instabilité du génome peut aussi provenir de dysfonctionnements de la mitose si les chromosomes

ne sont pas répartis correctement entre les deux cellules filles ce qui peut mener à une aneuploïdie
: un nombre anormal de chromosomes dans les cellules. Cela peut être la conséquence par exemple de
défauts dans la duplication du centrosome pendant la phase S menant à des fuseaux mitotiques
multipolaires.
*Figure 8-8. Fuseaux mitotiques multipolaires (vert)
dans une cellule tumorale en division. Les centrosomes
sont observés grâce à un immunomarquage révélé en
rouge. On observe que la cellule tumorale a le double du
nombre de centrosomes par rapport à une cellule
normale dans cette phase du cycle (métaphase). Les
chromosomes sont marqués en bleu. Source :
https://www.hhmi.org/bulletin/fall-2014/errors-
division

Une résistance à la mort cellulaire

Les cellules meurent normalement par apoptose si elles ne reçoivent pas des signaux de survie de
la part de leur environnement (ligands solubles ou composants de la matrice extracellulaire).
L'apoptose est aussi déclenchée si les cellules accumulent trop de mutations qui ne peuvent pas être
réparées.

Les cellules tumorales arrivent à échapper à ces mécanismes d'activation de l'apoptose, souvent par
perte de protéines promotrices d'apoptose (qui sont alors considérées comme codées par des gènes
suppresseurs de tumeurs). Les cellules tumorales expriment aussi généralement des niveaux élevés
de protéines anti-apoptotiques telles BCL-2, BCL-xL ou Mcl-1. Ces propriétés sont une des causes de la
résistance des cellules tumorales aux traitements (Lin et al., 2017).

Des molécules inhibant BCL-2, BCL-xL ou Mcl-1 sont en cours de tests cliniques pour traiter des cellules
tumorales rebelles aux traitements habituels (par exemple le navitoclax (Zhu et al., 2015)).
**Figure 8-9. L'inhibition conjointe de protéines anti-
apoptotiques et pro-proliférations aboutit à la mort de
cellules de mélanome. Des lignées de mélanomes en
culture sont incubés en présence/absence de navitoclax
(ou BCLi) qui inhibe BCL-2 et BCL-xL (2 protéines anti-
apoptotiques) et de alisertib (ou AURKAi) qui inhibe la
kinase Aurora A qui est impliquée dans la prolifération
cellulaire. On colore ensuite les cultures cellulaires avec
du crystal violet. Des études complémentaires montrent
que la diminution du nombre de cellules provoquée par
les traitements est due essentiellement à une
augmentation de l'apoptose. Source :
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)01718-1

687
 *Figure 8-10. Effet sur l'apoptose dans une tumeur d'un
traitement avec un inhibiteur de Mcl-1. Des souris avec
des carcinomes de l'œsophage ont été traités (ou non,
control) avec différentes doses de A-1210477, un
inhibiteur de Mcl-1. L'apoptose a été mesurée grâce à
une immunohistochimie anti-caspase 3 activée et un
marquage TUNEL. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5777705/

Ces molécules ont aussi pour effet de déclencher la mort de cellules sénescentes qui peuvent favoriser le
développement de tumeurs à partir des cellules voisines.

A la suite de dommages à l'ADN qui ne sont pas réparées suffisamment rapidement, p53 active
normalement l'apoptose. Elle réalise cette fonction notamment en stimulant la transcription du gène
codant la protéine PUMA qui inhibe l'activité des acteurs anti-apoptotiques et stimule l'activité des acteurs
pro-apoptotiques (Wang et al., 2007).
*Figure 8-11. L'activation de la transcription de PUMA
par p53 est nécessaire à une bonne induction de
l'apoptose en cas de dommages à l'ADN. Les cellules
humaines de cancer colorectal HCT116 avec les
génotypes indiqués (sans p21 pour éviter que les cellules
n'entrent en quiescence, avec ou sans PUMA (PUMA-KO)
et avec ou sans les 2 sites de fixation de p53 sur le
promoteur de PUMA (BS-KO)) ont été infectées avec un
adénovirus permettant la surexpression de p53 (Ad-
p53) ou traitées avec des agents qui endommagent
l'ADN, le 5-FU (50 μg/ml), l'oxaliplatine (50 μM),
l'étoposide (40 μM), l'adriamycine (0,4 μg/ml) ,
camptothécine (100 nM) ou irradiation γ (IR; 12 Gy).
L'apoptose est mise en évidence par coloration nucléaire.
Après les traitements indiqués pendant 48 h, les cellules
attachées et flottantes ont été fixées et analysées par
microscopie à fluorescence après coloration au Hoechst
33258. Les cellules avec des noyaux fragmentés et
condensés ont été comptées comme des cellules
apoptotiques. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.0700020104

p53 est inactivé dans environ 50% des cancers, ce qui veut dire que dans ce cas, les mutations non
réparées peuvent s'accumuler dans les cellules tumorales sans que l'apoptose ne soit déclenchée.
Signalons que dans les cancers du col de l’utérus, c'est la protéine virale du papillomavirus HPV appellée E6
qui se fixe spécifiquement sur p53 et le fait dégrader par recrutement d'une ubiquitine ligase.

En plus de l'apoptose, signalons que la ferroptose est aussi parfois inhibée dans les cellules tumorales. La
ferroptose est une mort cellulaire par accumulation de peroxides de phospholipides. Cette accumulation
peut être provoquée par des ions Fe2+ d’où son nom. L'activation oncogénique de la voie PI3K-Akt-mTOR
688
peut aboutir à une inhibition de la ferroptose par activation de l'expression de la stéaroyl-CoA desaturase-
1 (SCD1), une enzyme du métabolisme lipidique qui a un effet protecteur (Yi et al., 2020).
**Figure 8-12. La voie de signalisation PI3K et Akt est
protectrice de la ferroptose dans des cellules de
carcinome du sein. Les cellules ont été traitées avec
(rouge) ou sans (bleu) l'inhibiteur de PI3K GDC-0941
(2 μM), l'inhibiteur d'AKT MK-2206 (2 μM) et aussi en
présence/absence de RSL3 (1 μM) qui induit la
ferroptose ou l'inhibiteur de ferroptose Ferrostatine-
1 (Fer-1, 1 μM) pour 12 h (dans des cellules de
carcinome du sein BT474) ou 24 h (dans des cellules
de carcinome du sein MDA-MB-453). La mort
cellulaire a été mesurée. Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2017152117

Un cycle cellulaire hors de contrôle

Normalement, les cellules doivent recevoir un signal pour avancer dans le cycle cellulaire, répliquer
leur ADN et entrer en mitose. Ce signal correspond souvent à la réception d'un ou de plusieurs
facteurs de croissance sur des récepteurs qui activent alors des voies de signalisation
intracellulaires. Ces voies permettent souvent de passer le point de restriction en G1 à partir duquel
des facteurs de croissance ne sont plus nécessaires pour continuer dans les phases suivantes du
cycle. Les cellules tumorales ont en général perdu la nécessité de recevoir ce signal, y compris en
début de phase G1 où elles sont capables de passer le point de restriction sans l'aide de facteurs de
croissance. Cela leur confère un avantage décisif par rapport aux cellules "normales" voisines.

Les protéines qui contrôlent directement le cycle cellulaire sont bien sûr au premier rang des
altérations que l'on retrouve dans les cellules tumorales. Par exemple, le gène codant Rb présente
deux allèles défectueux dans les tumeurs de l'œil appelées rétinoblastome. La fonction normale de
Rb est d'inhiber la progression du cycle cellulaire de G1 vers S. Souvent, les patients ont hérité de
leur parent d'un allèle défectueux et lorsque l'autre allèle est muté dans certaines cellules, celles-ci
ont beaucoup de chance de devenir tumorales.
**Figure 8-13. Avancée dans le cycle cellulaire de G1 à S.
La protéine Rb inhibe E2F qui active la progression dans
le cycle cellulaire, déclenchant la prolifération.
Normalement, ce n'est seulement lorsque des facteurs
de croissance sont présents que CDK4/6 (associé à la
cycline D) phosphoryle Rb et l'inactive, libérant l'action
de E2F. Si Rb n'est plus fonctionnel, E2F est actif quelque
soit l'activité de CDK4/6. Source :
https://www.cell.com/cell-
reports/pdfExtended/S2211-1247(20)30394-6

Rb est considéré comme un gène suppresseur de tumeur et comme on le voit sur cet exemple, les
deux allèles doivent être atteints par une mutation perte-de-fonction pour favoriser le
développement des tumeurs (propriété d'allèle récessif). C'est l'inverse pour les proto-oncogènes
qui sont des protéines qui favorisent l'avancée dans le cycle cellulaire et où un seul allèle gain-de-

689
fonction (qui transforme ce proto-oncogène en oncogène) suffit à favoriser la tumorigenèse
(propriété d'allèle dominant).

Des récepteurs à des facteurs de croissance peuvent être mutées dans les cellules tumorales et être
constitutivement actives, c'est-à-dire capables d'activer les voies de signalisation en aval, même en
l'absence de ligand. Les récepteurs peuvent aussi être surexprimés par mutations dans les
séquences régulatrices de leur gène ou par amplification génique. C'est le cas par exemple du récepteur
aux EGF (EGFR) dans certaines tumeurs du poumon ou du cerveau.

*Figure 8-14. Mutations ou surexpression de l'EGFR dans les tumeurs pulmonaires et cérébrales. Les mutations
ponctuelles et les courtes délétions affectant le domaine kinase intracellulaire de EGFR sont principalement
détectées dans certaines tumeurs pulmonaires. Les mutations primaires sont situées dans les exons 18 à 21. Dans
les tumeurs cérébrales primaires, le mécanisme le plus courant d'activation de l'EGFR implique la surexpression du
récepteur et l'amplification génique. De plus, l'EGFR des tumeurs cérébrales est affecté par des délétions internes qui
conduisent à l'expression de mutants tronqués. EGFRvIII est la forme tronquée constitutivement active majeure. Elle
est associée à de mauvaises réponses aux thérapies conventionnelles. La duplication de la séquence codant pour le
domaine kinase et une fusion de gènes sont des aberrations plus rares dans les tumeurs cérébrales. Source :
https://www.mdpi.com/2072-6694/13/11/2748

HER2/ErbB2 qui est aussi un récepteur aux EGF est surexprimé dans 25% des cancers du sein (Slamon et
Clark, 1988). Dans 50% des cas des cancers du sein triplement négatif (pas d'expression de HER2/Erb2 et
de récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone), il y a une surexpression de EGFR (Alvarez et al., 2010).

En aval des récepteurs, le long des voies de signalisation, des mutations et des surexpressions des
différents acteurs peuvent aussi intervenir dans les processus tumoraux. Par exemple, en aval des
récepteurs de la famille des EGFR, la suractivation de STAT3 ou de STAT5 favorise la progression des
cellules vers un stade tumoral. Par ailleurs, Cette voie peut aussi être activée par des cytokines pro-
inflammatoires ce qui permet de lier inflammation et tumorigenèse (Johnson et al., 2018).

La mutation BRAFV600E se retrouve dans la moitié des cas de mélanomes. Le changement de la valine en
acide glutamique change la conformation de la sérine/thréonine kinase BRAF et la rend
constitutionnellement active alors que d'habitude, son activité nécessite la fixation d'un facteur de
croissance sur un récepteur de la cellule. D'autres mutations sont aussi trouvées sur le même site comme
BRAFV600K de manière moins fréquente mais avec des effets similaires.

690
 *Figure 8-15. Activité normale ou pathologique de BRAF. Le vemurafenib est un composé chimique qui inhibe la
forme mutée de BRAF et qui donne de bons résultats thérapeutiques. Source : https://translational-
medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-10-85

La protéine APC est codé par un gène suppresseur de tumeur. Elle fait partie d'un complexe qui favorise la
phosphorylation de la β-caténine par GSK3 et sa dégradation. Si la β-caténine n'est pas dégradée, elle rentre
dans le noyau et se lie aux facteurs de transcription LEF/TCF et active la transcription de gènes favorisant
la prolifération comme c-Myc ou Cycline D. Une baisse d'expression ou une mutation perte-de-fonction
d'APC provoque l'entrée systématique de la β-caténine dans le noyau et l'activation continuelle de la
transcription de gènes favorables à la prolifération. On trouve fréquemment des mutations ou des
surexpressions d'APC dans les cellules tumorales colo-rectales.
**Figure 8-16. Différentes manières avec lesquelles on a
constaté des pertes de fonction ou d'expression d'APC
dans les cellules cancéreuses. Une mutation peut aboutir
à un codon STOP précoce et à une protéine APC tronquée,
non fonctionnelle. Le promoteur du gène APC peut être
hyperméthylé aboutissant à l'inhibition de son
expression. Le facteurs de transcriptions inhibiteurs
EZH2 et YY1 peuvent aussi être surexprimés ou encore
les facteurs de transcription activateurs CDX2, CEBPZ,
USF1/2 peuvent être sous-exprimés. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.653222/full

Le gène suppresseur de tumeur BRCA1 code une protéine qui participe aux voies de réparation des cassures
double-brin de l'ADN mais qui interagit aussi directement avec le récepteur aux œstrogènes ER-α en
inhibant son action qui favorise la prolifération.

691
 **Figure 8-17. Interaction dans un même complexe entre
BRCA1 et ER-α. Des extraits protéiques de cellules de
tumeurs de glande mammaire MCF-7 (qui expriment
beaucoup de récepteurs aux œstrogènes) et de tumeurs
de prostate Du-145 (qui expriment très peu de
récepteurs aux œstrogènes) sont soumis à une
immunoprécipitation avec un anticorps anti-BRCA1 ou
anti-ER-α. Une immunoprécipitation avec un anticorps Ig
est réalisée à titre de témoin négatif. Ces fractions
immunoprécipitées sont soumises à un western-blot
avec un anticorps anti-BRCA1 ou anti-ER-α. Une
immunoprécipitation avec un anticorps Ig est réalisée à
titre de témoin négatif. On constate la présence de ER-α
dans la fraction précipitée avec l'anticorps anti-BRCA1 et
la présence de BRCA1 dans la fraction précipitée avec
l'anticorps anti-ER-α, seulement dans les cellules MCF-7.
Source :
https://www.academia.edu/download/54305986/Role_of_Direct_Interaction_in_BRCA1_Inhi201708
31-3012-v3wyqo.pdf

Les mutations perte-de-fonction de BRCA1 se retrouvent tout particulièrement dans les cellules tumorales
qui répondent aux œstrogènes (dans les glandes mammaires et les ovaires notamment). Quand BRCA1 est
moins présent, le récepteur ER-α est "trop" actif en présence d'œstrogènes et la prolifération est trop
stimulée pour que les réparations à l'ADN puissent se faire correctement (Wang et al., 2014). Tout comme
pour p53, on voit donc que réparation de l'ADN et avancée dans le cycle cellulaire sont liées et que
l'équilibre entre ces deux processus est rompu dans les cellules tumorales.

Normalement, le nombre de divisions qu'une cellule puisse réaliser est limité par le
raccourcissement des extrémités de ses chromosomes, appelés télomères.
*Figure 8-18. Télomères reconnus par hybridation in situ
avec une sonde qui reconnait leur séquence spécifique sur
un caryotype. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Telomere#/media/File:Telomere_caps.gif

Les télomères sont constitués d'une répétition d'une séquence de 5 à 11 pb (TTAGGG chez les
Vertébrés). Le raccourcissement progressif des télomères est observé dans les cellules en culture et
in vivo, et constitue une caractéristique établie du vieillissement qui est souvent appelée « horloge
des télomères » (Harley et al., 1992).

692
 *Figure 8-19. Raccourcissement des télomères et limites de la réplication. En absence d'activité de la télomérase, les
cellules avec des télomères qui se raccourcissent passent la limite de Hayflick et entrent en sénescence (sortie
"définitive" du cycle cellulaire). Source : https://planet-vie.ens.fr/thematiques/cellules-et-molecules/physiologie-cellulaire/la-senescence-
une-destinee-cellulaire-aux

L’érosion des télomères est la conséquence des mécanismes de la réplication et du besoin d’une
amorce pour l’ADN polymérase. Elle se produit dans les cellules qui manquent d’activité suffisante
d’une enzyme appelée télomérase, dont le noyau catalytique est composé d’une transcriptase inverse
(TERT) et d’un ARN appelé TERC qui compensent la perte des séquences télomériques dues à la réplication.
**Figure 8-20. Composition du complexe télomérase.
Le complexe télomérase permet de rallonger les
télomères dans les cellules eucaryotes. Une amorce
ARN, nommée TERC, s’hybride spécifiquement aux
répétitions (TTAGGG)n télomériques. L'ARN TERC qui
a une structure secondaire complexe qui n'est pas
représenté ici est enroulé autour d’une transcriptase
inverse TERT (sous-unité catalytique) et de protéines
associées essentielles à la stabilisation du complexe
riboprotéique. Source : Salomé Carcy, https://planet-
vie.ens.fr/thematiques/sante/pathologies/telomeres-et-
telomeropathies

Sans télomérase, une baisse inexorable des séquences télomériques conduit finalement à ce que l’on appelle
le décapage des télomères. Ce décapage provoque une réponse aux dommages à l’ADN qui entraîne une
perte et/ou des réarrangements de matériel génétique et la mort (Lazzerini-Denchi et Sfeir, 2016; Muraki
et al., 2012).

Néanmoins, les cellules tumorales échappent à cette limite car elles réexpriment très souvent la
télomérase. Par exemple, lors de l'établissement du pronostic du neuroblastome, une tumeur pédiatrique
du système nerveux périphérique, le niveau d'activité élevé de la télomérase est associé à une mauvaise
réponse au traitement et à une évolution plus défavorable (Yu et al., 2022). La voie ALT qui est un
mécanisme d'allongement des télomères basé sur la recombinaison peut aussi être activée.

693
 **Figure 8-21. Maintenance des télomères dans le développement des neuroblastomes à faibles et à forts risques.
Les neuroblastomes à faible risque (stades 1, 2, 3 n'ont pas de mécanismes de maintenance des télomères; par
conséquent, l'érosion progressive des télomères (due à une réplication incomplète des extrémités, à la coupe des
télomères et aux dommages à l'ADN des télomères) entraîne l'épuisement de la "réserve" des télomères et la perte
de la capacité proliférative. Les tumeurs de stade 4 hébergent soit la télomérase soit les membres de la voie ALT (une
voie alternative d'allongement des télomères) et sont capables de proliférer indéfiniment en compensant la perte de
télomères à chaque réplication. Les tumeurs de neuroblastome positives à la télomérase se développent plus
rapidement et se présentent principalement chez les enfants, tandis que les tumeurs ALT positives se développent
plus lentement et se présentent principalement chez les adolescents et les jeunes adultes. Source :
https://jhoonline.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13045-022-01337-w

Le niveau d'expression de facteur de transcription N-myc, qui régule l'expression de la télomérase, est
également prédictif de l'évolution de ces tumeurs. Les tumeurs ayant amplifié le gène N-myc avec un nombre
de copies élevé ont le pire pronostic.

Il est fréquent que des tumeurs se forment à partir de cellules qui ont déjà tendance à proliférer,
notamment les cellules souches adultes. Par exemple, une part substantielle des tumeurs du cancer du
colon, provient des cellules souches Lgr5+ qui se trouvent au fond des cryptes et se divisent
régulièrement (en situation normale) pour régénérer l'intestin sur une période de 5 jours. La mutation
du gène suppresseur de tumeur codant APC (impliqué dans la modération de la voie Wnt) est
fréquente dans les cancers du colon et les chercheurs ont montré que l'inactivation de ce gène dans
les cellules souches Lgr5+ suffit à provoquer des tumeurs (Barker et al., 2008).

Des capacités migratoires exacerbées

Les cellules tumorales à leur site primaire peuvent causer des dysfonctionnements mais 90% de la
mortalité des patients atteints de cancers provient des métastases qui sont issues de la tumeur
primaire par migration et transport lymphatique ou sanguin.

694
 *Figure 8-22. Les étapes du processus métastatiques. Certaines cellules d'un carcinome acquièrent la capacité de
réaliser une transition épithélio-mésenchymateurse et se délaminent. Elles sécrètent des enzymes (des MMP) qui
dégradent la lame basale et migrent dans les tissus sous-jacents. Certaines d'entre elles pénètrent dans les vaisseaux
sanguins par intravasation puis réalisent une extravasation dans un autre tissu. Si elles ont la capacité d'y survivre,
elles se mettent à proliférer formant des métastases. Source :
https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2014/05/medsci20143004p378/medsci20143004p378.html

Les mélanocytes de la peau peuvent donner naissance à des mélanomes qui sont parmi les plus
cellules tumorales les plus invasives lorsqu'elles forment des métastases (25% de survie à 5 ans chez
les patients avec métastases contre 99% si le mélanome reste in situ). C'est parce qu'elles réactivent des
réseaux génétiques proches de ceux des crêtes neurales (voir Figure 7-152).

La première étape de la formation des métastases pour les cellules tumorales d'origine épithéliales
est constituée par la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). On retrouve dans les cellules
tumorales de nombreuses voies de signalisation et de nombreux facteurs de transcription pour
coordonner leur EMT qui sont commun aux EMT lors du développement embryonnaire, comme par
exemple lors de la gastrulation des Amniotes ou lors du développement des cellules de crête neurale
(voir Figure 5-119). Voir aussi la Figure 5-124.

Les cellules épithéliales qui deviennent métastatiques perdent leur polarité apico-basale. Le complexe
Crumb est crucial pour maintenir cette polarité et des cellules tumorales invasives rénales ou mammaires
présentent une expression anormalement faible de l'un des composants du complexe, CRB3 (Mao et al.,
2015). Les cellules exprimant trop peu CRB3 perdent aussi l'inhibition de contact (Mao et al., 2018).

Très logiquement, les protéines contrôlant le réseau de microfilaments qui est responsable de la formation
des lamellipodes et des invadopodes impliqués dans la migration ont un fonctionnement altéré dans les
cellules métastatiques. C'est le cas par exemple des protéines de la famille Ena/VASP comme MENA dans
les cancers du sein (Di Modugno et al., 2006, Klemke, 2012). Au stade avancé de la tumeur, cette famille des
protéines est surexprimée ce qui augmente la vitesse de migration in vivo et stimule le caractère invasif des
cellules.

695
 **Figure 8-23. Rôle des protéines Ena/VASP
dans la croissance des microfilaments dans les
lamellipodes. L'interaction des protéines Ena /
VASP avec les extrémités «barbelées» des
filaments d'actine peut empêcher ou retarder la
liaison des protéines de coiffe (capping protein),
favorisant ainsi la croissance continue des
microfilaments au niveau de la membrane
plasmique. Les Ena/VASP semblent également
diminuer l'architecture de ramification du
réseau d'actine. Source

L'environnement des cellules tumorales joue également un rôle primordial dans la formation de
métastases, en premier lieu la matrice extracellulaire (MEC). Par exemple, la présence de HAPLN1 (une
protéine liée aux hyaluranes et aux protéoglycanes) facilite la formation de métastases péritonéales à partir
de cellules tumorales du pancréas (Wiedmann et al., 2023).
**Figure 8-24. HAPLN1 dans la matrice extra-cellulaire
stimule l'invasivité de cellules tumorales pancréatiques.
Des sphères de cellules tumorales pancréatiques sont
cultivées dans du Matrigel (MEC en 3D) contenant ou
non la protéine HAPLN1 qui se lie aux protéoglycanes de
la MEC. 48h plus tard, la surface envahie par les cellules
est mesurée. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-023-38064-
w

Parmi les éléments de l'environnement favorable aux cellules métastatiques figure le système immunitaire
et notamment les macrophages qui sont impliqués dans une boucle paracrine avec les cellules tumorales au
cours des stades métatastatiques initiaux. Le chimiotactisme des cellules métastatiques vers les vaisseaux
sanguins se produit en réponse à des molécules telles que l'EGF sécrétés par les macrophages associés aux
vaisseaux. Les cellules cancéreuses expriment le récepteur de l'EGF (EGFR) et sécrètent CSF-1, qui attire les
macrophages et les incite à exprimer l'EGF, complétant ainsi une boucle de rétroaction paracrine positive.
La signalisation entre le macrophage et la cellule tumorale affecte l'activité des régulateurs de l'actine tels
que WASP et N-WASP, entraînant la formation de podosomes dans les macrophages et des invadopodes
dans les cellules tumorales qui favorisent l'intravasation des cellules tumorales (Condeelis et Pollard, 2006).

Les cellules tumorales elles-mêmes peuvent participer à créer un environnement propice à leur migration.
Par exemple, des cellules faiblement métastatiques issues de cancer du sein secrètent des vésicules
extracellulaires riches en Transglutaminase 2 (Tg2) qui activent les fibroblastes environnants à produire
une matrice extracellulaire plus favorable à la migration (Schwager et al., 2022).

La migration est souvent étudiée à partir de la tumeur primaire mais pour la formation des tumeurs
secondaires, il ne faut pas oublier les étapes d'extravasation (sortie des vaisseaux sanguins vers le site de
colonisation) et la migration à travers le nouveau tissu.

696
 **Figure 8-25. Cellule tumorale mammaire (vert) qui
émet des prolongements filamenteux en direction des
cellules endothéliales des vaisseaux sanguins (rouge),
avant son extravasation. L'image a été obtenue par
microscopie in vivo à haute résolution dans un modèle
de métastases chez le poisson-zèbre. Source :
https://www.youtube.com/watch?v=ETizmYmmQHM

Un métabolisme particulier
En présence d'oxygène, les cellules métabolisent normalement le glucose en pyruvate via la
glycolyse. Le pyruvate est alors transporté dans les mitochondries, où il est introduit dans le cycle
de Krebs. Puis la chaîne respiratoire mitochondriale permet la production importante d'ATP via la
phosphorylation oxydative. L'oxygène est alors nécessaire comme accepteur final d'électrons. Si
l'oxygène est en quantité limitante (anoxie), les cellules métabolisent le pyruvate en lactate, une
réaction catalysée par la lactate déshydrogénase, permettant à la glycolyse de se poursuivre en
recyclant le NADH en NAD+. Les cellules cancéreuses et les cellules en prolifération ont un
métabolisme particulier convertissent la plupart du glucose en lactate, que l'oxygène soit présent
ou non. Il s'agit de l'effet Warburg (du nom d'Otto Warburg qui a découvert ce phénomène en 1924).

*Figure 8-26. L'effet Warburg dans les cellules tumorales. Les cellules cancéreuses utilisent la glycolyse comme
principale source d'énergie même sous normoxie, ce qui signifie que le pyruvate est principalement converti en
lactate plutôt que d'être incorporé dans le cycle de Krebs (cycle TCA). GLUT1 est responsable du transport du glucose
et les MCT (Monocarboxylate transporters) sont responsables du transport du lactate. Nom des enzymes : ②,
phosphohexose isomérase ; ④, aldolase ; ⑤, triose phosphate isomérase ; ⑥, glycéraldéhyde 3-phosphate
déshydrogénase ; ⑦, phosphoglycérate kinase ; ⑧, phosphoglycérate mutase ; ⑨, énolase. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.698023/full

Alors que les cellules différenciées expriment l'isoforme M 1 de la pyruvate kinase (PK-M 1), des cellules
cancéreuses expriment l'isoforme M2, qui est normalement exprimée uniquement au cours du
développement embryonnaire. PK-M2 est activée par la signalisation de la tyrosine kinase et entraîne la
conversion du pyruvate en lactate plutôt que d'orienter le pyruvate vers le cycle de Krebs.

La chémorésistance des tumeurs semble associée à une augmentation de l'effet Warburg. Par
exemple, la résistance aux traitements 5-FU/cisplatine dans le cancer colorectal est associée à une
697
augmentation de la glycolyse par augmentation du ratio PK-M2/PK-M1. Cet effet est médié par les lncARN
Xist/miR-137 (Hailun et al., 2021).

La lactate déshydrogénase A qui catalyse la transformation du pyruvate en lactate a son expression

fréquemment augmentée dans les cellules tumorales. Le gène codant cette enzyme est une cible directe de
l'oncogène et facteur de transcription c-Myc (Shim et al. 1997). L'inhibition de l'expression de la lactate
déshydrogénase A par des ARN interférents inhibe la tumorigenèse (Fantin et al., 2006). Le long ARN non
codant MEG3 réduit la stabilité de la protéine c-Myc en stimulant son ubiquitinylation et sa dégradation.
Cela a pour conséquence de diminuer la prolifération des cellules tumorales et notamment en inhibant la
glycolyse et la production de lactate (Zuo et al., 2020). L'expression de MEG3 est diminuée dans de
nombreux cas de cancers colo-rectaux et il peut être considéré comme un suppresseur de tumeur.

Il existe des mécanismes inhibiteurs de l'effet Warburg. Par exemple, le long ARN non codant (lncARN)
MEG3 dont l'expression est diminuée dans les cellules des tumeurs colo-rectales est capable d'inhiber la
glycolyse en activant (indirectement) l'ubiquitinylation et la dégradation de c-Myc qui est nécessaire à
l'expression d'enzymes telles que PK-M2, hexokinase 2 et la lactate déshydrogénase A (Zuo et al., 2020).
L'expression de MEG3 est activée par la vitamine D ce qui pourrait avoir des applications thérapeutiques
intéressantes.
**Figure 8-27. Le lncARN MEG3 provoque la dégradation de c-Myc et
l'inhibition de l'expression d'enzymes importantes pour l'effet
Warburg. Une lignée de cellules de tumeur colo-rectale est
transfectée avec un vecteur d'expression contrôle (pcDNA3.1) ou un
vecteur permettant la surexpression de MEG3 (à gauche). Elles sont
transfectées avec un siARN contrôle (siRNA-NC) ou un siARN ciblant
MEG3. L'expression de c-Myc, de l'hexokinase 2 (HK2), de l'isoforme
K2 de la pyruvate kinase (PKM2) et de la lactate déshydrogénase A
(LDHA) est étudiée par Western-blot avec l'expression de l'actine
comme contrôle de dépôt. Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2020.00274/ful
l

Signalons que l'effet Warburg n'est pas une propriété générale et que des cellules tumorales ont été
caractérisées avec toujours une dépendance majeure aux phosphorylations oxydatives dans les
mitochondries (Pendleton et al., 2023).

Le métabolisme lipidique est aussi altéré dans les cellules tumorales. Les cellules normales quiescentes
dépendent généralement de l’absorption des lipides de la circulation. En revanche, les cellules tumorales
très prolifératives montrent une forte avidité à acquérir des lipides et un taux de cholestérol élevés, soit en
augmentant l'absorption de lipides et de lipoprotéines exogènes (ou alimentaires), soit en activant leurs
mécanismes de synthèse lipidique endogène, notamment la lipogenèse de novo à partir de sources non
lipidiques telles que le glucose et l'acétate (Bian et al., 2020). Cette production accrue dans les cellules
tumorales fournit des lipides pour la synthèse des membranes et des molécules de signalisation lors de la
prolifération cellulaire rapide et de la croissance, dans un contexte où la disponibilité des lipides est limitée
dans le microenvironnement tumoral. La synthèse lipidique est contrôlée par plusieurs facteurs de
transcription, tels que SREBP1 et SREBP2 (SREBP1/2) qui jouent un rôle important dans le contrôle de la
synthèse lipidique dans les cellules tumorales (Griffith et al., 2013; Jiang et al., 2020).

698
 *Figure 8-28. SREBP1 est nécessaire pour une bonne
croissance tumorale. Des souris nude sont greffées en
sous-cutané avec des cellules tumorales humaines
exprimant ou non grâce à un système inductible par la
doxycycline un siARN inhibant la production de SREBP1
(pour Sterol regulatory element binding protein-1). DOX
= présence du siARN; no DOX = pas de siARN. On laisse
les tumeurs se développer pendant 30 jours puis on les
prélève, fixe, coupe et les colore à l'hématoxyline-éosine.
On constate que lorsque l'expression de SREBP1 est
inhibée, la tumeur possède nettement moins de cellules.
Source : https://cancerandmetabolism.biomedcentral.com/articles/10.1186/2049-
3002-1-3

Les facteurs oncogènes, tels KRAS et PI3K, favorisent la lipogenèse de novo dans le cancer du sein et d'autres
types de cancer par l'activation de mTORC1. La protéine Lipine-1 séquestre SREBP1/2 mature dans une
région du noyau séparé de l'ADN, empêchant ainsi SREBP1/2 d'activer l'expression des gènes. mTORC1
phosphoryle directement la Lipine-1, ce qui inhibe sa translocation nucléaire et restaure ainsi l'activité de
SREBP1/2 (Peterson et al., 2011).

La capacité à faire former de nouveaux vaisseaux sanguins

La progression tumorale nécessite la mise en place de nouveaux vaisseaux ce qui permet d'apporter
du glucose et de l'O2 à la nouvelle masse de cellules en prolifération active. Ce phénomène est appelé
angiogenèse tumorale. Il passe par la production de facteurs angiogéniques qui stimulent les
cellules endothéliales des vaisseaux sanguins préexistants à s'engager dans une angiogenèse
(Folkman, 2007). Par exemple, des stimulateurs angiogéniques tels que le VEGF sont libérés par les
cellules tumorales, et parfois par les macrophages du microenvironnement tumoral. L'angiogenèse est
également associée à la propagation des tumeurs aux sites métastatiques.

*Figure 8-29. Vascularisation d'une tumeur. (A) Observation par imagerie multiphoton d'un réseau de vaisseaux
sanguins dans une tumeur (cellules greffées d'adénocarcinome du colon) via une fenêtre d'imagerie abdominale chez
la souris. Les cellules endothéliales sont en rouge (les souris transgéniques utilisées expriment tdTomato sous le
contrôle d'un promoteur spécifique de l'endothélium); les cellules tumorales sont en vert (les cellules tumorales
greffées ont un vecteur d'expression de la GFP). La boîte blanche montre la région d'intérêt. (Barre d'échelle = 100
μm) (b) Région d'intérêt les cellules endothéliales seules. La morphologie vasculaire est anormale avec une faible
distance d'interbifurcation (entre les pointes de flèches) et une topologie complexe (fusion de trois à deux branches,
étoile). Les flèches indiquent la direction de l'écoulement. (Barre d'échelle = 50 μm). Source :
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2007770117

Les vaisseaux tumoraux, caractérisés par une morphologie anormale, sont fortement dysfonctionnels dans
leurs propriétés de barrière et de transport.

699
 **Figure 8-30. Une preuve de la dysfonctionnalité des
capillaires dans les tumeurs. Les fuites associées à la
microvascularisation des tumeurs entraîne la fuite
continue de thrombine et de fibrinogène du plasma
sanguin vers les tissus environnants. Le Facteur tissulaire
(ou facteur III ou thromboplastine), une protéine exprimée
à la surface des cellules cancéreuses et de nombreux autres
types de cellules non endothéliales active la thrombine qui
convertit alors le fibrinogène en fibrine. Il en résulte un
vaste réseau de faisceaux de fibrine (révélé ici en rouge
foncé) observé à la frontière entre des cellules de
carcinome mammaire et le tissu alentour. Source :
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.1365-
2559.2003.01629.x
Cela aboutit à une hétérogénéité d'oxygénation dans les tumeurs qui contribue à l'hétérogénéité
phénotypique des cellules tumorales (Barnabeu et al., 2020).
**Figure 8-31. Hétérogénéité dans une tumeur en
fonction de la distance aux vaisseaux sanguins. Dans une
tumeur squameuse humaine de la tête et du cou, là où les
vaisseaux sanguins (taches bleues) assurent une bonne
oxygénation, le
la tumeur apparaît noire. En revanche, dans les zones de
mauvaise vascularisation et avec une hypoxie modérée,
une enzyme anhydrase carbonique est exprimée (révélée
en rouge orange), tandis que dans les zones d'hypoxie
importante, le colorant pimonidazole est détecté (vert).
Le chevauchement entre ces deux marqueurs apparaît en
orange. Des zones de nécrose, situées encore plus loin du
système vasculaire tumoral, sont indiqués par «N ». Source
: https://aacrjournals.org/cancerres/article/62/23/7066/509392/Pimonidazole-
Binding-and-Tumor-Vascularity-Predict

Des stratégies thérapeutiques visant à induire un changement phénotypique dans les vaisseaux tumoraux
pour qu'ils ressemblent à des vaisseaux normaux, appelées normalisation vasculaire, ont été testées (Huang
et al., 2013). Les anticorps anti-VEGF induisent une normalisation vasculaire dans les modèles précliniques
et en clinique, ce qui peut expliquer en partie leur efficacité dans le traitement des cancers métastatiques.
Après traitement anti-VEGF, les vaisseaux tumoraux montrent aussi une augmentation de la perfusion et de
l'efficacité des chimiothérapies antitumorales (Goel et al., 2011).

Cependant, de manière un peu paradoxale, les régions tumorales bien oxygénées répondent mieux à la
radiothérapie (Bertout et al., 2011). L'hypoxie provoque en effet des modifications dans l'expression des
gènes et la sélection clonale associée aboutit à des tumeurs aux phénotypes plus agressifs et métastatiques.
C'est pour cela que certains traitements anti-angiogéniques peuvent parfois aboutir à de mauvais résultats.

La capacité à bloquer les processus immunitaires anti-tumoraux

Comme le montre l'expérience qui suit, le système immunitaire a la capacité de s'attaquer à des
cellules tumorales :

700
 *Figure 8-32. Le système immunitaire peut s'attaquer à
des tumeurs de manière spécifique. Des souris d'une
souche donnée ont été initialement injectés avec des
cellules cancéreuses irradiées et tuées (rouge) dérivant
d'une tumeur induite chimiquement chez une souris de
la même souche (une souris syngénique). Lorsque ces
souris furent ensuite injectées avec des cellules vivantes
de la même tumeur, les cellules n’ont pas réussi à se
développer. Cependant, lorsque ces souris ont été
injectées avec cellules vivantes provenant d'une seconde
tumeur, indépendante de la précédente mais provenant
tout de même d'une souris de la même souche (bleu), les
cellules ont proliféré et formé une masse tumorale.

Beaucoup de tumeurs échappent activement au système immunitaire en induisant un état

immunosuppresseur (Zitvogel et al., 2006). Les lymphocytes infiltrant les tumeurs CD8 (TIL) montrent
souvent des fonctions effectrices diminuées. PD-1 et CTLA-4 sont deux récepteurs inhibiteurs des fonctions
effectrices de ces lymphocytes qui jouent normalement un rôle dans l'immunotolérance. Ils sont
fréquemment ciblés par les cellules tumorales pour atténuer les fonctions effectrices via leurs ligands, PDL-
1 et B7 (Topalian et al., 2015). Une plus forte expression de PDL-1 dans les cellules tumorales est associée
à un mauvais pronostic (Okazaki et al., 2007). Des immunothérapies anti-PD1 ont permis de remporter
certains succès notamment pour la lutte contre les mélanomes et les tumeurs pulmonaires (Iwai et al.,
2017).

Le système immunitaire peut paradoxalement être impliqué dans des environnements protumorigéniques
:

*Figure 8-33. Microenvironnement de la tumeur (TME) antitumorigénique ou tumorigénique. Les

microenvironnements antitumorigéniques et protumorigéniques ont des profils immunologiques distincts. Gauche :
Un TME antitumorigénique contient des macrophages M1, des lymphocytes Th1, des cellules dendritiques (DC), des
lymphocytes CD8+, des cellules NK et des molécules bioactives (cytokines antitumorigènes (IL-2, IL-12, IFNγ),
facteur de croissance (GM-CSF), chimiokines (CXCL9, CXCL10). A droite, un TME protumorigénique contient des
macrophages M2, des DC tolérogènes, des MDSC (Myeloid-derived suppressor cells), des cellules Th2, des cellules
Treg et des molécules bioactives (cytokines protumorigènes (IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β, IFNγ), facteurs angiogéniques
(VEGF), facteurs de croissance (GM-CSF, EGF, HGF, FGF) et chimiokines (CCL2)). Source :
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.788365/full

701
Des macrophages s'accumulent aussi au cours de la progression tumorale proviennent de l'extravasation
de monocytes dérivés de la moelle osseuse (DeNardo et al. 2019). Les macrophages peuvent acquérir un
spectre de phénotypes pro-inflammatoires (également appelés « M1 ») à anti-inflammatoires (également
appelés « M2 ») (Mantovani et al., 2017). Dans les tumeurs, les macrophages pro-inflammatoires freinent
initialement la croissance tumorale en activant les lymphocytes cytotoxiques. Cependant, au cours de la
progression tumorale, les macrophages sont biaisés vers un phénotype anti-inflammatoire favorisant la
malignité tumorale en supprimant les lymphocytes cytotoxiques et en stimulant la formation de vaisseaux
sanguins (Squadrito et al., 2012).

**Figure 8-34. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) peuvent favoriser le développement tumoral par
différents moyens. Les TAM médient l'immunosuppression en recrutant des cellules Treg et en inhibant les
lymphocytes T CD8+. De plus, les TAM participent à la propagation métastatique, à l'angiogenèse et à la résistance
aux chimiothérapies. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.788365/full

**Figure 8-35. Des macrophages produisent du VEGF

dans le micro-environnement tumoral.
Immunohistochimie avec un anticorps anti-VEGF
(coloration noire) dans une tumeur de glande mammaire.
Les cellules où l'expression du VEGF est détecté
correspondent à des macrophages (flèches roses). Source :
https://pathsocjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1096-
9896(200003)190:4%3C430::AID-PATH538%3E3.0.CO;2-6

Ces macrophages de type M2 sont caractérisés par une forte expression du récepteur au mannose
MRC1/CD206 et par une faible expression de l'intégrine αX (CD11c). L'accumulation de ces macrophages
largement anti-inflammatoires est donc corrélée à un mauvais pronostic dans la plupart des cancers
(Mahmoud et al., 2012). Les mécanismes qui amènent les macrophages à devenir de type M2 commencent
à être élucidées (Hung et al., 2023).

702
 **Figure 8-36. Un exemple de mécanismes
polarisant les macrophages vers l'état M2. Sous le
contrôle de la protéine AXL, les cellules épithéliales
tumorales ou les fibroblastes associés sécrètent IL-
11 qui est reçu par les macrophages par le
récepteur PG130. Cela active la voie JAK/STAT3
qui active l'expression de gènes dont le produit
oriente les macrophages vers un état M2, pro-
tumoral. Source : https://www.cell.com/cell-
reports/fulltext/S2211-1247(23)01078-1

On voit donc qu'en plus d'un blocage des mécanismes immunitaires pouvant les attaquer, les tumeurs
détournent à leur profit des processus liés à l'immunité (comme l'angiogenèse).

CAHIER TECHNIQUE

Les outils pour étudier l'expression et la fonction des gènes

La découverte dans les années 1970 des enzymes de restriction, des enzymes bactériennes qui peuvent
couper l'ADN au niveau de séquences spécifiques, a ouvert la voie à toute une série de manipulations du
matériel génétique. Les chercheurs disposent maintenant d'une palette d'outils à la fois pour séquencer un
fragment d'ADN (voire tout un génome) et pour étudier l'expression des gènes mais aussi pour la modifier.

Le séquençage
Les techniques de séquençage reposent sur l'utilisation de didésoxyribonucléotides (et non des
désoxyribonucléotides comme on trouve habituellement dans l'ADN). Ces nucléotides particuliers se
retrouvent forcément en bout de la chaîne nucléotidique car aucun autre nucléotide ne peut s'ajouter à leur
extrémité 3'. En faisant synthétiser par une ADN polymérase un brin d'ADN à partir d'une matrice dont on
veut connaitre la séquence et en utilisant un didésoxyribonucléotide précis (par exemple celui dont la base
est la guanine), on sait que toutes les chaînes vont se terminer par G. Selon leur taille, ainsi que leurs tailles
relatives par rapport à des synthèses où on aura utilisé des nucléotides modifiés avec d'autres bases azotées,
on peut reconstituer la séquence d'un fragment d'ADN. Initialement, on utilisait des nucléotides radioactifs.
Maintenant, on utilise des nucléotides attachés à un fluorophore, une couleur différente pour chaque
didésoxyribonucléotide avec une base différente. On peut alors lire la séquence après séparation des brins
de différentes longueurs en mesurant la fluorescence des 4 canaux possibles correspondant à A, T, C et G.
*Figure CT-1. Exemple de comparaison de séquences
entre un allèle sauvage et un allèle mutant avec une
insertion. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-
9258(17)48496-1/fulltext

Les méthodes de séquençage moderne dites à haut débit lisent la fluorescence en cours de synthèse et non
plus une fois la synthèse des brins effectués ce qui permet de gagner en rapidité. Le coût du séquençage a
chuté drastiquement en conséquence. Le séquençage d'un génome humain qui était une véritable aventure
scientifique à la fin des années 1990/début des années 2000 est maintenant quelque chose de "banal".
703
L'analyse GWAS
Il s’agit d’une étude d’association sur tout le génome (pangénomique) (ou GWAS en anglais pour genome-
wide association study) entre des variations génétiques chez de multiples individus et des traits
phénotypiques (typiquement des maladies génétiques). Cela permet de localiser dans le génome des allèles
associés à un phénotype donné. Généralement, les marqueurs de variations utilisés sont les SNP (ou single
nucleotide polymorphism), qui représentent 90% des variations génétiques humaines et qui sont bien
répartis dans tout le génome (même si certaines régions sont plus riches en SNP, notamment les séquences
non codantes).

**Figure CT-2. Un exemple d'analyse GWAS. Analyse des SNP associés à des taux de cholestérol LDL élevés, dans la
région du génome où se trouve le gène codant le récepteur aux LDL (LDLR). Chaque point est un SNP. En ordonnées,
est indiqué le niveau d’association entre les SNP et un taux de cholestérol élevé. La couleur des points reflète le
déséquilibre de liaison des SNP dans la population considérée : plus la couleur est chaude, plus la probabilité que les
allèles ségrégent avec le SNP considéré est élevée. La mutation sur le SNP rs73015013 n’est peut-être pas la cause
directede l’augmentation du taux de cholestérol, mais elle est située dans une
région qui ségrége fréquemment avec ce trait phénotypique. Source :
https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1002198

L'hybridation in situ
Le terme hybridation in situ regroupe deux techniques qui se ressemblent par certains aspects mais qui ont
un objectif différent. L'une permet de détecter des gènes dans un génome et notamment sur des
chromosomes et l'autre permet de détecter des ARNm ou des microARN sur des embryons entiers ou des
coupes histologiques.

Pour détecter une séquence d'ADN génomique par fluorescence in situ sur les chromosomes (FISH), on
utilise une sonde fluorescente d'ADN simple brin avec la séquence complémentaire de celle qui nous
intéresse. On peut faire deux FISH en parallèle avec des fluorophores différents. L'ADN est coloré grâce au
DAPI.

704
 Figure CT-3. Diagnostics de FISH en cytogénétique clinique. (A) La détection du chromosome 18 en anneau
dicentrique, tricentrique et tétracentrique à l'aide d'une sonde centromérique D18Z2 pour le chromosome 18. Le
panneau de gauche montre le chromosome 18 normal, l'anneau dicentrique 18 en haut et l'anneau tétracentrique 18
en bas, le panneau de droite montre l'anneau dicentrique 18 et l'anneau tricentrique/tétracentrique 18 dans des
encarts par FISH. (B) La détection d'un chromosome 16 modifié par une translocation 2q32/16p13.3 par des sondes
reconnaissants les chromosomes entiers 2 (WCP2) et 16 (WCP16). (C) La détection des fusions de gènes ABL1/BCR
dans les cellules en interphase et en métaphase par des sondes de fusion double couleur (les flèches fines indiquent
le signal normal et les flèches épaisses indiquent les signaux de fusion anormaux). (D) Utilisation diagnostique des
sondes ETV6 et RUNX1 pour la détection de deux signaux de fusion pour un t(12;21)(p13;q22) cryptique, perte d'un
signal ETV6 et gain de trois signaux RUNX1 supplémentaires (les flèches fines pointent vers le signaux de fusion et
flèches épaisses vers des signaux RUNX1 supplémentaires). Toutes les images proviennent du laboratoire de
cytogénétique clinique de Yale. Source : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2016.00089/full

Pour détecter des ARNm, le principe de complémentarité des bases des acides nucléiques est utilisé. On tire
parti de l'avantage de la nature simple brin de l'ARNm et on introduit une séquence complémentaire à
l'ARNm cible avec des modifications qui permettent sa visualisation. D'abord cette sonde doit être
synthétisée in vitro. Il s'agit d'une molécule d'ARN antisens dont la longueur peut varier entre 200 pb à
2000 pb. La synthèse de cet ARN se fait en présence d'une UTP (uridine triphosphate) conjuguée à la
digoxygénine, un composé fabriqué par un groupe particulier de végétaux (les Digitales) et introuvable dans
les cellules animales.

Figure CT-4. La digoxygénine.

Un ARN sens (séquence identique à l'ARNm cible) est aussi produit et sert de témoin négatif (il ne doit pas
reconnaître lui-même) et permettra d'évaluer la part du marquage qui correspond à du bruit de fond.
L'embryon est fixé (typiquement avec du 4% paraformaldéhyde) puis est perméabilisé par des solvants
lipidiques (Tween-20 ou Triton X100) et des protéinases (protéinase K) afin que la sonde puisse entrer et
sortir de ses cellules. Une fois dans les cellules, l'hybridation se produit entre l'ARN anti-sens de la
sonde et l'ARNm ciblé. Pour visualiser les cellules dans laquelle l'hybridation s'est produite, les chercheurs
utilisent un anticorps qui reconnaît spécifiquement la digoxygénine. Cet anticorps a été artificiellement
705
conjugué à une enzyme, telle que la phosphatase alcaline. Après incubation dans l'anticorps et des lavages
répétés pour éliminer tous les anticorps non liés, l'embryon est baigné dans une solution contenant un
substrat pour l'enzyme (traditionnellement un mélange NTB/BCIP pour la phosphatase alcaline) qui donne
un produit coloré en bleu-violet. En incubant de plus en plus longtemps les tissus avec les substrats, on peut
révéler des expressions de plus en plus faibles. Cependant, cette méthode de détection n'est pas
quantitative.
*Figure CT-5. Hybridation in situ pour détecter
l'expression d'un ARNm. D'après
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/6-
tecnicas/5-hibridacion.php

Des méthodes plus modernes utilisent des sondes fluorescentes complémentaires des ARNm et peuvent
aussi être utilisées en culture cellulaire (Young et al., 2020).
Figure CT-6. Deux méthodes pour faire de l'hybridation
in situ fluorescente (FISH). Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7085896/#!po=34.1270

Des nouvelles techniques comme le RNAscope permettent d'améliorer encore la sensibilité de l'hybridation
in situ grâce à un système d’amplification : voir cette vidéo de présentation : https://youtu.be/CPgZEf6EyJQ

RT-qPCR
Un exemple d'étude avec une RT-qPCR :

https://www.youtube.com/watch?v=2vlDUPINXMA

Pour faire une RT-qPCR, il faut d'abord extraire les ARN des cellules ou des embryons.

Exemple de protocole d'extraction d'ARN :

Les embryons sont homogénéisés dans du Trizol à l'aide d'une seringue de 1 ml équipée d'une aiguille 21 G x
1/2. Du chloroforme saturé d'eau (200 µl) est ensuite ajouté aux échantillons et mélangé par vortex. Les
échantillons sont centrifugés pendant 15 min à 13.000 g à 4 °C. La phase aqueuse au-dessus est récupérée (les
protéines restent dans la phase organique; l'ADN est en général à l'interface entre les deux phases) et on ajoute
à 500 µl d'isopropanol pour précipiter l'ARN. L'ARN total est précipité par centrifugation à 13.000 g pendant
30 min à 4 °C. Le culot est ensuite lavé avec de l'éthanol, centrifugé à nouveau et remis en suspension dans 50

706
µl d'eau exempte de RNAse. L'ADN résiduel dans les échantillons est éliminé en incubant les échantillons dans
de la DNAse à 37 °C pendant 10 min. L'ARN total est purifié à partir de la réaction de DNAse en ajoutant 150
µl d'alcool isoamylique-phénol-chloroforme suivi d'une centrifugation à 13.000 x g pendant 5 min. La phase
aqueuse supérieure est récupérée et mélangée avec 300 µl d'éthanol et 25 µl d'acétate d'ammonium (4 M pH
5,6) pour précipiter l'ARN. Enfin, l'ARN isolé est précipité par centrifugation pendant 15 min à 13.000 x g à 4 °C
et les culots sont lavés dans de l'éthanol et remis en suspension dans 30 µl d'eau sans RNAse.

Ensuite, l'ARN est rétrotranscrit en ADN complémentaire grâce à une rétrotranscriptase. Puis des
fragments spécifiques de cet ADN sont amplifiés par PCR grâce à des couples d'amorces
oligonucléotidiques. On choisit ces amorces dans la séquence codante des gènes d'intérêt.

