u ff

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
GCM
ROTEIRO DE AULAS PRTICAS
PRTICA N
o
1 TITULAO DE AMINOCIDOS E ESTUDO DO EFEITO-TA
MPO
1.Introduo
1.1. Aminocidos
estrutura e
propriedades
Em qumica, um aminocido
qualquer molcula que contm
simultaneamente grupos funcionais
amina e cido carboxlico. Em
bioqumica, este termo usado como
termo curto e geral para se referir aos
aminocidos alfa: aqueles em que as
funes amino (NH
3
+
) e carboxila
(COO
-
) esto ligadas ao mesmo
carbono, conforme a frmula indicada
na Figur a 1:
H
R C
COO -
NH3
+
+
Figura 1 Frmula geral dos
aminocidos
Como se pode observar,
ambos os grupos esto ligados ao
carbono central, ao qual est tambm
ligado um grupamento lateral
varivel, denominado R. A estrutura
dos aminocidos d origem a dois
ismeros opticamente ativos, isto ,
capazes de promover a rotao do
plano da luz polarizada (Figura 2).
Espelho
O
O
-
O
R
NH
3
+
H
HO
Imagem
(D-aminocido)
Figura 2
Isomeria dos
aminocidos
Esses
ismeros so
denominados
enantimeros, so
quirais (do grego
kiros, que significa
mo). So
imagens
especulares que
no podem ser
sobrepostas. A
designao L ou D
foi proposta por
Emil Fischer, em
1891, com base na
caracterizao das
formas L e D d o
gliceraldedo,
conforme
mostrado na
Figura 3:
CHO
CHO
HO H H
CH
2
OH CH
2
OH
L-Gliceraldedo Gliceraldedo
COO
-
COO
H
NH
3
+
H
3
N
+
CH
3
L-Alanina
Figura 3 Relao entre as formas L e D do
Gliceraldedo e da Alanina.
Historicamente, as designaes L e D
usad
as
como abreviaes
dos
adjetiv
os
(provoca a rotao da luz para a esquerda) e
dextrorrotatrio
(provoca
direit
a),
respectivament
e. Entretanto, sabe-se que nem
todos os L-
aminocidos so
levorrotatrios.
Todos os
aminocidos das
protenas naturais
tm a configurao
L, porque as
protenas so
sintetizadas por
enzimas que
reconhecem e
inserem apenas L-
aminocidos nas
cadeias peptdicas.
Apenas alguns
poucos peptdeos
de
1
bactrias possuem aminocidos na forma D (ex.: cido D-
glutmico). Todos os 20 aminocidos que compem a
estrutura das protenas so -aminocidos, mas existem
aminocidos em que os grupos amino e carboxlico no
esto ligados ao mesmo carbono; alguns desses
aminocidos so importantes precursores de algumas
substncias (ex.: -alanina, precursora do cido
pantotnico) e possuem papis celulares especficos (ex.:
o cido -aminobutrico ou GABA, um neurotransmissor).
A presena dos grupos amina e carboxila propicia
aos -aminocidos um carteranfotrico em soluo
aquosa, ou seja, um comportamento tanto de cido como
de base (Cabe aqui ressaltar um ponto importante: no h
substncias cidas ou bsicas em absoluto. Esses termos
so conceitos; uma substncia s
1 cida ou bsicaem relao a outra substncia).
Em valores de pH 6,0 7,0, os aminocidos existem
predominantemente na forma dipolar inica, cuja
representao aquela mostrada na Figura 1. Esta forma
2 denominada zwitterion (do alemo on
hbrido). Em faixas extremas de pH, por outro lado,
eles se
apresentaro como espcies inicas diferentes (Figu ra
4):
Em pH 1 Em pH 11
H
H
R
C
COOH R C
C
O
O
-
NH
+
N
H
2
3
Figura 4 Espcies inicas dos aminocidos em
valores extremos de pH.
Portanto, os aminocidos possuemno mnimo
dois grupos (pois o R tambm pode ser ionizvel) que
podem sofrer protonaes e desprotonaes e essas
reaes dependero do pH da soluo em que os
aminocidos se encontram (Figura 5):
H
Em pH = 1 H
COO
-
+
H
+
CO
OH C C R R
- H+
NH
3
NH
3
+ +
H
Em pH = 11
H
CO
O
-
- H+
CO
OH C C R R
+
H
+
NH
3
NH
2
+
Figura 5 Reaes de protonao e
desprotonao dos aminocidos em valores extremos de
pH.
Pode-se estudar a dissociao dos prtons de um
aminocido em soluo realizando-se uma curva de
titulao e observando-se a variao do pH do meio com
o auxlio de um medidor de pH (ou pHmetro). A titulao
de um aminocido consiste na remoo grad ual de
prtons atravs da adio de uma base (como NaOH) e a
curva de titulao corresponde ao grfico dos valores de
pH da soluo em funo do volume de base adicionado.
Essa curva revela os pK
a
s (que so formas de expresso
das constantes de dissociao K
a
) dos grupos ionizveis
do aminocido (lembre-se que pK
a
= -log K
a
). medida
que a base adicionada, a curva passa apresentar estgios
distintos, que dependem da concetrao de cada uma das
formas doadoras de prtons, como mostra a Figura 6:
1 2 3
H
H
+
H
H
+
H
CO
O
-
C
O
O
- R
C
CO
OH R C R C
pK
1 pK2
NH
3
NH
3
NH
2
+
+
Adio de base
Figura 6 Reaes de dissociao de prtons
de um -aminocido simples monocarboxlico.
2
Assim, para um -aminocido simples
monocarboxlico, observaremos trs pontos de inflexo na
curva: A) um ponto no qual o pH igual ao valordo pK do
grupo carboxlico, onde esto presentes quantidades
equimolares das formas A (carga lquida = +1) e B (carga
lquida = 0); B) um ponto no qual o valor de pH
corresponde ao ponto isoeltrico (pI) do aminocido,
onde a forma B est principalmente presente; e C) um
ponto no qual o pH igual ao valor do pK do grupo
amino, onde esto presentes quantidades equimolares das
formas B e C (carga lquida = -1). Portanto, cada
aminocido apresentar uma curva especfica, j que esta
depende das interaes intramoleculares que o compem.
Alm disso, alguns aminocidos apresentaro mais de 2
valores de pK, uma vez que possuem mais um grupo
ionizvel no seu grupamento R.
1.1. O medidor de pH
Em linhas gerais, o medidor de pH um
aparelho capaz de converter a diferena de potencia l (ou
seja, um potencimetro ) detectada pelo eletrodo em
uma escala de pH. O eletrodo de vidro combinado (ver
Figura 7) um eletrodo compacto no qual o eletrodode
vidro acha-se envolvido pelo eletrodo de refernciade
Ag/AgCl (em alguns equipamentos esses eletrodos
podem ser encontrados em separado). O eletrodo de
vidro consiste de um tubo de vidro com um bulbo na
extremidade inferior, feito de vidro especial (constitudo
de xido de silcio). Nele est contida uma soluo de
Ag/AgCl em soluo de HCl 0,1 M. A superfcie do
+
bulbo revestida de ons Na que, quando em contato
com os ons hidrognio, so substitudos por prtons
que permanecem em equilbrio em cada lado da parede
de vidro:
Si ONa + H
2
O Si OH + NaOH
Quando o eletrodo imerso numa soluo que
se deseja investigar, formam-se potenciais de
membrana e a condutividade eltrica feita
principalmente pelos ons Na
+
. A diferena de potencial
estabelecida comparada com o eletrodo de referncia
(Ag/AgCl ou Hg/HgCl2) que envolve o eletrodo de vidro
e entra em contato com a amostra atravs de uma juno
cermica onde se forma uma ponte salina.
Figura 7 Eletrodo
de vidro combinado.
O medidor de pH possui um boto para ajuste
da temperatura (j que esta influencia no equilbrio
qumico dos tampes), um para calibrao (com solu o
em pH neutro - 7,0) e outro para valores de pH extremos
(normalmente 4 ou 10), que normalmente chamado de
boto de ajuste de assimetria e permite correes d e
desvios da curva do potencial do eletrodo. Alm disso,
alguns aparelhos possuem um boto para selecionar o
tipo de leitura que se deseja realizar em mV ou p H.
Para a calibrao do medidor, utiliza-se sempre solues-
padro disponveis comercialmente.
1.2. Solues-tampo
As substncias consideradas cidos ou bases
fortes so aquelas que tendem a se dissociar totalm ente
quando em soluo, diminuindo ou aumentando o pH do
meio, respectivamente. Assim, o pH de uma soluo 0 ,1
3
M de HCl praticamente 1,0 (pH = -log [0,1]),
enquanto o pH de uma soluo 0,1 N de NaOH
praticamente 13,0 (pOH = -log [0,1] e pH = 14 - 1). O
pH dos fluidos biolgicos mantm-se mais ou menos
constantes em valores prximos de 7,0 devido
presena de um grande nmero de substncias capazes
de captar ou liberar prtons. Nas clulas e nos fluidos
biolgicos predominam cidos e bases fracos, que no
so completamente ionizveis em soluo (alguns
dissociam-se menos que 1 %). Sendo assim, a relao
entre pH e o grau de dissociao de um cido fraco no
direta como nos cidos fortes. No entanto, ela pode ser
analisada atravs da equao de Henderson-Hasselbach.
Considere a reao de dissociao de um cido
fraco em soluo aquosa:
HA H
+
+ A
-
Aplicando a lei de ao de massas temos:
K
a
= [H
+
] [A
-
]
[HA]
Onde Ka a constante de equilbrio da reao.
Rearranjando a equao temos:
1 = 1 x
[A
-

]
[H
+
] K
a
[H
A]
Log
o:
log 1 = log 1
+ log
[A
-
]
[
H
+
] K
a
[H
A]
Chegamos finalmente equao de
Henderson-Hasselbach:
pH = pK
a
+ log [A
-
] [HA]
A equao mostra que o pH de qualquer soluo
aquosa que contenha uma quantidade significativa de um
cido fraco depender da proporo (E NO DA
QUANTIDADE ABSOLUTA) das formas
dissociadas e no dissociadas do cido e do pK deste
a
+
forem adicionados a
uma
mesmo cido. Se H ou
OH
soluo contendo
uma
proporo adequada
destas
formas, a razo [base]/[cido] ser alterada ao consumir
esses [H
+
] ou [OH
-
], sem variar o pH do meio e, claro,
mantendo-se inalterada a constante de dissociao, K
a
Assim, o TAMPONAMENTO DE UMA
SOLUO a capacidade desta em resistir a variae s
de pH. Substncias cuja presena na soluo so
responsveis por este efeito so conhecidas como
TAMPES. O fenmeno do tamponamento um dos
fatores que possibilitou o surgimento da vida. Em
organismos vivos o pH dos diferentes ambientes
mantido estvel, mesmo aps a adio de cidos ou
bases. Em laboratrios pode-se preparar uma soluo
tampo utilizando-se uma base fraca ou um cido fraco
(ex.: cido actico) e sua base conjugada na formade um
sal (ex.: acetato de sdio). Em pesquisa cientf ica os
tampes so essenciais para a manuteno do pH em
uma grande variedade de procedimentos, por exemplo,
cultura de clulas e tecidos, medida de atividade
enzimtica, purificao de protenas, etc... Normalmente
utiliza-se um tampo para manuteno de um valor de
pH que se encontre uma unidade acima ou abaixo de seu
valor de pK, pois dentro desta faixa o seu efeito
tamponante muito mais eficiente (como exemplo,
verifique as inflexes da curva de titulao dos
aminocidos nesta aula prtica).
2. Objetivos
1 Determinar os valores de pK das solues de
aminocidos (Glicina e cido glutmico) atravs de
titulao;
2 Construir as curvas de titulao para cada um dos
aminocidos;
3 Manusear e compreender o funcionamento de um
medidor de pH.
4
1 Estudar o efeito tamponante de misturas contendo
propores e concentraes diferentes de um cido
fraco e sua base conjugada.
3. Reagentes
Solues de Glicina e cido Glutmico 0,02 M
(pH 1);
Soluo de NaOH 0,5
N. Soluo de HCl 1 M.
Solues-padro para calibrao do medidor de
pH.
Soluo de cido actico 0,2 M
Soluo de acetato de sdio 0,2 M.
4. Procedimentos
4.1. Procedimentos gerais de ajuste do medidor de
pH
1 Ligar o aparelho;
2 Retirar o eletrodo do recipiente contendo soluo d e
KCl 3M e lav-lo com gua destilada.
3 Imergir o eletrodo na soluo-padro de pH 7 e
calibrar o aparelho no boto adequado.
4 Retirar o eletrodo da soluo e repetir o
procedimento de ajuste, agora para a soluo-
padro de pH 4,0, no boto adequado.
5 Lembrar de sempre colocar o aparelho em stand
by quando eletrodo no estiver imerso em uma
soluo.
4.2. Procedimentos para titulao dos aminocidos
1 Em um bcher colocar 40 mL de glicina ou cido
glutmico.
2 Mergulhar uma barra magntica na soluo e
posicionar o bcher sobre a placa agitadora.
3 Inserir o eletrodo limpo e calibrado na soluo, de
modo que a juno cermica fique submersa
(cuidado para o bulbo no esbarrar na barra
magntica).
1 Sob agitao, titular com NaOH 0,5 N, adicionando
0,2 mL por vez e anotando o pH aps cada adio
(adicionar o NaOH diretamente soluo, sem
esbarrar no eletrodo ou na parede interna do bcher).
2 Construir o grfico de pH da soluo versus volume
de NaOH adicionado.
4.3. Procedimentos para estudo da capacidade
tamponante
1 Em quatro bcheres, adicionar os volumes indicados
das solues de cido actico, acetato de sdio e
gua:
Bcher
cido Acetato de
H
2
O
actico sdio
1 20 mL 20 mL --
2 10 mL 10 mL 20 mL
3 25 mL 15 mL --
4 15 mL 25 mL --
1 Repetir os procedimentos descritos acima para
titulao de cada uma das solues, mas desta vez
adicionar 5 x 0,5 mL de NaOH 0,5 N. Anotar o valor
de pH a cada adio.
2 Construir o grfico de pH das solues versus
volume de NaOH adicionado.
5. Questes para discusso
1) Em relao prtica realizada:
1) Quais os valores de pK e pI da glicina e do cido
glutmico?
2) Por que a curva de titulao do cido glutmico
diferente da curva da glicina?
3)Calcule o pH terico das solues 1, 2, 3 e 4, s
abendo que o K
a
do cido actico 1,74 10
-5
.
5
2) Voc pode utilizar um aminocido para fazer uma
soluo-tampo? Por qu?
3) Como a concentrao de um tampo afeta a sua
capacidade tamponante?
4) Um tampo mantm constante o pH de um meio
indefinidamente?
5) Calcule o grau de dissociao inicial do cido actico
0,2 M. (Dica: considerando que a [H
+
] igual
concentrao de ons acetato, podemos reescrever a
reao de dissociao da seguinte forma: 0,2 y = y
y. Sendo assim a expresso de equilbrio pode ser:
K
a
= y
2
0,2 - y
o que gera uma equao do segundo grau que
pode ser resolvida!).
