Bactérias Láticas e Leveduras em Levain

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DOS
ALIMENTOS
KRISCHINA SINGER APLEVICZ
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS LÁTICAS E LEVEDURAS

EM FERMENTO NATURAL OBTIDO A PARTIR DE UVA E
SUA APLICAÇÃO EM PÃES
FLORIANÓPOLIS
2013
2

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciência dos
Alimentos da Universidade
Federal de Santa Catarina para a
obtenção do título de Doutor em
Ciência dos Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Ernani

Sebastião Sant’Anna.
Florianópolis
2013
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.

Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de “Doutor em

Ciências dos Alimentos” e aprovada em sua forma final pelo Programa
de Pós- Graduação em Ciência dos Alimentos.
Florianópolis, 29 de abril de 2013.
________________________
Profª. Drª. Roseane Fett
Coordenadora do Curso
Banca Examinadora:
________________________
Prof. Dr. Ernani Sebastião Sant’Anna
Orientador
UFSC
_________________________
_______________________
________________________
_______________________
Dedico este trabalho ao meu pai, Alberto Aplevicz (in memoriam),
exemplo de homem, que me ensinou a lutar pelos meus objetivos
e a acreditar na minha capacidade.
AGRADECIMENTOS
A Deus por iluminar meu caminho e por me dar forças para seguir
sempre em frente.
À minha amada família, em especial:
Ao meu amado Adriano, sempre prestativo para me ajudar, não
importando o dia e a hora. Obrigada pelo seu companheirismo, carinho e
“sábias palavras”.
À minha querida Mami Guimara, pela confiança, carinho e valiosos
conselhos.
À Universidade Federal de Santa Catarina a ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência dos Alimentos pela oportunidade.
Ao Professor Ernani, pela orientação, confiança e oportunidade.
À todos os co-autores desta tese, pela parceria na realização deste
trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Biotecnologia Alimentar, Biologia
Molecular, Cereais, Leite e Derivados e Microscopia pelo apoio e
parceria, em especial: Eunice C. Ilha, Tiago da Silva, Luiz R. Morioka,
Angelo Matos, Maria Helena Canella, Carlise B. Fritzen-Freire, Andréia
Z. Dinon, Juliana Lorenz, Fabiane P. de Castro, Tatiana Oro, Marivone
Borges e Valéria Limberger.
Ao Instituto Federal de Santa Catarina pelo apoio na realização desta
pesquisa, em especial às amigas: Berenice Von Dentz, Elinete de Lima,
Jane Parisenti e Emanoelle Marcos pelo apoio e bons conselhos.
À amiga Jaciara Z. Mazo pelos ensinamentos iniciais e pelo incentivo.
Às amigas Simone Inglez e Patricia Scheuer pela amizade e correção
dos artigos.
Às amigas distantes, porém sempre presentes, Madelon Mongruel,
Carolina Prestes, Tais Boscardin e Larissa Martins pelo apoio e pela
alegria de uma bela amizade.
Ao Professor Dr. Paulo José Ogliari, pelo auxílio na estatística.
Ao Professor Dr. Ivo Mottin Demiate pelos contínuos ensinamentos e
por aceitar prontamente ser o relator desta tese.
Aos Professores Renata Amboni, Pedro Barreto, Edna Amante e Elane
Prudêncio pelas valiosas contribuições ao longo da tese e como membro
da banca.
À Professora Regina de Oliveira Moraes Arruda como membro da
banca.
À todos os professores e funcionários do Departamento de Ciência e
Tecnologia de Alimentos.
Ao CNPQ, pelo apoio financeiro para a realização dessa pesquisa.
10
Às minhas gatinhas Mila e Amélie pelas longas horas de companhia

durante a escrita desta tese.
À todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a realização
deste trabalho. Obrigada!
11
APLEVICZ, Krischina Singer. Identificação de bactérias láticas e

leveduras em fermento natural obtido a partir de uva e sua
aplicação em pães. 2013. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos)
– Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Universidade
Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC.
RESUMO
O fermento natural é usado no preparo de produtos de panificação

proporcionando melhorias na massa. Consiste na mistura de farinha de
cereais composta por bactérias láticas e leveduras desenvolvidas por
fermentação espontânea ou pela adição de culturas starters. O objetivo
principal deste estudo foi desenvolver um fermento natural e identificar
bactérias láticas e leveduras interessantes à panificação, avaliando a
fermentação desses micro-organimos e a sua aplicação em pães. Foram
desenvolvidos três fermentos: com cana de açúcar, maçã e uva. O
fermento à base de uva foi o selecionado para esta pesquisa por
apresentar maior volume na fermentação e ser o preferido na análise
sensorial. A identificação fenotípica para bactéria lática e leveduras foi
realizada usando o kit API 50CHL e 20CAUX e foram também
caracterizadas genotipicamente pelo método por sequeciamento. Quatro
cepas foram isoladas neste estudo, sendo duas cepas identificadas como
Lactobacillus paracasei (LP1 e LP2) e as outras duas como
Saccharomyces cerevisiae (SC1 e SC2). No fermentador, LP2
apresentou a mesma fase exponencial que LP1 (15 h), sendo sua
velocidade específica de crescimento maior e estatisticamente diferente
dos demais. As leveduras SC1 e SC2 apresentaram uma fase
exponencial de 10 e 14 h, respectivamente. Os micro-organismos
apresentaram uma boa estabilidade após o congelamento e liofilização,
sendo que LP2 obteve a menor redução microbiana. Com relação ao
tempo de fermentação do fermento natural, se constatou que o
crescimento ideal foi o de 48 h. Os maiores volumes encontrados nos
pães foram com 6 h de fermentação. As amostras de pães com LP1
foram descartadas da análise sensorial por apresentarem menor volume
específico, massa muito firme e cor da casca pálida. A massa com SC1
apresentou o miolo mais macio e uma estrutura de glúten normal, com
superfície uniforme. O melhor resultado da análise sensorial foi para a
formulação com LP2/ SC1 (P < 0,05). Desta forma, o processamento do
fermento natural, a partir de culturas starters, pode ser utilizado no setor
12
de panificação, pois a partir delas é possível obter um produto

padronizado, seguro e de maior facilidade na manutenção.
Palavras-chave: fermentação espontânea, pão, fermento natural,

bactéria lática, levedura, acidez.
13
APLEVICZ, Krischina Singer. Identification of lactic acid bacteria

and yeasts in sourdough made from grape and application in bread.
2013. Thesis (PhD in Food Science) – Postgraduate Program in Food
Science, Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, SC.
ABSTRACT
Sourdough is used in the preparation of bakery products to provide

improvements in dough. It consists of a mixture of cereal flour,
composed of lactic acid bacteria and yeasts, which are developed by
spontaneous fermentation or by adding starter cultures. The main
objectives of this study were to develop sourdough and to identify lactic
acid bacteria and yeasts of use in baking, and to evaluate the
fermentation of these microorganisms and their application in bread.
Three starter sources were studied with cane sugar, apple and grape. The
sourdough from grape was selected for this research because it showed
greater volume in fermentation and was the preferred choice in sensory
analysis. The phenotypical identification of bacteria and yeasts was
performed by using a API 50CHL kit and 20CAUX, and they were also
genotypically characterized by the sequencing method. A total of four
isolated strains were analyzed in this study, two of these strains being
identified as Lactobacillus paracasei (LP1 and LP2) and another two as
Saccharomyces cerevisiae (SC1 and SC2). In the fermenter, LP2
showed the same exponential phase as LP1 (15 h) and its growth rate
was higher and statistically different from the others. SC1 and SC2
yeasts showed an exponential phase of 10 and 14 hours, respectively.
The microorganisms showed good stability after freezing and
lyophilization, and LP2 showed the lowest microbial reduction.
Regarding the fermentation time of sourdough, it was found that 48
hours of growth was considered to be ideal. The largest volumes were
found in breads with 6 hours of fermentation. The samples of breads
with LP1 were rejected in sensory analysis due to lower specific
volume, very firm dough and a clear crust color. The dough with SC1
presented the softest crumbs and a normal gluten structure with uniform
surface. The best results in terms of sensory analysis were for the
formulation with LP2/ SC1 (P < 0.05). Thus, the processing of
sourdough from starter cultures can be used in the bakery sector
intended for consumers because it is possible to produce a standardized,
safe and ease of maintenance.
14
Key words: spontaneous fermentation, bread, sourdough, lactic acid

bacteria, yeast, acidity.
15
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
CAPÍTULO 4
Figura 1 Evolução do pH (A), absorbância a 660nm (B),

biomassa seca (C) e contagem em placas (D) ao longo
do tempo....................................................................101
Figura 2 Evolução da contagem microbiana na fase exponencial
ao longo do tempo.....................................................103
Figura 3 Sobrevivência de micro-organismos congelados e
liofilizados em log UFC/ g........................................106
Figura 4 Evolução do pH (A), acidez titulável (B) e contagem
em placas (C) dos fermentos naturais ao longo do
tempo.........................................................................109
CAPÍTULO 5
Figura 1 Evolução do pH (A), acidez titulável (B) e contagem

emplacas (C) da massa do pão entre 4 a 10 h de
fermentação................................................................122
Figura 2 Evolução do pH (A), acidez titulável (B) e volume
específico (C) dos pães entre 4 a 10 h de
fermentação................................................................124
CAPÍTULO 6
Figura 1 Efeito dos micro-organismos na firmeza do miolo dos

Pães............................................................................142
Figura 2 Micrografia (magnificação = x 1500) dos miolos dos
pães produzidos com: LP (A); LB (B); SC (C); CP (D);
LPSC (E); LPCP (F); LBSC (G); LBCP (H).............145
Figura 3 Notas atribuídas no teste de aceitabilidade................147
16
17
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1 Características reológicas e físico-químicas da farinha

de trigo.........................................................................64
Tabela 2 Avaliação da atividade fermentativa dos fermentos
naturais a 25, 30 e 35 ºC..............................................66
Tabela 3 Características físico-química dos fermentos naturais e
dos pães........................................................................68
Tabela 4 Contagem em placas de BAL e leveduras do fermento
de uva a 25, 30 e 35 °C (log UFC/g).........................70
CAPÍTULO 3
Tabela 1 Identificação fenotípica de bacteria lática de fermento

natural de uva usando o kit 50 CHL............................82
Tabela 2 Identificação fenotípica de leveduras de fermento
natural de uva usando o kit API 20CAux..................84
CAPÍTULO 4
Tabela 1 Velocidade específica de crescimento (µ) e tempo de

duplicação (td) dos micro-organismos.......................104
CAPÍTULO 5
Tabela 1 Volume específico de pães com aproximadamente 24 g
de massa crua (mL/ g)........................................126
CAPÍTULO 6
Tabela 1 Resultados físico-químicos dos pães com fermento

natural........................................................................138
Tabela 2 Características dos pães produzidos com fermento
natural com LP1, LP2, SC1, SC2 e culturas mistas.140
Tabela 3 Resultados de determinação da cor (L*, b*, a*) na
crosta e no miolo dos pães com diferentes micro-
organismos.................................................................143
18
19
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
a* Gama de cor (verde ao vermelho)

ANOVA Análise de variância
ATT Acidez titulável total
b* Gama de cor (azul ao amarelo)
B. Bacillus
BAL Bactéria lática
CO2 Dióxido de carbono
EST Estabilidade
FN Fermento natural
FI Fermentação inicial
ITM Índice de tolerância à mistura
J Joules
K. Kluyveromyces
Lb. Lactobacillus
L Extensibilidade
L* Luminosidade
ln [N] Logaritmo natural
LP Lactobacillus paracasei subsp. paracasei
Log UFC/ g Logaritmo de unidade formadora de colônia
por grama
M Massa
MEV Microscópio eletrônico de varredura
MRS Man, Rogosa and Sharpe
m.v-1 Massa/ volume
N Normal
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
nm Nanômetro
P Tenacidade
PCR Reação em cadeia da polimerase
PDA Potato dextrose agar
P/ L Relação tenacidade x extensibilidade
r2 Coeficiente de determinação
rpm Rotações por minuto
S. Saccharomyces
SC Saccharomyces cerevisiae
ITM Índice de tolerância à mistura
µ Taxa de crescimento específico
µm Micrômetro
20
µHg Micrômetro de mercúrio

UB Unidades Brabender
td Tempo de duplicação
v/ v volume/ volume
W Energia de deformação da massa
TC Tempo de chegada
TD Tempo de desenvolvimento
21
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO....................................................................................25
CAPÍTULO 1........................................................................................27
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................27
1.1 PANIFICAÇÃO..............................................................................27
1.2. FERMENTO NATURAL...............................................................29
1.3 BACTÉRIA LÁTICA......................................................................32
1.4 LEVEDURA.....................................................................................33
1.5 MICROBIOTA DO FERMENTO NATURAL...............................34
1.6 QUALIDADE FÍSICA, QUÍMICA E SENSORIAL DE PÃES......37
REFERÊNCIAS.....................................................................................40
CAPÍTULO 2........................................................................................57
2 AVALIAÇÃO DO FERMENTO NATURAL NA PRODUÇÃO
DE PÃES APLICANDO A TÉCNICA DA FERMENTAÇÃO
ESPONTÂNEA.....................................................................................57
RESUMO...............................................................................................57
ABSTRACT...........................................................................................57
2.1 INTRODUÇÃO................................................................................58
2.2 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................59
2.2.1 Caracterização da farinha de trigo.................................................59
2.2.2 Elaboração do fermento natural.....................................................60
2.2.3 Avaliação da capacidade fermentativa..........................................60
2.2.4 Processamento dos pães................................................................60
2.2.5 Propriedades físico-químicas e microbiológicas dos fermentos
naturais e dos pães..................................................................................61
2.2.6 Análise sensorial............................................................................61
2.2.7 Contagem microbiológica de bactérias láticas e leveduras...........61
2.2.8 Análise estatística..........................................................................62
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................62
2.3.1 Caracterização da farinha de trigo.................................................62
2.3.2 Caracterização dos fermentos naturais e dos pães.........................65
2.3.3 Características microbiológicas.....................................................69
2.4 CONCLUSÃO..................................................................................71
REFERÊNCIAS.....................................................................................71
CAPÍTULO 3........................................................................................77
22
3 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS

LÁTICAS E LEVEDURAS DO FERMENTO NATURAL DE UVA
BRASILEIRA.......................................................................................77
RESUMO...............................................................................................77
ABSTRACT...........................................................................................77
3.1 INTRODUÇÃO................................................................................78
3.2 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................79
3.2.1 Preparação do fermento natural.....................................................79
3.2.2 Isolamento de bactérias láticas e leveduras...................................79
3.2.3 Caracterização fenotípica de BAL e leveduras no fermento
natural.....................................................................................................80
3.2.4 Caracterização genotípica de BAL e leveduras no fermento
natural.....................................................................................................80
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................81
3.3.1 Características fenotípicas.............................................................81
3.3.2 Identificação genotípica.................................................................86
3.4 CONCLUSÃO..................................................................................87
REFERÊNCIAS.....................................................................................87
CAPÍTULO 4........................................................................................93
4 ESTUDO DA CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO E
SOBREVIVÊNCIA AO CONGELAMENTO E LIOFILIZAÇÃO
DE MICRO-ORGANISMOS ISOLADOS DO FERMENTO
NATURAL DE UVA BRASILEIRA..................................................93
RESUMO...............................................................................................93
ABSTRACT...........................................................................................94
4.1 INTRODUÇÃO................................................................................94
4.2 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................95
4.2.1 Cultivo dos microrganismos..........................................................95
4.2.2 Avaliação do fermentado...............................................................96
4.2.3 Velocidade específica de crescimento e tempo de duplicação......96
4.2.4 Liofilização....................................................................................97
4.2.5 Sobrevivência dos micro-organismos após a liofilização.............97
4.2.6 Elaboração do fermento natural.....................................................97
4.2.7 Avaliação do fermento natural......................................................98
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................98
4.3.1 Cinética de crescimento na fermentação.......................................98
23
4.3.2 Avaliação da velocidade específica de crescimento e do tempo de

duplicação.............................................................................................103
4.3.3 Sobrevivência ao congelamento e liofilização ...........................105
4.3.4 Análises dos fermentos naturais..................................................107
4.4 CONCLUSÃO................................................................................110
REFERÊNCIAS...................................................................................111
CAPÍTULO 5......................................................................................117
5 INFLUÊNCIA DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO NAS
CARACTERÍSTICAS DO PÃO COM FERMENTO NATURAL.117
RESUMO.............................................................................................117
ABSTRACT.........................................................................................118
5.1 INTRODUÇÃO..............................................................................118
5.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................119
5.2.1 Micro-organismos........................................................................119
5.2.2 Elaboração do fermento natural...................................................119
5.2.3 Análise das massas e dos pães.....................................................119
5.2.4 Processamento dos pães..............................................................120
5.2.5 Volume específico.......................................................................120
5.2.6 Análise estatística........................................................................121
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................121
5.3.1 Avaliação da massa e do pão.......................................................121
5.4 CONCLUSÃO................................................................................127
REFERÊNCIAS...................................................................................128
CAPÍTULO 6......................................................................................131
6 EFEITO DA INCORPORAÇÃO DE DIFERENTES CULTURAS
LIOFILIZADAS NAS PROPRIEDADES DO PÃO COM
FERMENTO NATURAL..................................................................131
RESUMO.............................................................................................131
ABSTRACT.........................................................................................131
6.1 INTRODUÇÃO..............................................................................132
6.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................133
6.2.1 Micro-organismos ......................................................................133
6.2.2 Elaboração do fermento natural...................................................133
6.2.3 Processamento do pão.................................................................134
6.2.4 Propriedades físico-químicas e microbiológicas dos pães..........134
6.2.5 Volume específico, perda de umidade e umidade do miolo........134
6.2.6 Análise de textura .......................................................................135
6.2.7 Análise de cor..............................................................................135
24
6.2.8 Propriedade de microestrutura.....................................................135

6.2.9 Análise sensorial..........................................................................136
6.2.10 Análise estatística......................................................................136
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................136
6.3.1 Características físico-químicas e microbiológicas......................136
6.3.2 Avaliação do volume específico, da perda de umidade e da
umidade do miolo.................................................................................139
6.3.3 Firmeza do miolo.........................................................................141
6.3.4 Análise de cor..............................................................................142
6.3.5 Microestrutura da massa dos pães...............................................144
6.3.6 Análise sensorial..........................................................................146
6.4 CONCLUSÃO................................................................................147
REFERÊNCIAS...................................................................................148
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS..........................................................153
8 ANEXOS..........................................................................................155
ANEXO A - Resumo apresentado no 16 th World Congress of Food
Science and Technology……………………………………………...157
ANEXO B - Resumo apresentado no XI Congresso Latinoamericano de
Microbiología e Higiene de Alimentos................................................158
ANEXO C - Resumo apresentado no XXI Congresso Latinoamericano
de Microbiologia..................................................................................159
ANEXO D - Comprovante do artigo aceito para publicação...............160
ANEXO E - Comprovante da submissão do artigo..............................161
ANEXO F - Parecer de aprovação pelo Comitê de ética em pesquisa
com seres humanos da UFSC...............................................................162
25
INTRODUÇÃO
O pão é consumido em grande quantidade no mundo, nos

diferentes tipos e formas, dependendo dos hábitos culturais. É estimado
que 1,8 bilhão de pessoas consomem diferentes tipos de pães ao redor
do mundo (CHAVAN; CHAVAN, 2011), sendo o pão branco o mais
consumido (MANDALA et al., 2009).
O fermento natural é uma mistura de farinha de cereais
composta por uma população heterogênea de bactérias láticas e
leveduras, desenvolvida por fermentação espontânea ou iniciada através
da adição de cultura starter (DE VUYST; NEYSENS, 2005;
CORSETTI, SETTANNI, 2007; DE VUYST; VANCANNEYT, 2007).
Segundo Plessas et al. (2008), a fermentação natural tem sido muito
estudada, porém devido a sua natureza, ainda não é um processo bem
compreendido.
A utilização de bactérias láticas e leveduras no processo de
fermentação natural proporciona produtos com características
diferenciadas daqueles produzidos somente com a levedura comercial.
Várias culturas starters têm sido aplicadas no preparo desses pães
(PLESSAS et al., 2011b) visando melhoria na massa, no flavour, na
textura, retardando o envelhecimento do pão e a contaminação por
bolores e bactérias (GEREZ et. al., 2009; DE VALDEZ et. al., 2010).
De grande importância para o preparo dos produtos
panificáveis, a levedura da panificação ganhou relevante interesse
comercial e tecnológico, com desenvolvimento através da biotecnologia,
que propiciou redução de custo e aumentou a facilidade da preparação
dos pães, agregando qualidade, preço e acesso aos nutrientes. Contudo,
a busca pela oferta de um produto diferenciado ao cliente leva muitos
estabelecimentos comerciais a utilizarem técnicas antigas de
fermentação natural em pães, passadas de geração em geração. Estas
técnicas consistem num sistema natural formado por leveduras e
bactérias láticas, que convivem numa associação complexa. Embora de
forte apelo comercial devido à diversidade e singularidade dos produtos
que origina, o fermento natural acarreta gastos extras para a sua
manutenção, pois é necessário o emprego diário de mão de obra e
insumos para a sua conservação, o que acaba por aumentar o custo do
produto final.
Os requerimentos necessários para manter um fermento
natural acabam inviabilizando o seu uso. O desenvolvimento de um
fermento natural seco padronizado pode evitar e eliminar a manutenção
26
diária do fermento natural fresco. O fermento mantido estável através da

sua secagem se manterá ativo e sem alterações por mais tempo do que
um fermento natural mantido refrigerado (BIANCHINI, 2004). O uso de
fermento natural, utilizando a técnica da fermentação espontânea,
também ocasiona a falta de padronização do produto, ante a falta de
controle sobre o desenvolvimento das culturas microbianas presentes no
fermento com o possível surgimento de micro-organismos indesejáveis.
No Brasil estas constatações são verificadas mais pela prática
dos panificadores e pelos conhecimentos empíricos do que por
comprovações científicas. No Estado de Santa Catarina o Decreto nº
31455/ 87 (BRASIL, 1987) permite apenas o uso de fermentos
selecionados e de pureza comprovada por laboratório oficial, além de
proibir a fermentação obtida pelas iscas de massa que utilizam processos
de fermentação natural. Porém, é comum padarias especializadas, seja
em virtude dos modismos de época ou da cultura local, utilizarem a
técnica da isca de massa obtida por fermentação natural e ignorarem
qualquer disposição legal em sentido contrário.
Desta forma, a pesquisa proposta visa desenvolver fermentos
naturais utilizando culturas starters isoladas a partir de uma fermentação
espontânea e aplicá-las no processamento de pães.
Este trabalho está dividido na forma de capítulos, com os
seguintes tópicos:
Capítulo 1 – Revisão bibliográfica
Capítulo 2 – Artigo Avaliação do fermento natural na produção de pães
aplicando a técnica da fermentação espontânea
Capítulo 3 – Artigo Isolamento e caracterização de bactérias láticas e
leveduras de fermento natural de uva do brasileira
Capítulo 4 – Artigo Estudo da cinética de crescimento da fermentação e
sobrevivência ao congelamento e liofilização de micro-organismos
isolados de fermento natural de uva brasileira
Capítulo 5 – Artigo Influência do tempo de fermentação nas
características do pão com fermento natural
27
CAPÍTULO 1
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 PANIFICAÇÃO
Pão é um dos principais alimentos básicos consumido

diariamente em todas as partes do mundo. Embora exista uma grande
variedade de diferentes tipos, o termo pão geralmente se refere a
produtos fermentados que contenham trigo (HAGER et al., 2012). As
técnicas de produção e os produtos de panificação diferem em todo o
mundo (CHAVAN; CHAVAN, 2011), sendo estes compostos por
ingredientes que desempenham funções específicas no processo de
formação da massa (BORGES et al., 2006).
A qualidade do produto final depende do teor de proteínas, do
volume, da qualidade do miolo, da textura do pão (UPADHYAY et al.,
2012) e das características sensoriais (ROSELL; SANTOS, 2010).
Apesar do uso de centeio em algumas partes do mundo, o trigo ainda é o
cereal com maior destaque na elaboração de pães (GOESAERT et al.,
2005).
A determinação da qualidade da farinha é de grande
importância no que se refere ao produto final desejado e seu processo de
fabricação (DUYVEJONCK et al., 2012). Tendo em vista que a farinha
de trigo é o principal ingrediente na massa do pão, as quantidades dos
demais ingredientes são calculadas proporcionalmente sobre aquela, que
corresponde a uma base de 100% (MONDAL; DATTA, 2008).
A farinha de trigo é composta por amido (70 a 75 %), água
(12 a 14 %), proteínas (8 a 16 %) e outros constituintes menores, como
polissacarídeos não amiláceos (2 a 3 %), lipídeos (2 %) e cinzas (1 %)
(MORITA et al., 2002). Os principais componentes da farinha, como o
glúten e o amido, influenciam as propriedades do produto final, mas a
presença de células de gás dentro do pão também é essencial (WILDE,
2003) para formar a textura aerada que é característica da estrutura do
pão (SROAN et al., 2009).
A produção do pão inicia com a mistura da massa com os
principais ingredientes: farinha de trigo, água, fermento e sal (JEKLE;
BECKER, 2012). À massa ainda podem ser acrescentados ingredientes
não-essenciais, como: outros micro-organismos, gordura e açúcar
(GOESAERT et al., 2005). A maioria das formulações de pães
artesanais contém aproximadamente 60 a 75 % de água (MONDAL;
DATTA, 2008). A adição de sal provoca modificação na reologia da
28
massa, principalmente por influenciar a estrutura e a formação da rede

