SEJAM QUAIS FORAM OS RESULTADOS, COM ÊXITO OU NÃO, O

IMPORTANTE É QUE NO FINAL CADA UM POSSA DIZER: FIZ O QUE

PUDE.

- LOUIS PASTEUR

APOSTILA PRÁTICA
DE MICROBIOLOGIA
BÁSICA

PROFESSOR: LUCAS SANTANA

BELO HORIZONTE
 Sumário

03 Coloração de Gram
05 Coloração de Ziehl-Neelsen

07 Teste Novobiocina
08 Teste Bacitracina

09 10
Classificação por
Teste Optoquina
tipo de hemólise

12 14
Diferenciação das espécies Fluxograma para cocos
de Staphylococcus gram-positivos

16 Identificação de
enterobactérias 20 Meios de cultura e
inoculação

34 Técnicas de
Semeadura 37 Provas de
Identificação

45 Urocultura
 3
Coloração de Gram

Primeiramente será necessário preparar um esfregaço em uma lâmina, com uma fina camada de
bactérias fixadas, provenientes do material a ser analisado.

A partir de colônias bacterianas

1. Colocar uma gota de solução salina estéril na lâmina;

2. Tocar a colônia bacteriana com uma alça e homogeneizar o material da alça na gota salina
colocada na lâmina;

3. Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme”
tênue e homogêneo (esfregaço);

4. Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;

A partir de culturas em meio líquido

1. Colocar uma “alçada” da cultura na lâmina;

2. Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme”
tênue e homogêneo;

3. Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;

Coloração
1. Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto.

2. Enxaguar em água corrente;

3. Cobrir com lugol por 1 minuto;

4. Enxaguar em água corrente;

5. Descorar com solução de álcool-acetona por 30 segundos;

6. Enxaguar em água corrente;

7. Cobrir o esfregaço com fucsina por 30 segundos;

8. Enxaguar em água corrente;

9. Deixar secar à temperatura ambiente.

 4
Resultado e Interpretação

 Bactérias Gram-positivas serão coradas pelo cristal violeta, ficando com a coloração
azulada/roxa;
 Bactérias Gram-negativas serão coradas pela fucsina, ficando com a coloração rosa.

Bacilos Gram-negativos

Cocos Gram-positivos
 5
Coloração de Ziehl-Neelsen (Coloração de BAAR)

PRINCÍPIO

A coloração para bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) é utilizada basicamente para

micobactérias, que são bactérias que possuem uma parede celular constituída de ácidos
micólicos resistentes à descoloração por álcool-ácido. Essa coloração é o método mais rápido
para a detecção de micobactérias em amostras clínicas.

AMOSTRA

Amostras do trato respiratório inferior, biópsias, tecidos, líquidos em geral, fezes e linfa de lóbulo
de orelha.

PROCEDIMENTO

1. Preparo do esfregaço
Amostras de escarro:

 Selecionar a parte mais purulenta da amostra e espalhar em ¾ da lâmina.

 Deixar secar dentro da cabine de segurança e fixar no calor antes de corar.

Amostras de líquidos orgânicos, lavado brônquico e lavado gástrico:

 Centrifugar a amostra em centrífuga refrigerada a 5.000 rpm por 15 minutos.

 Desprezar o sobrenadante e homogeneizar, e com alça bacteriológica depositar uma gota
do sedimento na lâmina.
 Deixar secar dentro da cabine de segurança e fixar no calor antes de corar.

Biópsias e tecidos

 Transferir a amostra para um gral estéril e macerar com auxílio de pistilo. Se necessário,
adicionar algumas gotas de solução fisiológica estéril.
 Retirar com o auxílio de uma alça bacteriológica uma amostra do macerado e espalhar em
¾ da lâmina.
 Deixar secar dentro da cabine de segurança e fixar no calor antes de corar.

Amostras de urina

 Centrifugar todo o volume da amostra em centrífuga refrigerada a 5.000 rpm por 15

minutos.
 Desprezar o sobrenadante e homogeneizar, e com alça bacteriológica depositar uma gota
do sedimento na lâmina.
 Deixar secar dentro da cabine de segurança e fixar no calor antes de corar.
 6
Amostras de fezes

 Colocar uma gota de solução fisiológica em uma lâmina e emulsionar uma pequena
amostra de fezes sobre a gota.
 Deixar secar dentro da cabine de segurança e fixar no calor antes de corar.