*Figure CT-7. Etapes de la RT-PCR. Dans la réverse transcription, on utilise comme amorces des oligo dTs (une
succession de nucléotides T) pour ne rétrotranscrire que les ARNm qui ont une queue polyA. Cela peut créer un biais
avec une surreprésentation des parties 3' des gènes. On peut alors utiliser des amorces avec des séquences aléatoires
qui vont permettre de tout rétrotranscrire mais cela inclura aussi les ARNr qui sont très abondants mais pas toujours
pertinents pour une analyse transcriptomique. Pour la PCR, on utilise des couples d'amorces spécifiques des gènes
d'intérêt. Source : Microbenotes

La PCR peut être classique, c'est-à-dire que l'on observe la quantité d'ADN obtenue après migration sur un
gel d'électrophorèse ou la PCR peut être quantitative (qPCR ou aussi PCR en temps réel) signifiant que l'on
observe la quantité d'ADN au cours de l'amplification grâce à une molécule qui devient fluorescente en
présence d'ADN double brin (SYBRGreen).
Figure CT-8. Suivi de l'évolution de l'intensité de la
fluorescence (RFU) durant une qPCR. Les différentes
couleurs correspondent à différents échantillons qui
expriment de manière différente un gène dont la
séquence est amplifiée. On définit un seuil (par exemple
RFU = 200) et on obtient pour chacun des échantillons
le Cq, c'est-à-dire le nombre de cycles de PCR qu'il a fallu
pour obtenir une fluorescence à ce seuil. Théoriquement
si un échantillon A correspond à des cellules qui
expriment deux fois plus un gène que dans un
échantillon B, le Cq de A doit être plus petit de 1 que le
Cq de B (il faut raisonner comme si on était en
logarithme de 2).

La méthode de qPCR est quantitative car on vérifie que la quantité d'ADN a bien doublé à chaque cycle de
PCR pour chaque couple d'oligonucléotides utilisé à chaque cycle de PCR. Ce n'est pas le cas dans la PCR
classique.

Pour la RT-(q)PCR dans tous les cas, il faut inclure la mesure de l'expression d'un ou de plusieurs gènes de
ménage (des gènes dont l'expression n'est pas sensée bouger entre les différentes conditions pour servir de
référence de normalisation).

707
RNAseq
L'hybridation in situ pour détecter les ARNm ou la RT-PCR sont une méthode assez longue et laborieuse (il
faut procéder gène par gène). Une méthode qui permettrait de détecter l'expression de plusieurs centaines
ou de plusieurs milliers de gènes à la fois est la bienvenue.

Dans les années 2000, se sont développées les puces à ADN (microarray) mais les grands progrès du
séquençage avec l'avènement du NGS (Next Generation Sequencing ou séquençage haut débit) ont
permis d'utiliser une méthode encore plus efficace (Goldman et Domschke, 2014). Le RNAseq tire parti
des capacités de débit élevé de cette nouvelle méthode et permet aussi de quantifier les ARN
présents dans un tissu. Plus précisément, les ARN sont extraits et purifiés à partir des échantillons et
convertis en ADN complémentaire (ADNc) avec des procédures standard utilisant la transcriptase inverse.
Jusqu'à présent, cela ressemble au début d'une RT-PCR. Mais pour le RNAseq, cet ADNc est fragmenté en
morceaux plus petits et des séquences connues d'adaptateurs sont ajoutées aux extrémités. Ces adaptateurs
permettent l'immobilisation et l'amplification par PCR de ces transcrits. Le séquençage de nouvelle
génération peut analyser ces transcrits et les quantifier après alignement des séquences obtenues sur le
génome (Goldman et Domschke 2014).

**Figure CT-9. Etapes du RNAseq distinguant les étapes in vivo (faites naturellement par la cellule), les étapes in vitro
après extraction de l'ARN des cellules et les étapes in silico (bio-informatiques) une fois le séquençage haut débit
effectué. Comme le montre l'exemple choisi, on peut facilement quantifier l'épissage alternatif. Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/RNA-Seq#/media/File:Summary_of_RNA-Seq.svg

Le RNA-seq est particulièrement puissant pour comparer les transcriptomes entre des échantillons quasi-
identiques ne différant que par certains paramètres expérimentaux (ajout on non d'un morphogène par
exemple). Le développement du tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) et de la microdissection a
permis l'isolement précis des tissus et des cellules d'où sont extraits les ARN, compensant quelque peu
l'absence de résolution spatiale de cette approche. Les progrès récents de la sensibilité du RNAseq ainsi que
des méthodes de fluidique permettent désormais de réaliser une analyse transcriptomique de cellules
uniques (single cell RNAseq ou scRNAseq) (Klein et al., 2015). Le terme "cellules isolées" serait sans doute
plus approprié mais le terme "cellules uniques" est entré dans les mœurs.

Voir la vidéo d'explication sur ce site.

708
 Figure CT-10. Etapes pour une étude d'analyse
transcriptomique de cellules uniques. Les cellules sont
encapsulées dans des gouttelettes avec un tampon de
lyse, un mélange de transcription inverse et des
microsphères d'hydrogel portant des amorces à code-
barres. Après encapsulation, les amorces sont libérées.
L'ADNc dans chaque gouttelette est marqué avec un
code-barre lors de la transcription inverse. Les
gouttelettes sont ensuite cassées et le matériel de toutes
les cellules est amplifié linéairement avant le
séquençage. Toutes les séquences qui auront le même
code-barre proviennent de la même cellule et donc on
peut avoir accès au transcriptome de chaque cellule.
Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-
8674(15)00500-0

Voir un exemple d’analyse à la Figure 3-52.

Cette méthode contourne les limites de l'expression génique "moyennée" à partir d'organes entiers ou
d'échantillons de tissus et permet ainsi la définition et la caractérisation de cellules individuelles à haute
résolution. Ce type d'étude a généralement permis de se rendre compte d'une diversité
insoupçonnée de profils transcriptomiques au sein de tissus que l'on pensait homogènes et de
connaitre de manière plus précise les étapes de transition au cours du temps d'une population
cellulaire. Cette technique a cependant des limitations car seule la fraction la plus exprimée des transcrits
peut être analysée, laissant de côté les gènes peu transcrits mais dont certains peuvent néanmoins avoir un
impact significatif. Également, la résolution spatiale est perdue.

Ce genre d'analyse demande de solides bases en biostatistiques et en bioinformatique qui permettent de

sortir les informations les plus pertinentes de la quantité énorme de données que peut générer ce
genre d'étude. On peut classer par exemple les gènes différentiellement exprimés par fonction ou par
localisation subcellulaire grâce à la nomenclature Gene Ontology (GO).

On peut aussi réaliser des clusters, c'est-à-dire des regroupements de gènes qui ont des profils d'expression
similaires.

709
 **Figure CT-11. Analyse en cluster des résultats d'une
étude transcriptomique. Des cellules d'Arabidopsis
thaliana en suspension sont incubées en présence
d'aphidicoline qui les bloquent et les synchronisent à la
transition G1/S du cycle cellulaire. Puis on remplace le
milieu par un milieu sans aphidicoline et les cellules
reprennent le cycle cellulaire. On étudie les
transcriptomes des cellules à différents temps après
l'enlèvement de l'aphidicoline (colonnes dans la matrice
d'expression) et on classe les gènes en fonction de leur
dynamique d'expression au cours de cette cinétique
(lignes horizontales). On peut ainsi grouper les gènes par
classes (A, B, C...). Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(19)72050-
X/pdf

Les gènes rapporteurs

Étudier l'expression d'un gène précis est parfois complexe alors que certains gènes produisent des
protéines dont la présence et l'activité est aisément détectable. Ce sont les gènes rapporteurs. Les
produits de ces gènes ne doivent pas être présent naturellement pour que le signal observé soit clair, et ils
ne doivent pas interférer avec la physiologie cellulaire pour ne pas perturber le développement. Les gènes
rapporteurs peuvent coder : soit des enzymes dont le produit est facilement détectable (lumière
pour la luciférase, coloration bleu/rouge pour la β-galactosidase (selon le substrat Xgal/Redgal,
respectivement), soit des protéines fluorescentes telles que la GFP et ses dérivés.

*Figure CT-12. Réaction catalysée par la β-galactosidase avec le X-gal comme substrat.

L'avantage des protéines fluorescentes est qu'elle permette des observations sur les embryons vivants,
illuminés avec la bonne longueur d'onde tandis que la coloration à la β-galactosidase nécessite
généralement une fixation. Depuis récemment, l'activité luciférase peut aussi être observée sur des tissus
vivants et non plus seulement dans des extraits protéiques.

Voir la vidéo : https://youtu.be/VNmJxTEM1EY : La luciférase a été couplée avec le promoteur d'un gène
qui a un rythme d'expression circadien chez Arabidopsis. La vidéo correspond à 3 jours. Les plants sont
filmés par au-dessus avec une caméra sensible à la longueur d'onde qu'émet la luciférase en présence de
son substrat.

710
Couplés avec de la transgénèse, les gènes rapporteurs peuvent être des outils puissants pour étudier les
promoteurs et les enhancers puisque ces gènes peuvent être exprimés dans les embryons sous le contrôle
de ces éléments. L'adéquation du patron d'expression du gène rapporteur avec l'expression du gène
endogène dont on étudie les éléments de régulation transcriptionnelle permet de savoir si les fragments de
promoteurs ou d'enhancers choisis sont pertinents ou non.

Exemple d'utilisation de gène rapporteur : voir la Figure 1-41.

Les gènes rapporteurs peuvent aussi être introduits par knock-in dans le locus lui-même du gène et co-
transcrit avec lui. Dans l’exemple qui suit, ce n'est pas tant l'étude des séquences régulatrices qui importe
que de développer un outil pour repérer facilement l'expression d'un gène important qui est utile pour trier
des cellules ou suivre un lignage particulier par exemple.

**Figure CT-13. Introduction par knock-in d'un gène rapporteur. Le gène permettant d'exprimer la protéine
fluorescente jaune Venus dans le noyau (car produite fusionnées avec l'histone H2B) est introduit dans le premier
intron du gène Gata6. Il est excisé lors de l'épissage mais l'ARN correspondant pourra quand même sortir du noyau
et être traduit. Cette séquence ne perturbe pas la production de la protéine Gata6 (l'ATG de début de traduction se
trouve de toute manière en aval de l'ajout de la construction avec le gène rapporteur). Notez la cassette de sélection
β-actine-NEO-pA qui permet de produire un antibiotique qui permet de sélectionner les cellules ES dans lesquels le
knock-in a réussi. Cette cassette de sélection sera excisée par la suite. Source :
https://bmcdevbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12861-015-0086-5

Etude de la fixation des facteurs de transcription à l'ADN

> Hypersensitivité à la DNAse I

De manière assez indirecte, la fixation des facteurs de transcription peut se déduire de l'ouverture de la
chromatine et donc de l'hypersensitivité de traitement à la DNAse I qui coupera plus souvent dans des
régions chromatiniennes ouvertes.

Figure CT-14. Principe de la technique d’hypersensitivité à la DNAse I. Les fragments qui n’ont pas été
digérés parce qu’ils sont protégés par la chromatine sont séquencés et alignés sur le génome (DNAse-
seq). Source : Wang et al., 2012

711
 > ATACseq

Il s'agit d'une méthode qui tend à se substituer à l'hypersensibilité à la DNAse I. ATACseq vient de
Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing. Il s'agit de caractériser les
régions accessibles de la chromatine en utilisant la propriété des transposons (éléments ADN mobiles) de
s'intégrer préférentiellement dans les régions ouvertes de la chromatine. Le transposon recombinant utilisé
amène avec lui des séquences qui après fragmentation de l'ADN permettront de repérer les régions du
génome où il s'est inséré.
**Figure CT-15. Principe de l'ATACseq.
Source : https://www.france-genomique.org/expertises-
technologiques/regulome/cartographie-des-sites-daccessibilite-de-la-
chromatine-atac-seq/

Le protocole est plus rapide et demande moins de matériel que l'hypersensibilité à la DNAse I.

Des progrès techniques permettent maintenant de terminer l'accessibilité de la chromatine dans des
cellules en provenance d'une coupe histologique ce qui permet de maintenir une information spatiale et de
faire des cartes d'accessibilité de la chromatine pour un gène donné sur un embryon entier (en étudiant une
série de coupes) (Deng et al., 2022).

> EMSA (ElectroMobility Shift Assay) ou retard sur gel

Pour bien démontrer qu'un facteur de transcription (ou des histones ou tout autre protéine)
interagit avec une séquence spécifique d'ADN, on peut utiliser le fait que la fixation de la protéine
va retarder la migration de l'ADN dans une électrophorèse. Les protéines d'intérêt sont produites in
vitro ou présentes dans des extraits nucléaires (on cherche des facteurs de transcription, il est logique de
ne s'intéresser qu'à la fraction des protéines qui peut être au contact de l'ADN). Ces protéines sont mises à
incuber avec des fragments d'ADN (d'une vingtaine à une centaines de pb) marqués (soit radioactivement
mais cela ne se fait plus actuellement, soit avec de la biotine qui sera reconnue par la streptavidine couplée
à l'enzyme HRP dont l'activité sera révélée par une réaction d'électroluminescence (ECL). On doit également
mettre les mêmes fragments d'ADN mais non marqués pour réaliser une compétition et vérifier la spécificité
de la liaison de la protéine d'intérêt à l'ADN ou on peut utiliser des fragments d'ADN mutés dans le site de
fixation putatif que reconnaît la protéine comme témoin négatif (ou pour vérifier que ce site de fixation est
bien effectif). On fait migrer l'ensemble sur un gel à électrophorèse mais en conditions non
dénaturantes pour préserver la conformation des protéines et leurs interactions avec l'ADN. Ensuite,
l'ensemble est transféré sur une membrane de nitrocellulose comme pour un western-blot puis le marqueur
sur l'ADN est révélé. Vous pouvez étudier un exemple d’EMSA à la figure 6-74 ou 7-69.

712
Les facteurs de transcription fixés à l'ADN sont formellement identifiés grâce à l'utilisation
d'anticorps dirigés contre eux car ils forment avec les facteurs de transcription et l'ADN un complexe
encore plus gros qui ralentit d'autant plus la migration dans le gel lors de l'électrophorèse.

> L'immunoprécipitation de la chromatine

Figure CT-16. Etapes de la ChIPseq (immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage des fragments
précipités). La formation de liaisons covalentes entre les protéines et l'ADN est réalisée par le formaldéhyde. A la fin
de la procédure, on peut ne pas séquencer tous les fragments immunoprécipités et juste essayer d'amplifier par PCR
des fragments correspondants aux séquences régulatrices des gènes d'intérêt (ChIP-PCR).
D'après
https://en.wikipedia.org/wiki/Chromatin_immunoprecipitation#/media/File:Chromatin_immunoprecipitation_se
quencing.svg

> Le CUT&Tag-seq

Une nouvelle technique vient se substituer de temps à autre au ChIPseq avec une sensibilité plus forte,
moins de bruit de fond et moins de besoin en matériel de départ : le CUT&Tag-seq. Elle est toujours basée,
comme la ChIPseq, sur la fixation d'un anticorps sur la protéine dont on veut savoir où elle se lie sur l'ADN
génomique mais il n'y a plus d'immunoprécipitation. L'anticorps est reconnu par un complexe protéine A-
transposase Tn5 et c'est la transposase qui coupe l'ADN à proximité de la séquence où la protéine d'intérêt
s'est liée et y ajoute des tags (qui sont des adaptateurs pour le séquençage). Les fragments générés et qui
sont taggés sont ensuite séquencés (Kaya-Okur et al., 2019).

713
Détection des modifications épigénétiques de la chromatine
La méthode de ChIPseq précédemment décrite permet de connaître où se trouvent dans le génome des
formes méthylées ou acétylées d'histones particulières et donc d'avoir une idée de l'état favorable ou
défavorable de la chromatine à la transcription. La reconnaissance par les anticorps est si spécifique que
l'on peut distinguer une histone 3 diméthylée d'une histone 3 triméthylée.

*Figure CT-17. Résultat de ChIPseq avec an anticorps anti-H3K27ac (une forme de l'histone H3 acétylée sur la lysine
27, spécifique des chromatines ouvertes, favorables à la transcription). L'immunoprécipitation de la chromatine
(ChIP) a été réalisée avec 30 µg de chromatine provenant de cellules HAP1 (cellules humaines provenant d'une
tumeur myéloïde qui a la particularité d'être quasi haploïde ce qui facilite les analyses) et 4 µg d'anticorps Histone
H3K27ac. L'ADN immunoprécipité puis fragmenté a été séquencé en haut débit et 17,8 millions de séquences ont été
cartographiées sur le génome humain pour identifier les sites H3K27ac. Le diagramme mauve présente le nombre
de séquences obtenues après immunoprécipitation dans cette portion précise du génome. En dessous les exons et
les introns des gènes sont représentés. Source : https://www.activemotif.com/catalog/details/91193/abflex-
histone-h3k27ac-antibody-rab

Figure CT-18. Exemple d'analyse de la chromatine par

ChIP-seq. On obtient des corps embryonnaires à partir
de cellules ES où on fait exprimer (+) ou non (-) le facteur
de transcription Pax3. On extrait la chromatine puis on
réalise des ChIP-seq avec des anticorps reconnaissant
H3K27me3 (l'histone H3 avec une lysine 27
triméthylée), H3K27Ac (même acide aminé mais
acétylé), H3K4me3 ou H3K4me1. Chaque petite ligne
représente une région du génome et plus cette ligne est
bleutée plus elle a été retrouvée dans les séquences
d'ADN immunoprécipitées. Les séquences ont été
regroupées (clusterisées) selon leur profil. Ainsi, on peut
savoir quels changements épigénétiques ont été
provoquées par l'expression de Pax3. Source :
https://www.nature.com/articles/s41467-019-10318-
6

La détection de la méthylation de l'ADN est expliquée sur ce lien. Citons le BS (Bisulfite sequencing) : L'ADN
génomique est coupé par une ou plusieurs enzymes de restriction. On utilise fréquemment MspI qui n'est
pas influencé par la méthylation de l'ADN. Les fragments sont ensuite traités avec le bisulfite. En présence

714
de ce composé chimique, les cytosines sont converties en uracile, alors que les cytosines méthylées ne sont
pas affectées. L'ensemble des fragments traités est ensuite amplifié par PCR puis séquencé.
*Figure CT-19. Utilisation du bisulfite pour ensuite
repérer par séquençage les cytosines qui étaient
méthylées. Modifié depuis https://en.wikipedia.org/wiki/Bisulfite_sequencing#/media/File:Wiki_Bisulfite_sequencing_Figure_1_small.png

Détection des structures chromatiniennes

> Hi-C

**Figure CT-20. Technique de Hi-C. Des liaisons covalentes sont créées (crosslinking) pour stabiliser la structure de
la chromatine puis l'ADN est digéré par des enzymes. Des fragments dans le même TAD (domaine topologique
d'association) (bleu et rouge) ont une grande probabilité de rester associés par les protéines qui forment la frontière
entre les TAD et forment les boucles de chromatine. Ces ensembles de deux fragments sont rattachés ensemble puis
séquencés à haut débits. On représente les résultats sous la forme d'une matrice avec la représentation des fragments
retrouvés le plus souvent ensemble lors du séquençage. Source.

Etude de la traduction

Si la régulation de la transcription a attiré l'essentiel des regards jusqu'à récemment, l'étude de la

traduction devient de plus en plus importante, en relation avec la découverte de l'étendue des régulations
par les microARN. Parmi les méthodes développées, citons le TRAP (Translating Ribosome Affinity
Purification) qui permet de connaître quels ARNm sont effectivement traduits à un instant donné dans
une population de cellules.

**Figure CT-21. Principe du TRAP. On exprime dans des

cellules une forme taguée (ici avec Flag) d'une protéine
ribosomale (ici RpL3). Puis on immunoprécipite les
ribosomes avec des anticorps anti-tag. Les ARNm sur
lesquels les ribosomes étaient accrochés sont purifiés
puis séquencés. Source :
https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1007117

Pour l'étude de l'action des microARN sur la traduction, on peut avoir recours à la technique de
séquestration de microARN. On utilise des "éponges à microARN" en faisant exprimer dans les cellules de
multiples copies des séquences cibles d'un microARN donné pour qu'il s'associe à ces séquences et non pas
715
aux ARNm qu'il cible habituellement (voir par exemple : https://www.accegen.com/services/microrna-
sponge-service/).

Modifications du génotype

*Figure CT-22. Des mutants aux gènes et des gènes aux mutants.

De manière historique, la génétique du développement a procédé par l'observation de mutants soit naturels,
soit induits par des agents mutagènes et ensuite la cartographie génétique a permis de remonter aux loci
impliqués puis aux séquences des gènes dès que la technique de séquençage Sanger a été mise au point en
1977. De célèbres criblages par mutagénèse chez la drosophile en 1980 (600 mutations obtenues réparties
sur 120 gènes) et sur le poisson zèbre en 1996 ont permis l'identification de très nombreux gènes essentiels
pour le développement.

Cependant, les techniques plus précises de génétique inverse se sont progressivement imposées, grâce à
des procédures optimisées et de plus en plus précises de mutagénèse dirigée que nous allons voir. Elles
consistent à introduire soit des mutations gain-de-fonction ou des perte-de-fonction dans des gènes déjà
connus de par leur séquence. Les mutations gain-de-fonction permettent de savoir à quoi le produit
du gène est suffisant et les mutation perte-de-fonction permettent de savoir à quoi le produit du
gène est nécessaire.

> Transgénèse chez les végétaux

Les propriétés de la bactérie pathogène Agrobacterium tumefaciens (qui provoque

habituellement des galles) sont utilisées comme vecteur des gènes. On utilise le plus souvent des
plasmides dérivés de son plasmide Ti, dit plasmides désarmés (ou D-Ti), car leur ADN ne porte plus les
gènes responsables du pouvoir pathogène. Ce plasmide garde cependant la propriété de contrôler le
passage dans la cellule végétale puis l'insertion dans son génome de l'ADN de transfert (ou ADN-T) qui
contient le(s) gène(s) d’intérêt et un ou plusieurs gènes de sélection (le gène de résistance à la kanamycine
par exemple). L'ADN-T s'insère dans le génome et des agents de sélection permettent de ne faire
survivre que les cellules végétales transformées. Des plantes entières sont ensuite régénérées à partir
des protoplastes (cellules végétales sans parois) ou des cals où la transformation a eu lieu par des
techniques classiques de culture in vitro, faisant intervenir les hormones végétales telles que l'auxine et les
cytokinines.

La méthode "floral dip" permet de réaliser la transformation dans des bourgeons floraux en
développement. Le transfert de l'ADN-T peut alors affecter des cellules germinales et le transgène sera
transmis à la génération suivante par les gamétophytes (mâles ou femelles). On sélectionne alors quelles
plantules issues de la fécondation et de la germination ont intégré le transgène.

Une autre méthode très différente pour créer des plantes transgéniques utilise la biolistique
(mot fabriqué à partir de biologie et balistique) : des billes d'or ou de tungstène de 1 µm de diamètre
sont enrobées d'ADN et projetées à grande vitesse vers des cellules végétales. Certaines traversent

716
la paroi et la membrane plasmique et dans un petit nombre de cas l'ADN s'insère dans le génome
(nucléaire mais aussi éventuellement mitochondrial ou chloroplastique).

> Transgénèse chez la drosophile et système FRT-FLP

La transgénèse chez la drosophile consiste à insérer une séquence

d'ADN connue dans l'ADN chromosomique en utilisant comme vecteur un élément transposable
(transposon) qui se transpose spontanément dans certaines souches de drosophiles. Ce transposon est
connu sous le nom d'élément P. Les éléments P peuvent s'insérer dans n'importe quel site du génome et
peuvent aussi se transposer d’un site à un autre dans les cellules germinales, une action qui réclame la
présence d'une enzyme appelée transposase. Comme ce mécanisme est susceptible de générer de
l’instabilité génomique, on a retiré aux éléments P servant de vecteur de transgénèse le gène codant la
transposase. La transposase nécessaire à l'insertion initiale de l'élément P est fourni par un élément P dit
« helper », qui ne peut pas s'insérer dans le génome, et est donc rapidement éliminé. Les éléments P «
vecteur » et « helper » sont injectés ensemble dans la partie postérieure de l'œuf où se forment les
cellules germinales. En plus du gène à insérer, l'élément P modifié a un gène marqueur tel que l'allèle
sauvage du gène white. Dans ce cas, l'élément P est inséré chez des mouches homozygotes pour l'allèle
mutant white- (qui ont des yeux blancs à la place des yeux rouges habituels de la drosophile sauvage). Les
yeux rouges constituant un caractère dominant sur les yeux blancs, les mouches chez lesquelles l'élément P
a été inséré et est exprimé, auront des yeux rouges et seront ainsi facilement repérées.

Un système basé sur la spécificité de l'activité des promoteurs et utilisant la transgénèse permet de
ne faire exprimer un gène d'intérêt ou un gène rapporteur uniquement dans les cellules où un
promoteur est actif. Il s'agit du système UAS-GAL4. GAL4 est un facteur de transcription activateur qui
reconnait une séquence spécifique appelée UAS (pour Upstream Activation Sequence).

Voir la Figure 1-13.

Chez la drosophile, des pertes et des gains-de-fonctions peuvent être obtenus grâce au système FLP-
FRT. FLP (ou flippase) est une recombinase de levure qui est capable de recombiner deux séquences FRT
(pour Flippase Recognition Target) et de déléter les séquences qui se trouvent entre deux séquences FRT
(Figure 1-14).

> Transgénèse chez la souris

Par traitement hormonal, on fait superovuler des souris femelles puis on les accouple avec un mâle. Les
zygotes sont rapidement récupérés dans les voies génitales puis incubés in vitro. L'ADN d'intérêt, souvent
un gène sous le contrôle d'un promoteur spécifique est injecté dans le pronucléus mâle. Puis on
sélectionne les embryons qui ont poursuivi correctement leur développement et on les injecte dans l'utérus
d'une femelle pseudo-gestante (la copulation amène des stimuli mécaniques nécessaires au bon
développement de l'utérus pour la gestation alors la femelle est préalablement accouplée avec mâle
vasectomisé). Les souriceaux nés doivent ensuite être sélectionnés pour la présence et l'expression du
transgène. En effet, l'insertion du transgène dans le génome ne réussit pas à chaque fois et le
transgène peut aussi très bien s'être inséré dans de l'hétérochromatine silencieuse. On effectue une
PCR, puis une RT-PCR ou alors un test qui permet de révéler l'expression d'un gène rapporteur si on en a
mis un (coloration X-gal si on a mis le gène de la beta-galactosidase). De toute manière, il faut toujours
étudier plusieurs lignées transgéniques car l'ADN exogène s'insérant n'importe où au hasard dans le
génome il faut vérifier que le phénotype observé n'est pas provoqué par la mutation introduite au
point d'insertion mais bien par l'information du transgène lui-même.

> Knock-out chez la souris

La technique du knock-out et du knock-in chez la souris est basé sur le remplacement d'un allèle
sauvage par un allèle muté en utilisant la recombinaison homologue. Dans le cas du knock-out, le
nouvel allèle ne donne pas de protéine fonctionnelle alors que dans le knock-in, une protéine au
moins partiellement fonctionnelle (avec un site phosphorylable en moins par exemple) sera
produite.

717
 *Figure CT-23. Introduction des mutations
knock-out ou knock-in dans des souris. La
mutation par recombinaison homologue est
réalisée dans des cellules ES (embryonnaires
souches) pluripotentes. Ces cellules sont
injectées dans la masse cellulaire interne de
blastocyste sauvage et l'embryon chimérique
ainsi généré est transféré dans une mère
porteuse. On obtient des souriceaux
chimériques et certains d'entre eux ont leur
lignée germinale formée à partir des cellules
mutées (descendantes des cellules ES
injectées dans les blastocystes). On croise ces
souris avec des souris normales. A la
génération suivante, la moitié des souris aura
toutes leurs cellules hétérozygotes pour la
mutation. On croise alors ces souris entre elles
et un quart de leur descendance sera
homozygote pour la mutation introduite.
D'après https://www.genome.gov/about-genomics/fact-
sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet

L'International Mouse Phenotypic Consortium ont maintenant généré des knock-out de plus de 6000 gènes
chez la souris (Dickinson et al., 2016; Cacheiro et al., 2019)

> Le système Cre-Lox

Les knock-out abolissent la fonctionnalité d'un gène depuis le début de son expression. Or parfois un gène
peut avoir des fonctions à différents moments du développement. S'il a un rôle vital à une phase précoce du
développement, un knock-out ne permettra pas de connaître sa fonction à des phases tardives. Le système
Cre-Lox a permis de franchir cet obstacle en rendant possible une délétion d'un gène contrôlée spatio-
temporellement au cours du développement.

La recombinase Cre est une endonucléase du bactériophage P1 qui est capable d'exciser de l'ADN toutes
séquences entre deux sites de quelques nucléotides appelés LoxP (plus précisément, les séquences LoxP
sont constituées de 2 séquences inversées de 13 paires de bases séparées par 8 paires de bases). Ainsi, on
peut créer une souris transgénique exprimant la Cre sous certaines conditions (car sous le contrôle d'un
promoteur spécifique ou aussi activable par une injection de tamoxifène (analogue des œstrogènes) pour
une forme de la Cre liée au domaine de fixation du ligand du récepteur aux œstrogènes) et on peut la croiser
avec une souris knock-in où les allèles endogènes ont été remplacés par des allèles flanqués de 2 séquences
LoxP (on dit que l'allèle a été floxé). Le gène sera délété uniquement lorsque la Cre sera présente et
fonctionnelle.

718
 **Figure CT-24. Système Cre-Lox. Ici, l'activation de la Cre par un promoteur spécifique provoque la délétion d'un
gène mais permet l'expression de la eGFP (une forme de la GFP à la fluorescence renforcée). En effet, dans la souris
knock-in en haut à droite, la eGFP ne peut être exprimée car il y a un codon STOP entre le gène ciblé et elle. Grâce à
l'action de la Cre dans les cellules où elle est exprimée dans les souris F1, non seulement le gène cible mais aussi ce
codon STOP est éliminé. Cette méthode permet de repérer par fluorescence les cellules où le gène cible a été délété
et de suivre leur devenir. Source : https://en.wikipedia.org/wiki/Cre-
Lox_recombination#/media/File:CreLoxP_experiment.png

Le système Cre-Lox peut aussi être utilisé pour faire du suivi de lignage cellulaire. L'activation d'un
promoteur donné permet l'expression de la Cre qui va permettre la délétion d'une séquence générant un
codon STOP qui empêche la production d'une protéine rapportrice fonctionnelle. Toutes les cellules qui ont
activé le promoteur et aussi ses descendantes vont alors exprimer la protéine rapportrice. Cela est valable
y compris pour les cellules où l'activité du promoteur se sera éteinte car la délétion de la séquence générant
un codon STOP est définitive et donc une expression transitoire de la Cre suffit.

On peut réaliser un suivi de lignage cellulaire grâce au système Cre-Lox : voir la Figure 1-45.

Une méthode basée sur le système Cre-Lox permet de suivre individuellement le devenir de plusieurs
cellules en leur faisant exprimer une combinaison de fluorophores différents : la méthode Brainbow qui a
été développée pour l'étude des connexions nerveuses dans le cerveau mais qui peut s'appliquer à d'autres
systèmes.

719
 **Figure CT-25a. Principe de la méthode Brainbow. La recombinaison de la construction par Cre peut donner lieu à
trois résultats possibles : 1) Une recombinaison du site LoxN entraîne l'activation transcriptionnelle de RFP. Comme
les deux autres sites Lox (Lox2722 et LoxP ) sont dépourvus d'un second site parce qu'ils ont été placés 3′ du site
LoxN, aucune autre recombinaison ne peut se produire. 2) Si la première recombinaison se produit entre les sites
Lox2272, le résultat est l'expression de la YFP. 3) si elle se produit entre les sites LoxP, il en résulte au contraire
l'expression de la CFP. Des systèmes plus complexes ont été développés et permettent d'avoir une variété de couleur
fluorescente bien plus importante. Source :
https://www.researchgate.net/publication/256764828_The_CreLox_System_to_Assess_the_Development_of_the_M
ouse_Brain/figures?lo=1

**Figure CT-25b. Résultat de la méthode Brainbow

décrite ci-dessus. Selon les hasards de la recombinaison
des sites Lox par la recombinase Cre, trois populations de
neurones sont distinguables et on peut suivre leurs
prolongements. Source :
https://www.nature.com/articles/nature06293

> CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas9 a largement remplacé les méthodes traditionnelles de production d'animaux transgéniques et

knock-out en raison de sa rapidité et de sa grande efficacité d'édition (Burgio, 2018). De manière plus
transformative, CRISPR-Cas9 a élargi la portée des efforts pour comprendre comment les réseaux de gènes
contrôlent l'acquisition du destin cellulaire.

Voir la vidéo : https://www.youtube.com/watch?v=RplWR12npqM

Adapté d'un système « immunitaire » bactérien, le système CRISPR a été récupéré par les chercheurs pour
une utilisation dans l'édition des génomes eucaryotes en fabriquant des ARN guides simples (sgRNA) qui
se complexent avec une endonucléase, le plus souvent Cas9, pour induire des cassures double brin
(DSB) à un emplacement spécifique dans le génome, spécifié par la séquence de sgRNA et un motif
adjacent protospacer (PAM).

720
 *Figure CT-26. Principe de la technique de
mutagenèse dirigée CRISPR/Cas9. La cassure
double brin est réalisée par Cas9 à un locus précis
de génome grâce à l'ARN guide (sgRNA) et à la
proximité d'une séquence PAM. Si on introduit
une séquence d'ADN exogène avec des séquences
homologues à celles autour de la cassure
entourant une séquence d'ADN nouvelle, cette
dernière séquence sera introduite dans le génome
et ainsi un allèle sera remplacé par un autre de
manière contrôlé. En absence de cet ADN exogène,
une petite séquence aléatoire est ajoutée par les
enzymes de réparation de l'ADN ce qui engendre
des mutations mais moins précisément
contrôlées.
D'après
https://journals.biologists.com/dev/article/148/9/dev182667/261698/Using-CRISPR-
to-understand-and-manipulate-gene

Après la cassure double brin, les enzymes de réparation de l'ADN de la cellule entrent en action. Elles
peuvent : (i) soit combler la cassure en insérant une petite séquence aléatoire (méthode de réparation
appelée NHEJ pour Non-Homologous End Joining), ce qui introduit une mutation et par exemple un décalage
du cadre de lecture si on se trouve dans la séquence codante d'un gène et que la séquence aléatoire insérée
n'a pas un nombre de nucléotides multiple de 3 ; (ii) soit, en présence d'un fragment d'ADN exogène
comportant des séquences homologues autour de la cassure et une séquence nouvelle que l'on souhaite
insérer, remplacer par recombinaison homologue l'allèle abîmé par la cassure par l'allèle que l'on a
introduit. Le processus s'appelle HDR pour Homologous Directed Repair. Il permet de faire une mutagénèse
dirigée très précise et permet d'introduire par exemple une mutation ponctuelle sur un site de
phosphorylation (qui changera une sérine ou une tyrosine en alanine), sur un site de fixation d'un facteur
de transcription sur un promoteur, ou carrément l'introduction d'un gène rapporteur sur le site de la DSB.

Pour voir la comparaison de la technique classique du knock-out/knock-in et de la technique CRISPR/Cas9

pour introduire une mutation chez la souris : voir la Figure 1-43.

Initialement, l'édition CRISPR était limitée aux séquences proximales du PAM (protospacer adjacent motif,
une courte séquence d'ADN (généralement de 2 à 6 paires de bases) qui suit la région d'ADN ciblée pour le
clivage par le CRISPR). Cependant, désormais, de nombreux variants Cas9 et Cas12a de bactéries et de
phages ont été caractérisés, chacun avec des PAM distincts, ce qui permet d'élargir les cibles possibles à des
régions plus variées avec des PAM différents (Manghwar et al., 2019; Pausch et al., 2020). En outre, les
variantes Cas9 ont été conçues avec une reconnaissance PAM «plus lâche» qui sert à encore élargir la plage
de ciblage (Kleinstiver et al., 2015; Nishimasu et al., 2018; Walton et al., 2020).

Le principal danger de la méthode CRISPR/Cas9 est constitué par la création de mutations ailleurs dans le
génome qu'à l'endroit prévu. Des variantes avec une réduction de l'édition de l'ADN hors cible ont été
développées, bien qu'elles réduisent simultanément l'efficacité de l'édition (Kim et al., 2020; Kleinstiver et
al., 2016; Slaymaker et al., 2016).

Les facteurs épigénétiques, tels que les modifications post-transcriptionnelles des histones, la méthylation
de l'ADN et les ARN non codants, contribuent énormément au contrôle de l'expression génétique. Disséquer
le rôle de ces modifications épigénétiques sur la régulation des gènes a été accéléré par la capacité à
modifier spécifiquement les modifications épigénétiques en utilisant CRISPR/dCas9. dCas9 est un variant
de Cas9 qui joue juste le rôle de guide mais qui ne clive pas l'ADN car son activité endonucléase est abolie
par des mutations (D10A et H840A). Il a été utilisé pour recruter des modificateurs épigénétiques afin
d'évaluer leurs conséquences fonctionnelles. dCas9 est alors fusionné à des enzymes et des complexes de
modification épigénétique, par exemple l'histone déméthylase 1A spécifique de la lysine (LSD1; KDM1A)
(Kearns et al., 2015), l'histone acétyltransférase p300 (Hilton et al., 2015), ou EZH2, un répresseur de la
famille Polycomb (O'Geen et al., 2019).

721
 **Figure CT-27. La protéine de fusion dCas9-p300 active la transcription des gènes endogènes par son activité
histone acétyltransférase. (a) Schéma des protéines de fusion dCas9, dCas9VP64 (VP64 est un domaine d'activation
de la transcription), dCas9FLp300 (toute la protéine p300 fusionnée avec dCas9), dCas9p300 Core (seulement le
domaine nécessaire à l'activité histone acétylase de p300 fusionnée avec dCas9) et dCas9p300 Core D1399Y (une
forme mutée de p300 sans activité histone acétylase). b) Expression relative de l'ARNm d'IL1RN (Interleukin 1
Receptor Antagonist), de MYOD et d'OCT4, déterminée par qRT-PCR, avec chaque région promotrice respective ciblée
par les diverses protéines fusions co-transfectée avec quatre ARNg. Les nombres au-dessus des barres indiquent
l'expression moyenne ; NLS = séquence de localisation nucléaire; HA = étiquette d'épitope d'hémagglutinine (pour
l'étude de l'expression des protéines); CH = région riche en cystéine histidine; Bd = bromodomaine; HAT = domaine
histone acétyltransférase. On constate une nette augmentation de l'expression des gènes avec la forme p300Core en
relation avec son activité HAT (quelque chose de pas encore bien compris inhibe l'activité HAT avec la protéine
entière). Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4430400/pdf/nihms672873.pdf

dCas9 fusionnée à des activateurs de la transcription (comme VP64) a été aussi utilisé pour produire des
cellules iPS et pour la transdifférenciation de fibroblastes en neurones (Black et al., 2016; Liu et al., 2018;
Weltner et al., 2018).
Figure CT-28. dCAS9-VP64 (fusion de la protéine dCAS9
avec le domaine d'activation VP64) permet d'activer la
transcription d'un gène de manière ciblée. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/148/9/dev182667/261698/Using-CRISPR-to-understand-and-manipulate-gene

L'efficacité de la production des iPS a été augmentée en activant non seulement les facteurs de transcription
connus (POU5F1, MYC, KLF4, SOX2 et LIN28A), mais aussi en se fixant sur des séquences Alu enrichis en
722
motif EGA répétitif (motif EEA), qui se trouvent souvent sur les promoteurs de gènes exprimés lors de
l'activation de la transcription du génome de l'embryon humain, révélant ainsi un avantage supplémentaire
de dCas9 qui ne peut pas être facilement réalisé à l'aide de transgènes. Néanmoins, dans tous ces
paradigmes, la reprogrammation basée sur dCas9 est restée nettement moins puissante que la
reprogrammation basée sur les transgènes, probablement parce que les niveaux d'induction de facteurs de
transcription requis pour une reprogrammation efficace ne peuvent pas être atteints avec la technologie
CRISPR actuelle.

En ce qui concerne l’utilisation de la technique de CRISPR/Cas9 en thérapie génique, il faut s’armer de

prudence concernant le ciblage de l’édition qui n’est parfois pas correct. Une étude a montré que des
éditions dans les cellules des embryons humains précoces avaient provoqué des mutations non souhaitées
dans 22% des cellules concernées. Bien qu'il y ait eu des améliorations, une instabilité génomique
préoccupante peut suivre un traitement CRISPR/Cas9 (Papathanasiou et al., 2021).

En dehors des mutations "ponctuelles" ou limitées que nous venons de voir, CRISPR/Cas9 peut aussi être
utilisé pour des modifications génomiques à plus grande échelle. Si deux cassures double brin sont induites
simultanément sur le même chromosome ou sur des chromosomes différents, des réarrangements
chromosomiques, tels que des inversions et des translocations, peuvent être induits. Chez les plantes, les
réarrangements chromosomiques contribuent fortement aux processus évolutifs et sont répandus dans
diverses familles de plantes et les généticiens des plantes voient un grand intérêt dans CRISPR/Cas9
également pour cette raison.

*Figure CT-29. Exemples de modifications chromosomiques qui peuvent être obtenues par CRISPR/Cas9. Les flèches
orange indiquent la localisation des cassures double brin (qui doivent être simultanées) réalisées par Cas9. Source :
https://www.nature.com/articles/s41596-022-00686-7

Signalons qu'il existe aussi une forme photoactivable de Cas9 qui permet de déclencher le changement
d'allèle à un moment bien précis par une illumination LED (Takao et al., 2020).

> Interférence ARN

Les principes de l'interférence ont été découverts par hasard au cours de l'étude de la coloration des
pétunias au début des années 1990 puis a été développé chez le nématode Caenorhabditis elegans. De petits
fragments d'ARN de 21-25 nucléotides appelés ARNi se lient à des séquences des ARNm
complémentaires et bloquent leur traduction et même leur transcription (un phénomène appelé
RITS pour RNA-induced transcription silencing). Ces mécanismes se sont développés au cours de
l'évolution pour s'opposer aux virus et aux transposons, notamment les plantes. Les chercheurs peuvent
désormais les détourner à leur profit.

Chez les végétaux, on peut faire produire des ARNi par la plante grâce à la technique VIGS pour Virus-
Induced Gene Silencing : un vecteur viral (généralement dérivé du virus TRV (Tobacco Rattle Virus)) est
introduit dans la plante et permet de produire des ARN double brin contenant une partie de la séquence de
l'ARNm dont il faut inhiber la traduction. Les cellules végétales produisent ensuite elles-mêmes les ARNi
nécessaires dans un mécanisme de défense, croyant que cette séquence est une séquence virale alors qu'elle
correspond en fait à l'un de ses propres ARNm. C'est une méthode plus efficace et rapide que d'introduire
des ARNi dans les cellules végétales.
723
Pour introduire des ARNi dans C. elegans, il suffit de leur donner à manger des bactéries E. coli qui expriment
les ARNi sous la forme d'un double brin (plus stable). Par un mécanisme peu compris, ces ARN double brin
sont capables d'atteindre toutes les cellules où la machinerie cellulaire se charge de les transformer en ARNi
simple brin. L'introduction des ARNi n'est pas aussi simple dans les autres systèmes. Dans les cellules en
culture, on peut les introduire par lipofection. Dans les embryons, on peut les introduire par
électroporation. Mais leur présence est alors transitoire. Pour une présence plus prolongée on peut
introduire dans les cellules un ADN qui code un ARN qui va donner un ARNi. Cet ARN est appelé shARN (sh
pour short hairpin) car on lui donne une séquence qui le fait prendre une structure secondaire repliée pour
être plus stable et mieux se faire reconnaître par les complexes cellulaires pour se faire transformer en
ARNi.

Des criblages peuvent être réalisés grâce à des banques de ARNi ou de shARN. Cela permet, de manière non
biaisée, de trouver des nouveaux candidats pour une fonction donnée comme dans l'exemple suivant :

**Figure CT-30. Criblage de gènes dont les produits interviennent dans la différenciation en endoderme ou
mésoderme des cellules ES de souris. Une banque de shARN concernant des gènes impliqués dans les modifications
épigénétiques de la chromatine est testée sur des cellules ES que l'on fait différencier soit en endoderme, soit en
mésoderme. Les cellules ES expriment des gènes rapporteurs de différenciation endodermique (CD4 sous le contrôle
du promoteur de Foxa2) ou mésodermique (GFP sous le contrôle du promoteur de Brachyury). Les cellules ES en
différenciation sont soumises à des séries de FACS et celles qui se sont significativement plus ou moins différenciées
en endoderme ou mésoderme que les cellules contrôle sont identifiées. Les gènes cibles des shARN correspondants
sont ensuite étudiés. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(17)50653-
5/fulltexthttps://www.jbc.org/article/S0021-9258(17)50653-5/fulltext

Les outils bioinformatiques

L'accumulation exponentielle de données en provenance du séquençage et des analyses transcriptomiques
a amené à développer de nombreux outils pour trouver des informations pertinentes. Si certains de ses
outils sont une affaire de spécialistes, certains peuvent être utilisés de manière courante avec un minimum
de formation :

BLAST : pour comparer des séquences entre elles ou une séquence avec les génomes sequencés.

geWorkbench : plateforme open-source avec de nombreux outils et de plug-ins pour des analyses
génomiques et transcriptomiques.

Reactome : base de données sur les voies de signalisation et leurs liens avec des processus cellulaires.

MirGeneDB : une base de données des microARN chez de nombreuses espèces.

Les techniques et les outils pour la biologie cellulaire

La culture cellulaire
La culture cellulaire in vitro concerne :

• des cultures primaires : c'est-à-dire des cellules prélevées sur un être vivant et que l'on met
en culture in vitro mais qui ne peuvent pas être maintenues sur une longue durée de temps
avec une prolifération élevée (entre autre, parce qu'elles atteignent la limite de Hayflick où elles
entrent en sénescence, notamment à cause du raccourcissement des télomères à chaque
réplication),

724
 • des lignées cellulaires : c'est-à-dire des cellules prélevées sur un être vivant il y a longtemps
et qui maintiennent des capacités de prolifération théoriquement illimitées (parce qu'elles
sont cancéreuses, ou parce qu'elles ont des propriétés de cellules souches ou parce qu'elles
ont été "immortalisées" en leur faisant exprimer un oncogène (souvent l’antigène T du virus
SV40 qui inhibe Rb et p53).
*Figure CT-31. Test de sénescence dans des cultures de
fibroblastes de souris embryonnaires (MEF) ou test
SABG. (En haut) Avant la sénescence, MEF au 2ème
passage après prélèvement. Les MEF ont une forme de
fuseau. (En bas) Après le 8ème passage, les MEF se sont
agrandis et se sont aplatis. La coloration bleu-vert
indique l’expression de la β-galactosidase associée à la
sénescence (la coloration est obtenue en présence du
substrat X-gal). Source :
https://en.wikipedia.org/wiki/Cellular_senescence#/media/File:SABG_MEFs.jpg

Des stocks de lignées cellulaires peuvent être conservées "indéfiniment" dans de l'azote liquide
(cryoconservation à -196°C).

La culture cellulaire présente de nombreux avantages mais aussi des inconvénients. Les cellules sont dans
un environnement contrôlé (température, nutriments disponibles, éventuellement matrice
extracellulaire...) mais cet environnement est parfois éloigné des conditions physiologiques. Dans des
cultures classiques en 2D chaque cellule est facilement visible, mais les propriétés des organisations 3D
dans les tissus peuvent être perdues. Les capacités importantes de prolifération, notamment des lignées
cellulaires utilisées permettent d'obtenir beaucoup de matériel pour faire des études de biochimie et
facilitent les analyses statistiques mais une fois de plus les cellules ne sont pas dans leur cadre naturel et
des cellules très proliférantes ne correspondent qu'à un profil particulier de cellules.

La culture cellulaire permet de diminuer le recours à l'expérimentation animale mais ne peut pas la
remplacer complètement.

Les cellules sont cultivées dans un milieu nutritif contenant des nutriments et des vitamines et
souvent additionné de sérum (sérum de veau fœtal typiquement) dans lequel se trouvent des
facteurs de croissance nécessaire à la prolifération. Pour les cellules qui prolifèrent, on suit le
niveau de confluence, c'est-à-dire le pourcentage de la surface couvert par les cellules.

Des nouvelles technologies permettent un suivi en continu de l'adhérence, de la prolifération et de la

migration des cellules lors de la culture.
**Figure CT-32. Suivi en temps réel de l'adhérence et de
la confluence des cellules par la technologie xCELLigence
qui est basée sur les variations de l'impédance (de la
résistance électrique) d'une couche riche en or qui
dépend des cellules qui sont attachées sur le substrat.
Ces modifications d'impédance sont traduits en un "cell
index" qui est nul si aucune cellule n'est attachée. Des
changements dans la morphologie cellulaire (adhérence,
étalement), le nombre de cellules (prolifération ou mort)
ou la migration peuvent être étudiés à l'aide de ce
système. En haut, on suit l'adhérence initiale de cellules
que l'on vient de disperser dans le milieu de culture. En
bas, à plus long terme, on peut suivre l'étalement des
cellules. Ici, les cellules ne prolifèrent pas, mais si elles
proliféraient on observerait une pente ascendante au
lieu d'un plateau. Source : https://www.mdpi.com/2079-
6374/5/2/199/htm

725
Le fractionnement cellulaire par centrifugation différentielle
Il s'agit d'une technique pour purifier des fractions particulières du contenu des cellules (noyau,
mitochondries, ribosomes...). Elle est basée sur une série de centrifugation à des vitesses de plus en plus
élevées qui permettent de précipiter des composants de plus en plus petits.

Voir la vidéo : https://youtu.be/SjaFUJhzY9Q

Western-blot
Il s'agit d'une méthode de séparation des protéines selon leur taille dans un gel de polyacrylamide
puis de transfert vers une membrane où les protéines sont identifiées grâce à des anticorps.

Les anticorps utilisés (pour le western-blot ou d'autres techniques utilisant des anticorps) peuvent être de
deux types :

• Des anticorps polyclonaux (en fait un mélange d'anticorps différents) qui sont produits par un
animal (lapin, souris, chèvre...) après injection de l'antigène que l'on souhaite reconnaître.

• Des anticorps monoclonaux (tous identiques) contre un antigène donné produits dans des
hybridomes, c'est-à-dire des lymphocytes B rendus "immortels" après fusion avec des cellules
cancéreuses de myélome.

Présentation de la technique en vidéo :

https://www.youtube.com/watch?v=1h3PvWxMyd4

Un exemple de protocole d'extraction de protéines et de Western-Blot en détail :

d'inhibiteur de protéase et 1 comprimé d'inhibiteur de phosphatase par 10 ml. La concentration totale de

protéines dans les lysats a été déterminée à l'aide d'un kit Pierce BCA Protein Assay. L'absorbance a été mesurée
à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque. Un gel de polyacrylamide à 8 % contenant du SDS surmonté
d'un gel de stacking (pour concentrer les protéines) a été préparé. Ensuite, 15 µL de mélange d'échantillons,
contenant 9 µg de protéines totales et 5 µL de tampon d'échantillon (5,7 ml d'eau, 1,6 ml de glycérol, 1,1 ml de
SDS à 10 %, 1,3 ml de Tris 0,5 M (pH 6,8), 25 mg de dithiotréitol (DTT, casse les ponts disulfures des protéines),
300 µL de bleu de bromophénol) ont été chauffés à 90 °C pendant 5 min (pour dénaturer les protéines), refroidis
sur de la glace et chargé sur le gel. Le gel a été incubé dans du tampon d'électrophorèse (Tris Base 25 mM,
glycine 190 mM, 0,1 % SDS) à 70 V jusqu'à ce que les échantillons atteignent le gel de séparation, puis à 150 V
jusqu'à ce que les échantillons atteignent le bas du gel. Ensuite, les protéines ont été transférées sur une
membrane en polyfluorure de vinylidène (PVDF) pendant 1 h à 80 V sur glace dans un tampon de transfert
froid (Tris base 25 mM, glycine 190 mM, éthanol 20%). La membrane a été rincée à l'eau et lavée 2x dans une
solution saline tamponnée au Tris et du Tween-20 (TBS-T) (20 mM de Tris/HCl, 137 mM de NaCl, 0,1 % de
Tween-20). La membrane a été incubée pendant 1 h à température ambiante dans un tampon de blocage (5%
BSA dans du TBS-T, sature les sites non spécifiques sur lesquels l'anticorps pourrait s'accrocher) sous agitation.
Ensuite, la membrane a été incubée pendant la nuit dans le tampon de blocage avec un anticorps primaire à la
concentration souhaitée à 4°C sous agitation. La membrane a été lavée 3 × 5 min dans du TBS-T et incubée
dans le tampon de blocage avec l'anticorps secondaire reconnaissant l'anticorps primaire pendant 1 h à
température ambiante. Un ECL a été réalisé. Les images ont été prises par ImageQuant LAS500 (GE Healthcare,
Life Sciences, Chicago, IL, USA) et l'intensité relative des bandes de protéines a été quantifiée à l'aide d'ImageJ.

