Biologia Molecular Celular Essencial

Índice

Capítulos 1-3..........................................................2

Capítulos 4-7.........................................................13

Capítulos 10-13.......................................................33

Capítulos 14-16.......................................................49

Capítulo Epigenética...................................................63

Capítulos 18-23.......................................................75

Capítulo 24...........................................................85

Capítulo Mitocôndrias...................................................94

Capítulos 27-28......................................................102

Capítulos 29-33......................................................109

Capítulo Citoesqueleto I................................................134

Capítulo Citoesqueleto II...............................................143

Imunologia..........................................................147

Tecnologias BMC.....................................................169

Bases de Dados......................................................188

Biologia Molecular

da Célula

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(Capítulos 1-3)

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BLOCO 1 – Importância da Biologia Molecular em Medicina Humana. Engenharia Genética e medicamentos Recombinantes.

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Expressão génica

Expressão génica: diz respeito ao processo em que a sequência de nucleótidos de um gene é transcrita numa sequência de nucleótidos de uma molécula de RNA e que, na maioria dos casos, é traduzida numa sequência de aminoácidos de uma proteína.

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A função de uma proteína é determinada pela sua configuração tridimensional e a sua estrutura é, por sua vez, determinada pela sequência de aminoácidos numa cadeia polipeptídica. Por último, esta é codificada pela sequência de nucleótidos de uma cadeia de DNA.

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A expressão génica varia entre os seres eucariontes e procariontes:

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●  TRANSCRIÇÃO - O processo de transcrição é universal.

o  Todas as células usam a RNA polimerase e o emparelhamento complementar de bases de modo a sintetizar RNA a partir de um molde de DNA.

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●  PROCESSAMENTO – exclusivo dos seres eucariontes.

o  Da transcrição obtém-se uma molécula de pré-mRNA que contém intrões (sequências não-codificantes) e exões (sequências codificantes).

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o  Deste modo, é necessário remover os intrões e unir os exões para que haja a formação de uma molécula de mRNA maturo.

o  Os seres eucariontes não possuem intrões, logo a molécula obtida pelo processo de transcrição diz respeito à molécula de mRNA matura.

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●  O mRNA resultante do processamento é transportado para fora do núcleo (para o citoplasma), o que não acontece nos seres procariontes dado que não possuem um núcleo definido.

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●  TRADUÇÃO – comum a ambos os tipos de células.

o  Os ribossomas encarregam-se de ler a molécula de mRNA e a partir desta, pela adição de tRNA, sintetizam a estrutura primária de uma proteína.

Vírus

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Os vírus não são considerados seres vivos pois são incapazes de se auto-reproduzirem, pelo que se aproveitam da maquinaria da célula hospedeira para se replicarem, e não apresentam metabolismo próprio.

Os vírus fundem-se com a membrana celular, perdendo o seu envelope e libertam o seu contéudo para o interior da célula. No caso dos retrovírus, estes libertam uma ou mais moléculas de RNA relativamente pequenas e a transcriptase reversa:

●  A transcriptase reversa permite a realização da transcrição reversa, formando uma molécula de DNA complementar que é depois duplicada, formando uma dupla hélice.

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●  O DNA viral é incorporado no DNA nuclear e é posteriormente expresso, seguindo a via da transcrição e da tradução.

●  Obtém-se proteínas virais que vão depois empacotar o RNA viral (cópias do mRNA) e a transcriptase reversa, formando novos vírus, pelo que começa um novo ciclo de infeção.

Engenharia genética

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Plasmídeos

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Um plasmídeo é uma molécula de DNA circular com capacidade de se auto-replicar e que existe naturalmente em bactérias, apesar de não fazer parte do seu genoma principal. Contribui com propriedades como resistência a antibióticos, produção de toxinas e capacidade de transferência por conjugação.

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É de notar que a replicação de um plasmídeo ocorre independentemente da replicação do cromossoma bacteriano e de modo muito mais rápido.

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Devido à sua capacidade de replicação dentro das células bacterianas e ao seu reduzido tamanho, que permite uma fácil manipulação e introdução de longos fragmentos de DNA, são usados para clonar, transferir e multiplicar genes.

