Gas Chromatography (GC)

Label: DERIVATISASI, Kromatografi, kromatografi gas, post pintar

Pendahuluan
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen suatu campuran. Pemisahan tersebut didasarkan pada dua fasa
larutan, yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Kromatografi terdiri dari
bermacam-macam jenis yang salah satunya ialah kromatografi gas. Kromatografi gas (GC)
adalah jenis umum dari kromatografi yang digunakan dalam kimia analitik untuk
memisahkan dan menganalisis senyawa yang dapat menguap. GC dapat digunakan
untuk pengujian kemurnian zat tertentu, atau memisahkan komponen yang berbeda dari
campuran. Selain itu, GC juga dapat digunakan dalam mengidentifikasi suatu senyawa.

Apa itu GC? Syarat senyawa yang dapat dianalisis?

GC adalah instrumen yang digunakan untuk menganalisis senyawa-senyawa organik
yang mudah menguap atau mudah diuapkan dalam GC dimana titik uapnya antara 200o C-
350o C dan biasanya senyawa-senyawa tesebut memiliki massa molekul relatif kecil. Tentu
saja senyawa tersebut harus memiliki sifat tidak rusak karena panas. Untuk sampel yang tidak
memenuhi syarat tersebut dapat dilakukan derivatisasi terlebih dahulu.
GC terbagi menjadi dua yaitu Kromatografi Gas Cair dan Kromatografi Gas Padat.
Perbedaan keduanya terletak pada penggunaan fasa diam. Pada KGC, fasa diam yang
digunakan berupa cairan yang diikatkan pada suatu pendukung sehingga solut akan terlarut
dalam fasa diam. Sedangkan pada KGP, fasa diam yang digunakan yaitu berupa padatan.

Bagian-bagian dalam GC

1. Gas Pembawa
Gas pembawa (carrier gas) berfungsi sebagai fase gerak.Gas pembawa adalah gas
inert yang memiliki kemurnian tinggi (direkomendasikan grade Ultra High Purity atau
UHP).Gas pembawa ini yang akan membawa uap sampel masuk ke dalam kolom untuk
dipisahkan komponen-komponen dalam campurannya dan selanjutnya akan masuk ke
detektor untuk dideteksi secara individual. Gas pembawa yang biasa digunakan adalah
Helium,Nitrogen atau Hidrogen. Untuk analisis sampel gas,maka gas pembawa yang
digunakan harus berbeda dengan gas target analisis. Gas pembawa biasanya disimpan dalam
tabung gas bertekanan tinggi atau dari gas generator.
2. Injektor
Injektor memiliki fungsi untuk memasukkan sampel,menguapkan sampel,dan
mencampur uap sampel dengan gas pembawa. Dalam kromatografi gas,semua sampel dari
fase asal harus diubah menjadi fase gas/uap.Misalnya sampel padatan dapat dilarutkan
terlebih dahulu,baru larutannya diinjeksikan ke sistem kromatografi gas.Untuk sampel larutan
bisa langsung diinjeksikan menggunakan microsyringe biasa,sementara untuk sampel gas
bisa menggunakan gas-tight syringe.Untuk otomatisasi,bisa juga menggunakan
autoinjector/autosampler. Injektor dilengkapi dengan blok pemanas (heater block) yang
memungkinkan pengaturan suhu injektor untuk menguapkan sampel. Biasanya yang menjadi
patokan awal adalah kira-kira 50oC di atas titik didih tertinggi dalam campuran,dengan
asumsi semua zat target akan menguap tapi tidak sampai merusak komponen itu sendiri.
3. Kolom
Kolom berfungsi sebagai fase diam dan merupakan jantung dari kromatografi. Dalam
kolomlah terjadi proses pemisahan komponen-komponen dalam campuran berdasarkan
perbedaan afinitas masing-masing komponen terhadap fase diam dan fase gerak. Secara
imaginer,masing-masing komponen akan mengalami 3 kondisi:ikut dengan gas
pembawa,terdistribusi secara dinamis di antara gas pembawa dan kolom,serta tertahan/larut
dalam kolom.Mekanisme ini terjadi berulang-ulang mulai dari sampel masuk ke dalam kolom
hingga masuk ke detektor secara individual. Proses pemisahan dalam kolom dipengaruhi oleh
banyak faktor seperti sifat kimia-fisika dari sampel maupun material kolom,dimensi
kolom(panjang,diameter dan tebal lapisan kolom,kapiler/kemas),laju alir gas pembawa, suhu
oven kolom,dll. Secara umum,semakin mirip polaritas komponen sampel dengan fase
diam,maka semakin kuat interaksi antara keduanya sehingga komponen akan tertahan lebih
lama dalam kolom (waktu retensi makin lama).
4. Oven
Kolom diletakkan dalam sebuah oven yang bisa diatur suhunya sesuai kebutuhan
analisis. Semakin tinggi suhu oven kolom, maka makin lemah interaksi komponen sampel
dengan fasa diamnya, sehingga waktu retensi semakin cepat. Oven yang baik harus bisa
memberikan akurasi dan kestabilan suhu yang baik.
5. Detektor
Komponen dalam sampel akan masuk secara individual ke dalam sistem detektor dan
akan dideteksi responnya,kemudian akan dikonversi menjadi satuan tegangan listrik.
Masuknya komponen-komponen sampel ke detektor terjadi secara parsial dan plotingnya
akan membentuk "khromatogram". Ada beberapa jenis detektor dalam khromatografi
gas,berikut adalah jenis detektor yang dikenal :
a. Flame Ionization Detector (FID),adalah detektor general untuk mengukur komponen-
komponen sampel yang memiliki gugus alkil (C-H).Komponen sampel masuk ke
FID,kemudian akan dibakar dalam nyala (campuran gas H2 dan udara),komponen akan
terionisasi,ion-ion yang dihasilkan akan dikumpulkan oleh ion collector,arus yang dihasilkan
akan diperkuat,kemudian akan dikonversi menjadi satuan tegangan.Semakin tinggi
konsentrasi komponen,makin banyak pula ion yang dihasilkan sehingga responnya juga
makin besar.
b. Thermal Conductivity Detector (TCD) adalah detektor paling general sebab hampir semua
komponen memiliki daya hantar panas.TCD bekerja dengan prinsip mengukur daya hantar
panas dari masing-masing komponen.Mekanismenya berdasarkan teori "Jembatan
Wheatstone" di mana ada dua sel yaitu sel referensi dan sel sampel.Sel referensi hanya dilalui
oleh gas pembawa,sementara sel sampel dilalui oleh gas pembawa dan komponen
sampel.Perbedaan suhu kedua sel akan mengakibatkan perbedaan respon listrik antara
keduanya dan ini akan dihitung sebagai respon komponen sampel.Detektor TCD banyak
digunakan untuk analisis gas.
c. Electron Capture Detector (ECD) adalah detektor khusus untuk mendeteksi senyawaan
halogen organik.Banyak diaplikasikan untuk analisis senyawaan pestisida.Secara
prinsip,komponen sampel akan ditembak dengan sumber radioaktif Nikel,dan jumlah
elektron yang hilang dari proses itu dianggap linear dengan konsentrasi senyawaan tersebut.
d. Flame Photometric Detector (FPD) adalah detektor khusus untuk mendeteksi senyawaan
sulfur, posfor dan atau timah organik.Prinsipnya adalah pembakaran senyawaan komponen
sehingga mengemisikan energi tertentu yang akan dilewatkan ke filter tertentu (filter S,P atau
Sn) kemudian akan dideteksi oleh Photomultiflier.Banyak digunakan untuk analisis
senyawaan pestisida.
e. Flame Thermionic Detector(FTD) adalah detektor khusus untuk mendeteksi senyawaan
nitrogen dan atau posfor organik.Prinsipnya adalah pembakaran senyawaan komponen
kemudian direaksikan dengan garam Rubidium dan respon listrik yang dihasilkan akan
diperkuat dan dikonversi menjadi satuan tegangan.Banyak digunakan untuk analisis
senyawaan pestisida.
f. Mass Spectrometer (MS) adalah detektor khusus yang dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif maupun kuantitatif.Prinsip pengukurannya adalah komponen sampel dipecah
menjadi bentuk ion fragmennya (baik secara elektronik maupun kimiawi) lalu ion fragmen
tersebut dilewatkan ke Mass Analyzer untuk memisahkan ion berdasarkan perbedaan
massa/muatan dan selanjutnya diteruskan ke ion detector untuk mendeteksi jumlah ion yang
dihasilkan.Spektrum fragmen yang dihasilkan oleh masing-masing komponen akan
menunjukkan karakteristik yang khas,dan ini digunakan untuk tujuan identifikasi kualitatif
dengan membandingkan dengan database atau library spektrum yang telah ada.
6. Pengolah Data
Pengolah data berfungsi sebagai pengatur sistem instrumen dan pengolahan data
untuk tujuan analisis kualitatif maupun kuantitatif. Secara umum pengolah data bisa berupa
integrator/recorder ataupun berupa software yang beroperasi under-Windows.
 Derivatisasi dalam GC?
Derivatisasi merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa menjadi
senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai untuk dilakukan analisis menggunakan
kromatografi gas.