726
 *Figure CT-33. Une membrane de western-blot colorée
au Rouge Ponceau. Le Rouge Ponceau colore en rouge
l'ensemble des protéines qui ont été transférées depuis
le gel de polyacrylamide vers la membrane. Cela permet
de contrôler si le transfert s'est bien passé et si la
quantité totale des protéines est similaire d'un puits à
l'autre (ici moins de protéines dans le puits à gauche).
Les puits aux extrémités latérales correspondent aux
poids moléculaires contrôles (non colorés par le Rouge
Ponceau).

Un exemple de méthode de quantification relative du signal sur western-blot :

https://www.youtube.com/watch?v=Bs_Yd9XH8dg

Immunoprécipitation
Cette technique permet d'isoler d'un extrait cellulaire une protéine et tous les interactants directs
ou indirects avec cette protéine grâce à l'interaction très spécifique anticorps-antigène. Les anticorps
peuvent être fixés sur des billes et on peut récupérer les complexes formés grâce à une centrifugation.
Alternativement, on peut utiliser des billes qui sont ensuite attirées par un aimant. L'enrichissement de la
fraction immunoprécipitée par rapport à la fraction initiale (souvent appelée input) peut être appréciée par
western-blot.

Voir la vidéo suivante : https://www.youtube.com/watch?v=It9UH573z_w

Cette technique permet de savoir si deux protéines A et B appartiennent à un même complexe à un moment
donné et dans des conditions données. On fait une immunoprécipitation avec un anticorps contre A et on
analyse la présence par western-blot de la protéine B reconnue par un autre anticorps. Pour valider
complètement l'interaction, il est préférable aussi de montrer l'inverse (immunoprécipitation de B et
révélation de A).

Voir un exemple sur le Figure 8-17.

Les protéines récupérées lors d'une immunoprécipitation peuvent aussi être analysées de manière non
biaisée par spectrométrie de masse.

Si de bons anticorps ne sont pas disponibles contre une protéine donnée on peut faire exprimer via des
vecteurs d'expression dans les cellules ou par transgénèse dans l'embryon des protéines dites taguées avec
quelques acides aminés supplémentaires qui sont reconnus par un anticorps spécifique (tag HA ou tag FLAG
par exemple).
**Figure CT-34. Séquence de quelques tags
communément utilisés. Source :
https://www.addgene.org/55182/

727
 **Figure CT-35. Interaction entre Myc-MT1X et HA-FHL3
démontrée par immunoprécipitation. On ne dispose pas
de bons anticorps reconnaissant spécifiquement la
protéine MT1X et FHL3. Des cellules 293T ont été
transfectées avec des plasmides permettant d'exprimer
des protéines MT1X couplées au tag Myc et FHL3
couplées au tag HA. Des extraits protéiques sont réalisés
à partir de ces cellules et traitées en western-blot avec
des anticorps anti-HA et anti-Myc (input). On réalise
ensuite une immunoprécipitation avec un anticorps IgG
(témoin négatif) et un anticorps anti-HA (ce qui revient
à immunoprécipiter HA-FHL3) et on réalise ensuite une
analyse par western-blot du culot obtenu avec un
anticorps anti-HA (on vérifie que l'immunoprécipitation
a bien fonctionné) et avec un anticorps anti-Myc (on
cherche à savoir si Myc-MT1X se trouve dans le culot
avec HA-FHL3). Source :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0093723

Le double hybride
Le système du double hybride effectué chez la levure ou dans des cellules de mammifères est basé sur le
nature modulaire des facteurs de transcription qui sont généralement composés de deux domaines : un
domaine de liaison à l'ADN et un domaine d'activation de la transcription. Chez la levure, on utilise le facteur
de transcription Gal4. Si on veut savoir si la protéine A interagit avec la protéine B, on fait synthétiser aux
cellules deux protéines de fusion : une avec le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 fusionné avec la protéine
A et une autre avec le domaine d'activation de Gal4 fusionné avec la protéine B. Ce n'est seulement dans le
cas où A interagit avec B que le domaine d'activation de la transcription se trouvera à proximité du bon
domaine de liaison à l'ADN et alors la transcription d'un gène rapporteur (codant la luciférase, la GFP ou
une protéine indispensable à la croissance des colonies de levure) sera activée.

*Figure CT-36. Principe du double hybride. Les protéines fusion A-Gal4DBD (DBD = domaine de fixation à l'ADN) et
B-Gal4AD (AD = domaine d'activation) doivent interagir pour que la transcription du gène rapporteur (en orange)
puisse être activée. Source : https://www.creative-biolabs.com/Mammalian-Two-hybrid-Service.html

Immunohistochimie/Immunocytochimie/Immunofluorescence
Un exemple d'étude immunocytochimique :

https://www.youtube.com/watch?v=WnBRR9LSB7k

728
 *Figure CT-37. Un exemple d'immunohistochimie sur un embryon de poulet pour reconnaître les cellules de crêtes
neurales (anticorps primaire HNK-1 (en vert) qui reconnaît un antigène à la surface de ces cellules). La fixation est
réalisée avec du paraformaldéhyde (PFA) 4% qui en solution aqueuse donne du formaldéhyde. Il permet de
préserver les structures cellulaires en pontant les protéines entre elles. La perméabilisation nécessaire à la bonne
pénétration des anticorps fait appel à des détergents non ioniques comme le Tween 20 ou le Triton X-100.
L'anticorps primaire (vert) reconnait spécifiquement l'antigène (triangle vert). L'anticorps secondaire (rouge)
reconnaît le premier anticorps (il doit être choisi pour reconnaître les anticorps de l'espèce où a été produit
l'anticorps primaire) et il est couplé à la péroxidase qui en présence de DAB (3,3'-diaminobenzidine) et d'H202 donne
un produit coloré brun. Au final, les cellules de crêtes neurales se reconnaitront à leur coloration brune alors que les
autres cellules seront non colorées.

L'immunochimie est basée sur la révélation d'une activité enzymatique apportée par l'anticorps secondaire
alors que l'immunofluorescence est basée sur l'émission de photons à une longueur d'onde donnée d'un
fluorophore couplé à l'anticorps secondaire. On peut faire plusieurs détections d'immunofluorescence sur
un même échantillon à condition de bien choisir l'origine des anticorps (pas d'espèces communes pour la
production des différents anticorps primaires) et les longueurs d'onde des fluorophores des anticorps
secondaires.

Les progrès de la microscopie photonique et de l'analyse des images

Les progrès scientifiques sont indissociables des progrès techniques et cela est particulièrement
visible en ce qui concerne la microscopie. L'observation des cellules a bénéficié des progrès de
l'optique, puis des progrès chimiques (pour les colorants), des progrès de la génétique (pour créer
et introduire dans les cellules des protéines-fusion avec des protéines fluorescentes telles que la
GFP), et des progrès de l'informatique (pour traiter les images).

*Figure CT-38. Fonctionnement d'un microscope droit. On peut éclairer l'échantillon par dessous (Diascope) ou par-
dessus (Episcope) dans le modèle présenté. La lumière envoyée peut être une lumière blanche ou une lumière avec
une longueur d'onde donnée (obtenue avec un filtre ou générée par un laser). Le condenseur est une lentille qui
concentre la lumière sur l'échantillon qui est porté par la platine porte-objet. L'objet observé doit être suffisamment
fin pour que de la lumière passe au travers. Cette image est agrandie grâce à la lentille de l'objectif. Certains objectifs
sont dits à immersion car leur puissance ne peut être atteinte qu'en éliminant la couche d'air entre l'échantillon
(couvert par une lamelle) et l'objectif. On utilise pour cela une huile dont l'indice de réfraction est proche de celui du
verre. La mise au point se fait avec une vis micrométrique qui permet à l'objet d'être dans le plan focal de l'objectif.

729
 L'oculaire est une source de confort visuel car ses lentilles permettent de faire en sorte que l'image parait "au loin"
donc pas de nécessité d'accommodation. Source : https://www.naturoptic.com/comment-choisir/microscopes/microscope.php

*Figure CT-39. Trajet optique d'un microscope inversé. On appelle ce type de microscope inversé car les objectifs se
trouvent sous l'échantillon et non pas au-dessus. Cela permet notamment d'observer les cellules dans des boites de
culture cellulaire où les cellules sont recouvertes de milieu. Source : https://www.naturoptic.com/comment-
choisir/microscopes/microscope.php

La résolution d'un microscope photonique peut descendre jusqu'à 0,2 µm. Des objets plus petits et
brillants peuvent être aperçus mais à cause d'effets de diffraction, ils apparaissent flous (selon la fonction
d'étalement du point). Lorsque la lumière traverse un objet complexe les phases de ses ondes peuvent se
décaler en fonction de l'indice de réfraction du milieu qu'elles traversent. C'est cette propriété qui est
exploitée par le microscope à contraste de phase. Cet effet est amplifié par le microscope à contraste
interférentiel. Le faisceau lumineux est dédoublé en 2 faisceaux proches l'un de l'autre par divers systèmes
optiques avant la traversée de l'objet. Un second système optique recompose les 2 faisceaux qui produisent
des interférences qui dépendent de l'épaisseur et de la biréfringence des objets observés. Ce type de
microscopie accentue les contrastes au bord des structures.

**Figure CT-40. Trajet des rayons lumineux dans un microscope à contraste interférentiel différentiel. Source :
DIC_Light_Path.png: Richard Wheeler (Zephyris)

En microscopie "classique" l'image nette de l'échantillon qui se trouve dans le plan focal peut être
noyée dans les images floues qui proviennent de l'échantillon au-dessus ou en dessous de ce plan.
Le microscope confocal permet d'éviter cet inconvénient et permet de réaliser des images nettes de
très faible profondeur de champ (environ 400 nm). On peut parler de section optique. C'est possible
grâce à la présence d'un petit orifice (ou sténopé) devant le détecteur dans un plan focal conjugué au plan
focal de l'objectif. Il fera office de "filtre optique" ne laissant passer vers le détecteur que les photons
provenant du plan de l'échantillon où l'image sera nette.

La manière dont on illumine les échantillons a aussi fait des progrès. Pour les études en fluorescence on
utilise des lasers argon-ion (pour 457 nm, 488 nm, 514 nm) et hélium-néon (pour 543 nm, 633 nm).

730
L'angle avec lequel on illumine l'échantillon a aussi son importance comme dans la microscopie TIRF (pour
Total Internal ReFlection microscopy) qui permet de ne juste voir que les molécules fluorescentes à la
membrane plasmique ou juste en dessous.

***Figure CT-41. Microscopie à réflexion interne totale (TIRF). (A) Schéma du trajet lumineux pendant la microscopie
TIRF. Le laser d'excitation sort de l'objectif à un angle tel qu'il est complètement réfléchi à l'interface verre-liquide
formée par la lamelle de verre et l'environnement aqueux des cellules dans le milieu. La réflexion de la lumière laser
produit un champ électromagnétique connu sous le nom d'onde évanescente, qui diminue de façon exponentielle. Il
est seulement assez puissant pour exciter les fluorophores (cercles verts) dans une couche mince d'environ 100-200
nm au-dessus de la lamelle, laissant
les fluorophores à d'autres emplacements cellulaires non excités (cercles gris). (B) Le même champ de vision, imagé
en microscopie "normale" ou en
microscopie TIRF, d'une cellule d'ostéosarcome exprimant paxilline-GFP. Barre d'échelle = 2 µm. Source :
https://www.mdpi.com/2079-7737/10/11/1189

> Le FRAP (Redistribution de fluorescence après photoblanchiment) et le FLIP

Le photoblanchiment de la fluorescence est habituellement un problème lors de l'observation d'échantillons

contenant des fluorophores. Néanmoins, on peut en tirer avantage en épuisant la fluorescence sur une
région bien précise de la cellule et en observant la cinétique avec laquelle la fluorescence est restaurée dans
celle-ci. La restauration proviendra forcément de l'arrivée de nouvelles molécules fluorescentes et ainsi la
dynamique de diffusion ou de transports de molécules marquées avec un fluorophore peut être étudiée.

Le FLIP (ou perte de fluorescence induite par photoblanchiment) suit le principe inverse : on photoblanchie
de multiples fois une zone où des protéines marquées avec un fluorochrome sont présentes et on étudie la
diminution de la fluorescence ailleurs dans la cellule.

**Figure CT-42. Principe du FLIP.

D'après https://fr.wikipedia.org/wiki/Perte_de_fluorescence_induite_par_photoblanchiment#/media/Fichier:Fluorescence_Loss_in_Photobleaching_Schematic.jpg

731
 ***Figure CT-43. Analyse FLIP de la mobilité de la GFP:MEX-5 dans un zygote de C. elegans. Expériences FLIP sur des
zygotes de C. elegans au stade de la réunion des pronucléi. (A) Les embryons exprimant la GFP, la protéine de fusion
NMY-2:GFP ou la protéine de fusion GFP:MEX-5 (avec MEX5 sauvage ou avec diverses mutations (S458A ou
DZF1+ZF2) ont été photo-blanchis près du pôle postérieur (astérisque) pendant le nombre de cycles indiqué. (B)
Fluorescence mesurée au pôle antérieur (ligne pleine) et au pôle postérieur (ligne pointillée) pour des embryons
uniques après chaque cycle de photoblanchiment pour la GFP ou les protéines de fusion GFP:MEX-5 indiquées. La
perte de fluorescence postérieure est moindre pour la GFP et la GFP:MEX-5 mutée que pour les autres protéines,
probablement parce qu'une plus grande fraction de la protéine antérieure non blanchie se déplace vers l'arrière.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/135/22/3665/76427/MEX-5-asymmetry-in-one-cell-C-
elegans-embryos

> Le FRET (Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes)

Cette technique permet de voir en microscopie si deux fluorophores se trouvent à moins de 10 nm l'un de
l'autre. Pour ce faire, la longueur d'émission d'un fluorophore A doit pouvoir exciter un fluorophore B dont
on pourra enregistrer l'émission de photons. Comme couple de fluorophore utilisé, on peut citer le CFP
comme transmetteur d'excitation au YFP. Si ces fluorophores sont accrochés sur des protéines, on en
déduira que ces protéines sont sans doute dans un même complexe et on pourra savoir dans quel
compartiment de la cellule cette interaction a lieu. On peut aussi construire des biosenseurs basés sur le
FRET comme dans l'exemple qui suit :

*Figure CT-44. Un biosenseur de l'activité Cdc42 basé sur le FRET. (A) Une protéine chimérique rassemblant Cdc42
et PAK ainsi que CFP à une extrémité et YFP à une autre extrémité est construite. Lorsque Cdc42 n'est pas active
(attaché à un GDP) la protéine a une conformation où le FRET ne peut pas fonctionner. Lorsque Cdc42 est activée
(liée au GTP), elle interagit avec PAK provoquant un changement de conformation qui amène CFP à proximité de YFP
et un FRET se réalise. L'émission à 530 nm de YFP sera donc une indication de l'activation de Cdc42. (B) Quelques
exemples de mesure avec un jeune neurone en présence ou non de nétrine et agrandissement de son cône de
croissance. Source : https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0159405

732
 *Figure CT-45. Biosenseur de l'activité ERK basé sur le FRET. La phosphorylation de la thréonine 48 de Cdc25c par
ERK provoque une liaison avec le domaine WW et la nouvelle conformation de la protéine chimérique permet le
FRET entre les deux fluorophores. Source : https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.0804598105

Approches optogénétiques pour perturber la signalisation cellulaire

L'optogénétique est un domaine en plein essor où la lumière à une longueur d'onde précise agit sur des
protéines et change leur conformation, ce qui provoque des modifications dans la physiologie cellulaire. En
neurosciences, l'ouverture ou la fermeture par la lumière de canaux ioniques permet de manipuler les
dépolarisations des cellules nerveuses. Pour l'étude de la signalisation cellulaire, CRY2 (le cryptochrome 2
de la plante Arabidopsis) s'avère un outil de choix par sa capacité à s'homo-oligomériser lorsqu'il est
stimulé par la lumière bleu ou à s'hétéro-dimériser avec la protéine CIB1 (Duan et al., 2017). Ainsi, à l'aide
de protéines-fusion contenant CRY2 ou CIB1, on peut activer par la lumière une interaction.

**Figure CT-46. Utilisation de l'optogénétique pour perturber la signalisation cellulaire et indirectement le

cytosquelette. Des embryons de drosophile transgéniques sont produits où la protéine fusion CIBN::pmGFP se
localise sur la membrane plasmique et CRY2 est fusionné à Cherry et à la 5-ptase = Phosphoinositide 5 phosphatase
(mCh::Cry2::5-ptaseOCRL). En l'absence de lumière bleue (488 nm), CRY2 et CIB1 n'interagissent pas, donc la 5-ptase
reste localisée dans le cytosol. Lors d'une illumination avec un laser à 488 nm, CRY2 et CIB1 interagissent, la 5-ptase
se relocalise à la membrane plasmique et fait diminuer la quantité de PI(4,5)P2 en le déphosphorylant en PI(4)P.
Cela entraîne une déplétion d'actine, blocage de la contractilité cellulaire et inhibition des mouvements
morphogénétiques lors de la gastrulation des embryons de drosophile. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580715006851

De nombreuses possibilités et combinaisons peuvent être offertes pour contrôler l'activité d'une protéine
et donc étudier le mécanisme de nombreux processus cellulaires du développement.

733
 **Figure CT-47. Le contrôle de la localisation et de l'activité des protéines à l'aide de l'optogénétique. Dans tous les
cas, les photorécepteurs sont représentés en bleu, leurs partenaires de liaison en vert et les protéines d'intérêt en
gris. (A) La dimérisation des protéines induite par la lumière peut être utilisée pour recruter une protéine d'intérêt
à un emplacement intracellulaire spécifique, où elle peut poursuivre sa fonction. (B) L'oligomérisation dépendante
de la lumière (clustering) peut induire des hubs de signalisation fonctionnels actifs ou inhiber la fonction des
protéines. (C) La dimérisation induite par la lumière peut également être adoptée pour séquestrer une protéine
d'intérêt loin de son site d'action. (D) Le photo-uncaging basée sur les propriétés des domaines LOV peut être utilisée
pour contrôler directement l'activité des protéines avec la lumière.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/20/dev175067/224396/Principles-and-applications-of-
optogenetics-in

Les rapporteurs fluorescents pour la concentration calcique

Les concentrations cytoplasmiques de Ca2+ sont habituellement basses et l'augmentation de cette
concentration par l'ouverture de canaux sur le réticulum endoplasmique ou sur la membrane
plasmique augmente l'activité de certaines protéines et déclenche des cascades de signalisation.

Des molécules à la fluorescence augmentée par les ions Ca2+ sont devenus des outils précieux pour
ce domaine de recherche. La première molécule a avoir été populaire dans les laboratoires est le Fura-2,
un acide aminopolycarboxylique, découvert en 1986. Il absorbe à 340-380 nm (UV) et son émission à 510
nm dépend de la concentration calcique.
*Figure CT-48. Intensité de la fluorescence du Fura-2 en
fonction des concentrations de Ca2+ et des longueurs
d'onde d'excitations (abscisses). Source :
https://www.scbt.com/fr/p/fura-2-am-108964-32-5

Plus récemment, une protéine fusion entre la GFP, la calmoduline (une molécule de signalisation
sensible à la concentration en Ca2+) et M13 (une courte séquence de la kinase de la chaine légère de la
734
myosine) a été mise au point, GCamp. Comme c'est une protéine, on peut la faire exprimer sous le contrôle
de l'ADN (et via un promoteur spécifique par exemple) dans les cellules ou les embryons.
**Figure CT-49. Structure de la protéine-chimère GCamp
en présence de Ca2+. CaM = calmoduline, cpEGFP = une
forme optimisée de la GFP et M13 = courte séquence de
la kinase de la chaine légère de la myosine pour faire la
liaison. En absence de Ca2+, la conformation est un peu
différente, empêchant cpEGFP d'avoir une fluorescence
significative. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)32673-
9/fulltext

La cytométrie du flux
Il s'agit de marquer un ou plusieurs élément.s cellulaire.s d'intérêt avec un fluorochrome (anticorps
ou molécule rendue fluorescente quand elle se lie à l'ADN par exemple) puis de séparer les cellules
pour les faire passer une à une sous un laser à la longueur d'onde d'excitation de la fluorescence à
observer. Il y a un comptage du nombre de cellules avec telle ou telle intensité de fluorescence. Il peut y
avoir un tri des cellules selon leur niveau de fluorescence, le flux pouvant être automatiquement dévié vers
différents tubes en fonction des résultats obtenus. Dans ce cas-là, on parle de FACS (Fluorescent Activated
Cell Sorting), même si le terme de FACS s’est étendu à la méthode où on ne fait que compter les cellules.

*Figure CT-50. Principe du tri cellulaire guidé par fluorescence (FACS). Source :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Cytom%C3%A9trie_en_flux#/media/Fichier:Fluorescence_Activated_Cell_Sorting_(F
ACS)_principle.tif

La microscopie électronique
L'illumination de l'échantillon se fait avec un faisceau d'électrons et non pas un faisceau de photons. Les
microscopes électroniques ont un pouvoir de résolution près de 1000 fois supérieur à celui des microscopes
photoniques (0,2 nm contre 0,2 µm) car la longueur d'onde de De Broglie d'un électron est bien plus petite
735
que la longueur d'onde d'un photon, même dans les UV. La fixation de l'échantillon est le plus souvent
réalisée par du glutaraldéhyde (pontage des protéines) puis du tétroxyde d'osmium (réagit avec les lipides
et notamment les phospholipides des membranes biologiques, ce qui les rend plus visibles). Dans le cas
particulier du microscope électronique à balayage, le faisceau d'électron très fin balaie la surface d'un
échantillon qui réémet en réponse des électrons qui sont analysées et une image en 3D de l'objet observé
peut être réalisée.

Voir la vidéo de présentation : https://youtu.be/2w4q4-ltW7E

Les tests de migration cellulaire

> Test de cicatrisation

Le test de cicatrisation liée à la blessure de tapis cellulaire consiste à arracher les cellules de manière
contrôlée sur une trajectoire précise dans une boîte de Pétri et d'observer à intervalles réguliers/filmer la
manière dont les cellules avoisinantes de la "blessure" vont coloniser l'espace vide. La principale
composante de la cicatrisation de la blessure sera la migration cellulaire mais il peut y avoir aussi une
composante liée à la prolifération. Également, la matrice extracellulaire peut être abimée lors de la
réalisation de la blessure.

*Figure CT-51. Analyse de la migration des cellules de mélanome M3 par essai de cicatrisation in vitro. (A) Images
de microscopie de la fermeture de la blessure d'un tapis de cellules de mélanome non traitées (images de gauche) et
traitées avec de la chloroquine (CQ, 25 microM, images de droite) à 0, 10 et 20 h après la réalisation de la blessure.
Les lignes pointillées définissent la zone dépourvue de cellules. Barres d'échelle, 100 µm. (B) Quantification de la
zone blessée envahie pendant 20 h par des cellules de mélanome non traitées (vert) et par des cellules de mélanome
traitées CQ (rouge) présentées en unités relatives (r.u.). Les résultats représentent la moyenne de quatre mesures
de chaque zone blessée, obtenues dans 3 expériences indépendantes (n = 12). Les valeurs moyennes de la fermeture
relative de la plaie et les limites de confiance correspondantes (α = 0,05, lignes ombrées) sont tracées. La ligne
pointillée marque le moment où commencent les différences significatives. (C) Analyse de la vitesse du front
cellulaire dans les cellules de mélanome non traitées et traitée par CQ. Moyenne ± SD de 3 expériences indépendantes
(n = 12). (D) Quantification de la zone de vitesse de guérison (μm2/h) pendant 20 h dans des cellules non traitées et
traitées (n = 12). Les lignes pointillées marquent la moyenne de la zone de vitesse de guérison dans chaque
traitement. (E) Graphique montrant l'analyse quantitative de la zone de vitesse de guérison moyenne (μm2/h) des
cellules de mélanome non traitées et traitées (CQ); moyenne ± SD, (n = 12), à partir de 3 expériences indépendantes.
Les valeurs p obtenues par le test t de Student bilatéral non apparié sont indiquées dans les graphiques (C, E). Source
: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2019.00107/full

736
 > Test de migration en chambre de Boyden

Il s'agit de la création de deux compartiments avec des milieux de composition différente séparés par une
membrane poreuse (en général avec des pores d'un diamètre entre 3 et 12 micromètres (à adapter selon
les cellules étudiées)). Les cellules sont déposées sur cette membrane et on les incube durant une durée
permettant à certaines d'entre elles de traverser la membrane et de se retrouver à sa face inférieure dans
le second compartiment. Celui-ci peut par exemple contenir un milieu avec un chémoattractant.

**Figure CT-52. Protocole de la chambre de Boyden proposé par un fabricant. Source : https://www.merckmillipore.com/FR/fr/life-science-
research/antibodies-assays/assays-overview/cell-invasion-migration-assays/boyden-chamber-technique/I0qb.qB.KSMAAAFANtY.1ZcQ,nav

Les marqueurs de prolifération

> BrdU

*Figure CT-53.
BrdU ou bromodésoxyuridine

Il s'agit d'un analogue de nucléoside qui a une structure similaire à la thymine (où il y a un -CH3 à la
place du brome). Lorsqu'on met des cellules dans un milieu avec du BrdU ou qu'on l'injecte dans la
circulation sanguine d'un embryon, il rentre dans les cellules et s'incorpore dans l'ADN uniquement
s'il y a réplication. On replace ensuite les cellules dans un milieu sans BrdU (et il est dégradé
rapidement dans un organisme). La population de cellules qui a répliqué son ADN lors de sa
présence reste marquée et même si elle prolifère encore par la suite ou migre ou se différencie, on
pourra toujours détecter la présence de BrdU. Cela se fait avec un anticorps spécifique et les
techniques habituelles d'immunomarquage.

737
 > Ki-67 et PCNA

Pour suivre la prolifération dans un tissu, on peut également faire des immunomarquages contre des
protéines qui ne sont présentes que lors des phases G1 à M mais pas en phase G0.

Ki-67 est une protéine nucléaire impliquée dans la transcription des ARN ribosomaux. Elle est exprimée
tout au long du cycle de G1 à M mais est absente des cellules en G0. Durant la mitose où il n'y a plus de
noyaux, elle est localisée sur les chromosomes. La protéine est nommée d'après l'anticorps dont elle s'est
avérée l'antigène par la suite. L'anticorps a été produit dans la ville allemande de Kiel et était en position 67
dans une plaque de 96 puits avec divers anticorps produits contre des noyaux de lymphomes de Hodgkin.
*Figure CT-54. Immunofluorescence avec un
anticorps anti-Ki67 sur des coupes de glandes
mammaires de souris sauvages (+/+) ou
homozygotes (m/m) pour une mutation perte-de-
fonction du gène CHEK2, qui code la protéine CHK2
impliquée dans la réparation de l'ADN. Une
coloration de l'ADN au DAPI permet de repérer les
noyaux des cellules. On observe que chez le mutant
m/m, le tissu est désorganisé et constitué de
nombreuses cellules hors de la phase G0, sans doute
en prolifération, ce qui n'est pas le cas chez les
souris sauvages. On en déduit que CHEK2 est un
gène suppresseur de tumeur. Source :
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adf2860

PCNA est un facteur de processivité pour l'ADN polymérase lors de la réplication et est aussi impliqué dans
la réparation de l'ADN. Son expression est très faible dans des cellules quiescentes et est fortement activée
lors du passage G1/S.

> Utilisation du FACS

Voir la Figure 5-150.

> Le système FUCCI

FUCCI (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator) est un ensemble de sondes fluorescentes qui
permet de visualiser la progression du cycle cellulaire en temps réel dans des cellules vivantes. FUCCI utilise
l'expression qui dépend de la phase du cycle cellulaire des protéines Cdt1 et Geminin. Une protéine de fusion
d'un fragment de Cdt1 (acides aminés 30-120) avec la protéine fluorescente monomérique Kusabira-
Orange 2 (mKO2) sert d'indicateur de la phase G1. Une protéine de fusion d'un fragment de Geminin (acides
aminés 1-110 ou 1-60) avec la protéine fluorescente monomérique Azami-Green 1 (mAG1) visualise les
phases S, G2 et M.

*Figure CT-44. Coloration des phases du cycle cellulaire

dans le système FUCCI. Source :
https://www.mblintl.com/resources/learning-
center/technologies/drug-discovery/cell-cycle-
indicator/

DES OUTILS POUR ANALYSER/MONTER DES IMAGES EN BIOLOGIE CELLULAIRE

L'application libre Fiji (ou ImageJ) . Lien vers des tutoriels pour utiliser Fiji (en anglais).

L'application libre Cell Profiler

738
739
EXERCICES

Difficulté des questions : * = niveau embryon ; ** = niveau têtard; *** = niveau mature

Exercices sur le contrôle de l’expression des gènes

EXERCICE 1

(a) Embryons de souris Dnmt1-/- et Dnmt3a-/-; Dnmt3b-/- disséqués à E8.5 comparés aux témoins hétérozygotes de la
même portée (qui sont identiques à des embryons WT). Barres d'échelle: 300 μm. (b) Distribution moyenne de la
méthylation des CpG sur plusieurs centaines de gènes et les séquences flanquantes de 10 kb. TSS = Site de début de
transcription; TTS = site de terminaison de transcription. Ces profils de méthylation ont été obtenus après traitement
au bisulfite et séquençage. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-020-16919-w

**1.1 : D'après vos connaissances, quels sont les rôles respectifs de Dnmt1 et Dnmt3a/3b ?

*1.2 : Décrivez le phénotype des embryons en a). Trouvez des interprétations pour ces résultats.

**1.3 : Qu'est-ce que le bisulfite ? Expliquez le principe de la détection des séquences méthylées sur les cytosines.

*1.4 : Analysez et interprétez les profils de méthylation.

EXERCICE 2

740
a) Stades de développement du poisson-zèbre utilisés pour l'analyse de la chromatine. b) Images représentatives
montrant le marquage par immunofluorescence avec des anticorps reconnaissant H3K9me3 dans les cellules
d'embryons fixés à 2,7, 3,7, 4,5 et 6 h après la fécondation (hpf). Un marquage a été fait avec le DAPI (bleu). Toutes les
images ont été prises dans des conditions identiques, la barre d'échelle représente 1 µm. c) Analyse par western-blot
pour H3K9me3, histone H3 et alpha-tubuline. d) Enrichissement en H3K9me3 mesuré par immunoprécipitation de la
chromatine avec séquençage (ChIP-seq) à 2,5, 4,5 et 6 hpf. Ici, une région génomique représentative est présentée. Ne
pas tenir compte de la mention LTR et des bandes roses. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-019-
09582-3

*2.1 : Que veut dire précisément H3K9me3 ?

*2.2 : Analysez les immunofluorescences et interprétez.

*2.3 : Quelles informations supplémentaires nous apporte le western-blot ?

**2.4 : Expliquez le principe du ChIPseq. Analysez les résultats présentés en d.

EXERCICE 3

Séquences cibles de 3 facteurs de transcription : Sox3, Pitx1 et Sox10. Source :

https://www.nature.com/articles/s41467-021-26234-7

*3.1 : Expliquez comment analyser ces schémas.

*3.2 : Vous cherchez dans le génome des séquences de fixation pour Pitx1 et vous trouvez la séquence TAATCCTG. Qu'en
déduisez-vous sur la fixation de Pitx1 sur ce site ?

*3.3 : Que remarquez-vous en comparant les sites consensus de Sox3 et de Sox10 ? Interprétez.

741
EXERCICE 4

(A, en haut) Carte du gène FoxF (rouge) et de la région 5' en amont sur le bras chromosomique 3q de l'ascidie Ciona
intestinalis. (A, milieu) Diagramme construit avec VISTAplot montrant la conservation des séquences (50-100%) entre
deux espèces d'ascidies, Ciona intestinalis et Ciona savignyi (http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml). (A, en bas)
Diagramme récapitulatif de l'efficacité de différents fragments à faire exprimer un gène rapporteur LacZ dans la cellule
ventrale du tronc (TVC, la cellule précurseur du cœur) ou dans l'épiderme (B) Embryon exprimant LacZ sous le contrôle
de la séquence -3052 à +1 du promoteur de FoxF. La flèche indique TVC. (C) Les séquences régulatrices -1135 à -840 de
C. intestinalis et de C. savignyi de FoxF sont comparées. Les cases indiquent la boîte E (rouge) et les trois sites de liaison
Ets1/2 (vert). (D) L'expression de LacZ est mise sous le contrôle du fragment d'ADN génomique -1135 à -840 pb. (E)
On réalise diverses délétions dans l'ADN génomique -1135/-840. Les carrés colorés correspondent aux éléments de
régulation trouvés en C. L'histogramme affiche les proportions d'embryons présentant une coloration bleue dans les
TVC (n = embryons totaux). (F, G) La région de régulation -3052 à +1 avec le motif E-box délété (ΔE-box) de même que
le fragment -1135 à -840 (ΔE-box) contrôle l'expression de LacZ. (H, I) On fait exprimer dans les embryons Ets:VP16
qui est formé par le domaine de fixation à l'ADN de Ets avec le domaine fortement activateur de la transcription de
742
VP16. Il n'y a pas d'expression dans TVC mais dans des cellules appelées B7.5. Un témoin avec le vecteur pCESA est
réalisé (LacZ est juste sous le contrôle d'un promoteur minimal). Ne pas tenir compte des figures I et H. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/134/18/3297/64471/FoxF-is-essential-for-FGF-induced-migration-of

*4.1 Quel est l'intérêt de comparer les séquences des deux ascidies ?

*4.2 Que remarquez-vous sur la position des séquences les plus conservées chez les deux ascidies ? Interprétez.

*4.3 Comment révèle-t-on la localisation de l'expression du gène LacZ pour obtenir une image comme en B ?

*4.4 Quel est l'intérêt d'avoir trouvé et indiqué des sites de fixation de facteurs de transcription sur la comparaison de
séquence en C ?

*4.5 Que nous révèle la figure D en comparaison avec la figure B ?

*4.6 Analysez et interprétez les résultats en E.

**4.7 Quel est l'intérêt d'étudier la construction -3052/+1 avec la boîte E délétée (F) ?

EXERCICE 5

On traite des embryons de poule en gastrulation avec SU5402 (ou son solvant = contrôle). SU5402 est un inhibiteur des
récepteurs aux FGF. On extrait ensuite les ARN et on réalise des RT-qPCR avec des amorces permettant de distinguer
pour chaque miARN cité en bas du graphique son transcrit primaire (pri-miARN, barre noire), sa forme intermédiaire
(pré-miARN, barre grise) et sa forme mature (miARN, barre blanche). Le graphique présente le rapport entre les
quantités d'ARN étudiés avec le traitement SU5402 sur ceux avec le traitement contrôle. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)62316-X/fulltext

*5.1 Quel est l'ARN polymérase qui synthétise les pri-miARN ?

**5.2 Quels sont les complexes qui permettent de produire les pré-miARN et les ARN matures ? Où ces maturations ont-
elles lieu dans la cellule ?

**5.3 Comment faire pour distinguer lors de la PCR suivant la RT les pri-, pré-miARN et les miARN matures ?

*5.4 Analysez et interprétez les résultats de l'expérience.

743
EXERCICE 6

Embryons de souris de E10,5 en vue

latérale (B-G) ou en coupe transversale (H-M). C, I : Embryon hétérozygote où un des allèles de Patched1 (Ptch) a une
insertion de la séquence LacZ. D, J : Embryon transgénique exprimant LacZ sous le contrôle d'une séquence régulatrice
putative (Peak2) trouvée par ChIPseq avec un anticorps anti-Gli1. E, K : hybridation in situ avec une sonde reconnaissant
l'ARNm de Nkx2-2. F, L : Embryon transgénique exprimant LacZ sous le contrôle d'une séquence régulatrice putative de
Nkx2-2. G, M : on refait une souris transgénique mais cette fois-ci avec la séquence régulatrice mutée sur un site de
fixation de Gli1. Barres d'échelle : 1 mm en A-G, 200 µm en H-M. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/134/10/1977/52766/Genomic-characterization-of-Gli-activator-targets

*6.1 Quel est l'intérêt d'étudier un embryon tel que PtchLacZ/+ ?

*6.2 Analysez le résultat de la coloration Xgal en C et I. Quelle est la signification de ce qui est observé par rapport à la
fonction de Patched ?

**6.3 Des expériences de ChiPseq ont mis en évidence une séquence Peak2 dans le promoteur de Ptch. Rappelez quel
est le principe de cette technique.

*6.4 Analysez et interprétez les résultats obtenus en D, J.

*6.5 Analysez et interprétez les résultats obtenus en F, L.

*6.6 Quelles informations supplémentaires nous apportent les résultats en G, M ?

EXERCICE 7

744
Le gène Tmen146 codant une sous-unité delta de CatSper exprimé à la membrane plasmique des spermatozoïdes code
deux formes de cette sous-unité, une forme courte (Tmen146-s) et une forme longue (Tmen146-l). (d) Structure des
transcrits avec les exons (partie épaisse) et les introns (ligne) qui sont épissés. La flèche représente le site de démarrage
de la traduction (AUG). (e) On fait exprimer dans des cellules en culture l'un ou l'autre des deux ADNc issus des 2 ARNm
obtenus à partir du gène Tmen146. On purifie ensuite les protéines et on les analyse en western-blot avec un anticorps
qui reconnait la partie C-terminale de la sous unité delta de CatSper. (f) On réalise une hybridation in situ sur des coupes
de testicules de souris avec deux sondes : l'une qui reconnait les ARNm des 2 formes (antisense 1) et l'une qui reconnait
uniquement l'ARNm de la forme longue (antisense 2). (g) Au cours du développement post-natal de la souris, on suit
par RT-qPCR l'expression de l'un ou l'autre des ARNm.

Source : https://www.nature.com/articles/ncomms1153

*7.1 Quel est le processus mis en évidence ici ? Justifiez.

*7.2 Pourquoi l'une des formes de la sous-unité du canal est plus courte ?

*7.3 Sur le western-blot en e, pourquoi choisit-on un anticorps qui reconnait la partie C-terminale de la protéine ?

**7.4 Comment choisir les sondes en hybridation in situ pour ne localiser que les ARNm de la forme longue ?

*7.5 A quoi servent les témoins avec les sondes sens ?

*7.6 Que déduisez-vous de l'analyse de la figure f ?

**7.7 Comment a été choisi la région à amplifier par qPCR (regardez et commentez les diagrammes au-dessus des
courbes en g) ?

*7.8 Commentez les résultats de la RT-qPCR en g.

EXERCICE 8

On différencie des cellules ES de souris en présence d'acide rétinoïque. Les cellules ES proviennent de souris sauvages
ou de souris CBE+47-KO où on a délété par CRISPR/Cas9 une séquence où se fixe habituellement CTCF pour délimiter un
TAD (domaine topologique d'association) de la chromatine. Ce site est en 3' du complexe HoxA (attention, le côté 3' est
à gauche sur le schéma). On fait une analyse en RNAseq et on présente les résultats pour le complexe HoxA : le nombre
de séquences obtenu pour les différents fragments est cartographié sur la séquence génomique. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(21)00185-X/fulltext

**8.1 Qu'est-ce qu'un TAD ?

**8.2 Analysez les résultats et essayez de trouver une hypothèse pour les expliquer.

745
EXERCICE 9

Le gène ZNF507 code une protéine à doigts de zinc qui a des fonctions différentes dans les cellules souches et dans les
cellules différenciées. (c) On cartographie les exons présents (les exons sont les boîtes grises, le trait fin correspond aux
introns) dans les différentes isoformes de ZNF507 sur la séquence génomique. (d) On différencie des cellules ES en
neurones durant un protocole qui prend 50 jours. Par RT-qPCR, on mesure l'expression relative des différentes
isoformes. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-018-06908-5

*9.1 Quel phénomène est ici mis en évidence pour expliquer la production des trois isoformes de ZNF507 ?

**9.2 Par RT-qPCR, on souhaite distinguer l'expression des isoformes A et C de l'expression de l'isoforme B. Comment
réaliser cet objectif ?

*9.3 Que constate-t-on sur l'expression des isoformes au cours de la différenciation ?

EXERCICE 10

L'ARNm de nanos1 est produit au cours de l'ovogenèse du xénope mais non traduit, à cause de la présence d'une
séquence TCE qui crée une structure secondaire particulière de l'ARNm juste en 3' de l'AUG d'initiation de la traduction.
On injecte des ARNm de nanos1 ou de nanos1ΔTCE (avec une délétion de la séquence TCE). Certaines de ces injections
sont accompagnées d'une co-injection avec les ARNm de dnd1, vasa, deadSouth, centroid ou dazl qui codent des
protéines capables de se lier à des ARN. Au bout de 18 heures, on extrait les protéines et on réalise un western-blot avec
un anticorps anti-Nanos1. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/144/20/3755/48156/Maternal-Dead-
end-1-promotes-translation-of-nanos1

*10.1 : Proposez un mécanisme pour expliquer comment la séquence TCE bloque la traduction de l'ARNm de nanos1.
746
*10.2 : Analysez et interprétez ces résultats. Pourquoi la bande dans le puits nanos1ΔTCE est-elle plus basse que les
autres ?

On injecte dans des embryons de xénope des oligonucléotides anti-sens qui empêchent la traduction de Dnd1 (AS-oligo)
avec (ligne du bas) ou sans (ligne intermédiaire) une protéine Dnd1 synthétisée in vitro. On fixe ensuite les embryons
et on réalise une immunofluorescence reconnaissant Xiwi qui est présent dans le plasme germinal et Nanos1. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/144/20/3755/48156/Maternal-Dead-end-1-promotes-translation-of-
nanos1

**10.3 : Analysez et interprétez cette expérience.

EXERCICE 11

Des cellules iPS sont cultivées dans un milieu additionné ou non en Chiron (une molécule qui active la voie canonique
Wnt/ β-caténine) et en présence ou non de molécules inhibitrices de divers HDAC (histone désacétylases). Au 2ème
jour du protocole, on isole les cellules et on les traite en immunocytofluorescence avec un anticorps reconnaissant un
marqueur mésodermique (APLNR) et un anticorps reconnaissant un marqueur endodermique (CXCR4). La
fluorescence est ensuite analysée en cytométrie de flux. On donne la proportion des cellules exprimant tel ou tel

747
marqueur relativement au traitement avec Chiron seul (ligne rouge pointillée dans les graphes à 1). Les HDAC de classe
I sont HDAC 1-3 et 8. Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)00589-7

*11.1 : Quel est l'effet du Chiron sur la détermination des cellules en mésoderme et en endoderme ? Interprétez.

*11.2 : Rappelez ce que sont les histones désacétylases.

**11.3 : Analysez l'effet des différents inhibiteurs de HDAC et concluez sur le rôle des HDAC dans la différenciation
endomésodermique des cellules iPS.

EXERCICE 12

Dans une population de cellules de médulloblastome cultivée in vitro, le gène codant la protéine METTL3 est rendu non
fonctionnel par le système CRISPR-Cas9 avec 2 cibles indépendantes dans le gène (KD-1 et KD-2). SC = contrôle où
aucun gène n'est ciblé par le système CRISPR-Cas9. On extrait quelques jours plus tard les protéines et on les analyse
par western-blot avec des anticorps reconnaissant les protéines indiquées à gauche. GAPDH est une protéine de
ménage. Le panel du haut correspond à la membrane où METTL3 et PTCH1 ont été révélés et le panel du bas à la
membrane où GLI2 a été révélé. Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)01386-9

**12.1 Pourquoi réalise-t-on deux invalidations indépendantes du gène codant METTL3

*12.2 Est-ce que l'invalidation du gène METTL3 a fonctionné ?

*12.3 Analysez et interprétez les résultats concernant l'expression de PTCH1 et de GLI2.

24h après l'action de CRISPR-Cas9, on fait agir l'actinomycine D qui inhibe la transcription dans les cellules. 3h, 6h et
9h après l'ajout de cet inhibiteur, on quantifie les ARNm de PTCH1 et de GLI2 relativement à leur quantité juste avant
l'ajout d'actinomycine D. Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)01386-9

*12.4 Analysez et interprétez ces résultats.

**12.5 Est-ce que ces résultats peuvent expliquer ce que vous avez observé à la question 12.3 ? Emettez des hypothèses.

748
EXERCICE 13

On cherche à connaitre la fonction de la protéine METTL16 sur le contrôle de la traduction. On dispose de cellules
A459 sauvages (WT) et où le gène codant M16 a été délété par CRISPR-Cas9 (sgM16). On réalise des extraits
protéiques (input) et on isole la fraction protéique qui s'accroche à du m7GTP (m7GTP pull-down) ou à du GTP (GTP
pull down). On réalise ensuite un western-blot avec des anticorps reconnaissant METTL16, eIF4E2, eIF4E et GAPDH.
Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)00161-4

*13.1 Quel est l'intérêt de faire un m7GTP pull-down ?

*13.2 Quel est l'intérêt de réaliser un western-blot de l'input (l'extrait protéique total) ?

*13.3 Analysez les résultats des pull-downs.

*13.4 Sachant que eIF4E2 inhibe l'initiation de la traduction et que eIF4E active l'initiation de la traduction, déduisez le
rôle de METTL16 sur la traduction.

EXERCICE 14

On souhaite étudier Bantam qui est un microARN. On produit des drosophiles transgéniques qui ont le gène GFP sous
le contrôle du promoteur de la tubuline avec (bantam sensor) ou sans (control) une séquence complémentaire au
microARN Bantam dans le 3'UTR de l'ARNm de la GFP. On observe la fluorescence de la GFP dans des disques
imaginaux d'aile.

*14.1 Pourquoi utilise-t-on le promoteur de la tubuline ?

*14.2 En analysant l'expression de la GFP dans le disque imaginal de l'aile dans les deux drosophiles transgéniques,
que peut-on déduire de l'expression et de l'activité de Bantam ?

REPONSES

1.1 : Dnmt1 catalyse la méthylation de maintien des cytosines (après la réplication, méthylation sur les brins
néosynthétisés) alors que Dnmt3a/3b est impliqué dans la méthylation des cytosines de novo. 1.2 : Les embryons
présentent des malformations sévères et un retard de croissance. Il est difficile de distinguer des structures et des axes
précis (surtout pour l'embryon Dnmt1-/-). Dnmt1 et Dnmt3a/3b méthylent les cytosines des séquences CpG et cela a
un effet répresseur localisé sur la transcription. Par conséquent, les embryons mutés doivent avoir de multiples gènes
transcrits de manière ectopique ou trop précocement ce qui cause une sévère désorganisation. 1.3 : L’ADN génomique
est coupé par une ou plusieurs enzymes de restriction. Les fragments sont ensuite traités avec le bisulfite. En présence

749
de ce composé chimique, les cytosines sont converties en uracile, alors que les cytosines méthylées ne sont pas affectées.
L’ensemble des fragments traités est ensuite amplifié par PCR puis séquencé. 1.4 : Les profils de méthylation des
hétérozygotes sont à peu près normaux et l'absence de Dmt3b peut être compensée par Dnmt3a et inversement. Notons
que la compensation de Dnmt3b par Dnmt3a n'est que partielle. L'absence des deux Dnmt3a/b provoque une baisse
drastique de la méthylation et également l'absence de Dnmt1.

2.1 : Cela désigne une triméthylation de la lysine en position 9 dans l'histone H3. 2.2 : On voit une fluorescence
apparaître progressivement au fil du développement. Cela veut dire qu'il y a de plus en plus de triméthylation de la
lysine 9 de l'histone H3. Cela peut vouloir dire qu'il y a de plus en plus d'histone H3 de manière générale ou cela peut
vouloir dire qu'il y a de plus en plus de lysines 9 dans la population des histones H3 qui sont triméthylés (et non plus
diméthylés ou simplement méthylés ou pas méthylés du tout). 2.3 : La quantité d'histone H3 ne varie pas (à part une
légère baisse à 2.7 hpf et 3.7 hpf) si on la compare au contrôle alpha-tubuline. Cela veut donc dire que la forte
augmentation de la présence de triméthylation de la lysine 9 observée à 4,5 hpf et 6 hpf est dûe à l'augmentation de la
méthylation de lysine et non à une augmentation générale de la quantité d'histone H3. 2.4 : De l'ADN génomique est
traité avec un agent fixateur pour que les protéines restent accrochées dessus. L'ADN est fragmenté par sonication puis
incubé avec un anticorps reconnaissant une protéine particulière sur l'ADN. Après précipitation, on purifie l'ADN
obtenu dans le culot et on le séquence à haut débit. Ici, sur ce fragment de chromatine, on observe au cours du temps
une augmentation générale de l'enrichissement qui signe la présence de la triméthylation de la lysine. Une séquence
centrale est particulièrement enrichie, signant une triméthylation particulièrement poussée dans cette région du
génome.

3.1 : Ces schémas représentent les séquences consensus de fixation de facteurs de transcription sur leurs séquences
cibles dans les promoteurs et les enhancers/silencers. Les séquences consensus d'un facteur de transcription donné ne
sont jamais à 100% conservés à travers tout le génome. Lorsqu'à une position donnée, il n'y a qu'une seule grande lettre
qui prend toute la hauteur (le T en 4ème position pour Sox3 par exemple) cela veut dire que le nucléotide est toujours
présent. Lorsqu'il y a plusieurs lettres l'une sur l'autre à une position, la taille relative des lettres indique la probabilité
de trouver cette lettre dans la séquence consensus à cette position. Par exemple, en 1ère position pour Sox3 on trouvera
très fréquemment un C, moins fréquemment un G ou un T et très rarement un A. 3.2 : C'est un site putatif ou potentiel
qui correspond bien à ce qui est attendu d'une séquence où se fixe Pitx1. Mais en aucun cas, cela prouve que Pitx1 se
fixe effectivement à cet endroit. Il faut faire des tests spécifiques de fixation de facteurs de transcription (EMSA,
ChIPseq...). 3.3 : On trouve une ressemblance, notamment dans la partie centrale. C'est normal puisque Sox3 et Sox10
font partie d'une même famille multigénique et par conséquent, malgré des divergences, les sites de fixation à l'ADN ont
conservé des ressemblances et donc aussi les séquences de l'ADN où ces facteurs de transcription s'accrochent.

4.1 : Si des séquences sont plus conservées que d'autres entre les 2 espèces c'est qu'il y a sans doute eu une sélection et
que les mutants dans ces séquences ont été éliminées. Par conséquent, ces séquences doivent avoir une importance
fonctionnelle. 4.2 : Les séquences les plus conservées se trouvent en premier lieu dans les exons, ce qui est logique
puisque la séquence codant les acides aminés de la protéine se trouve dans les exons (mais la séquence codante ne
recouvre pas tous les exons (il y a le 5'UTR et le 3'UTR qui sont dans les exons mais qui ne sont pas traduits)). Ensuite,
on trouve des séquences très conservées en amont du site de démarrage de la transcription et aussi dans une partie de
l'intron. Ces deux dernières séquences pourraient être des séquences régulatrices de la transcription. 4.3 : Les
embryons sont fixés (suffisamment pour éviter la dégradation des tissus, mais pas trop pour ne pas inactiver les
enzymes). LacZ code la beta-galactosidase qui est une enzyme. On lui présente ses substrats Xgal et le cyanide ferrique
(et pas le galactose qui serait son substrat habituel dans une bactérie !) et l'enzyme catalyse une réaction qui donne un
produit coloré en bleu. Une post-fixation est parfois nécessaire pour éviter la disparition de la coloration avec le temps.
4.4 : Les sites putatifs de fixation de facteurs de transcription peuvent donner une idée des facteurs qui pourraient être
impliqués dans le contrôle de l'expression de FoxF à partir de ces éléments. Trouver que ces séquences particulières
sont conservées entre deux espèces donne du poids au fait que ces séquences sont fonctionnelles et importantes. Mais
cela ne constitue pas une preuve de la fixation réelle de ces facteurs de transcription sur ces séquences. 4.5 : On voit que
ce fragment d'ADN restreint l'expression de LacZ aux cellules TVC alors que le grand fragment -3052 à +1 conduisait
aussi LacZ à être exprimé dans l'épiderme. Donc la séquence qui contrôle l'expression dans l'épiderme se trouve en
dehors du fragment -1135 à -840. Il reste possible que d'autres séquences contrôlent l'expression dans les TVC en
dehors de ce fragment, même s'il parait suffisant, le niveau d'expression n'est peut-être pas optimal. 4.6 : La délétion de
la boîte E aboutit à une perte totale de l'expression du gène rapporteur dans les TVC. Elle est donc nécessaire pour que
FoxF y soit exprimé. La délétion des éléments Ets individuellement a des conséquences moins sévères mais
significatives et la délétion de deux de ces éléments a des conséquences sévères. Cela indique que la délétion d'un
élément Ets peut être partiellement compensée par la présence des autres mais pas la délétion de deux éléments. 4.7 :
Il s'agit de vérifier s'il n'y a pas un autre élément régulateur dans le grand fragment qui pourrait compenser la perte de
la boîte E. Il n'y en a pas. On constate aussi que l'expression dans l'épiderme semble plus forte que dans le contrôle sans
la délétion ce qui suggère que la boîte E contenant des éléments de régulation inhibiteurs de l'expression dans
l'épiderme.