2. Coloração
1. Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl;
2. Aquecer a parte inferior da lâmina com a chama do bico de Bunsen até observar a emissão
de vapores e deixar 5 minutos;
3. Lavar com água corrente;
4. Cobrir o esfregaço com álcool-ácido e deixar por 1 minuto;
5. Lavar com água corrente;
6. Cobrir o esfregaço com azul de metileno e deixar por 2 minutos;
7. Lavar com água corrente;
8. Deixar secar ao ar.

COMO REPORTAR O RESULTADO

Resultado negativo – não foram observados bacilos álcool-ácido resistentes na amostra

analisada.

Resultado positivo – ver tabela abaixo.

BAAR (OBJETIVA DE 100X) RESULTADO

0 bacilos/campo Negativo
1 a 2 bacilos/300 campos Confeccionar nova lâmina*
1 a 9 bacilos/100 campos 1+
1 a 9 bacilos/10 campos 2+
1 a 9 bacilos/campo 3+
>9 bacilos/campo 4+
* Se o resultado persistir, pedir nova amostra para confirmar o resultado.
 7
Novobiocina

Separa cepas de Staphylococcus saprophyticus (Novobiocina resistente) das demais cepas

de Staphylococcus coagulase negativa de importância clínica; Staphylococcus saprophyticus é a
única espécie isolada em humanos como causadora de infecções urinárias.

Interpretação

Resistente: Ausência de halo de inibição ou halos ≤ 15 mm.

Sensível: Presença de halo de inibição ≥ a 16 mm.
 8

Bacitracina

A primeira prova presuntiva para identificação de estreptococos beta hemolíticos é a hemólise

total (beta hemólise) em Ágar Sangue. Os estreptococos ß-hemolíticos que forem sensíveis à
Bacitracina são considerados presuntivamente como pertencentes ao Grupo A de Lancefield.

Interpretação

Positivo (Sensível): Presença de qualquer halo ao redor do disco.

Negativo (Resistente): ausência de halo ao redor do disco.
 9
Optoquina

A optoquina ou cloridrato de etil-hidrocupreína, um derivado da quinina, inibe seletivamente o

crescimento de Streptococcus pneumoniae em concentrações muito baixas (5 µg/mL ou menos),
podendo eventualmente inibir o crescimento de outros estreptococos alfa-hemolíticos, porém
apenas em concentrações maiores.

A prova de sensibilidade à optoquina é indicada para a diferenciação entre estreptococos alfa-

hemolíticos e pneumococos (S. pneumoniae).

Interpretação

Positivo (Sensível):
• Disco de 6 mm: halo de inibição de 14 mm ou mais.
• Disco de 10 mm: halo de inibição de 16 mm ou mais.

Negativo (Resistente):
• Disco de 6 mm: halo de inibição inferior à 14 mm ou ausência de halo.
• Disco de 10 mm: halo de inibição inferior à 16 mm ou ausência de halo.
 10

Classificação por tipo de hemólise em ágar sangue

Se a hemólise for total, diz-se que o estreptococo é beta-hemolítico.

Ex.: S. pyogenes

Se a hemólise for parcial, diz-se que o estreptococo é do tipo alfa-hemolítico.

Ex.: S. pneumoniae
 11

Não havendo hemólise, diz-se que o estreptococo é do tipo gama ou não hemolítico.
Ex.: Enterococcus faecalis

Classificação de Lancefield

Um segundo tipo de designação, também muito empregado, baseia-se nas características

antigênicas de um polissacarídeo de composição variável, chamado carboidrato C, localizado na
parede da célula, que pode ser detectado por diferentes técnicas imunológicas.

Tomando por base este polissacarídeo, os estreptococos foram divididos em 20 grupos

sorológicos (grupos de Lancefield), designados por letras do alfabeto (A, B, C, D, E, F, G, H, K, L,
M, N, O, P, Q, R, S, T, U e V).
 12
Diferenciação das espécies de Staphylococcus spp. mais frequentemente
envolvidas em infecções em seres humanos.

Espécie Catalase Coagulase Manitol Novobiocina

S. aureus + + + Sensível

S. epidermidis + - - Sensível

S. saprophyticus + - - Resistente
Positivo (+); Negativo (-)

Manitol

O S. aureus fermenta o meio manitol (tornando-o amarelo), enquanto que as outras duas
espécies não o fermentam.
 13
Diferenciação das principais categorias ou espécies de Streptococcus spp.
mais frequentemente envolvidas em infecções em seres humanos.

Espécie Catalase Hemólise Bacitracina Optoquina CAMP

S. pyogenes - β Sensível Resistente -

S. agalactiae - β Resistente Resistente +

S. pneumoniae - α Resistente Sensível -

Positivo (+); Negativo (-)
 14
Fluxograma para cocos gram-positivos mais frequentes

Staphylococcus spp.
CATALASE + Micrococcus spp.