Alasan dilakukan derivatisasi

1. Senyawa tersebut memungkinkan dilakukan analisis dengan KG terkait dengan

volatilitas dan stabilitasnya.
2. Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa senyawa tidak
menhasilkan bentuk kromatogram yang bagus(misal pucak kromatogram yang tumpang
tindih) atau sampel yang dituju tidak terdeteksi, oleh karena itu diperlukan derivatisasi
sebelum dilakukan analisis dengan kromatografi gas.
3. Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama derivatisasi adalah untuk
meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatil).
Senyawa-senyawa dengan dengan berat molekul rendah biasanya tidak mudah menguap
karena adanya gaya tarik menarik inter molekuler antara gugus-gugus polar, karenanya jika
gugus-gugus polar ini ditutup dengan cara derivatisasi, maka akan mampu meningkatkan
volatilitas senyawa tersebut secara dramatis.
4. Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dan senyawa-senyawa steroid.
5. Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatil mengalami dekomposisi parsial
karena panas sehingga diperlukan derivatisasi untuk meningkatkan stabilitasnya.
6. Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor tangkap elektron (ECD).
7. Menurunkan volatilitas suatu senyawa yang terlalu volatile.
8. Senyawa polar yang umumnya akan menyerap permukaan aktif dari column, dibuat
kurang polar dengan derivatisasi.

Beberapa cara derivatisasi pada GC?

1. Esterifikasi
Digunakan untuk membuat derivat gugus karboksil. Pengubahan gugus karboksil menjadi
esternya akan meningkatkan volatilitas karena akan menurunkan ikatan hidrogen.
Derivatisasi dengan esterifikasi dapat dilakukan dengan cara esterifikasi Fisher biasa
dalam asam kuat. Ester metil paling banyak digunakan, meskipun demikian ester etil,
propil, dan butil juga sering dimanfaatkan untuk derivatisasi ini. Ester alifatik yang lEbih
panjang dibuat dengan tujuan untuk menurunkan volatilitas, meningkatkan respon
detektor, meningkatkan resolusi atau daya pisah dari bahan pengganggu, dan
meningkatkan resolusi dari senyawa-senyawa yang mempunyai rumus molekul yang
hampir sama.
 2. Asilasi
Jika sampel yang diuji mengandung fenol, alkohol, atau amin primer atau sekunder maka
sering digunakan derivatisasi dengan asilasi yang merupakan reaksi yang paling umum.
Derivatisasi dengan cara ini dilakukan dengan menggunakan asam asetat. Asilasi pada
umumnya memberikan bentuk kromatogram yang baik.Asilasi dilakukan dengan
menggunakan perfluoroanhidrida yang murni atau dalam pelarut, misalnya asetonitril dan
etil asetat.

3. Alkilasi
Digunakan untuk menderivitasi alkohol, fenol, amina primer dan sekunder, imida, dan
sulfhidril.Derivat dapat dibuat dengan sintesis Wiliamson, yakni alkohol atau fenol
ditambah alkil atau benzil halida dengan adanya basa.

4. Sililasi
Derivat silil saat ini digunakan untuk menggantikan eter alkil untuk analisis sampel yang
bersifat polar yang tidak mudah menguap.Derivat yang paling sering dibuat adalah
trimetilsilil.

5. Kondensasi
Reaksi kondensasi dapat digunakan untuk derivatisasi amina yang mana pereaksinya
mengandung gugus karbonil.Amina primer bereaksi dengan keton membentuk enamin
atau bereaksi dengan karbon disulida membentuk isotiosianat.Aseton dan siklobutanon
bereaksi dengan amin primer membentuk enamin yang menghasilkan puncak tunggal
dalam KG.

6. Siklisasi
Penutupan gugus polar melalui siklisasi dilakukan pada senyawa yang mengandung 2
gugus fungsi yang kira-kira sangat mudah dibuat heterosiklis beratom 5 atau 6.Beberapa
heterosiklis yang terbentuk adalah ketal, boronat, triazin, dan fosfit.Asam amino juga
bereaksi dengan anhidrida asam atau klorida membentuk azlakton yang bersifat lebih
volatil.

FAKTOR-FAKTOR YANG DIGUNAKAN UNTUK EVALUASI KINERJA

KROMATOGRAFI KOLOM
Kualitas pemisahan dengan kromatografi kolom dapat dikontrol dengan melakukan
serangkaian uji kesesuaian sistem yang meliputi: (1) efisiensi kolom; (2) resolusi atau daya
pisah; (3) simetrisitas puncak; dan (4) faktor retensi atau kapasitas kolom0'3'. Untuk faktor
retensi, lihat kembati persamaan (1.2) dan (1.3).

1. Efisiensi kolom
Salah satu karakteristik sistem kromatografiyang paling penting adalah efesiensi atau jumlah
lempeng teoretis(N)(6). Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N)
yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi. Jumlah lempeng (N) dihitung
dengan:
N = (tR/σt)2

Yang mana:
tR = waktu retensi solut
ot = simpangan baku lebar puncak
Wh/2 = lebar setengah tinggi puncak
Wb = lebar dasar puncak
Gambar 1.3. menjelaskan bagaimana cara menghitung tp;W^;
Wy dan o suatu puncak kromatogram.