do glúten (BECK et al., 2012). Além disso, o sal é importante na
percepção sensorial dos pães (MILLER; HOSENEY, 2008).
O desenvolvimento de massa é resultado da hidratação dos

componentes da farinha e das mudanças estruturais induzidas pelo
processo mecânico (BELTON, 2005). Durante o amassamento as
propriedades do glúten se desenvolvem e ocorre a incorporação de ar à
massa (DOBRASZCZYK; MORGENSTERN, 2003), formando uma
massa viscoelástica tridimensional, (SONG; ZHENG, 2007; JOYE et
al., 2009) que segura o dióxido de carbono (CO2) durante a fermentação
e ocasiona a expansão da massa (GIL-HUMANES et al., 2011).
As proteínas do glúten desempenham um papel fundamental
na determinação da qualidade do trigo para a panificação, por conferir
capacidade de absorção de água, viscosidade e elasticidade na massa
(WIESIR, 2007). Segundo Pruska-Kedzior et al. (2008) as propriedades
da matriz do glúten estão relacionadas com a qualidade e quantidade das
frações protéicas. Apesar de suas proporções poderem variar, as
proteínas totais do glúten geralmente representam cerca de 80 % das
proteínas totais do grão, sendo aproximadamente 30% gliadinas e 50 %
gluteninas (SHEWRY et al., 2009). Collar et al. (2007) relataram que a
gliadina atua sobre a viscosidade da massa e a glutenina sobre a
elasticidade.
Durante a fermentação que utiliza a levedura Saccharomyces
cerevisiae, o açúcar é convertido em etanol, dióxido de carbono, água. O
aumento da temperatura expande o gás carbônico e o vapor d’água, que
atuam como isolantes prevenindo o aumento excessivo da temperatura e
a evaporação da umidade (MONDAL; DATTA, 2008). A mistura
também ocasiona a aeração da massa, caracterizada por núcleos de
bolhas de ar no miolo do pão (SHEHZAD et al., 2012). O volume do
pão é uma das características mais importantes para se determinar a
aceitabilidade pelo consumidor (STOJCESKA; BUTLER, 2012) e
depende da capacidade da massa em reter o gás por um tempo
prolongado durante a fermentação e o cozimento (DELCOUR;
HOSENEY, 2010). A duração da fermentação pode impactar na
distribuição das células. Assim, uma fermentação mais longa pode
resultar em uma menor distribuição das células (LE-BAIL et al., 2009).
29
1.2. FERMENTO NATURAL
O fermento natural é usado na produção de pães comuns, pães

fermentados com a levedura de panificação (como realçador de sabor ou
para melhorar a qualidade do pão e em preparações de massa ácida ativa
e inativa), pães especiais artesanais (uso do fermento natural como
agente levedante natural para melhoria da qualidade sensorial) e
tradicionais pães de centeio (obter a capacidade de produção da massa
de centeio). Também, bolos e crackers, pizza e vários pães doces são
produzidos com fermentação natural (GOBBETTI et al., 2005;
ARENDT et al., 2007; CORSETTI; SETTANNI, 2007; GÄNZLE et al.,
2007; DE VUYST et al., 2009). Muitas formulações e processos
variados são utilizados na preparação no fermento natural em todo o
mundo (HÄGGMAN; SALOVAARA, 2008).
As fermentações espontâneas são aquelas produzidas de
maneira natural, ou seja, realizadas pelas leveduras provenientes das
cascas das uvas, sem nenhum tipo de inoculação externa (TORIJA,
2003). Para Poutanen et al. (2009), a fermentação espontânea surgiu
apenas ativando os micro-organismos existentes nos grãos de cereais
moídos. Segundo Lahtinen et al. (2012), aproximadamente 30 % da
Europa utiliza essa técnica no preparo de pães. Valmorri et al. (2010)
relataram que em algumas regiões da Itália o fermento natural é
preparado artesanalmente, para manter e desenvolver a microbiota
diversificada típica da região. Tulha et al. (2011) afirmaram que a
propagação contínua do fermento natural visa manter os micro-
organismos ativos. Dewettinck et al. (2008) concluíram que o
conhecimento científico pode ser aplicado no desenvolvimento de novos
processos produtivos de fermentos para produtos comerciais.
As vantagens do uso do fermento natural em relação à
levedura do pão são: a melhoria da maquinabilidade e da funcionalidade
da massa (consistência da massa, resistência à extensão, extensibilidade,
elasticidade etc.) (ROBERT et al., 2006); a redução ou a eliminação dos
conservantes em produtos de panificação, devido a sua atividade
antibacteriana e antifúngica (RYAN et al., 2008, 2009; CHAVAN;
CHAVAN, 2011) e a melhoria das propriedades nutricionais, de textura
e sensorial em pães contendo farelo (RIZZELLO et al., 2012).
O impacto positivo da utilização do fermento natural é
atribuído à microbiota que forma um ecossistema único, consistente em
bactérias láticas (BAL) e leveduras (PARAMITHIOTIS et al., 2010). O
fermento natural é uma mistura de farinha e água, fermentado por BAL
e leveduras. Os níveis de BAL são maiores que 8 log UFC/ g e a
30
proporção é geralmente na razão de 100:1 de BAL para leveduras

(HANSEN, 2006). Segundo Choi et al. (2012), as propriedades
metabólicas das BAL são específicas de cada cepa, por isso a seleção da
cultura starter é fundamental para o processamento do pão com
fermento natural.
O processo de elaboração do fermento natural está relacionado
com a sua microbiota, com as suas atividades metabólicas, parâmetros
de fermentação e com a matéria-prima. Mudanças em um destes fatores
podem afetar a qualidade do pão. As principais atividades metabólicas
são: acidificação (BAL), formação de sabor (BAL e leveduras) e
levedação (leveduras e BAL), resultando na formação de massas com
baixo pH (em média 4,0) e pães com textura e sabor desejável
(GOBBETTI et al., 2005; ARENDT et al., 2007; CORSETTI;
SETTANNI, 2007; GÄNZLE et al., 2007; DE VUYST et al., 2009).
Estudos microbiológicos demonstraram que foram
encontradas mais de 50 espécies de bactérias láticas, na sua maioria do
gênero Lactobacillus, e mais de 20 espécies de leveduras, especialmente
do gênero Saccharomyces e Candida (DE VUYST; NEYSENS, 2005).
A temperatura adequada para o crescimento de Lactobacillus está entre
30 e 40 ºC, dependendo da cepa, e para as leveduras entre 25 e 27 ºC
(CHAVAN; CHAVAN, 2011). Bactérias lácticas produzem ácidos
lático e acético, mantendo, normalmente, o pH abaixo de 5. Leveduras
produzem dióxido de carbono e etanol. Interações entre Lactobacilos e
leveduras são importantes para a atividade metabólica do fermento
natural (POUTANEN et al., 2009).
A microbiota do fermento natural depende de fatores
endógenos e exógenos (LACAZE et al., 2007). Fatores endógenos são
determinados pela composição química e microbiológica da massa e
fatores exógenos principalmente pela temperatura. Na prática, os efeitos
principais são exercidos pela atividade de água, adição de sal,
quantidade e composição do starter, número de etapas de propagação e
tempo da fermentação (DE VUYST; NEYSENS, 2005). Para Chavan e
Chavan (2011), os fatores que afetam a qualidade do fermento são:
rendimento da massa, temperatura, tipo da cultura starter, acidificação
do meio e substrato. Segundo Vogelmann et al. (2009) todos esses
fatores, bem como suas interações, contribuem para o desenvolvimento
da microbiota. Plessas et al. (2008) relataram que existe uma tendência
no desenvolvimento de culturas starters que otimizem a fermentação do
fermento natural.
Starters são micro-organismos concentrados (bactéria lática
somente ou a combinação com leveduras) para inoculação de massas
31
ácidas, podendo ser secas, em pastas ou líquidas (KULP; LORENZ,

2003). Segundo Brandt (2007) as culturas starters usadas na produção
do fermento natural podem ser ativas ou liofilizadas. Clarke et al. (2003)
afirmaram que as culturas starters, usadas em processos distintos,
podem ocasionar diferentes resultados, e por isso devem ser
cuidadosamente selecionadas para se obter a qualidade desejada. Vera et
al. (2009) afirmaram que durante a fermentação do fermento natural a
população microbiana tem necessidades específicas de nutrientes. Além
disso, a microbiota do fermento natural é composta por diferentes
espécies que podem formar associações entre cepas de BAL ou de BAL
e leveduras (DE VUYST et al., 2009).
Seguindo os parâmetros tecnológicos aplicados, o fermento
natural foi classificado em três tipos. Tipo I, tradicionalmente preparado
à temperatura ambiente (30 ºC) e continuamente alimentado; tipo II, é
obtido do processo industrial e a fermentação é realizada em
temperatura mais elevada (acima de 30 °C) durante um longo período;
tipo III, é iniciado por culturas starters selecionadas e secas antes do uso
(DE VUYST; NEYSENS, 2005; HAMMES et al., 2005; CORSETTI;
SETTANNI, 2007). Valmorri et al. (2010) concluíram que o fermento
natural é continuamente alimentado com uma mistura de farinha e água
ou como semi-líquido usado em preparações com longos períodos de
fermentação.
Tulha et al. (2011) afirmaram que em áreas rurais de Portugal
o pão de centeio e de milho é preparado utilizando um pedaço de massa
crua antiga, que é mantida sob refrigeração e coberta com uma camada
de sal. Antes do preparo do pão é necessário ativar esse fermento,
misturando água e farinha, servindo de inóculo para a massa do pão.
Esse processo também é utilizado no Brasil, onde é chamado de isca de
massa. O processo de fermentação ocorre em condições não-assépticas,
podendo existir associações na microbiota por muitos anos (DE
VUYST; VANCANNEYT, 2007). O tempo de fermentação desse
fermento e o tempo final de fermentação da massa exercem influência
significativa no pH do pão (CLARKE et al., 2003).
Hansen e Hansen (1994) relataram que o tipo da farinha
influencia na produção de ácidos no fermento natural e que a
concentração de ácido lático foi 30 a 50 % maior em pães feitos com
farinha integral do que com farinha branca. Banu et al. (2011) e Plessas
et al. (2011a) afirmaram que o uso de 20 % de fermento natural origina
produtos com as características adequadas.
Simonsom et al. (2003) pesquisaram o uso do sal em fermento
natural industrial de centeio e concluíram que o sal influencia o
32
crescimento das BAL e a produção de ácido, podendo ser utilizado no

controle da acidez do pão. A acidez titulável foi mínima com a
utilização de 3,2 % de sal, porém, ao usar em conjunto com 6 % de
sacarose, ocasionou aumento da acidez, devido a produção de ácido
acético.
1.3 BACTÉRIA LÁTICA
Bactérias láticas têm uma história antiga de uso na

fermentação de cereais, especialmente na elaboração de produtos de
panificação de qualidade (GOBBETTI et al., 2005). Como organismos
de biopreservação, as BAL são utilizadas como culturas starters na
indústria de alimentos e são capazes de produzir diferentes tipos de
moléculas bioativas, como ácidos orgânicos, ácidos graxos, peróxido de
hidrogênio e bacteriocinas (HASSAN; BULLERMAN, 2008).
As bactérias láticas são Gram-positivas, quase sempre catalase
negativas, não formadoras de esporos e acumulam acido lático no
ambiente em que crescem, como produto do metabolismo primário.
Todos os componentes do grupo lático são fastidiosos e estão presentes
em ambientes nutricionalmente ricos, como vegetais, leite, carne e trato
intestinal. São anaeróbias, anaeróbias facultativas ou microaerófilas
(SAAD, 2006).
Malik et al. (2012) afirmaram que as BAL causam rápida
acidificação da matéria- -prima através da produção de ácidos
orgânicos, principalmente o ácido láctico. Além disso, também é
importante a produção de ácido acético, etanol, compostos aromáticos,
bacteriocinas e várias enzimas. Segundo Corsetti e Setanni (2007), a
razão entre ácido lático e acético é um importante fator que afeta o
aroma final do pão. As bactérias láticas são capazes de produzir uma
grande variedade de compostos originados de alimentos fermentados,
com o sabor característico de fermento natural e melhoria na segurança
e na reologia dos alimentos (ARENDT et al., 2007). Scheirlinck et al.
(2007) afirmaram que cepas específicas de BAL persistem em massas
artesanais durante anos, permanecendo no ambiente da padaria.
Os Lactobacillus (Lb.) podem ser divididos em três grupos,
tendo como critério o produto final da sua fermentação: Lactobacillus
termofílicos homofermentativos obrigatórios, que fermentam apenas
hexoses e ácido lático (Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Lb. delbrueckii
ssp. lactis e Lb. helveticus); Lactobacillus mesofílicos
heterofermentativos facultativos, que são capazes de fermentar outras
fontes de carbono além das hexoses, produzindo ácidos orgânicos, CO2,
33
álcool e H2O2 (Lb. casei, Lb. paracasei e Lb. plantarum) e Lactobacillus

mesofílicos heterofermentativos obrigatórios, que utilizam
obrigatoriamente hexoses e pentoses como fonte de carbono,
fermentando hexose a ácido lático, ácido acético, etanol e CO2, e
pentoses a ácido lático e ácido acético (Lb. brevis e Lb. fermentum)
(FOX et al., 2000). Segundo Reale et al (2011), os Lactobacillus
representam o grupo dominante na microbiota, especialmente em
fermento natural maduro.
As bactérias mais encontradas nos fermentos naturais são as
mesófilas, incluindo as Gram-negativas aeróbias (Pseudomonas),
facultativas anaeróbias (Enterobactérias) e as bactérias láticas Gram-
positivas homofermentativas e heterofermentativas, além das
indesejáveis Staphylococcus aureus e Bacillus cereus. Dos fermentos
naturais elaborados com farinha de trigo e centeio, Lb. sanfranciscensis
foi a bactéria lática mais isolada (CORSETTI et al., 2001). Kline e
Sugihara (1971) isolaram Lb. sanfranciscensis como a primeira cepa de
um fermento natural. A Lb. sanfranciscensis é interessante por
contribuir positivamente na acidificação heterolática, no flavour, na
proteólise, na textura e nas propriedades nutricionais dos produtos
panificáveis (SIRAGUSA et al., 2009).
1.4 LEVEDURA
As leveduras podem ser esféricas, ovais ou elípticas podendo

ainda apresentar-se bastante alargadas. Não possuem flagelo e
caracterizam-se por uma forma de reprodução vegetativa conhecida
como brotamento ou gemulação. Assim como qualquer forma de vida,
as leveduras necessitam de fatores físicos e químicos importantes
indispensáveis para seu crescimento e reprodução. Alguns elementos
são basicamente necessários, como: água, fontes de carbono e
nitrogênio, oxigênio e minerais (TORTORA; FUNKE; CASE, 2002).
As leveduras, no seu habitat natural, vivem como saprófitas em plantas
ou animais (TULHA et al., 2011).
São microrganismos capazes de crescimento aeróbio ou
anaeróbio facultativo, podendo utilizar o oxigênio ou um componente
orgânico como aceptor final de elétrons, o que os torna capazes de
sobreviver em diferentes condições ambientais. Na ausência de oxigênio
as leveduras fermentam os carboidratos e produzem etanol e dióxido de
carbono, sendo úteis em processos industriais principalmente na área de
alimentos (AIDOO et al., 2006).
34
As leveduras do gênero Saccharomyces cerevisiae são

unicelulares e são encontradas na natureza em frutas cítricas, cereais e
vegetais. São espécies de valor econômico, uma vez que algumas cepas
são utilizadas em muitos processos industriais na elaboração de produtos
fermentados (BROCK, 1994). A S. cerevisiae é a levedura mais comum
usada no preparo dos pães. Células da levedura metabolizam açúcares
fermentáveis (glicose, frutose, sacarose e maltose) e sob condições
anaeróbias produzem dióxido de carbono, que atua como um agente
levedante fornecendo volume à massa (CHAVAN; JANA, 2008).
A levedura S. cerevisiae é um microrganismo atrativo de se
trabalhar por ser não-patogênico, e devido a sua longa história de
aplicação na produção de produtos consumíveis como o etanol e o pão,
ela foi classificada como “microrganismo geralmente considerado
seguro” (GRAS – generally regarded as safe) (OSTERGAARD;
OLSSON; NIELSEN, 2000).
Para Vrancken et al. (2010), a presença de S. cerevisiae no
fermento natural de padaria pode ser ocasionada pela contaminação do
ambiente com levedura comercial, enquanto as leveduras do fermento
natural de laboratório, que é processado em condições assépticas, devem
ser originadas da farinha, que é um ingrediente não estéril.
Leveduras como Candida, Cryptococcus, Pichia,
Rhodotorula, Torulaspora, Trichosporon, Saccharomyces e
Sporobolomyces foram detectadas na quantidade aproximada 4,95 log
UFC/ g em cereais e 3,30 log UFC/ g nas farinhas. A S. cerevisiae não
foi encontrada nas matérias-primas, mas é aplicada no preparo do
fermento natural (CORSETTI et al., 2001).
1.5 MICROBIOTA DO FERMENTO NATURAL
As técnicas empregadas para a caracterização de micro-

organismos podem ser reunidas em três grupos: métodos que envolvem
o cultivo, seguidos da caracterização fenotípica; métodos que envolvem
o cultivo, seguidos da caracterização molecular e métodos que envolvem
somente a caracterização molecular (BERESFORD et al., 2001). A
combinação de testes fenotípicos e genotípicos é necessária para
determinar espécies (BERNARDEAU et al., 2008). O crescente
interesse em culturas starters para fermentação natural requer melhor
detalhamento sobre a diversidade fenotípica e genética das cepas para
exploração nos processos tecnológicos (SCHEIRLINCK et al., 2007).
O API® (Biomérieux, França) consiste em um sistema
comercial de identificação, que consiste em uma galeria com diferentes
35
conjuntos de substratos miniaturizados (EIGNER et al., 2005). É um

sistema padronizado que associa 50 testes bioquímicos em microtubos,
ocorrendo a fermentação de carboidratos e, assim, a identificação da
espécie (ZANINI et al., 2012). Entis et al. (2002) afirmaram que o API é
um sistema de diagnóstico muito utilizado para identificar isolados
alimentícios, ambientais e industriais. Esta galeria vem sendo
amplamente testada com exatidão de resultados de 90,2 a 93 %.
O uso de métodos moleculares representa um grande avanço e
tem aumentado a qualidade e a eficiência da identificação microbiana
(BERNARDEAU et al., 2008). A identificação utilizando PCR (Reação
em cadeia da polimerase) comparada à identificação da fermentação de
carboidratos é mais precisa e rápida, pois a fermentação de carboidratos
demonstra ser subjetiva devido às variações, principalmente na
diferenciação das amostras de Lactobacillus spp. (BARROS et al.,
2009). PCR é uma metodologia in vitro que amplifica enzimaticamente
uma sequência específica de DNA através do uso de primers que
flanqueiam a região de interesse do DNA alvo (KOCHER; WILSON,
1991).
Muitas pesquisas com identificação da microbiota do
fermento natural tem sido realizadas em vários países, como na Itália
(REALE et al., 2011; IACUMIN et al., 2009), Tailândia
(LUANGSAKUL et al., 2009), China (ZHANG et al., 2011) e França
(VERA et al., 2012).
Saeed et al. (2009) identificaram BAL e leveduras em um
fermento natural utilizando o kit API, e observaram que 46 % dos
isolados corresponderam à Lb. brevis, 24 % à Lb. plantarum e 8 % à Lb.
fermentum. Somente a S. cerevisiae foi identificada no grupo das
leveduras, sendo isso relacionado ao fato da adição desta levedura no
preparo desse fermento natural. Utilizando a mesma técnica, Lu et al.
(2008) encontraram Lb. plantarum e S. cerevisiae como as espécies
dominantes e Simonsom et al. (2003) identificaram Lb. plantarum, Lb.
paracasei subsp paracasei e Lb. delbrueckii subsp delbrueckii. Segundo
Endo et al. (2011), os carboidratos têm um grande impacto no
isolamento e na variedade da BAL em alimentos fermentados.
Edema e Sanni (2006) identificaram no fermento natural de
milho, durante a fermentação de 48 h a 28 ºC, 34 bactérias láticas de 15
espécies diferentes e 13 leveduras de 9 espécies. Entre os micro-
organismos predominantes foram encontrados Lb. plantarum, Lb.
brevis, Lb. fermentum, Lb. acidophilus, Pediococcus acidilactici,
Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum e S. cerevisiae.
36
Nas amostras de fermento natural da Bélgica foram

encontradas as espécies heterofermentativas: Lb. paralimentarius, Lb.
sanfranciscensis, Lb. plantarum e Lb. pontis (SCHEIRLINCK et al.,
2007).
Corsetti et al. (2001) identificaram no fermento natural
composições próximas de micro-organismos. Lb. sanfranciscensis
foram encontrados em maior quantidade, seguido de Lb. alimentarius,
Lb. brevis e Leuconostoc citreum. Também isolaram 19 leveduras,
sendo que 17 delas correspondiam a S. cerevisae. As outras espécies
identificadas foram S. exiguus e Candida krusei. S. cerevisae foi a
espécie de levedura mais isolada das massas ácidas estudadas por
Rosenquist e Hansen (2000).
Lu et al. (2008) caracterizaram fenotipicamente 170 BAL e 96
leveduras no macarrão de arroz fermentado da China, chamado de
mifen, sendo que Lb. plantarum e S.cerevisiae foram as espécies
predominantes.
Plessas et al. (2008) aplicaram, no fermento natural, a
levedura Kluyveromyces marxianus e as BAL homofermentativas Lb.
delbrueckii ssp. bulgaricus e Lb. helveticus e concluíram que no teste
sensorial o pão com 1 % de Kluyveromyces marxianus e 4 % de Lb.
bulgaricus ou Lb. helveticus tiveram resultados positivos com relação
aos atributos sabor e aroma.
Ontiveros-Martínez et al. (2011) pesquisaram o uso do
fermento natural elaborado com Lb. sanfranciscensis em tortillas, e
verificaram que o produto com menor concentração de fermento natural
(5 %) e com menor tempo de fermentação (1 h) obteve a melhor
aceitabilidade no atributo aroma.
Os pães preparados com cultura mista de Lb.acidophilus (10
%) e Lb. sakei (10 %) apresentaram pH de 3,9, obtendo as melhores
características organolépticas no teste sensorial (PLESSAS et al.,
2011b).
O valor de pH do fermento natural da Grécia variou de 3,56 a
3,71 e a acidez titulável total (ATT) variou de 14,5 a 19,3 mL 0,1 N
NaOH/ 100g. A população de BAL e leveduras variou de 8,23 a 8,51 e
de 7,00 a 7,87 log UFC/ g, respectivamente (PARAMITHIOTIS et al.,
2010). Saeed et al. (2009) pesquisaram 15 amostras de fermento natural
do Paquistão, e constataram que a contagem de BAL variou de 4,8 a
7,84 log UFC/ g, e das leveduras variou de 3,8 a 7,9 log UFC/ g.
Iacumin et al. (2009) pesquisaram fermento natural na Itália e
encontraram contagens de BAL variando entre 3 e 9 log UFC/ g, e de
levedura variando de 7 log UFC/ g. Edema e Sanni (2008) verificaram o
37
crescimento microbiano em fermento natural de milho em 48 h de

fermentação. A contagem em placa de BAL aumentou de 4,62 log UFC/
g no tempo inicial (0 h) para 6,45 log UFC/ g após 48 h de fermentação,
enquanto a contagem de leveduras aumentou de 4,18 log UFC/ g para
6,64 log UFC/ g no mesmo período.
Na produção de pão de trigo, o uso de fermento natural tem se
mostrado um inibidor da contaminação causada pelo Bacillus (B.)
subtilis e B. licheniformis (ROSENQUIST; HANSEN, 2000). Pepe et al.
(2003) observaram a inibição da contaminação ocasionada pelo B.
subtilis em pães produzidos com Lb. plantarum e Lb. mesenteroides
associado com S. cerevisiae. A atividade antimicrobiana de Lb.
plantarum também foi pesquisada por Dal Bello et al. (2007).
1.6 QUALIDADE FÍSICA, QUÍMICA E SENSORIAL DE PÃES
Reologia é uma ferramenta de estudo que relaciona as

propriedades de textura e análises físico-químicas (EVERETT; AUTY,
2008). Upadhyay et al. (2012) relataram que a massa de pão tem um
comportamento viscoelástico, combinando as propriedades de um fluido
viscoso e um sólido elástico. As propriedades reológicas da massa
indicam o potencial de aplicação da farinha de trigo (REGIER et al.,
2007), o comportamento da massa durante o processo de manuseio
mecânico (STOJCESKA et al., 2007) e a qualidade do produto final
(MOHAMMED et al., 2012).
Características reológicas como elasticidade, consistência e
extensibilidade são importantes para as indústrias de panificação
(HRUŠKOVÁ; ŠMEJDA, 2003). Diversas pesquisas utilizam
equipamentos como farinógrafo, alveógrafo, extensógrafo e mixógrafo
nas análises reológicas de farinhas, a fim de verificar as propriedades
dos produtos de panificação (DOBRASZCZYK; MORGENSTERN,
2003; INDRANI; RAO, 2007; KOMLENIĆ et al., 2010; RAZMI-RAD
et al., 2007; STOENESCU; IONESCU, 2011).
A análise de farinografia verifica as propriedades de mistura
da massa. Para a interpretação da curva farinográfica alguns parâmetros
são avaliados: absorção de água (ABS), que consiste na quantia de água
necessária para a farinha ser transformada em um produto final; tempo
de chegada (TC), que indica o tempo registrado quando o topo da banda
alcança a linha de consistência de 500 UB a partir do início da adição de
água; tempo de desenvolvimento da massa (TD), que indica o tempo em
que a massa alcança a consistência máxima; estabilidade (EST), que é a
diferença entre o tempo de chegada e o tempo de saída e indica a força
38
da massa; índice de tolerância à mistura (ITM), que indica a diferença

entre o topo da curva no pico e o topo da curva medido 5 min após o
pico ser alcançado (NAEGA, 2008).
A análise de alveografia verifica o comportamento da massa
na fermentação (GUTKOSKI; JACOBSEN NETO, 2002). Os
parâmetros obtidos na alveografia são: tenacidade (P), que mede a
pressão máxima exercida na expansão da massa (mm); extensibilidade
(L), que mede o comprimento da curva (mm), ou seja, a capacidade da
massa em se esticar; e a energia de deformação da massa (W), que
corresponde ao trabalho mecânico necessário para expandir a bolha até a
ruptura, expressa em 10-4 J (NAEGA, 2008).
A adição de fermento natural na massa ocasiona melhorias nas
propriedades reológicas (KOMLENIĆ et al., 2010), principalmente
durante a produção de pão de trigo (CLARKE et al., 2002; CLARKE et
al., 2004; KETABI et al., 2008). A acidificação e a redução de ligações
dissulfureto do glúten por Lactobacillos heteroferofermentativos
aumentam a atividade de proteases dos cereais e acessibilidade ao
substrato (GÄNZLE et al., 2008). Para Mondal e Datta (2008), as
propriedades reológicas da massa estão relacionadas ao volume
específico e a textura dos produtos de panificação.
A textura pode ser definida como todos os atributos
mecânicos, geométricos e de superfície de um produto, perceptível por
meios instrumentais e sensoriais (ESTELLER et al., 2004a). O
procedimento para determinação da firmeza e demais parâmetros de
textura consiste em submeter os pães à compressão, e analisar a curva
força-tempo resultante (ESTELLER et al., 2004b).
Mondal e Datta (2008) relataram que no preparo de pães a
água e a farinha são os ingredientes principais que afetam a textura e o
miolo. A aparência e a textura final do pão dependem das bolhas
formadas na massa, que são criadas durante os processos de descanso e
cozimento (MARTIN, 2004).
A maciez da crosta e a firmeza do miolo são mudanças que
ocorrem na textura dos pães devido ao seu envelhecimento. A
retrogradação não é o único fator relacionado ao envelhecimento do pão
(BAIK; CHINACHOTI, 2000). Ronda et al. (2011) afirmaram que a
água também exerce um papel importante no envelhecimento. Segundo
Ribotta e Le Bail (2007), a retrogradação da amilopectina é o principal
fenômeno envolvido na firmeza do pão. As moléculas de água são
incorporadas na região cristalina e a distribuição de água é deslocada do
glúten para o amido/ amilopectina, mudando assim a natureza da rede de
glúten (GRAY; BEMILLER, 2003).
39
A técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV) é

utilizada para observar a morfologia de amostras espessas, ou seja, das
amostras não transparentes ao feixe de elétrons. A razão principal de sua
utilização está associada à alta resolução e à grande profundidade de
foco, o que proporciona imagens tridimensionais. O equipamento
consiste em uma coluna óptica eletrônica, com sistema de vácuo,
controle eletrônico e sistema de imagens (GOODHEW; HUMPHREYS,
1988). Berglund et al. (1990) afirmaram que no preparo das amostras é
necessário que elas estejam desidratadas ou liofilizadas e expostas a
fixadores.
Através de técnicas microscópicas é possível verificar a
estrutura da rede do glúten, células de gás, estruturas celulares e
gelatinização do amido (AUTIO; LAURIKAINEN, 1997).
Kontogiorgos et al. (2008) relataram que os espaços vazios existentes
nas imagens corespondem aos espaços ocupados por bolsas de água, no
caso de massas congeladas, ou por inclusão de ar na massa.
A análise da estrutura do pão utilizando a microscopia
eletrônica de varredura tem sido estudada por vários pesquisadores
(INDRANI et al., 2003; KIM et al., 2003; ALTAMIRANO-FORTOUL
et al., 2012).
A aparência superficial e a cor são os primeiros parâmetros de
qualidade avaliados pelos consumidores e, portanto, são fatores críticos
para a aceitação do alimento. Embora a visualização humana ainda seja
considerada adequada, mudanças na iluminação a tornam subjetiva e
variável. Desta forma é recomendável que a análise da cor seja feita
através do uso de um instrumento de medida de cor (LEÓN et al., 2006).
A cor é uma característica importante nos produtos de
panificação, pois junto com a textura e o aroma contribui para a
preferência do consumidor (ESTELLER et al., 2006). Para Komlenić et
al. (2010) a adição de fermento natural seco na massa do pão influencia
na redução da luminosidade da massa.
A análise sensorial é uma ferramenta utilizada para o
desenvolvimento de novos produtos, reformulação dos produtos já
estabelecidos no mercado, estudo de vida de prateleira, determinação
das diferenças e similaridades apresentadas entre produtos concorrentes,
identificação das preferências dos consumidores por determinado
produto, otimização e melhoria da qualidade (MEILGAARD et al.,
2007).
Os testes sensoriais utilizam os órgãos dos sentidos humanos
como “instrumentos”, e devem ser incluídos como garantia de qualidade
por expressar uma medida multidimensional integrada que possui
40
importantes vantagens como, por exemplo, determinar a aceitação de

um produto por parte dos consumidores (CARDELLO; CARDELLO,
1998).
Aceitação e preferência estão entre os mais importantes testes
para determinar a escolha de alimentos (HEIN et al., 2008). A
aceitabilidade pode ser feita para um único produto e não requer
comparação entre produtos. O teste de preferência é aplicado em
comparações diretas entre um produto e outro com a finalidade de
aperfeiçoamento ou com produtos competitivos, forçando uma escolha
de um dos itens sobre outro ou outros produtos avaliados
(MEILGAARD et al., 2007).
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56
57
CAPÍTULO 2
AVALIAÇÃO DO FERMENTO NATURAL NA PRODUÇÃO DE

PÃES APLICANDO A TÉCNICA DA FERMENTAÇÃO
ESPONTÂNEA
RESUMO
Neste estudo foram desenvolvidos três fermentos naturais usando como

substrato: cana-de-açúcar, maçã e uva. A atividade fermentativa e as
características físico-químicas, microbiológicas e sensoriais do fermento
natural e dos pães tipo italiano foram avaliadas. Dentre os pães
preparados com os diferentes fermentos naturais, o elaborado com
fermento de uva apresentou maior pH, com 4,30, e menor acidez,
correspondendo a 2,99 mL NaOH 0,1N/ 100g. O fermento natural de
uva foi o selecionado para esta pesquisa por apresentar o maior volume
na fermentação e por ter obtido a maior nota de ordenação na análise
sensorial. A contagem de bactéria lática aeróbia a 30 °C foi de 7,52 log
UFC/ g e a de leveduras foi de 7,62 log UFC/ g. Após 1 ano de cultivo
as bactérias láticas aeróbias aumentaram 1,34 ciclos logarítmicos na
temperatura de 30 °C, e as leveduras reduziram 0,61 ciclos logarítmicos.
Os resultados deste estudo indicam que o uso de diferentes substratos na
preparação do fermento natural, fornece características sensoriais
diferentes aos produtos. Apesar de ser um processo antigo, a aplicação
da técnica da fermentação espontânea em pães ainda é muito utilizada,
tendo em vista a demanda por produtos com as características
específicas deste tipo de fermentação.
Palavras-chave: atividade fermentativa, bactéria lática, levedura,

análise sensorial.
EVALUATION OF SOURDOUGHS FOR THE PRODUCTION

OF BREADS USING
SPONTANEOUS FERMENTATION TECHNIQUE
ABSTRACT
This study developed three sourdoughs using sugarcane, apple and

grape as substrate. The fermentative activity and physicochemical,
microbiological and sensory characteristics of the sourdoughs and
italian type breads were evaluated. Among the breads that were prepared
58
using different sourdoughs, that which was made from grape sourdough
presented high pH (4.30) and less acidity (2.99 mL 0.1N/ 100g). The
grape sourdough was selected for research because it presented the
highest fermentation volume and because it was the most preferred in
the sensory analysis. The aerobic lactic acid bacteria count at 30 °C was
7.52 log CFU/ g and yeast count was 7.62 log CFU/ g. After one year of
cultivation, the aerobic lactic acid bacteria increased by 1.34 logarithmic
cycles at a temperature of 30 °C and the yeasts were reduced by 0.61
logarithmic cycles. The results of this study indicate that the use of
different substrates in the preparation of sourdoughs provides breads
with different sensory characteristics. Although it is an old process, the
application of the spontaneous fermentation technique in bread making
is still much used in view of the demand for products with the specific
characteristics of this type of fermentation.
Key words: fermentative activity, yeast, lactic acid bacteria, sensory

analysis.
2.1 INTRODUÇÃO
Pães são consumidos em grande quantidade em todo o mundo,

nos diferentes tipos e formatos, dependendo do hábito cultural. É
considerado um dos produtos mais antigos, estimando-se que mais de
1,8 bilhões de pessoas consomem vários tipos de pães em todo o mundo.
Produtos de panificação e suas técnicas de produção diferem
amplamente (CHAVAN; CHAVAN, 2011). Entre as farinhas de cereais,
somente a farinha de trigo pode formar uma massa viscoelástica
tridimensional quando misturada à água. A caracterização das
propriedades reológicas da massa é eficaz em prever o comportamento
do processo e no controle de qualidade dos produtos alimentícios
(SONG; ZHENG, 2007).
O uso do fermento natural tem aumentado nos últimos anos
devido à demanda pelo consumo de alimentos sem a adição de
conservantes químicos. Várias culturas starters têm sido aplicadas no
processamento do fermento natural visando o aumento da vida de
prateleira do pão e a melhoria das características sensoriais (PLESSAS
et al., 2011b). A fermentação tradicional da massa ácida é um processo
longo, que resulta em pães com textura peculiar e flavour típico, que
estão relacionados, principalmente, às condições tecnológicas aplicadas
(DECOCK; CAPPELLE, 2005).
59
Em geral, o fermento natural pode ser obtido de diferentes

métodos, por meio da fermentação espontânea ou pela adição de cepas
selecionadas. Seguindo os parâmetros tecnológicos aplicados, o
fermento natural foi classificado em três tipos. Tipo I, o fermento é
preparado tradicionalmente a temperatura ambiente (cerca de 30 °C) e
continuamente propagados. Tipo II, é obtido industrialmente e a
fermentação é realizada a uma temperatura mais elevada (acima de 30
°C) durante um longo período. Tipo III, geralmente é iniciado por
culturas starters selecionadas e secas antes do uso (DE VUYST;
NEYSENS, 2005; CORSETTI; SETTANNI, 2007; HAMMES et al.,
2005).
O fermento natural consiste na mistura de farinha e água, que
afeta as propriedades do pão de maneiras diferentes. Além de leveduras,
contém uma grande diversidade de bactérias láticas (BAL) que
produzem ácido láctico e/ ou acético, fornecendo gosto ácido nos
produtos finais (DE VUYST; NEYSENS, 2005).
As atividades metabólicas de Lactobacillus durante a
fermentação da massa ácida pode ocasionar melhorias nas propriedades
da massa, na textura e no sabor, além de retardar o processo de
envelhecimento do pão e evitar a deterioração por bolores e bactérias
(GEREZ et al., 2009; DE VALDEZ et al., 2010). A fermentação da
massa ácida melhora as características nutricionais, além de aprimorar
as propriedades de textura e sensorial de pães com farelo (RIZZELLO et
al., 2012). Características físico-químicas e bioquímicas, que surgem a
partir dessa diversidade, geram bons produtos assados (DE VUYST;
NEYSENS, 2005; ARENDT et al., 2007). A temperatura ótima de
crescimento dos Lactobacillus varia entre 30 e 40 oC dependendo da
cepa, e das leveduras entre 25 a 27 oC (CHAVAN; CHAVAN, 2011).
O objetivo deste estudo foi desenvolver e analisar um
fermento natural obtido a partir da técnica da fermentação espontânea e
aplicá-lo em pães, visando obter produtos com características sensoriais
diferentes dos comumentes produzidos no Brasil.
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1 Caracterização da farinha de trigo
A análise de umidade da farinha de trigo comercial foi

realizada de acordo com o método nº 44-15.02 (AACC, 1999). O teor de
cinzas foi analisado de acordo com a metodologia da AACC nº 08-12
(1999). A qualidade da farinha de trigo foi determinada conforme o
60
método nº 54-21 (AACC, 1999) usando um farinógrafo (modelo 8 101,

Brabender OHG, Duisburg, Alemanha). As características viscoelásticas
foram determinadas conforme o método nº 54-30A (AACC, 1999)
usando um alveo-consistógrafo (modelo NG, Chopin, Villeneuve la
Garenne, França). O falling number (modelo 2000, Perten Instruments,
Huddinge, Suécia) foi determinado pelo método nº 56-81B (AACC,
1999). O percentual de glúten seco, úmido e glúten index foram obtidos
usando um Glutomatic (modelo 220, Perten Instruments, Huddinge,
Suécia), de acordo com a metodologia nº 38-12 (AACC, 1999).
2.2.2 Elaboração do fermento natural
Foram desenvolvidos três fermentos naturais usando como

substrato cana-de-açúcar, maçã e uva. Estes ingredientes foram
escolhidos por serem comumente utilizados na preparação de fermentos
naturais no Brasil.
Foi utilizada a técnica de 5 estágios (1 fermentação inicial + 4
propagações diárias). Cada substrato foi misturado com água e
fermentado espontaneamente por três dias a 25 °C (FI). A primeira
mistura foi realizada com a adição de 100 % da fermentação inicial (FI),
100 % de farinha de trigo, 10 % de farinha de centeio e 90 % de água,
permanecendo por 24 h em temperatura ambiente (aproximadamente 25
ºC) (pré-fermento). Seguindo intervalos de 24 h, foram desenvolvidas a
segunda, terceira e quarta mistura com 100 % do pré-fermento, 50 % de
farinha de trigo, 10 % de farinha de centeio e 40 % de água. Os
fermentos, após cada propagação diária, foram acondicionados por 8 h a
25 °C, e por 16 h a 5 °C. Os fermentos naturais foram propagados
semanalmente durante um ano.
2.2.3 Avaliação da capacidade fermentativa
Após a finalização do preparo dos fermentos, foram avaliadas

amostras de cada um dos preparos quanto à capacidade fermentativa.
Utilizou-se 10 g de cada amostra em proveta graduada, em temperaturas
de 25, 30 e 35 ºC, por 13 h. O volume inicial de 10 mL foi considerado.
2.2.4 Processamento dos pães
Os fermentos naturais foram testados em pães tipo italiano

cuja formulação foi composta por 100 % de farinha de trigo, 20 % de
fermento natural (KATINA et al., 2006; PARAMITHIOTIS et al., 2005;
61
PLESSAS et al., 2011a; ROBERT et al., 2006), 60 % de água e 1,8 %

de sal. Após a mistura dos ingredientes, os pães foram fermentados a 30
ºC por 5 h (80 % de umidade relativa) e assados com vapor a 180 °C por
30 min.
2.2.5 Propriedades físico-químicas e microbiológicas dos fermentos

naturais e dos pães
Amostras dos fermentos naturais e dos pães foram submetidas

à análise de pH (modelo Q-400ª, Quimis, Diadema, Brasil) e acidez
titulável (ATT). A acidez foi determinada com 0,1N de NaOH e
expressa em mL 0,1N NaOH/ 100 g (IAL, 2004). As amostras dos pães
foram submetidas à análise de umidade, cinzas, gordura (IAL, 2004) e
proteína (AOAC, 2005), além de coliformes a 45 °C, Salmonella sp,
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, bolores e leveduras (APHA,
2001).
2.2.6 Análise sensorial
As amostras dos pães foram analisadas por 50 julgadores não

treinados, cada um avaliando 3 amostras e baseando a avaliação na
impressão global dos produtos. Os julgadores foram convidados a
classificar as amostras em ordem de preferência. As amostras mais
preferidas tiveram nota de ordenação 3 e as menos preferidas nota de
ordenação 1. As amostras foram servidas em pratos plásticos brancos e
codificadas com números de três dígitos aleatórios. Água mineral foi
fornecida para enxaguar a boca entre as avaliações (MEILGAARD;
CIVILLE; CARR, 2007).
O teste de ordenação-preferência foi aplicado para avaliar as
amostras de pães com fermentos naturais com cana-de-açúcar, maçã e
uva. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas com
Seres Humanos da UFSC sob o número 876/ 10. As análises
microbiológicas foram realizadas visando à segurança dos julgadores
durante a análise sensorial. O objetivo do teste sensorial foi identificar o
melhor fermento para, a partir dele, selecionar as BAL e leveduras de
interesse no preparo dos pães.
2.2.7 Contagem microbiológica de bactérias láticas e leveduras
A contagem de BAL e leveduras foi realizada através do

método pour plate. Do fermento natural com maior nota de ordenação
62
na avaliação sensorial, foram misturadas, assepticamente, 25 g de cada

massa com 225 mL de água peptonada estéril (0,1 g 100 g-1) em
stomacher (model P, Interscience, St. Nom, França). Foram realizadas
as diluições necessárias de BAL e leveduras. O cultivo de BAL foi
realizado em ágar MRS (Difco, Sparks, USA) em condições de
aerobiose e anaerobiose, com incubação a 30 ºC/ 48 h e as leveduras em
ágar PDA (Difco, Sparks, USA) com ácido tartárico 10% a 25 ºC/ 72 h.
BAL foram mantidas como culturas estoques em tubos com ágar MRS e
leveduras em ágar PDA com ácido tartárico 10 % a 5 °C e repicadas
mensalmente. A morfologia das bactérias láticas foi observada quanto à
coloração de Gram e teste da catalase. As colônias das leveduras foram
submetidas ao teste microscópico quanto à presença de hifa ou
pseudohifa.
2.2.8 Análise estatística
A diferença significativa entre as médias foi calculada usando

a análise de variância (ANOVA) e calculada pelo teste de Tukey (P <
0,05) usando o programa Statistica versão 8.0 (2007). Todos os
experimentos foram realizados em triplicata e os dados expressos como
média ± desvio padrão. O resultado do teste de ordenação-preferência
foi analisado de acordo com o teste não-paramétrico de Friedman
(MEILGAARD et al., 2007) usando o programa Bioestat 5.0 (2007).
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.3.1 Caracterização da farinha de trigo
A farinha de trigo apresentou teor médio de 14,1 ± 0,10 % de

umidade, 0,48 ± 0,02 % de cinzas, 9,5 ± 0,10 % de glúten seco e 355 ±
2,00 s de falling number. Os resultados da análise da farinha de trigo
estão apresentados na Tabela 1. A amostra analisada neste estudo
apresentou absorção de água de 60,8 ± 0,21 % e desenvolvimento da
massa de 2,1 ± 0,14 min. Os resultados foram próximos dos obtidos por
Indrani e Rao (2007), que foram 0,45 % de cinzas, 10,1 % de glúten
seco, 374 s de falling number e 57,5 % de absorção de água.
A estabilidade da massa consiste no intervalo de tempo
durante o qual ela mantém a máxima consistência, e o valor obtido foi
de 3,6 ± 0,64 min. A farinha apresentou um baixo índice de tolerância à
mistura (ITM), de 58 ± 2,83 UB, o que a caracteriza como capaz de
formar uma massa forte. A tenacidade e a extensibilidade obtida foi de
63
104 ± 2,12 e 57 ± 0,71 mm, respectivamente. A relação de P/ L da

amostra é de 1,84 ± 0,06. Esta relação indica uma farinha com
tenacidade média, ideal para pães.
Stoenescu e Ionescu (2011) observaram os principais índices
de qualidade em farinhas sem aditivos e constataram que o glúten úmido
foi de 26,1 % e falling number de 478 s. Valores altos de falling number
indicam a necessidade da adição de α-amilase para melhoria das
propriedades da massa. A massa preparada com farinha de trigo romena
apresentou elasticidade de 92 mm, extensibilidade de 42 mm, falling
number entre 250 e 300 s e um considerável valor para a elasticidade da
massa para pão, entre 60-70 mm.
64
Tabela 1 - Características reológicas e físico-químicas da farinha de trigo.

Farinografia Alveo-consistografia Análise físico-química
ABS (%) 60,8 ± 0,21 P (mm) 104 ± 2,12 umidade (% p/p) 14,10 ± 0,10
TC (min) 0,98 ± 0,03 L (mm) 57 ± 0,71 cinzas (% p/p) 0,48 ± 0,02
TD (min) 2,1 ± 0,14 P/ L 1,84 ± 0,06 glúten úmido (% p/p) 27,93 ± 0,55
EST (min) 3,6 ± 0,64 W (cm2 x 10-4 J) 241 ± 2,12 glúten seco (% p/p) 9,50 ± 0,10
ITM (UB) 58,0 ± 2,83 glúten index (% p/p) 89,70 ± 2,29
falling number (s) 355 ± 2,00
Resultados como média ± desvio padrão.
Propriedades farinográficas: ABS, absorção de água (base seca 14% de umidade); TC, tempo de chegada;
TD, tempo de desenvolvimento; EST, estabilidade; ITM, índice de tolerância à mistura.
Propriedades alveo-consistográficas: P, tenacidade; L, extensibilidade; P/ L relação entre tenacidade e extensibilidade;
W, energia de deformação da massa.
65
2.3.2 Caracterização dos fermentos naturais e dos pães
A atividade fermentativa está apresentada na Tabela 2. Os

fermentos de uva e maçã tiveram resultados próximos e superiores ao de
cana-de-açúcar, a 25 e 35 °C, na primeira e na segunda hora de
crescimento.
O fermento de cana-de-açúcar, de modo geral, foi o que
obteve menor produção inicial de gás. O fermento natural que
apresentou o maior volume foi o de uva a 25 °C. Seu maior volume foi
com 5 h, com 36 ± 3,08 mL. A análise estatística demostrou que não
existe diferença significativa entre as médias dos nove tratamentos ao
nível de significância de P < 0,05. A média do fermento de uva em 13 h
de fermentação a 25 °C foi de 28,62 mL, sendo superior e
significativamente diferente das outras.
Os tratamentos com cana-de-açúcar e maçã a 25 °C, cana-de-
açúcar, maçã e uva a 30 °C e cana-de-açúcar a 35 °C foram
considerados estatisticamente iguais Os tratamentos de maçã e uva a 35
°C diferem do restante e tiveram a menor média de volume.
66
Tabela 2 - Avaliação da atividade fermentativa dos fermentos naturais a 25, 30 e 35 ºC, expressa em mL.
Tempe-
ratura 25ºC 30ºC 35ºC
Cana-de- Cana-de- Cana-de-
Hora açúcar Maçã Uva açúcar Maçã Uva açúcar Maçã Uva
0 10,0 ± 0,00 10,0 ± 0,00 10,0 ± 0,00 10,0 ± 0,00 10,0 ± 0,00 10,0 ± 0,00 10,0 ± 0,00 10,0 ± 0,00 10,0 ± 0,00
1 12,8 ± 0,84 15,6 ± 1,14 15,8 ± 0,84 13,8 ± 1,30 16,2 ± 0,84 12,8 ± 1,30 14,8 ± 0,84 16,8 ± 1,30 16,25 ± 0,96
2 14,2 ± 1,10 22,4 ± 1,52 22,8 ± 2,39 16,6 ± 1,82 21,8 ± 0,84 16,4 ± 2,41 17,6 ± 0,55 22,2 ± 2,59 19,25 ± 1,71
3 16,6 ± 1,34 26,6 ± 2,51 25,0 ± 2,12 19,8 ± 2,77 24,0 ± 1,00 19,2 ± 3,03 20,8 ± 2,28 29,40 ± 3,65 25,0 ± 0,83
4 17,8 ± 1,64 30,0 ± 1,22 32,8 ± 1,79 24,8 ± 1,79 32,6 ± 0,55 34,2 ± 2,49 23,2 ± 1,92 35,0 ± 1,73 34,5 ± 1,73
5 22,8 ± 1,92 31,4 ± 0,89 36,0 ± 3,08 28,6 ± 2,61 31,2 ± 1,30 31,8 ± 2,86 26,2 ± 2,59 32,2 ± 2,59 26,0 ± 0,82
6 27,0 ± 2,00 32,2 ± 0,84 35,4 ± 2,30 29,6 ± 2,97 30,6 ± 1,34 30,6 ± 1,52 26,8 ± 3,11 30,0 ± 3,74 27,25 ± 1,71
7 28,2 ± 1,92 31,2 ± 0,84 31,8 ± 2,17 30,2 ± 2,95 30,4 ± 1,95 28,6 ± 1,67 28,0 ± 3,39 28,2 ± 1,10 26,0 ± 1,63
8 28,6 ± 2,41 30,8 ± 1,64 29,8 ± 0,84 29,4 ± 3,36 27,0 ± 3,08 26,2 ± 1,79 27,8 ± 3,27 18,8 ± 1,92 20,25 ± 3,86
9 29,0 ± 2,00 30,8 ± 0,84 30,4 ± 0,55 26,2 ± 1,10 27,2 ± 1,64 26,4 ± 2,70 28,2 ± 3,42 12,6 ± 3,58 17,0 ± 3,56
10 27,8 ± 1,30 24,4 ± 3,56 30,4 ± 2,07 26,2 ± 1,30 26,4 ± 1,67 24,6 ± 2,07 26,8 ± 2,77 10,0 ± 0,00 15,25 ± 3,59
11 27,6 ± 0,89 27,0 ± 2,61 30,0 ± 3,39 26,0 ± 2,35 26,4 ± 2,79 22,6 ± 1,95 25,6 ± 1,95 10,0 ± 0,00 13,0 ± 4,24
12 26,0 ± 1,22 21,8 ± 1,30 26,2 ± 1,30 23,2 ± 1,79 21,6 ± 2,30 21,0 ± 1,58 24,4 ± 2,70 10,0 ± 0,00 13,0 ± 4,24
13 22,2 ± 1,48 20,0 ± 0,71 25,6 ± 1,34 21,4 ± 1,67 20,6 ± 1,34 20,4 ± 1,14 22,2 ± 1,48 10,0 ± 0,00 12,5 ± 3,32
Média ab ab b ab ab ab ab a
em 13 h 23,12 26,48 28,62 24,29 25,85 24,22 24,03 20,40 20,40 a
Resultados como média ± desvio padrão. a–b Diferença de letras sobrescritas na mesma linha indicam diferença entre as amostras (Teste de Tukey,
P < 0,05).
67
Os resultados da análise dos fermentos e dos pães estão

ilustrados na Tabela 3. Os valores de pH dos fermentos ficaram
próximos, variando entre 4,22 ± 0,02 e 4,37 ± 0,01.
O pão com fermento de cana-de-açúcar teve a maior acidez,
com 5,44 ± 0,15 mL NaOH/ 100g e a menor acidez foi para o pão
preparado com fermento de uva com, 2,99 ± 0,02 mL NaOH/ 100g.
Crowley et al. (2002) em seu estudo obteve valores de pH de
4,11, 6,01, 5,21 e 4,75 para o fermento natural, para o pão padrão, para o
pão com 20 % de fermento e para o pão com 40 % de fermento,
respectivamente. Valores de acidez titulável total foram de 12,35, 2,6,
5,2 e 8,18 mL NaOH/ 100g. Como esperado, o aumento da quantidade
de fermento nos pães resultou no descréscimo do pH e
consequentemente maior ATT.
O pH do fermento maduro varia de acordo com a natureza do
processo e da cultura starter usado nas massas ácidas de trigo, variando
entre 3,5 a 4,3 (COLLAR et al., 1994; WEHRLE, ARENDT, 1998;
THIELE et al., 2002).
Paramithiotis et al. (2005) aplicaram 20 % de fermento e o pH
variou entre 3,57 e 3,85 e a ATT entre 10,1 e 12,5 mL. A concentração
de ácido lático foi maior nos pães contendo 50 % de fermento quando
comparada aos pães com 30 % (PLESSAS et al., 2008).
68
Tabela 3 - Características físico-química dos fermentos naturais e dos pães.

Fermento natural
Cana-de-açúcar Maçã Uva
pH 4,22 ± 0,02 4,37 ± 0,01 4,36 ± 0,02
Acidez titulável total (mL 0,1N/ 100g) 11,56 ± 0,10 5,55 ± 0,34 7,54 ± 0,64
Pão
Cana-de-açúcar Maçã Uva
pH 4,04 ± 0,01 4,16 ± 0,05 4,30 ± 0,02
Acidez titulável total (mL 0,1N/ 100g) 5,44 ± 0,15 4,35 ± 0,06 2,99 ± 0,02
Umidade (% p/p) 36,27 ± 0,19 37,07 ± 0,06 38,6 ± 0,10
Cinzas (% p/p) 1,46 ± 0,01 1,58 ± 0,01 1,55 ± 0,04
Gordura (% p/p) 1,17 ± 0,06 1,32 ± 0,08 1,22 ± 0,05
Proteína (% p/p) 8,89 ± 0,05 8,84 ± 0,02 8,46 ± 0,09
a–b
Resultados como média ± desvio padrão. Diferença de letras sobrescritas na mesma linha indicam diferença entre as
amostras (Teste de Tukey, P < 0,05).
69
O pão tipo italiano com fermento de uva apresentou maior

teor de umidade, com 38,6 ± 0,10 %. O pão com fermento de cana-de-
açúcar obteve os menores teores de umidade, cinzas e gordura. O teor de
proteína dos pães variou entre 8,46 ± 0,09 para o pão preparado com
fermento de uva e 8,89 ± 0,05 % para o pão preparado com fermento de
cana-de-açúcar. Análises microbiológicas de coliformes a 45 °C,
Salmonella sp, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, bolores e
leveduras dos pães com os fermentos apresentaram resultados
satisfatórios, podendo assim serem submetidos à análise sensorial.
De acordo com o teste de Friedman existe diferença
significativa (P < 0,05) entre as amostras de pães contendo fermento de
cana-de-açúcar e uva. A melhor nota de ordenação foi para os pães tipo
italiano contendo fermento de uva, sendo esta a amostra escolhida para a
seleção de bactérias lácticas e leveduras para futura aplicação em pães.
O pão com fermento de cana-de-açúcar teve a menor nota de ordenação,
sendo igual estatisticamente que o com fermento de maçã.
2.3.3 Características microbiológicas
A contagem em placas do fermento de uva está apresentada na

Tabela 4. Este fermento apresentou valores próximos na contagem em
placas nas diferentes temperaturas, e não foi predominante um tipo de
micro-organismo.
A contagem de BAL aeróbica a 30 °C foi de 7,52 ± 0,07 log
UFC/g, BAL anaeróbica foi de 7,55 ± 0,18 log UFC/ g e leveduras a 25
°C foi de 7,62 ± 0,29 log UFC/ g. Após um ano de cultivo do fermento
de uva, a contagem em placas foi realizada. BAL aeróbica aumentou
1,34 ciclos logarítmicos na temperatura de 30 °C e as leveduras tiveram
uma redução de 0,61 ciclos logarítmicos.
A microbiota de BAL é predominante (8 log UFC/g) e é
representada, principalmente pelo gênero Lactobacillus. Leveduras são
geralmente encontradas em menores níveis (7 log UFC/g) e podem estar
ausentes. As leveduras são, principalmente, do gênero Saccharomyces e
Candida (VERA et al., 2012).
70
Tabela 4 - Contagem em placas de BAL e leveduras do fermento de uva a 25,

30 e 35 °C (log UFC/g).
Leveduras Bactéria lática
Aeróbica Aeróbica Anaeróbica
25 °C 30 °C 35 °C 30 °C 35 °C
7,62 ± 0,29 7,52 ± 0,07 7,61 ± 0,05 7,55 ± 0,18 7,45 ± 0,21
Após 1 ano
7,01 ± 0,16 8,86 ± 0,11 8,97 ± 0,08 8,42 ± 0,11 8,51 ± 0,16
Saeed et al. (2009) pesquisaram 15 amostras de fermento

natural do Paquistão, e constataram que a contagem de BAL variou de
4,8 a 7,84 log UFC/g, e das leveduras variou de 3,8 a 7,9 log UFC/g.
Edema e Sanni (2008) verificaram o crescimento microbiano em
fermento natural de milho em 48 h de fermentação. A contagem em
placa de BAL aumentou de 4,62 log UFC/g no tempo inicial (0 h) para
6,45 log UFC/g após 48 h de fermentação, enquanto a contagem de
leveduras aumentou de 4,18 log UFC/g para 6,64 log UFC/g no mesmo
período.
O fermento natural é dominado pelas BAL
heterofermentativas (DE VUYST; NEYSENS, 2005). Endo et al. (2011)
relataram que os carboidratos exercem um grande impacto no
isolamento da variedade de BAL em alimentos fermentados. Scheirlinck
et al. (2009) indicaram que cepas específicas de BAL continuam
presentes em massas artesanais durante anos e circulam no ambiente da
padaria. Além disso, o ar é um potencial portador de BAL em ambientes
de padarias artesanais.
Mesmo se, aparentemente, a microbiota específica se
estabilizar, o fermento natural continua a evoluir de forma lenta,
podendo, como consequência ser considerado único. Por exemplo, o
fermento natural tipo I é frequentemente dominado por Lactobacillus
sanfranciscensis, Lb. brevis e Lb. plantarum enquanto Lb. fermentum,
Lb. panis e Lb. amylovorus são mais encontrados em fermentos tipo II.
Características fisico-químicas e bioquímicas, que surgem a partir dessa
diversidade, ocasionam bons produtos panificáveis. (ARENDT et al.,
2007; DE VUYST; NEYSENS, 2005).
Células da levedura metabolizam os açúcares fermentáveis
(glucose, fructose, sacarose e maltose) sob condições anaeróbicas e
produzindo dióxido de carbono (CO2) como produto residual, que atua
71
como agente levedante e fornece volume à massa (CHAVAN; JANA,

2008; GIANNOU et al., 2003). Rosenquist e Hansen (2000) reportaram
que Saccharomyces cerevisiae foi a única espécie de levedura isolada de
fermento natural.
As culturas starters oferecem vantagens quando comparadas
com a fermentação espontânea sem adição de starters. Geralmente a
fermentação espontânea precisa de um tempo longo (aproximadamente
96 h) para se completar, para reduzir o pH para um nível suficiente e
melhorar a estrutura e as características sensoriais dos produtos. O
início do processo pode levar um longo tempo (24-48 h) e existe o risco
da contaminação microbiana competir com microorganismos desejáveis
(HOLZAPFEL, 2002). A adição da cultura starter reduz o tempo da
fermentação, pela redução rápida do pH, e aumento da acidez. Isto ajuda
na redução do risco de contaminação microbiana e também contribui
para o controle do aroma, textura e flavour no produto final
(HOLZAPFEL 2002; LEROY; DE VUYST, 2004).
2.4 CONCLUSÃO
O fermento de uva foi o selecionado para a pesquisa por

apresentar maior volume na fermentação e por ter a maior preferência na
análise sensorial. A aplicação da técnica de fermentação espontânea é
um processo antigo, mas muito usado nos dias de hoje devido à
demanda por produtos com as características específicas deste tipo de
fermentação.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil, pelo apoio
financeiro, e também à empresa Granotec pela realização das análises da
farinha de trigo.
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76
77
CAPÍTULO 3
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS

LÁTICAS E LEVEDURAS DO FERMENTO NATURAL DE UVA
BRASILEIRA
RESUMO
Neste estudo foi desenvolvido um fermento natural de uva brasileira

obtido a partir de fermentação espontânea. O objetivo deste trabalho foi
caracterizar fenotipicamente e genotipicamente bactérias láticas e
leveduras isoladas do fermento natural de uva. A identificação
fenotípica para bactéria lática e leveduras foi realizada usando os kits
API 50CHL e 20CAUX e foram caracterizadas genotipicamente usando
o método por sequeciamento. Neste estudo, foram isoladas quatro cepas.
Duas cepas foram identificadas fenotipicamente e genotipicamente
como Lactobacillus paracasei e outra cepa como Saccharomyces
cerevisiae. A outra amostra de levedura, identificada fenotipicamente
como Candida pelliculosa, não obteve a mesma identidade com a
técnica de sequeciamento.
Palavras-chave: fermentação espontânea, fermento natural, bactéria

lática, leveduras.
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF LACTIC ACID

BACTERIA AND YEASTS FROM THE BRAZILIAN GRAPE
SOURDOUGH
ABSTRACT
This study was developed with Brazilian grape sourdough obtained from
spontaneous fermentation. The aim of this work was to characterize
phenotypically and genotypically lactic acid bacteria and yeasts isolated
from sourdough. The phenotypical identification for bacteria and yeasts
was performed by using the kit API 50CHL and 20CAUX and they
were also genotypically characterized by sequencing method. A total of
four isolated strains were analysed in this study. Two of these strains
were phenotypically and genotypically identified as Lactobacillus
paracasei and one as Saccharomyces cerevisiae. Another sample
phenotypically identified as Candida pelliculosa did not show the same
identity by sequencing.
78
Key words: spontaneous fermentation, sourdough, lactic acid bacteria,

yeast.
3.1 INTRODUCÃO
O fermento natural é usado na produção de pães ácidos, pães

tradicionais, snacks, pizza e pães doces (DE VUYST, VANCANNEYT,
2007). A produção de fermento natural pode ser iniciada com uma
simples mistura de farinha de trigo e água, deixada em um lugar
aquecido. Após algumas propagações o fermento estará formado. A
incorporação do fermento natural na tecnologia da panificação realça as
características sensoriais, aumenta a vida de prateleira e melhora as
propriedades nutricionais (ARENDT; LIAM, DAL BELLO, 2007;
CORSETTI et al., 2000). O impacto positivo da utilização é atribuído à
microbiota, que forma um ecosistema único com leveduras e bactérias
láticas (BAL) (PARAMITHIOTIS; TSIASIOTOU; DROSINOS, 2010).
A maioria dos pré-fermentos com leveduras é usada na produção de
pães brancos. O uso de BAL como cultura starter pode ajudar na
melhoria da qualidade e aumento da vida de prateleira dos produtos. As
BAL originadas naturalmente de fermentos naturais podem ser
utilizadas na produção de novos alimentos fermentados, como pão
ácido, que tem qualidade superior e longa vida de prateleira (SAEED et
al., 2009).
BAL são um grupo de bactérias Gram positivas, catalase
negativa, que não apresentam mobilidade, nem produzem esporos e
produzem ácido lático como principal produto final durante a
fermentação. São microaerófilas, acidofilias, tolerantes ao sal e com
necessidades nutricionais complexas para carboidratos, amidoácidos,
peptídios, ácidos graxos, sais, derivados nucléicos e vitaminas. O
habitat natural desses micro-organismos incluem humanos, animais e
plantas (HOLZAPFEL et al., 2001).
A microbiota de BAL é predominante (8 log CFU/g) e é
representada, principalmente, pelo gênero Lactobacillus. Leveduras são
geralmente contadas em níveis menores (7 log CFU/ g) e podem estar
ausentes. As principais leveduras são dos gêneros Saccharomyces e
Candida (VERA et al., 2012).
Na Itália (REALE et al., 2011), na Alemanha (VOGEL et al.,
1994), na França (VERA et al., 2012) e na Bélgica (SCHEIRLINCK et
al., 2009) o fermento natural tem sido pesquisado intensivamente. A
caracterização do fermento natural na Turquia (GÜL et al., 2005), na
Tailândia (LUANGSAKUL et al., 2009) e na China (ZHANG et al.,
79
2011) também tem sido estudada. No entanto, pesquisas publicadas no

Brasil ainda são escassas, mesmo que o pão seja amplamente
consumido. O objetivo deste estudo foi desenvolver um fermento
natural de uva e identificar, fenotipicamente e genotipicamente,
bactérias láticas e leveduras para futura aplicação em pães.
3.2.1 Preparação do fermento natural
O fermento natural foi desenvolvido usando suco da uva

“Niagara rosada” como substrato. O substrato foi misturado com água e
fermentado espontaneamente por 3 dias a 25 °C (FI). Em seguida foi
realizada a primeira mistura com a adição de 100 % da fermentação
inicial (FI), 100 % de farinha de trigo, 10 % de farinha de centeio e 90
% de água, permanecendo por 24 h a temperatura ambiente
(aproximadamente 25 °C) originando o pré-fermento. Seguindo
intervalos de 24 h, foi realizada a segunda, a terceira e a quarta mistura,
usando 100 % do pré-fermento, 50 % de farinha de trigo, 10 % de
farinha de centeio e 40 % de água. O fermento permaneceu por 8 h a 25
°C, e 16 h a 5 °C após cada propagação. O fermento foi propagado
regularmente durante um ano com a mesma formulação utilizada na
etapa da mistura.
3.2.2 Isolamento de bactérias láticas e leveduras
A contagem de BAL e leveduras foi realizada usando o

método pour plate. Assepticamente, 25 g de fermento natural foi
misturado com 225 mL de água peptonada estéril (0,1 g 100 g-1) em
stomacher (modelo P, Interscience, St. Nom, France). Foram realizadas
as diluições necessárias de BAL e leveduras. O isolamento por
esgotamento de BAL foi realizado em ágar MRS (Difco, Sparks, USA)
a 30 °C sobre aerobiose por 48 h e leveduras cultivadas em ágar PDA
(Himedia, Mumbai, India) com ácido tartárico 10 % sobre condições
aeróbicas a 25 ºC a 72 h.
A contagem de BAL aeróbica a 30° C foi de 7,52 ± 0,07 log
UFC/g e leveduras foi de 7,62 ± 0,29 log UFC/ g. Após incubação, 10
colônias de BAL foram isoladas aleatoriamente das placas com diluição
10-6 e foram transferidas para tubos com caldo MRS (Difco, Sparks,
USA). A morfologia foi observada pela coloração de Gram e teste da
catalase. Foram isoladas 25 colônias de leveduras selecionadas
80
aleatoriamente das placas da diluição 10-5 e transferidas para tubos com

extrato de malte (Himedia, Mumbai, India) (APHA, 2001). As colônias
foram analisadas num microscópio para detectar a presença de hifa ou
de pseudohifa.
3.2.3 Caracterização fenotípica de BAL e leveduras no fermento natural
A identificação de BAL foi realizada usando a análise

fenotípica API 50CHL (BioMérieux, Marcy-l'Etoile, France) de acordo
com Saeed et al. (2009) e Lu et al. (2008). As leituras foram realizadas
após 24 e 48 h de incubação a 30 °C. A identificação de leveduras foi
realizada usando o kit API 20CAux (BioMérieux, Marcy-l'Etoile,
France) segundo Saeed et al. (2009) e as leituras foram realizadas após
48 e 72 h de incubação a 30°C.
3.2.4 Caracterização genotípica de BAL e leveduras no fermento natural
Duas amostras caracterizadas fenotipicamente como BAL e

duas amostras de leveduras foram submetidas ao sequenciamento de
DNA na empresa Genotyping Biotecnologia (Botucatu, São Paulo,
Brazil). O DNA dos genomas dos isolados foi extraído com 10 % de
Chelex (Biorad, Hercules, CA), de acordo com o protocolo do
fabricante. A extração do DNA do genoma foi amplificada pelo primer
universal 16S (16S f AACGCGAAGAACCTAC e 16S F
CGGTGTGTACAAGACCC) para BAL e o primer ITS (ITS 4
TCCTCCGCTTATTGATAT e ITS 5
GGAAGTAAAAGTCTAACAAGG) para fungos.
Os produtos da reação por sequeciamento foram tratados com
ExoSAP-IT (USB, Ohio, USA), de acordo com o protocolo do
fabricante, e sequenciados com Applied Biosystems® 3500 Genetic
Analyzer (Foster City, CA). A sequência de nucleotídeos dos produtos
do sequeciaemento foi determinada conforme a metodologia de Sanger;
Nicklen e Coulson (1977). A identificação dos micro-organismos
isolados foi analisada usando a ferramenta Blast (Basic Local Alignment
Search Tools Nucleotide) do National Center for Biotechnology
Information (NCBI).
As análises foram realizadas em triplicatas e os dados

expressos como média ± desvio padrão. O gênero e a espécie das BAL e
81
leveduras isoladas foram interpretadas pelo programa estatístico

APIWEB 50CHL v 5.1 e APIWEB 20CAux v 4.0, respectivamente.
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.3.1 Características fenotípicas
Os resultados dos micro-organismos isolados e testados com o

API 50CHL estão ilustrados na Tabela 1. As amotras de BAL 1 e 2
(Tabela 1) de Lactobacillus paracasei (amostra BAL 1 obteve 6,36 ±
0,18 e amostra BAL 2 obteve 8,34 ± 0,15 log UFC/g) foram
selecionadas para este estudo devido a sua alta confiabilidade de
identificação. A espécie Lactobacillus paracasei foi dominante, com 60
% de identificação entre as bactérias láticas do fermento natural de uva.
A amostra de Lactobacillus paracasei (amostra BAL 1) obteve 99,5 %
de confiabilidade na identificação, enquanto a de Lactobacillus
paracasei (amostra BAL 2) obteve 99,9 %. Isso demonstra que as BAL
heterofermentativas são predominantes no fermento natural, conforme
De Vuyst e Neysens (2005). Segundo Endo; Futagawa-endo e Dicks
(2011), os carboidratos têm um grande impacto no isolamento e na
variedade da BAL em alimentos fermentados. Após 1 ano de cultivo do
fermento natural foi observado que Lactobacillus brevis foi a espécie
dominante, com 70 % de identificação. Scheirlinck et al. (2009)
afirmaram que cepas específicas de BAL persistem nas massas
artesanais após muitos anos.
82
Tabela 1 - Identificação fenotípica de bacteria lática de fermento natural de uva usando o kit API 50 CHL.
% de
Amostras Identificação confiabilidade Amostras Identificação % de
BAL de BAL após 1 ano confiabilidade
identificação de identificação
1 Lactobacillus paracasei 99,5 1 Lactobacillus paracasei 99,8
2 Lactobacillus paracasei 99,9 2 Lactobacillus brevis 93,3
3 Lactobacillus brevis 91,9 3 Lactobacillus brevis 95,8
5 Lactobacillus brevis 95,5 5 Lactobacillus paracasei 99,1
7 - perfil duvidoso 7 Lactobacillus brevis 99,8
8 Lactobacillus delbrueckii 95,6 8 Lactobacillus brevis 95,9
Lactobacillus
10 Lactobacillus paracasei 99,1 10 delbrueckii 92,5
83
Mugula; Narvhus e Sørhaug (2003) identificaram culturas

starters de BAL (Lactobacillus brevis, Lb. cellobiosus, Lb. fermentum,
Lb. plantarum e Pediococcus pentosaceus) e leveduras (Candida
pelliculosa, Candida tropicalis, Issatchenkia orientalis e Saccharomyes
cerevisiae) isoladas de togwa, um alimento fermentado da Tanzânia.
O resultado da fermentação de carboidratos de leveduras está
ilustrado na Tabela 2. As amostras de leveduras selecionadas para este
estudo foram as amostras 1 e 2, ambas com 99,9 % de confiabilidade de
identificação. Saccharomyces cerevisiae (amostra levedura 1) e Candida
pelliculosa (amostra levedura 2) obtiveram 7,54 ± 0,18 e 7,34 ± 0,06 log
UFC/ g, respectivamente.
A Candida pelliculosa foi a espécie dominante, com 48 % de
identificação entre as leveduras isoladas do fermento natural de uva,
seguidas de 28 % de identificação por Saccharomyces cerevisiae.
Leveduras como a Candida famata e a C. sphaerica foram identificadas
em 4% das amostras.
Após um ano de cultivo pode ser observado que a
Saccharomyces cerevisiae foi a espécie dominante. Saccharomyces
cerevisiae é a levedura mais comum usada no preparo dos pães. Células
da levedura metabolizam açúcares fermentáveis (glicose, frutose,
sacarose e maltose) e, sob condições anaeróbias, produzem dióxido de
carbono, que atua como um agente levedante fornecendo volume à
massa (CHAVAN; JANA, 2008; GIANNOU; KESSOGLOU; TZIA,
2003). Rosenquist e Hansen (2000) afirmaram que Saccharomyces
cerevisiae é a espécie de levedura mais isolada nos fermentos naturais.
84
Tabela 2 - Identificação fenotípica de leveduras de fermento natural de uva usando o kit API 20CAux.
% de % de
Amostras Identificação confiabilidade Amostras Identificação confiabilidade
leveduras de após 1 ano de
identificação identificação
1 Saccharomyces cerevisiae 99,9 1 Candida pelliculosa 93,9
Saccharomyces
2 Candida pelliculosa 99,9 2 cerevisiae 99,9
Saccharomyces
3 Saccharomyces cerevisiae 99,9 3 cerevisiae 96,2
4 Saccharomyces cerevisiae 96,2 4 Candida guilliermondii 89,9
5 Candida famata 96,2 5 - perfil duvidoso
Saccharomyces
6 Candida sphaerica 98,5 6 cerevisiae 99,9
7 - perfil duvidoso 7 Candida sphaerica 99,8
8 Candida pelliculosa 88,8 8 Candida sphaerica 98,5
9 Saccharomyces cerevisiae 96,2 9 - perfil duvidoso
10 - perfil duvidoso 10 - perfil duvidoso
Saccharomyces
Saccharomyces
12 - perfil duvidoso 12 cerevisiae 99,9
85
Saccharomyces
Saccharomyces
15 - perfil duvidoso 15 Candida guilliermondii 84,3
16 Candida pelliculosa 93,1 16 Candida pelliculosa 99,8
17 Candida pelliculosa 88,8 17 Cryptococcus albidus 99,8
Saccharomyces
Saccharomyces
20 Candida pelliculosa 93,1 20 - perfil duvidoso
Saccharomyces
Saccharomyces
Saccharomyces
Saccharomyces
Saccharomyces
86
Lu et al. (2008) caracterizaram fenotipicamente 170 BAL e 96

leveduras no macarrão de arroz fermentado da China, chamado de
mifen, sendo que Lb. plantarum e S.cerevisiae foram as espécies
predominantes. A microflora de 25 fermentos de trigo da região Apulia,
sul da Itália, foi caracterizada por Corsetti et al. (2001). Edema e Sanni
(2008) pesquisaram massa de pão de milho ácido e 30 % dos micro-
organismos isolados foram identificados como Lactobacillus
sanfranciscensis, 20 % como Lb. alimentarius, 14 % como Lb. brevis,
12% como Leuconostoc citreum, 7 % como Lb. plantarum, 6 % como
Lactococcus lactis subsp. lactis, 4 % como Lb. fermentum e Lb.
acidophilus, 2 % como Weissella confusa e 1% como Lb. delbrueckii
subsp. delbrueckii.
Qureshi et al. (2007) isolaram e caracterizaram cepas de
leveduras capazes de usar maltose durante a fermentação do pão. Das 40
cepas, 14 foram identificadas como S. cerevisiae, 12 como S. kluyveri, 4
como S. exigus e S. dairnensis, 2 como S. ludwigii, S. octosporus e S.
unisporus, respectivamente. Além disso, 14 dos micro-organismos
isolados de S. cerevisiae foram avaliados pela sua capacidade de
utilização da maltose na produção de pães.
3.3.2 Identificação genotípica
Quatro culturas representativas de BAL e leveduras

caracterizadas fenotipicamente neste estudo foram analisadas
genotipicamente pelo sequenciamento da região 16S rRNA para BAL e
ITS, para detecção de fungos. O produto do sequeciamento resultou no
fragmento de 600 bp para amostras de BAL e 800 bp para amostras de
leveduras.
A amostra caracterizada fenotipicamente como Lactobacillus
paracasei (amostra BAL 1) obtive 93 % de cobertura de sequência com
99 % de identificação para Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus e Lb.
paracasei. A cultura isolada fenotipicamente identificada como
Lactobacillus paracasei (amostra BAL 2) obtive 97 % de cobertura de
sequência com 98 % de identificação para Lactobacillus casei, Lb.
rhamnosus e Lb. paracasei.
A partir dos resultados do sequenciamento das culturas
isoladas e caracterizadas fenotipicamente como Saccharomyces
cerevisiae (amostra levedura 1), houve 88 % de identificação para
Saccharomyces cerevisiae, com 93 % de cobertura da sequência. A
cultura isolada caracterizada fenotipicamente como Candida pelliculosa
87
(amostra levedura 2) obteve 99% de identificação para Saccharomyces

cerevisiae, com 89 % de cobertura da sequência.
Esta sequência de resultados obtidos pela PCR indica que
todas as amostras de BAL mostram maior identidade com Lactobacillus
casei, Lb. rhamnosus e Lb. paracasei. Entretanto, a caracterização
fenotípica indicou que as amostras de BAL são Lactobacillus paracasei.
De acordo com os resultados fenotípicos e genotípicos para
amostras de leveduras, é possível confirmar a identificação de
Saccharomyces cerevisiae para amostra de levedura 1. Entretanto, a
amostra de levedura 2 foi identificada fenotipicamente como Candida
pelliculosa e genotipicamente como Saccharomyces cerevisiae.
Comparando à PCR, a caracterização por fermentação de carboidratos é
sensível devido às variações do processo (BARROS et al., 2009). De
acordo com Nigatu (2000), as diferenças principais entre análise
fenotípica e genotípica indicam que os resultados do kit API devem ser
complementados com os resultados genéticos para se obter um resultado
preciso.
3.4 CONCLUSÃO
Este estudo permitiu isolar e identificar quatro micro-

organismos de um fermento natural de uva para aplicação no
desenvolvimento do fermento para pão. A caracterização fenotípica e
genotípica indicou que duas amostras foram consideradas Lactobacillus
paracasei e outra amostra como Saccharomyce cerevisiae.
A outra amostra foi identificada fenotipicamente como
Candida pelliculosa, mas foi genotipicamente identificada como
Saccharomyces cerevisiae. O resultado fenotípico deve ser confirmado
por análise genotípica.
AGRADECIMENTOS

financeiro.
REFERÊNCIAS

88

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92
93
CAPÍTULO 4
ESTUDO DA CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO E

SOBREVIVÊNCIA AO CONGELAMENTO E LIOFILIZAÇÃO
DE MICRO-ORGANISMOS ISOLADOS DO FERMENTO
NATURAL DE UVA BRASILEIRA
RESUMO
Este estudo avaliou a influência de cepas de Lactobacillus paracasei

(LP1 e LP2) e de Saccharomyces cerevisiae (SC1 e SC2) na
fermentação e na sobrevivência ao congelamento e à liofilização, bem
como os seus efeitos na preparação do fermento natural. Os micro-
organismos foram cultivados em um sistema de fermentação
descontínua durante 15 h, sendo realizadas as análises de pH,
absorbância, biomassa seca e contagem em placas. LP1 teve a mesma
fase exponencial que LP2, mas a sua velocidade específica de
crescimento foi maior e estatisticamente diferente das demais (P < 0,05).
As leveduras apresentaram um crescimento mais rápido que as bactérias
láticas. Os micro-organismos apresentaram uma boa estabilidade antes e
após a liofilização e LP2 obteve a menor redução microbiana. Com
relação ao fermento natural, foi verificado que com apenas 24 h de
crescimento os microrganismos se desenvolveram satisfatoriamente. As
BAL apresentaram maior biomassa e menor valor de pH. Os fermentos
naturais preparados com BAL tiveram maior acidez que os preparados
com leveduras. Todos os micro-organimos apresentaram crescimento
microbiano satisfatório, sendo 48 h o tempo ideal. Com exceção de LP2,
os maiores crescimentos microbianos foram com 48 h.
Palavras-chave: fermentação, cinética, liofilização, bactéria lática,

levedura.
94
STUDY OF FERMENTATION GROWTH KINETICS AND

SURVIVAL TO FREEZING AND LYOPHILIZATION OF
MICROORGANISMS ISOLATED FROM BRAZILIAN GRAPE
SOURDOUGH
ABSTRACT
This study was developed to evaluate the influence of strains of

Lactobacillus paracasei (LP1 and LP2) and Saccharomyces cerevisiae
(SC1 and SC2) in fermentation and in survival during the processes of
freezing and lyophilization, as well as their effect in the preparation of
sourdough. The microorganisms were cultivated in a discontinuous
fermentation system for 15 h and the analyses of pH, absorbance, dry
biomass and plate counts were performed. LP1 showed the same
exponential phase as LP2, and its specific speed of growth was higher
and statistically different from the others (P < 0.05). The yeasts
presented growth rates higher than the LAB. The microorganisms
presented good stability before and after lyophilization, with LP2
showing lower microbial reduction. Regarding the sourdough, it was
found that after only 24 h of growth the microorganisms showed good
results. The LAB presented higher biomass yields and lower pH values.
The sourdoughs prepared with LAB presented higher titratable acidity
than those prepared with yeasts. All microorganisms showed a
satisfactory microbial growth, with 48 h being the ideal time. With the
exception of LP2, the highest growths were during a period of 48 h.
Key words: fermentation, kinetics, lyophilization, lactic acid bacteria,

yeast.
4.1 INTRODUÇÃO
O fermento natural é uma mistura de farinha e água, fermentado

por bactérias láticas (BAL) e leveduras (HANSEN, 2006), apresentando
algumas características específicas, como baixo pH e alta acidez. A
microbiota de BAL é predominante (8 log UFC/ g) e é principalmente
representada pelo gênero Lactobacillus. As leveduras, principalmente do
gênero Saccharomyces e Candida, aparecem em níveis menores (7 log
UFC/ g), podendo até mesmo estarem ausentes. O fermento natural pode
ser obtido por diferentes métodos, através de fermentação espontânea ou
de culturas starters específicas (DE VUYST; NEYSENS, 2005;
HAMMES et al., 2005; CORSETTI; SETTANNI, 2007). A aplicação do
95
fermento natural nos pães é motivada pelos benefícios como flavour,

textura, vida de prateleira e propriedades nutricionais (GÄNZLE et al.,
2007).
A reinoculação microbiana consecutiva, também chamada de
propagação dos micro-organismos, é usada para manter a microbiota
(HÄGGMAN; SALOVAARA, 2008). Nestas propagações dominam as
cepas mais adaptadas (LEROY; DE VUYST, 2004). Tulha et al. (2011)
afirmaram que a propagação contínua do fermento natural visa manter
os micro-organismos ativos. As culturas starters devem ser mantidas e
propagadas diariamente. A indústria tornou disponíveis essas culturas na
forma de concentrados congelados, secas ou liofilizadas. Algumas
permitem, inclusive, a inoculação direta (SANDINE, 1996).
A qualidade e a vida de prateleira dos alimentos são
determinadas pelo crescimento de micro-organismos, que depende de
fatores intrínsicos, como atividade de água e acidez, e fatores
extrínsicos, como a temperatura e a disponibilidade de oxigênio
(WIJTZES et al., 1995). Variações entre o tipo de cultura starter usada
na fermentação e as condições da fermentação (temperatura, tempo, pH
etc) diferem significativamente, dependendo do processo aplicado
(HANSEN; SCHIEBERLE, 2005).
O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de cepas de
Lactobacillus paracasei e de Saccharomyces cerevisiae na fermentação,
na sobrevivência ao congelamento e à liofilização, bem como os efeitos
da preparação do fermento natural usando a técnica de três estágios.
4.2.1 Cultivo dos microrganismos
O fermento natural foi produzido utilizando como substrato

suco da uva Niágara rosada adquirida no comércio local e previamente
higienizada. As cepas usadas neste estudo foram isoladas do fermento
natural de uva e caracterizadas fenotipicamente e genotipicamente
como: Lactobacillus paracasei (LP1 e LP2) e Saccharomyces cerevisiae
(SC1 e SC2).
Os inóculos foram produzidos a partir de uma cultura isolada
repicada mensalmente, ativados em tubos individuais contendo 5 mL de
caldo MRS (Difco, Sparks, USA) a 30 °C/ 16 h para as BAL, e caldo
extrato de malte (Himedia, Mumbai, India) a 25 °C/ 24 h para as
leveduras. A população final do inóculo foi de 5,45 log UFC/ g para
96
LP1; 9,79 log UFC/ g para LP2; 4,67 log UFC/ g para SC1 e 4,54 log
UFC/ g para SC2.
Os micro-organismos foram cultivados em um sistema de
fermentação descontínua (modelo Bioflo 2000, New Brunswick
Scientific, USA), contendo 4,5 L de caldo a 100 rpm por 15 h. Após
cada cultura atingir a fase estacionária o fermentado foi centrifugado
(modelo NT-825, Novatécnica, Piracicaba, Brasil) a 6000 x g por 15
min, a 4 °C. O sobrenadante foi desprezado e a biomassa foi lavada duas
vezes com água peptonada estéril (0,1 g 100 g-1) usando o mesmo
volume do caldo e ressuspendidas a 1/ 40 de volume em leite desnatado
reconstituído (10 % m.v-1) como crioprotetor (adaptado de
FIORENTINI et al., 2009). A solução foi congelada a – 20 ºC em tubos
de 50 mL, utilizando apenas 1/ 3 da sua capacidade. Todo o processo foi
realizado sob condições assépticas.
4.2.2 Avaliação do fermentado
As amostras foram coletadas a cada 60 min, por 15 h

seguidas, em frascos estéreis para realização das análises de pH,
absorbância, biomassa seca e contagem em placas. O pH foi medido em
phmetro (modelo Q - 400ª, Quimis, Diadema, Brasil) e a absorbância em
espectrofotômetro (modelo U 2010, Hitachi, Tóquio, Japão) a 660 nm
(OD 660nm) (ANASTASSIADIS et al., 2005; EDWARD et al., 2011). A
biomassa seca foi obtida por filtração em membranas Durapore HV
0,45µm (Millipore) e seca em estufa a 60 ºC, até peso constante, e o
resultado foi expresso em g/ L. A avaliação do crescimento foi
determinada por contagem em placas do logaritmo do número de células
viáveis (log UFC/ g). As BAL foram cultivadas em ágar MRS (Difco,
Sparks, USA) a 30 ºC/ 48h, e as leveduras em ágar PDA (Himedia,
Mumbai, India) com ácido tartárico 10% a 25 ºC/ 72h. Os resultados
foram expressos como média ± desvio padrão de três repetições em
duplicata.
4.2.3 Velocidade específica de crescimento e tempo de duplicação
A cinética da fermentação foi realizada para verificar o tempo

exponencial de cada micro-organismo para efetuar a maior coleta de
biomassa. A velocidade específica de crescimento, µ (h-1) e o tempo de
duplicação td (h) das BAL e das leveduras, a partir das curvas de
crescimento do número de células viáveis (UFC/ g) versus tempo (h),
foram calculados.
97
A taxa máxima da velocidade específica de crescimento está

de acordo com o coeficiente angular (inclinação) da equação linear do
logaritmo natural do número de colônias ln [N] em função do período de
fermentação t (h), relacionado com a fase de crescimento exponencial,
determinada pela regressão linear (RIBEIRO; HORII, 2004).
O tempo de duplicação (td) foi definido por Montville (1997) e
pode ser calculado seguindo a Equação (1).
td = ln 2/ µ (1)
4.2.4 Liofilização
Amostras dos micro-organismos foram acopladas a um

liofilizador (modelo LT1000, Terroni, São Carlos, Brasil) por 24 h a 90
µHg de vácuo. As culturas liofilizadas foram armazenadas a - 20 °C.
4.2.5 Sobrevivência dos micro-organismos após a liofilização
A sobrevivência dos micro-organismos foi verificada pelo log

do número de células viáveis em unidades formadoras de colônia por g
(log UFC/ g), antes e após a liofilização. Uma alíquota da cultura em
solução de leite foi retirada e submetida à diluição decimal utilizando
água peptonada estéril (0,1 g 100 g-1), plaqueadas e incubadas. As
amostras liofilizadas foram analisadas inicialmente e, após 6 meses,
ressuspendidas em água peptonada, diluídas, plaqueadas e incubadas
(PALMFELDT; HAHN-HÄGERDAL, 2000). Experimentos foram
realizados em três repetições em triplicata.
Para a preparação do fermento natural foi utilizada a técnica

de três estágios (72 h) adaptada de Paramithiotis et al. (2005). A massa
(M1) foi preparada misturando 60 mL de água com 50 g de farinha de
trigo, 0,5g de cultura starter (1 % peso da farinha, PLESSAS et al.,
2008) e 0,25 g de NaCl, e incubadas a 30 °C. Após 24 h de incubação o
fermento natural 1 (FN1) foi obtido. Para formar a massa 2 (M2), foi
misturado 100 g de FN1 com 200 g de farinha de trigo e 100 mL de
água. Após 24 h de incubação o fermento natural 2 (FN2) foi formado.
Para formar a massa (M3), foi misturado 100 g de FN2 com 200 g de
farinha de trigo e 100 mL de água. Após 24 h de incubação o fermento
natural 3 (FN3) foi finalizado.
98
4.2.7 Avaliação do fermento natural
Foram realizadas as análises de pH, acidez titulável (ATT) e

contagem em placas nas amostras do fermento natural, em um intervalo
de 3 dias, a cada 24 h.
O pH e a acidez foram verificados utilizando 0,1N NaOH/
100g (IAL, 2004). A ATT foi expressa em mL 0,1N NaOH/ 100g. A
avaliação do crescimento foi determinada pela contagem em placas do
logaritmo do número de células viáveis (log UFC/ g) usando o método
pour plate. Assepticamente, 25 g de cada massa foi misturada com 225
mL de água peptonada estéril (0,1 g 100 g-1) em stomacher (modelo P,
Interscience, St. Nom, França). Foram realizadas as diluições
necessárias de BAL e leveduras, sendo aquelas cultivadas em ágar MRS
a 30 ºC/ 48 h e estas em ágar PDA com ácido tartárico 10% a 25 ºC/ 72
h. Estes experimentos foram realizados em triplicata.
Os resultados foram analisados utilizando o programa

Statistica® versão 8.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA). A cinética do
crescimento na fermentação durante 15 h e o comportamento dos
fermentos naturais com diferentes micro-organismos durante 72 h foi
estudado aplicando o modelo de regressão linear simples, dado por Y=
β0+ β1X + Ɛ, onde X é o tempo de fermentação, em horas. As diferenças
entre as médias foram calculadas através da análise de variância
(ANOVA) one-way utilizando o teste de Tukey. Foram consideradas
significativas as diferenças ao nível de 5 % (P < 0,05).
4.3.1 Cinética de crescimento na fermentação
Culturas starters podem ser compostas por cepas individuais

de BAL ou por misturas de BAL e leveduras. Seu uso garante a
produção de um pão de qualidade. Os tipos de starters requerem
conhecimento prévio das suas características bioquímicas e dos
potenciais micro-organismos destinados aos panificados. O desempenho
de BAL isoladas tem sido estudado pelas influências nas propriedades
da massa, como o pH, a acidez titulável total e a produção de ácidos
acético e láctico durante a fermentação (COLLAR, 1996; CORSETTI et
al., 1998; HAMMES; GÄNZLE, 1998). Geralmente o uso de culturas
99
starters resulta na produção de pães com alta qualidade, exibindo um

alto grau de aceitação (PARAMITHIOTIS et al., 2005).
As equações estimadas da análise de regressão linear para pH,
absorbância a 660 nm, biomassa seca e contagem microbiana dos micro-
organismos estudados nas 15 h estão ilustradas na Figura 1 (A, B, C e
D).
As análises de regressão linear nas 15 h indicaram que os
coeficientes angulares e lineares de SC1 e SC2 e o coeficiente angular
de LP1 e LP2 referente às taxas de decréscimo do pH (Figura 1A) foram
estatisticamente iguais (P > 0,05). Portanto, não rejeitamos H0 pelo teste
F ao nível de significância de 5%, onde H0 indica que os coeficientes
angulares são iguais. Todos os outros contrastes apresentaram
diferenças estatísticas entre os tratamentos (P < 0,05). Na análise de pH
foi observado um coeficiente de determinação maior para as BAL (LP1:
0,9090; LP2: 0,9823), seguido das leveduras SC2 (0,8328) e SC1
(0,6577).
De acordo com os resultados obtidos para a taxa de
crescimento da absorbância a 660nm nas 15 h de fermentação (Figura
1B), constatou-se que os coeficientes de regressão de LP1/ SC2 foram
iguais entre si. Os coeficientes lineares foram significativamente
diferentes para LP1/ SC2 e para SC1/ SC2. Foi observado um
coeficiente de determinação maior na absorbância para LB, seguido por
SC2; SC1 e LP1 (r2 = 0,9878; 0,9726; 0,9530; 0,8111).
A análise de regressão referente ao aumento da biomassa nas
15 h (Figura 1C), através do teste F para contraste dos coeficientes
angulares, indicou que LP1 e SC2 diferem entre si, ou seja, apresentam
taxas de crescimento diferentes ao nível de significância de 5%. Todos
os outros testes de comparação de coeficientes angulares não
apresentaram diferença estatística entre os tratamentos (P > 0,05). Com
relação ao coeficiente linear, somente SC1 e SC2 foram iguais entre si.
As outras comparações entre os coeficientes lineares foram
significativamente diferentes (P < 0,05). SC2 obteve o maior resultado
do coeficiente de determinação para biomassa seca, de 0,9717, seguida
de LP2, SC1 e LP1 (0,9369, 0,8953, 0,8426).
Para contagem em placas nas 15 h (Figura 1D), a análise de
regressão indicou que os coeficientes angulares e lineares de SC1 e SC2,
e o coeficiente linear de LP1 e SC1 foram estatisticamente iguais (P >
0,05). Portanto, não rejeitamos H0 pelo teste F ao nível de significância
de 5 %. Todas as outras comparações entre coeficientes angulares e
lineares deram diferença estatística entre os tratamentos (P < 0,05). Os
maiores coeficientes de determinação (r2) na contagem em placas foram
100
para LP2 e LP1 (0,9926 e 0,9772), seguidos de SC2 (0,8159) e SC1

(0,7271).
Cepas de L. fermentum BFE 6620 produziram 2,8 g/ L de
biomassa comparada a 2,6 g/ L de Lactobacillus mesenteroides ssp.
mesenteroides BFE 7668 1 e 5,1 g/ L por L. plantarum BFE 6688. L.
fermentum BFE 662 com 18 h de fermentação obteve contagem
microbiana final de 11,6 (log UFC/ g), enquanto L. plantarum BFE
6713 apresentou 12,2 log UFC/ g. A produção de biomassa por
Weissella paramesenteroides BFE7601 e BFE7608 foram de 1,4 e 3,7 g/
L, respectivamente e as contagens no liofilizado foram entre 11,3 e 12,2
log UFC/ g. O tempo de fermentação foi entre 8 e 14,5 h. (EDWARD et
al., 2011).
León et al. (2006) afirmaram que L. brevis LBM13 apresentou
um crescimento acelerado desde o início, com uma contagem de 5,61
log UFC/ g (absorbância 0,130) em 10h, com 11,91 log UFC/ g
(absorbância 1,180) alcançou, em 12 h, a fase estacionária e o declínio
com 21 h. Salovaara (2004) obteve valores de crescimento aproximados
entre 7 e 8 h de cultivo, com 9,28 UFC/ g. Corsetti et al. (2000)
relataram que a absorbância obtida excede o máximo registado de 1,25
para uma contagem de 9 UFC/ g de BAL quando se cultiva a 24 °C em
caldo MRS. A contagem de L. plantarum variou entre 9,1 e 10,6 log
UFC/ g nas formulações inoculadas após 48 h de fermentação
(EDWARD et al., 2011). O pH inicial de L. brevis LBM13 foi de 6,33 e
em 10 h foi de 4,98. Pelos resultados obtidos, pode-se concluir que este
micro-organismo é considerado ideal na elaboração de fermentos
naturais, ante a sua rápida adaptação ao meio (LEÓN et al., 2006).
A maior velocidade específica de crescimento foi para LP1,
onde se observou, após 15 h, o pH de 4,28 ± 0,16, absorbância de 1,793
± 0,15 e 8,81 log UFC/ g. Também com 15 h, LB1 apresentou pH de
4,44 ± 0.01, absorbância de 2,346 ± 0,06 e 13,23 log UFC/ g. O
rendimento da biomassa de 3,6 ± 0,28 e 3,5 ± 0,14 g/ L foi obtido por
LP1 e LP2, respectivamente. SC1 apresentou, após 10 h, pH de 4,72 ±
0,30, enquanto SC2, após 14 h, obteve 4,69 ± 0,17. Ambas as leveduras
apresentaram a mesma biomassa, de 1,6 ± 0.00 g/ L, absorbância de
1,479 ± 0,01 e 1,456 ± 0,01, e contagem em placas de 7,68 log UFC/ g e
7,50 log UFC/ g, respectivamente. Os resultados mostram que as
leveduras apresentaram crescimento mais rápido que as BAL.
Entretanto, as BAL apresentaram maior rendimento da biomassa e
menor valor de pH.
101
Figura 1 - Evolução do pH (A), absorbância a 660nm (B), biomassa seca (C) e

contagem em placas (D) ao longo do tempo.
pH
A
6,4
6,2
6,0
5,8
5,6
5,4
5,2
pH
5,0
4,8
4,6 : LP1 y = 6,6153 - 0,1412*x; r2 = 0,9090