Manitol
S. epidermidis
S. saprophyticus + - Micrococcus sp.
S. aureus

Bacitracina S
Coagulase

DNAse
S. aureus + - S. epidermidis
S. saprophyticus

Novobiocina

S. epidermidis S R S. saprophyticus

(S) Sensível / (R) Resistente / (+) Positivo / (-) Negativo

 15

Streptococcus spp.
CATALASE - Enterococcus spp.

α hemólise γ hemólise β hemólise

S Optoquina R S Bacitracina R
+ Bile Solub. - R STX R

S. pneumoniae S. pyogenes

Enterococcus spp.
S. bovis + Bile Esculina - CAMP
S. equinus

S. viridans
- +
NaCl 6,5%

Bile Esculina S. agalactiae

- +

S. bovis E. faecalis
S. equinus E. faecium
(não enterococos) E. durans

(S) Sensível / (R) Resistente / (+) Positivo / (-) Negativo

 16
Identificação de Enterobactérias

A família das enterobactérias é composta de um grande número de bacilos e cocobacilos Gram-

negativos, que frequentemente são encontrados no laboratório clínico e são associados com
infecções em todas as áreas do organismo.

Todos os membros desta família apresentam como características metabólicas:

 Fermentam glicose;
 São citocromo oxidase negativos;
 Reduzem nitrato em nitrito;
 São anaeróbios facultativos.

Microrganismos mais comuns Infecções mais frequentes

Escherichia coli Urinária, feridas, septicemia, meningite neonatal
Klebsiella pneumoniae Urinária, pneumonia
Shigella spp. Disenteria bacilar
Enterobacter spp. Urinária, feridas
Salmonella spp. Febre tifoide, gastroenterites
Citrobacter freundii Urinária, feridas
Edwardsiella tarda Feridas
Serratia marcescens Feridas
Hafnia alvei Septicemia
Proteus spp. Urinária, feridas
Providencia stuartii Urinária, queimaduras
Morganella morganii Urinária
Yersinia enterocolitica Gastroenterite
Y. pseudotuberculosis Adenite mesentérica
Y. pestis Peste bubônica

ISOLAMENTO
O ágar MacConkey e o EMB são os mais utilizados para o isolamento das enterobactérias de
amostras clínicas, com exceção das fezes em que é utilizado uma combinação de meios
diferenciais, meios seletivos e um meio de enriquecimento.

MacConkey EMB
Inibidores de Gram positivos Cristal violeta, sais biliares Eosina azul de metileno
Substrato diferencial Lactose Lactose
Controla o crescimento do véu Cepas de E. coli desenvolvem
Vantagens
do Proteus sp. brilho metálico
 17
IDENTIFICAÇÃO

Todas as enterobactérias crescem em ágar MacConkey. Após o crescimento no meio é feita a

prova de oxidase, redução do nitrato e fermentação da glicose.

A identificação é baseada em uma série de reações bioquímicas, sendo as mais utilizadas:

Tríplice Açúcar Ferro (TAF), Citrato, Ureia, Lisina, Motilidade, Indol e Fermentação de
Carboidratos.
 18
Meio de Rugai

INOCULAÇÃO

 Com o auxílio de uma agulha de platina, coletar a amostra da colônia a ser pesquisada e
inocular através de picada até o fundo do tubo, realizando estrias na superfície do meio de
Rugai.
 Incubar em estufa a 36°C por 24 horas.

LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DAS PROVAS

1. Parte Superior (Meio de Rugai): cor original azul-esverdeada.

Ápice – podem ser realizadas as seguintes leituras:

 LTD - Reação positiva:

o Cor verde garrafa (o microrganismo é LTD negativo)
o Cor marrom (o microrganismo é LTD positivo)
 Fermentação da sacarose – Reação positiva: cor amarela
 Produção de gás – Reação positiva: formação de bolhas e/ou arrebentamento do meio
 Ureia – Reação positiva: cor azul intensa
 Produção de H2S – Reação positiva: cor negra

2. Parte Inferior (Meio de Lisina): cor original púpura.

Podem ser realizadas as seguintes leituras:

 Lisina:
o Reação positiva: qualquer cor diferente do amarelo
o Reação negativa: cor amarela
 Motilidade:
o Reação positiva: turvação do meio, qualquer crescimento além da picada
o Reação negativa: crescimento apenas na picada

3. Tampa: pode ser realizada a seguinte leitura:

 Indol – Reação positiva: cor vermelha após adição de uma gota de reativo de
Kovacs no papel de filtro existente na parte interna da tampa. OBS.: Esta leitura
deve ser realizada após incubação.
 19

Esta tabela é válida somente para o meio de Rugai e este aspecto apresentado refere-se a
amostras de perfil bioquímico típico.