6) Quais sero as concentraes de cido actico e
acetato de sdio necessrias para fazer um tampo de pH
5,1 com a soma cido actico + acetato = 0,2 M?
7) Num laboratrio hospitalar uma amostra de 10 mL de
suco gstrico, obtida vrias horas aps uma refeio, foi
titulada com NaOH 0,1N at neutralidade; foram
necessrios 7,3 mL. Como o estmago no continha nem
alimento nem bebida, pode-se assumir que no havia
tampes presentes. Qual o pH do suco gstrico?
6
PRTICA No 2 - FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTRO FOTOMETRIA DE ABSORO
1. Princpios gerais
O termo espectro foi utilizado inicialmente
por Newton, quando este descobriu que a luz branca,
ao atravessar um prisma, dividida em vrias cores.
Atualmente, sabe-se que o espectro visvel
apenasuma pequena parte do espectro
eletromagntico. A luz , portanto, definida como
uma forma de energia eletromagntica, formada por
ondas que apresentam comprimentos diferentes. O
comprimento de onda () medido em nm onde 1,0
nm equivale a 10
-9
m. A tabela abaixo mostra as
regies do espectro em relao ao comprimento de
onda:
REGIO: () EM nm:
Raios X 0,1-100
Ultravioleta 100-400
Visvel 400-800
Infravermelho 800-5000
Microonda 5000-30000
A cor dos objetos devida a duas causas:
reflexo e absoro. Assim, um papel transparente,
vermelho, recebe todos os da luz branca, mas
reflete e transmite somente o vermelho, sendo o
restante absorvido. Quando um objeto da cor
branca, todosos so refletidos, se negro,
porque, praticamente, todos os so absorvidos.
No entanto, existe uma cor (ou ) que mais
absorvida, a qual corresponde chamada cor
complementar. Se uma soluo absorve na faixa de
435-480 nm, que corresponde radiao azu l, a
sua cor (cor complementar) ser o amarelo; a
sensao visual do amarelo ser dada pelo conjunto
de todosos outros componentes da luz branca, que
no foram absorvidos. A tabela abaixo mostra as
cores de cada intervalo de radiao da faixa do
visvel e as suas respectivas cores complementares:
A capacidade que as diversas substncias
qumicas tm de absorverem luz em determinados
INTERVALO COR
(nm) ABSORVIDA
380-435 violeta
435-480 azul
480-490 azul esverdeada
490-500 verde azulada
500-560 verde
560-580 Verde- amarelada
580-595 amarelada
595-650 alaranjada
650-780 vermelha
comprimentos de onda
pode ser utilizada para a
sua determinao
quantitativa e
qualitativa, uma vez qu
e o espectro de absoro
caracterstico para
uma determinada
substncia e a
quantidade de absoro
(intensidade)
dependente da
concentrao do
composto.
A intensidade da
radiao transmitida por
uma soluo pode ser
determinada em aparelho
(fotmetro ), que dever
ser constitudo de: uma
fonte luminosa,um
seletor de (filtro ou
prisma), um
compartimento para a
amostra, uma clula
fotoeltrica (ou fototubo)
e um sistema para
amplificao e medida do
sinal (corren te eltrica)
proveniente da clula
fotoeltrica (medidor de
potencial eltrico =
potencimetro). Pode-se
selecionar o comprimento
de onda que incidir
sobre a soluo usando-
se um monocromador
(prisma ou retculo de
difrao) ou um filtro
ptico (vidro colorido ou
qu artzo, que transmite
uma determinada faixa de
na regio do
ultravioleta, UV). Se o
aparelho dispe de filtro
ptico, denominado
fotmetro ou
fotocolormetro e se
dispe de prisma ou
retculo denominado de
espectrofotmetro. Este
ltimo muito til, pois
pode selecionar faixas de
comprimentos de onda
extremamente estreitas,
nas regies do UV,
visvel e infravermelho
(IV).
7
A fotometria de absoro, portanto, presta-se
tanto para a medida da concentrao de compostos
naturalmente corados, como daqueles incolores, mas
passveis de adquirirem cor mediante o emprego de certos
reativos, bem como de compostos incolores que absorvem
UV ou IV. Esta metodologia, por conseguinte, tem largo
emprego na qumica analtica quantitativa. Alguns poucos
exemplos: na determinao de atividad e enzimtica ou nas
dosagens de compostos orgnicos em fluidos biolgicos,
como glicose, uria, protenas, etc., em que se dosa um
produto colorido, obtido por meio de uma reao qumica,
ou um produto incolor que absor va na regio do UV ou do
IV. Ensaios imunolgicos quantitativos (como o ELISA:
Enzyme-Linke
ImmunoadSorbent Assay) tambm usam a fotometria.
1.1. Leis da fotometria
O princpio bsico da fotometria baseado no
fato de que: partculas dispersas ou dissolvidas em uma
soluo interferem seletivamente com um raio de luz que
passa atravs desta soluo. Esta interferncia depende
dos seguintes fatores:
1) cor do composto ou do tipo de ligao qumica
presente;
2) tamanho da partcula;
3)transparncia da soluo;
4) combinao dos fatores acima.
Deste modo, as partculas podem absorver e
transmitir parte do espectro, dependendo da sua
concentrao, da sua natureza qumica e/ou da sua c or.
Se pudermos medir o total de luz que incide (I
o
) sobre a
soluo de uma determinada substncia e o total da luz
transmitida (I
t
), podemos avaliar o quanto a substncia
absorveu (absorvncia: A) O esquema abaixo mostra
como funciona um fotmetro ou um espectrofotmetro:
A seguinte formulao pode ser feita:
Transmisso = I
t
/ I
o
(luz transmitida / luz incidente).
Observe que o termo transmisso tem aplicao
limitada, uma vez que, a I
t
I
0
menos a luz que
absorvida no s pela substncia que se deseja medi r,
mas tambm pelo solvente, pelo material da cubeta epor
outras substncias a existentes. Assim, I
t
a luz
transmitida aps as absores pela substncia de
interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito,
admite-se It =1 (100% de Transmitncia) a luz
transmitida aps I
0
atravessar a cubeta contendo uma
soluo denominada branco. Este branco contm todos
os componentes do meio, exceto a substncia a ser
medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o
fototubo (fotoclula), aTransmitncia = 0, ou seja, no
h luz transmitida a ser medida.
Na prtica, a transmitncia (T), que medida
em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco na
passagem da luz), pouco utilizada, pois substituda
pelo valor de densidade ptica ( D.O.) ou absorvncia (
A), termo mais aceito atualmente, que corresponde ao
logaritmo do inverso da transmitnci a:
A = log 1/T
A absorvncia , desta forma, medida em uma
escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0). A relao da A
com a concentrao da substncia pode ser
compreendida pelas Leis de Lambert-Beer: a
absorvncia de uma soluo proporcional
concentrao da substncia na soluo e distncia
percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a soluo
(caminho ptico):
onde: = coeficiente
extino molar, que constante para cada substncia, e
definido como a absovncia (A) de uma soluo l molar
da substncia em um determinado comprimento de onda
(), numa cubeta de caminho ptico l = l cm (largura da
cubeta) e c = concentrao da soluo.
Observe, portanto, que a absorvncia uma
funo linear da concentrao. Assim, para uma mesm a
substncia, considerando-se o caminho ptico consta
nte, a A diretamente proporcional concentrao desta
8
A = . l.c,
substncia. No entanto, as Leis de LambertBeer nem
sem pre so obedecidas. Algumas desobedincias so
conhecidas e atribudas a fatores como: mudana na
natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos baixos
das concentraes das solues, etc. Tambm as
presenas de cidos, bases e sais na soluo podem
contribuir para essas desobedincias, por estarem mais
completamente dissociados, medida que aumenta a
diluio, visto que absoro da luz pelos ons di ferente
daquela apresentada pelas molculas no ionizadas. Para
se evitar discrepncias das Leis de Lambert-Beer, d eve-
se trabalhar com solues mais diludas e construir ,
previamente, uma curva padro, em que so usadas
concentraes conhecidas (e crescentes) da substnc ia
em anlise, e verificar as absorvncias no comprimento
de onda indicado e na cubeta de caminho ptico
adequado. Desta forma, teremos os limites de
concentrao nos quais a soluo obedece s Leis de
Lambert-Beer, ou seja, onde h linearidade. Com o
emprego da curva padro, podemos, tambm, determinar
a concentrao de uma soluo problema. O
comprimento de onda () usado para a obteno da curva
padro obtido pela preparao do espectro d e absoro
da substncia em estudo e , normalmente, o onde a
absorvncia para a substncia apresenta o va lor mximo.
2. Objetivos
1 Determinar o espectro de absoro de uma soluo
de Azul de Bromofenol em pH neutro e em pH
cido;
2 Caracterizar o comprimento de onda () onde ocorre
absoro mxima;
3 Construir uma curva padro do Azul de Bromofenol.
3. Reagentes
1 Soluo de Azul de Bromofenol 1 mg /100 mL em
meio levemente cido (amarelo) e Soluo de Azul
de Bromofenol 1 mg /100 mL (azul/violeta).
4. Procedimentos
4.1. Procedimentos gerais de ajuste do fotmetro
1 Ligar o aparelho;
2 Selecionar o comprimento de onda adequado.
3 Ajustar o zero de transmitncia;
4 Introduzir a cubeta com o branco (gua destilada) e
ajustar a 100% de transmitncia, no boto
correspondente;
5 Repetir os ajustes acima.
6 Obteno do espectro de absoro:
7 Ajustar o comprimento de onda inicialmente em 400
nm;
8 Ajustar o 100% de transmitncia com o branco. Isto
coincide com o 0 de absovncia;
9 Colocar a cubeta com a soluo de Azul de
Bromofenol em meio cido concentrao de 1
mg/100 mL;
10 Ler a absorvncia e registr-la;
11 Ajustar o a 430 nm, repetir o ajuste do
branco, recolocar a soluo de Azul de Bromofenol e
ler, novamente, a absorvncia correspondente a este
;
12 Repetir estas operaes para os seguintes
valores d e : 450, 470 e 490;
13 O mesmo ser feito para o Azul de Bromofenol
em pH neutro. Sendo os comprimentos de onda
analisados, respectivamente: 500, 530, 550, 570 e
590.
14 Fazer o grfico dos espectros de absoro do
Azul de Bromofenol em papel milimetrado,
relacionando absorvncia (ordenada) contra
(abcissa);
15 Determinar o de absorvancia mxima.
9
Azul de Bromofenol Azul de Bromofenol
(pH<3) (pH>4,6)
A A
410
430
450
470
490
510
530
550
570
590
Dados:
1) Espectofotmetro: TUNER, modelo 330
2) Soluo: Azul de bromofenol em meio cido
(1mg/100ml) e Azul de bromofenol em pH neutro
(1mg/100ml).
3) : comprimento de onda.
4) A: absorvncia.
4.2. Curva padro Obteno
1) Fazer diluio seriada:
1 Utilizar 6 tubos de ensaio e enumer-los.
2 Adicionar 4ml de H
2
O em cada tubo.
3 Colocar 4ml de Azul de Bromofenol no tubo 1e
agitar.
4 Retirar 4ml da soluo do tubo 1 e adicionar no
tubo 2. Repetir em todos os tubos.
5 No tubo 6 retirar 4ml e descartar.
6 Cada tubo estar, desta forma, diludo em 2x com
relao ao anterior.
2) Preparar solues de Azul de bromofenol nas
concentraes citadas na tabela abaixo:
Concentrao de
Absorvnci
a
Absorvnci
a
Azul de
(pH<3) (pH>4,6) Bromofenol
(mg/100ml)
0,50 (
1
/
2
)
0,25 (
1
/
4
)
0,125 (
1
/
8
)
0,0625 (
1
/
16
)
0,03125 (
1
/
32
)
0,015625 (
1
/
64
)
1 Ler as absorvncias das diferentes solues de Azul
de Bromofenol (no ideal) e registr-las;
2 Construir, em papel milimetrado, a curva padro
(absorvncias na ordenada e concentraes na
abscissa), considerando os pontos zero de absoro e
de concentrao.
5. Questes para discusso
5.1- Explique porque o Azul de Bromofenol apresenta
coloraes diferentes com a mudana no pH da soluo .
5.2- Voc dispe dos filtros azul, verde, vermelho e amarelo
de um fotmetro. Qual deles voc usar, paraque
uma soluo de cor vermelha tenha uma absoro
(con
tra
o
branco) o mais prximo de zero possvel?
5.3- Avalie, nas condies experimentais acima, se o
Az
ul
de Bromofenol segue, estritamente, as Leis de Lambert-
Beer, admitindo que nada interferiu em seu procedimento.
5.4- Explique por que no se deve usar cubetas de v idro
para leituras na regio do ultravioleta.
6. Questes complementares
6.1 Voc pesou l, 2 e 3 mg de Azul de Bromofenol e
dissolveu cada uma quantidade em 50 mL. As absovnci as
destas solues, em 430nm, foram, respectivamente, 0,2,
0,4 e 0,6. A abosvncia de uma soluo desconhecida do sal
foi 0,3. Calcule a sua concentrao, em mg/100m L.
6.2 Para a dosagem da glicose do sangue de um pac
iente, a amostra foi diluda em 10 vezes (no processo de
desproteinizao). 1mL do desproteinizado e 2mL de cada
10
um dos padres de glicose (P) de 10, 20 e 30mg/100m L
foram processados para a dosagem da glicose, sendo o
volume final, em todos os tubos, ajustados para 5mL. Aps
as leituras espectrofotomtricas em comprimento de onda
adequado, as absorvncias obtidas foram:
Amostra...................... ...
0,1
80
P-10 mg/100mL.............
0,1
50
P-20 mg/100mL..............
0,2
98
P-30 mg/100mL..............
0,4
00.
Qual a concentrao da glicose no sangue do pacient e?
6.3 - O coeficiente de extino molar ( ) de uma
substncia de peso molecular 200 14,5. Uma soluo
desta substncia apresentou , numa cubeta de caminho pti
co de 2 cm, a absorvncia de 0,800. Qual a concentrao
( em mg/L) da substncia nesta soluo?
1 Papel milimetrado:
11
PRTICA N
o
3 - ESTUDO FSICO-QUMICO DAS PROTENAS
1. Introduo
As protenas,
excluindo a gua, so os
compostos qumicos mais
abundantes nos
organismos, com extrema
versatilidade de
conformaes e funes .
O estudo de aspectos
importantes da
bioqumica nos leva,
invariavelmente, ao
estudo de protenas.
Portanto, torna-se
importante a existncia
de mtodos adequados de
purificao e
quantificao destes
compostos. A purificao
e caracterizao de uma
protena baseia m-se em
suas caractersticas fsico-
qumicas. Por serem
formadas por
aminocidos e
considerando-se que os
aminocidos aromticos
absorvem luz na regio
ultravioleta, as protenas,
em geral, podem ser
detectadas atravs da
absoro de luz a 280 nm.
No entanto, a deteco de
protenas em materiais
biol gicos envolve
reaes especficas com
determinados reativ os, os
quais originam
substncias coloridas que
absorve m luz na regio
visvel, permitindo
a sua quantifica
o. Dentre os
mtodos utilizados,
situa-se o mtodo
do biureto, que
baseado na reao
do sulfato de cobre
em meio alcalino
(reativo do biureto)
com protenas e
peptdeos (no
mnimo
tripeptdeos). O
nome do mtodo
o
provm do fato de
que a uria
aquecida a 180C
dar reao
positiva com
desprendimento de
amnia:
0
C
NH
2
N
H
H
H
N
0 C
N
H
H
2
BIURETO
URIA
Quando
a substncia
contm duas ou
mais ligaes
peptdicas,
produz uma cor
azul-violeta co m
o reativo de
biureto. Esta cor
desenvolvida
devida a um
complexo entre o
on cprico e
duas cadeias
peptdicas
adjacentes:
0 C
NH
R C H
O C
NH
R CH
Dependendo dos
aminocidos que fazem
parte das protenas
(estrutura primria),
podem-se ter diferenas
fisico-qumicas
individuais entre prote
nas numa mistura, as
quais podem ser
utilizadas para a
separao e purificao
destes compostos. Por
exem plo, mtodos
cromatogrficos podem
ser baseados em
diferenas no peso
molecular e/ou carga
eltrica.
As protenas
so macromolculas
coloidais, possuem uma
camada de
solvatao ou
hidratao. Ao
seu redor
interagem
molculas de
gua, que
permitema sua
solubilidade.
Diversas
substncias, entre
elas os sais
inorgnicos ((NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4
e
outros) podem
alterar a camada
de solvatao de
protenas, aument
ando (salting-
in) ou
diminuindo
(salting-out) a
solubilidade.
As
protenas possuem
estruturas
espaciais bem
definidas que,
segundo o nvel de
complexidade,
podem ser
caracterizadas
como estruturas
secundria,
terciria e
quaternria. A
funo biolgica
est associada
estrutura espacial,
que, por sua vez,
depende da
estrutura primria
(a simples
disposio dos
aminocidos na
cadeia
polipeptdica).
Certos agentes
podem alterar a
conformao
espacial original
das protenas, sem
que ocorra
alterao da
estrutura primria,
modificando, desta
forma, algumas de
suas propriedades
biolgicas. Este
efeito, chamado de
desnaturao,
pode ser
produzido pelo
aumento da
12
temperatura do meio, alterao do pH ou pela adio de
solventes orgnicos. A alterao da estrutura prim ria
das protenas (quebra das ligaes peptdicas) ocor re
por tratamento quente (100
o
C) em presena de cido
ou base forte ou atravs de adio de enzimas
proteolticas. Determinados agentes podem ser usados na
precipitao de protenas, o que til na
desproteinizao de materiais biolgicos, como o
sangue: nions de cidos complexos (tricloroactico,
tnico, fosfotngstico) formam sais insolveis onde a
protena funciona como ction; metais pesados (cobre,
zinco, prata, mercrio) em meio alcalino formam
precipitados onde a protena atua como nion.
Os aminocidos componentes de uma protena
podem ser genericamente caracterizados se, aps sua
hidrlise, efetuarmos a reao da ninhidrina. A ninhidrina
(hidrato de tricetoidrindeno) reage com aminocidos
produzindo cor prpura. uma reao inespecfica quanto
identidade do aminocido, sendo a reao dependente da
presena de grupos amina livre s. O aminocido prolina,
na verdade um iminocido, ao reagir com a ninhidrina
produz colorao amarela.
2. Objetivos
1 Realizar reao especfica para deteco de
protenas (reao do Biureto);
2 Realizar reao especfica de deteco de
aminocidos (reao com a ninhidrina);
3 Verificar a alterao de solubilidade de protenas em
presena de solues salinas e solventes orgnicos;
4 Verificar a ao de agentes desnaturantes;
5 Observar a separao cromatogrfica (cromatografia
de excluso molecular) de substncias de pesos
moleculares diferentes.
3. Reagentes
1 Reagente do Biureto: CuSO
4
em soluo alcalina.
2 Soluo diluda de protenas.
1 Soluo concentrada de protenas.
2 Soluo de ninhidrina 0,1g% (P/V).
3 Soluo de aminocidos.
4 cido tricloroactico (TCA ) 10% (P/V).
Soluo saturada de sulfato de amnio (NH
4
)
2
SO
4
.
1 Soluo tampo de fosfato de sdio 0,2 M, pH 7,0.
2 Etanol gelado.
3 Resina Sephadex G-25 (faixa de separao PM
1000-5000 D).
4 Soluo contendo compostos de diferentes pesos
moleculares (azul de dextran: 2.000.000 D, vitamina
B
12
: 1355 D em tampo pH 7,0, contendo sacarose).
4. Procedimentos
Enumerar 12 tubos de ensaio
4.1. Reao do Biureto:
1 Tubo 1 (tubo branco): colocar: 1 mL do reativo do
Biureto + 0,5 mL de gua destilada;
2 Tubo 2 : colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5
mL da soluo diluda de protenas;
3 Tubo 3 : colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5
mL da soluo de aminocidos;
4 Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.
4.2. Reao da ninhidrina:

o
Aquecer gua
100C
1 Tubo 4 (tubo branco): colocar 2 mL da soluo de
ninhidrina + 0,5 mL de gua destilada;
2 Tubo 5: colocar 2 mL da soluo de ninhidrina +
0,5 mL da soluo diluda de protenas;
3 Tubo 6: colocar 2 mL da soluo de ninhidrina +
0,5 mL da soluo de aminocidos;
4 Ferver os tubos de ensaio 4, 5 e 6 por 5 minutos;
5 Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.
4.4. Precipitao cida:
13
1 Tubo 7 (tubo de centrfuga) : colocar 1 mL de TCA
10% (P/V). + 1 mL da soluo diluda de protenas;
2 Agitar e observar;
3 Centrifugar (por 10 minutos), separando as fraes
sobrenadante e precipitado;
4 Colocar 0,5ml do sobrenadante no Tubo 8;
5 Adicionar 1mL do reativo do biureto ao Tubo 8;
6 Adicionar tampo ao precipitado do Tubo 7. Agitar;
7 Comparar os resultados.
4.5. Efeito da adio de sais:
1 Tubo 9 : Colocar 2 mL da soluo diluda de
protenas + 2 mL da soluo saturada de sulfato de
amnio. Agitar. Centrifugar 3000rpm por 10
minutos, separar as fraes sobrenadante e
precipitado;
2 Colocar o sobrenadante no tubo 10. Adicionar igual
volume de TCA 10% (P/V)., agitar e centrifugar
novamente. Se aparecer algum precipitado, tentar
dissolv-lo com 1 mL de tampo;
3 Adicionar 1 mL de tampo ao precipitado do tubo
10 e agitar. Verificar o que acontece.
4.6. Efeito da adio de solventes orgnicos:
1 Tubo 11: colocar 1mL da soluo de protenas + 2mL
de etanol gelado (lentamente at o aparecimento de
uma ligeira turvao).
4.7. Cromatografia em peneira molecular:
Montagem da coluna: numa coluna de vidro (aprox. 30
x 1,5 cm), colocar o gel suspenso em tampo pH 7,0,
deixando a extremidade inferior da coluna aberta, at
que o gel se acame. Cuidado para no deixar secar o gel,
adicionando sempre tampo, at que o gel esteja
equilibrado e acamado.
Aplicao da amostra: aplicar 1mL da amostra sobre a
superfcie da coluna, que dever estar com cerca de2 cm
de tampo sobre o gel. Como a amostra est mais
densa, devido presena da sacarose, esta se depos itar
sobre o gel.
Continuar adicionando o tampo e acompanhar o
fracionamento dos componentes da amostra, anotando
os resultados.
5. Questes para discusso:
5.1- Explique o que ocorreu em cada etapa executada.
5.2- Pelos resultados obtidos no item 4.5, podemos
afirmar que a soluo de sulfato de amnio saturado
precipita todas as protenas? Por qu? Como podemos
saber se esta precipitao reversvel ou no?
5.3.- Pelos resultados obtidos no item 4.6, podemos
afirmar que o etanol gelado precipita todas as protenas?
Por qu? Como poderamos comprovar isto? O
precipitado obtido (aps centrifugao) seria redissolvido
em tampo? Por qu?
5.4 - Qual foi a ordem de eluio das amostras na c
oluna (item 4.7)? Por qu?
6 - Exerccios complementares:
6.1- Voc dispe num laboratrio de dois frascos
idnticos, porm, no rotulados. Um deles contm soluo
de aminocidos e, o outro, contm uma soluo de
protenas. Qual seria o seu procedimento para identificar
as duas solues e rotular os frascos?
6.2- Descrever um mtodo que permita separar a
protena n
o
6 de uma mistura que contenha seis
protenas, sabendo-se que: a) as protenas de n
o
1, 3 e 5
precipitam pelo sulfato de amnio a 40% de satura o;
b) as protenas de n
o
1, 2, 4 e 6 precipitam pelo etanol
gelado; c) as protenas de n
o
1, 3, 5 e 6 precipitam pelo
sulfato de amnio a 75% de saturao; d) os pontos
isoeltricos das protenas 1 e 3 so iguais a 6,5 ; o da
protena 2 7,2; o das protenas 4 e 6 se igualam a 6,3 e
o da protena 5 6,8.
14
6.3- Num extrato biolgico existem hormnios proti cos
e isoenzimas, que devem ser isolados da maneira mais
pura possvel para uso posterior. Voc dispe de sulfato
de amnio, TCA, etanol, resinas cromatogrficas,
equipamentos cromatogrficos e de eletroforese. Que
mtodos voc poderia utilizar? Explique o seu princpio e
como execut-lo. Que mtodos no poderiam ser
utilizados?
6.4- Uma soluo a 1% de hormnio anti-diurtico
(nonapeptdio) foi submetida aos tratamentos abaixo
com os seguintes resultados: a) reao fortemente
positiva para o biureto e fracamente positiva para
ninhidrina; b) a adio de cido forte gelado e posterior
neutralizao do pH, no alteraram os resultados do
item anterior; c) Com a adio de cido forte que nte
(100
o
C por 2 h) e posterior resfriamento e neutralizao
do pH , a reao da ninhidrina foi positiva ( fortemente
positiva). Interprete e explique estes resultados.
15
PRTICA N
o
4 - CINTICA ENZIMTICA
1.
Introduo
Enzimas
so
catalisadore
s
biolgicos:
aceleram a
velocidade
das reaes
qumicas,
diminuindo
a energ ia
de ativao.
Possuem,
em geral,
estrutura
protica,
sendo que
foram
descritas
algumas
molculas
de RNA
com
atividade
cataltica.
As enzimas
no alteram
a constante
de
equilbrio
nem a
variao de
energia l
ivre das
reaes,
sendo
regeneradas
, sob a
forma origina
l, ao final da
catlise. As
molculas
reagentes so
denominadas
substratos (S)
e produtos
(P) so forma
dos ao final.
As enzimas
so,
geralmente,
bastante
especficas
com relao
aos
substratos,
formando um
complexo
com estes
durante a
catlise:
E +
S

ES

E +
P
Algu
mas teorias
procuram
explicar
esta
especificida
de: 1- teoria
de Fischer
(chave-
fechad ura)
, onde
enzima e
substrato
seriam
complement
ares; 2-
teoria de
Koshland do
encaixe
induzido, ou
seja, o
substrato
durante a
catlise se
encaixa na
enzima; 3-
teoria que
prope o
perfeito
encaixe no
estado de
transio,
estado onde
a barreira
energtica
(energia de
ativao) foi
vencida.
Diversos
so os fatores
que
influenciam a
velocidade de
uma reao
enzimtica.
Por terem
estrutura
protica,
alteraes no
pH, na
temperatur a,
na fora
inica do
meio
reacional
podem
modific-las
(s vezes,
at a
estrutura
dos
substratos
alterada),
modificand
o, assim, a
velocidade
das reaes.
Como
esperado, a
concentra
o de
substrato e
de enzima n
o
meio
reacional
so
determina
ntes para a
velocidade
reacional.
A
velocid
ade de
uma
reao
catalisa
da pode
ser
determinad
a, em
instantes
iniciais,
atravs da
determina
o do
produto
formado
por unidade
de temp o
(caso mais
comum) ou
atravs da
mensurao
do
substrato
consumido
por unidade
de tempo.
O produto
formado
pode ser
medido
diretamente
atravs de
alguma
propriedade
fsico-
qumica
caracterstic
a, ou ento
fazer uma
reao
qumica
com este
produto
produzindo
um outro
que possua
propriedade
s
apropriadas
para
medida.
Uma
propriedade
freqentem
ente usada
para tal fim
a
capacidade
do produto
a ser
quantificad
o de
absorver
determinad
os
compriment
os de onda
de
radiaes
luminosas
(o que no
deve, em
princpio,
acontecer
com
qualquer
outra
substncia
encontrad
a no meio
reacional),
aplicando-
se os
princpios
da
fotometria
.
Os
ensaios
de
atividade
enzimtica
desenvolv
idos na
aula
prtica
sero
realizados
com a
enzima
FOSFAT
ASE,
presente
no extrato
aquoso da
batata
inglesa.
No
ensaio, a
enzima
catalisar a
reao de
desfosforil
ao do
para-
nitrofenil
fosfato,
resu ltando
na
formao
de um
composto
de cor
amarelada
em meio
alcalino,
o
para-
nitrofenol.
Portant
o, a atividade
enzimtic
a ser detectada pelo aparecimento da
colorao amarela
n
o
mei
o reacional.
2.
Objeti
vos
valiar
o
efeito
de
alguns
fatores
que
interfe
rem
na
ativida
de
enzim
tica,
tais
como,
o
tempo de reao, a
concentrao de
substrato e a
concentrao de
enzim a.
16
3. Reagentes
1 Uma batata inglesa mdia (cerca de 110g).
2 Substrato: para-nitrofenilfosfato de sdio 1mM
(soluo fresca).
3 NaOH 0,02N.
4 Liquidificador.
4. Preparo de frao com atividade de fosfatase
alcalina
1 Descascar a batata;
2 Homogeneizar a batata descascada em 200mL de
gua, usando um liquidificador;
3 Filtrar o homogeneizado em algodo.
1 IMPORTANTE: O homogeneizado deve ser usado
no prazo mximo de 30 minutos.
5. Procedimentos
2 Enumerar os tubos de ensaio que seu grupo vai usar;
3 Colocar sempre os reagentes na mesma ordem em
todos os tubos;
4 O HOMOGENEIZADO DEVER SER
ADICIONADA SEMPRE POR LTIMO .
5 Aps adicionar o homogeneizado, agite a mistura
suavemente;
6 A incubao ser realizada temperatura ambiente.
5.1.
INFLU
NCIA
DO
TEMPO
DE
REA
O
TUB
O
SUBSTRATO
1
2
3
4
5
6
*Adicion
ar 2mL
de
NaOH
0,02N
antes da
adio
do hom
ogeneiza
do
(SOME
NTE NO
TUBO
1)
1 Obs
erve
a
cor
dese
nvol
vida
em
todo
s os
tubo
s.
2 Ano
te os
resul
tado
s.
5.2. INFLUNCIA DA
CONCENTRAO DA
ENZIMA
TUBO SUBSTRATO (mL)
7 3,0
8 3,0
9 3,0
10 3,0
1 Aps 5 minutos de
reao, adicione 2mL
de NaOH 0,02N em
cada tubo .
2 Observe a cor
desenvolvida nos
tubos (7-10). Anote os
resultados.
17
5.3. INFLUNCIA DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO.
(curv a [S] x velocidade da reao)
TUBO
SUBSTRATO SUBSTRATO GUA
HOMOGENEIZADO (mL)
M (mL) (mL)
11 0,0 0,0
5,
0 0,5
12 54,5 0,3
4,
7 0,5
13 163,0 0,9
4,
1 0,5
14 272,0 1,5
3,
5 0,5
15 545,0 3,0
2,
0 0,5
16 909,0 5,0
0,
0 0,5
1 Aps 10 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo .
2 Observe a cor desenvolvida nos tubos (11-16). Anote os resultados.
6. Questes para discusso:
6.1- Por que a enzima (homogeneizado) s deve
ser adicionada por ltimo?
6.2- Como so fixadas as condies de dosagem de
um a determinada enzima em condies timas?
6.3- Explique os resultados de cada item.
7. Exerccios complementares
7.1- A variao da velocidade de reao de uma
enzi ma em funo de sua concentrao foi
analisada em 5 tu bos conforme o indicado na
tabela abaixo. Cada tubo recebeu 0,8 mL de uma
soluo de substrato 0,01mM. A enzima usada (E)
estava contida num homogeneizado heptico a 10g
% e na tabela abaixo esto indicados os volumes
deste homogeneizado adicionado a cada tubo. O
volume final em cada tubo foi o mesmo, ajustado
com tampo apropriado. Ao final de 30 minutos de
reao a quantidade de produto formado foi igual
em todos os tubos, exceto no tubo 5 que foi mantido
a 0
o
C durante toda a experincia. Com estas
informaes, discuta:
1) o fato de ter sido obtida a mesma quantidade de
produto nos quatro primeiros tubos;
2) sem alterar o tempo de reao, como seria possv
el aumentar a quantidade
de produto formado
nesses quatro tubos?
3)o que teria acontecido
no tubo 5?
TUBO ENZIMA
(mL)
1 0,2
2 0,4
3 0,6
4 0,8
5 0,8
7.2 - Ao estudar-se in
vitro a cintica da
reao onde a formao
do produto P (fumarato),
a partir do subst rato S
(succinato) catalisada
pela enzima E (succinato
desidrogenase)
verificou-se que:
I) no sendo possvel
obter-se a enzima pura,
usou- se, sempre, um
mesmo volume do
mesmo extrato celular;
II) a quantidade de
substrato inicial estava
em ligeiro excesso; III) o
pH tinha sido
previamente estudado e
escolheu-se aquele que
proporcionava o mximo
de atividade enzimtica; IV) a formao de produto
cresceu entre o instante zero (incio da reao) at
20 min utos da reao; V) a partir do 20
o
minuto de
incubao, a velocidade de reao medida pela
quantidade de produto formado por minuto,
diminuiu.
VI) todas as
observaes acima
foram obtidas em
temperatura tima de
reao.
Pede-se:
discutir os fatores,
dentre aqueles
analisados, que
poderiam acarretar a
diminuio da
velocidade a partir do
20
o
minuto de
incubao.
1
8
PRTICA N
o
5 URINLISE
1.
Intro
du
o
O
s rins
dese
mpen
ham
suas
fun
es
mais
impor
tantes
ao
filtrar
em o
plasm
a
sang
neo e
remo
vere
m as
subst
ncia
s do
filtrad
o em
quant
idade
s
vari
veis,
depen
dendo
das
neces
sidad
es do
corpo.
Alm
disso,
eles
depura
m as
substnci
as
indesej
veis d o
filtrado
(e,
portanto,
do
sangue),
ao
excret-
las na
urina,
enquanto
devolve
m ao
sangue
as
substnci
as
indispen
sveis ao
metaboli
smo. A
intensida
de de
excreo
de
diferente
s
substnci
as na
urina
represe
nta a
soma de
trs
processo
s renais:
filtrao
glomerul
ar,
reabsor
o de
substnci
as dos
tbulos
renais
para o
sangue e
secreo
de
substnci
as do
sangue
para os
tbulos
renais.
A
urina
normal
essencia
lmente
compost
a de
gua,
tem
colora
o
varivel
entre o
incolor e
o
amarelo
(depe
ndent
e da
dieta,
ativi
dade
s
fsica
s e
princ
ipal
ment
e da
inges
to
de
gua)
, e
carre
ia
subst
ncia
s de
excre
o,
result
antes
do
meta
bolis
mo
do
orga
nism
o.
Todo
sang
ue,
ao
passa
r
pelos
rins,
filtrado
ou
depurad
o,
eliminan
do seus
catablit
os, que
so
veiculad
os pela
gua.
Entretan
to,
podem
aparecer
na urina
element
os
anormai
s, como:
albumin
a,
glicose e
altas
quantida
des de
corpos
cetnico
s, sais e
pigment
os
biliares
(urobilin
ognio e
urobilin
a). A
anlise
da urina
rnecefo
valiosas
informa
es no
diagnst
ico de
doenas
rena is,
das vias
urinrias
, do
trato
genital e
at de
doenas
sistmic
as.
Es
ta prtica
refere-se
a dois
dos
exames
de rotina
de urina,
atravs
dos quais

possvel
observar
o
metaboli
smo
anormal
envolven
do
algumas
substnci
as como
a glicose
e os
corpos
cetnicos
.
E
m
condi
es
norm
ais,
no
apare
ce
glicos
e na
urina
em
quant
idade
detect
vel
pelos
reage
ntes
conve
ncion
ais,
visto
que,
pratic
ament
e,
toda a
glicos
e
filtrada
reabsorvi
da pelos
rins.
Entretant
o,
quando a
carga
filtrada
excede a
capacida
de de
reabsor
o da
glicose, a
sua
excreo
urinria
se d em
nvel
detectve
l. Um
grande
aumento
da
concentr
ao
plasmtic
a de
glicose,
capaz de
elevar a
carga de
filtrao
renal
acima de
320
mg/minu
to,
ocasiona
a
excreo
do
excesso
de
glicose
na urina.
A glicose
plasmtic
a no
indivduo
sadio
quase
nunca
fica
elevada o
suficient
e para
causar a
sua
excreo
pela
urina. A
glicosri
a
(presena
de
glicose
na urina)
pode
estar
relaciona
da a
vrias
causas,
como,
por
exemplo:
fatores
endcrin
os,
hepticos
,
neurolgi
cos e
alime
ntares
. No
diabe
tes
mellit
us
no-
contr
olado,
o
nvel
plasm
tico
de
glicos
e
pode
atingi
r
valore
s
eleva
dos,
com
conse
qe
nte
excre
o
urinr
ia
desta
ose. A
prese
na
de
glicos
e na
urina
pode
ser
evidencia
da
atravs
da
reduo
alcalina
pelo
cobre.
Portanto,
utiliza-se
para a
pesquisa
de
glicose
na urina
o
reagente
de
Benedict,
que
consiste
de uma
soluo
de
sulfato
de cobre
em um
meio
alcalino .
O
s
chamado
s corpos
cetnicos
(acetoace
tato,
cido-
hidroxib
utrico e
acetona),
quando
presentes
em
nveis
elevados
na urina,
indicam
um
quadro
de jejum
severo e
prolonga
do ou
diabetes
mellitus
no
tratado.
Em
condie
s
normais,
o cido
acetoact
ico e o
cido -
hidroxib
utrico
que
entram
na
corrente
sangne
a s o
transport
ados, to
rapidame
nte, para
os
tecidos,
qu e suas
concentr
aes
plasm
ticas,
combi
nadas,
raram
ente
se
eleva
m
acima
de 3
mg/d
L. Os
corpo
s
cetni
cos
so
libera
dos
do
fgad
o e
transp
ortados
at as
clulas.
Todavia,
as
clulas
so
limitadas
, quanto

quantida
de de
corpos
cetnicos
que
podem
oxidar,
devido a
vrias
razes,
dentre as
quais
pode-se
destacar
a
quantida
de de
oxaloacet
ato que
necessri
o para
iniciar a
oxidao
de
Acetil-
CoA no
ciclo do
cido
ctrico.
Os
corpos
cetnicos
no
sangue e
na urina
podem
atingir
nveis
19
extraordinariamente altos, provocando uma condio
conhecida como: cetonemia e cetonria,
respectivamente. A pesquisa de corpos cetnicos na
urina realizada atravs do reagente de Imbert. Este
reativo de uma soluo de nitroprussiato de sdio em
cido actico glacial.
2. Objetivo
Analisar amostras de urina, quanto presena
ou ausncia de glicose e de corpos cetnicos.
3. Reagentes
1 8,5 mL de urina.
2 2,5 mL de Reativo de Benedict ( CuSO
4
; citrato de
sdio e Na
2
CO
3
).
3 1 mL de Reativo de Imbert ( nitroprussiato de sdio
e cido actico glacial).
4 3 mL de NH
4
OH 10% (p/v).
4. Procedimentos
4.1. Pesquisa de Glicose
1 colocar 2,5 ml do Reativo de Benedict em um tubo
de ensaio;
2 depositar 4 gotas de urina lmpida;
3 misturar e levar ao banho-maria at entrar em
ebulio;
4 deixar esfriar espontaneamente (aproximadamente
15 minutos);
5 observar a colorao do lquido.
RESULTADOS
cor inalterada (azul) negativo
verde-azulado ou verde traos
verde (qualquer tom) com positivo +
precipitado amarelo
castanho ou marrom positivo ++
vermelho tijolo positivo +++
4.2. Pesquisa de Corpos Cetnicos
1 colocar 8 ml de urina em um tubo de ensaio;
2 adicionar 12 gotas do Reativo de Imbert e misturar;
3 inclinar o tubo e com o auxlio de uma pipeta, deixar
escorrer pelas paredes do tubo aproximadamente 3
ml de NH
4
OH 10%, lentamente, de tal maneira que
os dois lquidos no se misturem;
4 observar a superfcie de contato entre os dois
lquidos.
RESULTADOS
Nenhuma alterao ocorrida negativo
Presena de um anel violeta positivo
5- Questes para Discusso
5.1- Comente (sucintamente) a participao dos
hormnios: adrenalina, cortisol, glucagon e insulin a no
controle da glicemia, envolvendo as vias metablica s e
os seus mecanismos de ao.
5.2- Por que em condies de jejum severo e
prolongado ou o diabete melito no compensado pode
acarretar uma cetonemia e conseqente cetonria?
5.3- Conceitue e
diferen
cie (metabolicamente):
diabetes
insipidus
e
diabetes
mellitus e
diabetes
renallis .
20
PRTICA N
o
6 - ISOLAMENTO DE DNA DE CLULAS DE CEBOLA
1. Introduo
Nos organismos
eucariontes e procariontes a
informao gentica est
localizada nas molculas ed
cido desoxirribonuclico
(DNA), que so polmerosde
nucleotdeos, nos quais o
acar a desoxirribose . O
DNA est localizado
principalmente no ncleo dos
eucariontes, associado com
protenas (principalmente
histonas) e dentro de
organelas como mitocndrias
e cloroplastos.
Os mtodos
utilizados para a deteco e
dosagem do DNA celular
nuclear de eucariontes (pois
o de cloroplastos e
mitocndrias no em geral,
dete ctado pelas tcnicas
rotineiras) implicam no
rompimento das membranas
citoplasmtica e nuclear.
Neste experimento, o
rompimento das membranas
plasmtica e nuclear ser
realizado com o tratamento
do detergente aninico
duodecil sulfato de sdio
(SDS). Os tratamentos com
detergentes, inicos ou no,
so largamente utiliza dos na
solubilizao de protenas e
lipdeos de membrana.
Nestes processos de
solubilizao por
detergentes, so
formadas micelas,
que consistem de
protenas, lipdios e
detergentes. O
tratamento das
clulas com uma
concentrao
relativamente alta
de SDS resulta no
rompimento das
membranas
celulares com a
conseqente
liberao das
nucleoprotenas. A
ativid ade da
enzima digestiva
(DNAase) ser
inibida pela ao do
EDTA em meio
alcalino que altera
pH e quela os ons
divalentes
necessrios ao
da DNAase. A
adio d e etanol
sobre a fase aquosa,
contendo os cidos
nuclicos
dissolvidos,
resultar na
precipitao destes,
uma vez que o
etanol diminui a
constante dieltrica
da gua,
promovendo uma
menor solubilizao
das molculas de
DNA.
Nas
tcnicas de
biologia molecular,
o DNA deve estar
livre de protenas,
para isto, estas
devem ser
extradas.
Normalmente, esse
procedimento
realizado
utilizando-se uma soluo
de clorofrmio/lcool
isoamlico, que desnatura
as protenas e, aps
centrifugao, estas so
retiradas da soluo de DN
A.
2. Objetivo
Isolar DNA de
clulas de cebola.
3. Material
1 Cebola.
2 S
o
l
u

o

s
a
l
i
n
a
-
E
D
T
A
:

N
a
C
l

0
,
1
5

M

EDTA 0,1
M
(pH=8,0).
3 SDS 2% (P/V).
4 Etanol absoluto
95%.
5 Soluo Tris-
EDTA (TE)*
10 mM
Tris.Cl, 1
mM EDTA
- pH 7,5.
Obs:
*Esta soluo
mantm a fora
inica, dissolvendo
o DNA, alm de
quelar ons
divalentes,
necessrios par a
ao da DNase.
4. Procedimentos
1 Cortar 5 g de
cebola (fatia fina
e bem picotada);
2 Colocar a
cebola picada
em um tubo
Falcon de 15
mL;
3 Adicionar 2.5
mL de soluo
salina EDTA;
4 Adicionar 1.0
mL de SDS 2%;
5 Macerar a
cebola com
ajuda de um
basto de vidro
durante 5
minutos;
6 Filtrar a
soluo com
gaze para
retirar os
fragment os de
cebola;
7 Colocar o
filtrado em um
tubo de vidro;
8 Adicionar,
lentamente, com
pipeta, 4 mL de
lcool etlico
95% de modo
que os dois
lquidos no se
21
misturem. Notar que na interface, forma-se um
material insolvel filamentoso, o DNA;
1 Introduzir um basto at a regio de interface.
Imprimir-lhe um movimento circular e verificar que
o material filamentoso ir aderir ao mesmo;
2 Retirar o basto e dissolver o precipitado a ele
aderido em 2 mL da soluo de Tris-EDTA.
Desproteinizao (No realizada durante a aula
prtica):
1 Aps a dissoluo do DNA, adicione igual volume
(2 mL) da mistura de clorofrmio:lcool isoamlico
24:1 (V/V), e agite vigorosamente por 30 minutos;
2 Centrifugue a emulso resultante a 3000 rpm
durante 10 minutos;
3 A emulso ser separada em 3 camadas;
SOLUO DE
DNA
1 A camada superior (aquosa) contm os dois tipos de
cidos nuclicos (DNA e RNA) que devem coletados
para posterior utilizao.
5. Questes para discusso:
5.1- Qual a funo da soluo de SDS?
5.2- Ao romper a clula e, tambm, suas organelas,pela
tcnica descrita acima, o DNA no seria degradado por
enzimas lisossomais?
22