Aula 2 LL - Técnicas e Princípios de Micros

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

CAMPUS FRANCISCO BELTRÃO
Técnicas e princípios de microscopia
Aula 2
Professor LUCIANO LUCCHETTA

USO DO “MICROSCÓPIO” PARA ANÁLISE DOS
ALIMENTOS
 Microscopia óptica Microscopia Eletrônica

Luminosa Varredura
Campo escuro Transmissão
Ultravioleta
Técnica qualitativa ou
Fluorescência quantitativa.
Contraste de base
Unidades de medidas
utilizadas em microscopia
 Microscopia óptica
1m = 10-3 mm = 10-6 m
 Microscopia eletrônica
1m = 10-3 m = 10-6 mm = 10-9 m
1 A = 10-1m = 10-4 m = 10-7 mm = 10-10m
Microscopia óptica -
Estereoscópio ou microscopia óptica simples
 Fundamento
Baseia-se na utilização de lentes com pequenos

aumentos (2x a 125x).
Simples - única lente ocular (não possui

objetivas, apenas oculares).
 Equipamento
 A microscopia óptica ou luminosa geralmente é de luz

visível refletida ou transmitida (utiliza radiação constituída
de fótons).
 Fonte de iluminação ideal - lâmpada de halogênio de

quartzo.
 Imagem tridimensional.
Fonte: http://www.angelfire.com/crazy3/qfl2308/1_multipart_xF8FF_6_Microscopia_otica.pdf
APLICAÇÃO
 Exame rápido de alimentos desidratados.

 Estudo de defeitos superficiais.
 Análise de estrutura de produtos de padaria e obtidos por
extrusão à quente.
 Determinação de materiais estranhos.
Microscopia óptica – Composto
FUNDAMENTO
 Formado por uma lente objetiva (próxima do objeto de
estudo) que forma e amplia a imagem e por uma lente
ocular, que amplia a imagem.
 Obtém aumento de 1000 vezes, podendo atingir até
2000 vezes, com resolução de 0,2 m.
 Utiliza luz visível refletida ou transmitida (utiliza
radiação constituída de fótons).
EQUIPAMENTO
 Equipamento
 Parte mecânica: revólver, platina, tubo, braço ou

coluna, parafuso micrométrico e macrométrico, base ou
pé.
 Parte óptica: lente ocular, lente do condensador e

comando do diafragma, sistema de iluminação, lente
objetiva.
 Ampliação
 Produto das ampliações individuais das objetivas e da
ocular.
 Exemplo - se a ampliação da objetiva é 100x e a
ampliação da ocular 10x, a ampliação total será 1000x.
 Poder de resolução
 Capacidade do aparelho em fornecer imagens
distintas de dois pontos adjacentes.
Limite de resolução
 Distância mínima entre dois pontos, de modo que as
respectivas imagens fornecidas pelo sistema óptico,
sejam distintas.
 Exemplo - duas partículas separadas por 0,3 m.

aparecem individualizadas quando examinadas em um
sistema óptico com limite resolutivo de 0,2m.
 Abertura numérica
É dada por:
AN= n . sen α, onde
n = Índice de refração
α = semi-ângulo formado da abertura da objetiva
 Limite de resolução
 Depende - comprimento de onda da radiação utilizada

e da abertura numérica.
LR = K. / AN, onde
LR = limite de resolução
K = constante (0,61)
 = comprimento de onda da luz utilizada
AN = abertura numérica (capacidade de concentrar a luz)
Limite de resolução
LR é proporcional ao 
LR é inversamente proporcional a AN
Profundidade de foco – diferença entre máxima

e mínima distância num objeto.
Campo de visão – tamanho da área que é
enxergada pela lente.
EXEMPLO
O microscópio “a” apresenta abertura numérica (AN) de 0,15 e o
microscópio “b” AN de 0,05. Levando-se em consideração que o valor de k é
de 0,61 e que o comprimento de onda () é de 0,55um, qual dos dois
microscópios apresenta maior poder de resolução?