Persamaan berikut digunakan untuk menggambarkan hubu-ngan antara panjang kolom (L)
dengan efisiensi kolom (H):
N = L/H
Bilangan lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang baik yang nilainya
sebanding dengan semakin panjangnya kolom (L) dan semakin kecilnya nilai H. Istilah H
merupakan tinggi ekivalen lempeng teoretis atau HETP (high equivalent theoretical plate),
yang mana merupakan panjang kolom yang dibutuhkan untuk menghasilkan satu lempeng
teoretis. Kolom yang baik akan mempunyai bilangan lempeng yang tinggi; dan karenanya
kolom yang baik mempunyai nilai H yang rendah. Ukuran partikel merupakan penyumbang
utama pada nilai H. Semakin kecil ukuran partikel, maka semakin tinggi bilangan lempeng
teoretis. Kondisi optimum diperoleh dengan melihat hubungan antara k tinggi lempeng
teoretis dan kecepatan alir (kurva Van Deemter)
Dalam sistem kromatografi, diharapkan untuk mempunyai r bilangan lempeng (N) yang
tinggi. Bilangan lempeng (N) akan meningkat dengan adanya beberapa faktor161, yaitu:
Kolom yang dikemas dengan baik
Kolom yang lebih panjang
Partikel fase diam yang lebih kecil
Viskositas fase gerak yang lebih rendah dan suhu yang lebih tinggi
Molekul-molekul sampel yang lebih kecil
Pengaruh di luar kolom yang minimal
2.Resolusi (daya pisah)
Kolom yang lebih efisien akan mempunyai resolusi yang baik. Tingkat pemisahan komponen
dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang
di hasilkan. Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak daiam kromatogram harus
terpisah secara sempurna dari puncak iainnya dengan sedikit tumpang suh [overlapping] atau
tidak ada tumpang suh sama sekali.Tingkat pemisahan antara puncak-puncak kromatografi
yang bersebelahan merupakan fungsi jarak antara puncak maksima dan lebar puncak yang
berhubungan. Untuk puncak Gaussian, hal ini cukup digambarkan dengan resolusi atau daya
pisah puncak'8'.
Dalam kromatografi gas (KG) dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), resolusi
didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan
(ΔtR=tR2 - tR1) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W +W )/2 sebagaimana dalam
Gambar 1.8. Rumus untuk menghitung resolusi adalah sebagai berikut:
RS = 2 Δ tR / (W1 + W2)
Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak
yang baik {base line resolution).

Sesuai persamaan (1.12), resolusi yang besar akan dicapai jika perbedaan waktu retensi analit
cukup besar dan lebar puncak analit dengan analit yang Iainnya adalah sesempit mungkin.

waktu retensi relatif pada sistem kromatografi tertentu dan (2) tergantung pada lebar puncak.
Untuk mengoptimisasi parameter-parameter ini supaya diperoleh resolusi yang maksimal,
maka diperlukan suatu pemahaman terhadap sifat dan faktor-faktor yang mempengaruhinya.
Meskipun waktu retensi komponen cukup menggambarkan banyaknya waktu yang
diperlukan oleh solut tertentu terelusi dari sistem kromatografi, akan tetapi suatu parameter
yang lebih berguna yang menggambarkan retensi kromatografi adalah faktor retensi
sebagaimana dalam persamaan (1.2) dan (1.3).
Selain itu, retensi relatif 2 puncak dalam kromatogram dapat didefinisikan dengan faktor
pemisahan atau selektifitas (a) sebagaimana dalam persamaan (1.4).
Sementara itu, pada kromatografi planar, resolusi dapat dihitung dengan persamaan:
RS = d/ (W1 + W2)√2
Yang mana:
d = jarak antar 2 pusat bercak
W dan W = rata-rata lebar bercak

Faktor asimetri (Faktor pengekoran)

Suatu situasi yang menunjukkan kinerja kromatografi yang ku-rang baik adalah ketika
ditemukan suatu puncak yang mengalami pengekoran {tailing} sehingga menyebabkan
puncak tidak setang-kup atau tidak simetri. Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah
asimetri (tidak setangkup), maka suatu perhitungan asimetrisitas merupakan cara yang
berguna untuk mengontrol atau mengkarak-terisasi sistem kromatografi. Puncak asimetri
muncul karena berba-gai faktor. Peningkatan puncak yang asimetri akan menyebabkan
penurunan resolusi, batas deteksi, dan presisi.
Gambar 1.9. menunjukkan bagaimana menghitung nilai faktor pengekoran (tailing factor,
TF). Kromatogram yang memberikan harga TF =1 menunjukkan bahwa kromatogram
tersebut bersifat setangkup atau simetris. Harga TF > 1 menunjukkan bahwa kromatogram
menga-lami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom yang di-pakai
semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat diguna-kan untuk melihat efisiensi
kolom kromatografi.
 Gambar 1.9. Menghitung besarnya TFpadci kromatogram

A. Latar belakang
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak
digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi,
pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih
sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang
tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika
dengan metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit
atau campurannya kompleks.
Meskipun dasar kromatografi adalah suatu proses pemisahan namun banyak diantara
cara ini dapat digunakan untuk analisi kuatitatif. Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat
dalam analisi kualitatif dan analisis kuantitatif adalah kromatografi kertas, kromatigrafi lapis
tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi gas, dan kromatografi cair kinerja tinggi.
Kromatografi kertas dan KLT pada umunya lebih bermanfaat untuk tujuan indentifikasi,
karena lebih mudah dan sederhana.
Kromatografi kolom memberikan pemilihan fase diam yang lebih luas dan berguna
untuk pemisahan campuran secara kuantitatif. Dalam indutri metode inibanyak dipakaiuntuk
menghilangkan zat-zat yang tidak diinginkandalam hasil, misalnya pada pemurnian minyak
tanah atau minyak goring dan pemurnian hidroksidayang dihasilkan dari proses elektrolisis.
Teknik pemisahan kromatografi dilakukan untuk mendapatkan pemisahan campuran
diantara dua fase.Fase tersebut adalah fase diam dan fase gerak.Fase diam dapat berupa zat
cair dan zat padat, sedangkan fase gerak dapat berupa zat cair atau gas.
Latar belakang dari makalah ini adalah menghadirkan materi dasar yang akan
memperkenalkan dengan berbagai aspek dari proses kromatografi, menjelaskan dalam istilah
yang sederhana bagaimana prinsip kerja kromato grafi, dan menunjukan beberapa penerapan
yang telah membuat kromatografi tidak dapat diabaikan dalam berbagai bidang kehidupan.

B. Rumusan masalah
1. Apa pengertian dari kromatografi?
2. Bagaimana pembagian kromatografi?
3. Bagaimana cara membedakan fase gerak dan fase diam?
 C. Tujuan
1. Mengetahui dan memahami pengertian kromatografi.
2. Mengetahui dan memahami pembagian kromatografi.
3. Mengetahui dan memahami cara membedakan fase gerak dan fase diam.