Outros fatores como procedência do material, resistência a antimicrobianos, sorologia e provas

bioquímicas adicionais devem ser necessárias para a o identificação final do microrganismo em
questão.

Neste meio, devido à grande diversidade de substratos, pode ocorrer interferência entre as
reações observadas. O microbiologista deve estar atento a este fato.
 20
Meio Mio (Meio Ornitina Indol Motilidade)

É usado para identificação de Enterobacteriaceae com base na motilidade, produção de indol e

atividade de ornitina descarboxilase.

O meio MIO foi formulado por Ederer e Clark, e Oberhofer e Hajkowski para detecção de
motilidade, descarboxilação de indol e ornitina em um único tubo de cultura. A caseína enzimática
hidrolisada e a digestão péptica de tecido animal fornecem aminoácidos e outras substâncias
nitrogenadas.

O extrato de levedura é a fonte de vitaminas do complexo B. Dextrose é o carboidrato

fermentável. As culturas são inoculadas por perfuração do ágar. As reações de descarboxilação
da ornitina e a motilidade são lidos antes de testar a produção de indol.

Os organismos móveis mostram crescimento difuso ou turbidez se estendendo além da linha de

inoculação enquanto organismos que não são móveis crescem junto da linha de inoculação.

Organismos fermentam a dextrose de maneira a formar ácido que causa a mudança de coloração
do indicador de pH bromocresol púrpura, de púrpura a amarelo.

Organismos que possuem a ornitina descarboxilase descarboxilam a ornitina a putrescina o que

aumenta o pH, fazendo com que o meio se torne alcalino, que é indicado pela mudança de
coloração de amarelo a púrpura através do meio.

A reação negativa da descarboxilase é indicada pela coloração amarela do meio ou amarelo com
uma banda púrpura próxima ao topo do meio.

O indol é produzido a partir do triptofano presente na caseína enzimática hidrolisada. O indol

produzido se combina com o aldeído presente no reagente de Kovac de maneira a formar um
complexo vermelho.
 21
Meio Tríplice Açúcar Ferro (TAF) ou Triple Sugar Iron (TSI)

Esta prova é, geralmente, utilizada para diferenciar os diferentes gêneros das Enterobactérias e
para distinguir esta família de outros bacilos Gram-negativos de origem intestinal. Esta
diferenciação é feita atendendo às diferenças na fermentação dos carboidratos presentes no
meio e à produção de sulfureto de hidrogénio (H2S).

O TSI é um meio sólido e apresenta uma base e uma inclinação. É constituído de glicose (0,1%),
lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de
sódio e citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H 2S), com pH neutro e um indicador
de pH, o vermelho de fenol.

O meio é inoculado por picada, no cilindro e por estria, na superfície inclinada.

Após o crescimento da bactéria pode-se observar os seguintes resultados:

 ÁCIDO (amarelo) / ÁCIDO (amarelo) – A/A – fermentação de glicose, lactose e sacarose.

Ocorre acidificação do meio de cultura devido a grande produção pelas bactérias,
superando a reação alcalina que ocorre na superfície, tornando o meio de cultura amarelo.
 ÁCIDO (amarelo) / ALCALINO (vermelho) – A/K – indica que o microrganismo fermenta a
glicose, mas não a lactose e a sacarose. Estes microrganismos fermentam a glicose
produzindo ácidos orgânicos, que alteram o pH. A base fica amarela e a superfície
inclinada fica vermelha.
 ALCALINO (vermelho) / ALCALINO (vermelho) – K/K – organismos não fermentadores
não provocam alterações, seja na base, seja na superfície inclinada. A formação de H2S é
demonstrada pela reação com o sulfato ferroso, que escurece o meio.

Condição Superfície Base

Não fermentador Alcalino Alcalino
Fermentador de glicose Alcalino Ácido
Fermentador de glicose, sacarose e lactose Ácido Ácido
22
23
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 29
TSA - Método de difusão em disco
(modificado de Bauer e Kirby - 1966)

Preparo do inóculo bacteriano

Para obter uma turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Equivalente a

aproximadamente 1,5x108 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL.