Utilização de óleo de imersão

 Aplicação
 Determinação de contaminação por fungos.
 Determinação de matérias estranhas.

Variações na Microscopia óptica -
Luz polarizada
 Conceitos
 Luz natural: luz a partir de uma fonte ordinária que

vibra em todas as direções, de maneira aleatória.
 Luz polarizada: a onda vibra numa direção linear

devido a passagem da luz por um filtro polarizador.
Luz polarizada
 Fundamento
 Emprega feixe de luz polarizada que, ao atravessar

estruturas cristalinas, é dividido em dois, cujos planos
são perpendiculares. Estas estruturas são chamadas
de anisotrópicas e são birrefringentes.
 Estruturas que não podem modificar o plano de

polarização da luz são denominadas de isotrópicas.
Luz polarizada
Amido de mandioca Amido de mandioca

modificado mostrando modificado sob luz
diâmetros variáveis e polarizada demonstrando
conservação da forma conservação da
(100X) cristalinidade (100X).
(Fonte: Zambrano, Camargo e Tavares, 2001).

Luz polarizada
 Equipamento
 Semelhante ao óptico, porém

contém dois prismas para
reorientar a luz: um no
condensador (polarizador) e o
outro na ocular (analizador).
Luz polarizada
 Aplicação
 Avaliação da qualidade dos produtos.
 Análise de amidos.
 Outras aplicações: avaliação de emulsões.
 Avaliação de minérios.
Microscopia óptico de
Fluorescência
Fundamentos
 A fluorescência é um tipo de luminescência

(emissão de luz) em que um corpo absorve luz
e após um curto intervalo de tempo re-emite
essa luz.
 Esse é o princípio da microscopia de
fluorescência, na qual compostos químicos
chamados fluoróforos, emitem a fluorescência.
Fluorescência
A diferença de energia entre o estado

excitado e o estado de menor energia é emitida
em forma de um fóton. A técnica de microscopia
de fluorescência consiste justamente em captar
este fóton que é emitido e com ele gerar uma
imagem.
Fluorescência
 Fluorescência pode ser:

• primária - substâncias que fluorescem
naturalmente quando irradiadas com excitação
específica
• secundária - induzidas por meio de corantes
como anticorpos (imunofluorescência).
 Vantagens da microscopia de fluorescência

• requer mínima preparação da amostra;
• especificidade química;
• alta sensibilidade e resolução.
Fluorescência
Equipamento
Microscópio de luz incidente (epi-

iluminação), onde o feixe luminoso
tem, no entanto, um comprimento de
onda apropriado (habitualmente na
região azul ou ultravioleta) para
excitar substâncias fluorescentes
(fluoróforos ou fluorocromos) que se
encontram na amostra.
Fluorescência
Aplicação
 Avaliação de fraudes.
 Reconhecimento de estruturas químicas.

Microscopia óptico de Campo
Escuro
Princípio
A luz é dispersada pela superfície dos materiais
que possuem diferentes índices de refração, num fundo
escuro.
Condensador de iluminação oblíqua.
Utilizado para microrganismos não corados.
Microscopia óptico de
Contraste de base
Princípio
Sistema óptico que permite maior contraste de
materiais biológicos.
Utilizado no estudo de células e tecidos vivos.
Microscopia óptico Ultravioleta
Princípio
Utiliza-se a luz ultravioleta (0,2 a 0,3 µm).