BAB II
PEMBAHASAN

A. Pengertian Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani RusiaMichael
Tsweet pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara
perkolasi esktrak petroleum eter dalam kolom gelas yangberisi kalsium karbonat (CaCo3).
Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering
digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis,
baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparative dalam bidang farmasi, lingkungan,
industri, dan sebagainya. Kromatografi suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam
(stationary phase) dan fase gerak (mobile phase)(Rohman, 2007).
Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan kimia yang didasarkan pada
adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile
phase).Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu χρῶμα yang berarti warna dan γράφειν
yang berarti menulis.
Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun analitik.Tujuan kromatografi
preparatif biasanya adalah untuk memisahkan senyawa dalam campuran (biasanya digunakan
 untuk pemurnian).Kromatografi analitik digunakan untuk mengetahui perbandingan senyawa
dalam campuran.
Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah, antara lain:
1. Analit adalah zat yang dipisahkan.
2. Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya puncak
karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.
3. Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.
4. Fasa gerak adalah fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.
5. Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya.
6. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.
7. Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen
analit.
B. Pembagian/penggolongan kromatografi
Penggolongan kromatografi ada 3 yaitu :
1. Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan
2. Berdasarkan fase yang digunakan
3. Berdasarkan alat yang digunakan

1. Kromatografi Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahannya pemisahannya, kromatografi

dapat dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorpsi; (b) kromatografi partisi; (c)
kromatografi penukar ion; (d) kromatografi eksklusi ukuran; (e) kromatografi afinitas.
a. Kromatografi Adsorpsi
Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja dan jangan sekali-kali
dikacaukan dengan proses absorpsi yang berarti penyerapan keseluruhan. Adsorpsi pada
permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan
dipol-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipole.Silika gel merupakan jenis absorben
(fase diam) yang penggunaannya paling luas.Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si-O-Si
dan gugus silanol (Si-OH). Kromatografi Adsorpsi seperti:
1) Kromatografi Kertas
Pada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas dengan susunan
serabut dan tebal yang sesuai.Sebagai alternatif dapat juga digunakan sistem dua fase.Kertas
diimpregnasi dengan salah satu fase yang kemudianmenjadi fase diam (umumnya fase yang
lebih polar dalam hal kertas yang dimodifikasi).Kromatogram dilakukan dengan
merambatkan fase gerak, melalui kertas. Dapat dilakukan kromatografi menaik, pelarut
merambat naik pada kertas ditarik oleh gaya kapiler ataupun kromatografi menurun,
pelarutnya mengalir oleh gaya gravitasi.

2) Kromatografi Lapis Tipis

Pada KLT, zat penjerap merupakan lapis tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng
kaca. Plastik atau logam secara merata, umumnya digunakan lempeng kaca. Pemisahan yang
tercapai dapat didasarkan pada adsorpsi, partisi atau kombinasi dari kedua efek, tergantung
 jenis penyangga, cara pembuatan, dan jenis pelarut yang digunakan. Perkiraan identifikasi
diperoleh dengan pengamatan bercak dengan harga Rf yang identik dan ukuran yang hamper
sama. Dengan menotolkan zat uji dan baku pembanding pada lempeng yang sama. Bercak
dapat dikerok dari lempeng, kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dan diukur
secara spektrofotometri.
Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi.Fasa diamnya air dan fasa
penyokongnya adalah selulosa.Fasa geraknya biasanya merupakan campuran dari salah satu
pelarut-pelarut organik atau air.Setelah elusi selesai, noda ditandai dengan penanda.Bila noda
tidak berwarna maka harus dideteksi secara fisika dan kimia.
a. Secara fisika dengan menggunakan uap iodium, lampu UV
b. Secara kimia dengan menggunakan pereaksi cerium sulfat,
dragendrof, liberman burchard.
Kecepatan elusi pada kromatografi kertas dipengaruhi oleh:
a. Ketebalan kertas
b. Kekentalan eluen
c. Pelarut, jangan menggunakan pelarut yang terlalu cepat
menguap.
Pada kromatografi kertas, eluen bergerak berdasarkan gaya kapiler dari bawah keatas
(ascending) sama dengan KLT. Tetapi bisa juga dengan gaya gravitasi bila elusinya dari atas
ke bawah (descending). Eluen yang digunakan pada kromatografi kertas umumnya adalah
campuran berbagai pelarut terutama air.
Kertas kromatografi yang sering digunakan adalah kertas whatmann yang beredar bermacam-
macam seperti ukuran 20 x 20 cm, 5 x 100 cm dan 50 x 50 cm.
Kromatografi kertasserat fasa penyokongnya lebih pendek, bercaknya lebih kecil dari
pada KLT (kromatografi lapis tipis), waktunya lebih lama dari pada adsorben lain, tapi lebih
singkat dari pada KLTtidak bisa menggunakan pereaksi H2SO4 karena selulosa akan
terdekomposisi.
b. Kromatografi Partisi
Partisi merupakan analog dengan ekstraksi pelarut.Fase diam diikatkan pada padatan
lapis tipis yang lembam (inert). Karena fase diam cair diikatkan pada padatan pendukung
maka masih diperdebatkan apakah proses adsorpsinya merupakan partisi murni atau partisi
yang dimodifikasi karena absorpsi juga mungkin terjadi (Rohman,2007).
Cara ini didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tak bercampur, salah
satunya diam (fase diam) dan yang lainnya bergerak (fase gerak). Pada tahap awal KC, fase
diam dibuat dengan cara yang sama seperti membuat penyangga kromatografi gas (Johnson,
Stevenson,1991).
c. Pertukaran Ion
Cara ini didasarkan pada pertukaran (penjerapan) ion antara fase gerak dan titik ion
pada kemasan.Banyak dammar diperoleh dari kopolimer stirena divinilbenzena yang telah
ditambahi gugus fungsi.Dammar jenis asam sulfonat dan jenis amin kuartener merupakan
pilihan terbaik untuk sebagian besar pemakaian.Baik fase terikat maupun dammar telah
 digunakan. Cara tersebut banyak dipakai dalam ilmu hayat, contohnya pemisahan asam
amino, dan dapat pula dipakai untuk pemisahan kation dan anion (Jonhson, Stevenson,1991)
d. Kromatografi Eksklusi
Eksklusi berbeda dari mekanisme sorpsi yang lain, yakni dalam eksklusi tidak ada
interaksi spesifik antara solute dengan fase diam. Teknik ini unik karena dalam pemisahan
didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat pengepak (fase diam). Pengepak adalah suatu
gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert.Sebagai fase gerak
digunakan cairan. Kromatografi jenis ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur
dan ukuran molekul (Rohman,2007).
e. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC
(High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan
awal tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-
asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan
kadarsenyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis,
2. Kromatografi berdasarkan fase yang digunakan dapat dibedakan menjadi
(a) kromatografi Padat cair; (b) kromatografi Padat cair; (c) kromatografi Cair cair
(k.partisi); (d) kromatografi Gas cair
a. kromatografi Padat cair
bila fase geraknya berupa air sedangkan fase diamnya berupa padatan yang amorf yang dapat
menyerap.
b. Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan
yang dapat menyerap/mengadsorp.
c. Kromatografi cair-cair, bila fase gerak dan diamnya berupa cairan, dimana fase diamnya
dilapisi pada permukaan padatan pendukung yang inert
d. Kromatografi gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan yang
dilapiskanpada padatan pendukung yang inert.
3. Kromatografi Berdasarkan alat yang digunakan dapat dibedakan menjadi
(a) Kromatografi planar; (b) HPLC; (c) Kromatografi kertas; (d) Kromatografi cair kinerja
tinggi; (e) kromatogarfi vakum; (f) kromatografi kolom.
a. Kromatografi kolom, apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak
melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen terpisahkan berupa zona-zona pita. Pada
kromatografi analitik setiap komponen yang keluar dari kolom akan dicatat oleh rekorder dan
disajikan dalam bentuk puncak (peak) yang menunjukkan konsentrasi eluen sebagai fungsi
waktu. Untuk suatu senyawa yang mengandung komponen tunggal akan ditandai dengan
waktu elusi yang tampak pada konsentrasi eluen maksimum. Tinggi atau luasan puncak
sebanding dengan konsentrasi komponen sampel. Pada kromatografi preparatif, akan
diperoleh sejumlah fraksi isolate dari komponen sampel dalam fase gerak.
b. Kromatografi planar (kromatografi lapis tipis dan kromatogafi kertas), apabila komponen
yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang
 bergerak berupa bentuk noda (spot) yang dapat dikenali dengan bantuan metode fisika, kimia,
maupun biologis. Posisi noda menunjukkan identitas suatu komponen / senyawa, sedangkan
besar atau intensitasnya menunjukkan konsentrasinya. Pada kromatografi planar beberapa
komponen dapat dipisahkan secara bersamaan maupun dipisahkan dengan dua langkah yang
pertama, Cara ini dikenal dengan metode kromatografi dua dimensi.
c. Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal
tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-asam
amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan kadar
senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis.
d. Kromatografi cair vakum (KCV)
Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu
dengan memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan
tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan
pompa vakum.Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida
(Ghisalberti, 2008).
Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses
penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu:
a. Cara Basah
Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam
fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan
dibuat merata.Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap
dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al., 2006).