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Enzimas de restrição

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Nucleases: enzimas que cortam ácidos nucleicos

●  Exonucleases: cortam o DNA a partir das extremidades

●  Endonucleases: cortam no meio da molécula de DNA

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As enzimas de restrição são endonucleases pois clivam ligações fosfodiéster entre nucleótidos adjacentes. Estas são obtidas a partir de diferentes estirpes bacterianas – é um dos seus mecanismos naturais contra a infeção viral - a estirpe bacteriana é resistente às suas próprias enzimas de restrição devido à metilação do seu próprio DNA nestas sequências de restrição.

Estas enzimas têm uma particularidade: a maioria corta sequências específicas do DNA designadas por palíndromas (sequências em que a leitura do DNA é a mesma em ambas as cadeias) e que contêm, normalmente, entre 4 a 8 nucleótidos. Podem dar origem a extremidades coesivas ou a extremidades não coesivas.

●  Extremidades coesivas ou protuberantes (sticky ends) - extremidades desemparelhadas

o  Extremidades coesivas a 5’ (a cadeia de extremidade 5’ fica maior após o corte)

o  Extremidades coesivas a 3’ (a cadeia de extremidade 3’ fica maior após o corte)

●  Extremidades não coesivas ou cegas (blunt ends) - extremidades não desemparelhadas

As enzimas de restrição cortam o plasmídeo no local de policlonagem, que contém várias sequências de restrição que são únicas no plasmídeo. Tanto o plasmídeo como o insert (fragmento de DNA a inserir) serão cortados pela mesma ou pelas mesmas enzimas (podem ser usadas duas enzimas, uma para cada extremidade palindrómica). Deste modo, tanto o plasmídeo como o insert vão obter extremidades coesivas que são complementares, possibilitando o estabelecimento de pontes de hidrogénio entre as bases azotadas das

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mesmas. Posteriormente, a ação da DNA ligase promove a circularização do plasmídeo, formando um plasmídeo recombinante. É de destacar a extrema importância da existência de uma única sequência de restrição no plasmídeo, caso contrário o nosso plasmídeo poderia ser cortado em vários fragmentos, o que comprometeria a eficácia da técnica dada a incerteza da inserção do insert.

Em laboratório, as enzimas e o insert são cortados pelas enzimas de restrição em tubos de ensaio diferentes e são posteriormente misturados com a ligase do DNA num mesmo tudo de ensaio para ocorrência da fase ligação, com consumo de ATP.

A eficácia desta técnica não é 100%:

o Tanto o plasmídeo como o insert podem não sofrer a ação da enzima de restrição e, deste modo, não são clivados;

o Pode ocorrer que um plasmídeo seja cortado, mas que o insert não o seja ou vice-versa.

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Devemos ainda considerar as situações em que o plasmídeo retorna a fechar sem incorporar o insert.

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Deste modo, podemos verificar a ocorrência de:

-  Plasmídeos circularizados que não foram clivados pelas enzimas de restrição;

-  Plasmídeos circularizados que foram cortados por uma enzima de restrição e que recircularizaram;

-  Plasmídeos recombinantes (em que ocorreu posterior introdução do insert).

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Engenharia Genética

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A Engenharia Genética é uma ferramenta utilizada atualmente na obtenção de proteínas humanas a larga escala, que visa curar ou atenuar certas patologias resultantes da carência de proteínas circulantes e que podem ser corrigidas através da sua administração intravenosa por terapia de substituição de hormonas recombinantes. Este é o caso dos diabetes (insulina), nanismo (hormona do crescimento humano), etc.

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A base da Engenharia Genética, a tecnologia do DNA recombinante, permite a junção de moléculas de DNA provenientes de diferentes espécies, de modo a originar uma nova combinação. Deste modo, permite isolar, caracterizar e manipular genes.

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Esta tecnologia é de interesse na clonagem molecular, que visa a clonagem de um fragmento de DNA de interesse, normalmente um gene.

A clonagem molecular é realizada através da introdução de um fragmento de DNA num vetor genético, ou seja, uma molécula de DNA utilizada como veículo para transportar uma determinada informação genética para o interior de uma célula hospedeira. Por sua vez, estes vetores podem ser plasmídeos ou genomas de bacteriófagos isolados de estirpes bacterianas.

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Relativamente aos plasmídeos, convém ainda referir que, consoante a presença ou ausência de um promotor, podemos distinguir dois tipos de plasmídeos:

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●  Plasmídeos de expressão: contêm um promotor a montante do local de policlonagem, que possibilita a sua utilização para a produção da proteína de interesse (permite a ligação da RNA polimerase).

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●  Plasmídeos de clonagem: não contêm um promotor, pelo que são apenas utilizados para a clonagem do segmento introduzido, no âmbito da clonagem molecular.

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Tendo em conta as propriedades dos plasmídeos já referidas, a sua introdução numa bactéria permite a auto-replicação dos plasmídeos. Normalmente, recorre-se à bactéria Escherichia coli devido à sua simplicidade, ao aprofundado conhecimento que temos da mesma, à sua elevada taxa de multiplicação e, por fim, à sua aceitação relativamente fácil de DNA estranho proveniente de outra espécie, permitindo a sua replicação, transcrição e ainda, caso seja esse o interesse, produção de proteína.

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Clonagem molecular

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Utilizam-se os vetores de clonagem, que contêm:

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●  Origem de replicação (Ori): sequência de 50 a 100 bp à qual se liga a DNA polimerase, que permite que o vetor seja replicado e transmitido à descendência.

●  Marca de seleção: gene que confere características vantajosas à bactéria num determinado meio, como um gene de resistência a antibiótico.

●  Local de policlonagem, que contém algumas sequências de restrição que são únicas no plasmídeo, onde se insere o fragmento de DNA a clonar.

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O procedimento para a clonagem molecular resume-se aos seguintes passos:

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Estudo do vetor e do fragmento de DNA de interesse, tendo em vista a identificação de sequências de restrição adequadas à clonagem (não se pode inserir o fragmento num local aleatório) que possibilitem a escolha das enzimas de restrição a utilizar, que devem, preferencialmente, clivar estas sequências de modo a gerar extremidades coesivas.

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Digestão de restrição: incuba-se separadamente o vetor e o DNA com as enzimas de restrição escolhidas.

As enzimas de restrição reconhecem a sua sequência de restrição e clivam o vetor e o DNA;

A presença de extremidades coesivas e complementares entre o vetor linearizado e o insert possibilita o estabelecimento de pontes de hidrogénio entre as bases azotadas dos nucleótidos;

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3.  Ligação, através da ação da DNA ligase, e formação de um plasmídeo recombinante.

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4.  Transformação: corresponde à introdução do plasmídeo recombinante na célula hospedeira, neste caso, uma bactéria.

a.  A entrada dos plasmídeos na bactéria ocorre através da parede da mesma, sendo que a bactéria tem de ser tornada competente para transformação:

-  Suspendem-se as bactérias numa solução fria de catiões (normalmente utiliza-se uma solução de cloreto de cálcio ou cloreto de cálcio e magnésio), de modo a que estes formem complexos com os fosfatos expostos à superfície da membrana celular;

-  A baixa temperatura estabiliza a distribuição dos fosfatos carregados enquanto os complexos imobilizam a membrana;

-  A entrada dos plasmídeos é promovida através de choque térmico, que permite a abertura de poros na parede bacteriana (o que antes não seria possível dada a mobilidade dos fosfolípidos).

b.  Por norma, não entra mais que um plasmídeo para uma bactéria.

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5.  Adição de meio de cultura que possibilite a multiplicação das bactérias e início da produção da proteína que confere resistência a antibiótico.

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6.  Inoculação das bactérias em meio sólido de agar com antibiótico, utilizando uma ansa de inoculação, para permitir a seleção das bactérias que incorporaram o plasmídeo (bactérias transformadas).

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7.  Colocação em meio de cultura líquido, à temperatura ambiente, que permite o crescimento das bactérias - através de muitas divisões celulares, gera-se então uma colónia