: LP2 y = 6,3031 - 0,1287*x; r2 = 0,9823
4,4
: SC1 y = 5,3928 - 0,0452*x; r2 = 0,6577
: SC2 y = 5,3232 - 0,0538*x; r2 = 0,8328
4,2
4,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
T empo (horas)
Absorbância a 660 nm
B
2,6
2,4
: LP1 y = -0,3431 + 0,1182*x; r2 = 0,8111
2,2 : LP2 y = -0,1466 + 0,1735*x; r2 = 0,9878
: SC1 y = -0,2428 + 0,1456*x; r2 = 0,9530
2,0 : SC2 y = 0,0289 + 0,1039*x; r2 = 0,9726
1,8
1,6
1,4
ABS
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tempo (horas)
102
Biomassa seca
C
4,0
: LP1 y = 1,1618 + 0,1193*x; r2 = 0,8426

3,5 : LP2 y = 1,6765 + 0,109*x; r2 = 0,9369
: SC1 y = 0,4279 + 0,0954*x; r2 = 0,8953
: SC2 y = 0,361 + 0,091*x; r2 = 0,9717
3,0
2,5
2,0
g/ L
1,5
1,0
0,5
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tempo (horas)
Contagem em placas
D
14
13
: LP1 y = 5,3745 + 0,2545*x; r2 = 0,9772
: LP2 y = 7,1769 + 0,4337*x; r2 = 0,9926
12 : SC1 y = 5,7387 + 0,1437*x; r2 = 0,7271
: SC2 y = 5,8408 + 0,1308*x; r2 = 0,8159
11
10
Log UFC/ g
4
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tempo (horas)
LP1: Lactobacillus paracasei 1; LP2: Lactobacillus paracasei 2;

SC 1: Saccharomyces cerevisiae 1; SC 2: Saccharomyces cerevisiae.
103
4.3.2 Avaliação da velocidade específica de crescimento e do tempo de

duplicação
A evolução da contagem microbiana na fase exponencial ao

longo do tempo está ilustrada na Figura 2. A velocidade específica de
crescimento e o tempo de duplicação dos micro-organismos estão
apresentados na Tabela 1.
Figura 2 - Evolução da contagem microbiana na fase exponencial ao longo do

tempo.
Contagem em placas
14
13 : LP1 y = 5,3745 + 0,2545*x; r2 = 0,9772

: LP2 y = 7,1769 + 0,4337*x; r2 = 0,9926
12 : SC1 y = 5,3123 + 0,2488*x; r2 = 0,9619
: SC2 y = 5,7804 + 0,1438*x; r2 = 0,8468
11
10
log UFC/ g
4
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tempo (hora)

104
Tabela 1 - Velocidade específica de crescimento (µ) e tempo de duplicação (td)

dos micro-organismos.
Amostras µ (h-1) td (h)

b
LP1 0,586 ± 0,00 1,18 ± 0,00b
LP2 0,999 ± 0,03c 0,69 ± 0,02a
SC1 0,573 ± 0,01b 1,20 ± 0,02b
SC2 0,331 ± 0,01a 2,09 ± 0,08c
a–c
Resultados como média ± desvio padrão. Letras diferentes sobrescritas
entre as amostras na mesma coluna indicam diferença significativa (Teste de
Tukey, P < 0,05).
A duração da fase lag pode variar consideravelmente. Pode ser

curta ou não existir se o inóculo foi proveniente de uma cultura em fase
exponencial de crescimento, ou pode ser longa se o inóculo for obtido
de um meio rico e o micro-organismo for colocado em um meio mínimo
definido. Nesse caso, provavelmente o micro-organismo teria que
sintetizar muitas proteínas envolvidas na geração dos componentes
celulares que estavam prontamente disponíveis no meio complexo
(INGRAHAM et al., 1997).
A fase exponencial da cultura LP foi de 0 a 15 h. LP1
apresentou uma velocidade específica de crescimento de 0,586 h-1,
correspondendo ao tempo de duplicação de 1,18 h. Apesar dos inóculos
serem provenientes de culturas em fase exponencial, houve uma fase de
latência de 1 h para LP1. Reações cinéticas de primeira ordem podem
ser usadas para descrever as alterações no número de células durante a
fase exponencial de crescimento. Microbiologistas de alimentos
geralmente usam o tempo de duplicação (td) como uma constante
cinética para descrever a velocidade de crescimento exponencial
(MONTVILLE, 1997).
LP2 apresentou a mesma fase exponencial que LP1, mas a sua
velocidade específica de crescimento foi maior, de 0,999 h-1 com 0,69 h
de tempo de duplicação, sendo estatisticamente diferente dos demais (P
< 0,05). No caldo com LP2 o valor de r2 foi de 0,9926, significando que
o ajuste da regressão explica 99,26 % da variação total de Y, sendo
apenas 0,74 % para a variação residual (erro), o que é considerado um
bom ajuste.
105
No caldo com a levedura SC1 a fase exponencial foi menor,

apenas 10 h, com 0,573 h-1 de velocidade específica de crescimento e
1,20 h de tempo de duplicação. Os coeficientes de regressão de
contagem microbiana na fase exponencial de LP1 e SC1 foram iguais (P
> 0,05). Todos os outros coeficientes angulares e lineares foram
significativamente diferentes entre si.
No caldo com SC2 a cultura se manteve em fase exponencial
durante 14 h (0 a 14 h), cujo tempo foi utilizado para estimar a equação
de regressão linear. A velocidade específica de crescimento foi de 0,331
h-1, com o maior tempo de duplicação de 2,09 h, sendo estatisticamente
diferente dos demais (P < 0,05).
Shin et al. (2000) afirmaram que o tempo de duplicação da
Bifidobacterium spp. (Bf-1), crescida em leite desnatado, foi de 3,95 h.
Lactobacillus sp. (LB - 12) mostraram maior velocidade específica de
crescimento e, portanto, menor tempo de duplicação (µ: 0,5480 h-1; Td:
1,2 h). Lactobacillus acidophilus (B/ 103-1-5) apresentou velocidade
específica de crescimento de 0,4930 h-1 e Td de 1,4 h (BRIZUELA et al.,
2001). A velocidade específica de crescimento é o principal parâmetro
de controle da indústria na produção de levedura para panificação (VAN
HOEK et al., 1998). Vrancken et al. (2008) estudaram a produção de L.
fermentum IMDO 130101 e relataram que a maior velocidade específica
de crescimento foi observada usando frutose (0,85 ± 0,02 h−1) e maltose
(0,82 ± 0,02 h−1). Adamberg et al. (2003) relataram que o pH reduziu de
6,2 para 5,8, e a velocidade específica de crescimento de L. bulgaricus
foi quase constante (1,15 h-1). L. acidophilus La5 e L. paracasei E1H3
tiveram a menor velocidade específica de crescimento, 0,5 e 0,3 h-1,
respectivamente.
4.3.3 Sobrevivência ao congelamento e liofilização
LP2 e LP1 congeladas apresentaram resultados próximos, de

11,81 e 11,28 log UFC/ g, respectivamente, considerando uma redução
de 0,53 ciclos de log.
O maior índice de sobrevivência após a liofilização foi para
LP2, que apresentou 1,65 ciclos de log a mais que LP1. LP1 congelada e
LP2 liofilizada apresentaram resultados próximos.
Com relação às leveduras, vale destacar que antes da
liofilização SC1 apresentou 9,77 log UFC/ g, enquanto SC2 apresentou
8,91 log CFU/ g, representando uma redução de 0,86 ciclos de log. O
maior índice de sobrevivência entre as liofilizadas foi para SC1, com
8,30 log UFC/ g, enquanto SC2 apresentou 7,5 log UFC/ g. Durante os 6
106
meses de estocagem a – 20 ºC, foi constatada uma pequena redução no

número de células. Os resultados indicam que os micro-organismos
utilizados neste estudo apresentaram uma boa estabilidade antes e após a
liofilização, e LP2 mostrou a menor redução microbiana. Estes
resultados estão ilustrados na Figura 3.
Figura 3 - Sobrevivência de micro-organismos congelados e liofilizados em log

UFC/ g.
14
12
10
8
UFC/ g
Congelamento
Liofilização inicial
0
LP1 LP2 SC1 SC2 Liofilização após 6 meses
Micro-organismos

Fiorentini et al. (2009) relataram que cepas de Staphylococcus

xylosus AD1 e U5 armazenadas por 1 e 6 meses, a - 20 ºC, apresentaram
boa estabilidade no processo de liofilização. Uma pequena diminuição
do número de células foi observada durante a estocagem, que ocorre
devido aos efeitos positivos das condições de estocagem e também do
crioprotetor utilizado (leite em pó). Condições de armazenamento
desejáveis para culturas liofilizadas são: congelamento a temperaturas
mais baixas que - 15 °C e ausência de oxigênio e umidade. Sob essas
condições a atividade da cultura starter é garantida por oito meses
(BUCKENHÜSKES, 1993). De acordo com Carvalho et al. (2004), o
leite em pó é capaz de prevenir a injúria celular pela estabilização da
membrana celular, e fornece um revestimento protetor para as células.
107
Zhao e Zhang (2005) reportaram que a alta sobrevivência de

L. brevis e Oenococcus oeni foram obtidos com reidratação com 10% de
sacarose e meio MGY (minimal glycerol), respectivamente. As células
bacterianas L. brevis e O. oeni, quando congeladas rapidamente (- 65
°C), mostraram maior viabilidade após a liofilização do que quando
congeladas lentamente (- 20 °C).
4.3.4 Análises dos fermentos naturais
As equações de regressão, estimadas a partir dos dados

experimentais, e os coeficientes de determinação para os diferentes
microrganismos podem ser observados nas Figuras 3 (A, B e C). As
análises de regressão linear indicaram que as taxas de decréscimo do pH
(Figura 4A) e de aumento da acidez titulável (Figura 4B), dos quatro
micro-organismos, são iguais ao longo do tempo pelo teste F para
comparação dos coeficientes de regressão (β1) ao nível de significância
de 5 %, sendo as quatro retas paralelas estatisticamente. Foi observado
um coeficiente de determinação maior no pH para SC1, seguido por
SC2; LP2 e LP1 (r2 = 0,9998; 0,9799; 0,8165; 0,7177, respectivamente).
Entre os grupos, o menor valor do pH final foi da bactéria lática LP1,
com 2,98 ± 0,03. Já no grupo das leveduras, o menor valor final foi para
SC1, com 3,84 ± 0,01.
As leveduras SC1 e SC2 obtiveram os maiores valores do
coeficiente de determinação na análise de ATT, com valores iguais a
0,9930 e 0,9925, respectivamente, tendo em vista que os seus resultados
apresentaram um crescimento progressivo ao longo do tempo. O maior
valor de ATT com 72h foi para LP1, com 14,70 ± 0,90, seguido de LP2
com 13,16 ± 0,36 mL 0,1N NaOH/ 100g. As leveduras SC1 e SC2
apresentaram 9,66 ± 1,12 e 7,60 ± 0,55 mL 0,1N NaOH/ 100g,
respectivamente. A partir dos resultados obtidos constatou-se que os
fermentos elaborados com bactérias láticas apresentaram menor pH e
maior ATT que os elaborados com leveduras. Também foi constatada
uma tendência à aproximação dos resultados pelos grupos de micro-
organismos.
O valor do pH para os fermentos naturais da Grécia variaram
entre 3,56 e 3,71, a ATT de 14,5 e 19,3 mL 0,1 N NaOH/ 100g. A
população de BAL e leveduras variaram entre 8,23 e 8,51 e de 7,00 a
7,87 log UFC/ g, respectivamente (PARAMITHIOTIS et al., 2010). O
pH variou de 3,57 a 3,85 e ATT variou de 10,1 a 12,5 mL 0,1 N NaOH/
100g. A inclusão de espécies complementares de BAL e a aplicação da
108
técnica de três estágios produziu efeito na acidificação da massa

(PARAMITHIOTIS et al., 2005).
Com exceção de LP2, os maiores crescimentos microbianos
foram com 48 h de fermentação, sendo o maior valor para LP1, com
9,12 log UFC/ g. Nesse mesmo período as leveduras obtiveram um
crescimento próximo, com 8,20 log UFC/ g para SC2 e 8,16 log UFC/ g
para SC1. Com 72 h de fermentação houve uma redução de 0,24, 0,18 e
0,16 ciclos de log para LP1, SC2 e SC1, respectivamente. Já para LP2
houve um aumento de 1,54 ciclos de log. A partir dos resultados
constatou-se que, com apenas 24 h de crescimento, os microrganismos
se desenvolveram satisfatoriamente. Porém, com exceção de LP2, os
maiores crescimentos microbianos foram com 48 h.
Contagens em placas de BAL e leveduras, na fermentação
espontânea de farinha de milho, foram estudadas por Edema e Sanni
(2008). A contagem de BAL aumentou de 4,62 log UFC/ g no tempo
inicial (0 h) para 6,45 log UFC/ g após 48 h de fermentação, enquanto as
leveduras aumentaram de 4,18 a 6,64 log UFC/ g no mesmo período.
Saeed et al. (2009) pesquisaram no Paquistão quinze amostras de
fermentos, e constataram que a contagem de BAL foi entre 4,8 e 7,84
log UFC/ g e das leveduras entre 3,8 e 7,9 log UFC/ g .
Para contagem em placas (Figura 4C), a análise de regressão
indicou que apenas os coeficientes lineares de LP2 e SC2 foram
F ao nível de significância de 5 %. Todos os outros contrastes obtiveram
diferença estatística entre os tratamentos (P < 0,05). O baixo valor do
coeficiente de determinação (r2) para SC1 e SC2 indicam uma possível
associação com outros fatores além do tempo, tais como espécie do
micro-organismo, quantidade de nutrientes e temperatura.
109
Figura 4 - Evolução do pH (A), acidez titulável (B) e contagem em placas (C)

dos fermentos naturais ao longo do tempo.
pH
A
7
: LP 1 r2
y = 5,365 - 0,0394*x; = 0,7177
: LP 2 y = 5,368 - 0,0361*x; r2 = 0,8165
6 : SC1 y = 6,002 - 0,0301*x; r2 = 0,9998
: SC2 y = 6,109 - 0,0267*x; r2 = 0,9799
4
pH
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (horas)
Acidez titulável B
16
: LP1 y = 3,454 + 0,172*x; r2 = 0,7922

14 : LP2 y = 3,256 + 0,16*x; r2 = 0,8316
: SC1 y = 1,139 + 0,1168*x; r2 = 0,9930
: SC2 y = 1,052 + 0,0897*x; r2 = 0,9925
12
10
mL 0.1N NaOH/ 100g
0
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (horas)
110
Contagem em placas
C
12
10
8
log UFC/ g
4
: LP1 y = 7,732 + 0,0207*x; r2 = 0,7479
: LP2 y = 8,429 + 0,0312*x; r2 = 0,8615
: SC1 y = 6,719 + 0,0239*x; r2 = 0,5846
2 : SC2 y = 6,4 + 0,0298*x; r2 = 0,6192
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (horas)

4.4 CONCLUSÃO
Os resultados indicam que as leveduras apresentaram

velocidade específica de crescimento menor que as BAL. Entretanto, as
BAL apresentaram maior rendimento da biomassa e menor valor de pH.
LP2 apresentou a mesma fase exponencial que LP1, sendo sua
velocidade específica de crescimento maior e estatisticamente diferente
dos demais (P < 0,05). SC2 apresentou a menor velocidade específica de
crescimento (P < 0,05), diferente de LP2 e SC1. Neste estudo os micro-
organismos apresentaram boa estabilidade antes e após a liofilização,
sendo que LP2 apresentou menor redução microbiana.
Com relação ao fermento natural, verificou-se que os
elaborados com bactérias láticas apresentaram menor pH e maior acidez
titulável que os elaborados com leveduras. De uma maneira geral, o
tempo ideal para o crescimento microbiano foi de 48 h. Todos os micro-
111
organismos apresentaram um crescimento microbiano satisfatório para

futura aplicação em pães.
AGRADECIMENTOS

financeiro.
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116
117
CAPÍTULO 5
INFLUÊNCIA DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO NAS

CARACTERÍSTICAS DO PÃO COM FERMENTO NATURAL
RESUMO
O fermento natural é usado no processamento de vários produtos de

panificação. As cepas usadas no preparo dos fermentos foram de
Lactobacillus paracasei e Saccharomyces cerevisiae. Das amostras de
massa crua, foi analisado o pH, a acidez titulável e a contagem em
placas. Das amostras do pão, foi analisado o pH, a acidez titulável e o
volume específico. As amostras foram analisadas num intervalo de 2 h,
entre 4 e 10 h de fermentação. Ao final, os menores valores de pH foram
para a massa crua com LP2 e o pão com SC1. Os valores de acidez
titulável aumentaram ao longo do tempo, apresentando os maiores
teores de acidez a massa e o pão com leveduras. As bactérias láticas
apresentaram as maiores contagens microbiológicas ao longo do tempo.
Com exceção de SC2, os maiores crescimentos microbianos foram com
10 h de fermentação. LP1 apresentou menor volume em todas as horas
(P < 0,05). Os maiores volumes encontrados nos pães foram com 6 h de
fermentação. SC1 apresentou os melhores resultados de volume
específico durante todo o período.
Palavras-chave: fermento natural, pão, bactéria lática, levedura,
regressão linear.
118
INFLUENCE OF FERMENTATION TIME IN THE

CHARACTERISTICS OF SOURDOUGH BREAD
ABSTRACT
The sourdough is used in the manufacture of a number of bakery

products. The strains used in the preparation of the sourdoughs were
Lactobacillus paracasei and Saccharomyces cerevisiae. Samples of raw
dough were analyzed for pH, titratable acidity and plate counts and
samples of bread were analyzed for pH, titratable acidity and specific
volume. The samples were analyzed in a range of 2 h, between 4 and 10
h of fermentation. At the end of 10 hours of fermentation, the lower
values of pH were for the dough with LP2 and the bread with SC1.
Values titratable acidity were increasing over time, with the highest
levels of acidity of dough and of bread with yeast. Lactic acid bacteria
showed the highest microbial counts over time. With the exception of
SC2, the biggest microbial increases were with 10 hours of
fermentation. LP1 showed the lowest volume in all hours (P < 0.05).
The largest volumes were found in breads were with 6 hours of
fermentation. SC1 showed the best values of specific volume in all
times.
Key words: sourdough, bread, lactic acid bacteria, yeast, linear

regression.
5.1 INTRODUÇÃO
Devido ao aumento da demanda dos consumidores por

produtos naturais, saborosos e saudáveis, a produção do tradicional
processo do fermento natural de pão vem sendo empregada com sucesso
nos últimos anos (BRÜMMER; LORENZ, 1991; THIELE et al., 2002;
LOPEZ et al., 2003). O fermento natural tem sido empregado no
processamento de vários produtos, como pães, bolos e biscoitos (DE
VUYST; GÄNZLE, 2005).
Gocmen et al. (2007) e Thiele et al. (2002) afirmaram que a
aplicação do fermento natural em pães de trigo produz vários efeitos,
incluindo levedação, acidificação, melhoria das propriedades da massa,
flavour, textura, redução da firmeza e do envelhecimento, aumentando a
resistência à deterioração microbiana e melhoria da disponibilidade de
nutrientes nos produtos. Esses benefícios são provenientes das bactérias
láticas (BAL) e leveduras, que estão presentes nos fermentos naturais.
119
A adição do fermento natural ocasiona mudanças nas

propriedades reológicas da massa de trigo, tornando-a macia, menos
elástica e facilmente extensível (CLARKE et al., 2002). A massa deve
conter um grande volume de gás e manter uma reserva para o seu
aumento no forno (BLOKSMA, 1990). Além disso, existem outros
fatores que devem ser considerados, como o tipo de farinha, as
condições de fermentação do fermento natural (pH e temperatura), a
seleção da cultura starter específica e as propriedades metabólicas,
como a produção de compostos voláteis (DE VUYST;
VANCANNEYT, 2007). Nesta pesquisa, foi verificada a influência do
tempo de fermentação no pH, na acidez titulável, na contagem
microbiológica e no volume da massa e dos pães.
5.2.1 Micro-organismos
As bactérias láticas Lactobacillus paracasei (LP1 - 9,4 log

UFC/ g e LP2 - 11,11 log UFC/ g), e as leveduras Saccharomyces
cerevisiae (SC1 - 8,18 log UFC/ g e SC2 - 7,16 log UFC/ g), foram
isoladas do fermento natural de uva, liofilizadas e aplicadas neste
estudo.
Os fermentos naturais foram preparados isoladamente com

cada cepa utilizando 1% de micro-organismos (p/ p base da farinha,
PLESSAS et al., 2008), e fermentado por 48 h.
A massa (M1) foi preparada misturando 60 mL de água com
50 g de farinha de trigo, 0,5g de cultura starter e 0,25 g de NaCl, e
incubadas a 30 °C. Após 24 h de incubação o fermento natural 1 (FN1)
foi obtido. Para formar a massa 2 (M2), foi misturado 100 g de FN1
com 200 g de farinha de trigo e 100 mL de água. Após 24 h de
incubação o fermento natural 2 (FN2) foi formado, de acordo com
Paramithiotis et al. (2005), com modificações.
5.2.3 Análise das massas e dos pães
As amostras da massa crua foram analisadas o pH, a acidez

titulável (ATT) e a contagem em placas. Nas amostras de pão foram
120
analisados o pH, a acidez titulável e o volume. Estas análises foram

realizadas a cada 2 h, entre 4 e 10 h de fermentação.
O pH e a acidez foram verificados utilizando 0,1N NaOH
(IAL, 2004). A ATT foi expressa em mL 0,1N NaOH/ 100g. A
avaliação do crescimento foi determinada pela contagem em placas do
logaritmo do número de células viáveis (log UFC/ g) usando o método
pour plate. Assepticamente, 25 g de cada massa foi misturada com 225
mL de água peptonada estéril (0,1 g 100 g-1) em stomacher (modelo P,
Interscience, St. Nom, França). Foram realizadas as diluições
necessárias de BAL e leveduras, sendo aquelas cultivadas em MRS ágar
a 30 ºC/ 48 h e estas em PDA ágar com ácido tartárico 10 % a 25 ºC/ 72
h. Estes experimentos foram realizados em triplicata.
5.2.4 Processamento dos pães
Os fermentos foram aplicados nos pães, cuja formulação foi

composta de 100 % de farinha de trigo, 20 % de fermento natural
(PARAMITHIOTIS et al., 2005; KATINA et al., 2006a; ROBERT et
al., 2006; PLESSAS et al., 2011), 60 % de água e 1,8 % de sal. Após a
mistura de todos os ingredientes, foram pesados 24 g de cada massa. Em
seguida foram colocadas para fermentar em uma climatizadora (modelo
CFC P-20, Perfecta, Curitiba, Brasil) a 30 ºC por 4, 6, 8 e 10 h (80 %
umidade relativa) e assadas em forno (modelo ventile E-6, Líder,
Araucária, Brasil) a 180 °C por 18 min.
5.2.5 Volume específico
O volume dos pães foi medido usando a metodologia de

deslocamento de sementes descrito por Hallén, İbanoğlu e Ainsworth
(2004). O volume do pão foi medido em um recipiente com volume
conhecido (VC). O recipiente foi coberto com sementes, o pão foi
removido e o volume de sementes anotado (VR). O volume do pão (VL)
foi calculado seguindo a Equação (1).
VL (mL) = VC - VR .................. (1)
Após esfriar 1 h, os mesmos pães foram medidos e pesados

em escala digital (g). O volume específico (VS) do pão foi calculado
seguindo a Equação (2).
VS (mL/ g) = VL/ P ........... (2)