b. Cara kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam
yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi
dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al., 2006).
Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode
seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering (Canell, 1998).
Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan
digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi
yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang
sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil
fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan
dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang
sama (Canell, 1998; Sarker et al., 2006).
e. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan dibanding dengan kromatografi
lainnya, diantaranya adalah: cepat dalam proses analisa, resolusi yang lebih tinggi,
 sensitivitas detektor yang lebih tinggi, kolom yang dipakai dapat digunakan kembali, ideal
dan cocok untuk zat bermolekul besar dan berionik dan mudah untuk rekoveri sampel. HPLC
boleh dibilang sebagai teknik tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga
menggunakan sistem instrumen seperti pada kromatogarfi gas. Di dalam teknik ini juga
digunakan tekanan dan kecepatan yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi
yang lebih baik.
Jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisa kualitatif dan kuantitatif
yang digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian Farmakope Indonesia adalah
kromatografi Kolom, Kromatografi Gas, Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis Tipis dan
KCKT.

C. Cara membedakan fase gerak dan fase diam

1. Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses
pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi
perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa analit termasuk asam
amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil
atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.
2. Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert
maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat
juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah
menguap (volatil).

BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan yang dewasa ini telah banyak
digunakan, dibandingkan dengan metode yang lainnya seperti detilasi, kristalisasi,
pengendapan, ekstraksi, dan lain-lain mempunyai keuntungan dalam pelaksanaan yang lebih
sederhana, penggunaan waktu yang sangat singkat terutama mempunyai kepekaan yang
tinggi serta mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi, Metode ini digunakan, jika
dengan metode lain tidak dapat di lakukan misalnya karena jumlah cuplikan sangat sedikit
atau campurannya kompleks.
Penggolongan Kromatografi
¨ Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan
¨ Berdasarkan fase yang digunakan
¨ Berdasarkan alat yang digunakan
Cara membedakan fase gerak dan fase diam
¨ Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses
pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi
perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa analit termasuk asam
amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil
atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.
¨ Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert
maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat
juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah
menguap (volatil).
Jika dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair, ekstraksi fase padat yang biasa
disebut Solid Phase Extraction (SPE) merupakan teknik yang relatif baru akan tetapi SPE
cepat berkembang sebagai alat yang utama untuk pra-perlakuan sampel atau untuk clean-up
sampel-sampel yang kotor, misal sampel-sampel yang mempunyai kandungan matriks yang
tinggi seperti garam-garam, protein, polimer, resin, dll.
Keunggulan SPE dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair adalah:
 Proses ekstraksi lebih sempurna
 Pemisahan analit dari penganggu yang mungkin ada menjadi lebih efisien
 Mengurangi pelarut organik yang digunakan
 Fraksi analit yang diperoleh lebih mudah dikumpulkan
 Mampu menghilangkan partikulat
 Lebih mudah diotomatisasi
Karena SPE merupakan proses pemisahan yang efisien maka untuk memperoleh recovery
yang tinggi (>99%) pada SPE lebih mudah dari pada ekstraksi cair-cair. Dengan ekstraksi
cair-cair diperlukan ekstraksi beberapa kali untuk memperoleh recovery yang tinggi,
sedangkan dengan SPE hanya dibutuhkan satu tahap saja untuk memperolehnya.
Sementara itu kerugian SPE adalah banyaknya jenis cartridge (berisi penjerap tertentu) yang
beredar di pasaran sehingga reprodusibilitas hasil bervariasi jika menggunakan cartridge yang
berbeda dan juga adanya adsorpsi yang bolak-balit pada cartridge SPE.

Prosedur SPE
Ada 2 strategi untuk malakukan penyiapan sampel menggunakan SPE ini. Strategi pertama
adalah dengan memilih pelarut yang mampu menahan secara total analit yang dituju pada
penjerap yang digunakan, sementara senyawa-senyawa yang mengganggu akan terelusi.
Analit yang dituju yang tertahan pada penjerap ini selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil
pelarut organik yang akan mengambil analit yang tertahan ini. Strategi ini bermanfaat jika
analit yang diutuju berkadar rendah.
Diagram skematik prosedur SPE sebagai berikut :
Strategi lain adalah dengan mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi),
sementara senyawa pengganggu tertahan pada penjerap.
Tahap pertama menggunakan SPE adalah dengan mengkondisikan penjerap dengan pelarut
yang sesuai. Untuk penjerap non polar seperti C18 dan penjerap penukar ion dikondisikan
dengan mengalirinya menggunakan metanol lalu dengan akuades. Pencucian yang berlebihan
dengan air akan mengurangi recovery analit. Penjerap-penjerap polar seperti diol, siano,
amino, dan silika harus dibilas dengan pelarut nonpolar seperti metilen klorida.