1. Com uma alça de platina ou swab, transferir 3 a 4 colônias com a mesma morfologia e
inoculá-las em 3 a 4 mL de solução fisiológica a 0,9% em um tubo de ensaio;

2. Agitar vigorosamente os tubos para ter uma suspensão (turvação) uniforme, pois em
repouso tende a precipitar;

3. Comparar a olho nu o tubo com a escala de McFarland (comprado comercialmente) com

o tubo da suspensão bacteriana na solução fisiológica a 0,9%.

Inoculação da placa

1. Introduzir um swab estéril na suspensão bacteriana ajustada a 0,5 da escala de

McFarland;

2. Comprimir o swab contra a parede interna do tubo para retirar o excesso do inóculo;

3. Semear a superfície do ágar em três direções diferentes; (Não ultrapassar 15 minutos

desde a preparação do inóculo até a semeadura).

4. Deixar a placa semeada secar por 5 minutos à temperatura ambiente, para que o
inóculo seja completamente absorvido pelo ágar antes de aplicar os discos. (Não
ultrapassar 15 minutos entre a semeadura e a colocação dos discos).

** O meio de cultura mais utilizado é o Ágar Mueller-Hinton;

*** Todos os procedimentos devem ser feitos em capela microbiológica ou de fluxo laminar,
com o auxílio de um bico de Bunsen.

Aplicação dos discos

Placas de 150 mm: colocar no máximo 12 discos; Placas de 90 mm: colocar 5 discos;

1. Retirar os discos da geladeira ou do congelador uma a duas horas antes de sua

utilização.

2. Após colocar o disco, pressionar levemente com um auxílio da pinça sua superfície;

3. Distribuir os discos, uniformemente, na placa de Petri;

4. Uma vez colocado, não remover os discos do lugar, pois a difusão da droga é imediata.
 30

Incubação das Placas

1. Colocar as placas (invertidas) dentro da estufa, no máximo 15 minutos após a colocação

dos discos;

2. A temperatura máxima da estufa deve ser 35 ± 2ºC;

3. O tempo de incubação deve ser de 16 a 18 horas, salvo exceções.

Leitura das placas

1. Após o período de incubação, ler as placas;

2. O diâmetro do halo de inibição é lido em milímetros (mm) com auxílio de uma régua ou
halômetro sobre o fundo da placa;

3. Colônias pequenas dentro dos halos devem ser verificadas se são clones resistentes ou
eventual contaminação, antes de serem liberadas como cepas resistentes a estes
antimicrobianos;

4. Considere os halos de inibição a partir do ponto, onde não foi observado o crescimento
bacteriano a olho nu.

Interpretação dos Resultados

Os halos de inibição para cada antimicrobiano testado devem ser interpretados como sensível,
intermediário ou resistente, de acordo com os critérios estabelecidos pelo Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) mais atual.
 31
Teste de Sensibilidade Antimicrobiana

Os testes de sensibilidade antimicrobiana (TSA) medem a capacidade de um antibiótico ou

outro agente microbiano de inibir o crescimento bacteriano in vitro. Esta capacidade pode ser
estimada tanto pelo método de diluições quanto pelo método de difusão.

O TSA deve ser sempre realizado na avaliação das seguintes bactérias:

 Enterobactérias;
 Pseudomonas spp.,
 Acinetobacter spp.;
 Staphylococcus spp.;
 Enterococcus spp.;
 Streptococcus pneumoniae;
 Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico;
 Haemophilus influenzae;
 Complexo Burkholderia cepacia;
 Stenotrophomonas maltophilia;
 Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.

Método de diluição: tem o objetivo de estimar quantitativamente a atividade do antibiótico. É

realizada uma série de diluições do antibiótico, que são incorporadas ao meio em caldo ou ágar.

O meio é inoculado com uma suspensão do microrganismo em estudo e incubado a 35°C

durante 18 horas. Após o período de incubação os meios são observados para ver se houve
crescimento bacteriano.

A menor concentração que inibe in vitro o crescimento bacteriano é conhecida como a

Concentração Inibitória Mínima (MIC do inglês, Minimal Inhibitory Concentration) do agente.
 32
Método de difusão em disco: são colocados discos de papel impregnados com
antibióticos, acima do ágar semeado de maneira uniforme com o microrganismo em estudo.

É formada uma concentração em gradiente de difusão do disco, e o crescimento da

bactéria em teste fica inibido a certa distância do disco. Esta distância está relacionada, entre
outros fatores, com a suscetibilidade do organismo.
 33

NaCl 6,5%

PRINCÍPIO
A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a
capacidade de alguns microrganismos crescerem em presença do sal.