121

Statistica® versão 8.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA). O
comportamento da massa crua e do pão preparado com fermento natural
com LP1, LP2, SC1 e SC2 entre 4 e 10 h de fermentação foi estudado
aplicando o modelo de regressão linear simples, dado por Y= β0+ β1X +
Ɛ, onde X é o tempo de fermentação, em horas. As diferenças entre as
médias foram calculadas através da análise de variância (ANOVA) one-
way utilizando o teste de Tukey. Foram consideradas significativas as
diferenças ao nível de 5 % (P < 0,05).
5.3.1 Avaliação da massa e do pão
As equações estimadas da análise de regressão linear para o

pH, a ATT e a contagem em placas para a massa entre 4 e 10 h de
fermentação estão ilustradas na Figura 1 (A, B e C). O pH, a ATT e o
volume do pão entre 4 e 10 h de fermentação estão ilustrados na Figura
2 (A, B e C).
Os valores do pH da massa e do pão foram reduzindo ao longo
do tempo de fermentação. O pH inicial das massas e dos pães em 4 h de
fermentação variou entre 4,51 e 4,73 ± 0,01 e 4,45 à 4,74 ± 0,01,
respectivamente. Ao final de 10 h de fermentação os menores valores de
pH foram para a massa com LP2 (3,44 ± 0,04) e o pão com SC1 (2,99 ±
0,05). As análises de regressão linear indicaram que as taxas de
decréscimo do pH da massa (Figura 1A) e do pão (Figura 2A) foram
F ao nível de significância de 5 %, onde H0 indica que os coeficientes
angulares são iguais. Na análise do pH da massa foi observado um
coeficiente de determinação maior para as leveduras (SC2: 0,8832; SC1:
0,8723; LP2: 0,8416: LP1: 0,8094), enquanto que no pH dos pães as
BAL tiveram um maior r2 (LP2: 0,9512; LP1: 0,9162; SC1: 0,9061;
SC2: 0,8831). Entre os efeitos mais importantes, o valor do pH exerceu
influência na produção de ácidos orgânicos e nas propriedades
viscoelásticas da massa (WEHRLE; ARENDT, 1998).
Os valores de acidez titulável aumentaram ao longo do tempo.
A massa e o pão preparado com leveduras apresentaram os maiores
teores de acidez. SC2 apresentou a maior produção de acidez da massa
122
em todas as horas (5,08 ± 0,41; 5,52 ± 0,16; 5,68 ± 0,10; 6,51 ± 1,32),
seguida de SC1 (4,70 ± 0,13; 5,19 ± 0,49; 5,52 ± 0,01; 6,42 ± 0,13). As
análises de regressão linear do aumento da acidez titulável das massas
(Figure 1B), através do teste F para contraste dos coeficientes, indicaram
diferenças significativas entre os coeficientes angulares e lineares de
LP2/ SC2 e o coeficiente linear de LP2/ SC1 (P < 0,05). SC1 apresentou
o coeficiente de determinação maior na acidez titulável, seguido por
LP1; SC2 e LP2 (r2 = 0,9564; 0,9459; 0,9225; 0,9080). Para a análise da
acidez titulável dos pães (Figura 2B) houve diferença significativa entre
os coeficientes angular e linear de LP1/ SC1 e SC1/ SC2, coeficiente
angular de LP2/ SC2 e o coeficiente linear de LP2/ SC1 (P < 0,05). O
maior coeficiente de determinação foi de LP1, seguido por LP2; SC2 e
SC1 (r2 = 0,9801; 0,9196; 0,9138; 0,8296).
O processo de acidificação, afetado pela aplicação do
fermento natural, é utilizado principalmente para a melhoria da
qualidade e flavour dos pães de trigo (BRÜMMER; LORENZ, 1991;
KATINA et al., 2006a; ARENDT et al., 2007), além de reduzir o
envelhecimento dos pães (KATINA et al., 2006b; PLESSAS et al.,
2007).
Figura 1 - Evolução do pH (A), acidez titulável (B) e contagem em placas (C)

da massa do pão entre 4 a 10 h de fermentação.
pH A
4,8
: LP1 y = 5,092 - 0,1785*x; r2 = 0,8094

4,6
: LP2 y = 5,037 - 0,176*x; r2 = 0,8416
: SC1 y = 5,04 - 0,17*x; r2 = 0,8723
4,4 : SC2 y = 5,325 - 0,185*x; r2 = 0,8832
4,2
4,0
pH
3,8
3,6
3,4
3,2
0 2 4 6 8 10 12
T empo (horas)
123
Acidez titulável B
7,0
6,5 : LP1 y = 2,64 + 0,2975*x; r2 = 0,9459

: LP2 y = 1,38 + 0,4575*x; r2 = 0,9080
: SC1 y = 3,536 + 0,2745*x; r2 = 0,9564
6,0
: SC2 y = 4,14 + 0,2225*x; r2 = 0,9225
5,5
mL 0,1N NaOH/ 100g
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
0 2 4 6 8 10
T empo (horas)
Contagem em placas C
9,2
9,0
8,8
8,6
8,4
8,2
8,0
log UFC/ g
7,8
7,6
7,4
7,2
7,0
6,8 : LP1 y = 7,815 + 0,09*x; r2 = 0,9262
: LP2 y = 7,923 + 0,106*x; r2 = 0,8942
6,6 : SC1 y = 5,432 + 0,2615*x; r2 = 0,9674
6,4 : SC2 y = 6,471 + 0,107*x; r2 = 0,8255
6,2
0 2 4 6 8 10
T empo (horas)

As BAL apresentaram as maiores contagens ao longo do
período analisado. Com exceção da SC2, os maiores crescimentos
124
microbianos foram com 10 h de fermentação, sendo o maior valor para

LP2 com 8,91 log UFC/ g, seguido de LP1 com 8,66 log UFC/ g e SC1
com 8,03 log UFC/ g. Nessa mesma hora, SC2 apresentou uma queda de
0,21 log UFC/ g. Com 6 h de fermentação, LP2 obteve 8,66 log UFC/ g
e LP1 8,33 log UFC/ g. As leveduras apresentaram 7,18 log UFC/ g para
SC1 e 7,08 log UFC/ g para SC2.
Edema e Sanni (2008) estudaram as contagens de colônias de
BAL e leveduras durante a fermentação espontânea de farinha de milho.
As contagens de BAL aumentaram de 4,62 log UFC/ g no tempo inicial
(0 h) para 6,45 log UFC/ g após 48 horas de fermentação, enquanto a
contagens de leveduras aumentaram de 4,18 para 6,64 log UFC/ g no
mesmo período.
Para contagem em placas (Figura 1C), a análise de regressão
indicou que os coeficientes angulares e lineares de LP1/ LP2 foram
estatisticamente iguais (P > 0,05), assim como os coeficientes lineares
de LP1/ SC2 e LP2/ SC2. Todos os outros contrastes obtiveram
diferença estatística entre os tratamentos (P < 0,05). O maior coeficiente
de determinação (r2) na contagem em placas foi de SC1, com 0,9674,
significando que o ajuste da regressão explica 96,74 % da variação total
de Y, com apenas 3,26 % para a variação residual (erro), o que é
considerado um bom ajuste.
Figura 2 - Evolução do pH (A), acidez titulável (B) e volume específico (C) dos
pães entre 4 a 10 h de fermentação.
pH A
5,0
4,8
4,6
4,4
4,2
4,0
pH
3,8
3,6
3,4
: LP1 y = 5,365 - 0,1975*x; r2 = 0,9162
3,2 : LP2 y = 5,519 - 0,2245*x; r2 = 0,9512
: SC1 y = 5,611 - 0,243*x; r2 = 0,9061
3,0 : SC2 y = 5,814 - 0,252*x; r2 = 0,8831
2,8
0 2 4 6 8 10
T empo (horas)
125
Acidez titulável
B
7,0
6,5 : LP1 y = 2,573 + 0,1635*x; r2 = 0,9801

: LP2 y = 1,61 + 0,3325*x; r2 = 0,9196
: SC1 y = 4,226 + 0,112*x; r2 = 0,8296
6,0 : SC2 y = 2,646 + 0,362*x; r2 = 0,9138
5,5
mL 0,1N NaOH/ 100g
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
0 2 4 6 8 10
T empo (horas)
Volume específico
C
2,8
2,6
: LP1 y = 1,279 - 0,0245*x; r2 = 0,7758
: LP2 y = 1,898 - 0,0315*x; r2 = 0,7670
2,4
: SC1 y = 2,842 - 0,031*x; r2 = 0,7975
: SC2 y = 2,261 - 0,0155*x; r2 = 0,7909
2,2
2,0
mL/ g
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0 2 4 6 8 10
T empo (horas)

126
A análise de regressão do volume específico (Figura 2C)

indicou que todos os coeficientes lineares são estatisticamente diferentes
(P < 0,05). Os maiores coeficientes de determinação (r2) foram para as
leveduras SC1 e SC2 (0,7975; 0,7909).
Os Lactobacillus podem ser divididos em três grupos, tendo
como critério o produto final de sua fermentação: Lactobacillus
termofílicos homofermentativos obrigatórios, que fermentam apenas
hexoses e ácido lático (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis e Lactobacillus helveticus);
Lactobacillus mesofílicos heterofermentativos facultativos, que são
capazes de fermentar outras fontes de carbono além das hexoses,
produzindo ácidos orgânicos, CO2, álcool e H2O2 (Lactobacillus casei,
Lactobacillus paracasei e Lactobacillus plantarum); e Lactobacillus
mesofílicos heterofermentativos obrigatórios, que utilizam
obrigatoriamente hexoses e pentoses como fonte de carbono,
fermentando hexose a ácido lático, ácido acético, etanol e CO2, e
pentoses a ácido lático e ácido acético (Lactobacillus brevis,
Lactobacillus fermentum) (FOX et al., 2000).
LP1 apresentou menor volume em todas as horas (P < 0,05).
Os maiores volumes encontrados nos pães foram com 6 h de
fermentação (Tabela 1). SC1 apresentou melhores resultados em todos
os tempos, seguido de SC2. SC1 obteve, com 6 h de fermentação, o
maior resultado, com 2,71 mL/ g (P < 0,05). Saccharomyces cerevisiae é
usada no preparo de pães devido a sua capacidade de formar uma massa
com estrutura e de reter gás. A partir de 6 h de fermentação pode ser
observada uma influência inversamente proporcional entre o aumento da
acidez titulável e a queda do volume ao longo do tempo.
Tabela 1 – Volume específico de pães com aproximadamente 24 g de massa

crua (mL/ g).
Amostras 4h 6h 8h 10h
LP1 1,15 ± 0,03a 1,18 ± 0,04a 1,08 ± 0,04 a
1,02 ± 0,03a
b a,b
LP2 1,73 ± 0,15 1,76 ± 0,10 1,67 ± 0,07b
1,55 ± 0,08b
SC1 2,68 ± 0,08d 2,71 ± 0,22c 2,60 ± 0,10d 2,51 ± 0,17d
SC2 2,18 ± 0,03c 2,19 ± 0,37b,c 2,15 ± 0,09c 2,09 ± 0,07c
Resultados como média de triplicatas ± desvio padrão.
a-d
Diferença de letras sobrescritas na mesma coluna indicam diferença entre as
amostras (Teste de Tukey, p < 0,05).
127
Sanz-Penella et al. (2012) aplicaram Bifidobacteria

pseudocatenulatum como cultura starter no fermento natural, e
relataram que com a utilização de 20 % deste fermento no pão
obtiveram o valor de ATT de 9,23 ± 0,32 mL NaOH 0,1N/ 100g e pH
de 4,57 ± 0,11. Prepararam outro pão adicionado esta BAL e levedura
comercial, e a ATT passou 10,60 ± 0,41 mL NaOH 0,1N/ 100g e o pH
para 4,96 ± 0,06. As amostras com 20 % de fermento natural
apresentaram volume específico de 2,22 ± 0,12 mL/ g. Crowley et al.
(2002) relataram que o volume específico do pão aumentou
significativamente na formulação contendo 20 % de fermento natural
(3,40 ± 0,08 mL/ g).
Collar et al. (1994) desenvolveram pães usando alta
porcentagem de fermento com L. plantarum e L. brevis. A acidificação
do fermento e a parcial acidificação da massa do pão impactou na
estrutura dos componentes, como o glúten e o amido. Durante a
incubação do fermento natural e da massa do pão ocorreram mudanças
bioquímicas nos carboidratos e nas proteínas da farinha devido à ação de
enzimas endógenas e microbianas (ROLLAN et al., 2005). Arendt et al.
(2007) afirmaram que existe um considerável consenso entre várias
pesquisas sobre os efeitos positivos da adição do fermento natural sobre
a estrutura do miolo e do volume do pão.
5.4 CONCLUSÃO
Os valores do pH da massa e do pão foram reduzindo ao longo

do tempo de fermentação. Saccharomyces cerevisiae 2 apresentou a
maior produção de acidez da massa em todas as horas estudadas. As
BAL apresentaram as maiores contagens microbiológicas na massa crua
entre 4 e 10 h. Lactobacillus paracasei 1 apresentou o menor volume
específico em todas as horas (P < 0,05). O melhor tempo de fermentação
dos pães considerado nesta pesquisa foi de 6 h, por apresentar os
maiores volumes.
AGRADECIMENTOS

financeiro.
128
REFERÊNCIAS

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131
CAPÍTULO 6
EFEITO DA INCORPORAÇÃO DE DIFERENTES CULTURAS

LIOFILIZADAS NAS PROPRIEDADES DO PÃO COM
FERMENTO NATURAL
RESUMO
No processamento do pão com fermento natural foi analisada a adição

de cepas de Lactobacillus paracasei (LP1 e LP2) e de Saccharomyces
cerevisiae (SC1 e SC2) como cultura starter. Foram avaliadas as
propriedades físico-químicas, microbiológicas, de volume, textura, cor,
microestrutura e sensorial. Pães produzidos com fermento natural
adicionado de LP1/ SC2 tiveram menor pH e a maior acidez foi para
SC1 (P < 0,05). O volume específico foi negativamente afetado pela
adição de LP1 na formulação. O maior volume específico obtido foi
para os pães com SC1. Pães com LP2 ou tratamentos combinados (LP2/
SC1 e LP2/ SC2) tiveram melhor maciez do miolo que amostras com
LP1 ou suas combinações (LP1/ SC1 e LP1/ SC2). Entretanto, o pão
com LP1 foi significativamente mais firme e apresentou crosta mais
clara que as outras amostras. A massa com SC1 apresentou uma rede de
glúten firme, com superfície uniforme. As melhores notas da análise
sensorial foram encontradas em pães contendo LP2/ SC1 na formulação
(P < 0,05).
Palavras-chave: pão, fermento natural, firmeza, produção de gás,

glúten.
EFFECT OF THE INCORPORATION OF DIFFERENT

FREEZE-DRIED CULTURES ON THE PROPERTIES OF
SOURDOUGH BREAD
ABSTRACT
The application of strains of Lactobacillus paracasei (LP1 and LP2) and

Saccharomyces cerevisiae (SC1 and SC2) as starter cultures for
sourdough breadmaking was analyzed. The physicochemical,
microbiologial, specific volume, texture, color, microstructural and
sensorial properties of sourdough bread were evaluated. The breads that
were produced using the LP1/ SC2 sourdough process had low pH
levels and the highest acidity was for SC1 (P < 0,05). The specific
132
volume was negatively affected by the addition of LP1 in the

formulation. The highest specific volume obtained was for breads made
with SC1. Breads made with LP2 or with a combination treatment (LP2/
SC1 and LP2/ SC2) had improved crumb softness relative to samples
with LP1 or with a combination treatment (LP1/ SC1 and LP1/ SC2).
However, LP1 sourdough bread was significantly harder and had a
lighter-colored crust than other samples. The dough with SC1 presented
a firm gluten matrix and a uniform surface. The best scores for sensory
analysis were found in breads containing LP2/ SC1 in formulation (P <
0.05).
Key words: bread, sourdough, firmness, gas production, gluten.
6.1 INTRODUÇÃO
Produtos de panificação e suas técnicas de produção diferem

amplamente em todo o mundo (CHAVAN; CHAVAN, 2011). O
fermento natural é uma mistura de farinha e água, fermentado por
bactérias láticas (BAL) e leveduras (HANSEN, 2006), aplicado no
processamento de panificáveis de qualidade (VERA et al., 2012).
O alto valor nutricional do fermento natural e a preferência
pelo consumo pode ser atribuída às características sensoriais e ao
aumento da vida de prateleira quando comparado ao pão com levedura
comercial (KATINA et al., 2002; MESSENS; DE VUYST, 2002). A
adição de fermento natural durante a produção de pães de trigo provoca
mudanças nas características da massa (CLARKE; SCHOBER;
ARENDT, 2002; CLARKE et al., 2004; KETABI et al., 2008). O fator
positivo da utilização do fermento natural é atribuído à microbiota, que
forma um ecossistema único, consistente em BAL e leveduras
(PARAMITHIOTIS; TSIASIOTOU; DROSINOS, 2010).
A qualidade do produto panificável depende do teor de
proteína, do volume, da qualidade do miolo e da textura do pão
(UPADHYAY; GHOSAL; MEHRA, 2012). Os principais componentes
da farinha, como o glúten e o amido, exercem forte influência nas
propriedades do produto final, mas a presença de gás nas células
também é essencial (WILDE, 2003). A adição de fermento natural pode
modificar a maquinabilidade e a funcionalidade da massa (ROBERT et
al., 2006). Assim, várias culturas starters têm sido aplicadas no preparo
do pão com fermento natural visando o aumento da vida de prateleira e a
melhoria das características sensoriais (PLESSAS et al., 2011).
133
Culturas starters específicas de fermento natural, fermento

natural ativo ou micro-organismos liofilizados são usadas para iniciar a
fermentação com a microflora necessária (BRANDT, 2007). Os níveis
de BAL são maiores que 8 log UFC/ g e a proporção é geralmente na
razão de 100:1 de BAL para leveduras (HANSEN, 2006). Nos pães com
este fermento, BAL produzem menores concentrações de compostos
voláteis que as leveduras e são, principalmente, responsáveis pela
acidificação da massa. As leveduras são responsáveis pela produção de
compostos do flavour (MEIGNEN et al., 2001). Além disso, BAL
contribuem no aspecto sabor, textura e vida de prateleira, além da sua
capacidade antifúngica devido à formação de bacteriocinas (PLESSAS
et al., 2007). As propriedades metabólicas das BAL são específicas de
cada cepa, por isso a seleção da cultura starter é fundamental para o
processamento do pão com fermento natural (CHOI et al., 2012).
O objetivo deste estudo foi avaliar a incorporação de cepas de
Lactobacillus paracasei (LP1 e LP2) e de Saccharomyces cerevisiae
(SC1 e SC2) e nas propriedades físico-químicas, microbiológicas, de
volume, textura, cor, microestrutura e sensorial em pães.
6.2.1 Micro-organismos
A BAL heterofermentativa facultativa Lactobacillus

paracasei (LP1 - 9,4 log UFC/ g e LP2 - 11,11 log UFC / g) e a levedura
Saccharomyces cerevisiae (SC1 - 8,18 log UFC/ g e SC2 - 7,16 log
UFC/ g), foram isoladas do fermento natural de uva, caracterizadas
fenotipicamente e genotipicamente, liofilizadas e aplicadas neste estudo.
Para a preparação do fermento natural foi utilizado 1% de

micro-organismos (p/ p base da farinha) (PLESSAS et al., 2008)
fermentado por 48 h. Foram preparadas oito formulações de fermento
natural com micro-organismos individuais (LP1, LP2, SC1 e SC2) e
culturas mistas na proporção de 1:1 de bactéria lática e levedura (LP1/
SC1, LP1/ SC2, LP2/ SC1 e LP2/ SC2).
A massa 1 (D1) foi preparada misturando-se 60 mL de água
com 50 g de farinha de trigo, 0,5 g de cultura starter e 0,25 g de NaCl, e
incubadas a 30 °C. Após 24 h de incubação o fermento natural 1 (FN1)
foi obtido. Para formar a massa 2 (M2), foi misturado 100 g de FN1
134
com 200 g de farinha de trigo e 100 mL de água. Após 24 h de

incubação o fermento natural 2 (FN2) foi formado, de acordo com
Paramithiotis et al. (2005), com modificações.
6.2.3 Processamento do pão
Os fermentos foram aplicados nos pães, cuja formulação foi

composta de 100 % de farinha de trigo, 20 % de fermento natural
(PARAMITHIOTIS et al., 2005; KATINA et al., 2006a; ROBERT et
al., 2006; PLESSAS et al., 2011), 60 % de água e 1,8 % de sal.
Para a mistura dos ingredientes, foi utilizada uma masseira
(modelo ARES 25N, Haas, Curitiba, Brasil) por aproximadamente 12
min. Foram pesadas 450g de massa, e, em seguida, foram
acondicionadas em formas com tampa, fermentadas em uma
climatizadora (modelo CFC P-20, Perfecta, Curitiba, Brasil) a 30 ºC por
6 h (80 % umidade relativa) e assadas em forno (modelo ventile E-6,
Líder, Araucária, Brasil) a 180 °C por 40 min.
6.2.4 Propriedades físico-químicas e microbiológicas dos pães
As amostras dos pães foram analisadas quanto à umidade,

cinzas e gordura, como descrito pelas Normas Analíticas do Instituto
Adolfo Lutz (IAL, 2004). O teor proteico foi estimado através da
determinação do nitrogênio total pelo método Kjeldahl de acordo com
AOAC (2005). O valor do pH foi determinado com o pHmetro (modelo
Q - 400ª, Quimis, Diadema, Brasil), e a acidez titulável (ATT) foi
determinada de acordo com IAL (2004). Nas amostras dos pães também
foram analisados coliformes a 45 °C e Salmonella sp (APHA, 2001). Os
experimentos foram realizados em triplicata.
6.2.5 Volume específico, perda de umidade e umidade do miolo
O volume dos pães foi medido usando a metodologia de

deslocamento de sementes descrito por Hallén; İbanoğlu e Ainsworth
(2004). O volume do pão foi medido em um recipiente com volume
conhecido (VC). O recipiente foi coberto com sementes, o pão foi
removido e o volume de sementes anotado (VR). O volume do pão (VL)
foi calculado seguindo a Equação (1).
VL (mL) = VC - VR (1)
135
Após esfriar 1 h, os mesmos pães foram medidos e pesados

em escala digital (g). O volume específico (VS) do pão foi calculado
seguindo a Equação (2).
VS (mL/ g) = VL/ P (2)
A perda de umidade foi medida deduzindo o peso do pão

assado do peso inicial da massa antes do assamento (PLESSAS et al.,
2007). O teor de umidade do miolo dos pães foi analisado por três dias
seguidos, de acordo com IAL (2004). Os experimentos foram realizados
em triplicata.
6.2.6 Análise de textura
A firmeza do miolo foi medida 12 h após o assamento dos

pães e foi determinada como a força de compressão máxima (40 %
compressão) usando um texturômetro modelo TA-XT plus (Stable
Micro Systems, Texture Exponent software, Surrey, UK) e um probe
cilíndrico com 36 mm de diâmetro. Oito amostras de cada formulação
de pão foram medidas e os resultados foram expressos como média ±
desvio padrão. A medida de cada fatia foi de 2,5 cm, e as bordas das
fatias foram cortadas antes das medições (adaptado de KATINA et al.,
2006b). O pico máximo de força (g) foi medido através da curva de
penetração, resultando na firmeza do miolo.
6.2.7 Análise de cor
A análise da cor foi realizada na crosta e no miolo, utilizando

o colorímetro Minolta Chroma Meter (CR - 400, Konica Minolta,
Osaka, Japão), ajustado para operar com D65 de luz e 10° de ângulo de
observação. A escala de cor CIELab foi usada para medir os parâmetros
L*, a* e b*. Na escala de cor CIELab o parâmetro L* varia de 0 a 100,
indicando a variação de cor do preto ao branco; o eixo a* demonstra a
variação do vermelho (+ a*) ao verde (- a*); o eixo b* demonstra a
variação do amarelo (+ b*) ao azul (- b*). A medida de cor da crosta e
do miolo de cada formulação foi repetida oito vezes.
6.2.8 Propriedade de microestrutura
As amostras de pães foram preparadas para a microscopia

eletrônica de varredura (MEV) pelo método adaptado de Kim et al.
136
(2003). Após o assamento as amostras foram congeladas (- 20 °C) e

desidratadas no liofilizador (modelo LT1000, Terroni, São Carlos,
Brasil) por 6 h a 90 µHg a vácuo. As amostras liofilizadas dos pães
foram quebradas em tamanhos aproximados de 0,5 x 0,5 x 0,5 cm
usando uma faca e recobertas com ouro. O microscópio eletrônico de
varredura (JSM – 3690LV, Jeol, Tóquio, Japão) foi usado a 10 kV na
magnificação de 1500 x.
A análise sensorial foi realizada de acordo com a metodologia

descrita por Meilgaard; Civille e Carr (2007). O teste de aceitabilidade
foi aplicado a um grupo de julgadores não treinados (n = 50), utilizando
a escala hedônica estruturada de nove pontos (1 - desgostei
extremamente; 9 - gostei extremamente). Foi aplicado um questionário
para se obter informações sobre os julgadores. A pesquisa foi aprovada
pelo Comitê de Ética em Pesquisas com Seres Humanos da UFSC sob o
número 876/ 10.