Dari diagram atas dapat diketahui bahwa ada 4 tahap dalam prosedur SPE, yaitu:
i. Pengkondisian
Cartridge (Penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi permukaan penjerap dan
untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak
diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari.
ii. Retensi (tertahannya) sampel
Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang diharapkan
sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang tidak diharapkan
sementara analit yang dikehendaki terelusi.
iii. Pembilasan
Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan oleh penjerap
selama tahap retensi.
iv. Elusi
Tahap ini merupakan tahap akhir untuk mengambil analit yang dikehendaki jika analit
tersebut tertahan pada penjerap.

Fase SPE
Berbagai macam cartridge SPE yang berisi berbagai macam penjerap diringkas dalam tabel
dibawah. Suatu penjerap pada SPE harus dipilih yang mampu menahan analit secara kuat
selama pemasukan sampel ke dalam cartridge.
Inilah berbagai jenis fase SPE dan kondisi-kondisinya.

Untuk sampel-sampel yang bersifat ionik atau yang dapat terionisasi, digunakan penjerap
penukar ion. Fraksi analit yang keluar dari SPE dapat langsung diinjeksikan ke sistem
kromatografi atau dilakukan pengaturan pH untuk meminimalkan ionisasi sehingga dapat
dipisahkan dengan kolom fase terbalik pada KCKT.

Pengembangan metode
Sebagaimana dalam metode kromatografi cair, retensi analit tergantung pada konsentrasi
sampel, kekuatan pelarut, dan karakteristik penjerap. Pendekatan empirik untuk melakukan
pengembangan metode SPE melibatkan screening penjerap yang tersedia. Langkah pertama
adalah menentukan penjerap mana yang paling baik dalam hal menahan analit yang dituju.
Pertimbangan kedua adalah pelarut apa yang dibutuhkan untuk mengelusi analit yang dituju.
Langkah ketiga adalah menguji matriks sampel blanko untuk mengevaluasi adanya
pengganggu yang mungkin ada, dan akhirnya (langkah keempat) adalah menentukan
recovery dengan menambah analit dalam jumlah tertentu harus dilakukan.
Polaritas pelarut yang meningkat dibutuhkan untuk mengelusi senyawa yang tertahan dalam
penjerap silika; sementara untuk senyawa yang tertahan dalam penjerap non polar (seperti
C18) digunakan pelarut non polar.

KROMATOGRAFI ELEKTROFORESIS
BAB 1

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

 Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama
peniliti yang berkaitan dengan genetika maupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman
yang semakin pesat di negara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan
ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah
pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekular ini
telah dimulai pada akhir abad ke-19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai
untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang kimia dan biologi.

Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19, setelah ditemukan

penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-
molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini juga termasuk protein.

Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau
perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Metode elektroforesis telah digunakan dan
dikembangkan dalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode
tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena
pengerjaannya yang sangat sederhana dan sangat mudah. Didalam ilmu biologi maupun biologi
molecular, metode elektroforesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik, dan genetic
dari hewan ataupun tumbuhan.

I.2 Rumusan Masalah

Masalah yang akan dibahas pada makalah ini adalah sebagai berikut :

1. Apakah pengertian elektroforesis?

2. Bagaimana prinsip operasi elektroforesis?

3. Bagaimana cara kerja elektroforesis?

4. Apa saja jenis-jenis elektroforesis?

I.3 Tujuan

Tujuan dari makalah ini adalah sebagai berikut :

1. Mengetahui pengertian elektroforesis.

2. Mengetahui prinsip operasi elektroforesis.

3. Mengetahui cara kerja elektroforesis.

4. Mengetahui jenis-jenis elektroforesis.

BAB II

ISI

II.1 Pendahuluan

Pemerian terperinci kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett,

seorang ahli botani Rusia yang bekerja di Universitas Warsawa. Pada tahun 1906, dia
mengumumkan pemerian pemisahan klorofil dan pigmen lainnya dalam suatu sari tanaman
dengan menggunakan alat seperti ditunjukkan dalam lampiran .

Gambar Michael tswett

Larutan eter petroleum yang mengandung cuplikan diletakkan pada ujung atas
tabung gelas sempit yang telah diisi dengan serbuk kalsium karbonat. Ketika kedalam kolom
itu dituangi eter petroleum maka akan terlihat bahwa pigmen-pigmen itu terpisah dalam
beberapa daerah. Setiap daerah berwarna itu diisolasi dan diidentifikasi senyawa penyusun nya.
Adanya pita berwarna itu, maka dia mengusulkan nama “kromatografi” yang berasal dari
bahasa Yunani “kromatos” yang berarti warna dan “graphos” yang berarti menulis.

Sekarang kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan

distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tetap tinggal pada sistem dan
dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah-celah
fasa diam. Gerakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan.
 II.2 Macam-macam Kromatografi

Ada beberapa cara dalam mengelompokkan teknik kromatografi. Kebanyakan

berdasarkan pada macam fasa yang digunakan (fasa gerak – fasa diam) dan cara
pengelompokkan lainnya berdasarkan mekanisme yang membuat distribusi fasa, diantaranya
adalah :

1. Kromatografi cairan – padat atau Kromatografi serapan

Ditemukan oleh Tswett dan dikenalkan kembali oleh Kuhn dan Lederer pada 1931, telah
digunakan sangat luas untuk analisis organic dan biokimia. Pada umumnya sebagai isi kolom
adalah silica gel atau alumina yang mempunyai angka banding luas permukaan terhadap
volume sangat besar. Keterbatasan yang lebih nyata pada kenyataan bahwa koefisien distribusi
untuk serapan kerap kali tergantung pada kadar total. Hal ini akan menyebabkan pemisahan
tidak sempurna.

2. Kromatografi cairan – cairan atau Kromatografi partisi

Dikenalkan oleh Martin dan Synge pada 1941 dan kemudian mendapatkan hadiah Nobel
untuk hal itu. Fasa diam terdiri dari lapisan tipis cairan yang melapisi permukaan dari padatan
inert yang berpori-pori.

3. Kromatografi gas – padat

Digunakan sebelum tahun 1800 untuk memurnikan gas. Pada waktu dulu teknik ini tidak
berkembang karena keterbatasannya yang sama seperti halnya kromatografi cairan – padat,
tetapi penelitian lebih lanjut dengan macam fasa padat baru memperluas penggunaan teknik
ini.

4. Kromatografi gas – cairan

Metode pemisahan yang sangat efisien dan serba guna. Teknik ini telah menyebabkan
revolusi dalam kimia organic sejak dikenalkan pertama kali oleh James dan Martin pada 1052.
Hambatan yang paling utama adalah bahan cuplikan harus mempunyai tekanan uap paling
tidak beberapa torr pada suhu kolom. Sistem ini sangat baik sehingga dapat dikatakan sebagai
metode pilihan dalam kromatografi karena dapat memisahkan dengan cepat dan peka.

5. Kromatografi kertas

Merupakan kromatografi cairan – cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis
air yang diserap dari lembap udara oleh kertas. Teknik ini sangat sederhana bila digunakan.

6. Kromatografi lapis tipis

Serupa dengan kromatografi kertas, kecuali kertas diganti dengan lempeng gelas atau
alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silica gel, atau bahan serbuk lainnya.
Kromatografi ini pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan
kromatografi.
7. Kromatografi penukar ion

Merupakan bidang khusus kromatografi cairan – cairan. Seperti namanya, sistem ini
khusus digunakan untuk spesies ion.

8. Penyaringan gel

Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran –
molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan
membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan
ukurannya.

9. Elektroforesis

Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa
gerak.

II.3 Pengertian Elektroforesis

Fenomena elektroforesis dapat diketahui jika suatu fase zat bermuatan dan diberi
beda potensial, maka fase itu akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu ke arah katoda
atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu
ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. koloid, protein enzim
menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk
identifikasi zat-zat spesifik.

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan komponen atau molekul yang

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Prinsip kerja
dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam
hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (katode), sedangkan partikel-partikel
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode).

Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap

massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan
dengan gaya Lorentz yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan
kondisi elektris lingkungan :

Fe = q.E

Dimana F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah
medan listrik.

Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil

elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil
amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya.

Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu
partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk
fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari
campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang
diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan
jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu.

II.4 Prinsip Operasi Elektroforesis

Elektroforesis merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai
dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip
dengan kromatografi : memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya.
Dalam elektroforesis, pemisahan dilakukan berdasarkan adanya pergerakan komponen
bermuatan positif (+) pada kutub negative (-) serta komponen bermuatan negative (-) pada
kutub positif (+). Pergerakan yang terjadi disebut elektrokinetik. Hasil yang didapatkan dari
elektroforesis adalah elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa cepat
perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan migrasi.

Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai
untuk separasi protein dan asam nukleat. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang
besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut.
Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi
ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk
memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya. Dalam hal ini protein diberi muatan
negatif. Sampel protein dimasukkan ke dalam slot atau sumuran pada ujung agar. Karena
sampel ini memiliki berat, mereka akan turun ke dasar sumuran.

II.5 Cara Kerja Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak
pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam
nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan pada kolom-kolom

(disebut well atau "sumur") pada sisi elektroda negatif, kemudian dialirkan listrik dengan kutub
yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Ketika aliran listrik diberikan, maka terjadi
pengaliran elektron, sehingga zat objek akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi
elektroda positif. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah
salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda,
tergantung dari muatan dan berat molekul DNA.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk

mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Pada
elektroforesis terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak. Fase diam
 berfungsi menyaring objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa
objek yang akan dipisah. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung
aparat elektroforesis.

Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi 2, yaitu :

1. Elektroforesis Planar

2. Elektroforesis Kolom

Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena elektrokinetik juga

dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi dengan fasa diam. Pemisahan yang
disebabkan karena interaksi tersebut tidak disebut elektroforesis melainkan
“elektrokromatografi”. Arus yang digunakan pada elektroforesis adalah arus DC dengan nilai
tegangan kurang dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan terjadi efek
pemanasan pada media gel. Efek pemanasan tersebut disebut “efek joule” yang disebabkan
karena adanya tumbukan partikel electron. Efek pemanasan dapat dihilangkan dengan dua cara,
yakni :

1. Pendinginan

2. Efek Konveksi

Efek konvensi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan mengganti bentuk
planar menjadi bentuk kolom atau kapiler. Kapiler yang digunakan dibuat dari silica yang
bermuatan netral atau negative. Bagian luar kapiler dilapisi dengan polimer agar bersifat lentur.

II.6 Jenis-jenis elektroforesis

Jenis elektroforesis antara lain, elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan

elektroforesis kapiler.

II.6.1. Elektroforesis Kertas

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase
diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks.
Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan
adsorbsivitas zat terlarut.

Teknik pemisahan DNA/RNA berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal

tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu,
tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi
melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian
menghasilkan nukleosida 2′ -monoposfat dan 3′ -monoposfat . Ternyata mereka menggunakan
suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah
satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA
 terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan ‘elektroforesis‘,
yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan
penyangga (buffer ). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring,
kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi
tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur
molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara ( intermediate ) dan hasil reaksi ( nukleosida
2′ -monoposfat dan nukleosida 3′ -monoposfat ) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan
mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses
elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan
mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

II.6.2 Elektroforesis Gel

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai
dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang
menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya
elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk
memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein- protein. Kemudian elektroforesis
gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

Tahun 1955, Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji
dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan
menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji
tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam
( stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Teknik
elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian
ditemukan gel poliakrilamida ( PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk
melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan
campuran DNA/RNA atau protein dangan ukuran lebih besar.

Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi yaitu memisahkan campuran
bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan
terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda. Elektroforesis gel
memisahkan makromolekul berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah
pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi
pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu sebagai
berikut :

1.Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan

menganalisis hasil ekstensi primer.
 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3.Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang
digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju

pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel
karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran
besar.

2. Konsentrasi gel semakin tinggi karena konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat
sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi
memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah
memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3. Bentuk molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak
dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4. Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan
tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5. Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6. Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7. Larutan buffer, elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi
listrik sehingga mempercepat migrasi DNA.

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui

ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil
ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai
penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA
tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya
jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda Hind III. Marker tersebut memiliki
delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb. Penggunaan DNA marker
tersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran
110--20.000 pb.

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:

1. Comb : digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.

2. Tray : digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.

3. Chamber : digunakan sebagai wadah gel agarosa.

4. Sumber listrik : digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang

bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol
Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel.

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat
di sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari
spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing ,
mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu,
mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas
gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah
diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik
dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen
DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi
melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan
menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA.

Gambar Prosedur Kerja Elektroforesis Gel

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan
protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang
 digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda
antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan
jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam
nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah
agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)

pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.
Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub
listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju
elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan
proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat.
Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan
untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah
"diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul
sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

II.6.3 Elektroforesis Kapiler

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk

memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi
yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai digunakan secara luas pada
akhir tahun 1940. Untuk aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia,
lingkungan, dan analisis farmasi. Elektroforesis kapiler menggunakanlistrik bertegangan
tinggi yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda.
Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik
pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa
kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik
namun boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal.

Karakteristik elektroforesis kapiler yaitu :

1. Menggunakan pipa kapiler pada pemisahan elektroforesis.

2. Memanfaatkan medan listrik berkekuatan tinggi, lebih dari 5 V/cm.

3. Menggunakan detektor berteknologi modern, sebagaimana yang ada pada kromatogram.

4. Efisiensinya kadangkala sama dengan kromatografi gas kapiler, namun juga bisa lebih besar.

5. Membutuhkan waktu beberapa menit untuk mengamati sampel.

6. Mudah diotomatiskan untuk menganalisis dalam segi kuantitatif, dan mudah digunakan.

7. Terbatas dalam mengkomsumsi atau melibatkan sejumlah reagent.

8. Metode ini lebih aplikatif untuk menyeleksi dalam ukuran luas, dibandingkan dengan teknik
separasi lainnya.

Dalam kromatografi modern, efisiensi (N) merupakan factor penentu keberhasilan

pemisahan. Oleh karena keluaran elektroforesis kapiler menyerupai kromatogram maka peak
elektroforesis merupakan indicator efisiensi, semakin tajam suatu peak semakin efisiensi
pemisahan tersebut. Selain efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dihitung dengan cara yang
sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dinyatakan dalam formula
berikut :

N=

Dimana, µef menyatakan mobilitas elektroforetik, µeo adalah mobilitas

alektroosmotik, E adalah tegangan listrik yang diberikan, dan D adalah koefisien difusi solute.

Salah satu keuntungan utama dari CE adalah dibutuhkan peralatan yang sederhana.
CE terdiri dari satu daya tegangan tinggi, penyangga reservoir, sebuah kapiler, dan sebuah
detektor. Pengaturan dasar dapat diuraikan dengn peningkatan fitur seperti sampel, peralatan
injeksi ganda, mengontrol suhu kapiler, pengaturan penyediaan daya, detektor ganda, dan
kumpulan fraksi.

Berbagai model elektroforesis kapiler dapat dilakukan menggunakan instrumen CE.

Dasar dari perbedaan model pemisahan dapat dikarenakan bahwa elektroforesis kapiler telah
dikembangkan dari suatu kombinasi elektroforesis dan teknik kromatografi. Istilah umumnya
ini dapat dianggap sebagai pemisahan elektroforesis dari sejumlah senyawa di dalam tabung
sempit. Walaupun sebagian besar aplikasi telah dilakukan menggunakan cairan sebagai media
pemisah, teknik elektroforesis kapiler dimana kapiler berisi elektroforesis gel, lapisan
kromatografi.

Instrumentasi CE terdiri dari :

1. Pipa kapiler

Pipa kapiler bertindak sebagai kolom tempat proses pemisahan pengganti kertas atau
agar-agar pada elektroforesis konvensional. Pipa kapiler terbuat dari gelas dengan diameter
dalam berkisar antara 25-100 µm dan panjang antara 50-100 cm. semakin kecil ukuran
diameter pipa kapiler maka semakin besar harga N. Oleh karena itu, semakin besar diameter
(>100) maka pemisahan semakin tidak efisien.

2. Larutan buffer
 Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut tercelup
dalam larutan buffer. Larutan buffer berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan
arus listrik dan untuk pengontrol muatan molekul. Karena molekul dapat bermuatan positif,
negative, atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dalam
menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan
elektroforesis,

3. Sumber arus searah

Dalam elektoforesi konvesional dialirkan arus searah sekitar 100 volt tetapi dalam
elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertegangan sangat tinggi 10.000-30.000 volt. Oleh
karena itu, ekperimen elektroforesis kapiler dapat dilakukan dalam beberapa menit sedangkan
eksperimen elektroforesis konvensional dilakukan dalam waktu sehari.

4. Detector

Detector dapat diletakkan disalah satu ujung pipa kapiler yaitu dekat katoda. Berbagai
detector telah digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan, antara lain
: spektrometri (seperti UV dan fluoresen) dan detector elektrokimia (seperti konduktometri dan
amperometri).

Contoh Aplikasi Elektroforesis :

1. Pemisahan ion Li+ dan Na+

Kedua kation ini, Li+ dan Na+ sama-sama memiliki muatan +1, namun memiliki
ukuran berbeda. Ion Li+ memiliki ukuran yang lebih kecil dari Na+. Ion Li+ akan lebih
tersolvasi dengan air sehingga akan mengikat banyak molekul air. Akibatnya mobilitas
Li+ akan menjadi kecil dan ion Na+ akan lebih dahulu keluar dari kapiler.

2. Pemisahan NO2- dan NO3- menggunakan EOF (E l e c t r o O s m o t i c F l o w )

HNO3 merupakan asam kuat, dalam air akan terurai sempurna menjadi H+ dan NO3- ,
sedangkan HNO2 merupakan asam lemah, dalam air akan terdisosiasi sebagian. Pada pH 7,
HNO2 akan terdisosiasi sebagian, menyisakan spesi HNO2. Hal ini tidak baik untuk pemisahan
karena tidak semua HNO2 berada dalam spesi NO2-. Untuk melakukan pemisahan dengan
baik, kita harus menggunakan pH yang tinggi sehingga kedua spesi tersebut dapat berada dalam
bentuk anionnya. Namun ketika pH sudah diatur tinggi, hanya akan terbentuk satu puncak pada
elektroforegram. Hal ini disebabkan karena kedua spesi akan menuju pada kutub yang sama.
Pemisahan dapat tetap dilakukan dengan baik asalkan muatan detektor diatur menjadi positif
dan muatan injektor diatur menjadi negatif.
 Sistem yang berdasarkan pada skema (a) hanya akan menghasilkan satu puncak,
artinya pemisahan tidak berlangsung dengan baik. Pada skema (b) akan muncul dua puncak,
artinya pemisahan NO3- dan NO2-terjadi dengan baik. Hal ini disebabkan karena nilai mobilitas
elektroforetik (μep) NO3- lebih kecil dibanding μep NO2- , akibatnya mobilitas total (μt)
NO2- menjadi lebih besar dari μt NO3- . Hal ini akan berakibat NO2- akan keluar terlebih dahulu
dibanding NO3- .

Untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :

a. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki
karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah
kasus.

b. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

c. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

II.7 Medium Pendukung

Elektroforesis untuk makromolekuler memerlukan medium pendukung untuk

mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel
 poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi
protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis
dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna
suatu cairan dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun medium pendukung relative
stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi electron (elektro
osmosis), atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya yang kesemuanya mempengaruhi
kecepatan gerak senyawa.

II.7.1 Cellulose asetat

II.7.2 Larutan Buffer

Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga

dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :

1. Komposisi

Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi
kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat karena dapat membentuk
gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.

2. Konsentrasi

Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa akan meningkat
dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan
ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas jugs meningkat,
biasanya dipilih konsentrasi sebesar 0,05 – 0,10 M.

3. pH

Tingkat ionisasi asam-asam organic akan bertambah apabila pH bertambah sebaliknya

untuk basa-basa organic. Oleh sebab itu, tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH.

II.7.3 Medan Elektrik

Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan
dalam medium :

1. Voltase

Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara
keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient
potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.

2. Aliran listrik

Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion
buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan
 yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding
dengan waktunya.

3. Tahanan

Medium elektroforesa menimbulkan aliran ion sebandin dengan jenis medium, jenis
buffer, dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara
elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi
ion dalam buffer.

BAB III

PENUTUP

III.1 Kesimpulan

Dari pembahasan materi yang telah dijabarkan, dapat ditarik beberapa kesimpulan,
antara lain sebagai berikut:

1. Elektroforesis merupakan teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

2. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi, yaitu memisahkan campuran bahan-
bahan berdasarkan perbedaan sifatnya.

3. Jenis-jenis elektroforesis yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel dan elektroforesis

kapiler.

4. Elektroforesis dapat digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang.

III.2 Saran

1. Seharusnya, sebelum membuat makalah tentang elektroforesis ini alangkah baiknya

dipelajari atau dibahas terlebih dahulu didalam kelas. Sehingga dalam pembuatan makalah
menjadi mudah karena sudah mengetahui dasar-dasar elektroforesis.