O meio base utilizado é o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral,
empregado para o cultivo de muitas bactérias. Este meio normalmente contém
0,5 % de NaCl e aumenta-se a concentração para 6,5 %, tornando um meio
semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns microrganismos.

UTILIDADE
Separa Enterococcus spp., que são NaCl 6,5 % positivo dos demais
Streptococcus spp., que são NaCl 6,5% negativos.

TÉCNICA

 Inocular 2 a 3 colônias a serem testadas em um caldo BHI

suplementado com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador);
 Incubar a 35 ºC (±2ºC) por até 72 h.

INTERPRETAÇÃO

A turvação ou mudança de cor (no caso de adição de indicador) é indicativa de

crescimento bacteriano.

CONTROLE
Positivo: Enterococcus faecalis ou Enterococcus faecium.
Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae
 34
Técnicas de semeadura

Semeaduras em meios sólidos em tubos

Estria sinuosa: semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag, partindo da

base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio).
Objetivo: obtenção de intensa massa de micro-organismos.

Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com cuidado
de não ferir o Agar, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada
do meio).
Objetivo: obtenção de pequena massa de micro-organismos.

Picada Central: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo

da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste.
Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas.

Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar.

Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo
deste.
Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas.
 35
Semeaduras em meios sólidos em placas de Petri

Pour-plate ou disseminação (método em profundidade): Transferir 1 ml da

cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio fundido (e
resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente
com movimentos circulares.
Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado também para análise de micro-
organismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após
o endurecimento da primeira camada.

Estria simples: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e
estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A estria pode ser realizada em
movimento de zig-zag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio
(estria reta).

Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para visualização de determinadas

propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise
de substâncias do meio - gema de ovo, sangue...), e produção de pigmentos.

Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da

cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o
meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2
tipos:
• 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando
atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar
mais 90° e estriar o meio restante.
• 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo
quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4
da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.

Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na
estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se,
alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um
pequeno inóculo para a próxima estria.
 36

Spread-plate ou distensão: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio sólido na

placa e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou alça
bacteriológica / swab / alça Drigalsky.
Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana.
Esta técnica é muito utilizada na realização de antibiogramas.

Semeaduras em meios líquidos

Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou
líquido) é introduzida no meio líquido, com agitação da alça, para maior difusão dos
micro-organismos (da alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar
o tubo a 30° e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o tubo retornar à
posição original o inóculo se difundirá no meio.
Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido.
 37
PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
Teste da solubilidade em bile

Detergentes fracos, como os sais biliares desoxicolato de sódio ou taurocolato de sódio têm a
capacidade de lisar seletivamente o S. pneumoniae. Estes sais ativam as enzimas autolíticas
(autolisinas) produzidas pelo pneumococo, acelerando a reação lítica natural da bactéria.

A turvação produzida por uma suspensão de pneumococo ficará completa ou parcialmente

límpida ao se adicionar os sais biliares. Em meio sólido, as colônias bile-solúveis “desaparecem”
em contato com algumas gotas de solução destes sais e o teste é um pouco mais difícil de ser
visualizado.

PROCEDIMENTO

 Preparar uma suspensão bacteriana densa a partir da cultura recente, que não tenha
ultrapassado 18-24 horas de incubação;
 Separar dois tubos de ensaio com transparência adequada para observar a presença de
suspensão bacteriana. Marcar um com “C” (tubo controle) e outro com “T” (tubo teste);
 Adicionar solução de desoxicolato de sódio a 2% ao tubo “T” e solução salina a 0,85% ao
tubo “C”. Os volumes em cada tubo devem ser iguais, pequenos, mas suficientes para
fazer a leitura, por exemplo, 0,5 mL. Adicionar a cada tubo o mesmo volume, por exemplo,
0,5 mL da suspensão bacteriana;
 Homogeneizar e fazer a leitura imediatamente, após 1h e até 2h de incubação a 35 ºC
(±2ºC).

INTERPRETAÇÃO

A leitura é feita observando a turvação do tubo T em relação ao tubo C. Verificar se o tubo C

apresenta uma suspensão homogênea da cultura em solução salina. Compará-lo com o conteúdo
do tubo teste, contendo a cultura em desoxicolato de sódio.

Se o tubo T apresentar turvação visivelmente menor que o controle ou estiver límpido, o teste é
positivo e identifica Streptococcus pneumoniae.

C T
Positivo
S. pneumoniae
Negativo
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Teste de CAMP

FINALIDADE
O serve para identificar de cepas de S. agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o fator CAMP
(Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo
Staphylococcus aureus em ágar sangue.

TÉCNICA
 Semear um inóculo de Staphylococcus aureus (ou cepa de S. aureus com duplo halo de
hemólise) de um ponto a outro da placa de ágar sangue;

Staphylococcus aureus
(produtor de β-hemolisina)

Ágar Sangue

 Semear perpendicularmente (90°) a colônia de Streptococcus β-hemolítico a ser testada,

sem que haja o contato com a estria de Staphylococcus aureus;

Colônia de Streptococcus β-hemolítico a

ser testada

 Incubar a 35 ºC (±2ºC) em atmosfera de 5% de CO2 por 48h.

INTERPRETAÇÃO
A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S. aureus na intersecção do
crescimento das duas bactérias indica que o teste é positivo, e indicativo de S. agalactiae.

Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo e a cepa não pertence ao grupo
B de Lancefield.
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Teste de DNAse

O teste de DNAse é usado para detectar a degradação do DNA, contido no meio de cultura, por
bactérias que possuem uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease, responsável pela reação.

O teste é útil para diferenciar Staphylococcus aureus de outros tipos bacterianos. Ao utilizar o
meio de Ágar DNAse, deve-se acrescentar uma quantidade de HCl para revelar a atividade
enzimática.

Uma zona transparente em volta da colônia indica reação positiva. Caso não haja atividade dessa
enzima o HCl reagirá com o ácido nucleico intacto, formando um precipitado em todo ágar.
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Prova da catalase

PRINCÍPIO
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H 2O2) em água e oxigênio.

UTILIDADE
Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Baci
llus, Moraxella catarrhalis.

INOCULAÇÃO
 Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma lâmina em um
tubo;
 Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo na gota de peróxido de
hidrogênio.

INTERPRETAÇÃO

+ Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a conversão do

H2O2 em água e oxigênio gasoso.
- Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência.
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Prova da coagulase

PRINCÍPIO
Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um coágulo, uma
vez que a coagulase é uma proteína com atividade similar à protrombina, capaz de converter o
fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível. Pode ser encontrada em
duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre.

A coagulase conjugada (prova em lâmina), é também conhecida como fator de aglutinação,

encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está presente em filtrados de cultivos.
Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio), formam-se cordões de
fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visíveis.

A coagulase livre (prova em tubo) é uma substância similar à trombina e está presente em
filtrados de cultivos. É secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no
plasma denominado Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar um complexo que,
por sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina (coágulos). Quando uma suspensão em
plasma do microrganismo produtor de coagulase é preparada em tubo de ensaio, forma-se um
coágulo visível após o período de incubação.

UTILIDADE
Separar as espécies de Staphylococcus de importância clínica, S. aureus – coagulase positiva,
das demais espécies – coagulase negativa.

INOCULAÇÃO
Coagulase conjugada:
 Traçar dois círculos com lápis de cera em uma lâmina de vidro;
 Colocar duas gotas de água destilada ou solução fisiológica estéreis dentro de cada círculo;
 Com auxílio de um fio bacteriológico agregar a colônia em estudo, homogeneizando
delicadamente em cada círculo;
 Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos círculos;
 No outro círculo, adicionar outra gota de água destilada ou solução fisiológica estéreis, como
controle;
 Homogeneizar com palito de madeira;
 Inclinar a lâmina delicadamente, para frente e para trás;
 Observar presença de aglutinação.

Coagulase livre:
 Com auxílio do fio bacteriológico, suspender colônias em estudo em caldo BHI e colocar em
estufa à 37ºC até que turve;
 Se necessário, acertar a turbidez até 0,5 da escala de MacFarland;
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 Em um tubo de ensaio estéril, colocar 0,5 ml de plasma reconstituído e 0,5 ml do caldo BHI
com crescimento bacteriano recém turvado;
 Incubar em estufa à 35ºC 4 horas;
 Verificar se há presença de coágulo;
 Se não houver presença de coágulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as
leituras com 18 e 24 horas de incubação.

INTERPRETAÇÃO
Coagulase conjugada:
+ Positiva: formação de precipitado branco e aglutinação dos microrganismos da suspensão,
após 15 segundos, no círculo que contém o plasma.
- Negativa: ausência de aglutinação no círculo que contém o plasma.
***A presença de precipitado ou aglutinação, torna a prova inespecífica, devendo ser repetida a
prova em tubo.

Coagulase livre:
+ Positiva: presença de qualquer grau de coágulo.
- Negativa: ausência de coágulo.
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Prova de Citocromo oxidase

A prova utiliza certos reativos corantes, que atuam como aceptores artificiais de elétrons,
substituindo o oxigênio. O reativo corante é incolor no estado reduzido, mas na presença de
citocromo oxidase e oxigênio atmosférico se oxida formando azul de indofenol.