Statistica® versão 8.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA). As diferenças
entre as médias foram calculadas através da análise de variância one-
way (ANOVA) com o teste de Tukey. Foram consideradas significativas
as diferenças ao nível de 5 % (P < 0,05).
6.3.1 Características físico-químicas e microbiológicas
Os resultados físico-químicos dos pães estão apresentados na

Tabela 1. Os teores de umidade dos pães foram próximos dos obtidos
por Sanz-Penella; Tamayo-Ramos e Haros (2012).
Todos os pães produzidos por culturas starters individuais
tiveram valores de pH significativamente iguais. Plessas et al. (2011)
reportaram que os pães preparados com cultura mista de Lactobacillus
acidophilus (10 %) e Lactobacillus sakei (10 %) apresentaram pH de
3,9. No entanto, nesta pesquisa, os pães produzidos com fermento com
LP1 tiveram menor ATT (P < 0,05). Moore; Dal Bello, Arendt (2008)
relataram que o valor da ATT do fermento natural com Lactobacillus
137
plantarum foi maior (5,61) que os fermentos preparados com

Lactobacillus sanfranciscensis (5,31).
Análises microbiológicas de coliformes a 45 °C e Salmonella
sp apresentaram resultados de acordo com os padrões exigidos pela
legislação.
138
Tabela 1 - Resultados físico-químicos dos pães com fermento natural.

Umidade (% Cinzas Gordura Proteína ATT
Amostras p/p) (% p/p) (% p/p) (% p/p) pH (mL NaOH/ 100g)
LP1 38,95 ± 0,03a 1,22 ± 0,03a 1,02 ± 0,00a 8,07 ± 0,04a 4,29 ± 0,04d 4,32 ± 0,00ab
LP2 38,79 ± 1,20a 1,20 ± 0,00a 1,11 ± 0,05a 8,98 ± 0,08a 4,23 ± 0,00d 3,63 ± 0,13a
SC1 36,91 ± 0,08a 1,45 ± 0,01a 1,15 ± 0,05a 7,76 ± 0,37a 4,24 ± 0,01d 5,07 ± 0,04c
SC2 42,82 ± 0,36a 1,35 ± 0,01a 0,89 ± 0,05a 6,95 ± 0,05a 4,23 ± 0,00d 4,83 ± 0,49bc
LP1/ SC1 35,77 ± 0,25a 1,59 ± 0,00a 1,19 ± 0,05a 7,52 ± 0,24a 4,11 ± 0,01c 4,76 ± 0,04bc
LP1/ SC2 37,16 ± 0,02a 1,59 ± 0,01a 1,07 ± 0,02a 7,49 ± 0,33a 3,91 ± 0,01a 4,63 ± 0,01bc
LP2/ SC1 36,35 ± 0,01a 1,64 ± 0,01a 1,13 ± 0,10a 7,57 ± 0,04a 4,14 ± 0,02c 4,96 ± 0,06bc
LP2/ SC2 37,56 ± 0,18a 1,65 ± 0,01a 1,10 ± 0,13a 7,36 ± 0,08a 4,03 ± 0,02b 4,63 ± 0,03bc
Resultados como média ± desvio padrão. a-c Letras diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferença significativa entre
os tratamentos (Teste de Tukey P < 0, 05).
139
6.3.2 Avaliação do volume específico, da perda de umidade e da

umidade do miolo
Os resultados das análises de volume e umidade estão

apresentados na Tabela 2. Segundo Delcour e Hoseney (2010) o volume
do pão depende da capacidade da massa em reter o gás por um tempo
prolongado durante a fermentação e o cozimento. O volume específico
dos pães foi negativamente afetado pela adição de LP1 na formulação. O
maior volume específico obtido entre os pães foi com SC1.
A produção de gás na fermentação da massa é um parâmetro
essencial na formação da estrutura da massa do pão. Os resultados do
volume específico estão de acordo com Plessas et al. (2007), que
encontraram valores de 1,9 mL/ g para levedura comercial e 2,1 mL/ g
para pão com kefir. Sanz-Penella; Tamayo-Ramos e Haros (2012)
também obtiveram resultados próximos, utilizando 20 % de fermento
natural preparado com Bifidobacteria pseudocatenulatum, apresentando
um volume específico significativamente menor que o controle, com
2,22 mL/ g.
140
Tabela 2 - Características dos pães produzidos com fermento natural com LP1, LP2, SC1, SC2 e culturas mistas.
Volume Perda de
Amostras específico (mL/ g) umidade (g) Umidade do miolo (g H2O/ g)
1° Dia 2 ° Dia 3° Dia
LP1 1,18 ± 0,04a 4,40 ± 0,17ab 0,396 ± 0,00a 0,380 ± 0,00a 0,368 ± 0,00a
LP2 1,62 ± 0,38abc 4,19 ± 0,81a 0,433 ± 0,00a 0,422 ± 0,00a 0,397 ± 0,00a
SC1 2,71 ± 0,22d 5,60 ± 0,51ab 0,415 ± 0,01a 0,411 ± 0,01a 0,396 ± 0,01a
SC2 2,19 ± 0,37cd 5,96 ± 0,74b 0,416 ± 0,01a 0,411 ± 0,00a 0,387 ± 0,01a
LP1/ SC1 1,42 ± 0,13ab 5,04 ± 0,32ab 0,424 ± 0,01a 0,419 ± 0,00a 0,388 ± 0,00a
LP1/ SC2 1,40 ± 0,20ab 5,35 ± 0,23ab 0,425 ± 0,00a 0,403 ± 0,01a 0,401 ± 0,01a
LP2/ SC1 2,04 ± 0,12bc 4,70 ± 0,06ab 0,414 ± 0,00a 0,411 ± 0,00a 0,400 ± 0,00a
LP2/ SC2 1,76 ± 0,10abc 4,66 ± 0,88ab 0,421 ± 0,00a 0,415 ± 0,01a 0,408 ± 0,02a
Resultados como média ± desvio padrão. a-d Letras diferentes sobrescritas na mesma coluna
indicam diferença significativa entre os tratamentos (Teste de Tukey P < 0, 05).
141
Quanto à perda de umidade, as amostras preparadas com LP2 e

SC2 retiveram, respectivamente, mais e menos umidade após o
assamento. A menor perda de umidade do miolo, com 0,72 %, foi para
LP2/ SC1 após 2 dias. Pães fermentados com LP2/ SC2 mantiveram as
características de umidade por mais tempo. A umidade do miolo para
SC1 reduziu 0,96 % em 2 dias e 4,58 % após 3 dias (Tabela 2). Plessas
et al. (2005) reportaram que o pão com levedura comercial obteve
redução da umidade do miolo em 15 % após 3 dias e 35 % após 5 dias.
O envelhecimento do pão após 3 dias foi observado para LP1/ SC1 e
LP2.
6.3.3 Firmeza do miolo
A firmeza do miolo dos pães está ilustrada na Figura 1. Pães

com LP2 ou tratamentos combinados (LP2/ SC1 e LP2/ SC2) tiveram
miolos mais macios que com LP1 e tratamentos combinados (LP1/ SC1
e LP1/ SC2). No entanto, o pão com LP1 foi significativamente mais
duro que as outras amostras. Wehrle; Grau e Arendt (1997) sugerem que
a mudança no valor do pH causada pela produção de ácido lático
também influenciam as propriedades da massa.
Os miolos dos pães somente com leveduras (SC1 e SC2)
foram significativamente mais macios que os pães com somente BAL
(LP1 e LP2) na composição. O miolo do pão da amostra com SC1
tiveram os melhores resultados de maciez (P < 0,05).
Rizzello et al. (2010) elaboraram fermento natural com
gérmen de trigo e observaram que o pico da força requerida para o pão
foi de 2381 g. Carr e Tadini (2003) obtiveram valores de firmeza de
5602 g para o pão francês. Coda; Rizzello e Gobbetti (2010) prepararam
fermento com Lactobacillus plantarum e leveduras usando 50 % de
fermento na sua formulação e observaram maior firmeza (5189 g),
valores próximos de volume específico (1,83 mL/ g) e menor brilho
(46,66) que neste estudo. Moore; Dal Bello e Arendt (2008) estudaram
fermento preparado com Lactobacillus plantarum e Lactobacillus
sanfranciscensis em pães sem glúten e relataram que após o assamento,
a firmeza do miolo foi estatisticamente igual.
142
Figura 1 - Efeito dos micro-organismos na firmeza do miolo dos pães.

6.3.4 Análise de cor
Esteller et al. (2006) afirmam que a cor é uma importante

característica de produtos de panificação, pois junto com a textura e com
o aroma, contribui para a preferência do consumidor. As análises de cor
da crosta e do miolo estão apresentadas na Tabela 3. A cor da crosta do
pão com LP1/ SC2 foi significativamente mais escura que as demais
amostras. Pães com LP1 apresentaram maior brilho da crosta, com
tendência levemente para o verde e amarelo. Consumidores de pães têm
preferência por produtos com miolo mais claro, que pode ser obtido
utilizando LP2, que também apresenta uma coloração ao verde.
A cor do miolo de SC1, LP1/ SC1, LP1/ SC2 e LP2/ SC1
apresentaram, significativamente, o mesmo brilho. A diferença de cor
encontrada na casca e no miolo está relacionada a fermentação dos
diferentes micro-organismos utilizados na preparação do fermento.
Komlenić et al. (2010) relataram que a adição de fermento
natural seco reduziu significativamente o brilho e aumentou a tendência
ao amarelo e vermelho do miolo, quando comparado ao fermento com
Lactobacillus brevis.
143
Tabela 3 - Resultados de determinação da cor (L*, b*, a*) na crosta e no miolo dos pães com diferentes micro-organismos.
Crosta Miolo
Micro-
organismos L* a* b* L* a* b*
e a d ab f
LP1 61,89 ± 1,55 7,20 ± 1,19 33,92 ± 1,96 65,62 ± 1,34 0,71 ± 0,04 13,98 ± 0,24d
LP2 54,69 ± 1,31c 12,24 ± 0,61cd 30,84 ± 1,02abc 70,66 ± 1,19d 0,43 ± 0,06e 13,07 ± 0,57bc
SC1 57,29 ± 1,77d 11,26 ± 0,62c 32,08 ± 1,15cd 67,59 ± 1,18c -0,31 ± 0,11a 14,24 ± 0,60d
SC2 59,18 ± 1,05d 9,33 ± 0,75b 29,29 ± 0,92a 64,53 ± 0,92a -0,05 ± 0,07b 11,71 ± 0,61a
LP1/ SC1 52,69 ± 1,59abc 13,63 ± 0,66e 31,64 ± 0,66bc 68,64 ± 1,21c 0,12 ± 0,11c 15,22 ± 0,25e
LP1/ SC2 50,82 ± 1,86a 13,56 ± 1,36de 31,54 ± 1,32bc 68,05 ± 1,04c 0,30 ± 0,10de 13,71 ± 0,26cd
LP2/ SC1 54,02 ± 1,79bc 11,51 ± 0,66c 29,47 ± 1,31a 68,59 ± 1,28c 0,11 ± 0,10c 13,72 ± 0,29cd
LP2/ SC2 51,87 ± 1,83ab 12,05 ± 0,69c 29,82 ± 0,98ab 67,20 ± 1,27bc 0,21 ± 0,07cd 12,90 ± 0,26b
Resultados como média ± desvio padrão. a-f Letras diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferença significativa entre
os tratamentos (Teste de Tukey, P < 0, 05).
144
6.3.5 Microestrutura da massa dos pães
A microestrutura das amostras dos pães com diferentes micro-

organismos está ilustrada nas Figuras 2 (A-H). De acordo com Kim et
al. (2003), durante a fermentação os amidos incham e a massa retém gás
nas células. As membranas entre as células de gás precisam ser capazes
de sustentar grandes extensões sem ruptura. Assim, a ruptura das
membranas exteriores causa perda de gás, reduzindo o volume do pão,
como pode ser observado na Figura 2 A.
A Fig. 2 (B) mostra menos erupção de bolhas de gás e muitos
grânulos de amido inchados aparecem na superfície, enquanto na Fig. 2
(C) a massa com SC1 apresenta um rede de glúten normal, com uma
superfície uniforme. Os grânulos de amido estão distribuídos na matriz
protéica. Além disso, a massa com SC2 (Fig. 2D) e LP2/ SC1 (Fig. 2G)
tem um rede de glúten descontínua quando comparada à massa com SC.
Sroan; Bean e Macritchie (2009) afirmaram que durante o
crescimento da massa a rede de glúten-amido em torno das células de
gás expande, devido ao excesso de pressão produzido naquelas células,
por difusão de dióxido de carbono, tendo em vista a expansão térmica
dos gases durante o cozimento. Nas Figuras 2 (E) e (F) a superfície é
coberta com numerosas erupções de bolhas de gás e por uma rede de
glúten menos coesa. A Figura 2 (H) ilustra os grânulos de amido
dispersos no interior da proteína.
Upadhyay, Ghosal e Mehra (2012) compararam o tamanho
das bolhas de gás e a sua distribuição usando diferentes concentrações
de leveduras (2, 5 e 10 %), e relataram que o aumento na concentração
da levedura tornam as bolhas menores.
145
Figura 2 - Micrografia (magnificação = x 1500) dos miolos dos pães produzidos

com: LP1 (A); LP2 (B); SC1 (C); SC2 (D); LP1/ SC1 (E); LP1/ SC2 (F); LP2/
SC1 (G); LP2/ SC2 (H).
A B
C D
E F
146
G H

No teste sensorial, 76 % dos julgadores foram mulheres. A

totalidade dos julgadores foi classificada como grandes consumidores de
pão, pois 32 % relataram consumir três ou mais vezes ao dia, 42 % duas
vezes e 18 % uma vez ao dia.
Os pães com LP1 não foram submetidos à análise sensorial
por apresentarem baixo volume específico, massa muito firme e cor da
casca com mais brilho (P < 0,05). Lactobacillus paracasei é uma
bactéria lática classificada como heterofermentativa facultativa (FOX et
al., 2000) e não produziu quantidade suficiente de gás.
A partir dos valores das médias dos pães obtidas pelo teste de
aceitação, foi verificada a ausência de diferença significativa entre as
amostras com SC1, SC2, LP1/ SC1 e LP2/ SC2. As melhores notas
sensoriais foram para os pães produzidos somente com LP2/ SC1 na
formulação (P < 0,05). Os resultados do teste de aceitabilidade foram
analisados com o teste de Tukey e estão ilustrados na Figura 3.
Os resultados obtidos por Plessas et al. (2008) mostraram que
culturas starters mistas de Kluyveromyces marxianus e Lactobacillus
bulgaricus ou Lactobacillus helveticus podem ser usadas na produção de
pães, pois tiveram a melhor avaliação sensorial. Robert et al. (2006)
observaram que a utilização de cepas de Leuconostoc sp ou
Lactobacillus plantarum na produção de pães tiveram resultados
satisfatórios de aceitação.
147
Figura 3 - Notas atribuídas no teste de aceitabilidade.
Escala hedônica: 1 - desgostei extremamente; 9 - gostei extremamente.

As notas atribuídas pelos julgadores no teste de aceitabilidade

variaram entre “indiferente e gostei regularmente”. Os resultados podem
estar relacionados à elevada acidez dos pães aliada à falta de hábito dos
julgadores em consumir produtos com essa característica.
6.4 CONCLUSÃO
Os resultados desta pesquisa mostram que as culturas starters,

utilizadas de forma individual ou mista, foram capazes de produzir pães
com características diferentes.
A aplicação individual de Lactobacillus paracasei 1 não
apresentou êxito nos resultados, porém quando utilizada em conjunto
com Saccharomyces cerevisiae 1 teve uma boa aceitação sensorial. O
melhor resultado sensorial foi para a cultura mista de Lactobacillus
paracasei 2 e Saccharomyces cerevisiae 1.
A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura muito utilizada
no preparo de pães, pois atua como agente levedante fornecendo volume
à massa. Os melhores resultados da análise de volume específico,
textura do miolo e de formação da rede do glúten foram para
148
Saccharomyces cerevisiae 1. Essa pesquisa, mais uma vez, comprovou

as vantagens da utilização desta levedura no processamento de pães.
AGRADECIMENTOS

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio
financeiro e ao LCME-UFSC pelo uso do microscópio eletrônico de
varredura (MEV).
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153
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados desta pesquisa indicam que o uso de diferentes

substratos, na produção do fermento natural, proporciona pães com
características diferenciadas. Embora muito utilizada atualmente, a
aplicação da técnica da fermentação espontânea é um processo antigo. A
contra indicação decorre, basicamente, de dois fatores: 1) falta de
padronização do produto final, devido à falta de controle sobre a
microbiota e, 2) necessidade de emprego diário de mão de obra e
insumos para a sua manutenção.
Este estudo permitiu isolar e identificar quatro
microrganismos de um fermento natural de uva para aplicação no
desenvolvimento do fermento natural. A caracterização fenotípica e
genotípica indicou que duas amostras foram consideradas Lactobacillus
paracasei e outra amostra como Saccharomyces cerevisiae. A outra
amostra de levedura foi identificada fenotipicamente como Candida
pelliculosa, mas foi genotipicamente identificada como Saccharomyces
cerevisiae.
Na cinética da fermentação foi observado que Lactobacillus
paracasei 2 apresentou a mesma fase exponencial que Lactobacillus
paracasei 1, de 15h. Os resultados indicam que as leveduras
apresentaram velocidade específica de crescimento maior que as
bactérias láticas. Entretanto, as bactérias láticas apresentaram maior
rendimento da biomassa e menor valor de pH. Os micro-organismos
apresentaram boa estabilidade antes e após a liofilização, sendo que
Lactobacillus paracasei 2 apresentou menor redução microbiana.
Com relação ao fermento natural, os elaborados com bactérias
láticas apresentaram menor pH e maior acidez titulável em comparação
aos elaborados com leveduras. De uma maneira geral, os fermentos
naturais apresentaram crescimento microbiano ideal com 48 h de
cultivo. Todos os micro-organismos apresentaram um crescimento
microbiano satisfatório para futura aplicação em pães.
A análise dos resultados do tempo de fermentação da massa
de pão com fermento natural entre 4 e 10 h demonstrou que as bactérias
láticas apresentaram as maiores contagens microbiológicas. Com
exceção da Saccharomyces cerevisiae 2, os maiores crescimentos
microbianos foram com 10 h de fermentação. Com relação ao volume
específico dos pães, o melhor resultado foi com 6 h de fermentação.
Os resultados desta pesquisa mostram que as culturas starters,
utilizadas de forma individual ou mista, foram capazes de produzir pães
com características diferentes. A aplicação individual de Lactobacillus
154
paracasei 1 não apresentou êxito nos resultados, porém quando utilizada

em conjunto com Saccharomyces cerevisiae 1 apresentou boa aceitação
sensorial. O melhor resultado sensorial foi para a cultura mista de
Lactobacillus paracasei 2 e Saccharomyces cerevisiae 1.
A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura muito utilizada
no preparo de pães, pois atua como agente levedante fornecendo volume
à massa. Os melhores resultados da análise de volume específico,
textura do miolo e de formação da rede do glúten foram para o pão com
Saccharomyces cerevisiae 1. Essa pesquisa, mais uma vez, comprovou
as vantagens da utilização desta levedura no processamento de pães.
Sugere-se, para estudos futuros, a análise cromatográfica dos
compostos voláteis dos pães produzidos com os fermentos naturais
pesquisados. Além disso, é necessário o aumento de pesquisas sobre a
caracterização da microbiota dos fermentos naturais produzidos no
Brasil, uma vez que, apesar da legislação restritiva, a técnica é cada vez
mais aplicada no cotidiano dos estabelecimentos que elaboram produtos
panificados.
155
8 ANEXOS
156
157
th
ANEXO A – Resumo apresentado no16 World Congress of Food Science and Technology, Foz do Iguaçu, agosto
de 2012.
158
ANEXO B – Resumo apresentado no XI Congreso Latinoamericano de Microbiología e Higiene de Alimentos,

Buenos Aires, novembro de 2012.
159
ANEXO C – Resumo apresentado no XXI Congresso Latinoamericano de Microbiologia, Santos, outubro de 2012.
160
ANEXO D – Comprovante do artigo aceito para publicação “Influence

time fermentation in the characteristics of sourdough bread” submetido
à Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences.
161
ANEXO E – Comprovante da submissão do artigo “Effect of the

incorporation of different freeze-dried cultures on the properties of
sourdough bread” submetido à LWT - Food Science and Technology.
162
ANEXO F - Parecer de aprovação pelo Comitê de ética em pesquisa com seres humanos da UFSC

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

KRISCHINA SINGER APLEVICZ

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS LÁTICAS E LEVEDURAS

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS LÁTICAS E LEVEDURAS

Tese apresentada ao Programa de

Orientador: Prof. Dr. Ernani

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS LÁTICAS E LEVEDURAS

Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de “Doutor em

Às minhas gatinhas Mila e Amélie pelas longas horas de companhia

APLEVICZ, Krischina Singer. Identificação de bactérias láticas e

O fermento natural é usado no preparo de produtos de panificação

de panificação, pois a partir delas é possível obter um produto

Palavras-chave: fermentação espontânea, pão, fermento natural,

APLEVICZ, Krischina Singer. Identification of lactic acid bacteria

Sourdough is used in the preparation of bakery products to provide

Key words: spontaneous fermentation, bread, sourdough, lactic acid

Figura 1 Evolução do pH (A), absorbância a 660nm (B),

Figura 1 Evolução do pH (A), acidez titulável (B) e contagem

Figura 1 Efeito dos micro-organismos na firmeza do miolo dos

Tabela 1 Características reológicas e físico-químicas da farinha

Tabela 1 Identificação fenotípica de bacteria lática de fermento

Tabela 1 Velocidade específica de crescimento (µ) e tempo de

Tabela 1 Resultados físico-químicos dos pães com fermento

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

a* Gama de cor (verde ao vermelho)

µHg Micrômetro de mercúrio

3 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS

4.3.2 Avaliação da velocidade específica de crescimento e do tempo de

6.2.8 Propriedade de microestrutura.....................................................135

O pão é consumido em grande quantidade no mundo, nos

diária do fermento natural fresco. O fermento mantido estável através da

Pão é um dos principais alimentos básicos consumido

massa, principalmente por influenciar a estrutura e a formação da rede

O desenvolvimento de massa é resultado da hidratação dos

1.2. FERMENTO NATURAL

O fermento natural é usado na produção de pães comuns, pães

proporção é geralmente na razão de 100:1 de BAL para leveduras

ácidas, podendo ser secas, em pastas ou líquidas (KULP; LORENZ,

crescimento das BAL e a produção de ácido, podendo ser utilizado no

1.3 BACTÉRIA LÁTICA

Bactérias láticas têm uma história antiga de uso na

álcool e H2O2 (Lb. casei, Lb. paracasei e Lb. plantarum) e Lactobacillus

As leveduras podem ser esféricas, ovais ou elípticas podendo

As leveduras do gênero Saccharomyces cerevisiae são

1.5 MICROBIOTA DO FERMENTO NATURAL

As técnicas empregadas para a caracterização de micro-

conjuntos de substratos miniaturizados (EIGNER et al., 2005). É um

Nas amostras de fermento natural da Bélgica foram

crescimento microbiano em fermento natural de milho em 48 h de

1.6 QUALIDADE FÍSICA, QUÍMICA E SENSORIAL DE PÃES

Reologia é uma ferramenta de estudo que relaciona as

da massa; índice de tolerância à mistura (ITM), que indica a diferença

A técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV) é

importantes vantagens como, por exemplo, determinar a aceitação de

AIDOO, K.E.; ROB, N.M.J.; SARKAR, P.K. Occurrence and function

ALTAMIRANO-FORTOUL, R.; LE-BAIL, A.; CHEVALLIER, S.;

ARENDT, E.K.; LIAM, A.M.R.; DAL BELLO, F. Impact of sourdough

AUTIO, K.; LAURIKAINEN, T. Relationships between flour/ dough