750
5.1 : L'ARN polymérase II. 5.2 : Les pré-miARN sont produits par le complexe Drosha dans le noyau et les miARN mature
sont produits par Dicer puis RISC dans le cytoplasme. 5.3 : Pour les pri-miARN, il faut choisir au moins une des deux
amorces de telle manière à ce qu'elle reconnaisse des séquences qui ne sont présentes que dans le pri-miARN et non
pas dans les formes plus matures car elles auront été excisées. Pareil pour les amorces pour les pré-miARN. Pour le
miARN, les séquences seront trouvées dans les précurseurs donc on ne peut pas trouver d'amorces spécifiques mais on
peut soustraire le signal obtenu par les précurseurs du signal obtenu avec les amorces des miARN. 5.4 : Globalement
l'inhibition de la signalisation FGF aboutit à une augmentation des miARN matures. Cela provient en partie d'une
stimulation de la transcription des gènes codant ces miARN car on observe une augmentation de la quantité de pri-
miARN. Dans certains cas, la baisse de la quantité de pré-miARN indique une stimulation de leur maturation en miARN
matures (miR-9 et miR-218 et dans une moindre mesure miR-let7b). Pour d'autres cas, c'est l'étape de maturation des
pri- en pré-miARN qui est stimulée (miR-130b). On en conclut que FGF inhibe la production et la maturation des
précurseurs des miARN à différents niveaux.

6.1 : Le gène rapporteur LacZ est inséré dans le locus d'un gène d'intérêt et donc sa transcription est soumise aux mêmes
séquences régulatrices que ce gène. Cette insertion peut provoquer une perte-de-fonction mais seul un des deux allèles
est ainsi muté et en général, l'allèle sauvage restant est capable de compenser et le phénotype de l'embryon est normal
ou très peu altéré. Dans ce cas précis, Ptch code le récepteur de Shh donc on peut savoir où ce récepteur est exprimé.
6.2 : LacZ est exprimé le long de l'embryon dans un bon tiers ventral du tube neural avec un gradient (diminution an
allant vers la région dorsale). Il est exprimé dans la corde et un peu dans le mésenchyme latéral adjacent, sans doute le
sclérotome qui va former les vertèbres. Comme LacZ est sous le contrôle des séquences régulatrices de Patched, on peut
en déduire que le récepteur de Shh est probablement exprimé dans les mêmes régions et cela donne une idée où le
morphogène Shh peut agir (il est produit par la corde et la plaque du plancher (la partie la plus ventrale du tube neural)).
6.3 : voir cette page . 6.4 : Le gène rapporteur est exprimé dans une partie seulement du domaine d'expression de Ptch
qui a été observé en C, I. Il manque notamment l'expression dans le sclérotome et dans la partie la plus dorsale du
domaine d'expression dans le tube neural. D'autres éléments régulateurs que Peak2 doivent intervenir pour contrôler
la transcription de Ptch. 6.5 : On observe une expression irrégulière du gène rapporteur dans la partie ventrale du tube
neural, d'un côté en grande majorité (à droite sur l'image, gauche ou droite pour l'embryon on ne peut pas le savoir).
Quand on compare avec l'hybridation in situ en E, K, on constate que la séquence régulatrice utilisée ne permet pas de
bien récapituler l'expression du gène Nkx2-2. Il y a même une expression ectopique (soulignée par les flèches) hors du
domaine habituel d'expression de Nkx2-2 ce qui indique que d'autres séquences régulatrices de ce gène doivent être
répressives. 6.6 L'expression du gène rapporteur disparait presque complètement ce qui nous indique que les
séquences régulatrices mutées sont importantes et que Gli1 est très probablement impliqué. Une petite partie de
l'expression ectopique est maintenue (flèche) ce qui indique que le contrôle de cette partie du patron d'expression n'est
pas réalisé par Gli1 mais par un autre facteur de transcription qui peut toujours se fixer sur la séquence régulatrice
malgré la mutation introduite.

7.1 : On observe que les transcrits finaux n'ont pas la même composition en exons avec l'exon 1 et l'exon 5 manquant
dans l'un des cas. Comme le montre le western-blot en e, cela donne des protéines de taille différente. On en déduit qu'il
s'agit d'un cas d'épissage alternatif. 7.2 : Le site de démarrage de la traduction de la forme longue est dans l'exon 1. Or
celui-ci est épissé dans l'ARNm de la forme courte et ce n'est que dans l'exon 7 que se trouve l'AUG de démarrage de la
traduction. La protéine est donc plus courte car il lui manque les acides aminés codés par les exons 1 à 6. 7.3 : La partie
N-terminale de la protéine est différente chez la forme longue et courte et donc il faut prendre un anticorps qui reconnait
une partie commune entre les deux formes de la protéine et c'est le cas de la partie N-terminale. 7.4 : On doit choisir des
séquences d'ARNm anti-sens qui s'hybrident avec des séquences spécifiques de la forme longue. La forme longue peut
être reconnue par une sonde qui s'hybride avec les séquences correspondantes à l'exon 1 ou à l'exon 5. 7.5 : Les
hybridations avec les sondes sens servent de témoin négatif : elles permettent d'estimer le marquage de bruit de fond
lié à la procédure. 7.6 : Avec la sonde antisense 1, on voit que l'une ou l'autre des formes est exprimée dans toute la
paroi des tubes séminifères alors que la sonde antisens 2 qui ne reconnait que la forme longue donne un signal que dans
des cellules du côté basal des tubes séminifères dans la région où se trouvent les spermatogonies. On peut penser que
la forme longue est d'abord exprimée dans les spermatogonies et qu'ensuite c'est uniquement la forme courte qui est
exprimée dans des cellules germinales plus matures. Notez que la forme courte peut aussi être exprimée dans les
spermatogonies (on n'a aucun moyen de le prouver ou de l'infirmer avec les données présentées). 7.7 : Le fragment à
amplifier spécifique de la forme longue correspond à l'exon 5. Le fragment à amplifier pour la forme courte est à cheval
entre l'exon 4 et l'exon 6. Les oligonucléotides utilisés pour amplifier ce deuxième fragment peuvent reconnaitre des
séquences correspondantes aux formes longues mais le transcrit sera de taille plus importante dans ce cas, ce qui
permettra de distinguer les transcrits. 7.8 : La forme courte est exprimée plus précocement que la forme longue et est
exprimée plus fortement même lorsque la forme longue est également produite à partir des jours 17-20 après la
naissance. A 80 jours après la naissance, les quantités relatives s'égalisent cependant par baisse de la quantité d'ARNm
de la forme courte.

751
8.1 : C'est une région de la chromatine (flanquée par des isolateurs où se fixent CTCF) où les interactions entre
séquences régulatrices de la transcription sont privilégiées. 8.2 : On constate que le nombre de séquences lues en
RNAseq et donc le niveau de transcription est globalement augmenté pour tous les gènes du complexe entre Hoxa1 et
Hoxa9. La transcription des gènes plus en 5' dans le complexe reste éteinte. La frontière de TAD qui a été ôtée chez le
mutant est en 3' du complexe donc du côté des gènes dont la transcription a été stimulée. On peut penser que leur
transcription chez le mutant est tombée sous l'influence d'un enhancer qui se trouve habituellement dans un autre TAD
et qui n'agit pas sur eux dans les cellules sauvages.

9.1 : On observe que certains exons sont présents dans des isoformes et pas dans d'autres (par exemple, le 6ème exon
est présent dans les isoformes B et C mais pas dans l'isoforme A). On en déduit qu'il s'agit d'un épissage alternatif. 9.2 :
Les isoformes A et C ont l'exon 9 en commun mais il n'est pas présent dans l'isoforme B. Il suffit donc de choisir des
amorces pour la qPCR qui soient dans l'exon 9. Pour suivre l'expression de l'isoforme B qui n'a pas d'exon 9, on peut
choisir des amorces dans les exons 8 et 10, la taille du fragment obtenu sera plus courte pour l'isoforme B que pour les
isoformes A et C (où l'exon 9 rallonge la séquence entre les deux amorces). 9.3 : L'expression des isoformes A et C sont
quasi-exclusives dans les cellules ES non différenciées mais elle diminue au cours de la différenciation neuronale. Dès
le 11ème jour, l'épissage alternatif qui aboutit à l'expression de l'isoforme B est activé et représente la moitié des
transcrits. La proportion de transcrits de l'isoforme B augmente ensuite jusqu'à atteindre plus de 90% en fin de
protocole. On comprend que ZNF507 a des fonctions différentes dans les cellules souches et dans les cellules
différenciées : ce n'est plus tout à fait la même protéine.

10.1 : La structure secondaire de l'ARNm de nanos1 provoquée par la séquence TCE juste en arrière du codon d'initiation
pourrait empêcher la progression des ribosomes. 10.2 : En absence de TCE, l'ARNm de nanos1 est bien traduit en
protéine mais celle-ci est plus courte que la protéine normale car il manque la séquence correspondante au TCE (qui
est en 3' de l'AUG d'initiation donc dans la séquence codante traduite). En présence de dnd1, vasa et deadSouth, on
détecte la protéine Nanos1 montrant que ces protéines sont nécessaires pour permettre la traduction des ARNm de
nanos1 qui possèdent leur TCE. Il y a un très léger effet aussi en présence de centroid. 10.3 : Dans les embryons contrôle,
on observe une co-localisation entre Xiwi et Nanos1 indiquant que Nanos1 est localisée dans le plasme germinal. En
absence de Dnd1, le plasme germinal est toujours présent (mais différemment localisé) comme l'atteste l'expression de
Xiwi mais on ne détecte plus Dnd1. Le sauvetage de ces embryons par une protéine Dnd1 restaure partiellement la
bonne localisation du plasme germinal. On déduit de ces expériences que Dnd1 est nécessaire pour la production de la
protéine Nanos1 et que celle-ci est nécessaire à la bonne localisation du plasme germinal.

11.1 : Sans Chiron (première barre à gauche des graphes), il y a moitié moins environ de cellules qui expriment un
marqueur mésodermique et endodermique. On en déduit que la voie canonique Wnt/ β-caténine stimule la
détermination en mésoderme et en endoderme. Parmi les cibles de β -caténine/TCF, il doit y avoir des gènes importants
pour l'engagement vers l'un et/ou l'autre feuillet. 11.2 : Ce sont des enzymes qui catalysent la perte du groupe acétyl
sur les lysines de la queue N-terminale des histones et ce qui renforce les liaisons faibles entre les histones et l’ADN et
inhibe la transcription en diminuant l’accessibilité des facteurs de transcription à leur séquence cible. 11.3 : L'inhibition
de tous les HDAC ou des HDAC1-3 aboutit à une augmentation de la détermination en mésoderme au détriment de la
détermination en endoderme. Cependant, l'inhibition sélective de HDAC2 n'a pas d'effet significatif. On en déduit que
c'était l'inhibition de HDAC1 et de HDAC3 qui a véritablement influencé le changement de détermination. Donc les
désacétylations d'histones par HDAC1 et HDAC3 (et donc des inhibitions de l'expression de gènes contrôlées par les
séquences dont l'état de condensation de la chromatine a été modifiée par ces 2 enzymes) sont nécessaires pour une
détermination maximale en endoderme et pour inhiber la détermination en mésoderme.

12.1 : Il s'agit de vérifier la spécificité de l'action de CRISPR-Cas9 et de voir si on obtient le même phénotype avec deux
cibles indépendantes sur le même gène. Si ce n'est pas le cas, ça veut dire qu'il y a eu dans un des cas une édition du
génome ailleurs que dans METTL3, ce qui a pu influencer le phénotype. 12.2 : La protéine de ménage GAPDH est à peu
près pareillement exprimée dans le cas SC et KD-2 et moins dans KD-1 ce qui rend les conclusions moins faciles pour
KD-1. Néanmoins, on observe une nette diminution de l'expression de METTL3 par l'action de CRISPR-Cas9 dans les
deux cas où le gène est ciblé. Cependant, un peu de METTL3 est toujours présent : soit CRISPR-Cas9 n'a pas pu agir
correctement dans toutes les cellules de la population dont on a extrait les protéines, soit il s'agit du METTL3 produit
avant l'action de CRISPR-Cas9 et qui n'a pas encore été entièrement dégradé. 12.3 : L'expression de la protéine PTCH1
augmente lorsque la quantité de METTL3 est diminuée tandis que c'est l'inverse pour GLI2. METTL3 inhibe donc
l'expression de PTCH1 (soit au niveau de la transcription, soit au niveau de la traduction) et METTL3 active l'expression
de GLI2 (là aussi au niveau de la transcription ou de la traduction). Alternativement, METTL3 peut influencer la stabilité
de ces protéines. 12.4 : L'inhibition de la transcription permet de suivre la survie des ARNm qui ont été produits avant.
Pour les ARNm de PTCH1 on constate que la diminution de l'expression de METTL3 a plutôt un effet stabilisant (avec
un effet plus fort de KD-1 relativement à KD-2). On observe la même chose avec les ARNm de GLI2 avec cette fois-ci un
effet similaire entre KD-1 et KD-2. On en déduit que METTL3 a un effet déstabilisant sur les ARNm de ces deux gènes,
stimulant sans doute leur dégradation. 12.5 : La stabilisation des ARNm de PTCH1 lorsque METTL3 est moins présent
peut expliquer l'augmentation de la quantité de protéine PTCH1 observé en western-blot (cependant on ne retrouve
752
pas l'effet différentiel de KD-1 et de KD-2 sur le western-blot). En revanche, pour GLI2 la stabilisation des ARNm va à
l'encontre de la chute importante de la quantité de protéine. D'autres mécanismes que la stabilisation des ARNm doivent
être à l'œuvre au niveau transcriptionnel ou traductionnel.

13.1 : La coiffe des ARNm se compose d'une guanosine méthylée en position N7 donc il s'agit de séparer les protéines
qui se fixent à cette coiffe des autres protéines. 13.2 : Cela permet d'abord de vérifier que la protéine METTL16 est bien
absente dans les cellules sgM16 alors qu'elle est présente dans les cellules WT. Ensuite, cela permet de vérifier que les
quantités de protéines sont similaires entre les 2 conditions, GAPDH qui est étudié comme un contrôle mais aussi
eIF4E2 et eIF4E. Toutes différences dans les pull-downs sera lié à un accrochage différentiel avec la coiffe. 13.3 : Il n'y a
rien dans le pull-down GTP, ce qui indique que ce qui est récupéré par le pull-down m7GTP n'est pas lié au GTP en
général mais spécifiquement à la forme du GTP qui est présente dans la coiffe des ARNm. Cela montre la spécificité de
liaison. On constate que METTL16 ne se fixe à la coiffe, mais eIF4E2 et eIF4E si. Cependant, en absence de METTL16
dans la cellule, eIF4E2 est plus fixé à la coiffe qu'en sa présence et c'est l'inverse pour eIF4E. 13.4 : METTL16 va très
probablement stimuler la traduction car son absence facilite la fixation d'un inhibiteur de la traduction sur la coiffe et
rend plus difficile la fixation d'un activateur de la traduction sur cette coiffe.

14.1 On utilise un promoteur d'un gène exprimé de manière généralisée dans toutes les cellules de la drosophile pour
que la GFP soit exprimée de manière ubiquitaire et que toute inhibition localisée de sa production soit facilement
repérable. 14.2 On constate que de larges zones du disque imaginal n'expriment pas le GFP lorsque les séquences cibles
du microARN Bantam se trouvent dans le 3'UTR de l'ARNm de la GFP, contrairement à la situation contrôle où la GFP
est exprimée quasiment partout. On en déduit que le microARN Bantam est exprimé et inhibe la traduction de ces cibles
dans les régions devenues non fluorescentes chez la drosophile transgénique de droite.

Exercices sur les matrices extracellulaires, le cytosquelette et les adhérences cellule-cellule

EXERCICE 1 :

Des images ont été prises de tests de fermeture de cicatrisation de tapis de cellules trophoblastiques HTR8/SVneo
cultivées dans un milieu sans sérum complété par le solvant (panneaux supérieurs) ou les peptides RGD et YIGSR
(panneaux inférieurs). Chaque condition de culture a été en outre traitée sans (milieu sans sérum) ou avec des
microvésicules produites par des cellules ES ou du sérum à 1 %. La ligne pointillée indique la largeur de la plaie
d'origine. Barre d'échelle, 250 μm. (f) Les résultats en e ont été quantifiés et tracés en tant que zone relative de plaie
ouverte. Toutes les valeurs affichées sont présentées sous forme de moyenne ± s.e.m. (n≥3 expériences indépendantes
pour chaque dosage). Les différences ont été analysées à l'aide du test t de Student ; *p<0,05, **p<0,01. Source :
https://www.nature.com/articles/ncomms11958

* 1.1 Rappelez le principe du test de cicatrisation. Quels sont les processus cellulaires à l'œuvre ?

*1.2 Quelle est la fonction des peptides RGD dans l'expérience ?

*1.3 Sachant que YIGSR est la séquence sur la laminine reconnue par les intégrines, interprétez les résultats de
l'expérience.

753
EXERCICE 2 :

On cultive des cellules Ishikawa (des cellules de carcinomes d'endomètre utérin) dans un milieu contrôle ou additionné
d'un mélange de 17beta-estradiol et de progestérone (E2P4) ou d'acide suberoylanilique hydroxamique (SAHA) qui est
connu dans ce modèle pour faciliter l'attachement de sphéroïdes JAR (des cellules de choriocarcinomes qui miment les
cellules trophoblastiques d'un embryon qui doit s'implanter). Une immunofluorescence anti-E-cadhérine et anti-N-
cadhérine est effectuée ainsi qu'une coloration avec de la phalloïdine couplée à un fluorochrome. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)48101-3/fulltext

**2.1 Les cellules dans la rangée du haut sont observées en microscopie DIC (microscopie à contraste interférentiel).
Expliquez comment cela fonctionne.

*2.2 Analysez et interprétez les immunofluorescences anti-E-cadhérine et anti-N-cadhérine.

*2.3 Que marque la phalloïdine ?

*2.4 Analysez les résultats avec la phalloïdine.

EXERCICE 3 :

On souhaite connaitre la fonction de Ikkbeta dans des fibroblastes embryonnaires de souris. A) Des cellules de type
sauvage (Wt) ou porteuses à l'état homozygote d'une mutation perte-de-fonction Ikkbeta-/- ont été ensemencées et

754
cultivées à la même densité. Les cellules ont été colorées avec phalloïdine-FITC et étudiées en microscopie confocale
(on a deux grossissements différents pour chaque type de cellules). B) Test de la chambre de Boyden. Les chambres
supérieures ont été remplies de 20 000 cellules dans 250 microlitres de DMEM (milieu de base) sans sérum (photo de
gauche) et les chambres inférieures ont été remplies de 1% de serum dans 250 microlitres de DMEM. Les cellules sur
la face inférieure de l'insert et les cellules à la surface des chambres inférieures ont été colorées au cristal violet et
photographiées (photos du milieu et à droite) C) Des immunofluorescences sont réalisées avec des anticorps contre
FAK total, FAK phosphorylé, taline et la cytokératine 8 dans les cellules de type sauvage et mutantes. D) Des western-
blots ont été réalisés à partir d'extraits protéiques des cellules et des anticorps contre les protéines IKKalpha, IKKbeta,
pFAK, FAK total, Pyk2 (une tyrosine kinase apparentée à FAK), ILK (pour integrin-linked kinase), taline et vinculine ont
été utilisés. Les flèches indiquent des bandes spécifiques. L'astérisque indique des bandes non spécifiques. Les données
sont représentatives d'au moins trois expériences. Source : https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)72063-
6/fulltext

*3.1 Décrivez les résultats en A.

*3.2 Quel est le principe du test de la chambre de Boyden ?

**3.3 La membrane entre les deux chambres a été couverte de Matrigel. Quel est ce composé et à quoi sert-il ?

*3.4 Quelle conclusion tirez-vous de cette expérience ?

**3.5 Que nous apprennent les immunofluorescences ?

**3.6 Analysez et interprétez le résultat du western-blot en D et essayez d'expliquer le phénotype cellulaire observé en
3.4

EXERCICE 4

On s'intéresse à deux mutants perte-de-fonction du poisson-zèbre dak et pic. A,D,G Coloration au bleu alcian du
squelette céphalique (vue ventrale) de poisson de 6 jours de développement. B,C,E,F,H,I Eléments du squelette isolés
vus à fort grossissement. Source : https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000136

*4.1 Que colore le bleu alcian ?

*4.2 Analysez le phénotype des mutants.

755
Immunomarquage avec des anticorps anti-héparan, anti-kératan et anti-chondroïtine sulfate sur des embryons de
poisson-zèbre de 24hpf (heures après la fécondation) sauvage et mutants. (A-C) Vue latérales troncales (D-F) Vues
latérales caudales (G-I) Vue du cartilage ceratohyal (à 72hpf). Source :
https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000136

*4.3 Que nous révèle l'analyse de ces phénotypes ?

On étudie par hybridation in situ l'expression des gène sox9a et collagen2a1a dans les têtes de poisson à 60hpf. Source
: https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1000136

*4.4 Quel est l'intérêt de faire cette étude ?

*4.5 Quelles conclusions tirez-vous de cette expérience et de l'ensemble des résultats de l'exercice ?

EXERCICE 5

756
On fait exprimer dans le mésoderme de la drosophile la E-cadhérine et la β-caténine couplées chacune à un fluorophore.
Lorsque les deux fluorophores sont suffisamment proches l'un de l'autre, un phénomène de FRET a lieu. Source :
https://elifesciences.org/articles/33381

**5.1 Qu'est-ce que le FRET ?

*5.2 Dans quel type de complexe trouve-t-on la E-cadhérine et la β-caténine ?

**5.3 Quel évènement impliquant le complexe décrit à la question précédente pourrait faire baisser l'efficacité du FRET
?

Au cours de la gastrulation de la drosophile en vue ventrale externe, on observe non pas le FRET mais le temps de vie
de la fluorescence du donneur d'énergie dans le FRET qui est inversement proportionnelle à l'efficacité du FRET. Source
: https://elifesciences.org/articles/33381

**5.4 Que peut-on déduire de ces observations ?

EXERCICE 6

On observe un épithelium unistratifié formé par les cellules folliculaires autour des cellules germinales dans un ovariole
de drosophile. (D). Les panneaux supérieurs sont des plans traversant des domaines latéraux qui capturent une partie
de la surface apicale en raison de la courbure des tissus, comme illustré en (E). Les panneaux inférieurs sont des coupes
transversales. Des immunofluorescences sont réalisés avec des anticorps anti-Dlg (marqueur de domaines latéraux) et
anti-aPKC (marqueurs de domaines apicaux, utilisé sur les coupes transversales uniquement). Les drosophiles utilisées
757
sont transgéniques et expriment la protéine fusion Col IV-GFP. On croise ces drosophiles avec des mutants : spastin-OE
qui surexprime la spastine qui clive les microtubules, le mutant de la chaîne lourde de la kinésine Khc-733-3 généré par
introduction d'un codon STOP précoce par CRISPR-Cas9, le mutant rab10-/- qui n'exprime plus la petite GTPase Rab10.
Source : https://www-cell-com.insb.bib.cnrs.fr/current-biology/fulltext/S0960-9822(21)01701-2

*6.1 Où trouve-t-on habituellement la collagène IV ? Quelle est sa particularité parmi les différents collagènes ?

*6.2 Le mutant Khc-733-3 est-il un mutant gain-de-fonction ou perte-de-fonction ?

**6.3 Le mutant Khc-733-3 a été produit grâce à CRISPR-Cas9. décrivez brièvement le principe de cette technique.

*6.4 Analysez et interprétez les résultats en D et F (E sert pour se repérer) pour spastin OE.

*6.5 Faites la même chose pour Khc-733-3.

*6.6 Que se passe-t-il dans les cellules mutantes rab10-/- ?

EXERCICE 7 :

Des cellules COS (mésenchyme de rein) ont été transfectées avec un vecteur permettant d'exprimer EGFP ou la protéine
fusion SRGAP2A-EGFP. En plus elles ont été transfectées avec un autre vecteur permettant d'exprimer les protéines
fusion SRGPAP2C-mRFP, SRGAP2B-mRFP, SRGPAC2 avec un de ses domaines appelé F-BAR délété de 5 arginines couplé
à mRFP (F-BARΔ5R-mRFP) et SRGPAC2 avec son domaine F-BAR délété de 49 acides aminés (la délétion n'affecte pas
les 5 arginines) (F-BARΔ49-mRFP). Sur les images, on observe la fluorescence de EGFP. Barre d'échelle = 5 µm. Source
: https://europepmc.org/article/PMC/3357949

*7.1 Quel est l'effet de l'expression de SRGAP2A sur les cellules (Figures A et B) ?

*7.2 Quel est l'effet de SRGAP2C et de SRGAP2B sur l'action de SRGAP2A ?

*7.3 Que nous apprennent les expériences sur le domaine F-BAR de SRGPAC2 ?
758
**7.4 SRGAP2A fait partie des protéines de la famille GAP qui active les petites GTPases. Quelle pourrait être sa cible et
comment pourrait-elle fonctionner ?

On réalise une immunoprécipitation à partir d'extraits protéiques de cellules HEK qui expriment les protéines indiquées
(HA et GFP servent de tag pour l'immunoprécipitation). Les anticorps utilisés pour l'immunoprécipitation sont indiqués
en haut (ms = anticorps de souris; α = anti- ; IgG est un anticorps contrôle). On réalise un western-blot avec le culot de
l'immunoprécipitation et les protéines sont révélés avec un anticorps anti-GFP. Input : correspond à l'extrait protéique
avant immunoprécipitation. Source : https://europepmc.org/article/PMC/3357949

**7.5 Que nous apprennent les immunoprécipitations ?

EXERCICE 8 :

Dans des fibroblastes provenant de vache de génotype sauvage (WT) et de vache de génotype mutant pour le gène
codant C-Nap1, causant une maladie chez les vaches de race montbéliarde provoquant diverses anomalies de
développement (Mutant) sont soumis à une immunofluorescence anti-gamma tubuline. On transfecte des fibroblastes
mutants avec un vecteur permettant l'expression de la forme sauvage de C-Nap1 couplée avec le tag Myc (myc-C-Nap1).
Une immunofluorescence anti-Myc est réalisée (a, panel en bas à droite). L'ADN est coloré au DAPI. (b) Distance entre
les deux centrioles et pourcentage des cellules avec le phénotype anormal selon les cas. Source :
https://www.nature.com/articles/ncomms7894

*8.1 Quelle structure cellulaire est localisée grâce à l'anticorps anti-gamma tubuline ?

*8.2 Quel est l'effet de la mutation ?

*8.3 A quoi sert l'expérience avec myc-C-Nap1 ?

759
*8.4 Quel effet de la mutation est ici mis en évidence ?

EXERCICE 9

On observe au microscope confocal des embryons de drosophile fixés lors des étapes de la cellularisation où un
épithélium se forme à la surface de l'embryon (plusieurs étapes : early, mid et late) et traitées en immunofluorescence
avec un anticorps reconnaissant Armadillo (Arm) qui est l'orthologue de la β-caténine chez la drosophile. Les images
indiquées MIP correspondent à la projection des intensités maximales des images vues en microscopie confocale. Le
côté apical est en haut (flèche rouge) et le côté basal est en bas (flèche blanche). L'épithélium s'épaissit au fur et à
mesure du développement. Des embryons sont traités avec des ARN interférents inhibant la production des protéines
Scrib (B) et Dlg (C). Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/22/dev180976/223180/Scribble-and-
Discs-large-direct-initial-assembly

*9.1 Où peut-on s'attendre à voir la β-caténine dans un épithélium ?

*9.2 Que constatez-vous sur la répartition de la β-caténine chez le sauvage ?

*9.3 Quel est le rôle mis en évidence ici des protéines Scrib et Dlg ?

EXERCICE 10

760
MOR1 est une MAP (Microtubule Associated Protein) exprimée chez Arabidopsis thaliana. mor1-10 est une mutation
hypomorphe dans le gène codant cette protéine. On incube pendant 4 jours des racines en croissance en présence de
différentes concentrations de propyzamide, une molécule qui destabilise les microtubules. Les parois cellulaires sont
visibles en jaune (coloration avec PI). L'axe apico-basal est vertical. Source :
https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koac147/6586806

*10.1 Quel est l'effet du propyzamide aux doses utilisées sur les racines sauvages (WT) ?

*10.2 Quelles sont les conséquences de la mutation mor1-10 sur les effets du propyzamide ? Quelles peuvent être les
conséquences fonctionnelles pour la plante mutée ?

**10.3 Proposez une ou des hypothèses pour expliquer le phénotype obtenu.

Avec de la tubuline-GFP, on observe les bandes préprophasiques des cellules en division dans la racine des plants
sauvages ou mutants mor1-10, sans ou avec incubation avec 5µM de propyzamide. Source :
https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koac147/6586806

**10.4 Qu'observez-vous et en quoi cela explique le phénotype observé plus haut ?

EXERCICE 11

Cow est une HSPG (héparane sulfate protéoglycane). On réalise des immunofluorescence permettant de localiser la
protéine de signalisation secrétée Wingless lorsqu'elle est extracellulaire (marquage bleu) dans des disques
imaginaux d'ailes de drosophile sauvage (A') ou mutantes où la région dorsale du disque (D) exprime un miARN anti-
Cow (B'-E') avec un gène témoin (RFP) (B'), une forme de Cow dont l'expression n'est pas inhibée par le miARN (C',
E') ou une forme mutée de Cow dont l'expression n'est pas inhibée par le miARN et sans héparanes sulfates appelée
mSG1+2 (D'). On réalise une quantification du signal (région ventrale V et dorsale D, la couleur bleu correspond à A',
le rose à B', le jaune à C', le vert à D' et le marron à E'). Source :
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0111573

*11.1 Précisez ce qu'est une héparane sulfate protéoglycane. Faites un schéma de sa structure.

*11.2 Analysez et interprétez les résultats A', B' et C'.

**11.3 Comment peut-on faire produire une forme de Cow sans héparanes sulfates ?

*11.4 Analysez et interprétez les résultats concernant la forme de Cow sans héparanes sulfates.

761
EXERCICE 12

On réalise des polymérisations d'actine G en actine F en présence ou non du complexe CP (complexe protéique de
coiffage) et en présence ou non de concentrations croissantes de la protéine VASP. On suit au cours du temps la
formation des microfilaments.

*12.1 La courbe en absence de CP et de VASP est la courbe noire. Comparer avec la courbe en présence de CP et en
absence de VASP. Quel est l'effet mis en évidence ?

*12.2 Analysez et interprétez l'effet de VASP.

**12.3 Quelles expériences supplémentaires il faudrait faire pour mieux comprendre l'effet de VASP ?

EXERCICE 13

On veut comprendre le rôle du domaine intracellulaire de la E-cadhérine au cours du développement de la glande mammaire. On
créé des souris transgéniques qui expriment sous le contrôle d'un promoteur de MMTV (un virus qui exprime ses gènes uniquement
dans la glande mammaire) un gène codant une protéine chimérique : le domaine extracellulaire d'une protéine membranaire
intervenant dans le système immunitaire (H2) et le domaine transmembranaire et intracellulaire de la E-cadhérine. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160699995179

*13.1 Pourquoi utilise-t-on le promoteur de MMTV et non pas un autre promoteur activé de manière plus général ?

**13.2 Pourquoi met-on le domaine extracellulaire de H2 dans la construction chimérique ?

762
Des préparations des tubules et des lobules des glandes mammaires sont préparées à partir de souris sauvages (ligne
du haut) ou transgéniques (ligne du bas) qui ont des embryons à 8, 12 et 14 jours de gestation. Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160699995179

*13.3 Quel est l'effet de l'expression du transgène sur l'organisation de la glande mammaire ?

**13.4 Quelles hypothèses posez-vous qui ferait le lien entre ce phénotype et la structure du transgène ?

Les souriceaux nourris avec le lait qui est produit par les glandes mammaires des souris transgéniques ont une
croissance très faible et beaucoup finissent par mourir. On étudie par immunofluorescence anti-laminine des coupes
transversales de glandes mammaires de souris sauvages (C) ou transgéniques (D). Source :
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160699995179

*13.5 Expliquez pourquoi les souriceaux ont une croissance plus faible lorsqu'ils sont nourris par les femelles
transgéniques ?

**13.6 Qu'est-ce que les résultats de cette expérience indiquent sur une des fonctions de la E-cadhérine ?

REPONSES :

1.1 Le test de cicatrisation liée à la blessure de tapis cellulaire consiste à arracher les cellules de manière contrôlée sur
une trajectoire précise dans une boîte de Pétri et d’observer à intervalles réguliers/filmer la manière dont les cellules
avoisinantes de la “blessure” vont coloniser l’espace vide. La principale composante de la cicatrisation de la blessure
sera la migration cellulaire mais il peut y avoir aussi une composante liée à la prolifération. 1.2 La séquence RGD est la
séquence sur un certain nombre de molécules de la MEC et notamment la fibronectine sur laquelle se fixe les intégrines.
Il s'agit de savoir si le comportement des cellules observé ici dépend d'une interaction RGD-intégrine (et donc
probablement fibronectine-intégrine). 1.3 Les microvésicules des ES augmentent la rapidité de la cicatrisation
suggérant qu'ils stimulent la migration cellulaire. Le mélange de peptides RGD et YIGSR ralentit la cicatrisation
provoquée par les microvésicules. On en déduit que les interactions des intégrines des trophoblastes avec la MEC sont
probablement augmentées par les microvésicules mais comme c'est un mélange qui est utilisé, impossible de savoir si
c'est la laminine, la fibronectine ou les deux qui sont les molécules impliquées dans la MEC.

2.1 Lorsque la lumière traverse un objet complexe les phases de ses ondes peuvent se décaler en fonction de l’indice de
réfraction du milieu qu’elles traversent. C’est cette propriété qui est exploitée par le microscope à contraste
interférentiel. Cet effet est amplifié par le microscope à contraste interférentiel. Le faisceau lumineux est dédoublé en 2
faisceaux proches l’un de l’autre par divers systèmes optiques variés avant la traversée de l’objet. Un second système
optique recompose les 2 faisceaux qui produisent des interférences qui dépendent de l’épaisseur et de la biréfringence
des objets observés. 2.2 En condition contrôle, on observe un marquage membranaire important de la E-cadhérine avec
une disposition des cellules en couche épithéliale. La N-cadhérine est aussi exprimée mais de manière plus irrégulière.
Avec le traitement E2P4, la E-cadhérine est exprimée de manière plus hétérogène et le marquage n'est plus seulement
membranaire mais aussi cytoplasmique. L'expression de la N-cadhérine reste membranaire et semble un peu plus
généralisé. Avec le traitement SAHA, l'expression de la E-cadhérine est nettement plus faible et plus du tout
membranaire mais péri-nucléaire tandis que la N-cadhérine est bien exprimée à la membrane plasmique. Le traitement
E2P4 et surtout le traitement SAHA a abouti à exprimer comme cadhérine dominante à la membrane la N-cadhérine à
la place de la E-cadhérine. Un tel changement se retrouve lorsqu'il y a une transition épithélio-mésenchymateuse. 2.3
La phalloïdine marque les microfilaments d'actine. 2.4 La répartition des microfilaments d'actine est essentiellement
sous membranaire sans traitement et avec le traitement E2P4. En revanche, il est plus réparti dans le cytoplasme avec
le traitement SAHA avec la formation de fibres de stress. Cela accompagne bien l'idée émise avec l'étude des cadhérines
que SAHA a un effet plus fort sur les cellules que E2P4 et qu'il active une transition épithélio-mésenchymateuse.

3.1 La phalloïdine couplé à un fluorophore rend visible les microfilaments d'actine. Chez les cellules mutantes, ces
microfilaments sont arrangées en fibre de stress ce qui n'est pas le cas chez les cellules sauvages où l'actine forme
763
surtout une masse au centre de la cellule. 3.2 Il s'agit de la création de deux compartiments avec des milieux de
composition différente séparés par une membrane poreuse (en général avec des pores d'un diamètre entre 3 et 12
micromètres (à adapter selon les cellules étudiées)). Les cellules sont déposées sur cette membrane et on les incube
durant une durée permettant à certaines d'entre elles de traverser la membrane et de se retrouver à sa face inférieure
dans le second compartiment. Celui-ci peut par exemple contenir un milieu avec un chémoattractant. 3.3 Le Matrigel
est le nom commercial de la matrice de membrane basale solubilisée sécrétée par les cellules de sarcome de souris
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Le Matrigel ressemble à la membrane basale riche en laminine/collagène IV que l'on
trouve dans de nombreux tissus et est utilisé par les biologistes cellulaires comme substrat tridimensionnel pour la
culture des cellules ou comme ici pour tester les capacités migratoires des cellules. 3.4 Il y a plus de cellules mutantes
qui ont traversé la membrane vers la chambre inférieure que de cellules sauvages alors même que l'attachement des
cellules à la membrane dans la chambre supérieure était similaire (photos de gauche). On en déduit que les cellules
mutantes ont des capacités de migration plus importantes que les cellules sauvages. On en déduit que Ikkbeta est un
inhibiteur de la migration. 3.5 Le niveau général de FAK et de pFAK est le même dans les deux types de cellules, mais
les cellules mutantes présentent des concentrations de pFAK à la périphérie cellulaire qui évoque des points d'adhésion
focaux. L'expression de la taline (une protéine souvent associée en complexe avec les intégrines) est plus faible dans les
cellules mutantes et on ne voit pas de différence notable pour la cytokératine 8 (un filament intermédiaire). 3.6 On a
bien une disparition de la bande spécifique pour les puits correspondants aux extraits protéiques des cellules Ikkbeta-
/-. On ne constate pas d'augmentation compensatrice importante de l'expression d'Ikkalpha. La quantité de FAK total
est augmentée donc il est difficile de dire si l'augmentation de pFAK est du à ce qu'il y ait plus de FAK total (solution la
plus probable) ou si une proportion plus grande de FAK est phosphorylée. Pyk2 et ILK sont être plus exprimées chez le
mutant tandis que taline est moins exprimée (ce qui confirme ce que l'on avait vu en immunofluorescence). La vinculine
est stable ou faiblement augmentée dans les cellules mutantes par rapport aux cellules sauvages. Les capacités de
migration accrue des cellules mutantes provient sans doute de la présence de plus de FAK sous la forme phosphorylée.

4.1 : Le bleu alcian colore les tissus cartilagineux, plus précisément les GAG qui se trouvent spécifiquement dans la
matrice extracellulaire. 4.2 : Le mutant dak-/- possède un tissu cartilagineux bien coloré en bleu (donc présence
siffisante de GAG) mais la forme des chondrocytes est altérée. Aucun n'a la forme en parallélépipède qu'ont les
chondrocytes du poisson sauvage. Le mutant pic-/- a le même défaut de morphologie cellulaire mais en plus la matrice
extracellulaire est très affectée car elle n'est même plus colorée par le bleu alcian, indiquant une diminution importante
de sa teneur en GAG. 4.3 : Le mutant dak-/- présente des quantités diminuées des GAG sulfatés qui sont analysés et le
mutant pic-/- présente une disparition complète des GAG. Cela confirme ce que l'on avait observé en 4.2. Le mutant pic-
/- est nettement plus affecté et ces absences de GAG peuvent expliquer l'absence de coloration au bleu alcian. 4.4 : Sox9
code un gène impliqué dans le développement des chondroblastes et le collagène 2a1a est un collagène spécifique de la
matrice extracellulaire cartilagineuse qui est exprimé assez tôt. Il s'agit de voir si les défauts observés ne viennent pas
d'anomalies au cours du développement du tissu. 4.5 : On n'observe pas de différence entre le sauvage et le mutant pic-
/-. Le mutant dak-/- présente des modifications dans la disposition du cartilage en développement marqué. Cela suggère
que le mutant dak-/- a des défauts d'origine développementale qui se répercutent sur sa matrice extracellulaire et la
forme des cellules alors que le mutant pic-/- a un phénotype qui apparait plus tardivement et qui affecte uniquement la
matrice extracellulaire et la différenciation finale des cellules.

5.1 : Cette technique de transfert d’énergie entre molécules fluorescentes permet de voir en microscopie si deux
fluorophores se trouvent à moins de 10 nm l’un de l’autre. Pour ce faire, la longueur d’émission d’un fluorophore A doit
pouvoir exciter un fluorophore B dont on pourra enregistrer l’émission de photons. 5.2 : On trouve ces 2 molécules dans
les jonctions adhérentes type zonula adherens des épithéliums avec des interactions homophiliques extracellulaires
entre deux cadhérines et un complexe intracellulaire avec la β-caténine, la p120-caténine, l'alpha-caténine, la vinculine
et des microfilaments d'actine. 5.3 : L'efficacité du FRET baisse si la distance augmente entre les deux flurorophores,
c'est-à-dire si le domaine intracellulaire de la E-cadhérine où se trouve le premier fluorophore s'éloigne de la béta-
caténine. Cela peut arriver si le complexe se défait ou s’il y a une tension sur la E-cadhérine qui la tire vers l'extérieur et
déforme le complexe. 5.4 On observe un temps de vie de fluorescence homogène dans les différentes cellules au stade
5 et au début du stade 6 où on observe que des cellules au centre de l'image présentent une légère déformation par
rapport aux autres. Au stade 6, cette déformation est accentuée, des cellules sont plus étroites dans une dimension. Ces
cellules ont un temps de vie de fluorescence nettement plus élevé que leurs voisines ce qui indique qu'il y a sans doute
des tensions aux jonctions intercellulaires accompagnant ces déformations qui éloignent les fluorophores de la E-
cadhérine et de la β-caténine.

6.1 : Le collagène IV est retrouvé habituellement dans la lame basale et elle s'assemble en réseau réticulé et non pas en
fibres. 6.2 : Il est précisé qu'un codon STOP précoce a été introduit ce qui veut dire que la protéine est tronquée de sa
partie C-terminale lors d'une traduction qui est incomplète. Cela entraîne très probablement la perte-de-fonction de la
protéine. 6.3 Grâce à un ARN guide spécifique, l'endonucléase Cas9 réalise une cassure double brin dans la séquence
codante de Khc et une séquence d'ADN avec des séquences homologues aux régions autour de la cassure et un codon
STOP est introduit et est utilisée par la cellule pour réparer la cassure, permettant l'insertion du codon STOP dans le

764
génome. 6.4 : La surexpression de la spastine détruit le réseau de microtubules. Cela a pour conséquence que le
collagène de type IV est présent non seulement dans la lame basale mais aussi sur les côtés latéraux des cellules. Dlg,
un marqueur des domaines latéraux semble en partie des régions où le collagène IV s'accumule de manière ectopique.
La destruction des microtubules aboutit donc à des défauts de polarisation des cellules épithéliales. 6.5 : La mutation
perte-de-fonction de la kinésine donne les mêmes résultats que la destruction des microtubules. Cela indique que la
destruction des microtubules avec la surexpression de spastine perturbe essentiellement le trafic des vésicules qui
dépend de la kinésine. Ces vésicules doivent être mal adréssées et déversent les précurseurs du collagène IV du côté
latéral plutôt que du côté basal. 6.6 : On constate que le collagène IV est nettement moins présent dans la lame basale
et qu'une partie est adressée vers la partie apicale. Il s'agit d'une perturbation de la polarité cellulaire encore plus grave
que dans les cas précédents.

7.1 : Les cellules sont plus étalées et émettent de fins prolongements : des filopodes. Cela indique des modifications dans
le réseau de microfilaments d'actine. 7.2 : Les deux protéines inhibent la formation des filopodes que forme SRGAP2A.
7.3 : La délétion des 5 arginines laisse SRGAP2A former des filopodes dans les cellules donc les 5 arginines sont
indispensables pour que SRGAP2C inhibe l'action de SRGAP2A sur la formation des filopodes. En revanche, les 49 acides
aminés (où ne figurent pas les 5 arginines) ne sont pas importants pour cette fonction de SRGAP2C (elles peuvent être
importantes pour une autre fonction). 7.4 : Cdc42 est la petite GTPase qui active la formation des filopodes et on peut
émettre l'hypothèse que c'est la cible de SRGAP2A. Pour l'activer, SRGAP2A échange probablement un GDP contre un
GTP ce qui active les petites GTAses telles que Cdc42. 7.5 : Quand on immunoprécipite HA (c'est-à-dire SRGAP2C), on
peut mettre en évidence dans la fraction obtenue la GFP (et ce n'est pas le cas lorsqu'on a immunoprécipiter avec
l'anticorps IgG contrôle). La GFP est fusionnée avec SRGAP2A dans le panel de gauche et SRGAP2C dans le panel de
droite, ce qui montre que SRGAP2C forme un complexe avec SRGAP2A ou avec lui-même. On peut imaginer que
SRGAP2C inhibe SRGAP2A en formant un complexe avec lui et en l'empêchant l'agir sur la formation des filopodes.

8.1 : La gamma-tubuline permet de repérer le centrosome composé de 2 centrioles. 8.2 : La mutation provoque une
augmentation significative de la distance entre les 2 centrioles du centrosome. 8.3 : Il s'agit d'une expérience de
sauvetage pour vérifier que le phénotype lié à la mutation est uniquement dû à un manque d'expression de C-Nap1. De
plus, cela permet d'introduire une forme taguée de la protéine, facilement localisable grâce à un anticorps couramment
utilisée (anticorps anti-Myc). On observe que les cellules qui expriment myc-C-Nap1 retrouvent un centrosome normal
où les centrioles sont côte à côte. La cellule en bas à droite n'exprimant pas myc-C-Nap1 a toujours ses deux centrioles
éloignés. Le sauvetage a bien marché et en plus, on remarque que myc-C-Nap1 est localisé au centrosome et donc agit
directement localement. 8.4 : On observe que la cicatrisation de la blessure réalisée sur le tapis cellulaire démarre de
manière similaire entre les cellules sauvages et mutantes mais à 15h et à 20h la cicatrisation des cellules mutantes
prend du retard sur celle des cellules sauvages. Cela indique un défaut de migration et éventuellement un défaut de
prolifération (la cicatrisation est aussi dépendante de ce paramètre).

9.1 : La β-caténine est localisée au niveau des jonctions adhérentes et également on peut en déceler dans le cytoplasme
et éventuellement dans le noyau si les cellules épithéliales répondent à un ligand Wnt. 9.2 : Au stade précoce, la β-
caténine est localisée aux niveaux apical, basal et aussi au niveau latéral (flèche verte). Cette dernière localisation
s'amenuise aux stades plus tardifs. La localisation apicale devient plus intense que la localisation basale. 9.3 : Lorsque
l'expression de l'une ou l'autre de ces protéines est inhibée, on observe la β-caténine tout le long du flanc des cellules
épithéliales que ce soit du côté apical, latéral ou basal. Elle est un peu plus présente du côté apical mais la polarité apico-
basale de sa répartition habituelle est globalement perdue. Scrib et Dlg sont donc nécessaires à cette polarité de
répartition et donc probablement à la formation de jonctions adhérentes fonctionnelles.

10.1 : Ce n'est qu'avec 5 µM de propyzamide que des différences apparaissent chez les racines sauvages par rapport aux
racines non traitées. Les files de cellules deviennent perturbées avec l'une des files qui s'est divisée en deux et une
cellule qui s'est divisée en 3 perpendiculairement à l'axe principal. Cela suggère des défauts dans l'orientation des
divisions cellulaires. 10.2 : Chez le mutant mor1-10, on constate des défauts importants de disposition des cellules dès
la dose de 3 µM de propyzamide et les défauts sont encore plus importants à 5 µM (notamment en comparaison avec la
racine sauvage à la même dose). La mutation provoque une hypersensibilité des racines à l'action de la propyzamide.
Cela suggère que les altérations de l'orientation des divisions cellulaires se font plus facilement. 10.3 : MOR1 est une
protéine associée aux microtubules qui doit sans doute les protéger de l'action de la propyzamide. Lorsque cette
protéine est moins présente, les microtubules sont plus facilement déstabilisés entraînant des dysfonctionnements lors
des divisions cellulaires (probablement le positionnement de la bande préprophasique qui est essentiel pour la bonne
orientation des divisions cellulaires). 10.4 : On observe que les bandes préprophasiques sont anormales (penchées,
dédoublées) chez les mutants en présence de propyzamide. Sachant que la bande préprophasique est essentielle pour
positionner correctement le plan de clivage cellulaire, on comprend que toute perturbation de la bande entraîne des
divisions mal orientées, provoquant une désorganisation des files de cellules dans la racine.

11.1 : Les HSPG sont constituées d'une protéine dite centrale sur laquelle sont accrochées de manière covalente des
glycosaminoglycanes (GAG) de type héparane sulfate (longue chaîne d'oses formée par la répétition d'un dimère acide
765
glucuronique ou iduronique et N-acétylglucosamine). Pour le schéma voir sur la page du site sur les MEC. 11.2 : Quand
on inhibe l'expression de Cow du côté dorsal on y observe une baisse marquée de la présence de Wingless
extracellulaire (marquage moins intense et surtout moins étendu). L'effet sur le côté ventral est présent mais nettement
moins marqué suggérant qu'un peu de Cow produit du côté dorsal pouvait diffuser du côté ventral et y jouer un rôle.
L'ajout de la forme normale de Cow dont l'expression n'est pas affectée par le microARN correspond à une expérience
de sauvetage pour vérifier si le microARN n'a bien ciblé que l'expression de Cow et pas une autre protéine, ce qui est le
cas puisqu'on retrouve les niveaux et la distribution normale de Wingless. 11.3 : Les GAG tels que les héparanes sulfates
sont accrochées à des sérines spécifiques de la protéine centrale donc il faut produire une forme mutée de la protéine
Cow où les sérines sont remplacées par un autre acide aminé. 11.4 : La forme mutée de Cow sans héparanes sulfates
n'est pas capable de sauver la distribution de Wingless (alors que son expression n'est pas ciblée par le microARN) alors
que la forme de Cow avec les héparanes sulfates avait réussi à sauver cette distribution. Il en résulte que les héparanes
sulfates sont nécessaires à Cow pour contrôler la distribution du Wingless extracellulaire dans les tissus.

12.1 Le complexe CP empêche la polymérisation des microfilaments car au cours du temps leur concentration atteint
un plateau nettement plus bas qu'en absence du complexe. 12.2 Avec un effet-dose, VASP permet une polymérisation
plus importante de l'actine malgré la présence de CP. On peut donc supposer qu'il empêche CP d'agir. 12.3 Il faudrait
vérifier si VASP a un effet sur la polymérisation de l'actine même en l'absence de CP car il est possible que VASP favorise
la polymérisation de l'actine par un mécanisme indépendant de l'inhibition de CP. Il faudrait aussi faire des expériences
dans des cellules cultivées in vitro et suivre la polymérisation de l'actine quand on inhibe l'expression de VASP ou quand
on réalise une surexpression de cette protéine.

13.1 Le promoteur MMTV n'est activé que dans la glande mammaire et permet de restreindre l'expression du transgène
à ce tissu. Une expression plus large du transgène avec un autre promoteur pourrait perturber le développement
général et la morphologie des souris de telle manière qu'une analyse des glandes mammaires ne serait plus possible.
13.2 Il s'agit probablement de stabiliser la protéine contenant le domaine intracellulaire de la E-cad car sinon, la
protéine ne pourrait pas être exprimée à la membrane plasmique et serait adressée ailleurs ou détruite. 13.3 Les lobules
sont beaucoup plus nombreux chez les souris transgéniques que chez les souris sauvages d'un stade équivalent. En
comparant B et A, on observe que les tubules sont un peu plus courts. 13.4 La surexpression du domaine intracellulaire
de la E-cadhérine peut perturber le cytosquelette car ce domaine intracellulaire se lie à des microfilaments d'actine via
les caténines. Cela peut aussi perturber la voie de signalisation Wnt car la β-caténine qui se trouve dans le complexe lié
au domaine intracellulaire de la E-cad est aussi impliquée dans cette voie. Tout cela peut perturber la morphogenèse de
la glande mammaire. 13.5 On observe que la lame basale marquée par la laminine de l'épithélium de la glande mamaire
est désorganisée chez les souris transgéniques et qu'il y a même des régions où il n'y a pas de lame basale. La lame
basale est importante pour la différenciation des épithéliums et sans doute cet épithélium mammaire n'est pas
pleinement fonctionnel ce qui peut expliquer que le lait des souris transgéniques n'est pas aussi nutritif que d'habitude
(malgré le fait qu'il y ait plus de lobules). 13.6 La surexpression du domaine intracllulaire de la E-cad influence la
morphogénèse épithéliale et notamment la formation de la lame basale ce qui indique que l'adhérence cellule-cellule
joue un rôle dans la formation de la matrice extracellulaire dans les épithéliums.