PROCEDIMENTO
 Técnica direta – adicionam-se diretamente na placa 2 gotas do reativo às colônias
bacterianas isoladas que cresceram na placa.
 Técnica indireta (tiras de papel) – adicionam-se algumas gotas do reativo na tira de papel e
estende-se uma alça da colônia suspeita.

INTERPRETAÇÃO
As colônias bacterianas que possuem atividade de citocromo oxidase desenvolvem em 10
segundos uma cor azul escura no local da inoculação.

***Não usar alça de inoculação de aço inoxidável, pois os produtos de oxidação formados na
superfície ao flambá-la podem produzir reação falso-positiva.

E. coli Pseudomonas

CONTROLE
Positivo – Pseudomonas aeruginosa
Negativo – Escherichia coli
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Urocultura

Amostras de urina devem ser submetidas à cultura quando existe a suspeita de infecção do trato
urinário, para controle de tratamento, ou em pacientes assintomáticos com alto risco de infecção.

Os agentes etiológicos que mais frequentemente causam esse tipo de infecção são as
enterobactérias, como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Enterobacter spp., e
entre os cocos gram-positivos os mais frequentes são os estafilococos, destacando o
Staphylococcus saprophyticus e o Enterococcus spp.

Nas infecções urinárias de pacientes da comunidade a E. coli é o principal agente, sendo

responsável por mais de 70% dos casos.

A grande maioria das infecções urinárias é caracterizada pela presença de um número elevado
de leucócitos na urina (piúria), sendo importante verificar, juntamente com a cultura, a contagem
de leucócitos e a presença de microrganismos (bacteriúria).

A presença de piúria é uma resposta inflamatória e em algumas situações sua presença não está
relacionada com infecção urinaria. É importante ressaltar que há situações em que infecções
urinárias podem apresentar contagem normal de leucócitos ou somente um pouco elevada.

1. Coleta da amostra
- Urina de jato médio:

É a amostra mais comum submetida para cultura. Deve ser realizada higiene prévia da região
genital. Desprezar o primeiro jato de urina. Colher o jato médio em frasco estéril apropriado e o
restante da micção deve ser desprezado.

- Urina de qualquer jato:

É a amostra obtida de crianças com auxílio de saco coletor. Fazer higiene prévia na região
genital e colocar o saco coletor de forma asséptica. Trocar o coletor a cada 45 minutos a 1 hora,
repetindo a higiene. É fundamental evitar contaminação fecal.

- Urina de paciente com sonda vesical:

Essa amostra não é ideal para cultura. Nessa situação pinçar a cânula do coletor. Realizar
desinfecção da cânula com álcool a 70%. Com uma seringa e agulha estéreis puncionar a cânula
e retirar até 10mL de urina. Colocar em frasco estéril.

2. Procedimento
- Coloração de Gram:

 Homogeneizar bem a amostra de urina (sem centrifugar);

 Retirar 10µL da urina e colocar em uma lâmina, sem espalhar;
 Deixar secar ao ar;
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 Reportar o número de microrganismos observados por campo de imersão (raros, alguns ou
numerosos).

- Semeadura em placa de Petri:

 Homogeneizar a urina sem centrifugar;

 Flambar a alça que será utilizada;
 Imergir a alça calibrada de 1µL ou 10µL na urina de forma vertical;
 Semear em ágar CLED;
 Incubar em estufa de 35ºC (±1ºC) por 18 a 24 horas.

Interpretação do resultado:

 Crescimento com alça de 1µL → 1 colônia equivale a 1.000 ou 10³ UFC/mL.

 Crescimento com alça de 10µL → 1 colônia equivale a 100 ou 10² UFC/mL.

*UFC/mL= Unidades Formadoras de Colônias por mL de urina.

Para uma interpretação mais adequada da cultura de urina devemos levar em consideração não
só a contagem do microrganismo, mas também a presença ou ausência de leucócitos e se
possível a sintomatologia clínica.

Ágar CLED

3. Como repostar o resultado

Independente do tipo de coleta realizada, o resultado da cultura de urina deve sempre ser
quantitativo em unidades formadoras de colônias por mililitro de urina (UFC/mL).

Informe o método utilizado na coleta de urina.

Em casos de dúvidas na interpretação, sugerir repetição do exame para esclarecimento

diagnóstico.

Cultura negativa – não houve crescimento de microrganismos.

Cultura positiva - ≥ 100.000 UFC/mL.

O próximo passo é identificar família, e consequentemente, a espécie da bactéria.