Melhora o LR.
Utiliza lentes de quartzo.
A imagem é fotografada.
Microscopia eletrônica
Fundamentos
Princípio – aceleração de elétrons por diferença

do potencial, gerando comprimentos de onda de
até 100.000 vezes menor que a luz visível.
O reduzido λ aumenta o Poder de
Resolução.
Emprega como radiação o feixe de

elétrons, sendo ele refratado por meio de lentes
eletrônicas.
Microscopia eletrônica
Tipos
1. Microscopia Eletrônica de Transmissão –

MET ou TEM
2. Microscopia eletrônica de varredura – MEV

ou SEM
Microscopia Eletrônica de Transmissão –
MET ou TEM
Parte essencial – Coluna vertical a qual é percorrida por

um feixe de elétrons.
Possui um canhão eletrônico que possui um filamento de

tungstênio, onde é aplicado alta voltagem (40 a 100 mil V)
para aceleração dos elétrons.
Obtenção da imagem - Avaliam as modificações que

os elétrons experimentam ao atravessar os cortes, isto é, a
dispersão que sofrem (elétrons transmitidos), nos dão a
imagem final (bidimensional).
MET ou TEM
Fundamentos
Interação dos elétrons e da matéria

MET ou TEM
Capacidade de ampliação:
1500 a 200.000 vezes
MET ou TEM
Microscopia eletrônica de varredura –
MEV ou SEM
Um feixe de elétrons extremamente fino varre o

objeto emitindo elétrons secundários.
Os elétrons secundários e os retroespalhados são
recolhidos por um tubo fotomultiplicador e a imagem é
formada num écran.
A imagem é tridimensional.
•Poder de resolução: 2,0 – 5,0 m
• Capacidade de ampliação 10 – 100.000 vezes.
MEV ou SEM
Fonte: www.images.google.com
MEV ou SEM
Fonte: www.images.google.com
Microscopia Eletrônica
Aplicação
Microscopia eletrônica de transmissão

• Estudo de materiais biológicos.
Microscopia eletrônica de varredura

• Classificação e taxonomia de insetos e fungos.
• Estrutura de plantas e animais.
Análise de imagens
Equipamento
Computador + câmera de vídeo acoplada ao

micrsocópio + programa adequado.
Aplicação
Avaliação da morfologia.
 Número de estruturas presentes.
 Distribuição do tamanho de partículas.
 Área, perímetro, comprimento e largura.
Dernier
Comparativo de Microscópios
Fonte:http://docentes.esa.ipcb.pt/lab.biologia/disciplinas/biologia/microscopia.pdf
Comparativo de
Microscópios -
Aspectos
Importantes
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• BARBIERI,M.K. Microscopia em alimentos. 2.ed. Campinas: Ital, 2001.
• BEUX, M. R. Atlas de microscopia alimentar: identificação de elementos histológicos

vegetais. São Paulo: Varela, 1997.
• FLINT, O. Microscopia de los alimentos: manual de métodos prácticos utilizando la

microscopia óptica. Zaragoza: Acribia, 1996.
• Fontes, E.A.F. Fontes, P.R. Microscopia de alimentos: fundamentos teóricos. Viçosa,

Editora UFV, 2005, 151p.
• MALISKA, A. M. Microscopia eletrônica de varredura. Florianópolis: UFSC, 2008.

Disponível em: http://www.materiais.ufsc.br/lcm/web-MEV/MEV_index.htm Acesso em 01
jul. 2008.
• SÁ, D. Microscopia eletrônica na engenharia. Disponível em:

http://www.eletrica.ufpr.br/piazza/materiais/DiegoSa.pdf Acesso em 05 jan. 2008.
• REIS, C. M. G. Microscopia. Disponível em:

http://docentes.esa.ipcb.pt/lab.biologia/disciplinas/biologia/microscopia.pdf. Acesso em 02
fev. 2008.
• BORJA, F. Introdução à microscopia. Disponível em:

http://www.cstr.ufcg.edu.br/histologia/microscopia.htm. Acesso em 10 fev. 2008.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• JUNQUEIRA, l. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 5 ed. São