766
Exercices sur les cycles et les divisions cellulaires

EXERCICE 1

(A) On suit par western-blot quantitatif la quantité de Cycline B1 total (ligne bleu), la quantité de Cdk1 phosphorylé sur
la tyrosine 15 (ligne rouge) et on mesure l’activité de Cdk1 par sa capacité à phsophoryler l’histone H1 (ligne verte) du
stade zygote au stade 8 cellules d’embryons de xénope. (B) On suit à nouveau dans une nouvelle série de mesures la
quantité de Cycline B1, et on mesure la proportion de Cdc25C qui est hyperphosphorylée et la quantité de Cdc25C
phosphorylée sur la sérine 287. M = mitose. Source
: https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.1001788

*1.1 En quoi ces stades du développement sont-ils particuliers en ce qui concerne les cycles cellulaires ?

*1.2 Analysez et interprétez les variations de la quantité de Cycline B1.

*1.3 Expliquez la base biologique du test de l’activité de Cdk1.

*1.4 Analysez et interprétez les variations de l’activité de Cdk1.

**1.5 Que nous révèle l’analyse des oscillations de la quantité de Cdk1 phosphorylée sur la tyrosine 15 ?

**1.6 Analysez et interprétez les variations de la proportion de Cdc25C hyperphosphorylée.

**1.7 Analysez et interprétez les variations de la quantité de Cdc25C phosphorylé sur la sérine 287.

767
EXERCICE 2

Les
chercheurs de ces travaux souhaitent comprendre le rôle de la cycline B2 (CCNB2) au cours de la meiose dans des
ovocytes de souris. On extrait les protéines d’ovocytes avant ovulation issus de femelles
adultes Ccnb2+/+, Ccnb2+/- et Ccnb2-/- et (A) on effectue une analyse par western-blot avec des anticorps
reconnaissant CCNB2, CDK1 et l’actine. En B, on utilise les extraits pour phosphoryler in vitro la thréonine 320 de la
protéine PP1, une cible de CDK1. On réalise un western-blot avec un anticorps reconnaissant la forme phosphorylée
pT320-PP1 et un anticorps reconnaissant PP1 sous toutes ses formes. Ne raisonner que avec les puits 20 dans chaque
génotype. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/8/dev172734/19880/Cyclin-B2-is-required-for-
progression-through

*2.1 A quelle étape de la méiose se trouvent les ovocytes ? Quel est le génotype de ces ovocytes produits par les
femelles Ccnb2+/- ?

*2.2 Que cherche-t-on à vérifier avec le western-blot en A ?

*2.3 Que nous apprend l’expérience en B ?

Les ovocytes sont incubés avec du cilostamide qui bloque toute progression de la méiose. On enlève le cilostamide et
on observe le temps que mettent les ovocytes à réaliser la GVBD (Germinal Vesicle Break Down) qui correspond à la
« dissolution » de la membrane nucléaire et l’activation de la poursuite de la méiose. L’axe des abscisses a pour unité
les heures. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/8/dev172734/19880/Cyclin-B2-is-required-for-
progression-through

*2.4 Analysez et interprétez les résultats.

768
EXERCICE 3

On surexprime dans des cellules HeLa la protéine chimérique GFP-AurB. Des cellules-contrôles surexpriment le même
niveau de GFP. On extrait les protéines de ces cellules et on les soumet à un western-blot avec un anticorps
reconnaissant AurB ou les formes phosphorylées pAurA, pAurB, pAurC ou la tubuline ou la forme phosphorylée de
l’histone H3 (H3 est connue pour être phosphorylée par AurB). Source
: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.1018161/full

*3.1 Quels sont les effets de la surexpression de AurB-GFP sur AurA, AUrB et AurC et leurs formes phosphorylées mis
en évidence dans ce western-blot ?

*3.2 Quel est l’effet de la surexpression de AurB-GFP sur l’activité kinase de AurB sur l’histone H3 ?

On observe des cellules HeLa surexprimant GFP-AurB en mitose. L’ADN et la tubuline sont reconnus respectivement
par coloration fluorescente et immunofluorescence. Source
: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.1018161/full

*3.3 Décrivez et caractérisez les défauts observés sur ces figures mitoses (dont vous préciserez le stade).

**3.4 Qu’est-ce qui pourrait être à l’origine des défauts observés en I et K ?

REPONSES

1.1 : Ce sont des stades où il y a une oscillation entre une phase S et une phase M qui se succèdent très rapidement
(surtout à partir du stade 2 cellules). Il n’y a pas de phase G1 et pas de phase G2. Tout se déroule sans transcription. 1.2
: On observe une augmentation de la quantité de cycline B1 puis une baisse avant chaque division. La hausse est
nettement plus marquée chez le zygote avant la première division. Il s’agit des variations classiques avec accumulation
de la cycline B1 jusqu’à la métaphase puis sa dégradation par la suite lors de la dernière partie de la mitose par le
protéasome. Ici, l’augmentation de la quantité de cycline B1 ne peut pas être dûe à de la transcription (il n’y en a pas à
ce stade) mais est sans doute dûe à de la traduction. 1.3 : Cdk1 est une kinase et elle phosphoryle l’histone H1 ce qui
769
provoque la forte condensation de la chromatine en prophase de mitose. 1.4 : Les variations de l’activité de Cdk1 suit
les variations de la cycline B1 ce qui est attendu puisque l’activité kinase de Cdk1 dépend de son association avec la
cycline B1. 1.5 : La phosphorylation sur la tyrosine 15 de Cdk1 aboutit à une inhibition de son activité kinase. On observe
un pic de cette phosphorylation à chaque fois un peu avant le pic d’activité de Cdk1 ce qui veut dire que la montée de
cette activité est freinée par un mécanisme régulateur. Le relâchement de ce mécanisme aboutit au pic d’activité. 1.6 :
Cdc25C est hyperphosphorylée pendant les mitoses. Elle joue un rôle de déphosphorylation de la tyrosine 15 de CDK1
donc on peut imaginer que cette hyperphosphorylation stimule son activité phosophatase et aide à activer CDK1 lors
de la mitose. 1.7 : Les oscillations de la phosphorylation de la sérine 287 sont en opposition de phase avec les
hyperphosphorylations mitotiques de Cdc25C. On peut imaginer que la phosphorylation de la sérine 287 inhibe
l’activité de Cdc25C et l’empêche d’aller déphosphoryler la tyrosine 15 de CDK1 en dehors de la mitose.

2.1 : Des ovocytes non ovulés chez des souris adultes sont bloqués en prophase I de méiose. La première division de
méiose n’a pas encore séparé les chromosomes paternels et maternels, donc les ovocytes des
femelles Ccnb2+/- possèdent un allèle sauvage et un allèle muté perte-de-fonction. 2.2 : On vérifie que l’expression de
CCNB2 est bien abolie dans les ovocytes issus des femelles Ccnb2-/- et que l’expression est diminuée environ de moitié
dans les ovocytes issus des femelles Ccnb2+/-. Le western-blot permet aussi de vérifier que l’expression du partenaire
de CCNB2, CDK1 n’est pas affecté par sa diminution ou son absence. 2.3 : On observe qu’en absence de CCNB2, CDK1 est
nettement moins capable de phosphoryler PP1 (moins de la forme phosphorylée avec autant de PP1 total). On en déduit
que CCNB2 est nécessaire à la bonne activité kinase de CDK1 (au moins lorsque sa cible est PP1). 2.4 : Lorsqu’il y a une
diminution de la quantité de CCNB2 (et encore plus lorsqu’il n’y en a plus), la reprise de la méiose prend plus de temps.
Notons tout de même qu’elle a lieu donc CCNB2 n’est pas entièrement nécessaire mais permet d’accélérer le processus.
On peut imaginer que d’autres cyclines B et notamment cycline B1 (CCNB1) peuvent finir par compenser l’absence de
CCNB2.

3.1 : On observe que la surexpression de GFP-AurB fait baisser un peu la production de AurB endogène (bande plus
basse sur le western-blot car sans la GFP qui fait 27 kDa) et sa phosphorylation. GFP-AurB est aussi présente sous une
forme phosphorylée (en quantité plus importante que la forme endogène phosphorylée). La quantité de AurA
phosphorylée reste identique mais la quantité de AurB et de AurC phosphorylée est diminuée. 3.2 : Il y a moins de forme
phosphorylée de l’histone H3 lorsque GFP-AurB est surexprimé. Il faudrait toutefois connaître la quantité totale de
l’histone H3 pour vérifier qu’il s’agit juste bien d’un manque d’activité kinase ou s’il y a indirectement une baisse de
l’expression de l’histone H3 (phosphorylée ou non). 3.3 : I) Métaphase. L’un des chromosomes ne semble pas aligné
avec les autres sur la plaque métaphasique. K) Fin anaphase. L’un des chromosomes est resté sur la plaque
métaphasique. M) Métaphase. Il y a un fuseau mitotique multipolaire (et non seulement bipolaire). 3.4 : Il pourrait s’agir
d’un dysfonctionnement des kinétochores qui ancrent les microtubules au centromère ce qui permet de contrôler les
déplacements des chromosomes lors des phases de la mitose.

770
Exercices sur les voies de signalisation

EXERCICE 1 : sur la voie BMP

(a) Un blastomère d'embryons à deux cellules de souris a été injecté avec des ARNm permettant de produire une forme
dominante négatif de Smad4, dnSmad4 (n = 21), une forme dominante négative du récepteur Bmpr2, dnBmpr2 (n =
22). Tous les embryons ont été co-injectés dans le même blastomère avec des ARNm permettant de produire GAP43-
RFP. GAP43 est une protéine membranaire sans effets connus dans les embryons précoces de souris. Les contrôles ont
été injectés avec les ARNm GAP43-RFP seuls dans un des 2 blastomères). Les embryons ont cultivés jusqu'à E4.5. (b)
Nombre total de cellules pour chaque lignée dans la moitié injectée de l'embryon. (c) Nombre total de cellules et
contributions de la lignée par rapport au témoin. PE = endoderme primitif; EPI = épiblaste; TE = trophectoderme. Source
: https://www.nature.com/articles/ncomms6667

*1.1 : A quoi sert l'injection des ARNm de GAP43-RFP ?

*1.2 : Comment s'appelle un embryon de souris à E4,5 ?

*1.3 : Qu'est-ce qu'un dominant négatif ?

**1.4 : Imaginez quelle pourrait être le mode de fonctionnement d'un dominant négatif de Smad 4 ? Et d'un dominant-
négatif de Bmpr2 ?

*1.5 : Quel est l'effet des dominants-négatifs sur le nombre de cellules ?

*1.6 : Quel est l'effet des dominants-négatifs sur la destinée des cellules ? Conclure sur la fonction de la voie BMP.

771
EXERCICE 2 : sur la voie Wnt

Les embryons de souris mutantes Tie2-Ezh2-KO (mutation perte-de-fonction du gène Ezh2) présentent un défaut de
formation des progéniteurs érythro-myéloïdes dans la vésicule vitelline. (A) Immunofluorescence avec un anticorps
anti-beta-caténine des cellules dans la vésicule vitelline qui auraient dû donner des progéniteurs. On effectue aussi une
coloration au DAPI. (B) Des explants de vésicules vitellines sauvages sont mis en culture et leur capacité à générer des
colonies de cellules érythroïdes et myéloïdes est testée (CFU = colony forming units). DMSO = solvant utilisé pour diluer
les autres molécules; GSK126 = inhibiteur de Ezh2; CHIR99021 = inhibiteur de l'activité kinase de GSK3beta; IWP2 =
bloque la phosphorylation de LRP6. Source : https://www.nature.com/articles/s41467-021-27140-8

*2.1 Que constatez-vous sur la figure A ? Qu'est-ce que cela veut dire en ce qui concerne le contrôle de la transcription
?

*pour CHIR99021; **pour IWP2 2.2 Expliquez l'action de CHIR99021 et de IWP2 sur la voie Wnt.

*2.3 Est-ce que les résultats en B pour GSK126 seul et CHIR99021 seul confirment les résultats de la figure A ?

**2.4 Analysez le résultat avec IWP2. Interprétez.

**2.5 Analysez les résultats avec GSK126+CHIR99021 et GSK126+IWP2.

772
EXERCICE 3 : sur la voie Shh

La mutation S352F dans la protéine Sufu est retrouvée chez des patients atteints d'un cancer du cervelet, le
médulloblastome. (A) On fait exprimer la forme taguée par HA de Sufu sauvage (WT) ou mutée S532F dans des cellules
NIH3T3. On traite les cellules avec du cycloheximide et on analyse les extraits protéiques à 0, 3, 6 et 12 heures après cet
ajout par un western-blot et des anticorps anti-HA et anti-GAPDH. Dans le cas des cellules exprimant Sufu-S352F on
ajoute également des siRNA contre Fbxl17 qui est une E3 ubiquitine ligase (un premier siRNA Fbxl17 (1) et un deuxième
Fblx17 (2)). (B) Une construction permettant l'expression de la luciférase sous le contrôle du promoteur de Gli1 (une
cible de la voie de signalisation Shh) est introduite dans des cellules n'exprimant plus Sufu (Sufu-/-), des cellules
sauvages (WT) et des cellules exprimant la forme mutée de Sufu. L'activité luciférase est mesurée en absence (DMSO)
et en présence d'un agoniste de la voie Shh (SAG) et on présente dans le graphique le rapport entre les deux.

**3.1 Quel est l'avantage d'utiliser une forme taguée HA de Sufu ?

*3.2 Interprétez les résultats de l'expérience avec le cycloheximide sans les siRNA.

*3.3 Analysez et interprétez les résultats avec les siRNA ? Pourquoi utilise-t-on deux siRNA différents contre Fblx17 ?

**3.4 D'après la description de l'activité de Fblx17, émettez des hypothèses sur ses relations avec Sufu.

*3.5 Comment appelle-t-on le gène de la luciférase dans ce contexte ? Comment révéler l'activité de ce gène ?

**3.6 Analysez et interprétez les résultats obtenus en B.

EXERCICE 4 : sur la voie BMP

Des cellules ES de souris sont soumis à un protocole pour les faire différencier en tissu neural. Ces cellules proviennent
d'une lignée transgénique où la GFP est sous le contrôle du promoteur du gène Sox1, qui est exprimé précocement au
cours de l'induction neurale. On applique différents traitements (sauf pour NT = non traité). FK/CsA est un traitement
qui inhibe la calcineurine. (A) Quantification des cellules positives GFP à jour 12 du protocole par FACS.
(B) Analyse par western-blot avec des anticorps reconnaissant les formes phosphorylées de Smad1/5 sur les sérines
463 et 465, toutes les formes de Smad1 et Smad5 ainsi que l'actine dans les cellules traitées avec les molécules indiquées
durant 1h. (C) Analyse par western-blot des fractions protéiques nucléaires et cytoplasmiques. TBP = TATA-binding
protein TBP. CnB1 = calcineurine. Les cellules ont été traitées avec les molécules indiquées pendant 1h. OA : acide

773
okadaïque, un inhibiteurs d'autres phosphatases que la calcineurine. Source :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4011666/pdf/nihms-568915.pdf

*4.1 Quel est l'intérêt d'utiliser des cellules avec la construction promoteur de Sox1::GFP ?

*4.2 A quoi correspondent les deux pics observés sur les résultats du FACS ?

*4.3 Quels sont les effets de BMP4 et de Noggin sur l'expression de la GFP ? Interprétez.

*4.4 Que se passe-t-il lors du traitement avec FK/CsA ? Puis quand on ajoute Noggin à FK/CsA ?

**4.5 Analysez et interprétez les résultats en B. Est-ce qu'il y a un résultat surprenant dans ce blot ?

*4.6 A quoi sert la présence de TBP et tubuline dans l'analyse western-blot en C ?

**4.7 Analysez l'effet de BMP4 dans la figure C.

**4.8 Analysez l'effet de FK/CsA dans la figure C.

**4.9 Quel est l'intérêt du traitement avec l'acide okadaïque ?

**4.10 Etablissez un modèle (sous forme de schéma par exemple) de l'ensemble des résultats.

EXERCICE 5 : sur la voie Notch

On injecte au stade 2 cellules dans un des 2 blastomères des ARNm permettant de coder diverses protéines dans
l'embryon de xénope. On co-injecte l'ARNm de LacZ. On laisse les embryons se développer jusqu'au stade souhaité. On
les incube avec de la dexaméthasone puis on les fixe un peu plus tard. On fait une coloration X-gal et on traite les
embryons en hybridation in situ avec des sondes reconnaissant les ARNm de Xslug et de FoxD3, deux gènes exprimés
dans les cellules de crêtes neurales. Le côté injecté est indiqué par des flèches. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/131/2/347/42470/Interplay-between-Notch-signaling-and-the

*5.1 A quelle étape du développement sont les embryons sur ces photos ?

*5.2 NICD correspond au domaine intracellulaire C-terminal de Notch. Que cherche-t-on à faire en l'exprimant ?

*5.3 GR veut dire récepteur aux glucorticoïdes. Les protéines avec GR ne peuvent rentrer dans le noyau que si les
embryons sont traités avec la dexaméthasone. Quel est l'intérêt d'accoler la séquence de GR à celle de NICD ?

*5.4 Quel est l'intérêt de co-injecter les embryons avec l'ARNm de LacZ ?

*5.5 Quel est l'effet de NICDGR sur la spécification des crêtes neurales ?

*5.6 Quel est le rôle de Su(H) dans la voie de signalisation Notch ?

*5.7 Ici, c'est une forme inductible et constitutivement active de Su(H) qui est exprimée. Est-ce que les résultats obtenus
sont cohérents avec ceux obtenus précédemment avec NICD ? Que nous apportent ces résultats ?
774
*5.8 DlStu et Su(H)DBMGR sont des formes dominante-négative respectivement de Delta et de Su(H) ? Que veut dire
l'expression dominant-négatif ? Interprétez les résultats de l'expérience.

EXERCICE 6 : sur la voie Wnt

On cherche à connaitre la fonction de la protéine AAK1 sur la voie Wnt. On a transfecté dans les cellules de fibrosarcome
humain étudiées des vecteurs d'expression du gène rapporteur, la luciférase de luciole, sous le contrôle de séquence de
fixation de LEF/TCF. On introduit aussi un vecteur d'expression de la luciférase de Renilla qui demande d'autres
substrats et émet à une autre longueur d'onde mais dont l'expression n'est pas contrôlée par les séquences de fixation
de LEF/TCF (mais par un promoteur toujours actif). (A) Les cellules de fibrosarcome humain ont été transfectées avec
des siARN indiqué pendant 56 heures, puis traitées avec WNT3A ou CHIR99021, un inhibiteur de GSK3beta pendant 16
heures (à gauche, LOF). Les cellules ont été transfectées avec la construction d'ADN de surexpression indiquée et
laissées récupérer pendant 12 heures. Les cellules ont ensuite été traitées avec WNT3A ou CHIR99021 pendant 16
heures (à droite, GOF). (B) dosage des activités luciférase à partir de cellules transfectées comme précédemment par
les vecteurs d'expression des luciférases et les constructions d'expression indiquées. Douze heures après la
transfection, les cellules ont été traitées pendant 16 heures avec du surnageant de cellules contrôle (Lcell CM) ou du
surnageant de cellules excrétant WNT3A (WNT3A CM. et ensuite testées pour l'activité luciférase. AAK1-74A est une
forme de AAK1 qui n'a plus d'activité kinase et AAK1-AID est une forme tronquée de AAK1. Ne pas tenir compte du
western-blot (C) On refait la même expérience que précédemment mais cette fois-ci en présence de siARN pour des
isoformes de la clathrine CLTC-A et CLTC-B. (D) On refait les expériences précédentes avec des siARN contre AAK1 et
en présence de la chlorpromazine qui est un inhibiteur de l'endocytose médiée par la clathrine. Ne pas tenir compte des
expériences en E. Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(18)31953-3

**6.1 Quel est l'intérêt d'étudier le rapport activité luciférase de luciole/activité luciférase de Renilla avec un système
tel que décrit dans la légende de la figure ?

*6.2 Analysez et interprétez les résultats de la figure A. A quel niveau AAK1 agit en relation avec la voie de signalisation
considérée ?

775
*6.3 Quelles informations nous apporte la figure B ?

*6.4 Analysez et interprétez les résultats de la figure C.

*6.5 Quel est l'intérêt de l'expérience de la figure D ? Quelles conclusions tirez-vous de cette expérience ?

**6.6 Conclure sur l'ensemble des résultats A à D et posez des hypothèses sur la fonction d'AAK1.

EXERCICE 7 : sur la voie Wnt et la voie Hedgehog

A) Les cellules HEK-293 ont été transfectées de manière transitoire avec Gli1 (avec un tag MYC) pendant 24 heures,
puis stimulées avec le milieu conditionné (CM) par des cellules HEK-293 sécrétant Wnt-1 pendant 3 h. Les cellules ont
été lysées et fractionnées. En outre, sFRRP-1 qui est une forme de Frizzled secrété a été inactivé par un siARN dans
certains cas. Des quantités équivalentes de protéines de chaque fraction cytosolique ont été analysées par western-blot
avec des anticorps monoclonaux contre la beta-caténine. B) L'expression du gène cible de la voie canonique Wnt, DKK1,
a été examinée par RT-qPCR dans les mêmes conditions que les expériences précédentes. Le niveau relatif de DKK1 a
été déterminé par comparaison avec le contrôle interne, l'ARN 18S.
C) Les cellules SIIA (qui ont naturellement une voie Hedgehog active) ont été traitées avec 2,5 µM de cyclopamine
(cyclo), un inhibiteur de Smoothened, pendant 24 h, puis stimulées avec du milieu conditionné (CM) par des cellules
HEK-293 sécrétant Wnt-1 pendant 3 h. Les protéines cytosoliques ont été analysées par western-blot comme
précédemment. Source : DOI 10.1074/jbc.C600200200

*7.1 Dans quelle voie de signalisation est impliqué Gli1 ? Quel est son rôle ?

*7.2 Analysez et interprétez les résultats sans vous occuper des expériences avec le siARN sFRP-1.

*7.3 Dans quel compartiment la beta-caténine agit-elle lorsque la voie Wnt est activée ? Qu'auriez-vous fait pour le
vérifier dans le cadre de ces expériences ?

*7.4 Sachant que sFRP-1 est capable de fixer Wnt dans le milieu et que c'est une protéine extracellulaire, non
transmembranaire, quel est l'effet de sFRP-1 sur la voie Wnt en général ?

*7.5 Quelles informations supplémentaires nous apportent les expériences avec le siARN sFRP-1 ? Interprétez.

*7.6 Quelles sont les conclusions à tirer de l'expérience B ?

*7.7 Quelle voie est activée ou inhibée par la cyclopamine ?

*7.8 Quel est l'intérêt d'utiliser les cellules SIIA ? Analysez les résultats en C.

**7.9 Présentez un modèle de l'ensemble des résultats. Proposez des expériences pour tester votre modèle.

776
EXERCICE 8 : sur la voie FGF

On séquence à partir de l’ADN génomique de deux patients atteints par le syndrome de Crouzon (qui est caractérisé par
une malformation cranofaciale) le gène codant le récepteur FGFR2. La séquence de la protéine sauvage (Homo sapiens)
et mutante (Mutant) résultante est comparée avec la séquence de diverses espèces de mammifères. Source
: https://www.mdpi.com/2073-4409/11/19/3129

*8.1 Que constatez vous sur les résultats du séquençage d’ADN et que concluez-vous ?

*8.2 Que nous apporte les comparaisons de la séquence protéique ?

Des cellules MC3T3 sont transfectées avec un vecteur d’expression permettant d’exprimer la forme sauvage de FGFR2
(WT) ou la forme mutée caractérisée précédemment (MT). Les cellules sont cultivées dans un milieu où du FGF est

777
présent puis les protéines sont extraites et analysées en western-blot (p désigne les formes phosphorylées des
protéines, t = toutes les formes). RPS18 est utilisé comme contrôle de dépôt. Source : https://www.mdpi.com/2073-
4409/11/19/3129

*8.3 Avec les résultats présentés, que peut-on conclure au sujet de l’effet de la mutation sur la voie de signalisation FGF
?

EXERCICE 9 : sur la voie Wnt

On souhaite mieux connaître les mécanismes de l’entrée dans le noyau de la β-caténine. On injecte dans la future région
ventrale d’embryons de xénope au stade 4 cellules les ARNm codant les protéines présentées en haut à gauche. Il s’agit
de la β-caténine humaine « sauvage », de la β-caténine humaine avec deux acides aminés modifiés (P687 et M688 en
alanine) et de la β-caténine ainsi mutée avec un domaine NLS qui permet d’entrer dans le noyau. Des embryons non
injectés sont également analysés (UIC). Les images présentent des cas représentatifs à deux stades différents de ce qui
est classé comme embryon à un axe et embryon à double axe. Le graphique présente le pourcentage d’embryons à
double axe. Source : https://elifesciences.org/articles/70495

*9.1 Avec vos connaissances, expliquez rapidement pourquoi l’injection de la β-caténine sauvage dans la future région
ventrale d’un embryon de xénope induit un double axe.

*9.2 Analysez et interprétez les résultats de l’expérience.

EXERCICE 10 : sur la voie Notch

(I) On cultive des cellules HeLa dans des conditions de culture où la voie Notch est activée en présence de DMSO
(solvent) ou d'une molécule dont on chercher à savoir comment elle influence la voie Notch (CB-103). Les cellules
HeLa avaient préalablement été transfectées par un vecteur permettant l'expression de la protéine fusion N1-ICD-GFP
(domaine intracellulaire de Notch1 couplé à la GFP). Une coloration DAPI est également réalisée. (J) On mesure
l'activité luciférase dans les cellules HeLa en condition activatrices de la voie Notch et transfectées au préalable par
une construction avec le gène codant la luciférase sous le contrôle des séquences activées par RBPJ associé à N1-ICD.
Dans certains cas, les cellules sont co-transfectées avec un vecteur permettant l'expression de MAML1, une protéine
de type Mastermind et habituellement recruté par RBPJ associé à N1-ICD pour initier l'expression des gènes cibles de
la voie Notch. Les quantités de MAML1 exprimés sont faible, moyenne ou forte (gradient représenté). Les cellules sont
traitées par le solvent (DMSO) ou CB-103. Source : https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1922606117

778
*10.1 Quel est l'effet testé de CB-103 sur la voie Notch ? Que nous permet de connaître le DAPI ? Cet effet a-t-il lieu ?

*10.2 Quel est l'effet de CB-103 qui est mis en évidence dans cette expérience ? (ne tenir compte pour l'instant que de
l'expérience avec une co-expression faible de MAML1)

**10.3 Comment concilier ces observations avec celles de l'expérience I ? Proposez des hypothèses pour expliquer l'effet
de CB-103.

**10.4 Que nous apprend l'expérience avec les concentrations croissantes de MAML1 ?

REPONSES

1.1 : La fluorescence sert à distinguer les cellules descendantes du blastomère injecté et des cellules descendantes du
blastomère non injecté et qui servent de contrôle interne à chaque embryon. 1.2 : un blastocyste. 1.3 : c'est une protéine
(ou un gène muté codant une protéine) qui non seulement est inactive mais aussi empêche les protéines normales
d'agir. 1.4 : Le dominant négatif de Smad4 pourrait se fixer à Smad1/5/8 sans pouvoir activer la transcription. Le
dominant-négatif de Bmpr2 pourrait former un hétérodimère avec le récepteur normal sans activer de voie de
transduction. 1.5 : il y a une diminution du nombre total de cellules ce qui montre un effet sur la prolifération ou sur la
survie des cellules. 1.6 : il y a moins de détermination en TE et PE et plus de détermination en EPI. La voie BMP oriente
la détermination des cellules de l'embryon de souris vers le TE et le PE (qui sont les deux lignages extra-embryonnaires,
contrairement à EPI).

2.1 : Il y a plus de beta-caténine dans le noyau, ce qui veut dire que ses gènes cibles sont sans doute plus transcrits. 2.2
: CHIR99021 inhibe GSK3beta qui ne pourra donc pas phosphoryler beta-caténine et donc celle-ci ne sera pas dégradée
et pourra entrer dans le noyau et activer la transcription. C'est un activateur de la voie Wnt. IWP2 inhibe la
phosphorylation de LRP6 ce qui va l'empêcher d'arrimer Axin et d'inhiber l'activité kinase de GSK3beta. C'est un
inhibiteur de la voie Wnt. 2.3 : Chez le mutant, il n'y a pas d'activité Ezh2 et il y a moins de précurseurs érythro-
myéloïdes produits. Cela se retrouve ici avec GSK126 qui inhibe Ezh2 et diminue le nombre de colonies produites. Chez
le mutant, l'activité beta-caténine dans le noyau est renforcée, ce que fait aussi CHIR99021 et on obtient également
moins de colonies. 2.4 : Il y a moins de colonies formées, or IWP2 est un inhibiteur de la voie Wnt et doit aboutir à une
moindre activité nucléaire de beta-caténine. Ce résultat est inattendu, cependant on peut imaginer que pas de voie Wnt
activée peut avoir le même résultat que trop de voie Wnt activée. 2.5 : Il n'y a pas beaucoup de changement avec le
traitement avec GSK126+CHIR99021 par rapport aux molécules seules : dans toutes les situations on activait la voie
Wnt et elle ne peut pas sans doute être plus activée. Dans le cas de GSK126+IWP2, on constate une augmentation
significative de la formation de colonies par rapport à GSK126 seul : GSK126 active indirectement la voie Wnt mais
IWP2 l'inhibe ce qui compense et permet à plus de colonies de se former.

3.1 : Avec la tag HA, on est sûr que l'anticorps anti-HA reconnaîtra notre protéine d'intérêt même si elle change de
conformation à la suite de la mutation S532F. Le tag HA peut aussi permettre de pallier l'absence d'anticorps disponible
contre une protéine. 3.2 : Alors que le contrôle GAPDH reste au même niveau, on voit la protéine Sufu-HA de moins en
moins présente au fur et à mesure du temps. Elle est dégradée (et le cycloheximide assure que pas de nouvelles
protéines la remplace). On constate que la dégradation de la forme mutée est plus rapide que celle de la forme sauvage.
3.3 : L'inhibition de l'expression de Fblx17 aboutit à une dégradation plus lente de Sufu mutée. Elle devient même plus
lente que celle de la protéine sauvage à gauche. Cela veut dire que Fblx17 est nécessaire pour la dégradation de Sufu
(celle normale de la forme sauvage et celle accélérée de la forme mutée). On utilise deux siRNA différents car les siRNA
peuvent dans certains cas inhiber la traduction d'autres ARNm que ceux ciblés. Si on a le même phénotype avec deux
siRNA, cela indique que les effets sont spécifiques. 3.4 Fblx17 est une E3 ubiquitine ligase et donc participe à
l'ubiquitinylation de protéines qui sont ainsi désignées pour la dégradation dans le protéasome. Il est donc probable
que Fblx17 fait partie du complexe qui ubiquitinyle Sufu et l'envoie se faire dégrader. 3.5 La luciférase est un gène
rapporteur qui code une enzyme qui catalyse une réaction de bioluminescence en présence de son substrat, la luciférine
(et d'O2, d'ATP et de Mg2+). On réalise la réaction dans un luminomètre qui détecte les photons produits. 3.6 Dans les
conditions normales, l'activation de la voie Shh aboutit bien à l'augmentation de la transcription à partir du promoteur
de Gli1. En absence de Sufu, l'activation de la voie Shh ne change rien à l'activité luciférase (qui doit être très élevée; on
ne connait pas la valeur absolue de l'activité luciférase mais l'activité relative avec agoniste/sans agoniste). Lorsque
Sufu est mutée, l'activation lorsque la voie Shh est activée par rapport à lorsqu'elle n'est pas activée est très importante.
La cellule répond trop fort, sans doute car Sufu est mutée est dégradée particulièrement rapidement et qu'elle est une
inhibitrice de l'activation du promoteur de Gli1.

4.1 : La GFP est une protéine rapportrice facilement visible sur des cellules vivantes et donc juste en illuminant avec un
laser bleu les cellules en cours de traitement, on peut suivre l'induction neurale dans les cellules en temps réel. 4.2 : Le
premier pic correspond sans doute au bruit de fond de fluorescence GFP lié au fait que le promoteur de Sox1 est un peu

779
actif (phénomène de fuite). Le deuxième pic à droite correspond en revanche à une activation "physiologique" du
promoteur qui contrôle la GFP. 4.3 : BMP4 a un effet inhibiteur sur l'expression de la GFP ce qui veut dire que le
promoteur de Sox1 est moins activé et donc que l'induction neurale est inhibée. Noggin a un effet inverse et est un fort
stimulateur de l'induction neurale. On sait que Noggin est un inhibiteur des BMP. Cela veut dire aussi qu'en dehors d'un
traitement spécifique avec BMP4, les cellules produisent de manière endogène du BMP que Noggin est capable de
piéger. 4.4 : L'inhibition de la calcineurine abolit l'activation du promoteur de Sox1 ce qui suggère que la calcineurine
est nécessaire à l'induction neurale. En présence de Noggin, sans calcineurine active, l'induction neurale est nettement
plus faible qu'en présence de calcineurine active. Néanmoins, elle a lieu ce qui montre que la calcineurine n'est pas
complètement indispensable mais est un stimulateur de l'induction neurale. 4.5 : Le traitement avec BMP4 comme
attendu augmente fortement la phosphorylation de Smad1/5 et le traitement avec Noggin fait disparaître la faible
phosphorylation visible dans les cellules non traitées (signe qu'il y avait de la signalisation BMP d'origine endogène aux
cellules). Pour ce traitement Noggin, on constate une baisse inattendue du niveau total d'expression de Smad5, alors
que le niveau contrôle d'actine est le même que dans les autres puits et que le niveau total de Smad1 est normal.
L'inhibition de la calcineurine augmente la phosphorylation de Smad1/5 ce qui montre qu'en temps normal, la
calcineurine s'oppose à la voie de signalisation BMP. Sans la calcineurine active, le traitement par Noggin laisse
"échapper" quand même une très faible phosphorylation de Smad1/5 mais il est difficile d'interpréter avec un niveau
de Smad1 et de Smad5 total plus important qu'avec Noggin seul. 4.6 : TBP est une protéine nucléaire (c'est un élément
d'un facteur de transcription central) et donc son étude permet de vérifier que la purification des fractions nucléaires
et cytoplasmiques a été bien faite. On constate d'ailleurs qu'il y a un peu de TBP dans la fraction cytoplasmique ce qui
indique qu'elle n'est pas totalement pure et a été contaminée avec des protéines nucléaires mais le niveau est très faible
par rapport à la fraction nucléaire. La tubuline est une protéine cytoplasmique donc c'est le contrôle pour la fraction
correspondante. 4.7 : BMP4 renforce les diverses phosphorylations de Smad1 et de Smad5 dans la fraction
cytoplasmique et surtout dans la fraction nucléaire. On voit aussi plus de protéines Smad1 et Smad5 totales dans le
noyau. La signalisation activée par BMP4 provoque l'entrée de Smad1 et de Smad5 dans le noyau (associée à Smad4 qui
n'est pas étudié ici). BMP4 ne change pas l'expression et la répartition de la calcineurine CnB1. 4.8 : L'inhibition de la
calcineurine augmente la présence des Smad1/5 phosphorylées dans le noyau mais pas autant que BMP4. Les
inhibiteurs de la calcineurine ne changent pas la quantité et la répartition de la protéine ce qui montre qu'ils n'agissent
pas sur son expression ou son adressage. 4.9 : L'acide okadaïque n'a pas les mêmes effets que les inhibiteurs plus
spécifiques FK/CsA. Donc cette expérience permet de montrer l'aspect spécifique de la fonction de la calcineurine. Ce
n'est pas n'importe quelle phosphatase qui a ses effets mais seulement la calcineurine. 4.10 : Proposition de modèle :
BMP inhibe l'induction neurale en inhibant la transcription de Sox1 via la phosphorylation et l'entrée dans le noyau de
Smad1/5. La calcineurine s'oppose à l'action des BMP en déphosphorylant Smad1/5 et en empêchant leur entrée dans
le noyau.

5.1 : A la fin de la neurulation (les crêtes neurales sont spécifiées et prêtes à migrer). 5.2 : Le domaine intracellulaire de
Notch est libéré de la protéine transmembranaire lorsque la voie Notch est activée. Ici, on cherche à avoir une activation
constitutive de la voie Notch, même en l'absence de ligand. 5.3 : NICD ne peut entrer dans le noyau qu'au moment
souhaité par l'expérimentateur. Son action est ainsi inductible car NICD soit rentrer dans le noyau pour activer la
transcription. 5.4 : L'expression de la beta-galactosidase visible après incubation avec du Xgal permet de reconnaître le
côté (gauche ou droit) où l'embryon a été injecté. Le côté opposé sert de contrôle interne. 5.5 : On observe une
expression plus étendue et plus intense de 2 marqueurs de crêtes neurales. On en déduit que l'activation constitutive
de la voie Notch suffit à augmenter la spécification des cellules en crêtes neurales (CCN). On ne peut formellement pas
exclure qu'il y a une plus grande prolifération de CCN déjà spécifiées. 5.6 : Su(H) est le facteur de transcription auquel
s'associe NICD dans le noyau pour contrôler l'expression de ses gènes cibles. 5.7 : L'activation constitutive de Su(H) a
les mêmes effets que l'activation constitutive de son inducteur Notch donc c'est cohérent. Le résultat montre que Notch
agit bien par la voie de signalisation classique et non pas par une voie moins "canonique". 5.8 : un dominant-négatif est
une protéine (ou un gène muté codant une protéine) qui non seulement est inactive mais aussi empêche les protéines
normales d'agir. On observe l'effet inverse de l'activation constitutive de Notch et de Su(H) avec une expression
nettement plus faible de Xslug et de FoxD3. Cela montre que la signalisation Notch est nécessaire à la bonne spécification
des CCN et qu'elle a bien un rôle endogène normal (l'expression des formes constitutivement actives des premières
expériences n'a fait qu'amplifier une signalisation qui existe déjà et non pas introduit une signalisation complètement
nouvelle).

6.1 : Ce rapport permet de tenir compte des variations de transfection et de ne tenir compte de la part d'expression de
la luciférase qui ne dépend que des séquences de fixation LEF/TCF (donc de l'activité de la voie de signalisation
Wnt/beta-caténine). 6.2 : L'activité luciférase spécifique liée à la voie Wnt/beta-caténine en présence de WNT3A est
augmentée si l'expression de AAK1 est inhibée. En cas de surexpression de AAK1, on obtient l'inverse, ce qui montre
bien qu'AAK1 est nécessaire et suffisant pour inhiber la voie Wnt/beta-caténine. Par contre, sa surexpression ou son
absence ne change à la réponse cellulaire à un inhibiteur de GSK3beta. Cela indique que AAK1 agit en amont de
GSK3beta. 6.3 : Tandis que l'inhibition de l'activité de la voie Wnt/beta-caténine est diminuée de moitié environ en
présence de AAK1, il n'y a plus d'inhibition lorsque son activité kinase est abolie ou lorsqu'il manque une partie de la

780
protéine. C'est cette partie qui doit contenir le domaine qui intervient pour inhiber la voie Wnt. 6.4 : Sans la clathrine,
l'activation de la voie Wnt/beta-caténine en réponse à WNT3A est nettement plus faible et la présence ou l'absence de
AAK1 ne change plus l'activation de cette voie. On en déduit qu'en temps normal, la clathrine (et probablement son rôle
dans l'endocytose) est importante pour l'activation de la voie Wnt mais que AAK1 a besoin de la clathrine pour avoir
un effet sur cette voie. 6.5 : L'implication de la clathrine a suggéré que l'endocytose était impliquée dans les processus
observés. La clathrine pourrait cependant jouer d'autres rôles dans la cellule. Il s'agit de vérifier que c'est bien
l'endocytose médiée par la clathrine qui a un effet sur le système. On cherche aussi à vérifier l'interaction de l'inhibition
de cette endocytose avec une perte d'expression d'AAK1. Cette vérification est positive. Avec une dose modérée de
l'inhibiteur de l'endocytose, on peut voir que l'on affecte spécifiquement l'effet de l'inhibition d'AAK1 sans affecter
l'action de Wnt3A. 6.6 : AAK1 est un inhibiteur de la voie Wnt/beta-caténine qui agit en amont de GSK3beta et la
nécessité de l'endocytose médiée par la clathrine pour le voir agir indique qu'il est actif à cette étape là. L'endocytose
des récepteurs (ou des co-récepteurs) d'un ligand est un point de contrôle important d'une voie de signalisation. AAK1
doit agir via son domaine kinase dont il doit phosphoryler une protéine cible (on peut imaginer que c'est la clathrine ou
une protéine associée).

7.1 : L'expression de Gli1 est activé par la voie Hedgehog et ensuite c'est un facteur de transcription activateur des gènes
cibles de cette voie. 7.2 : L'ajout du milieu avec Wnt1 augmente la quantité de beta-caténine dans le cytoplasme comme
attendu, et on sait par d'autres expériences que cela est dû à l'inhibition de sa dégradation mais cet effet n'a pas lieu en
présence de Gli1 (rapport proche de 1). Gli1 ou ses gènes cibles s'opposent donc à la voie de signalisation canonique
Wnt en amont de la stabilisation de la beta-caténine. 7.3 : La beta-caténine agit dans le noyau. En s'associant avec les
facteurs de transcription LEF/TCF elle active la transcription de gènes cibles. Ici, on n'observe que l'accumulation dans
le cytoplasme qui se traduit en général par une entrée dans le noyau. Il faudrait étudier par western-blot les extraits
nucléaires ou étudier l'expression d'un gène rapporteur sous le contrôle de séquences consensus de fixation de
LEF/TCF. 7.4 : Il fixe le ligand des récepteurs Frizzled transmembranaires qui sont en compétition avec lui. Par
conséquent, l'expression de sFRP-1 aura un effet inhibiteur sur la voie Wnt. 7.5 : En absence de sFRP-1 causée par le
siARN, l'effet inhibiteur de Gli1 sur la stabilisation de la beta-caténine n'existe plus. Par conséquent, sFRP-1 est
nécessaire pour que Gli1 puisse agir et inhiber la voie Wnt. 7.6 : Sachant que Dkk est une cible de la voie Wnt canonique,
on teste si l'accumulation de beta-caténine dans le cytoplasme observée en A se traduit par une entrée dans le noyau et
une activation de la transcription. C'est effectivement ce que l'on constate et les effets observés sont tout à fait similaires
à ceux obtenus en A. Gli1 et sFRP-1 n'ont pas d'action particulière en aval de l'accumulation cytoplasmique de la beta-
caténine. 7.7 : La cyclopamine inhibe Smoothened dont elle inhibe la voie Hedgehog. 7.8 : Dans les cellules SIIA, la voie
Hedgehog est naturellement active donc pas besoin de transfecter Gli1. On observe les mêmes résultats que pour les
HEK transfectées par Gli1. Lorsque la voie Hedgehog est inhibée par la cyclopamine on retrouve une accumulation
cytoplasmique de beta-caténine en présence de WNT. 7.9 : La voie Hedgehog active l'expression de Gli1 qui stimule
l'expression de sFRP-1 qui inhibe la voie Wnt. Il faudrait étudier par RT-qPCR ou par western-blot l'expression de sFRP-
1 en présence ou en absence de Gli1.

8.1 : On observe qu’une position du séquençage est représentée par deux nucléotides différents ce qui indique que les
2 allèles présents dans le génome des patients n’ont pas la même séquence (hétérozygotie). L’un des allèles chez les
patients présente un C à la place d’un T. Si c’est la mutation qui est à l’origine du phénotype (à prouver) alors elle serait
dominante. 8.2 : L’allèle muté code une protéine avec une arginine à la place d’une cystéine en position 342. C’est un
changement d’un type d’acide aminé en un type d’acide aminé très différent ce qui laisse à penser que l’effet sur la
conformation de la protéine sera significatif d’autant plus que cette cystéine est très conservée chez les Mammifères,
contrairement à d’autres acides aminés voisins. 8.3 : On observe une augmentation relative de la phosphorylation de
FGFR et de ERK lorsque la protéine est mutée par rapport à la protéine sauvage alors les quantités totales de ces
protéines sont les mêmes. Cela indique une hyperactivation de la voie FGFR/ERK en présence de FGF. On ne sait pas si
c’est une activation constitutive car il aurait fallu aussi cultiver les cellules dans un milieu sans FGF.

9.1 : La surexpression de la β-caténine dans la région ventrale lui permet de compenser la dégradation causée par la
phosphorylation par GSK3beta et l’accumulation résultante de β-caténine lui permet d’entrer dans le noyau et d’activer
une cascade d’expression de gènes qui mène à la formation d’un nouvel organisateur de Spemann qui induit un
deuxième axe. 9.2 : Les mutations introduites dans la séquence de la β-caténine diminuent fortement les capacités de la
β-caténine à induire un deuxième axe. Cette diminution est levée si on ajoute une séquence NLS qui permet l’entrée
dans le noyau, suggérant que la forme mutante de la β-caténine a des difficultés à entrer dans le noyau et l’ajout de ce
NLS a permis de compenser cette déficience. Cela suggère que les acides aminés mutés jouent un rôle important pour
l’importation de la β-caténine dans le noyau.

10.1 : On teste la localisation du domaine intracellulaire de Notch1, révélée ici par la GFP dans la protéine-fusion.
Lorsque Notch1 n'est pas activé, ce domaine devrait être à la membrane plasmique. En présence d'un ligand de Notch1,
ce domaine est clivé et migre dans le noyau. On cherche ici à savoir si CB-103 perturbe ce clivage et cette translocation
dans le noyau. Le DAPI est une molécule qui devient fluorescente lorsqu'elle est stimulée par des UV lorsqu'elle est
associée à de l'ADN double-brin. Le DAPI nous permet de connaître la localisation de l'ADN dans la cellule et donc la
781
position du noyau. Nous constatons qu'en absence ou en présence de CB-103, N1-ICD-GFP se trouve exclusivement dans
le noyau avec la même intensité (une cellule avec CB-103 a une intensité plus faible mais il n'y a aussi pas de signal à la
membrane ou dans le cytoplasme et il est aussi exclusivement présent dans le noyau. La différence générale d'intensité
est liée à des variations d'efficacité de transfection). CB-103 n'a donc pas d'effet sur la localisation de N1-ICD donc pas
d'effet sur les premières étapes de la voie de signalisation. 10.2 : L'expression de la protéine rapportrice luciférase qui
dépend de l'association entre RBPJ et N1-ICD est inhibée en présence de CB-103. Cela indique que cette molécule bloque
l'étape d'activation de la transcription des gènes-cibles de la voie Notch. 10.3 : L'inhibition de l'activation de la
transcription par CB-103 n'est pas dû à un défaut de clivage de Notch1, ni d'un défaut de la translocation de N1-ICD
dans le noyau. C'est donc une étape plus tardive qui est affectée, par exemple l'association avec RBPJ ou un effet en aval
de cette association qui aboutit à l'activation de la transcription des gènes cibles. 10.4 : L'expression croissante de
MAML1 aboutit à sauver l'activation de la transcription du gène rapporteur en présence de CB-103. Cela indique que
l'étape bloquée par CB-103 correspond au recrutement de MAML1 et que la surexpression de MAML1 permet de
compenser ce blocage.

Exercices sur les étapes du développement, les inductions embryonnaires et la mise en place des
axes de polarité

EXERCICE 1

On étudie des embryons de souris knock-out pour une mutation d'une isoforme de PKA. On réalise des coupes
d'embryons de souris sauvage (A) et mutante (B) à E6,5. ant = région antérieure; ect = ectoderme; end = endoderme;
mes = mésoderme; post = région postérieure; ps = ligne primitive. Barres d'échelle = 50 micromètres. En C, on réalise
une hybridation in situ sur un embryon sauvage (à gauche) ou mutant (à droite) avec une sonde reconnaissant l'ARNm
de brachyury.

*1.1 : A E6,5, les embryons de souris sont-ils implantés dans l'utérus ?

*1.2 : A quelle étape du développement se trouve l'embryon de souris à E6,5 ?

*1.3 : Décrivez les coupes en A et B.

*1.4 : Quelles informations supplémentaires nous apporte la figure C ?

782
EXERCICE 2

On réalise chez la souris une mutation conditionnelle du récepteur alpha aux œstrogènes soit dans l'épithélium de
l'oviducte (cKO), soit dans le mésenchyme de l'oviducte. (A) Après accouplement des souris femelles sauvages ou
mutantes, on récupère les embryons soit à 0,5 dpc (jour après la copulation), soit à 1,5 dpc. (B-D) Quantifications de
divers paramètres. Sperm = spermatozoïdes. (E) On réalise des fécondations in vitro avec des ensembles COC (c'est-à-
dire ovocyte et cumulus oophorus) prélevés dans l'oviducte ou dans l'ovaire ou des COC prélevés dans l'oviducte dont
on a enlevé le cumulus oophorus avant de faire la fécondation in vitro. (F-H) On cultive in vitro des zygotes prélevés
dans l'oviducte ou produits par fécondation in vitro (FIV) à partir d'ovocytes prélevés dans l'oviducte ou dans l'ovaire
jusqu'à différents stades (2 cellules, 4/8 cellules, morula/blastocyste). On compte les embryons obtenus et on exprime
ce nombre en pourcentage des zygotes obtenus. Source : https://elifesciences.org/articles/10453

**2.1 : Comment peut-on réaliser une mutation conditionnelle du récepteur alpha aux œstrogènes soit dans l'épithélium
de l'oviducte (cKO), soit dans le mésenchyme de l'oviducte ?

*2.2 A quoi voit-on qu'il y a bien eu fécondation à 0,5 dpc?

*2.3 Quel est le phénotype obtenu en A chez les mutants ?

*2.4 Que nous apprennent les figures C et D ?

**2.5 Que nous apporte comme informations la figure E ?

**2.6 Quelles conclusions peut-on tirer des données des figures F à H ?

783
EXERCICE 3

(A) Des embryons de xénope sont injectés au stade 2 cellules dans un des blastomères avec un ARNm codant une forme
dominante négative de la E3 ubiquitine ligase Cullin1. On laisse les embryons se développer jusqu'au stade bourgeon
caudal et on fait des coupes transversales. Une hybridation in situ est réalisée avec une sonde reconnaissant l'ARNm de
la N-tubuline qui est exprimée dans les neurones différenciés. Deux coupes sont présentées, à des niveaux différents
sur l'axe antéro-postérieur (la coupe à droite est dans une région habituellement moins pigmentée). La flèche indique
le côté injecté. (B) Des extraits protéiques sont réalisés à partir des embryons injectés avec deux doses d'ARNm du
dominant-négatif de Cullin1 (Cul1-C75) ou à partir d'embryons non injectés et soumis à une analyse western-blot avec
l'anticorps de la beta-caténine ou de la tubuline-alpha. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/133/3/559/43500/A-dominant-negative-form-of-the-E3-ubiquitin

*3.1 Qu'est-ce qu'un dominant-négatif ?

*3.2 Qu'observe-t-on sur les coupes transversales ? Proposez des hypothèses pour expliquer le phénotype.

**3.3 Proposez des expériences pour valider ou invalider vos hypothèses.

*3.4 Que nous apprend le western-blot ? Quel pourrait être la fonction de Cullin1 ?

**3.5 A l'aide de vos connaissances, essayez de trouver un scénario pour expliquer le phénotype.

**3.6 Sachant qu'il y a un effet sur la β-caténine qui est essentielle dès le développement précoce du xénope, pourquoi
l'effet du dominant-négatif n'est pas plus massif ?

EXERCICE 4

784
(A-F) Coupes transversales d'embryons de poulet à E4.5 à la suite d'électroporations (Ep) in ovo de GFP-ADN (vert) aux
stades indiqués (ss = nombre de somites). Une immunofluorescence avec l'anticorps HNK1 (qui reconnaît notamment
les cellules de crêtes neurales) est réalisée (rouge). Les pointes de flèches représentent les mélanoblastes et les petites
flèches dans A et B pointent vers les cellules le long des racines ventrales. Ao, aorte ; DRG, ganglions de la racine dorsale ;
M, mélanocytes ; No, notocorde ; NT, tube neural ; SG, ganglion sympathique ; VR, racine ventrale. Barre d'échelle :
100 micromètres. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/137/4/585/44210/Evidence-for-a-dynamic-
spatiotemporal-fate-map-and

**4.1 Combien de temps de développement sépare les embryons de 27 somites et de 30 somites ?

*4.2 Présentez la technique d'électroporation in ovo.

*4.3 De manière globale, quelles sont les cellules qui ont été électroporées ?

*4.4 Comparez les résultats des différentes électroporations réalisées à différents stades et tirez des conclusions
concernant le développement des cellules de crêtes neurales.

EXERCICE 5

Trim36 est une protéine présente dans l'ovocyte et le zygote. Des morpholinos (MO) ciblant l'ARNm de Trim36 ont été
injectés dans des ovocytes de xénope. Les ovocytes ont ensuite été fécondés in vitro et on laisse développer les
embryons (B, D, F, H) en parallèle avec des embryons issus d'ovocytes injectés avec un MO contrôle (A, C, E, G). On
réalise une hybridation in situ au stade 12 avec des sondes eomesodermin (eomes) [eomesodermine marque à ce stade
le mésoderme], myod et au stade 9,5 avec une sonde Xnr3 (nr3). A-D : vues dorsales. E, F : vue du pôle végétatif, le côté
dorsal est vers le haut. G, H : Immunohistochimie anti-beta-caténine d'embryons au stade 8 vue du pôle animal. Le côté
dorsal est à droite. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/136/18/3057/65351/Vegetally-localized-
Xenopus-trim36-regulates

*5.1 Analysez et interprétez les résultats de l'étude de l'expression de eomes et myod dans les embryons issus d'ovocytes
déplétés en Trim36.

**5.2 Analysez les résultats concernant l'expression de Xnr3 et précisez en quoi ils sont liés aux résultats de la question
précédente.

*5.3 Analysez et interprétez les résultats de l'immunohistochimie anti-beta-caténine. Proposez des hypothèses
concernant le rôle de Trim36.

785
Immunofluorescence avec des anticorps anti-tubuline 80 minutes après la fécondation de zygote issus d'ovocytes
contrôles (A) et d'ovocytes injectés avec MO anti-Trim36 (B). Vue du pôle végétatif. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/136/18/3057/65351/Vegetally-localized-Xenopus-trim36-regulates

*5.4 Pourquoi cette observation est-elle faite 80 minutes après la fécondation ?

*5.5 Qu'observez-vous et comment cela est-il lié aux résultats des questions précédentes ?

**5.6 Proposez une expérience qui pourrait sauver le phénotype des embryons (en dehors d'injecter une forme de
l'ARNm Trim36 insensible au MO)

EXERCICE 6

Deux cellules ventrales ou dorsales ont été injectées à l'équateur d'embryons de xénope de stade 4 cellules avec 0,75 ng
par blastomère d'ARNm qui code la protéine GBP, et on a laissé les embryons se développer pendant 3 jours. Des
embryons représentatifs injectés par voie dorsale (embryon du haut) et injectés par voie ventrale (embryon du bas)
sont présentés.

**6.1 Comment peut-on reconnaître sur des embryons de xénope au stade 4 cellules, les cellules ventrales et les cellules
dorsales ?

*6.2 Analysez et interprétez ces résultats. Quel autre ARNm codant une autre protéine pourrait donner le même résultat
après une injection similaire ?

786
(B) Des ovocytes fécondés de xénope ont été irradiés aux UV dans les 40 minutes suivant la fécondation. Au stade de 2
à 4 cellules, une cellule a été injectée avec l'ARNm codant GBP aux doses indiquées. Les embryons témoins UV n'ont pas
été injectés. L'indice dorsoantérieur (DAI) des embryons a été noté après 3 jours, et le DAI moyen de chaque échantillon
est indiqué, avec la taille de l'échantillon indiquée ci-dessus. Les embryons avec un DAI de 0 n'ont aucune structure
dorsale et ceux avec un DAI de 5 sont normaux. (C) Des ovocytes fécondés de xénope ont été irradiés aux UV dans les
40 minutes suivant la fécondation. Au stade de 2 à 4 cellules, une cellule a été injectée avec 2 ng d'ARNm codant XGSK-
3 tagué myc ou 1 ng d'ARNm codant GBP, seuls ou en combinaison, comme indiqué, et le DAI a été évaluée après 3 jours.
Les embryons témoins UV n'ont pas été injectés. Source : https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(00)81208-
8

*6.3 Que provoque l'irradiation aux UV ?

*6.4 Analysez et interprétez l'expérience en B.

*6.5 Quelles informations supplémentaires nous apporte l'expérience C ? Posez des hypothèses sur l'action de GBP.

**6.6 Des fonctions similaires à quelle autre protéine GBP pourrait-elle avoir ?

EXERCICE 7

(A-C) On réalise des coupes sagittales dans un embryon de xénope aux stades indiqués et on les observe. (D-F) On isole
l'endoderme et le mésoderme de la calotte animale (ectoderme) d'embryons de stade 10 et on cultive les explants
pendant des durées équivalentes permettant d'obtenir les stades en B et C. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/126/16/3703/76494/Vegetal-rotation-a-new-gastrulation-movement

*7.1 Qu'indique bc sur la légende de la figure A ? Et qu'indique la pointe de flèche blanche en B et C ?

*7.2 Analysez et interprétez les résultats de l'expérience.

787
EXERCICE 8

On cultive des agrégats constitués de cellules de la calotte animale de xénope avec des cellules de l'hémisphère végétatif
de blastula de xénope. Quelques jours plus tard, on extrait les ARN de ces agrégats et on effectue une analyse par RT-
PCR avec des amorces reconnaissant les séquences codantes l'actine musculaire ou l'actine du cytosquelette général.
Control cap : calotte animale cultivée seule. On déplète les ARNm VegT maternel des embryons sur lesquels on prélève
les cellules de l'hémisphère végétatif (ΔVegT, puits 5) et on réinjecte dans certains cas des ARNm de Bix4 (un gène activé
par VegT, puits 6) ou de VegT (puits 7).

Source : https://journals.biologists.com/dev/article/126/19/4193/40422/Bix4-is-activated-directly-by-VegT-and-
mediates

*8.1 Comparez le résultat avec la calotte animale seule et lorsque la calotte animale est associée aux cellules de
l'hémisphère végétatif (Con/Con). Expliquez ce qu'il s'est passé dans les agrégats.

*8.2 Que nous apprend sur VegT l'expérience dont le résultat est présenté dans le puits 5 ?

*8.3 Analysez et interprétez le rôle de Bix4.

EXERCICE 9

On inhibe l'expression de Wnt11 dans des embryons précoces de xénope avec des injections d'ARN anti-sens (Wnt11-
). Il y a co-injection de l'ARNm codant Wnt11 ou de LRP6 (qui est une protéine transmembranaire). La morphologie des
embryons est observée en A au stade neurula et l'expression de gènes cibles connus de la voie canonique Wnt/β-
caténine siamois et Xnr3 est étudiée par RT-qPCR. En C et D, on injecte des ARN anti-sens inhibant l'expression de LRP6
et certains de ces embryons sont co-injectés avec des ARNm permettant de surexprimer Wnt11. Les embryons sont
observés au stade bourgeon caudal. En D, les résultats sont montrés pour deux séries d'expériences indépendantes.
Source : https://journals.biologists.com/dev/article/134/3/503/53002/Wnt11-catenin-signaling-in-both-oocytes-
and-early

*9.1 Quel est le phénotype des embryons où Wnt11 n'est pas produit ? Quel est l'intérêt de faire les co-injections de
l'ARNm de Wnt1 avec l'ARN anti-sens Wnt11 ?

*9.2 Analysez et interprétez les résultats obtenus avec l'injection de l'ARNm de LRP6.

788
*9.3 Analysez et interprétez les résultats obtenus en C et D.

**9.4 Proposez un modèle pour expliquer les résultats.

EXERCICE 10

(A) On injecte des zygotes de poisson-zèbre avec un ARNm qui code une protéine Bif1 dont on souhaite connaître la
fonction. 24 heures après l'injection, on observe la morphologie des embryons et on les classe (C1 à C5) avec des degrés
d'anomalie croissants. (B) Quantification des expériences en A avec le même code couleur (et noir= embryon normal).
On effectue des expériences supplémentaires avec des injections d'ARNm codant Bmp2b co-injectés ou non avec des
ARNm codant Bif1. On utilise un même code de l'intensité de couleur mais en rouge correspondant à une ventralisation
de plus en plus importante. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/146/6/dev164103/49053

*10.1 Quelles sont les malformations observées en A ? Comment les interpréter ?

*10.2 Quelles informations supplémentaires nous apporte l'expérience avec l'injection d'ARNm codant Bmp2b co-
injectés ou non avec des ARNm codant Bif1 ?

On réalise des extraits protéiques à partir d'embryons de poisson zèbre qui ont été injectés ou pas (NI) avec l'ARNm
codant Bif1. Un western-blot est réalisé avec un anticorps anti-phosphoSmad1/5/8, un anticorps ant-Smad1/5/8 et un
anticorps anti-actine. Une quantification est réalisée et les résultats du NI sont normalisés à 1. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/6/dev164103/49053

*10.3 Analysez et interprétez les résultats de cette expérience.

789
EXERCICE 11

On dispose d'embryons de poisson-zèbre sauvage (wild-type), traités avec des morpholinos qui inhibent l'expression
du facteur de transcription foxh1 (foxh1 MO), de mutants perte-de-fonction pour le gène eomesa (MZeomesa) ou pour
le gène oep (MZoep), et de gain-de-fonction par injection d'ARNm de foxh1 et de combinaisons entre ces cas. On réalise
juste avant la gastrulation des hybridations in situ avec des sondes reconnaissant les ARNm de ntla (marqueur de
mésoderme), de sox32 (marqueur d'endoderme) et de gsc (ou goosecoid). Les vues ont été prises par le pôle animal. Le
côté "dorsal" est à droite. Source : https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-014-0081-5

*11.1 D'après les images et vos connaissances, dans quelle région est exprimée gsc ?

*11.2 Décrivez les effets des pertes-de-fonction de foxh1 et de eomesa.

*11.3 Que nous apprend la double perte-de-fonction foxh1 et eomesa ?

*11.4 Analysez et interprétez les résultats des injections d'ARNm de foxh1 dans un contexte sauvage ou mutant pour
eomesa.

EXERCICE 12

(A) Des explants ventraux de xénope ont été cultivés intacts (+Meso) ou après ablation de mésoderme (-Meso) à
différents stades et étudiés par hybridation in situ au stade NF37 (organogenèse). (B) Graphique des résultats
expérimentaux montrant le pourcentage d'explants exprimant les marqueurs de cellules du foie (nr1h5), du

790
poumon/thyroïde (nkx2.1) et/ou du pancréas (pdx1 ou ptf1a) au stade NF37, en fonction du stade où le mésoderme a
été retiré. Source : https://link.springer.com/article/10.1186/1471-213X-12-27

*12.1 Analysez et interprétez les données expérimentales concernant l'expression des marqueurs de foie et de poumon.

*12.2 Comment interpréter les résultats concernant l'expression des marqueurs de pancréas.

EXERCICE 13

Des calottes animales de Xénope sont disséquées puis recombinées. L'une des calottes provient d'un embryon pigmenté
et exprime (XMeis3) ou non (AC) le facteur de transcription XMeis3. L'autre calotte provient d'un embryon albinos et a
été neuralisée en y exprimant un récepteur dominant-négatif des BMP (BMP DNR). Après quelques jours, on fixe les
recombinants et on réalise une hybridation in situ avec une sonde reconnaissant les ARNm de Otx2 (A, B) ou de Krox20
(C, D). La coloration de cette hybridation est bleu/gris. La pigmentation des embryons est brune. Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/131/1/153/64395/Xenopus-Meis3-protein-forms-a-hindbrain-inducing

*13.1 : Pourquoi l'expression d'un dominant-négatif des récepteurs aux BMP neuralise-t-il les calottes animales ?

*13.2 : Pourquoi utilise-t-on une calotte animale provenant d'un embryon pigmenté et une autre provenant d'un embryon non
pigmenté pour les recombinaisons ?

**13.3 : Quel est l'effet de XMeis3 sur l'expression de Otx2, un marqueur de cerveau antérieur, dans les recombinants ?

**13.4 : Que peut-on déduire de l'étude de l'expression de Krox20, un marqueur de cerveau postérieur ?

791
EXERCICE 14

Chez le xénope, les cellules de crêtes neurales (NC) au stade 16 expriment le récepteur à l'endothéline EdnrA lors de
leur spécification au début de la neurulation et le mésoderme intermédiaire (IM) exprime le ligand Edn1. On cultive
des explants contenant les crêtes neurales du stade 16 au stade 22 (C, D, F, G) en présence ou absence d'Edn1 ou de
BQ123 qui est un antagoniste de l'EdnrA et en présence ou absence d'explants de mésoderme intermédiaire (+M
quand présence). On observe aussi des explants du stade 16 tout juste isolés de l'embryon (en B). On étudie par
hybridation in situ l'expression du gène Snail2 qui est habituellement exprimé dans les cellules de crête neurale. Ne
pas tenir compte de la figure E. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012160608011172

*14.1 Que se passe-t-il si on cultive les explants du stade 16 au stade 22 sans mésoderme et sans Edn1 ? Interprétez.

*14.2 Quel est le rôle du mésoderme intermédiaire mis en évidence ?

*14.3 Que peut-on conclure du rôle de la signalisation endothéline dans ce système avec ces expériences ?

EXERCICE 15

On a injecté des embryons de xénope au stade 4 cellules dans la future région ventrale avec des ARNm codant la protéine
Dscr6 avec ou sans des ARNm codant la protéine Stat3C. On laisse se développer les embryons jusqu'au début de la
gastrulation et ils sont fixés puis traités en hybridation in situ avec des sondes reconnaissant les ARNm de chordin et de
wnt8. Les photos sont prises en vue du pôle végétatif. Les chiffres indiquent la proportion des mebryons où un tel
phénotype a été constaté.

*15.1 Comment peut-on savoir sur des embryons de xénope au stade 4 cellules où se développera la région ventrale ?

792
*15.2 D'après vos connaissances, où est exprimé l'ARNm de chordine ? Sachant que les embryons sur les photos sont
tous orientés de la même manière déduisez où est exprimé wnt8.

*15.3 Analysez et interprétez l'effet de l'injection des ARNm codant Dscr6. A des stades plus tardifs, quel pourrait être
l'effet sur l'organisation des embryons et des têtards ?

*15.4 Analysez et interprétez l'effet de l'injection conjointe des ARNm codant Dscr6 et Stat3C.

REPONSES

1.1 : Oui, l'implantation a eu lieu à E4,75. 1.2 : Au début de la gastrulation. 1.3 : L'embryon muté est plus élargi que
l'embryon sauvage avec les cellules du mésoderme qui sont moins jointives et qui forment un tissu plus lâche, voire
lacunaire par endroit. L'endoderme est plus fin et discontinu. Une ligne primitive se forme tout de même dans la région
postérieure et semble normale en comparaison avec l'embryon sauvage. 1.4 : En termes de morphologie générale, les
différences se creusent entre le mutant et le sauvage à E8,5 par rapport à E6,5 avec l'embryon mutant qui est nettement
plus petit ce qui n'était pas le cas deux jours auparavant. Brachyury est exprimé dans le mésoderme à ce stade et on
constate que son expression est très faible chez le mutant, ce qui suggère un défaut majeur touchant les cellules du
mésoderme, soit de détermination, soit de survie.

2.1 : On peut utiliser le système Cre-Lox avec la Cre sous le contrôle d'un promoteur spécifique de l'épithélium de
l'oviducte ou spécifique du mésenchyme de l'oviducte et le gène codant le récepteur flanqué de deux séquences LoxP.
2.2 : Sur certains embryons, on voit clairement deux globules polaires. Le deuxième globule polaire n'est émis que juste
après la fécondation, l'activation de l'ovocyte par l'entrée du spermatozoïde débloquant la méiose bloquée en
métaphase II. 2.3 : Alors que les embryons semblent normaux à 0,5 dpc, les embryons portés par les mères cKO sont en
train de dégénérer. 2.4 : Alors qu'il n'y a pas de différences de nombre d'ovocytes ovulés entre le sauvage et le mutant,
le nombre de spermatozoïdes est très bas chez le mutant dans les différentes régions de l'oviducte. Le récepteur alpha
aux œstrogènes est nécessaire dans l'épithélium de l'oviducte pour que les spermatozoïdes puissent y entrer ou y
survivre. Ce n'est pas un problème de chemoattraction envers les ovocytes puisque ceux-ci sont présents en quantité
normale. 2.5 Les COC prélevés dans les oviductes ne sont pas aussi aptes à être fécondés s'ils proviennent du mutant
par rapport à s'ils proviennent du sauvage. Cela est dû à un défaut dans les cellules du cumulus oophorus car si on les
enlève, le taux de fécondation redevient le même que chez le sauvage. Les COC provenant de l'ovaire se comportent
normalement même en provenance du mutant. L'expression du récepteur alpha aux œstrogènes dans l'épithélium de
l'oviducte est nécessaire pour que les cellules du cumulus oophorus soient pleinement fonctionnelles. 2.6 Même dans
des conditions de culture in vitro, les embryons issus de zygotes prélevés chez les mères mutantes ont une mortalité
importante avec 2 paliers de mortalité : entre le zygote et le stade 2 cellules, et entre le stade 4/8 cellules et
morula/blastocyste. Par contre, si on cultive des zygotes fécondés in vitro, on obtient des taux de survie normaux. On
en conclut que la fonction du récepteur aux œstrogènes dans l'épithélium de l'oviducte est essentielle au moment de la
fécondation via notamment une action sur les cellules du cumulus oophorus (voir les questions précédentes).

3.1 : Un dominant-négatif une protéine (ou un gène muté codant une protéine) qui non seulement est inactive mais
aussi empêche les protéines normales d’agir. 3.2 : On observe nettement plus de cellules pigmentées (des mélanocytes)
du côté injecté que du côté contrôle. Cela s'accompagne de la quasi-disparition de l'expression de la N-tubuline vue par
hybridation in situ. Dans cette région, il est probable que les neurones soient des dérivés des cellules de crêtes neurales
(CCN) tout comme les mélanocytes. L'expression du dominant-négatif de la Cullin1 a donc pu changer la détermination
des dérivés des CCN, les faisant prendre un destin mélanocytaire plutôt que neuronal. On peut aussi imaginer que le
dominant-négatif a fait proliférer les mélanocytes et a tué les neurones par apoptose. 3.3 : Il faudrait faire un marquage
au BrdU (ou faire un immunomarquage Ki67) pour observer la prolifération et un marquage TUNEL pour observer
l'apoptose. Pour l'hypothèse de la détermination, il faudrait faire des études in vitro sur des cultures de CCN isolées ou
faire des études de marquage in vivo et suivre la destinée des cellules. 3.4 : La quantité de β-caténine est plus élevée en
présence du dominant-négatif, ce qui veut dire que la Cullin1 inhibe l'expression de la β-caténine. Au vu de sa fonction
d'E3 ubiquitine ligase, on peut supposer qu'elle ubiquitinyle la β-caténine et provoque sa dégradation. 3.5 : La β-
caténine intervient dans la voie Wnt canonique or cette voie est impliquée dans la détermination des CCN vers la voie
mélanocytaire. Par conséquent, la moindre dégradation de la beta-caténine en présence du dominant-négatif pousse les
CCN vers la voie mélanocytaire au détriment de la voie neuronale. 3.6 : Le dominant-négatif de la Cullin1 ne peut agir
qu'en empêchant la fonction de la Cullin1. Si la Cullin1 n'est pas exprimée au cours du développement précoce du
xénope, le dominant-négatif ne peut pas modifier quoi que ce soit au niveau d'expression de la β-caténine.

4.1 : Chez l'embryon de poulet, une paire de somites est générée toutes les 90 minutes donc les embryons à 30 somites
sont (3x 1h30 =) 4h30 environ plus âgés que les embryons à 27 somites. 4.2 : On injecte une solution contenant un

793
vecteur d'expression dans la lumière du tube neural puis on place 2 électrodes de part et d'autre de l'embryon. On fait
passer de courts pulses de courant qui ouvrent les membranes et font rentrer l'ADN chargé négativement dans les
cellules uniquement du côté de l'électrode positif (car l'ADN migre vers ce côté comme dans une électrophorèse).
L'autre côté de l'embryon qui n'a pas reçu d'ADN sert de contrôle interne. 4.3 : Les cellules électroporées sont des
cellules qui se trouvaient aux stades indiqués (15-25ss, 27ss...) d'un côté de la paroi du tube neural et à son sommet
(qui correspond à l'ancienne bordure neurale). Certaines de ces cellules sont restées dans le tube neural, d'autres sont
sorties du tube neural et expriment le marqueur HNK1, ce sont des cellules de crêtes neurales (CCN). 4.4 : Les CCN
électroporées entre 15 et 25ss (c'est-à-dire marquées par la GFP depuis ce stade) donnent à E4,5, un ensemble assez
large de dérivés : mélanoblastes, cellules du DRG, cellules de la racine ventrale, quelques cellules dans les ganglions
sympathiques (GS). Les CCN marquées à 27 somites ne contribuent plus aux GS mais à tous les autres dérivés. A partir
de 30 somites, les CCN marquées ne donnent plus que des mélanoblastes (quelques cellules dans les DRG à 30 somites
mais nettement moins qu'à 27 somites). Quand on marque le tube neural au stade 40 somites, plus aucune CCN n'est
produite. On en conclut qu'au cours du temps, la population de CCN dans le tube neural dorsal évolue et que globalement
elle perd en multipotence pour devenir uniquement productrice de mélanoblastes aux stades tardifs. Notez qu'on
raisonne sur une population et qu'on ne sait pas si même aux stades précoces, les CCN étaient chacune déjà unipotentes
et que l'ensemble constituait un mélange hétérogène ou si les CCN étaient alors chacune multipotentes. L'émigration
des CCN s'arrête entre les stades 40 et 44 somites.

5.1 : Chez les embryons affectés, eomes est exprimé mais plus faiblement que dans les embryons normaux. Il manque
notamment une structure allongée dans le plan de symétrie bilatérale et c'est sans doute la corde (flèche noire). Le
mésoderme paraxial et notamment les futurs muscles (myod) sont très affectés avec une expression très faible de myod.
On en déduit que l'induction du mésoderme a eu lieu mais de manière nettement moins efficace qu'habituellement. 5.2
: On observe une expression très diminuée de Xnr3 dans les embryons issus des ovocytes sans Trim36. Xnr3 est exprimé
dans la région dorsale par rapport au pôle végétatif et il donc il pourrait être exprimé dans le centre de Nieuwkoop et
aussi dans l'organisateur de Spemann au vu de son extension dorsale. Les protéines Xnr sont impliqués dans l'induction
de l'organisateur de Spemann et dans l'induction du mésoderme. C'est peut-être le défaut de Xnr3 qui est à l'origine des
défauts mésodermiques (notamment dorsaux) observés à la question précédente. 5.3 : Dans l'embryon issu d'ovocytes
normaux, on observe bien la β-caténine dans le noyau dans les cellules dorsales et cette localisation n'est plus présente
(ou alors très faible) chez les embryons issus d'ovocytes sans Trim36. La localisation nucléaire de la beta-caténine est
essentielle pour la mise en place de l'organisateur de Spemann et les défauts observés sur des embryons plus âgés sont
les conséquences de ce qui est observé ici. La localisation nucléaire de la β-caténine dépend du transport de Dishevelled
au futur côté dorsal de l'embryon lors de la rotation corticale et on peut imaginer que Trim36 est nécessaire pour cet
évènement. On peut aussi imaginer que Trim36 est nécessaire pour empêcher la dégradation de la β-caténine. 5.4 : La
rotation corticale a lieu juste après (vers 1h30 après la fécondation pour des zygotes à température ambiante) et il s'agit
d'observer les microtubules qui contrôlent la réalisation de cette rotation corticale. 5.5 : Dans les zygotes contrôles, les
microtubules sont alignés selon une direction préférentielle alors que dans les zygotes sans Trim36 on ne voit pas
clairement de microtubules bien organisés et si certains sont présents, ils ne sont pas alignés selon une direction
préférentielle. Cela indique que la rotation corticale ne peut se réaliser normalement ce qui entraîne un défaut de
transport de Dishevelled du côté dorsal et un défaut de localisation nucléaire de β-caténine. 5.6 : On pourrait injecter
de la protéine Dishevelled du côté dorsal du l'embryon ou également de l'ARNm de la β-caténine du côté dorsal. Cette
surexpression permet de compenser la forte dégradation de la β-caténine causée par GSK3 et de lui permettre de rentrer
dans le noyau et d'activer la cascade d'évènements qui aboutit à la formation du centre de Nieuwkoop et de
l'organisateur de Spemann.

6.1 : Le croissant gris se forme lors de la rotation corticale et il se trouve toujours du côté dorsal. Donc c'est grâce à la
pigmentation qu'on peut reconnaître les différentes destinées régionales des cellules. 6.2 : L'embryon surexprimant
GBP dorsalement semble donner un têtard normal. En revanche, l'embryon surexprimant GBP ventralement a un
double axe dorsal avec une duplication des régions antérieures. Cela rappelle les injections ventrales d'ARNm de β-
caténine ou de siamois. On peut imaginer que GBP est impliqué dans la même voie que ces deux protéines. 6.3 :
L'irradiation aux UV désorganise le réseau de microtubules au pôle végétatif ce qui rend impossible la rotation corticale
et donc la mise en place des axes de polarité. 6.4 : Comme prévu, l'irradiation aux UV provoque un indice DAI quasi-nul.
De manière dose-dépendante, l'injection de l'ARNm de GBP permet de restaurer partiellement le phénotype normal
(avec les doses utilisées, on n'arrive jamais à 5). Cela veut dire que GBP est suffisant pour compenser l'absence de
rotation corticale. Il est probable qu'il se trouve en aval de la rotation corticale dans la cascade d'évènements
aboutissant à la formation des axes de polarité. 6.5 : XGSK-3 s'oppose à l'action de GBP dans la compensation de
l'absence de rotation corticale. XGSK-3 doit inhiber GBP ou alors la fonction de GBP est d'inhiber XGSK-3 mais l'injection
d'ARNm de XGSK-3 rend impossible d'inhiber toute la quantité de XGSK-3 exprimée. Sachant que XGSK-3 est un
inhibiteur de la β-caténine qui est indispensable pour la mise en place des axes, on peut imaginer que GBP fonctionne
en inhibant XGSK-3 ce qui permet à la β-caténine de ne plus être dégradée et d'agir, ce qui peut parfaitement expliquer
sa fonction de sauvetage des embryons sans rotation corticale. 6.6 : Dans l'hypothèse précédemment évoquée, GBP a
une fonction similaire à Dishevelled.

794
7.1 : bc désigne le blastocoele et la pointe de flèche blanche indique le blastopore. 7.2 : On observe que le blastopore se
forme même dans un explant sans ectoderme, et avec la même cinétique que sur un embryon entier ce qui montre que
l'ectoderme n'est pas nécessaire pour la formation du blastopore.

8.1 : Alors que la calotte animale seule n'exprime pas d'actine musculaire (mais exprime bien l'isoforme de l'actine
qu'on trouve dans tous types cellulaires), l'association avec les cellules de l'hémisphère végétatif provoque l'expression
de l'actine musculaire. Les cellules de l'hémisphère végétatif sont des cellules endodermiques et donc on peut
raisonnablement penser que ce sont les cellules de la calotte animale sous l'influence de signaux provenant des cellules
endodermiques qui ont activé l'expression de l'actine musculaire car le muscle est un tissu mésodermique. Il s'agit ici
de l'induction du mésoderme à partir de cellules ectodermiques sous l'influence de signaux provenant de l'endoderme.
8.2 : La déplétion du VegT d'origine maternel annule complètement l'activation de l'expression de l'actine musculaire
dans les agrégats montrant que l'action de VegT est nécessaire pour l'induction du muscle (et sans doute de mésoderme,
quelqu'il soit). 8.3 : Alors que la réexpression de VegT permet de sauver (au moins partiellement) l'activation de
l'expression de l'actine musculaire (puits 7), l'expression de Bix4, pourtant un gène activé par VegT, ne suffit pas à
sauver l'activation de l'expression de l'actine musculaire. On peut en déduire que Bix4 seul ne peut pas compenser
l'absence de VegT et que sans doute d'autres cibles sont impliqués dans l'induction du mésoderme.

9.1 : Les embryons sans Wnt11 présentent une importante malformation. On ne distingue pas la formation claire de
bourrelets neuraux alors qu'on est au stade neurula. Les embryons n'activent pas l'expression des cibles de la voie
Wnt/β-caténine siamois et Xnr3, indiquant qu'aucun autre ligand Wnt n'a pu le remplacer dans cette fonction.
L'injection des ARNm Wnt11 restaure plus ou moins bien le phénotype normal (plutôt bien pour l'embryon de gauche,
moins bien pour celui de droite) et rétablit l'expression de siamois et de Xnr3. Cette expérience démontre que les ARN
antisens ont bien eu une action spécifique (pas sur un autre gène Wnt par exemple) et qu'il n'ont pas induit de toxicité
non lié à sa fonction. 9.2 : La surexpression de LRP6 (avec 75 pg d'ARNm) compense partiellement l'absence de Wnt11
en termes de morphologie (notamment sur l'embryon de droite où on observe des bourrelets neuraux). L'expression
de siamois et de Xnr3 sont sauvés. Avec l'injection de 300 pg d'ARNm de LRP6, les embryons sont malformés et siamois
et Xnr3 sont surexprimés, indiquant sans doute une hyperdorsalisation. 9.3 : La perte de LRP6 aboutit à une perte de la
mise en place des axes de l'embryon et à une inhibition de l'expression de siamois et Xnr3. Ces défauts ne sont pas
corrigés par la surexpression de Wnt11 montrant que Wnt11 a besoin de LRP6 pour pouvoir agir. 9.4 : Les expériences
montrent que LRP6 est en aval de Wnt11 (si Wnt11 n'est pas là, LRP6 peut compenser mais l'inverse n'est pas vrai).
Sachant que LRP6 est une protéine transmembranaire on peut émettre l'hypothèse que c'est un co-récepteur qui
participe à l'activation de la voie Wnt/β-caténine.

10.1 : On observe une régression de l'axe antéro-postérieur de l'embryon et l'axe dorso-ventral semble lui aussi
perturbé dans les situations C4 et C5. La structure céphalique y est particulièrement grosse ce qui fait penser à une
dorsalisation/antériorisation. Le vitellus ne semble pas affecté. La surexpression de Bif1 a induit une mauvaise mise en
place des axes de polarité. 10.2 : Comme prévu la surexpression de BMP2b provoque une ventralisation. La
surexpression concomitante de Bif1 est capable de compenser plus ou moins totalement l'effet d'une quantité plus
importante de BMP2b. Bif1 s'oppose aux effets des BMP, soit directement (en inhibant une des composantes de la voie),
soit indirectement. Cela expliquerait pourquoi une surexpression de Bif1 aboutit à une dorsalisation puisque l'inhibition
des BMP a cet effet. 10.3 : On observe une baisse de la phosphorylation de Smad1/5/8 alors que la quantité totale de
ces protéines n'est pas modifiée. Bif1 est ainsi suffisante pour inhiber la voie de signalisation BMP et elle agit en amont
de l'étape de la phosphorylation de Smad1/5/8. Cet effet explique ce qui a été observé dans l'expérience précédente.

11.1 : Sur les images, on observe que gsc est exprimé dans un côté du mésoderme (co-localisation avec une partie du
marquage de ntla), le côté dorsal. D'après vos connaissances, vous devez savoir que gsc est exprimé dans l'organisateur
de Spemann. 11.2 : La perte de fonction de foxh1 diminue la taille de l'organisateur de Spemann mais n'affecte pas de
manière générale le mésoderme et l'endoderme. La perte-de-fonction d'eomesa perturbe fortement la formation de
l'endoderme qui est réduit à sa portion dorsale. En ce qui concerne, le mésoderme (et notamment l'organisateur de
Spemann), son étendue semble moins délimitée. 11.3 : Sans foxh1, ni eomesa, il n'y a pas d'endoderme et très peu de
mésoderme avec disparition totale de l'organisateur de Spemann. En combinant ces résultats aux simples pertes-de-
fonction, on en conclut que l'expression d'eomesa est nécessaire pour compenser l'absence de foxh1 lors de la formation
du mésoderme (compensation cependant partielle pour l'organisateur de Spemann) et que l'expression de foxh1 est
nécessaire pour compenser l'absence de eomesa lors de la formation de l'endoderme. 11.4 : Le gain-de-fonction de foxh1
étend l'organisateur de Spemann, démontrant que l'expression de foxh1 est suffisante pour cette fonction (dans une
région précise néanmoins, donc d'autres facteurs doivent intervenir). Cette fonction est indépendante de l'expression
d'eomesa car la perte de fonction d'eomesa ne perturbe pas cette extension. En comparant avec la perte-de-fonction
d'eomesa seul, la surexpression de foxh1 fait plus que compenser le phénotype de réduction de l'organisateur de
Spemann. Le gain-de-fonction de foxh1 ne semble pas affecter le développement de l'endoderme (peut-être un léger
renforcement dorsal). La surexpression de foxh1 compense en partie la diminution de la taille de l'endoderme du
mutant eomesa. On peut émettre l'hypothèse que foxh1 agit en partie en aval de eomesa ou alors agit via une voie
indépendante sur les mêmes gènes cibles.
795
12.1 : Si le mésoderme est enlevé avant un certain stade, on remarque que l'endoderme ne forme pas de foie ou de
poumons, ce qui indique que le mésoderme est nécessaire à l'induction de ces structures dans l'endoderme (et c'est le
mésoderme qui, très probablement, envoie le signal inducteur). Au-delà de ce stade critique (25-26 pour le foie; 32-35
pour les poumons), les signaux inducteurs ont été envoyés et l'ablation du mésoderme n'a plus d'effets. 12.2 : La
présence de mésoderme n'est pas aussi critique pour le développement du pancréas dans l'endoderme que pour le foie
et les poumons aux stades étudiés. L'induction du pancréas a pu avoir lieu avant (et par exemple se terminer un peu
après le stade 16, ce qui expliquerait l'expression plus faible des marqueurs de pancréas si on enlève le mésoderme à
ce stade). La baisse de marqueurs de pancréas si on enlève le mésoderme au stade 32 est plus difficilement explicable.
C'est peut-être un stade fragile/difficile à disséquer où l'ablation du mésoderme a pu endommager des cellules du
pancréas.

13.1 : Les calottes animales isolées et laissées à se développer normalement donnent de l'épiderme cilié sous l'influence
de la voie de signalisation BMP. Un dominant-négatif des récepteurs aux BMP bloque la voie de signalisation des BMP
mimant l'action des molécules secrétées par l'organisateur de Spemann telles que Chordine qui induisent des tissus
neuraux. 13.2 : Cela permet de suivre le devenir des différentes calottes, l'absence ou la présence de pigmentation étant
utilisée comme un traceur de lignage. 13.3 : L'expression de Otx2 est fréquemment activée dans les calottes neuralisées
indiquant que c'est du cerveau antérieur qui a été induit par le blocage de la voie BMP. Lorsque l'autre calotte exprime
XMeis3, les calottes neuralisées n'expriment plus autant Otx2 et il s'agit d'un effet non cellulaire-autonome car les
cellules qui expriment XMeis3 sont différentes de celles où l'expression de Otx2 est inhibée. On remarque aussi au
passage que la partie neuralisée non pigmentée est alongée, indiquant un changement morphologique des tissus sous
l'influence non cellulaire-autonome de XMeis3. 13.4 : Les calottes neuralisées n'expriment pas Krox20 en absence de
XMeis3 dans la calotte voisine. Quand XMeis3 est exprimé, il induit de manière non-cellulaire autonome l'expression de
Krox20 dans une bande étroite de cellules de la calotte neuralisée. On en déduit que XMeis3 a induit la postériorisation
au moins partielle du tissu neural.

14.1 : Les explants au stade 16 expriment bien Snail2 tandis que les explants cultivés sans rien jusqu'au stade 22
n'expriment plus Snail2. Ces explants ne sont donc pas capables de maintenir la détermination de leurs cellules en crêtes
neurales (ou alors ces cellules peuvent mourir). 14.2 : En co-culture avec du mésoderme intermédiaire, l'expression de
Snail2 est maintenue au stade 22. Ce mésoderme doit donc envoyer un signal qui maintient les cellules de crêtes
neurales dans les explants. 14.3 : En absence de mésoderme intermédiaire, l'ajout d'Edn1 dans le milieu suffit à
maintenir l'expression de Snail2. En présence de mésoderme intermédiaire, l'inhibition de la signalisation endothéline
inhibe le maintien de l'expression de Snail2 dans la majorité des explants, montrant que la signalisation endothéline est
généralement nécessaire dans ce cas. On en déduit que l'action de l'Edn1 produite par le mésoderme intermédiaire
essentielle pour maintenir la détermination (ou la survie) des cellules de crêtes neurales exprimant EdnrA dans le
feuillet voisin.

15.1 Après la fécondation a lieu la rotation corticale qui laisse une région appelée "croissant gris" au futur côté dorsal
de l'embryon. Le futur côté ventral est le côté opposé. 15.2 Chordine est exprimé dans l'organisateur de Spemann, c'est-
à-dire dans le mésoderme dorsal. Wnt8 est exprimé dans la zone marginale de l'autre côté donc on en déduit qu'il est
exprimé dans le mésoderme ventral. 15.3 On observe une expression ectopique de chordine dans le mésoderme plus
ventral par rapport à l'organisateur de Spemann. En parallèle, une partie des régions ventrales n'exprime plus wnt8.
Dscr6 favoriserait donc l'expression de chordine au détriment de wnt8. On peut interpréter ce patron d'expression
comme le développement d'un deuxième centre organisateur de Spemann plus ventral. Les embryons devraient
développer deux axes dorsaux (tout comme les greffes classiques de Spemann-Mangold). 15.4 L'injection concomitante
de l'ARNm Stat3C avec l'ARNm de Dscr6 rétablit le phénotype normal (sauvetage) montrant que Stat3C s'oppose aux
effets de Dscr6.

796
Exercices sur le développement des muscles striés squelettiques

EXERCICE 1 :

On réalise une hybridation in situ avec une sonde permettant de connaître l'expression de Pax7 sur des embryons de
souris à E10,5 sauvages ou exprimant le domaine de fixation de Pax3 à l'ADN couplé avec le domaine répresseur de la
transcription de Engrailed. Source : http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/696

*1.1 Quelle molécule reconnaît la sonde ?

**1.2 De quel type est le domaine de fixation de Pax3 à l'ADN ?

*1.3 Quel est l'effet de l'expression de Pax3-En sur l'expression de Pax7 ?

**1.4 Quel est le contrôle interne important visible sur les images pour vérifier que l'expérience a été bien faite et les
interprétations valides ?

**1.5 Peut-on conclure de cette expérience que Pax3 active ou inhibe l'expression de Pax7 ? Peut-on en conclure qu'il le
fait directement ?

EXERCICE 2 :

797
(A) Photographies représentatives d'immunofluorescence de coupes de muscle sains de souris adultes et 5 jours après
une blessure de souris où le gène Ern1 est toujours exprimé dans les cellules musculaires différenciées (Ern1fl/fl) et de
souris où il n'est plus exprimé dans ces cellules (Ern1cKO). On utilise des anticorps reconnaissant la protéine Pax7
(rouge) ou la laminine (verte). Les noyaux ont été identifiés par coloration au DAPI. Barre d'échelle : 50 µm. Les flèches
blanches pointent vers les cellules Pax7+. (B) Nombre moyen de cellules Pax7+ par champ (∼ 0,15 mm2) dans le muscle
indemne et blessé 5 jours auparavant des souris Ern1fl/fl et Ern1cKO. n = 6 souris par groupe. (C) Niveaux d'ARNm
relatifs de Pax7 dans le muscle indemne et blessé des souris Ern1fl/fl et Ern1cKO ont été mesurés en effectuant une RT-
qPCR (n = 3 à 5 souris dans chaque groupe). (D) Western-blot représentatifs montrant des niveaux de Pax7 et de la
protéine contrôle GAPDH dans le muscle indemne et blessé des souris Ern1fl/fl et Ern1cKO. Source :
https://elifesciences.org/articles/73215

*2.1 : Que marque l'immunofluorescence Pax7 ?

*2.2 : Quelle structure cellulaire est marquée par l'immunofluorescence laminine ?

*2.3 : Est-ce que les coupes de muscles sont transversales ou longitudinales ?

*2.4 : Analysez les résultats de l'expérience.

**2.5 : Interprétez les résultats et posez des hypothèses sur le rôle de Ern1 dans la régénération des cellules musculaires
?

EXERCICE 3 :

(En haut) Le fragment de 10 kilobases (kb) situé entre -48kb et -58kb du site de début de la transcription de Myf5 est
coupé en deux (Myf-5-I et Myf-5-II) et chacun des fragments est placé devant la séquence codante d'un gène chimérique
permettant de coder la protéine Myf5 fusionnée avec la beta-galactosidase. (Au milieu et en bas) Vues latérales
d'embryons de souris aux stades indiqués incubés avec X-gal. Les images B,C correspondent aux souris transgéniques
avec Myf-5-I et les images E,F correspondent aux souris transgéniques avec Myf-5-II. La tête de flèche en B indique le

798
futur muscle hypoglosse. Source : https://journals.biologists.com/dev/article/130/14/3297/639/Myf5-expression-
in-somites-and-limb-buds-of-mouse

*3.1 : A quoi faut-il veiller lorsqu'on fait la construction génétique de la séquence codant Myf5-beta-galactosidase ?

*3.2 : Décrivez l'expression du gène rapporteur Myf-5-I au stade 12,5 dpc (B). Est-ce qu'il reproduit fidèlement
l'expression de Myf5 ?

**3.3 : Comment l'expression de ce gène rapporteur évolue au stade 13,5 dpc (C) ?

*3.4 : Analysez et interprétez les résultats pour le transgène Myf-5-II.

EXERCICE 4

On fait différencier des myoblastes C2C12 en fibres musculaires in vitro. Au cours de la différenciation (6h à 72h, growth
= avant l'induction de la différenciation), on étudie en western-blot l'expression de SATB2, une protéine qui est
impliquée dans la structure de la chromatine. On utilise un anticorps qui reconnait un épitope dans la partie C-terminale
de SATB2. La lamine A/C est utilisée comme protéine contrôle. Source : https://www.mdpi.com/2073-
4409/11/6/966/htm

*4.1 : Décrivez et interprétez les résultats du western-blot.

Les cellules C2C12 sont transfectées avec soit un siARN contrôle ou un siARN ciblant l'ARNm de SATB2. Les cellules
sont observées en période de prolifération (growth) ou en condition menant à leur différenciation progressive (48h).
Une immunofluorence est réalisée (SATB2 révélé en rouge, desmine (un filament intermédiaire spécifique des muscles)
révélée en vert) ainsi qu'une coloration DAPI (bleu). Le graphique à droite, montre le pourcentage moyen de nombre
de noyaux par myotubes (100% étant le nombre maximal habituellement observé pour des cellules complètement
différenciées). Source : https://www.mdpi.com/2073-4409/11/6/966/htm

*4.2 : Quel est l'intérêt de faire une immunofluorence anti-SATB2 ?

*4.3 : Que déduisez-vous du rôle de SATB2 à partir des données de fluorescence et de la quantification ?

799
EXERCICE 5

On cultive des myoblastes primaires (extraits de souris nouveau-nés) in vitro dans un milieu qui favorise la
différenciation pendant plusieurs jours (Day1, Day2, Day3, Day5) alors qu'avant elles avaient été cultivées dans un
milieu permettant leur prolifération mais pas leur différenciation (GM) . Les myoblastes ont soit un génotype sauvage
(WT), soit une mutation perte-de-fonction de b-caténine produite par CRISPR/Cas9. On réalise une
immunofluorescence avec un anticorps contre-MyHC (la chaine lourde de la myosine musculaire). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/6/dev167080/49055/Catenin-is-essential-for-differentiation-of

*5.1 : Analysez les résultats de l'expérience.

**5.2 : Proposez des hypothèses pour expliquer le rôle de la beta-caténine.

On réalise la même expérience que précédemment avec des myoblastes porteurs d'une mutation perte-de-fonction
totale de beta-caténine mais on les transfecte avec des vecteurs vides (pcDNA3) ou permettant l'expression de la beta-
caténine sauvage ou de la béta-caténine avec des mutations qui délètent soit son domaine de liaison à l'alpha-caténine,
soit son domaine de liaison à TCF. On détermine un indice de différenciation des myoblastes en myofibres en fonction
d'un certain nombre de critères (expression de MyHC, forme des cellules...). Source :
https://journals.biologists.com/dev/article/146/6/dev167080/49055/Catenin-is-essential-for-differentiation-of

**5.3 : Quelles conclusions peut-on tirer de cette expérience ?

EXERCICE 6

800
Des cellules C2C12 sont cultivées dans des conditions où elles se différencient en myotubes. On réalise une analyse
ChIPseq avec des anticorps reconnaissant la forme acétylée sur la lysine 27 de l'histone H3 et la forme méthylée sur la
lysine 4 de cette même histone. Des enhancers potentiels du gène codant la myogénine se trouvent dans la région
génomique présentée (En1, En3, En4 et En5). Ne pas tenir compte du bas de la figure. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(22)00591-9/fulltext

**6.1 : Quelles conclusions tirer de l'analyse ChIPseq ?

On utilise le système dCas9-KRAB dans les C2C12 en cours de différenciation qui permet d'orienter un facteur inhibiteur
de la transcription vers une séquence donnée du génome (par exemple vers l'enhancer potentiel En1 caractérisé
précédemment pour dCas9-KRAB-En1). Un témoin où dCas9-KRAB est exprimé mais sans pouvoir se fixer sur une
séquence donnée est également utilisé (dCas9-KRAB). On observe la morphologie des cellules et on réalise une
immunofluorescence avec un anticorps reconnaissant la myogénine (MYOG) ainsi qu'une coloration DAPI. Source :
https://www.jbc.org/article/S0021-9258(22)00591-9/fulltext

*6.2 : Quelles conclusions tirez vous de ces résultats ?

REPONSES :

1.1 : L'ARNm de Pax7. 1.2 : Homéoboîte et type paired. 1.3 : Baisse de l'expression de Pax7 dans les somites,
particulièrement les somites postérieurs. 1.4 : On voit que le signal en dehors des somites est le même (dans la tête
notamment) ce qui montre que la révélation a été faite durant une durée et des conditions similaires entre le sauvage
et le mutant. 1.5 : Non, il faudrait comparer avec le mutant perte-de-fonction ou gain-de-fonction de Pax3. Non, on ne
peut pas conclure que Pax3 agit directement.

2.1 : Dans le tissu musculaire adulte, Pax7 est exprimé dans les cellules satellites. 2.2 : La laminine est un élément de la
lame basale qui est la matrice extracellulaire qui entoure les cellules musculaires striées squelettiques. 2.3 : Les coupes
sont transversales, si elles étaient longitudinales, les fibres musculaires apparaitraient allongées en fuseau. 2.4 : Chez
les souris qui expriment Ern1, la blessure provoque 5 jours plus tard une forte augmentation du nombre de cellules
satellites. Chez les souris mutées, cette augmentation est moins forte. Les niveaux d'expression de Pax7 vus en RT-qPCR
sont changés de la même manière que le nombre de cellules, ce qui veut dire que l'expression de Pax7 par cellules
satellites est sans doute la même chez le mutant que chez le sauvage et que la baisse observée n'est que le reflet de la
baisse du nombre de cellules. Les niveaux protéiques amènent à la même conclusion même s'il faudrait quantifier le
signal obtenu. 2.5 : L'expression de Ern1 est donc cruciale pour que les cellules souches satellites prolifèrent
correctement après une blessure et donc pour les faire sortir complètement de leur quiescence. Or Ern1 est exprimé
dans les cellules musculaires striées différenciées. Il doit donc y avoir une communication entre ces cellules et les
cellules satellites sous une forme juxtacrine (adhérence, Notch/Delta...) ou paracrine (facteurs de croissance secrétés...)
qui dépend de la présence de Ern1.

3.1 : Il faut veiller à ce que la séquence codant la beta-galactosidase soit dans le même cadre de lecture que la séquence
codant Myf5 pour que la traduction puisse ajouter les bons acides aminés en lisant les bons codons. 3.2 : On observe

801
une expression segmentée typique des somites et on observe aussi une expression dans des masses cellulaires dans les
bourgeons de membre. Il y a aussi une expression céphalique, notamment dans le futur muscle hypoglosse. Cela
correspond bien à ce que l'on connait de l'expression de Myf5 qui est exprimé dans le dermomyotome (des somites),
dans les myoblastes en migration vers les bourgeons de membre et dans de futures masses musculaires céphaliques.
3.3 : On voit clairement l'expression dans les somites se scinder en deux dans la région troncale (petite flèche noire).
Cela correspond à la division en région épaxiale et hypaxiale. L'expression s'étend aussi dans la tête, pas tellement dans
les bourgeons de membre. 3.4 : A 12,5 dpc, l'expression du gène rapporteur est réduite à quelques somites, et dans
chacun de ces somites, l'expression est moins étendue. Il est exprimé dans le futur muscle hypoglosse. A 13,5 dpc, cette
expression disparaît quasiment complètement (expression résiduelle dans une partie des somites de la queue). Le
fragment d'enhancer Myf-5-I contient l'essentiel des séquences régulatrices de Myf5 tandis que le fragment Myf-5-II ne
contient que des séquences régulatrices de renforcement dans des régions bien définies (une partie des somites, futur
muscle hypoglosse) et à un moment bien défini (à 12,5 dpc et plus à 13,5 dpc).

4.1 : Lors de la phase de prolifération, on observe une forte présence de la forme entière de SATB2 (entre 75 et 100
kDa) et une faible présence d'une forme clivée qui contient l'épitope C-terminal (il y a peut-être l'autre partie de la
protéine qui est présente dans les extraits mais l'anticorps utilisé ne peut pas la reconnaître). Au fur et à mesure de la
différenciation, la forme entière est de moins en moins abondante et la forme clivée est de plus en plus abondante. On
peut proposer que lors de la différenciation la protéine STAB2 est clivée. On ne peut pas savoir si cela la rend plus active
ou moins active. 4.2 : Il s'agit de vérifier que le siARN introduit a bien fonctionné et a inhibé la production de la protéine
SATB2, ce qui est le cas. 4.3 : En condition de prolifération, on constate que les cellules sans SATB2 sont plus marquées
par la desmine et plus allongées. Après 48h de mise en culture dans des conditions de différenciation, cet effet est encore
plus visible, indiquant une différenciation précoce des cellules C2C12. Cela est confirmé par la présence d'un nombre
moyen de noyaux dans les myotubes nettement supérieur en absence de SATB2, indiquant des fusions cellulaires plus
importantes. SATB2 joue donc un rôle de frein à la différenciation des myoblastes. Le clivage observé lors de la
différenciation doit probablement inactiver la protéine.

5.1 : Dans les myoblastes sauvages, l'expression de MyHC devient visible dès le premier jour de culture dans le milieu
de différenciation puis devient de plus en plus étendue. On observe que les cellules prennent une forme allongée et se
différencient en myofibres. En absence de beta-caténine, l'expression de myHC est très retardée (très peu d'expression
au jour 2, activation plus marquée au jour 3) et la majorité des cellules ne prend pas une forme allongée. 5.2 : La béta-
caténine est impliquée dans deux processus : l'adhésion cellule-cellule lorsqu'elle est dans le complexe reliant les
cadhérines aux microfilaments d'actine et la voie de signalisation Wnt. On ne peut pas savoir avec ces expériences
laquelle de ces deux fonctions est impliquée dans ce qui est observé. Si c'est la fonction de beta-caténine dans la voie de
signalisation Wnt qui est impliqué, le milieu de différenciation utilisé en culture doit contenir des ligands Wnt. 5.3 : Il
s'agit d'une expérience de sauvetage. La réexpression de la béta-caténine sauvage permet de sauver la différenciation
en myofibres contrairement à un vecteur vide montrant la spécificité de la mutation de la beta-caténine endogène
réalisée par CRISPR-Cas9. La forme de la beta-caténine incapable de s'associer dans le complexe
cadhérine/caténine/microfilaments d'actine n'est pas capable de sauver la différenciation tandis que la forme de la
beta-caténine incapable de s'associer à TCF (et donc incapable d'être partie prenante dans la voie de signalisation Wnt)
est capable de sauver la différenciation. Cela veut dire que la fonction pertinente de la béta-caténine dans ce contexte
n'est pas sa participation à la voie de signalisation Wnt mais liée à son action dans les complexes d'adhérences cellule-
cellule.

6.1 : Le ChIPseq nous indique que des marques épigénétiques activatrices de la transcription sont présentes dans les
régions correspondant aux enhancers potentiels, ce qui correspond bien à leur fonction. On ne peut cependant en
conclure que ces enhancers régulent vraiment l'expression du gène codant la myogénine à ce stade de l'analyse. 6.2 :
Contrairement au contrôle (première colonne) où les cellules expriment fortement myogénine et forment des
myotubes, l'orientation d'un inhibiteur de la transcription vers chacun des enhancers inhibe l'expression de la
myogénine (forte diminution pour une inhibition de En1 et En3 et disparition quasi-complète pour En4 et En5) et
empêche les cellules de former des myotubes. Par conséquent, chacun des enhancers putatifs est nécessaire pour une
bonne expression de la myogénine (En4 et En5 étant absolument indispensables pour avoir au moins un peu
d'expression).

802
Exercices sur le développement des bourgeons de membre

EXERCICE 1

On place une barrière d'aluminium entre le mésoderme présomitique et les lames latérales au niveau de la zone
présomptive de développement du bourgeon de membre postérieur d'un côté d'un embryon de poulet au stade 15. On
fixe les embryons aux stades 18, 19 et 23 et on réalise des hybridations in situ avec les sondes indiquées (mélange de
sondes reconnaissant les ARNm de Shh et de FGF8 pour H). Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-
1247(15)00706-8

*1.1 Quel est l'objectif de la mise en place de la barrière ?

*1.2 Analysez et interprétez les résultats de cette expérience concernant la morphologie et les expressions de FGF10,
FGF8 et Shh.

*1.3 Quelles informations complémentaires nous apporte les hybridations in situ avec la sonde Tbx4 ?

On refait l'expérience précédente avec les barrières mais en ajoutant des billes du côté des lames latérales sécrétant du
FGF4 (I-L) ou de l'acide rétinoïque (M-P). Source : https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(15)00706-
8

*1.4 Que peut-on conclure de ces expériences sur le rôle du FGF4 et de l'acide rétinoïque au cours du développement
précoce du bourgeon de membre ? Est-ce que ce sont les inducteurs en provenance du mésoderme pré-somitique ?

803
EXERCICE 2

On cherche à connaître les effets sur le développement du bourgeon de membre d'une mutation perte de fonction du
gène codant le facteur d'initiation de la traduction eIF3C (mutant Eif3cXs-J/+) chez la souris. On réalise des préparations
de squelette des pattes antérieures (forelimb) et postérieures (hindlimb) coloré au bleu alcian/rouge alizarine. On
étudie aussi une souris double mutante perte-de-fonction Eif3cXs-J/+;Ptch1+/-. Ptch1 est une protéine impliquée dans la
voie Shh et qui l'inhibe. Les souris Ptch1+/- ne présentent pas de phénotype notable au niveau des membres. Le doigt 1
est le doigt le plus antérieur. Source : https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1534580721008108

*2.1 Décrivez et proposez une explication pour le phénotype chez les mutants Eif3cXs-J/+.

**2.2 Décrivez et interprétez le phénotype des souris Eif3cXs-J/+;Ptch1+/-.

REPONSES

1.1 Elle a pour objectif de bloquer les communications paracrines entre le mésoderme présomitique et les lames
latérales. 1.2 En comparaison avec le côté témoin à gauche, le bourgeon de membre est très atrophié du côté où la
barrière a été placée. L'expression de FGF10 est à peine activée et celle de FGF8 n'est pas activée alors que du côté sans
la barrière, l'expression de ces gènes est assez importante. FGF8 est exprimé dans l'AER que 'on voit bien formé au stade
19 du côté sans barrière et donc l'AER n'est pas formé du côté avec la barrière. Shh est légèrement exprimé du côté
normal au stade 19 dans le mésenchyme postérieur (début de la formation de la ZPA). Il n'y a pas d'expression du côté
avec la barrière. On en déduit que l'absence de communication paracrine entre le mésoderme présomitique et les lames
latérales ont gravement compromis le début du développement du bourgeon de membre. 1.3 Au stade 19, Tbx4 est tout
de même activé du côté avec la barrière mais plus faiblement et dans un volume plus petit que du côté témoin. Au stade
23, le marquage est plus large et il semble qu'un bourgeon de membre est en train de se développer avec retard (Tbx4
est un des gènes activés les plus précocement dans le bourgeon de membre postérieur, avant FGF8/10 et Shh). Il est
possible que des voies de signalisation alternatives aient pu compenser l'absence des signaux en provenance du
mésoderme présomitique. Il est aussi possible que la barrière ne limite plus bien le passage des signaux en provenance
du mésoderme présomitique (qui a pu évoluer en somites) avec la croissance des tissus. 1.4 Avec les billes sécrétant
FGF4 le bourgeon de membre produit parait plus gros au stade 23 (en comparaison avec la photo J de la figure
précédente) et on observe une expression faible de FGF10 et une expression de FGF8 dans un AER. C'est un bourgeon
de membre qui est néanmoins très en retard par rapport à celui du côté normal qui a éteint FGF10 et FGF8 qui sont
exprimés au début de la croissance du bourgeon. Le bourgeon normal exprime Shh dans la partie postérieure ce qui
n'est pas (encore ?) le cas du bourgeon du côté traité. On aurait aimé avoir pour comparaison les hybridations in situ
FGF8/10 et Shh avec la barrière mais sans les billes. Avec les billes sécrétant l'acide rétinoïque, les expressions des
gènes sont plus marquées et étendues et il y a un AER exprimant FGF8 et une ZPA exprimant Shh. L'acide rétinoïque
semble avoir aussi un effet sur le bourgeon de membre à droite réactivant des gènes comme FGF8 et FGF10 ce qui
indique que l'acide rétinoïque peut diffuser très largement et contourner la barrière. Les doses utilisées ne sont peut-
être pas physiologiques. En tout cas, FGF4 et l'acide rétinoïque sont des candidats pour constituer le signal en
provenance du mésoderme pré-somitique mais rien ne confirme que ce sont bien eux. Ils peuvent mimer l'action d'une
autre molécule ou se trouver en aval dans la cascade de signalisation par rapport au signal envoyé par le mésoderme
pré-somitique. Il faudrait faire des expériences de perte-de-fonction spécifique pour le savoir.

2.1 : Le squelette des membres antérieurs et postérieurs des mutants semblent globalement un peu plus fins/moins
développés que chez le sauvage. A part cela, la régionalisation des doigts semble normale dans la patte postérieure
tandis que dans la patte antérieure, le doigt 1 (le plus antérieur) est nettement plus allongé, avec plus de phalanges au

804
lieu d'une. Il se met à ressembler à des doigts plus postérieurs. Cette postériorisation pourrait être due à une
signalisation Shh plus importante, Shh étant un morphogène qui donne une identité plus postérieure pour de plus fortes
concentrations. 2.2 : Avec la double mutation perte-de-fonction, mêmes les pattes postérieures présentent désormais
une postériorisation du doigt 1 et il y a un doigt supplémentaire (polydactylie) qui est lui aussi postériorisé. Dans les
pattes antérieures, la postériorisation du doigt 1 est encore plus marquée que dans le simple mutant et il y a aussi
développement d'un doigt supplémentaire. Sachant que les souris Ptch1+/- ne présentent pas de phénotype notable au
niveau des doigts, cela indique une interaction génétique importante entre eIF3c et la voie Shh dont fait partie Ptch1 en
tant qu'inhibiteur. Ainsi, le facteur eIF3c serait requis pour inhiber la voie Shh et renforce l'effet de la mutation Ptch1
(et inverse

Exercices sur la gamétogenèse et la fécondation

EXERCICE 1 :

**Dans certains cas, l'ICSI échoue à donner un embryon. Parmi ces échecs, les chercheurs ont trouvé des cas où PLC-ζ
n'est pas exprimé ou n'est pas fonctionnelle chez les hommes dont on a utilisé les spermatozoïdes. Expliquez pourquoi
cela peut causer l'échec de l'ICSI. Comment y remédier tout en continuant à utiliser les spermatozoïdes des mêmes
hommes ?

EXERCICE 2 :

Le gène WT1 code un facteur de transcription exprimé (entre autres) dans les cellules folliculaires. Des femmes
infertiles portent une mutation à l'état hétérozygote dans la séquence codante de WT1 changeant l'arginine en position
394 en tryptophane. On produit des lignées de souris reproduisant la mutation wt1+/R394W. (A, D) On étudie des coupes
d'ovaires de souris tout juste mature sexuellement. (E) Quantification par ovaire du nombre de follicules primordiaux
et du nombre de follicules primaires chez les souris sauvages et mutantes. Source : doi:10.1093/hmg/ddt423

*2.1 Comment peut-on qualifier la mutation qui affecte les patientes ?

*2.2 En observant les coupes histologiques (A-D), quelles différences peut-on observer entre les ovaires des souris
sauvages et des souris mutantes ?

*2.3 Que déduisez-vous des quantifications en E ? Comment pourrait alors s'expliquer la stérilité des femmes porteuses
de la mutation ?

EXERCICE 3

Extrait du sujet de Bac STL 2012

805
En 2004, des scientifiques ont étudié, chez un groupe d’une quinzaine d’hommes volontaires, l’effet d’implants sous-
cutanés contenant de la testostérone. Les implants ont été renouvelés toutes les douze semaines.
Trois paramètres ont été étudiés pendant 48 semaines :
la concentration plasmatique en hormone lutéinisante (LH), la concentration plasmatique en hormone
folliculostimulante (FSH) et le pourcentage d'infertilité.
Aucun effet secondaire n’a été observé chez les sujets ni pendant, ni après l’expérience.

*3.1 Analysez et expliquez les résultats obtenus concernant les concentrations plasmatiques de LH et de FSH.

*3.2 Comment évolue la fertilité des hommes traités. Proposez une explication.

806
EXERCICE 4

On cherche à étudier le rôle de la protéine MLX qui est un facteur de transcription dont l'activité dépend de la
disponibilité en glucose. Le gène Mlx est délété dans les cellules de Sertoli grâce à un système Cre/Lox avec la Cre sous
le contrôle du promoteur du gène codant AMH. On réalise des coupes de testicule sur des souris adultes mâles dites
sauvages (WT testis) ou mutantes (KO testis) et on les colore au DAPI (bleu) ou avec une immunofluorescence
reconnaissant SOX9 exprimé dans les cellules de Sertoli (vert). A gauche, n'a été utilisé que l'anticorps secondaire et pas
l'anticorps primaire. Barre d'échelle = 400 µm. La fertilité des mâles est testée par des croisements et les mâles sont
pesés (fl/fl = WT; fl/fl+Amh-Cre = KO). Source :
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3001085

*4.1 : Justifiez l'utilisation du système Cre/Lox avec la Cre sous le contrôle du promoteur du gène codant l'AMH pour
déléter Mlx dans les cellules de Sertoli.

*4.2 : Analysez et interprétez les résultats.

EXERCICE 5

DCST1 et DCST2 sont deux protéines présentes à la membrane plasmique des spermatozoïdes (spzdes). Des spzdes
sauvages (Ctrl) et mutants perte-de-fonction pour Dcst1 (Dcst1d1/d1) et Dcst2 (Dcst2d25/d25) sont mis en incubation avec
des ovocytes (A) pendant 30 min puis on "lave" les spzdes non accrochés à l'ovocyte. En B, on étudie par western-blot
l'expression de IZUMO1 et de SLC2A3 dans les cellules germinales testiculaires (TGC) et dans les spermatozoïdes.
SLC2A3 est un transporteur de glucose très exprimé dans le flagelle des spzdes et il est utilisé comme contrôle de dépot.
Source : https://www.nature.com/articles/s42003-022-03289-w

*5.1 Que constate-t-on sur les photos en A ?

807
*5.2 Quel est la localisation et le rôle de la protéine IZUMO ? Qu'observe-t-on concernant son expression dans les spzdes
avec les différents génotypes ?

(C) On réalise une immunofluorescence avec des anticorps qui reconnaissent IZUMO (vert) sur des spermatozoïdes
incubés en présence d'ovocytes. Il n'y a pas d'étape de perméabilisation pour cette immunofluorescence. (D) On
compte le nombre de spzdes qui ont réalisé la réaction acrosomiale et attaché à la membrane plasmique de l'ovocyte.
Source : https://www.nature.com/articles/s42003-022-03289-w

*5.3 Analysez les résultats en C.

*5.4 Analysez les résultats en D et proposez des hypothèses pour les expliquer.

On incube les
ovocytes avec du Hoechst33342 qui marque l'ADN (en bleu) puis on lave le Hoechst33342 et on met en présence
l'ovocyte avec les différents types de spzdes. Source : https://www.nature.com/articles/s42003-022-03289-w

**5.5 Analysez et interprétez l'expérience présentée en E.

*5.6 Que nous confirme les résultats en F ?

REPONSES :

1 : Lors d'une ICSI, on introduit la tête d'un spermatozoïde dans le cytoplasme de l'ovocyte. PLC-ζ se trouve
normalement dans le cytoplasme de la tête du spermatozoïde et passe dans le cytoplasme de l'ovocyte. Cette
phospholipase clive PI(4,5)P2 et permet de produire IP3 (inositol-triphosphate) qui active le sortie du Ca2+ du réticulum
endoplasmique vers le cytosol. Ce Ca2+ est nécessaire à l'activation de l'ovocyte et au démarrage du développement
embryonnaire. Sans cette PLC-ζ, l'ICSI est un échec. Pour remédier au problème, on pourrait utiliser des ionophores à
Ca2+ c'est-à-dire des molécules qui perméabilisent la membrane plasmique de l'ovocyte à Ca 2+ permettant ainsi d'activer
l'ovocyte et d'enclencher la suite du développement (c'est une technique qui existe et qui s'appelle l'activation assistée
de l'ovocyte).

808
2.1 : C'est une mutation dominante car un seul allèle muté provoque un phénotype. 2.2 : En A et B, on constate que les
ovaires des souris mutées sont plus petits que les ovaires des souris sauvages. Cela est dû à un nombre de follicules qui
parait plus faible. Quand on regarde à plus fort grossissement, on observe que les cellules folliculaires autour des
ovocytes sont bien ordonnées chez les souris sauvages alors que l'organisation est plus désordonnée chez les souris
mutées. 2.3 : Le nombre de follicules primordiaux n'est pas statistiquement différent entre les souris sauvages et mutées
ce qui indique que le développement embryonnaire s'est passé normalement et que le début de la folliculogenèse n'a
pas été affecté. En revanche, il y a significativement moins de follicules primaires chez les souris mutées. Cela indique
que la mutation de WT1 a bloqué le développement des follicules au stade primordial. La stérilité des femmes pourrait
être expliqué par le fait que les follicules n'arrivent pas à maturer à partir de la puberté (où, normalement,
régulièrement, une cohorte de follicules commence leur maturation jusqu'à ce qu'il y en ait un qui domine les autres et
permette l'ovulation). Les follicules restent dans un état immature.

3.1 : Les taux de LH et de FSH baissent drastiquement à cause du rétrocontrôle négatif exercé par la testostérone dans
l'adénohypophyse. 3.2 : La fertilité baisse et est complètement nulle au bout de 12 semaines. Cela peut s'expliquer par
le fait que l'inhibition de la production de FSH aboutit à moins stimuler les cellules de Sertoli qui aident la
spermatogenèse à s'accomplir (la production de testostérone par les cellules de Leydig sous la stimulation de la LH est
abolie car la concentration de LH devient nulle mais l'implant permet un bon apport de testostérone donc ce n'est pas
cela l'origine de l'infertilité).

4.1 : L'AMH est une hormone qui est produite spécifiquement par les cellules de Sertoli et pas par d'autres cellules
somatiques ou les cellules germinales dans les testicules. Ainsi, le gène Mlx flanqué de séquences Lox ne sera délété par
la Cre que dans les cellules de Sertoli. 4.2 : On constate que les souris mâles sans Mlx dans leurs cellules de Sertoli sont
complètement stériles mais ce n'est pas dû à un retard général de croissance puisque leur poids est normal. Sur les
coupes des mutants, on observe des tubes séminifères avec un grand nombre de cellules de Sertoli mais pas d'autres
cellules (dont le noyau aurait pu être marqué par le DAPI). On en conclut qu'il y a un grand déficit en cellules germinales
ce qui peut expliquer la stérilité. Sachant que le gène Mlx a été délété uniquement dans les cellules de Sertoli, on met ici
en évidence un effet non-cellulaire autonome des cellules de Sertoli sur les cellules germinales. Il y a aussi un effet
cellulaire autonome avec des cellules de Sertoli plus nombreuses dû à une plus forte prolifération (ou une moindre
apoptose).

5.1 : Les spzdes sans DCST1 ou sans DCST2 sont capables de s'accrocher aux ovocytes (leur zone pellucide ou leur
membrane plasmique, on ne peut pas le distinguer). 5.2 : IZUMO est localisé à la membrane de l'acrosome puis après la
réaction acrosomiale (ou acrosomique), à la membrane plasmique. Cette protéine interagit avec JUNO qui se trouve à la
membrane plasmique de l'ovocyte et cette interaction est nécessaire à la fusion entre les membranes plasmiques des 2
gamètes. On n'observe pas de différences notables dans l'expression d'IZUMO démontrant que ni DCST1, ni DCST2 ne
sont indispensables pour son expression. 5.3 : Le fait de voir IZUMO en immunofluorescence sans perméabilisation veut
dire que la réaction acrosomiale a eu lieu car elle est nécessaire pour que IZUMO soit à la membrane plasmique et donc
détectable par un anticorps dans ces conditions. On constate que les spzdes mutants n'ont aucun problème notable à
réaliser la réaction acrosomiale. Soit ni DCST1, ni DCST2 sont impliqués dans ce processus, soit l'absence de l'un peut
être compensé par l'autre. 5.4 : Il y a en moyenne plus de spzdes mutants accrochés à la membrane plasmique de
l'ovocyte que de spzdes sauvages. Cela peut vouloir dire que DCST1 et DCST2 diminuent les capacités de fixation des
spzdes à la membrane plasmique de l'ovocyte ou alors que DCST1 ou DCST2 sont nécessaires pour l'étape suivante et
que le blocage de la polyspermie n'a pas été enclenché permettant à de multiples spermatozoïdes de s'accrocher à la
membrane plasmique de l'ovocyte. 5.5 : On observe le marquage Hoechst dans le pronucléus de l'ovocyte mais aussi
chez le contrôle dans le pronucléus mâle (flèche). Ce dernier marquage ne correspond pas au noyau d'un spzde resté à
l'extérieur puisque le Hoechst n'est plus présent lors de la fécondation et donc l'ADN du spzde doit être dans l'ovocyte
pour pouvoir être marqué. On n'observe pas de marquage autre que celui du noyau femelle dans les ovocytes fécondés
avec les spzdes mutants. On en déduit qu'il n'y a pas eu de fusion entre les spzdes mutants et les ovocytes. 5.6 : Ces
données nous permettent de confirmer que DCST1 ou DCST2 sont nécessaires pour la fusion entre spzdes et ovocytes.

809
GLOSSAIRES

Glossaire des termes scientifiques

3'UTR : séquence sur l'ARNm au-delà du codon STOP qui contient souvent des sites spécifiques de fixation
des microARN ou pour des protéines permettant la localisation des ARNm dans une région du cytoplasme.

Accouplement : rapprochement et ensemble d’actes accomplis par deux individus sexuellement

complémentaires aboutissant à une reproduction sexuée.

Acrosome : vésicule homologue d’un lysosome, situé au sommet de la tête du spermatozoïde, contenant
des enzymes qui lysent la membrane vitelline (ou zone pellucide) de l’ovocyte et qui favorisent la fusion des
membranes plasmiques du spermatozoïde et de l’ovule.

AER (pour crête apicale ectodermique) : structure épaissie de l'ectoderme à l'extrémité distale du bourgeon
de membre, qui sécrète des FGF et est nécessaire à la croissance proximo-distale du membre et au maintien
de la ZPA.

Alécithe : se dit d’un ovocyte qui ne contient pas (ou très peu) de vitellus. Ex : chez les mammifères (autres
que les monotrèmes).

Allantoïde : chez les amniotes, annexe embryonnaire composée d’endoderme doublé de mésoderme
vascularisé. Sert de « poche urinaire » et, accolé au chorion (ectoderme et somatopleure), elle sert aussi de
surface d’échange respiratoire chez les sauropsidés. Chez les mammifères euthériens, participe à la
formation de la vascularisation du placenta et au cordon ombilical.

Allèle : L'une des différentes formes d'un gène qui peut exister à un locus donné.

Amnios : (nom masculin) annexe embryonnaire formée d’ectoderme doublé de mésoderme qui forme la
cavité amniotique (ou poche des eaux chez les mammifères euthériens) permettant la protection hydrique
et mécanique de l’embryon. Chez les hexapodes, existe une amnioserosa formée uniquement d’ectoderme
à fonction analogue (exemple de convergence évolutive => reproduction indépendante du milieu
aquatique).

Amniote : phylum de vertébrés tétrapodes qui développent un amnios au cours de son développement
embryonnaire (tous les tétrapodes sauf les amphibiens). Tous les Amniotes possèdent aussi une allantoïde.

Amplexus : technique d'accouplement de la plupart des anoures et des urodèles, qui voit le mâle monter
sur le dos de la femelle et s'accrocher à elle avec ses pattes (et sa queue pour certains urodèles). À cet effet,
de nombreux anoures mâles présentent des callosités nuptiales qui permettent de mieux saisir la femelle
(dimorphisme sexuel). L’émission des gamètes est simultanée et malgré la fécondation externe dans le
milieu aquatique, il y a peu d’effets de dilution.

Anisogamie : différence de taille et de forme entre les gamètes mâle et femelle.

Annexe embryonnaire : structure transitoire formée à partir d’extensions des feuillets embryonnaires et
qui assurent la survie de l’embryon.

Anoikis : activation de l'apoptose lorsqu'une cellule se détache de la matrice extracellulaire.

Apoptose : un type de mort cellulaire programmée, avec une phase de fragmentation active de l'ADN, activé
par des voies de signalisation spécifiques. Ex : apoptose interdigitale lors du développement des membres
chiridiens. Détectée par la technique du TUNEL.

Area opaca : À la périphérie de l'embryon des oiseaux durant le clivage et le début de la gastrulation,
épiblaste qui repose sur une couche rigide de plusieurs cellules épaisses de grandes cellules
mésenchymateuses, qui entrent directement en contact avec le vitellus sous-jacent. Ne donne ensuite que
des tissus extraembryonnaires. S'oppose à Area Pellucida.
810
Archentéron : cavité qui se forme lors de la gastrulation des amphibiens, qui est ouverte sur l’extérieur par
le blastopore et qui donne naissance à la lumière du tube digestif.

Autophagie : processus par lequel des protéines et des organites sont adressés aux lysosomes pour y être
dégradés via une vésicule à double membrane appelée autophagosome.

Autophagosome : Vésicules transitoires à double membrane qui engloutissent les composants

cytoplasmiques, y compris des organites entiers, et les livrent aux lysosomes pour dégradation.

Axone : prolongement cellulaire des neurones maintenu essentiellement par des microtubules qui génère
un potentiel d'action et le propage jusqu'à la ou les synpase.s terminale.s. Lors de son développement, il est
terminé par un cône de croissance.

Axonème : faisceau de microtubules et de protéines associées que l'on trouve dans les cils et les flagelles et
responsable de leurs mouvements.

Barr : voir corps de Barr

Blastocœle : cavité de la blastula délimitée par les blastomères.

Blastocyste : blastula des mammifères marsupiaux et euthériens comportant un blastocœle entouré des
cellules trophectodermiques et de la masse cellulaire interne.

Blastomère : cellules du stade blastula. Chez les amphibiens, on distingue les petits micromères dans
l'hémisphère animal et les gros macromères dans l'hémisphère végétatif.

Blastopore : cavité formée par l’invagination de l’endoderme lors de la gastrulation et dont le devenir
définit les protostomiens (donne la bouche) et les deutérostomiens (donne l'anus).

Blastula : stade embryonnaire correspondant aux étapes intermédiaires du clivage composé de

blastomères entourant un blastocœle.

Bordure neurale : région de l'ectoderme entre la plaque neurale et l'ectoderme non-neurale d'où émergent
les cellules de crête neurale et les placodes.

Canal de Wolff : canal pair chez l'embryon des Vertébrés qui dérive du mésoderme intermédiaire et qui
élimine l'urine des reins embryonnaires. Garde une fonction urinaire après la naissance chez les
Anamniotes (et peut aussi transporter des spermatozoïdes comme chez les Amphibiens mâles). Chez les
Amniotes mâles, perd sa fonction urinaire et devient l'épididyme et le canal déférent et par
bourgeonnement, contribue aux vésicules séminales et à la prostate. Régresse chez les Amniotes femelles.

Capacitation : maturation des spermatozoïdes* induite par les sécrétions de l'utérus et de l'oviducte des
femelles des mammifères les rendant capable de féconder l'ovocyte (hyper-activation de la nage,
augmentation de la fluidité membranaire).

Carte des territoires présomptifs : carte des territoires d'un embryon à un stade donné, obtenu par
marquage d'un groupe de cellules puis observation de la destinée de ces cellules au cours du
développement.

Cellule de Schwann : cellule gliale formant une gaine de myéline autour d'un axone dans le système
nerveux périphérique, dérivée des cellules de crêtes neurales.

Cellule ES = cellules souches embryonnaires : cellules totipotentes cultivées in vitro obtenues à partir de
la masse cellulaire interne de blastocyste de mammifères. En présence de facteurs de croissance et de
différenciation adéquats, peuvent se différencier en n'importe quelle cellule de mammifère.

Cellules iPS = cellules souches pluripotentes induites : cellules obtenues à partir de cellules
différenciées par l'activation par 4 facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc) du programme de
pluripotence.

811
Cellules satellites : cellules souches chez l'adulte capable de régénérer des cellules musculaires striés
squelettiques. Marqueur : Pax7.

Cellules souches : cellules capables de s'auto-renouveler lors de leur prolifération mais elles peuvent être
quiescentes. Ne sont pas obligatoirement pluripotentes.

Centre quiescent : groupe de cellules en phase G0 qui maintient par des signaux la niche des cellules
souches du méristème apical racinaire et empêche leur différenciation.

Centriole : structure cylindrique formée de 9 triplets de microtubules qui est présente en deux exemplaires
dans le centrosome*.

Centrosome : centre organisateur des microtubules, en général formé d'une paire de centrioles. Il n'existe
pas chez les végétaux.

Chorde ou corde : tissu mésodermique dorsal sous le tube neural servant de structure de soutien aux
embryons des cordés et de centre de signalisation (sécrétion de Sonic Hedgehog, induction du sclérotome
et du tube neural ventral).

Chromatide (n. f.) : moitié d'un chromosome après la phase du cycle cellulaire issu de la réplication de
l'ADN. Les chromatides d'un même chromosome sont accrochées entre elles au niveau d'un centromère
jusqu'à l'anaphase de la mitose (ou de la méiose II).

Chromatine : Complexe formé par l'ADN associé à des protéines (notamment les histones). L'état de
condensation de la chromatine est un paramètre épigénétique majeur contrôlant la transcription.

Cil primaire : région particulière de la cellule formée par un repli de la membrane plasmique autour d'un
axonème formé de neuf doublets de microtubules formant un axonème surmontant un centriole. Centre de
signalisation de la cellule.

Clivage : première étape du développement embryonnaire où le zygote puis l'embryon subit des mitoses
successives, compartimentant le cytoplasme issu de l'ovocyte. Peut être radiaire ou spirale (Spiralia), total
ou partiel lorsqu’une partie du cytoplasme de l'ovocyte n'est pas cellularisé (cas des embryons issus
d'ovocytes télolécithes).

Cœlome : cavité creusée dans le mésoderme, servant souvent d’hydrosquelette.

Compaction : au stade 8 cellules du développement des mammifères, augmentation de l'activité des E-

cadhérines d'origine maternelle qui provoque une plus forte adhérence entre les cellules embryonnaires.

Compétence : capacité des cellules à répondre à un signal inducteur (par l'expression d'un récepteur à une
protéine secrétée par exemple).

Corona radiata : Cellules folliculaires du cumulus oophorus entourant directement l'ovocyte et la zone
pellucide dans une follicule mature (de De Graaf) de Mammifère.

Corps de Barr : Une masse dense observée dans la chromatine des noyaux des cellules des mammifères
femelles qui correspond à un des chromosomes X qui est inactivé.

Corps jaune (ou corpus luteum) : glande endocrine temporaire formée par les cellules folliculaires qui sont
restées dans l'ovaire après l'ovulation. Sécrète notamment de la progestérone qui permet la maturation
complète de l'endomètre de l'utérus.

Crêtes génitales : partie du mésoderme intermédiaire à partir de laquelle se développe la gonade

bipotentielle qui est colonisée par les cellules germinales.

Crêtes neurales : cellules multipotentes présentes chez les vertébrés, émigrant de la partie dorsale du tube
neural à la fin de la neurulation et migrant à travers l’embryon pour former le système nerveux
périphérique, les mélanocytes et dans la tête des structures osseuses. Parfois qualifiées de quatrième
feuillet.

812
Croissant de Koller : Bande de cellules épithéliales à la limite latérale postérieure entre l'area opaca et de
l'area pellucida en pré-gastrulation de l'embryon d'oiseau. Cette bande prend une forme allongée et
s'épaissit. Permet le développement de la ligne primitive.

Cytonème : Fine expansion cellulaire apparentée à un filopode qui permet de transporter des protéines de
signalisation (par exemple Sonic Hedgehog) et de les secréter à distance de la partie principale de la cellule.

Dendrite : Extension d'un neurone généralement ramifiée qui reçoit des signaux en provenance de l'axone
d'autres neurones (soit à son extrémité, soit sur son trajet (formation alors d'épine dendritique)).

Dermomyotome (ou dermamyotome) : côté dorso-latéral du somite une fois que le sclérotome en
position ventrale a subi la transition épithélio-mésenchymateuse. Donne le dermatome à l'origine du derme
et le myotome à l'origine des mucles du dos et des membres.

Desmosome : jonction adhérente dans un épithélium (ou dans le muscle cardiaque) constitué de
desmocolline et de desmoplakine liée via un complexe à des filaments intermédiaires.

Détermination : Activation d'un programme génétique dans une cellule qui restreint ses potentialités et
l'engage vers une destinée cellulaire. Précède la différenciation.

Deutérostomien : animal dont le blastopore a donné l’anus et dont la bouche se forme secondairement.
Comprend les Echinodermes et les Cordés.

Diblastique (ou diploblastique): se dit d’un organisme qui n’a que deux feuillets (ectoderme et
endoderme). Ex : les cnidaires, les spongiaires

Différenciation : mise en place des caractéristiques spécifiques (moléculaires, morphologiques,

fonctionnelles) d'un type cellulaire donné. Succède à plusieurs étapes de détermination.

Dimorphisme sexuel : ensemble des différences morphologiques entre le mâle et la femelle d'une même
espèce.

Domaine de transactivation : Partie d'un facteur de transcription requise pour l'activation de la

transcription d’un ou plusieurs gènes cibles. Il peut se lier à des composants de la machinerie
transcriptionnelle et/ou peut recruter des protéines qui modifient la structure de la chromatine.

Ectoderme : Feuillet embryonnaire externe donnant naissance à l’épiderme et au système nerveux

(neurectoderme) après induction.

Empreinte parentale : différence d'expression d'un allèle en fonction de son origine maternelle ou
paternelle.

Endocrine : mode de communication intercellulaire par lequel une hormone ou une neurohormone est
secrétée dans le sang et active un récepteur dans des cellules-cibles spécifiques où une voie de signalisation
est activée en aval.

Endoderme : Feuillet embryonnaire interne donnant naissance au tube digestif et à ses annexes (foie,
pancréas) ainsi qu'aux poumons, aux branchies (internes), et à la vessie quand ils sont présents.

Endoderme viscéral antérieur (AVE) : région extra-embryonnaire des mammifères qui sécrète des
inhibiteurs des WNT, BMP et NODAL et induit la région antérieure de l’embryon, en empêchant notamment
la ligne primitive de se former de ce côté.

Enhancer : séquences d'ADN auxquelles se lient des facteurs de transcription spécifiques pour contrôler la
transcription d’un gène dans le temps et dans l’espace (les enhancers stimulent la transcription,
contrairement aux silencers). Contrairement aux promoteurs, ils ne se situent pas forcément juste avant ou
juste après le site de démarrage de la transcription et leur orientation est indifférente. Ils sont cependant
souvent dans le même domaine topologique de la chromatine (TAD) que le.s gène.s qu'ils contrôlent.

Epididyme (n.m.) : canal tortueux, collé au bord postérieur du testicule des amniotes. Son extrémité
supérieure (la tête) reçoit les spermatozoïdes venant des tubes séminifères qui y maturent, la partie
813
inférieure (corps et queue) est le lieu d'accumulation des spermatozoïdes qui sont ensuite expulsés dans le
canal déférent.

Epigénétique : Modifications chimiques des histones ou de l'ADN qui modifient l'expression du gène sans
altérer la séquence d'ADN.

Epineurien : se dit d'un organisme ayant un système nerveux central dorsal formé par lors de la
neurulation par l'invagination et la fermeture d'un tube dorsal. Les épineuriens sont les cordés.

Epistasie : Une situation dans laquelle le différentiel phénotypique de l'expression d'un génotype à un locus
dépend du génotype à un autre locus.

Extension convergente : réarrangement cellulaire dans un tissu qui diminue sa taille dans une dimension
et l'augmente dans une autre. Ex : allongement selon l'axe antéro-postérieur à la fin de la gastrulation.

Facteur de transcription : Protéine se fixant à l'ADN au niveau de séquences spécifiques, dans un contexte
chromatinien particulier et qui contrôle la transcription. Certains facteurs de transcription sont dits
généraux et recrutent une ARN polymérase sur le promoteur central d'un grand ensemble de gènes, d'autres
sont spécifiques et concernent un nombre plus restreint de gènes.

Fécondation : Union d’un gamète mâle et d’un gamète femelle qui aboutit à la formation d’un zygote
diploïde. Peut être externe ou interne.

Feuillet embryonnaire : Ensemble de cellules déterminées avant la gastrulation et qui s'individualise et se

positionne dans l'embryon au cours de la gastrulation de manière caractéristique au plan d'organisation.

Flagelle (ici eucaryote) : Fin et long prolongement cellulaire soutenu par un axonème formé de plusieurs
faisceaux de microtubules associés à la dynéine et capable de mouvements permettant de propulser une
cellule (les spermatozoïdes par exemple).

Folliculaires (cellules) : cellules somatiques qui entourent l'ovocyte au sein de follicules. Contrôlent le
développement de l'ovocyte et des organes génitaux via la production d'hormones (et de sécrétions
paracrines).

Gamète : cellule haploïde issue d'une méiose qui contribue par la fécondation à générer un nouvel
organisme.

Gastrulation : phase du développement embryonnaire suivant le clivage où les feuillets embryonnaires

s'individualisent et se positionnent les uns par rapport aux autres grâce à des mouvements cellulaires.

Germarium : Tissu le plus antérieur de l'ovaire des insectes où les ovocytes se développent à partir de
cellules issues des cellules souches germinales.

Germinale (lignée) : ensemble des gamètes et des cellules embryonnaires aboutissant à donner ces
gamètes. Par opposition à la lignée somatique.

Gène à effet maternel : Un gène exprimé lors de l'ovogenèse et qui a des effets sur le développement de
l'embryon. Exemple : bicoid chez la drosophile.

Gène candidat : Un gène qui, à cause de sa position chromosomique, son expression ou la structure de la
protéine qu’il code devient un candidat pour une fonction particulière ou pour causer une maladie lorsqu’il
est muté.

Glandes mammaires : glandes exocrines dérivées des glandes sudoripares caractérisant les mammifères
et sécrétant du lait permettant la nutrition du nouveau-né (lactation).

Globule polaire : cellule issue d'une division cellulaire très asymétrique lors des divisions méiotiques de
l'ovogenèse.

Granules corticaux : vésicules de sécrétion stockées sous la membrane plasmique de l'ovocyte qui sont
exocytées à la suite de l'entrée du Ca2+ dans le cytoplasme suivant la fécondation. Les enzymes déversées
814
clivent des protéines de la matrice extracellulaire de l'ovocyte rendant l'attachement de nouveaux
spermatozoïdes impossible.

Haploinsuffisance : le fait que la possession d'un seul allèle fonctionnel au lieu de deux provoque un
phénotype.

Hématopoïèse : ensemble des processus de multiplication et de différenciation des cellules sanguines. Au

cours du développement embryonnaire des mammifères, elle se déroule d’abord dans la vésicule vitelline
puis dans le foie (et dans la rate) et enfin dans la moelle osseuse où elle continue après la naissance.

Hétérochromatine : structure chromatinienne compacte, souvent riche en séquences répétées, résistante

à l'action de la DNAse I. La forte densité en nucléosomes de l'hétérochromatine limite l'accès de la
machinerie transcriptionnelle à l'ADN (et favorise aussi le maintien sous silence et la stabilité des éléments
transposables).

Hétérolécithe : se dit d’un ovocyte dont les réserves énergétiques (vitellus) assez abondantes sont
réparties de manière inégale dans le cytoplasme (plus concentrées autour du pôle végétatif). Ex : ovocyte
d’Amphibiens.

Hétérozygote : locus (ou par extension individu) avec deux allèles différents pour un gène donné. Opposé
à homozygote.

Homozygote : locus (ou par extension individu) avec deux allèles identiques pour un gène donné. Opposé
à hétérozygote.

Hyponeurien : organismes dont le système nerveux est essentiellement formé d'une chaîne nerveuse
ventrale de ganglions. Il peut y avoir des ganglions dorsaux dans la tête. Ex : annélides, arthropodes.

Implantation : Etape du développement lors du clivage de l'embryon des Mammifères lorsqu'il s'accroche
à la paroi de l'endomètre utérin et l'envahit grâce aux cellules du trophoblaste.

Induction embryonnaire : spécification d'un groupe de cellules dans l'embryon sous l'influence de signaux
produits par un groupe de cellules voisines. Les cellules qui reçoivent et interprètent les signaux sont dites
compétentes.

Inhibition latérale : Capacité qu'a une cellule à inhiber les cellules voisines à prendre le même destin
qu'elle. Typiquement médiée par la voie de signalisation Notch.

Involution : lors de la gastrulation des Amphibiens, mouvement du mésoderme qui passe par la lèvre
dorsale du blastopore et qui fait une rotation de presque 180° pour remonter par l'intérieur le long des
couches cellulaires de l'hémisphère animal.

Kinétochore : assemblage supramoléculaire protéique au niveau des centromères des chromosomes qui
permet de les relier aux faisceaux de microtubules lors de la mitose ou de la méiose.

Larve : forme post-embryonnaire immature des animaux à développement indirect dont la structure et le
mode de vie sont souvent très différents de l’adulte. Passage à l’état adulte par une métamorphose.

LncRNA : pour long non-coding RNA. ARN de plus de 200 nucléotides qui ne codent pas une protéine. Vaste
famille avec plusieurs milliers de membres chez l'Homme. Participent à de nombreuses fonctions
notamment dans la régulation de l'expression génétique. Exemple : Xist, Hotair

Locus : emplacement sur un chromosome. Un gène peut y être situé mais pas forcément.

Masse cellulaire interne : cellules faisant saillie dans le blastocœle du blastocyste des mammifères
euthériens et qui donnent toutes les cellules de l'embryon (pluripotence) et une partie des cellules des
annexes embryonnaires. Donne les cellules ES quand cultivées et maintenues pluripotentes in vitro.

Méristème apical caulinaire : méristème qui génère la tige, les feuilles et après induction florale, les fleurs.
Contient une niche où la présence de cellules souches est maintenue par la signalisation Wuschel/Clavata.

815
Mésoderme : Feuillet embryonnaire présent uniquement chez les Triploblastiques (=Bilateria) qui donne
naissance aux cellules sanguines, aux vaisseaux sanguins, au squelette interne, aux muscles, au derme…

Métamère : unité répétée le long de l'axe antéro-postérieur organisée autour d'une paire de cavités
cœlomiques.

Métamorphose : Période de la vie d'un animal qui correspond au passage d'une forme larvaire à une forme
juvénile ou adulte. Elle se manifeste le plus souvent par d'importants changements (histologiques,
physiologiques, comportementaux, etc.) et une modification du plan d’organisation et du mode et du milieu
de vie.

MicroARN : petits ARN (22 nucléotides en général) non traduits qui sont capables de bloquer la traduction
d'un ARNm en se fixant sur une séquence cible (sur son 3'UTR en général) avec l'assistance d'un complexe
RISC.

Microtubules : Les microtubules sont des structures creuses polarisées assemblées par polymérisation
dépendante du guanosine triphosphate (GTP) d'hétérodimères de tubuline a/β.

Morphogène : Molécule (généralement une protéine secrétée mais peut être aussi l'acide rétinoïque) qui a
un effet différent sur la destinée des cellules selon sa concentration.

Morula : stade du développement embryonnaire lors du clivage qui se présente sous forme d’une masse
boursouflée ressemblant à une mûre (typiquement un embryon de Mammifère à 8 cellules avant la
compaction)

Müller (canaux de) : canaux embryonnaires qui se développent chez les femelles mammifères en
oviductes, utérus et en partie supérieure du vagin. Dégénèrent chez les mâles sous le contrôle de l’hormone
anti-müllerienne.

Multipotence : capacité d'une cellule souche à donner naissance à différents types cellulaires mais de
manière plus restreinte que la pluripotence. Ex : cellule souche hématopoïétique, cellule de la crête neurale.

Myoblaste : cellule déterminée à donner des cellules musculaires, capables de proliférer et de migrer mais
non encore différenciée.

Neurulation : Phase du développement embryonnaire (en fin ou après la gastrulation) où il y a

individualisation du système nerveux central du reste de l’ectoderme. Chez les cordés, il y a formation puis
invagination de la plaque neurale (neurectoderme) à l’origine du tube neural. Chez les protostomiens, phase
de détachement de l’ectoderme des cellules à l’origine des ganglions.

Niche : Environnement qui permet à des cellules souches de maintenir leurs propriétés par les facteurs
paracrines, la matrice extracellulaire et les adhérences cellule-cellule présentes.

Organisateur (ou centre organisateur) : région nécessaire et suffisante pour l'induction d'axes de polarité
ou d'organes. Ex : organisateur de Spemann qui induit le tissu neural dans l'ectoderme et dorsalise le
mésoderme.

Organogénèse : phase tardive du développement embryonnaire où les organes se mettent en place par
interaction entre les différents tissus.

Orthologue : se dit de gènes qui dérivent d'un gène commun et qui appartiennent à deux espèces
différentes (cas particulier de gènes homologues). A distinguer des gènes paralogues.

Ossification endochondrale : mode de développement et de croissance des os longs où les cellules

cartilagineuses (chondrocytes) s'hypertrophient et meurent et sont remplacées par des ostéocytes qui
génèrent une matrice extracellulaire osseuse calcifiée et par des cellules sanguines qui forment la moelle
rouge osseuse.

Ovariole : chaîne de productions d'œufs qui compose les ovaires des insectes. Dans sa partie antérieure, se
trouve le germarium où se situe la niche des cellules souches germinales et folliculaires.

816
Ovocyte : gamète femelle en train d'accomplir sa méiose. C'est en général au stade ovocyte II (blocage en
métaphase II de la deuxième division méiotique) qu'il y a fécondation (sauf chez l'oursin par exemple).

Paralogues : se dit de gènes qui dérivent d'un ancêtre commun à la suite d'une duplication dans le génome.
Peuvent se trouver dans un même organisme ou dans des organismes différents. Cas particulier de gènes
homologues, à distinguer de gènes orthologues.

Phénotype : état d'un caractère mesurable ou observable chez un individu.

Placodes : épaississements de l'ectoderme issus de la bordure neurale à l'origine de nombreuses structures

sensorielles (placode otique, placode du cristallin...)

Plaque neurale : zone aplatie de l'ectoderme dorsal qui se forme au début de la neurulation et qui formera
le tube neural. Marqueur : Sox2.

Plasmodesme : chez les végétaux, canal traversant la paroi cellulaire et reliant les cytoplasmes de deux
cellules adjacentes en un symplasme.

Pléiotropie : qualifie un gène dont la mutation peut avoir des effets phénotypiques sur plusieurs organes
ou tissus (gène pléiotrope).

Pluripotence : capacité d'une cellule à pouvoir se différencier en des types cellulaires provenant des 3
feuillets embryonnaires (et éventuellement en cellules germinales). Ex : les cellules ES ou les cellules iPS.
Plus restrictif que la totipotence, plus large que la multipotence.

Polarité planaire : polarisation collective des cellules le long d'un plan tissulaire (typiquement dans un
épithélium) et est le plus souvent contrôlée par un ensemble conservé de protéines associées à la membrane
activée par la voie Wnt/PCP.

Points focaux d'adhérence : Complexes formés par des intégrines liées à des molécules de la matrice
extracellulaire, des protéines adaptatrices intracellulaires et des fibres de tension d'actine qui constitue un
point d'appui de la cellule, notamment pour la migration et un centre de signalisation.

Promoteur : séquence juste en amont ou juste en aval du site de démarrage de la transcription d’un gène
qui permet l’initiation de la transcription par les facteurs de transcription généraux.

Quiescence : propriété d'une cellule non proliférante qui est au stade G0 de manière réversible.

Rhombomères : unités répétées du rhombencéphale (région postérieure du cerveau). Au nombre de 8 chez

l'Humain.

Rotation corticale : rotation de la partie corticale (périphérique) du cytoplasme du zygote des Amphibiens
contrôlée par le centriole apporté par le spermatozoïde qui permet de réorganiser les faisceaux de
microtubules. Cette rotation est indispensable à la formation des axes de polarité de l'embryon.

Sac embryonnaire : gamétophyte femelle chez les Angiospermes qui reste dans l'ovule. Ses synergides
secrètent des molécules qui attirent les tubes polliniques. Après la double fécondation, son oosphère (à un
noyau) participera à la formation de l'embryon et sa cellule centrale (à deux noyaux) participera à la
formation de l'albumen.

Sarcomère : unité de contraction des cellules musculaires striées (squelettiques et cardiaques) formée d’un
complexe de filaments fins (actine), de filaments épais (myosine) et de protéines associées (titine...). Bordé
par des lignes Z.

Sclérotome : tissu issu d’une portion de somite induite par la corde. Après cette induction, les cellules font
une transition épithélio-mésenchymateuse et migrent avant de se différencier en vertèbres. Marqueur
habituel : Pax1

Segmentation : premières divisions du zygote qui correspond à la cellularisation d’une partie (ex : oiseaux)
ou de la totalité (ex : amphibiens, mammifères) du volume de l’ovocyte (=clivage) ou mise en place des
segments (métamères) lors de l’organogénèse.
817
Sénescence : état cellulaire caractérisé par un arrêt définitif (ou quasi-définitif) du cycle cellulaire. Les
cellules restent cependant bien vivantes, conservent de nombreuses fonctions et influencent leur
environnement.

Sertoli (cellules de) : cellules somatiques des tubes séminifères, assistant la spermatogénèse sous le
contrôle de la FSH et de la testostérone et sécrétant l'hormone anti-müllerienne au cours du développement
embryonnaire.

Silencers : séquences d'ADN auxquelles se lient des facteurs de transcription spécifiques pour contrôler la
transcription d’un gène dans le temps et dans l’espace (les silencers inhibent la transcription, contrairement
aux enhancers). Contrairement aux promoteurs, ils ne se situent pas forcément juste avant ou juste après le
site de démarrage de la transcription et leur orientation est indifférente. Ils sont cependant souvent dans le
même domaine topologique de la chromatine (TAD) que le.s gène.s qu'ils contrôlent.

Somatopleure : feuillet externe de la portion ventrale du mésoderme, notamment à l'origine des os des
membres chiridiens. Opposé à splanchnopleure.

Somites : Structures métamérisées des vertébrés formées par le mésoderme dorsal dit paraxial et donnant
naissance aux vertèbres (sclérotome), aux muscles du tronc et des membres (myotome) et au derme
(dermotome). Se forme à partir du mésoderme pré-somitique grâce à une horloge moléculaire.

Spermatozoïde : gamète mâle mobile grâce à son flagelle.

Spermiogenèse : Etape finale de la spermatogenèse durant laquelle les spermatides issues de la méiose se
transforment en spermatozoïdes*. Cela implique la formation de l'acrosome *, la formation du flagelle*, les
modifications chromatiniennes...

Suspenseur : tissu allongé formé par des cellules en file indienne qui enfonce l'embryon des Angiospermes
au centre de l'ovule et qui lui transmet des éléments nutritifs. Issu de la cellule basale produite par la
division asymétrique du zygote.

TAD : domaine topologique d'association. Région de la chromatine (flanquée par des isolateurs) où les
interactions entre séquences régulatrices sont privilégiées.

Télolécithe : se dit des ovocytes qui contiennent un abondant vitellus qui reste ensuite en dehors de
l'embryon lors du clivage (ovocyte des Téléostéens, des Sauropsidés, des Mammifères monotrèmes).

Territoire présomptif : région d'un embryon à un stade donné du développement dont la destinée normale
est connue. Une carte des territoires présomptifs est construite par le suivi du lignage d'une ou plusieurs
cellules marquées (colorant vital, molécule fluorescente non diffusible injectée en intracellulaire). Cette
région n'est pas nécessairement déterminée.

Totipotence : capacité d'une cellule à pouvoir se différencier en l'ensemble des types cellulaires d'un
organisme et de ses éventuelles annexes embryonnaires. Le zygote est, par définition, une cellule
totipotente. Les premiers blastomères des mammifères (stade 2 à 8 cellules) sont totipotents (d'où le
développement vrais jumeaux si ces cellules se séparent). Différent de pluripotence et de multipotence.

Transdifférenciation : Acquisition par une cellule différenciée d'une lignée donnée d'un phénotype
caractéristique des cellules différenciées d'une autre lignée.

Transition épithélio-mésenchymateuse : processus par lequel des cellules épithéliales perdent leur
adhérence entre elles, détruisent leur membrane basale et se mettent à devenir mésenchymateuse et à
migrer. Exemple : les cellules du mésoderme et de l'endoderme au cours de la gastrulation des amniotes,
les cellules du sclérotome des somites, les cellules de crête neurales.

Triploblastique ou triblastique : animaux à trois feuillets embryonnaires (ectoderme, endoderme,

mésoderme). Tous les Bilateria sont triploblastiques.

818
Trophectoderme : couche épithéliale de cellules qui borde les blastocystes des mammifères. Ne participe
pas à la formation de l'embryon mais seulement à des annexes embryonnaires. Opposé à masse cellulaire
interne. Marqueur habituel : Cdx2.

Tube neural : tube creux formé par invagination de la plaque neurale et soudure des bords de la gouttière
neurale au cours de la neurulation des cordés. Donne le système nerveux central (encéphale à l’avant,
moelle épinière à l’arrière) et les cellules qui en émigrent dorsalement sont les cellules de la crête neurale.

Tube séminifère : Long tube épithélial au trajet très tortueux contenu dans les testicules des amniotes. Sa
base est constituée par les spermatogonies et les cellules de Sertoli. Au cours de leur différenciation, les
spermatocytes, les spermatides et les spermatozoïdes migrent de la base de l’épithélium vers la lumière du
tube.

Utérus : organe de l'appareil génital femelle des mammifères, séparé du vagin par un col, constitué d'une
muqueuse (endomètre) dont le développement est sous le contrôle des hormones ovariennes et de cellules
musculaires lisses (myomètre). L'endomètre est le lieu d'implantation des embryons vivipares.

Ventricules cérébraux : Cavités élargies du canal central du tube neural des vertébrés dans la région
céphalique. Les deux premiers ventricules à l’avant sont situés dans les hémisphères cérébraux du
télencéphale (hémisphères droit et gauche).

Vernalisation : acquisition de la capacité à fleurir des plantes suite à leur exposition au froid.

Vésicules cérébrales ou céphaliques : vésicules se formant à l’extrémité antérieure (céphalique) du tube

neural* des vertébrés*. Au cours du développement, présence d'abord de 3 vésicules (prosencéphale,
mésencéphale, rhombencéphale) puis de 5 (télencéphale, diencéphale, mésencéphale, métencéphale,
myélencéphale).

Vésicule vitelline (ou sac vitellin) : annexe embryonnaire présente chez les vertébrés (sauf chez les
amphibiens) formée d'endoderme et de mésoderme vascularisé qui permet d'exploiter le vitellus (quand il
y en a). A l'origine des premiers vaisseaux sanguins et des premières cellules sanguines chez les vertébrés
(sauf chez les amphibiens).

Vitellus : réserves nutritives accumulées dans l’ovocyte au cours de l'ovogenèse et constituées de

phospholipides et de protéines. Chez les vertébrés, elles sont synthétisées dans le foie sous forme de
vitellogénine sous contrôle des œstrogènes et acheminées par voie sanguine vers l'ovocyte.

Vivipare : qualifie une espèce dont les embryons se développent dans les voies génitales de la femelle en
étant alimentés par celle-ci (gestation). Elle peut être placentaire (présence d’un placenta) ou aplacentaire
(ex : mouche tsé-tsé, certains requins ou amphibiens…).

Xylème : tissu conducteur de sève brute formé de trachéides. On distingue le xylème primaire qui est issu
de l'activité du méristème apical caulinaire et le xylème secondaire issu de l'activité d'un méristème
secondaire (assise génératrice libéro-ligneuse).

Zone pellucide (=membrane pellucide/vitelline) : matrice extracellulaire entourant l’ovocyte

synthétisée par l'ovocyte et les cellules folliculaires. Ses glycoprotéines ZP1 à ZP4 sont importantes pour la
fixation des spermatozoïdes à l’ovocyte lors de la fécondation*. Après la fécondation, sa structure est
modifiée pour bloquer la polyspermie. Chez les mammifères placentaires, elle empêche une implantation
(ou nidation) trop précoce dans la paroi utérine.

ZPA : (pour Zone d'Activité Polarisante) : région du mésenchyme postérieur du bourgeon de membre qui
secrète le morphogène Shh et qui est indispensable à la mise en place de l'axe antéro-postérieur du membre
et au maintien de l'AER.

Zygote : cellule diploïde, unique et totipotente formée par la fécondation, dont le cytoplasme est hérité de
l’ovocyte. Sa division cellulaire enclenche le clivage (ou segmentation).

819
 Glossaire des molécules les plus étudiées en biologie du développement

Achaete-scute (= MASH1 ou ASCL1 chez les Vertébrés) : Facteur de transcription de la famille hélice-
boucle-hélice basique proneural. Inhibé par la signalisation Notch dans le cadre de l'inhibition latérale.

Acide rétinoïque : L’acide rétinoïque (AR) est une petite molécule lipophile qui agit comme ligand des
récepteurs nucléaires de l’AR (RAR). L’AR est synthétisé à partir du rétinal par la rétinaldéhyde
déshydrogénase de type 2 (Raldh2) et dégradée en métabolites polaires par Cyp26. A un rôle dans la
postériorisation de l'axe antéro-postérieur des Vertébrés.

Actine : Famille de protéines globulaires (actine G) qui forment par polymérisation (actine F) les
microfilaments du cytosquelette et des filaments minces dans les fibrilles musculaires.

Activine : Protéine secrétée de la famille des TGFβ qui a des propriétés de morphogène dans les embryons.
Plus tard, chez l'adulte, hormone secrétée dans l'ovaire et qui a des effets sur la sécrétion de FSH par
l'adénohypophyse.

ADAM (= A Disintegrin and Metalloproteinase) : famille de protéines contenant un domaine

métalloprotéase (avec un ion zinc) et un domaine désintégrine extracellulaires, un domaine
transmembranaire puis un domaine intracellulaire de longueur variable. Jouent un rôle dans la
signalisation, l'adhérence, la fusion cellulaire.

ADMP (= Anti-dorsalizing morphogenetic protein) : ligand de la famille des TGFβ, exprimée dans
l'organisateur de Spemann et qui module l'activité des gènes de cet organisateur.

Agrine : molécule de signalisation secrétée par le cône de croissance axonal et reçue par la cellule
musculaire lors de la formation de la synapse neuromusculaire.

Antennapedia (Antp) : facteur de transcription à homéodomaine, codé par un gène du complexe ANT-C.
Exprimé essentiellement dans les régions thoraciques où il joue un rôle dans la formation des pattes chez
la drosophile.

Akt : sérine/thréonine kinase qui agit en aval de PI3kinase et qui est impliquée dans la prolifération et la
survie.

AMPc (pour AMP cyclique) : nucléotide produit à partir de l'ATP par l'adénylcyclase, laquelle est activée
par diverses voies de signalisation. L'AMPc agit en activant notamment la PKA.

APAF-1 (pour Apoptotic peptidase activating factor 1) : protéine qui rentre dans la composition de
l'apoptosome lorsqu'elle se lie au cytochrome c. Elle peut ainsi activer des caspases qui vont déclencher
l'apoptose.

APC/C : Complexe promoteur d'anaphase/cyclosome. Une ubiquitine ligase qui catalyse l'ubiquitinylation
de protéines cibles initiant la séparation des chromatides sœurs lors de la transition métaphase-anaphase
de la mitose.

Arp2/3 : facteurs de nucléation qui aide à former de nouveaux microfilaments d'actine à partir de
microfilaments existants.

Auxine (ou acide beta-indole acétique ou AIA ou IAA) : hormone végétale qui agit comme un morphogène
lors de très nombreuses étapes du développement des végétaux : mise en place de l'axe apico-basal chez
l'embryon précoce, stimulation de la rhizogenèse, croissance orientée par la lumière (photomorphisme),
formation des feuilles (phyllotaxie), inhibition de la ramification des parties aériennes (dominance
apicale)...

Bax : protéine de la famille Bcl2, principal effecteur de la voie intrinsèque pro-apoptotique dans les cellules
de mammifères.

820
Bcl-2 : protéine anti-apoptotique qui s'oppose à l'action de protéines pro-apoptotiques telles que Bax et
Bak.

Beta-caténine (= armadillo chez la drosophile) : Protéine présente dans le complexe reliant la partie
intracellulaire des cadhérines aux filaments d'actine. Quand libre dans le cytoplasme, elle est dégradée en
absence de Wnt. En présence de Wnt, sa dégradation est stoppée. Elle pénètre dans le noyau et active la
transcription de gènes cibles spécifiques en se liant aux facteurs de transcription LEF/TCF.

Bicoid : facteur de transcription à homéodomaine, régulant aussi la traduction. Il est codé par un gene à
effet maternel chez la drosophile qui est transcrit dans les cellules nourricières et dans l’ovocyte. La protéine
forme un gradient avec une quantité maximale du côté antérieur de l’embryon précoce de la drosophile et
régule l’expression de plusieurs gènes gap.

BMP4 : Ligand de la famille des TGFβ. Morphogène ventralisant lors de la formation des axes chez les
Vertébrés. Inducteur dans l'épiblaste des cellules germinales primordiales chez les Mammifères.

Brachyury (= ntl chez le poisson-zèbre) : Facteur de transcription à boîte T qui est exprimé dans le
mésoderme de manière général puis dans le mésoderme chordal. Exprimé dans la région orale chez les
Cnidaires (qui n'ont pas de mésoderme).

Cadhérine : classe de protéine à un domaine transmembranaire avec une partie N-terminale extracellulaire
qui est capable de faire des homodimères avec les cadhérines des cellules voisines en présence de Ca 2+. La
partie C-terminale intracellulaire forme un complexe relié au cytosquelette.

Calmoduline : protéine qui fixe 4 ions Ca2+ ce qui lui fait changer de conformation et interagir avec d'autres
protéines ce qui les activent ou les inhibent.

Cas9 : endonucléase qui coupe l'ADN sur un site qui est complémentaire à un ARN guide de 20 nucléotides.

Caspase : famille de protéases qui clivent les protéines à des sites particuliers, elles-mêmes activables par
clivage puis dimérisation. Se répartissent entre caspases initiatrices (caspase-2, -8, -9 et -10) et caspases
exécutrices (caspase-3, -6 et -7) lors de l'apoptose.

CatSper : canal à Ca2+ exprimé à la membrane plasmique du spermatozoïde * et qui est activé par un pH
alcalin et par la progestérone dans les voies génitales femelles. Son ouverture stimule la nage du
spermatozoïde*.

Caudal : protéine importante pour le développement des régions postérieures de la drosophile dont la
traduction est inhibée par Bicoid.

Cdc25 : phosphatase qui déphosphoryle les CDK* (sur la thréonine 14 et la tyrosine 15) ce qui active les
CDK* et fait avancer le cycle cellulaire.

Cdc42 : membre de la famille des petites GTPases de type Rho qui contrôle le cytosquelette des
microfilaments d'actine et les microtubules.

CDK : kinase dont l'activité dépend des cyclines et de son état de phosphorylation. Joue un rôle fondamental
dans le contrôle du cycle cellulaire.

Cdx2 : facteur de transcription à homéoboite qui détermine les cellules du trophectoderme dans les
blastocystes de souris.

Cerberus : protéine secrétée nécessaire à la formation de la tête des vertébrés et qui bloque l'action de
BMP, Nodal et Wnt.

Chordine : protéine produite dans l'organisateur de Spemann et qui se lie aux BMP et les empêche ainsi de
se fixer sur leurs récepteurs. A un effet dorsalisant et est un inducteur neural.

Clathrine : protéine capable de s'assembler en cage polyhédrique du côté cytosolique de la membrane

plasmique lors de l'endocytose.

821
CLAVATA3 (CLV3) : protéine secrétée par les cellules souches du méristème apical caulinaire dont
l'expression est activée par WUS et qui se lie aux récepteurs CLV1 et CLV2 à la surface des cellules du centre
organisateur ce qui aboutit à l'inhibition de l'expression de WUS (boucle de rétroaction négative).

Cohésine : complexe de protéines qui maintiennent ensemble les chromatides d'un chromosome avant
l'anaphase. Lors de la méiose, le complexe est différent de la mitose et n'est pas désassemblé lors de la
première division méiotique.

Collagène : élément protéique essentiel des matrices extracellulaires animales constitué de triple hélice de
longues chaines polypeptidiques avec des répétitions de triplets Glycine-Proline-HydroxyProline. Le
collagène IV forme un réseau maillé est présent dans la lame basale.

Connexine : protéines formant les jonctions gap.

CREB : facteur de transcription qui se fixe à l'ADN sur des éléments CRE en réponse à des concentrations
élevées d'AMPc.

CXCR4 : récepteur de SDF-1 qui est un chimioattractant essentiel pour les cellules de crêtes neurales.

Cycline : protéine dont la présence varie au cours du cycle cellulaire et capable d'activer des protéine CDK
(des kinases cycline-dépendantes).

Cytokinines : famille d'hormones végétales dérivées de l'adénine. Elles sont impliquées dans de
nombreuses fonctions, souvent en opposition avec l'auxine : développement des bourgeons, inhibition de
la rhizogenèse... Ex : la zéatine,

DAG (= diacylglycérol) : second messager dans la membrane plasmique formé de deux résidus d'acide gras
liés à un glycérol qui est produit à partir de PIP2 (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) par la PLC
(phospholipase C), en réponse à la stimulation de certains récepteurs par un ligand. Le DAG est capable
d'activer la PKC (Protéine Kinase C).

DCX (= doublecortine) : protéine associée aux microtubules qui est exprimée dans les neurones en cours de
différenciation.

Delta : protéine à un seul domaine transmembranaire qui active le récepteur Notch sur une cellule voisine
(communication juxtacrine).

Dickkopf-1 : Ligand de haute affinité pour LRP6 ce qui le rend antagoniste de la voie Wnt. Nécessaire pour
une bonne formation de la tête chez les Vertébrés.

Dishevelled : protéine d'échafaudage recrutée par un récepteur Frizzled activé par Wnt et qui est capable
d'inhiber la phosphorylation de β-caténine par GSK3. Impliquée également dans la voie Wnt/PCP.

DNMT1 (ADN méthyltransférase 1) : enzyme qui transfère un groupement méthyle sur les cytosines des
îlots CpG sur un brin néosynthétisé d'ADN à la suite d'une réplication et qui maintient donc la méthylation.

DNMT3A/3B (ADN méthyltransférase 3A ou 3B) : enzyme qui transfère un groupe méthyle sur les
cytosines des îlots CpG qui n'étaient pas méthylées au préalable. Elle assure ainsi la méthylation de novo.

Dorsal : Régulateur de la transcription de la famille NFκB impliqué dans l'établissement de l'axe

dorsoventral chez l'embryon de drosophile. Il est exprimé ventralement (nom donné d'après le phénotype
du mutant perte-de-fonction).

Dynéine : moteur moléculaire se deplaçant de manière ATP-dépendante le long des microtubules vers leur
pôle négatif.

E2F : facteur de transcription qui active l'expression de nombreux gènes nécessaires pour l'entrée dans la
phase S du cycle cellulaire. Inactif quand associé avec Rb.

Endothélines : peptides de 21 acides aminés dont la forme active est synthétisée grâce aux enzymes ECE1
et ECE2. EDN1 a été impliqué dans le développement des crêtes neurales céphaliques, tandis que EDN3 a
822
été impliqué dans le développement des crêtes neurales vagales et troncales, notamment les mélanocytes
et le système nerveux entérique.

Ephrine : Famille de ligands interagissant avec les récepteurs tyrosine kinase Eph. Certaines éphrines sont
transmembranaires (Ephrines-B), d'autres liées à la membrane plasmique par un GPI (Ephrines-A).
Participe à la communication juxtacrine entre 2 cellules. Impliquée dans le guidage axonal et le guidage de
la migration des cellules de crêtes neurales.

ERK (= ERK1 er ERK2) kinases de la famille des MAPK qui sont activées par phosphorylation et qui activent
d'autres protéines par phosphorylations sur des thréonines ou des tyrosines. Impliquées dans de
nombreuses voies de signalisation, notamment provenant de récepteurs tyrosine-kinase.

FAK (ou PTK2) : protéine à activité tyrosine kinase qui, lorsqu'elle est sous une forme phosphorylée,
s'associe aux points focaux d'adhérence et augmente leur turn-over ce qui facilite la migration cellulaire.

FGF8: Facteur de croissance de la famille des FGF qui est exprimé dans l'AER et qui est impliqué dans le
développement du bourgeon de membre.

FGF10 : Facteur de croissance de la famille des FGF qui est exprimé dans le mésenchyme des lames latérales
donnant naissance au bourgeon de membre. Il active l'expression de FGF8 dans l'AER et réalise une boucle
de régulation positive avec lui.

Fibronectine : dimère de grosses chaines polypeptidiques alpha et béta liées par des ponts disulfures dans
la matrice extracellulaire. Interagit notamment avec les intégrines à la surface des cellules et permet la
migration cellulaire.

FLC (Flowering Locus C) : Facteur de transcription à boîte MADS qui bloque la floraison en inhibant
directement l'expression de FT. La vernalisation inhibe son expression.

Fringe : glycotransférase qui augmente l'affinité de Notch pour ses ligands

Frizzled : récepteur à 7 domaines transmembranaires des Wnt. En présence du ligand, se lie à Dishevelled.
Impliqué dans la voie canonique Wnt/beta-caténine mais aussi la voie Wnt/PCP.

FSH (= hormone folliculo-stimulante) : hormone produite dans l'adénohypophyse sous le contrôle de la

GnRH produite par l'hypothalamus et qui stimule le développement des follicules ovariens chez les femelles
et des cellules de Sertoli chez les mâles.

Fushi-tarazu : gène pair-rule codant un facteur de transcription à homéodomaine, exprimé dans les
parasegments pairs de l'embryon de drosophile.

GATA6 : Facteur de transcription à doigt de zinc qui est notamment impliqué dans la détermination des
cellules de l'endoderme primitif de l'embryon des Mammifères

Gènes homéotiques : gènes dont la mutation provoque une anomalie du développement où un segment de
l'organisme prend les caractères d'un autre segment. Ex : antennapedia, ultrabithorax chez la drosophile.

Gli : (ou Cubitus interruptus chez la drosophile) : Famille de facteurs de transcription à doigts de zinc. Gli2
et Gli3 sont clivés et réduits à leur partie C-terminale répressive de la transcription en absence de Hedgehog.
En présence de ce ligand, ils ont leur structure entière et active la transcription, notamment de Gli1 qui est
toujours activateur.

Goosecoid : facteur de transcription à homéoboîte exprimé dans l'organisateur de Spemann. Réprime

directement l'expression de XWnt8 qui est un répresseur de la formation de la tête.

Granules P : complexes ribonucléoprotéiques que l'on trouve dans le cytoplasme des cellules qui vont
donner la lignée germinale au cours des divisions cellulaires asymétriques chez C. elegans.

GSK3β = Glycogen synthase kinase-3. Sérine/Thréonine kinase capable de phosphoryler beta-caténine et

de provoquer ainsi sa dégradation. Inhibée par l'activation de la voie Wnt canonique.

823
Gurken : ligand produit par l'ovocyte et reçu par le récepteur Torpedo (= EGFR) sur les cellules folliculaires
lors de l'ovogénèse de la drosophile. A l'origine de la polarité antéro-postérieure et dorso-ventrale de
l'embryon.

HDAC ou (histone désacétylase) : enzyme qui catalyse la perte du groupe acétyl sur les lysines de la queue
N-terminale des histones et ce qui renforce les liaisons faibles entre les histones et l'ADN et inhibe la
transcription en diminuant l'accessibilité des facteurs de transcription à leur séquence cible.

Hedgehog : protéine secrétée de drosophile codée par un gène de polarité segmentaire et par extension
nom de toute la famille de protéines homologues qui jouent un rôle de morphogènes * dans de très nombreux
processus de développement. Voir Sonic* Hedgehog.

Hormone juvénile : hormone sesquiterpénoïde produite dans les corps allates (ou corpora allata), stimule
la vitellogenèse et le développement des ovocytes des Insectes. Plus tard, maintient les caractères larvaires
lors des mues.

HSPG (=protéoglycane au sulfate d'héparane) : Famille de protéoglycanes de la matrice extracellulaire

impliquée dans la signalisation (voies FGF, Wnt).

Hunchback : Facteur de transcription à doigts de zinc qui est codé par un gène gap au cours du
développement de la drosophile. Sa transcription est activée par Bicoid dans la région antérieure et sa
traduction est réprimée par Nanos dans la région postérieure. Codé également par le génome maternel.

Intégrines : dimères de protéines avec une sous-unité α et une sous-unité β qui se lient à diverses protéines
de la matrice extracellulaire par leur domain extracellulaire et se lient via des protéines adaptatrices à des
microfilaments d'actine par leur domaine intracellulaire (ou à des filaments intermédiaires dans le cas des
hémidesmosomes). Initient une signalisation essentielle pour la migration, la prolifération, la survie et la
différenciation de très nombreux types cellulaires.

JNK : ou c-Jun N-terminal kinase. Serine/Thréonine kinases appartenant à la famille MAPK.

Laminine : gros complexe de trois longues chaines arrangées en croix trouvé dans les lames basales sous
forme de réseau maillé.

Lats1/2 : composants de la voie Hippo qui phosphorylent YAP et l'empêchent de rentrer dans le noyau
et/ou le mène à la dégradation.

Lefty : protéine inhibitrice de la voie Nodal (qui se fixe sur Nodal et sur son co-récepteur Cripto). Egalement
cible de la voie Nodal, il permet de réaliser une rétroaction négative.

Lgr5 : récepteur à 7 domaines transmembranaires de la R-spondine qui stimule la signalisation Wnt.

Marqueur des cellules souches intestinales.

LRP5/6 : co-récepteur avec Frizzled des ligands Wnt.

MAP : protéines associées aux microtubules qui ont pour rôle de réguler leur stabilité. Exemple : MAP2,
MAP4, TAU dans les neurones.

MITF : facteur de transcription bHLH-LZ qui est essentiel pour la détermination, la prolifération, la survie
et la différenciation des cellules de la lignée mélanocytaire.

MPF (ou M-phase promoting factor) : nom "historique" donné au complexe cycline B-Cdk1 qui joue un rôle
majeur dans le déclenchement et le déroulement de la mitose et de la méiose.

Myf-5 : facteur de transcription de détermination myogénique de la famille des hélice-boucle-hélice

basique. Exprimé tôt dans le lignage myogénique.

MyoD : facteur de transcription de détermination myogénique de la famille des hélice-boucle-hélice

basique. Exprimé tôt dans le lignage myogénique.

824
Myostatine : ligand de la famille des TGFβ qui inhibe la prolifération des myoblastes et stimule leur
différenciation.

Nanog : Facteur de transcription à homéodomaine qui maintient la pluripotence des cellules qui
l'expriment.

Nanos : Protéine qui se lie à des ARN avec l'aide de Pumilio et qui, notamment, inhibe la traduction de
l'ARNm de hunchback dans la région postérieure de l'embryon de drosophile.

Nodal (=Xnr chez le xénope) famille de ligands de type TGFβ qui activent SMAD2 et SMAD3 dans les cellules
cibles et qui joue un rôle essentiel dans la mise en place du mésoderme, de l'organisateur de Spemann et de
l'asymétrie gauche-droite.

Noggin : protéine secrétée (par l'organisateur de Spemann, mais pas seulement) qui est un inhibiteur
extracellulaire de BMP.

Notch : récepteur à un domaine transmembranaire. Activé par des ligands Delta ou Serrate par
communication juxtacrine, son domaine C-terminal est clivé, rentre dans le noyau et contrôle la
transcription de gènes cibles.

Métalloprotéinases ou MMP (Matrix Metalloproteinases) : enzymes qui digèrent la matrice extracellulaire

et qui jouent un rôle (entre autres) dans la transition épithélio-mésenchymateuse, la migration cellulaire et
la formation de métastases.

Oct4 (=Pou5f1) : facteur de transcription à domaine POU qui fait partie des facteurs de pluripotence. Avec
Sox2, active l'expression de Nanog.

Œstrogènes (ou estrogènes) : groupe d'hormones stéroïdes (dont la principale est l'œstradiol) produites
par les cellules folliculaires ovariens (sous le contrôle de la FSH) qui favorisent le développement des
caractères sexuels secondaires féminins (développement des seins à la puberté notamment) et le
développement de l'utérus lors de la phase folliculaire du cycle sexuel. Exerce un rétrocontrôle négatif puis
positif au cours de cette phase sur la production de FSH et de LH par l'adénohypophyse.

Oskar : protéine se liant à l'ARN qui organise la région postérieure de l'ovocyte puis de l'embryon de
drosophile. Il est notamment essentiel pour la mise en place de l'axe antéro-postérieur et la production de
cellules germinales.

Otx2 : facteur de transcription à homéodomaine qui spécifie le tube neural antérieur

p53 : facteur de transcription qui joue de multiples rôles dans la régulation du cycle cellulaire et de
l'apoptose. Si p53 n'est pas fonctionnelle (comme c'est le cas dans 50% des tumeurs), les cellules dont l’ADN
comporte des lésions continuent à se répliquer, propageant à la génération suivante des mutations non
réparées.

PAR : protéines de fonctions biochimiques variées identifiées chez C. elegans comme impliquées dans les
divisions asymétriques lors du développement précoce. PAR-1 est une sérine/thréonine kinase qui se lie à
une myosine non-musculaire. PAR-2 fixe l’ATP et à un domaine RING lié au zinc. PAR-1 et PAR-2 sont
localisés dans la région postérieure du zygote de C. elegans. PAR-3 et PAR-6 ont un domaine PDZ et forment
un complexe avec la protéine kinase C atypique aPKC3. Ce complexe se retrouve associé à la membrane
plasmique dans la région antérieure du zygote.

Patched : Protéine à 12 domaines transmembranaires qui réprime l'activité et la localisation de

Smoothened dans le cil primaire. Quand Hedgehog se fixe sur Patched, cette répression est levée.

Pax3 : facteur de transcription à homéodomaine et à domaine Paired. Impliqué dans la mise en place de la
bordure neurale et dans l'induction des facteurs de détermination myogénique dans le dermomyotome.

Pax7 : facteur de transcription à homéodomaine et à domaine Paired. Maintien le caractère de cellules

souches des cellules satellites musculaires.

825
Pie-1 : facteur de transcription à doigts de zinc qui est réparti asymétriquement lors des premières
divisions cellulaires chez C. elegans. Il est concentré dans les cellules qui vont contribuer à la lignée
germinale. En son absence, il n’y a pas de cellules germinales et un excès de cellules intestinales et
pharyngiennes.

PIWI : Protéine de la famille Argonaute qui a des fonctions importantes dans la lignée germinale en se liant
à ses piARN. Souvent utilisé comme marqueur des cellules qui appartiennent à la lignée germinale.

PLC-ζ (=PLC-zêta) : phospholipase apportée par le spermatozoïde dans le cytoplasme de l'ovocyte qui
aboutit à une entrée de Ca2+ dans le cytoplasme, au blocage de la polyspermie par exocytose des granules
corticaux et l'activation de l'ovocyte qui termine sa méiose.

Polycomb : famille de protéines qui catalysent des modifications épigénétiques des histones
(ubiquitinylations, méthylations) et qui répriment ainsi l'expression génétique de manière durable.

Profiline : protéine qui aide l'actine F à se polymériser du côté barbelé du microfilament existant.

Rac : petite GTPase qui induit la formation de lamellipodes.

Raldh2 : ou rétinaldehyde déshydrogénase-2 : enzyme clé de la synthèse de l'acide rétinoïque à partir du

rétinaldéhyde.

Ras : petite GTPase accrochée à la face interne de la membrane plasmique et qui est activée par des
récepteurs à domaines tyrosine kinase (comme les récepteurs aux FGF) qui activent SOS, qui est sa GEF
(Guanine nucleotide Exchange Factor).

Rb : (pour protéine du rétinoblastome) : protéine qui exerce un contrôle négatif sur l'avancée de la phase
G1 du cycle cellulaire en séquestrant le facteur de transcription E2F.

Récepteur aux endothélines : récepteurs à sept domaines transmembranaires. Les récepteurs de type A
(EDNRA) ont été impliqués dans le développement des crêtes neurales céphaliques, tandis que les
récepteurs de type B (EDNRB) ont été implqiués dans le développement des crêtes neurales vagales et
troncales, notamment les mélanocytes et le système nerveux entérique. Des mutations dans EDNRB ont été
identifié chez des patients atteints de la maladie de Hirschsprung (HSCR, absence de ganglions entériques
le long de l'extrémité distale de l'intestin) et/ou du syndrome de Waardenburg (WS, défauts de
pigmentation et surdité dus à développement des mélanocytes).

Rho : petite GTPase qui induit la formation de fibres de tension d'actine (via notamment de l'activation de
la kinase ROCK).

SCF (pour Stem Cell Factor) : Ligand du récepteur tyrosine kinase c-kit qui est indispensable à la survie et à
la migration des cellules germinales primordiales chez les Mammifères. Joue également un rôle dans la
survie et le maintien des cellules souches hématopoïétiques.

SDF-1 (ou CXCL12) : Chimiokine dont le récepteur est CXCR4 et qui joue notamment un rôle dans la
migration des cellules de crêtes neurales et dans l'attraction des cellules souches hématopoïétiques vers la
moelle osseuse puis dans leur maintien dans cette niche.

Shh : voir Sonic Hedgehog.

SHOOTMERISTEMLESS (STM): facteur de transcription à homéodomaine qui est indispensable à la mise

en place et au maintien du méristème apical caulinaire.

Siamois : facteur de transcription avec un homéodomaine qui s’exprime dans la région dorso-végétative de
l’embryon de xénope. Son expression est activée directement par β-caténine/TCF.

Smoothened : protéine à 7 domaine transmembranaire qui est inhibée par Patched en absence de ligand
de la famille Hedgehog. En présence de ce ligand active la voie de signalisation Hedgehog dans le cil
primaire.

826
Smurf1/2 : E3 ubiquitine-ligases qui provoquent l'endocytose de Patched en réponse à Shh et aussi dans
un autre contexte des récepteurs aux BMP.

Snail2 (ou Snai2 ou Slug) : facteur de transcription à doigts de zinc qui est un activateur majeur des
transitions épithélio-mésenchymateuses lors de la gastrulation et lors de l'émergence des cellules de crêtes
neurales.

Sonic Hedgehog : lipoprotéine secrétée, orthologue chez les Vertébrés d'Hedgehog de la drosophile, qui
joue un rôle de morphogène dans la polarité antéro-postérieure du bourgeon de membre et dans la polarité
dorso-ventrale du tube neural.

SOX : Famille de gènes (ou de protéines selon le contexte) apparenté à SRY avec une boîte HMG (High
Mobility Group) qui constitue un domaine de liaison à l’ADN. Ce sont des facteurs de transcription.

Sox2 : Facteur de transcription nécessaire au maintien de la pluripotence (ou de la multipotence selon les
contextes) et de l'auto-renouvellement dans les cellules souches. Un des premiers marqueurs de la plaque
neurale.

Sox9 : Facteur de transcription activé par SRY qui dirige le développement des testicules et active
directement l'expression de l'hormone anti-Müllerienne. Sox9 est également exprimé dans les
chondroblastes en prolifération.

SRY : Facteur de transcription codé par un gène sur le chromosome Y et qui, en activant l'expression de
Sox9, permet de transformer la gonade bipotentielle en testicule.

Staufen : protéine qui se lie aux ARNm dans les ovocytes des animaux (notamment à l'ARNm de bicoid chez
la drosophile ou à l'ARNm de Vg1 chez le xénope) et les arrime à des moteurs moléculaires pour des
déplacements aboutissant à leur localisation spécifique.

Su(H) ou Suppressor of Hairless (ou RBPJ chez les Vertébrés) : facteur de transcription qui s'associe dans
le noyau avec le domaine intracellulaire de Notch lorsque la voie de signalisation Notch est activée.

Tbx5 : Facteur de transcription à boîte T qui est déterminant pour le développement précoce des bourgeons
de membres antérieurs des Tétrapodes et des nageoires pectorales des Téléostéens.

Testostérone : hormone stéroïde de la famille des androgènes produite par les cellules de Leydig dans les
testicules (sous le contrôle de la LH) et qui a un rôle majeur dans le développement embryonnaire et post-
embryonnaire des caractères sexuels mâles primaires et secondaires. Dans les tissus cibles, elle est
transformée sous sa forme plus active, la dihydrotestostérone (= DHT) par la 5α-réductase.

TOR ou mTOR : sérine/thréonine kinase qui est au centre d'une cascade de signalisation reliant la
disponibilité en nutriments (notamment en acides aminés) et la présence de facteurs de croissance pour
coordonner la croissance et la prolifération des cellules. Impliqué dans 2 complexes mTORC1 et mTORC2,
inhibés par la rapamycine.

Tri-iodo-thyronine (T3) : forme la plus active des hormones thyroïdiennes obtenue par désiodation de la
thyroxine (T4).

Trithorax : groupe de protéines qui maintiennent la chromatine dans un état favorable à la transcription
(contrairement aux protéines du groupe Polycomb).

Tubuline : protéine de 55 kDa qui forme les microtubules, souvent sous forme d'hétérodimères. Il existe
l’α-tubuline et la β-tubuline, qui se polymérisent en alternance en protofilaments linéaires. 13 de ces
protofilaments s’associent pour former un microtubule qui a la forme d'un tubule creux de 25 nm de
diamètre. Les dimères se lient au GTP et s’assemblent à l’extrémité + des microtubules. La γ-tubuline est
présente dans les centrosomes et forme des sites de nucléation pour les nouveaux microtubules.

Twist1 : facteur de transcription de la famille bHLH qui est exprimé dans les cellules de crêtes neurales et
dont la mutation perte-de-fonction à l'état hétérozygote cause des malformations cranio-faciales.

827
Ubiquitine : protéine de 76 acides aminés qui est accrochée de manière covalente sur une lysine d'une
autre protéine lors de l'ubiquitination par un complexe enzymatique E1, E2, E3 et qui marque cette protéine
pour la dégradation par le protéasome.

Ubiquitine ligase (ou E3 ubiquitine ligase) : Enzyme qui intervient dans le complexe qui ubiquitine des
protéines cibles ce qui les adresse pour la dégradation au protéasome.

Vasa : protéines capables de lier des ARN impliqués dans la spécification de la lignée germinale chez les
Bilatériens.

VCAM-1 (ou CD106) : protéine d'adhérence cellulaire de la superfamille des immunoglobulines.

VegT : Gène à effet maternel exprimé dans les futurs territoires endodermiques (dans l’hémisphère
végétatif du xénope) et qui induit l’expression des gènes codant les ligands Nodal, inducteurs du
mésoderme.

Vg1 : ligand de la famille des TGFβ. Son ARNm s'accumule au pôle végétatif dans l'ovocyte des Amphibiens.
Avant la gastrulation de l'embryon d'oiseau, Vg1 induit le croissant de Koller ce qui amène à former la ligne
primitive.

Villine : La principale protéine de regroupement de l'actine dans les

microvillosités intestinales.

Vimentine : Protéine de filament intermédiaire trouvée dans une grande variété de cellules
mésenchymateuses. Utilisée souvent comme un marqueur de mésenchyme pour témoigner de la réalisation
d'une transition épithélio-mésenchymateuse.

Vinculine : Protéine qui médie l'association des microfilaments d'actine avec des intégrines au niveau des
adhérences focales.

WASP : Protéine qui stimule la ramification des filaments d'actine.

Wee1 : kinase qui phosphoryle CDK1 et l'inactive.

Wnt (= Wingless chez la drosophile) : Famille de protéines de signalisation sécrétée dont le récepteur est
Frizzled et impliqué dans de nombreux processus développementaux et tumoraux.
Wnt7a : Ligand de la famille Wnt exprimé dans l'ectoderme dorsal du bourgeon de membre et qui induit la
moitié dorsale du membre. Il contribue aussi à maintenir l'expression de Shh dans la ZPA.

WUSCHEL (WUS) : facteur de transcription à homéodomaine qui est exprimé dans le centre organisateur
du méristème apical caulinaire et qui migre via les plasmodesmes vers les cellules souches du méristème
où il active l'expression de CLAVATA3.

Xist : Long ARN non codant (17kb) synthétisé à partir d'un des chromosomes X des femelles de Mammifères
et qui le recouvre, initiant sa transformation en corps de Barr, transcriptionnellement inactif.

YAP : protéine co-activatrice de la transcription (avec les facteurs de transcription TEAD) qui est inhibée
par la voie Hippo.

Glossaire des techniques et du matériel utilisés pour les expériences

3C : ou capture de conformation de chromosome : méthode pour identifier les régions d'un chromosome
qui sont localisées à proximité dans un génome donné, à un instant donné.

828
Acridine orange : molécule qui est fluorescente en vert quand fixée sur l'ADN doule brin et en
orange/rouge sur l'ADN simple brin, les ARN et dans les lysosomes. La fragmentation de l'ADN et
l'augmentation du nombre de lysosomes lors de l'apoptose entraîne un ratio orange/vert plus élevé.

Anticorps monoclonaux : Anticorps produits à partir d'hybridomes (après injection d'un antigène (d'une
autre espèce) dans un animal les cellules de la rate sont fusionnées in vitro avec des cellules de myélome
malin cultivées). Chaque clone d'hybridome produit des anticorps homogènes contre l'antigène.

Annexine V (ou annexine A5) : protéine utilisée pour mettre en évidence l'apoptose car elle se fixe sur la
phosphatidylsérine qui est exposée à la surface des cellules apoptotiques.

BALB/c : lignée de souris albinos communément utilisée dans les laboratoires.

β-galactosidase : enzyme qui dégrade les β-galactosides en oses simples. Celle utilisée en recherche
provient d'E. coli et sert de protéine rapportrice car son activité est facilement observable en présence du
substrat X-gal où elle catalyse une réaction donnant un produit bleu.

Biotine-Streptavidine : La biotine est une petite molécule (la vitamine B7) qui peut s'attacher de manière
covalente à des protéines grâce à une molécule de liaison. Elle est reconnue avec une très forte affinité par
la streptavidine. Peut être utilisé pour des expériences de détection ou de purification de protéines.

Bisulfite : Par réaction avec ce composé chimique, les cytosines sont converties en uracile, alors que les
cytosines méthylées ne sont pas affectées. Après séquençage, cela permet de connaître les cytosines qui
étaient méthylées, notamment dans les îlots CpG où la méthylation des cytosines provoque une répression
de la transcription.

Bleu alcian : colorant qui adhère aux molécules chargées négativement et donc notamment aux tissus très
riches en GAG comme la matrice extracellulaire des tissus cartilagineux et les colore en bleu.

BrdU (= bromodésoxyuridine) : Analogue de nucléoside apparenté à la thymine qui s'incorpore dans

l'ADN lors de la réplication. Il est reconnu par des anticorps spécifiques qui marquent ainsi une cohorte de
cellules qui ont proliféré à un moment donné.

C57BL/6 : lignée de souris noire communément utilisée dans les laboratoires.

Calotte animale (ou coiffe animale) : cellules pluripotentes extraites du toit du blastocœle d'une blastula
d'amphibien que l'on peut cultiver dans un milieu salin additionné ou non de divers facteurs.

Cellules BY-2 (pour Bright Yellow-2) : lignée cellulaire issu d'un cal développé sur une graine de tabac
(Nicotiana tabacum) qui est facilement cultivable en suspension et qui est largement utilisée pour la biologie
cellulaire et moléculaire végétale.

Cellules COS : cellules mésenchymateuses de rein de singe immortalisées avec le grand antigène T de SV40.

Cellules ES : culture de cellules de la masse cellulaire interne extraites de blastocystes de Mammifères et

maintenues pluripotentes (elles le sont naturellement contrairement aux cellules iPS où la pluripotence est
induite). Peuvent être maintenues pluripotentes ou différenciées en de multiples types cellulaires ou
organoïdes selon divers protocoles.

Cellules HEK-293 : cellules épithéliales rénales de fœtus humain très largement utilisées en biologie
cellulaire in vitro pour ses bonnes capacités d'être transfecté et ses bonnes capacités de prolifération.

Cellules HeLa : Lignée cellulaire humaine cancéreuse provenant de métastases d'un cancer du col de
l'utérus d'Henrietta Lacks (décédée en 1951).

Cellules iPS : cellules pluripotentes induites obtenues à partir de cellules différenciées par l'expression
forcée d'une combinaison de facteurs de transcription (dont Sox2 et Oct4). Peuvent être maintenues
pluripotentes ou différenciées en de multiples types cellulaires ou organoïdes selon divers protocoles.

Cellules MDCK : Lignée cellulaire dérivée de cellules épithéliales de tubule rénal de chien.

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Cellules NIH3T3 : Lignée cellulaire dérivée de fibroblastes embryonnaires de souris.

Chambre de Boyden : Dispositif qui permet de tester la migration cellulaire à travers une membrane
poreuse recouverte de matrice extracellulaire entre deux compartiments remplis de milieux de composition
souvent différente.

ChIP (pour Chromatin Immunoprecipitation) : Utilisation d'anticorps pour isoler des régions spécifiques
de la chromatine et identifier les régions d'ADN auxquelles sont liées les protéines régulatrices reconnues
par ces anticorps.

Colchicine : molécule extraite de la colchique qui dépolymérise les microtubules.

CRISPR/Cas9 : méthode dérivée d'un système de défense bactérien où une endonucléase (Cas9) réalise une
cassure double brin à un locus spécifié par un ARN guide.

Cycloheximide : Inhibiteur de la synthèse des protéines chez les Eucaryotes. Souvent utilisé pour étudier
la vitesse de dégradation d'une protéine donnée ou pour voir si l'activation de l'expression d'une protéine
est directe.

Cyclopamine : alcaloïde stéroïde extrait d'une plante Liliacée qui est un inhibiteur de la voie Hedgehog (en
se fixant et en inhibant Smoothened).

Cytochalasine B : molécule extraite d'un champignon qui dépolymérise les microfilaments d'actine.

DAB : ou 3,3'-diaminobenzidine. Substrat qui, en présence d'eau oxygénée et de l'enzyme péroxidase, donne
un produit coloré brun. Souvent utilisé en immunohistochimie.

DAPI : ou 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Molécule fluorescente quand elle se fixe sur l'ADN

(particulièrement les régions riches en AT). Son spectre d'absorption est alors maximal à 358 nm (UV) et
son maximum d'émission est à 461 nm (bleu).

DAPT : ou tert-Butyl (S)-{(2S)-2-[2-(3,5)-difluorophenyl) acetamido] propanamido} phenylacetate.

Inhibiteur de la γ-sécrétase et donc inhibiteur de la voie Notch.

DiI (= 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) est une molécule lipophile

fluorescente (pic d'absorption = 549 nm; émission = 565 nm) qui s'incorpore dans la membrane plasmique.
Souvent utilisé pour des marquages de cellules et des suivis de lignages.

DMEM (=Dulbecco's Modified Eagle Medium) : milieu de culture le plus courant pour cultiver des cellules
in vitro. De nombreuses variantes existent pour cultiver certaines cellules.

DNAse-seq : méthode de séquençage à haut débit pour identifier des régions chromatiniennes ouvertes
basée sur l'accessibilité laissée à la DNAse I de faire un clivage.

Dominant négatif : protéine (ou un gène muté codant une protéine) qui non seulement est inactive mais
aussi empêche les protéines normales d’agir. Utilisé pour réaliser des expériences de perte-de-fonction.

Double hybride : test d'interaction directe entre deux protéines A et B fondé sur l'activation de la
transcription d'un gène rapporteur (2 protéines chimères : domaine de fixation à l'ADN + protéine A et
domaine d'activation de la transcription + protéine B).

ECL (=électroluminescence) : réaction chimique qui émet de la lumière en présence de l'enzyme HRP (une
péroxidase). Cette enzyme est fréquemment couplée aux anticorps secondaires utilisés pour la révélation
des western-blot.

EDTA : éthylènediamine tétracétate de sodium. Agent chélateur des ions Ca2+ et Mg2+ (permettant
d'empêcher l'action de ces ions).
Electrophorèse : migration de molécules chargées (très souvent des acides nucléiques ou des protéines)
dans un gel (d'agarose pour les acides nucléiques, de polyacrylamide pour les protéines) soumis à un champ

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électrique. Dans les méthodes d'électrophorèse habituelles, ces molécules sont essentiellement séparées
par leur taille.

Enhancer trap : méthode d'identification d'éléments régulateurs de la transcription par intégration au

hasard d'un gène rapporteur dans le génome et étude de son expression. Utilisée surtout chez la drosophile.

Enzyme de restriction : endonucléase qui coupe l'ADN au niveau d'une séquence précise. Cette coupure
peut être "de biais" et laisser quelques nucléotides simple brin (fragments à bouts cohésifs) ou alors laisser
des fragments à bouts francs.

FDA (= Fluorescéine Diacétate) : Substrat d'estérase capable de pénétrer dans les cellules et qui peut
servir de sonde de viabilité à la fois par la mesure de l'activité enzymatique estérase cellulaire, qui est
nécessaire pour activer sa fluorescence, et de l'intégrité de la membrane cellulaire, qui est nécessaire pour
la rétention intracellulaire de ce produit fluorescent.

FISH : Hybridation in situ détectée par fluorescence : désigne habituellement l'hybridation de sondes
fluorescentes sur des chromosomes pour localiser un locus particulier. Désormais également utilisé pour
l'hybridation de sondes nucléotidiques fluorescentes sur les ARN pour étudier l'expression des gènes.

FRAP (ou Redistribution de fluorescence après photoblanchiment) : Epuisement de la fluorescence dans

une région bien précise de la cellule puis observation de la cinétique de la restauration de la fluorescence
par de nouvelles molécules diffusant ou transportées dans la région.

FRET : Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes qui permet de voir en microscopie si deux
fluorophores se trouvent à moins de 10 nm l'un de l'autre. Pour ce faire, la longueur d'émission d'un
fluorophore A (par exemple CFP) doit pouvoir excité un fluorophore B (par exemple YFP) dont on pourra
enregistrer l'émission de photons. Si ces fluorophores sont accrochés sur des protéines, on en déduira que
ces protéines sont sans doute dans un même complexe et on pourra savoir dans quel compartiment de la
cellule cette interaction a lieu.

Gène candidat : Un gène qui, à cause de sa position chromosomique, son expression ou la structure de la
protéine qu’il code devient un candidat pour une fonction particulière ou pour causer une maladie lorsqu’il
est muté.

GFP : protéine de 27 kDa habituellement produite par la méduse Aequora victoria et qui émet une lumière
verte (504 nm) quand elle est éclairée par une lumière bleue (475 nm). De nombreuses variantes avec
différentes couleurs de cette protéine ont été obtenues par mutations. Peut être inclue dans une
construction qui permet d'obtenir une protéine fusion (protéine d'intérêt liée à la GFP). Protéine
rapportrice qui peut être suivie dans une cellule vivante.

Hématoxyline/éosine (ou coloration HE) : méthode de coloration histologique utilisant un colorant

cationique (ou basique), l'hématoxyline, qui a une affinité pour les constituants cellulaires chargés
négativement (comme les acides nucléiques) et un colorant anionique (ou acide), l’éosine, qui a une affinité
pour les constituants cellulaires chargés positivement.

Hi-C : technique qui permet de connaître la structure chromatidienne et notamment la présence de TAD en
séquençant à haut débit des populations de deux fragments d'ADN restés attachés ensemble malgré l'action
de nucléases.

Hybridation in situ : méthode de détection des ARN (souvent ARNm ou microARN) dans un embryon
entier ou sur coupe basé sur l'appariement des bases entre une sonde marquée (par un antigène qui sera
reconnu par immunohistochimie) et une séquence de l'ARN d'intérêt.

Immunohistochimie : technique qui permet de localiser une protéine dans des tissus à l'aide d'un
anticorps primaire spécifique qui est reconnu par un anticorps secondaire couplé à une enzyme (la
péroxydase par exemple) qui catalyse une réaction donnant un produit coloré.

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Immunofluorescence : technique qui permet de localiser une protéine dans des cellules ou dans un tissu
à l'aide d'un anticorps primaire spécifique qui est reconnu par un anticorps secondaire couplé à un
fluorophore.

Latrunculine : molécule extraite d'une éponge qui se fixe sur l'actine et aboutit à une dépolymérisation des
microfilaments.

LiCl (=chlorure de lithium) : inhibe GSK3-β, ce qui provoque une stabilisation de la β-caténine qui peut
entrer dans le noyau et activer ses cibles (mime une activation de la voie Wnt canonique).

Luciférase : protéine rapportrice qui catalyse une réaction de bioluminescence (λmax ∼560 nm) en
présence de son substrat, la luciférine (et d'O2, d'ATP et de Mg2+). Le gène est très souvent placé sous le
contrôle de promoteurs ou d'enhancers dont on veut connaître l'activité.

Lugol : I2 + KI ou eau iodée. Donne une coloration bleu foncé avec l'amidon et peut colorer en brun le
glycogène.

Knock-in : méthode de remplacement d'un allèle sauvage d'un gène par un allèle différent (sans perte-de-
fonction totale) grâce à la recombinaison homologue dans les cellules ES de souris. Un knock-in complet
implique la présence des deux allèles mutés ce qui est obtenu après des croisements entre hétérozygotes.

Knock-out : méthode de remplacement d'un allèle sauvage d'un gène par un allèle perte-de-fonction totale
grâce à la recombinaison homologue dans les cellules ES de souris. Un knock-out complet implique la
présence des deux allèles mutés ce qui est obtenu après des croisements entre hétérozygotes.

Matrigel : Nom commercial de la matrice de membrane basale solubilisée sécrétée par les cellules de
sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Elle ressemble à la membrane basale riche en
laminine/collagène IV et est utilisée par les biologistes cellulaires comme substrat tridimensionnel pour la
culture des cellules.

Microscopie à contraste interférentiel : microscopie qui exploite les propriétés des interférences entre
deux faisceaux lumineux proches qui traversent un échantillon. Cette microscopie accentue le contraste
entre deux milieux de composition différente.

Microscope confocal : microscope optique capable de produire des images nettes de très faible profondeur
de champ en ne faisant passer que les photons du plan focal par un sténopé ("trou") et en arrêtant les
photons des autres plans qui donneraient une image floue.

Morpholino (MO) : Chaine apparentée à une chaine nucléotidique (mais non chargée négativement) qui
peut se fixer sur un ARNm qui a une séquence complémentaire et inhiber sa traduction.

Nocodazole : molécule qui dépolymérise les microtubules.

PCR (pour Polymerase Chain Reaction) : méthode d'amplification d'une séquence spécifique d'ADN définie
par deux oligonucléotides à ses extrémités.

Phalloïdine : peptide bi-cyclique extrait de l'amanite phalloïde (champignon). La phalloïdine se lie

spécifiquement aux filaments d’actine, empêchant sa dépolymérisation. Couplée avec un fluorophore, elle
permet de rendre apparent les microfilaments d'actine sans utilisation d'anticorps.

Protéine fusion : protéine d'intérêt dont la séquence est en continuité avec une protéine rapportrice (dans
la très grande majorité des cas une protéine fluorescente comme la GFP).

Puce à ADN (=DNA microarray) : Multiples fragments d'ADN fixés sur une petite surface (verre, silicium,
plastique...) que l'on peut hybrider avec des ADNc produits à partir d'ARN provenant d'une ou plusieurs
populations cellulaires différentes. L'hybridation de ces ADNc aux fragments permet de connaître
l'expression de plusieurs centaines à plusieurs milliers de gènes.

QCPN : anticorps qui permet d'immunomarquer des cellules de caille et pas des cellules de poulet, utile dans
le cadre des greffes caille/poulet pour suivre le développement d'une population cellulaire.

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qPCR : méthode de PCR où on peut suivre l'augmentation de la quantité d'ADN produit en temps réel, ce
qui permet d'accéder à des valeurs quantitatives. Utilisée après une RT (Réverse Transcription), elle permet
d'avoir accès de manière quantitative à l'expression des gènes.

Réverse transcription (ou transcription inverse) : technique de synthèse d’ADN utilisant une réverse
transcriptase (ou transcriptase inverse), une ADN polymérase issue de rétrovirus qui est capable de
synthétiser un brin d'ADN (appelé ADN complémentaire ou ADNc) en utilisant un ARN comme matrice et
une amorce. Utilisée dans la première étape de la RT-PCR.

RGD : Peptide composé d'arginine-glycine-acide aspartique qui sert de leurre pour les intégrines car
entrent en compétition avec la séquence de la fibronectine (entre autres) sur laquelle les intégrines
s'attachent.

RNA-seq : séquençage à haut débit d'ADNc provenant d'une population d'ARN qui permet de quantifier
l'expression des gènes.

RT-PCR : Technique d'analyse de l'expression des gènes par rétrotranscription des ARN qui permet
d'obtenir des ADN complémentaires suivie d’une PCR (quantitative (RT-qPCR) ou non).

Rouge alizarine : colorant extrait de la racine de garance des teinturiers qui s'accroche aux dépôts
calciques et donc colore en rouge la matrice extracellulaire osseuse.

Streptavidine : voir Biotine-Streptavidine

SU5402 : inhibiteur des récepteurs aux FGF, FGFR1 (et aussi de VEGFR2 et de PDGFRB).

SYBRGreen : molécule (2-{2-[(3-dimethylaminopropyl)-propylamino]-1-phenyl-1H-chinolin-4-

ylidenmethyl}-3-methyl-benzothiazol-3-ium) qui s'accroche à l'ADN double brin (et non pas simple brin),
ce qui active sa fluorescence. Utilisée pour réaliser des qPCR *.

TOPFlash : Nom donné à la construction avec un gène rapporteur (la luciférase) sous le contrôle de
séquences de fixation LEF/TCF. Rapporteur de l'activité de la voie canonique Wnt/β-caténine.

TUNEL : On fait agir sur des embryons ou des cellules en culture fixés une Terminal Transférase qui ajoute
des nucléotides marqués (par exemple du BrdUTP) à l'extrémité des fragments d'ADN puis ces nucléotides
sont reconnus par un anticorps couplé à un fluorophore. Les cellules apoptotiques ont beaucoup plus de
marquage que les cellules normales à cause de la fragmentation de l'ADN et donc apparaissent
fluorescentes.

UAS-GAL4 : Méthode qui utilise le facteur de transcription de levure GAL4 se fixant sur une séquence UAS
pour faire exprimer un gène de manière contrôlée grâce à un promoteur spécifique des drosophiles
transgéniques.

Ultracentrifugation : Centrifugation d'un extrait ou d'un mélange à vitesse très élevée (supérieure à 10
000 g) permettant la séparation des macromolécules.

Vecteur d'expression : Plasmide d'origine bactérienne ou virus modifié où un gène d'intérêt est sous le
contrôle d'un promoteur permettant son expression dans des cellules in vitro ou in vivo.

Western-blot : Méthode de séparation des protéines selon leur taille dans un gel de polyacrylamide puis
de transfert vers une membrane où les protéines sont identifiées grâce à des anticorps.

X-gal (ou 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) : galactose accroché à un noyau indole qui

est un substrat "artificiel" de l'enzyme β-galactosidase qui est très souvent utilisée comme protéine
rapportrice. Le produit de la réaction donne une coloration bleu. Une molécule dérivée, le RedGal, est
utilisée si on souhaite obtenir un produit coloré en rouge.

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