Paulo: Guanabara Koogan, 1991.
• FRANCO, C. M. L. et al. Cultura de tuberosas amiláceas latino

americanas. Vol 1 – Propriedades gerais do amido. [S.l.]: Fundação
Cargil, 2002. Disponível em:
http://www.abam.com.br/livroscargil/Capitulo%201/CAP%209.pdf. Acesso
em 20 jan. 2008.
• GALLETI, S. R. Introdução à microscopia de alimentos. Biologico, São

Paulo, v. 65, n. ½, p. 33-35, jan./dez., 2003. Disponível em
http://www.biologico.sp.gov.br/biologico/v65_1_2/galetti.PDF. Acesso em 01
fev. 2008.
• PADILHA, A. F. Microscopia eletrônica de transmissão. Disponível em:

http://www.angelfire.com/crazy3/qfl2308/1_multipart_xF8FF_3_MET_PMI-
2201.pdf Acesso em: 01 fevf. 2008.

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Técnicas e princípios de microscopia

Professor LUCIANO LUCCHETTA

 Microscopia óptica Microscopia Eletrônica

Baseia-se na utilização de lentes com pequenos

Simples - única lente ocular (não possui

 A microscopia óptica ou luminosa geralmente é de luz

 Fonte de iluminação ideal - lâmpada de halogênio de

 Exame rápido de alimentos desidratados.

 Parte mecânica: revólver, platina, tubo, braço ou

 Parte óptica: lente ocular, lente do condensador e

 Exemplo - duas partículas separadas por 0,3 m.

AN= n . sen α, onde

 Depende - comprimento de onda da radiação utilizada

LR = K. / AN, onde

Profundidade de foco – diferença entre máxima

O microscópio “a” apresenta abertura numérica (AN) de 0,15 e o

microscópio “b” AN de 0,05. Levando-se em consideração que o valor de k é

de 0,61 e que o comprimento de onda () é de 0,55um, qual dos dois

microscópios apresenta maior poder de resolução?

Utilização de óleo de imersão

 Determinação de contaminação por fungos.

 Determinação de matérias estranhas.

 Luz natural: luz a partir de uma fonte ordinária que

 Luz polarizada: a onda vibra numa direção linear

 Emprega feixe de luz polarizada que, ao atravessar

 Estruturas que não podem modificar o plano de

Amido de mandioca Amido de mandioca

(Fonte: Zambrano, Camargo e Tavares, 2001).

 Semelhante ao óptico, porém

 Avaliação da qualidade dos produtos.

 Outras aplicações: avaliação de emulsões.

 A fluorescência é um tipo de luminescência

A diferença de energia entre o estado

 Fluorescência pode ser:

 Vantagens da microscopia de fluorescência

Microscópio de luz incidente (epi-

 Reconhecimento de estruturas químicas.

Utiliza-se a luz ultravioleta (0,2 a 0,3 µm).

Princípio – aceleração de elétrons por diferença

Emprega como radiação o feixe de

1. Microscopia Eletrônica de Transmissão –

2. Microscopia eletrônica de varredura – MEV

Parte essencial – Coluna vertical a qual é percorrida por

Possui um canhão eletrônico que possui um filamento de

Obtenção da imagem - Avaliam as modificações que

Interação dos elétrons e da matéria

Um feixe de elétrons extremamente fino varre o

Microscopia eletrônica de transmissão

Microscopia eletrônica de varredura

Computador + câmera de vídeo acoplada ao

• BARBIERI,M.K. Microscopia em alimentos. 2.ed. Campinas: Ital, 2001.

• BEUX, M. R. Atlas de microscopia alimentar: identificação de elementos histológicos

• FLINT, O. Microscopia de los alimentos: manual de métodos prácticos utilizando la

• Fontes, E.A.F. Fontes, P.R. Microscopia de alimentos: fundamentos teóricos. Viçosa,

• MALISKA, A. M. Microscopia eletrônica de varredura. Florianópolis: UFSC, 2008.

• SÁ, D. Microscopia eletrônica na engenharia. Disponível em: