Fatores Indutores E Supressores Da Eritropoiese em Caninos Doentes Renais Crônicos

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL
FATORES INDUTORES E SUPRESSORES DA

ERITROPOIESE EM CANINOS DOENTES RENAIS
CRÔNICOS
Sofia Borin Crivellenti

Médica Veterinária
2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL
FATORES INDUTORES E SUPRESSORES DA

ERITROPOIESE EM CANINOS DOENTES RENAIS
CRÔNICOS
Sofia Borin Crivellenti
Orientador: Prof. Dr. Aureo Evangelista Santana
Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de
Jaboticabal, como parte das exigências para
obtenção do título de Doutor em Medicina
Veterinária, área de Clínica Médica Veterinária.
2014
Borin-Crivellenti, Sofia
B734f Fatores indutores e supressores da eritropoiese em caninos
doentes renais crônicos / Sofia Borin Crivellenti. – – Jaboticabal, 2015
ix, 45 p. : il. ; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de

Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015
Orientador: Aureo Evangelista Santana
Banca examinadora: Mirela Tinucci Costa, Daniela Gomes da
Silva, Thiago Demarchi Munhoz, Geórgia Modé Magalhães.
Bibliografia
1. Citocinas. 2. Hormônios. 3. Mielograma. I. Título. II.

Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:616.61:636.7
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da

Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de
Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
SOFIA BORIN CRIVELLENTI – nascida em 29 de junho de 1983 na cidade de

Lençóis Paulista – SP, filha de Luiz Anselmo Borin e Regina Maria de Souza Borin.
Graduou-se em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Uberlândia (UFU)
em 2006. Durante os anos de 2007-2009 participou do Programa de Residência
Médico-Veterinária em Clínica Médica de Pequenos Animais no Hospital Veterinário
“Governador Laudo Natel” da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV)
da Universidade Estadual Paulista (Unesp), Câmpus de Jaboticabal. No ano de 2011
adquiriu o título de Mestre em Clínica Médica pelo Programa de Pós-graduação em
Medicina Veterinária da FCAV/Unesp – Jaboticabal (Bolsista FAPESP - Mestrado).
No mês de março de 2011 ingressou no doutorado em Clínica Médica na mesma
instituição, realizando estágio e pesquisa internacional na Faculdade de Medicina
Veterinária da “The Ohio State University”, Ohio, Estados Unidos (Bolsista FAPESP
– doutorado/BEPE). Desde o início da pós-graduação integrou os Serviços de
Patologia Clínica Veterinária (2009 – atual) e de Oncologia Veterinária (2009-2013)
do Hospital Veterinário da Unesp – Jaboticabal. Autora dos livros “Casos de Rotina
em Medicina Veterinária de Pequenos Animais” (MedVet, 2012) e “Bulário Médico-
Veterinário - Cães e Gatos” (MedVet, 2013). Possui experiência clínica e acadêmica
nas áreas de clínica médica de pequenos animais, patologia clínica, endocrinologia
e hematologia veterinária.
“Feliz daquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”
Cora Coralina
Dedico
A todos aqueles que lutam por um mundo melhor.
AGRADECIMENTOS
A Deus, primeiramente pela minha vida, mas também pelas pessoas, animais,
oportunidades e adversidades que coloca no meu caminho. Todos, sem exceção,
contribuem diariamente para que eu me torne uma pessoa melhor.
Ao meu eterno orientador Prof. Tit. Dr. Aureo Evangelista Santana, que ao me
receber por sua orientanda me deu a oportunidade de conhecer o verdadeiro sentido
da palavra “professor”. Este homem é, para mim, a personificação da frase que
escolhi como epígrafe desta tese. Com humildade e modéstia ele é capaz de
transferir o que sabe e vivenciar o que ensina. Serei eternamente grata à sua
presença em minha vida.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo

incentivo à pesquisa e apoio financeiro por meio da concessão da Bolsa de
Doutorado (2011/08601-8), Bolsa de Estágio e Pesquisa no Exterior (2013/0027-6) e
Auxílio à Pesquisa Regular (2011/20581-2).
À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual

Paulista (Unesp), Câmpus de Jaboticabal pela oportunidade e receptividade.
Ao meu “orientador americano” Prof. Dr. Chen Gilor da Faculdade de Medicina

Veterinária da “The Ohio State University” pela confiança em mim depositada e pela
incalculável experiência profissional e pessoal que me proporcionou.
A equipe do Laboratório de Patologia Clínica “Prof. Dr. Joaquim Martins Ferreira

Neto” do Hospital Veterinário da Unesp – Jaboticabal pelo apoio, amizade,
profissionalismo e companheirismo nestes oito anos de convívio. Não poderia deixar
de fazer um agradecimento especial ao Eugênio Campos Filho, nosso querido
“Geninho”, que por anos a fio ajudou na elaboração e na realização de tantos e
tantos projetos de pesquisa, sempre tão disposto e solícito.
Aos meus contemporâneos de república, residência, pós-graduação, professores,
funcionários e estagiários do Hospital Veterinário e do Serviço de Oncologia da
Unesp de Jaboticabal, com os quais convivi durante minha Residência em Clínica
Médica de Pequenos Animais, Mestrado e Doutorado. Não estaria sendo justa se
não fizesse um agradecimento especial às minhas irmãs (e irmão) de República
Tathiana Motheo, Marcy Lancia Pereira, Alexandre Pinto Ribeiro e Caroline Pigatto
De Nardi; aos meus contemporâneos de residência Giuliana D’Angelo, Fábio Nelson
Gava, Amanda Cristiane Ondani e Mariana Rondelli; à minha orientadora de
residência Profa. Dra. Mirela Tinucci Costa, e aos queridos funcionários do HV Maria
José Agostine (Zezé), Lauro Cesar, Douglas Ludovério e Matheus Yamazaki.
À banca de qualificação do doutorado, composta pela Profa. Dra. Márcia Ferreira da

Rosa Sobreira, Profa. Dra. Lizandra Amoroso, Profa. Dra. Daniela Gomes da Silva e
pela Profa. Dra. Annelise Carla Camplesi, pela disponibilidade e pela contribuição
com suas considerações.
Aos pesquisadores do laboratório de patologia clínica Nathan Cruz, Letícia Anai,

Mônica Chaves, Andressa Nogueira, Caroline Miranda, Catarina Contin, Stefanie
Coelho e Aline Tedesco pelo excelente convívio, por toda ajuda, e pelo critério no
auxílio de alguns experimentos envolvendo este trabalho.
Aos meus queridos pacientes e seus proprietários que tornaram esse experimento
possível.
À minha mãe Regina Maria de Souza Borin, não somente por sua luta incessante
para que eu viesse ao mundo, mas por todo apoio, amor, carinho, críticas, incentivo
e busca pela minha felicidade. Não importa o que aconteça, eu sei que sempre a
terei ao meu lado.
À “turma do lado de lá” que está sempre guiando meus passos e iluminando meu
caminho. Ao meu pai Luiz Anselmo Borin pela minha vida, à minha avó Adelina
Cavalheiro de Souza por ter sido a melhor avó do mundo, e à minha avó Helena
Martins Borin pelo belo exemplo de serenidade e fé.
À minha sogra Eliana Viccari Zuccolotto Crivellenti e ao meu sogro Hildebrando

Crivellenti, por me acolherem como uma verdadeira filha no seio de sua linda família.
Às minhas famílias Souza, Cavalheiro, Martins, Borin, Crivellenti e Zuccolotto! Avós,

avôs, tios, tias, cunhada e cunhado, primas e primos tão queridos! Agradeço a cada
um por todos os incríveis momentos compartilhados!
E, finalmente, ao meu esposo Leandro Zuccolotto Crivellenti, por seu apoio

incondicional, por seu amor, por me dar a sua mão e caminhar sempre ao meu lado,
por compartilhar comigo meus sonhos, por lutar por mim e por me defender, por me
incentivar e me motivar a ser uma pessoa melhor todos os dias. “Euteamo”, assim
sem vírgulas, espaço e sem ponto final.
i
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS................................................................................ iii

LISTA DE FIGURAS................................................................................ iv
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................... vii
RESUMO................................................................................................. viii
ABSTRACT.............................................................................................. ix
1. INTRODUÇÃO.............................................................................. 1
2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................ 3
3. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 10
3.1 Animais e grupos experimentais.............................................. 10
3.2 Obtenção das amostras ......................................................... 13
3.3 Avaliação do quadro hematológico........................................ 13
3.3.1 Eritrograma e leucograma............................................. 13
3.3.2 Reticulocitometria.......................................................... 14
3.4 Bioquímica sérica e urinária.................................................... 14
3.5 Urinálise.................................................................................. 15
3.6 Aferição da pressão arterial sistêmica.................................... 15
3.7 Avaliação citológica da medula óssea.................................... 16
3.8 Dosagens dos hormônios e citocinas séricos......................... 18
3.9 Análise estatística................................................................... 19
4. RESULTADOS.............................................................................. 20
4.1 Provas de função renal.......................................................... 20
4.2 Eritrograma e leucograma...................................................... 21
4.3 Citologia da medula óssea ..................................................... 23
4.4 Fatores indutores e supressores da eritropoiese.................... 29
5. DISCUSSÃO................................................................................. 31
6. CONCLUSÕES............................................................................. 36
7. REFERÊNCIAS............................................................................. 37
APÊNDICES........................................................................................ 44
ii
iii
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Nomenclatura da série eritróide............................................ 4
Tabela 2. Estadiamento da doença renal crônica canina segundo a

International Renal Interest Society (IRIS), 2009.................. 11
Tabela 3. Subestadiamento da doença renal crônica canina segundo

a International Renal Interest Society (IRIS), 2009............... 12
Tabela 4. Cálculo das diferentes relações e índices para a

investigação da eritropoiese................................................. 16
Tabela 5. Valores médios e desvios-padrão obtidos para o perfil

morfofuncional renal em cães controle (CG) e doentes
renais crônicos nos estágios 2 (DRC2), 3 (DRC3) e 4
(DRC4). Jaboticabal, 2014.................................................... 20
Tabela 6. Valores médios e desvios-padrão obtidos para o

eritrograma e leucograma em cães controle (CG) e
naqueles nos estádios 2 (DRC2), 3 (DRC3) e 4 (DRC4) da
doença renal crônica canina. Jaboticabal, 2014................... 21
Tabela 7. Valores médios e desvios-padrão obtidos para as variáveis

citológicas da medula óssea com vistas à avalição da
eritropoiese em cães controle (CG) e naqueles nos
estádios 2 (DRC2), 3 (DRC3) e 4 (DRC4), da doença renal
crônica canina. Jaboticabal, 2014 ........................................ 23
Tabela 8. Valores médios e desvios-padrão obtidos para os fatores

indutores (EPO e IL-3) e supressores (PTH, IL-1β, TNFα e
IFNγ) da eritropoiese avaliados em cães controle (GC) e
doentes renais crônicos nos estádios 2 (DRC2), 3 (DRC3)
e 4 (DRC4). Jaboticabal, 2014.......................................... 29
iv
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Esquema ilustrativo da eritropoiese nos mamíferos. A
partir da CFU-E, unipotencial e comprometida com a série
eritróide, tem início a produção de células eritróides na
medula óssea, que sequencialmente inclui os estádios de
proeritroblastos, eritroblastos basofílicos, eritroblastos
policromatofílicos, eritroblastos ortocromáticos,
reticulócitos e eritrócitos maduros. Adaptado de Williams
Hematology (PRCHAL, 2010). EPO, eritropoietina; GM-
CSF, fator estimulador de colônia de granulócitos e
macrófagos; IL-3, interleucina 3; CFU-E, unidade
formadora de colônia eritróide; BFU-E, unidade formadora
do burst eritróide; CFU-GEMM, unidade formadora de
colônia granulócitos, eritrócitos, monócitos/macrófagos...... 6
Figura 2. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea canina à

microscopia de luz. Em A e B estão ilustrados
monocamadas de hemácias, permeadas por precursores
mielóides e eritróides, e importante componente adiposo
(obj10x). Em C e D está destacada a monocamada de
hemácias, formando visíveis cordões, e deixando antever
a proporcionalidade e a distinção no padrão de cromatina
das células precursoras eritróides e mielóides da medula
óssea (obj40x). Em E, F, G e H estão evidenciadas células
precursoras eritróides e mielóides, em objetiva de imersão,
na qual se estabelece a quantificação das células
medulares com vistas à obtenção do mielograma e, em
cujas ilustrações, diferentes estádios evolutivos
eritrocitários estão identificados (seta): PE, proeritroblasto;
EB, eritroblasto basofílico; EP, eritroblasto
policromatofílico; EO, eritroblasto ortocromático (obj100x).
Coloração May-Grünwald-Giemsa. Jaboticabal, 2014......... 17
Figura 3. Representação gráfica dos valores médios do eritrograma

dos cães controle (GC) e doentes renais crônicos nos
estádios 2 (DRC2), 3 (DRC3) e 4 (DRC4). Jaboticabal,
2014...................................................................................... 22
Figura 4. Representação gráfica dos valores médios do leucograma

dos cães controle (GC) e dos doentes renais crônicos nos
estádios 2 (DRC2), 3 (DRC3) e 4 (DRC4). Jaboticabal,
2014...................................................................................... 22
v
Figura 5. Representações gráficas (mediana e intervalos

interquartis) dos percentuais de precursores eritróides (A),
relação mielóide/eritróide (M:E) (B), relação de
precursores eritróides imaturos e maduros (I:Me) (C) e
índice de maturação eritrocitário (EMI) (D) dos cães
controle e com doença renal crônica nos estádios 2
(DRC2), e (DRC3) e 4 (DRC4). Jaboticabal, 2014...............
24
Figura 6. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea de um

exemplar do grupo controle à microscopia de luz.
Ilustrações da franja do esfregaço medular estão
representadas em A (obj4x) e B (obj10x). O corpo da
lâmina está representado em C (obj4x) e D (obj40x),
destacando, nesta última, a monocamada de hemácias,
formando visíveis cordões, e deixando antever a
proporcionalidade e a distinção no padrão de cromatina
das células precursoras eritróides e mielóides da medula
óssea. Em E, estão evidenciadas as células precursoras
eritróides e mielóides em grande aumento, na qual se
estabelece a quantificação das células medulares com
vistas à obtenção do mielograma (obj100x). Coloração
May-Grünwald-Giemsa. Jaboticabal, 2014........................... 25

exemplar do grupo DRC2 à microscopia de luz. Ilustrações
da franja do esfregaço medular estão representadas
em A (obj4x) e B (obj10x). O corpo da lâmina está
representado em C (obj4x) e D (obj40x), destacando,
nesta última, a monocamada de hemácias, formando
visíveis cordões, e deixando antever a proporcionalidade e
a distinção no padrão de cromatina das células
precursoras eritróides e mielóides da medula

nesta última, a monocamada de hemácias, formando 27
vi

May-Grünwald-Giemsa. Jaboticabal, 2014...........................

nesta última, a monocamada de hemácias, formando
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
BFU-E – burst eritróide MO – medula óssea

CFU-E – unidade formadora de colônia PAS – pressão arterial sistólica
eritróide PE – proeritroblasto
CHCM – concentração de hemoglobina PTH – paratormônio
corpuscular média rhEPO – eritropoietina recombinante
CTH – célula tronco hematopoiética humana
D.O. – densidade óptica rhG-CSF – fator estimulante de colônia
DRC – doença renal crônica de granulócitos recombinante humano
DRC2 – grupo DRC estádio 2 TNFα – fator de necrose tumoral alfa
DRC3 – grupo DRC estádio 3 UPC – razão proteína creatinina urinária
DRC4 – grupo DRC estádio 4 VCM – volume corpuscular médio
DU – densidade urinária
EB – eritroblasto basofílico
EFNa – excreção fracionada de sódio
EMI – índice de maturação eritrocitário
EO – eritroblasto ortocromático
EP – eritroblasto policromatofílico
EPO – eritropoietina
GC – grupo controle
GM-CSF – fator estimulante de colônia
de granulócitos e macrófagos
I:Me – relação de precursores eritróides
imaturos e maduros
IFNγ – interferon gama
IL-1β – interleucina 1 beta
IL-3 – interleucina 3
IRIS – International Renal Interest
Society
LLD – limite inferior de detecção
M:E – relação mielóide eritróide
viii
FATORES INDUTORES E SUPRESSORES DA ERITROPOIESE EM CANINOS

DOENTES RENAIS CRÔNICOS
RESUMO – Este estudo teve como objetivo a quantificação sérica de hormônios e

citocinas indutores (eritropoietina e IL-3) e supressores (paratormônio, IL-1β, TNFα e
IFNγ) da eritropoiese, correlacionando-os com as variáveis eritrocitárias periféricas e
centrais. Amostras de sangue periférico, urina e medula óssea foram obtidas de 10
cães com doença renal crônica estádio 2 (DRC2), 10 cães com DRC estádio 3
(DRC3), 10 cães com DRC estádio 4 (DRC4) e 10 cães adultos saudáveis (grupo
controle) com vistas à realização de hemograma, análise bioquímica sérica e urinária,
urinálise, ensaios imunoenzimáticos e análise citológica da medula óssea. As
concentrações dos fatores indutores e supressores da eritropoiese, assim como os
resultados do mielograma dos cães do DRC2 assemelharam-se aos do grupo
controle, e apesar de não terem manifestado anemia, a presença de reticulocitose
alerta para o fato de fatores externos a medula óssea estarem precocemente
causando perda ou destruição dos eritrócitos. A anemia em cães com DRC está
relacionada ao aumento nas concentrações de paratormônio e TNFα, e a
exacerbação dos referidos fatores supressores, bem como à hipoplasia da série
eritróide, representada principalmente pela redução da população de eritroblastos
policromatofílicos e ortocromáticos, constituem, parcialmente, a base da gênese e do
agravamento do estado anêmico nas fases mais avançadas da DRC em cães.
Palavras-chave: eritropoietina, IFNγ, interleucinas, mielograma, paratormônio, TNFα

ix
ERYTHROPOIESIS STIMULATOR AND SUPPRESSOR FACTORS IN DOGS

WITH CHRONIC KIDNEY DISEASE
ABSTRACT - The aim of this study was to evaluate bone marrow precursor cells,
circulating concentrations of cytokines and hormones that can stimulate
(erythropoietin and IL-3) and suppress (parathyroid hormone, IL-1β, TNF and IFN)
erythropoiesis, and make their correlation with the peripheral and central erythrocyte
variables. Peripheral blood samples, urine and bone marrow were obtained from 10
dogs with chronic kidney disease stage 2 (CKD2), 10 dogs with CKD stage 3 (CKD3),
10 dogs with CKD stage 4 (CKD4), and 10 healthy adult dogs (control group) for
complete blood count (CBC), serum and urinary biochemical analysis, urinalysis,
immunoassays and cytological analysis of bone marrow. The concentrations of
erythropoiesis stimulator and suppressor factors, and cytological bone marrow results
from CKD2 dogs were similar to those of the control group. This group also exhibited
reticulocytosis even though not have expressed anemia, which means that extrinsic
factors are early cause of blood loss or destruction of red blood cells. The anemia in
dogs with CKD is related to increased parathyroid hormone and TNFα serum
concentrations. The increases of such suppressor factors in association with
erythroid hypoplasia are considered as part of the genesis and the aggravation of the
anemic state in the end stages of CKD in dogs.
Keywords: erythropoietin, IFNγ, interleukins, myelogram, parathyroid hormone,

TNFα
1
1. INTRODUÇÃO
Há relativamente pouco tempo se reconhece que a eritropoiese é um

processo muito mais complexo do que se pensava. Embora a eritropoietina (EPO)
ainda seja o principal estímulo para diferenciação e proliferação das células
eritróides, bem como de prevenção da apoptose, a ação da EPO pode ser
influenciada positiva ou negativamente tanto por outros hormônios, quanto por
citocinas e fatores de crescimento.
O estado anêmico evidenciado no plano clínico-patológico da doença renal
crônica trata-se, indiscutivelmente, de uma síndrome multifatorial, a qual pode ser
agravada pelas inúmeras lesões causadas pela uremia ao longo do trato
gastrintestinal, levando à hematêmese, melena e hematoquesia; modificação da
proporção de fosfolípides e de colesterol na membrana dos eritrócitos, o que
aumenta sua fragilidade e diminui seu tempo de vida; hiporexia e poliúria, levando
ao consumo insuficiente e a perda, respectivamente, de minerais e vitaminas
importantes à eritropoiese, dentre outras causas. Entretanto, a exata natureza das
toxinas urêmicas ainda se mantém obscura, e o paratormônio, assim como citocinas
tais como a interleucina 1 beta (IL-1β), o interferon gama (IFNγ) e fator de necrose
tumoral alfa (TNFα), têm sido amplamente investigados como potenciais fatores
supressores da eritropoiese em humanos, em diferentes tipos de doenças crônicas.
Diante dos dados obtidos na dissertação de mestrado conduzida pelo grupo
de estudos em hematologia veterinária da FCAV/Unesp – Jaboticabal (BORIN, 2011),
e após a devida correlação dos achados da citologia de medula óssea e o
hemograma de cães com doença renal crônica, constatou-se que as variáveis
hematológicas periféricas e centrais comportaram-se de distintas formas nos
diferentes estádios da doença renal crônica. O momento exato, cujos fatores
indutores e supressores da eritropoiese atuam, isoladamente ou em conjunto, não
pareceu claro, no grupo de pacientes estudados. Diante de tais resultados, aventou-
se que uma investigação mais aprofundada da eritropoiese, especialmente com
relação ao comportamento dos hormônios eritropoietina e paratormônio, bem como
de conhecidas citocinas indutoras (IL-3) e supressoras (IL-1β, TNFα, IFNγ) da
eritropoiese, contribuirá não somente para um melhor entendimento da gênese da
2
anemia nos pacientes com doença renal crônica canina em suas distintas fases, mas
para, talvez futuramente, se alcançar meios mais eficazes de tratamento desta
importante alteração.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
O processo pelo qual as células progenitoras hematopoiéticas produzem

eritrócitos é chamado de eritropoiese. A dinâmica da diferenciação, proliferação e
amadurecimento de células eritrocitárias engloba quatro compartimentos distintos
que incluem o das células-tronco hematopoiéticas (CTH), das células progenitoras
eritróides, das células precursoras eritróides e dos eritrócitos maduros (CAR, 2000).
Dois progenitores comprometidos com a linhagem eritróide já estão bem
estabelecidos com base nos estudos envolvendo culturas celulares in vitro, ou sejam,
as chamadas unidades formadoras de burst eritróides (BFU-E) e unidades
formadora de colônias eritróides (CFU-E). A diferenciação das CTH multipotenciais
em BFU-E, bem como destas em CFU-E, e, derradeiramente, destas últimas em
precursores eritróides, é regulada, principalmente, pela interleucina 3 (IL-3) e pelo
fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (JAIN, 1993).
As BFU-E primitivas têm intensa capacidade proliferativa e são dependentes
de grande quantidade de eritropoietina por expressarem baixa densidade de
receptores para eritropoietina (EPO). Na medida em que as BFU-E evoluem e se
diferenciam, na direção ao estádio das CFU-E, sua capacidade proliferativa diminui e
sua sensibilidade à eritropoietina (EPO) aumenta, expressando cada vez mais
receptores de membrana à eritropoietina. Inicialmente, são também responsivas a
outros fatores de crescimento hematopoiético, coletivamente denominados de
atividade promotora de burst (BPA), que incluem a IL-3 (estimulação de
multilinhagens celulares) e o GM-CSF (Fator Estimulador de Colônias de CTH
multipotencial e de linhagens granulocítica e macrofágica). Já, as CFU-E não
possuem grande capacidade proliferativa e são dependentes, obrigatoriamente, da
eritropoietina (OHLS et al., 1990).
A unidade formadora de colônia de eritrócitos (CFU-E) dá origem ao
proeritroblasto, primeiro precursor reconhecível da série eritróide, que, após divisão
mitótica dá origem ao eritroblasto basofílico. Este se divide dando origem ao
eritroblasto policromatofílico, que por sua vez, dá origem ao eritroblasto
ortocromático, precursor este já considerado não proliferativo. Em condições
normais, não há mais atividade mitótica a partir do eritroblasto ortocromático. Por
4
outro lado, com relação à hemoglobina, sua biossíntese tem início precocemente no
citoplasma dos precursores eritróides, já no estádio de eritroblasto basofílico e,
incrementa, na medida em que o eritroblasto evolui para os estádios de eritroblasto
policromatofílico e ortocromático, momento este último em que atinge seu apogeu, e
no qual há cariofagocitose do eritroblasto por parte do macrófago, topograficamente
situado no centro da ilhota eritroblástica. O estádio seguinte, já anucleado, é
denominado reticulócito, que exibe grau de hemoglobinização muito próximo
daquele de uma hemácia madura, mas que ainda apresenta organelas
intracitoplasmáticas e resíduos de RNA para continuidade da síntese protéica,
inclusive de hemoglobina. Após a saturação intracitoplasmática máxima de
hemoglobina, atinge-se, enfim, o estágio de eritrócito, morfofuncionalmente maduro
(OHLS et al., 1990). Devido aos diferentes sistemas de denominação para os
precursores eritrocitários (Tabela 1), optou-se por utilizar o Sistema Eritroblasto
como forma de padronização durante todo o texto.
Tabela 1. Nomenclatura da série eritróide.

SISTEMA ERITROBLASTO SISTEMA NORMOBLASTO SISTEMA RUBRÍCITO
Proeritroblasto Pronormoblasto Rubriblasto
Proeritroblasto basofílico Normoblasto basofílico Prorrubrícito
Eritroblasto basofílico Normoblasto basofílico Rubrícito basofílico
Eritroblasto policromatofílico Normoblasto policromatofílico Rubrícito policromatofílico
Eritroblasto ortocromático inicial Normoblasto ortocromático inicial Rubrícito normocrômica
Eritroblasto ortocromático tardio Normoblasto ortocromático tardio Metarrubrícito
* Adaptado de Stockham e Scott (2011).
A EPO é o fator de crescimento hematopoiético responsável pela estimulação

da eritropoiese em resposta à anemia. É uma glicoproteína de 30,4 kDa, que possui
meia-vida de 6 a 10 horas na circulação, produzida, em sua maior parte, pelas
células peritubulares intersticiais renais, sendo o fígado responsável por cerca de 10
a 15% da sua produção total (CAR, 2000). O principal sinal para o
desencadeamento da síntese de EPO é a hipoxemia renal. Por outro lado, a
hipersaturação de oxigênio tecidual resulta na diminuição de sua produção (GIGER,
1992).
5
A maneira pela qual a EPO estimula a diferenciação, proliferação e maturação

das células da linhagem eritrocitária, na medula óssea, tem relação com a sua
faculdade de estabelecer ligação com receptores específicos presentes na superfície
das células eritrocitárias (GIGER, 1992). A EPO é, também, considerada o principal
fator promotor da sobrevivência dos precursores eritrocitários (KOURY;
BONDURANT, 1988), pois além de estimular a produção de pró-eritroblastos a partir
das células tronco hematopoiéticas unipotenciais (CFU-E), também é capaz de
aumentar a velocidade de divisão e maturação dos diversos estádios eritroblásticos
em face de uma demanda aumentada (ERSLEV; BESARAB, 1997).
De outra parte, a IL-3, também conhecida como fator estimulador de
multilinhagens (multi-CSF), é um fator de crescimento produzido pelas células T
CD4+, que ao atuar sobre as CTH, dá suporte à proliferação de várias células
hematopoiéticas. Suas ações de regulação são mediadas por um complexo receptor
da membrana citoplasmática, presente nas células específicas da linhagem
hematopoiética, e em vários estágios de sua diferenciação (McCUBREY et al., 1991).
A influência dos fatores indutores da eritropoiese IL-3 e fator estimulador de colônia
de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e, de outra parte, do hormônio eritropoietina
(EPO), se dá em momentos diametralmente opostos, no processo de evolução da
célula eritrocitária, como ilustrado na Figura 1. A diferenciação das células-tronco
hematopoiéticas pluripotenciais em unidades formadoras de burst eritróides (BFU-E)
e destas para as unidades formadoras de colônias eritróides (CFU-E) é regulada,
principalmente, pela IL-3 e pelo GM-CSF. Por outro lado, se as BFU-E primitivas são
dependentes de grande quantidade de eritropoietina, à medida que se diferenciam,
suas capacidades proliferativas diminuem e sua sensibilidade à EPO aumenta
(PRCHAL, 2010).
6
Figura 1. Esquema ilustrativo da eritropoiese nos mamíferos. A partir da CFU-E,

unipotencial e comprometida com a série eritróide, tem início a produção de
células eritróides na medula óssea, que sequencialmente inclui os estádios
de proeritroblastos, eritroblastos basofílicos, eritroblastos policromatofílicos,
eritroblastos ortocromáticos, reticulócitos e eritrócitos maduros. Adaptado
de Williams Hematology (PRCHAL, 2010). EPO, eritropoietina; GM-CSF,
fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos; IL-3, interleucina
3; CFU-E, unidade formadora de colônia eritróide; BFU-E, unidade
formadora do burst eritróide; CFU-GEMM, unidade formadora de colônia
granulócitos, eritrócitos, monócitos/macrófagos.
Com relação aos valores do mielograma, a partir de preparações

microscópicas coradas e obtidas por citoaspiração da medula óssea, tem sido
reportado por vários autores que para cães sadios, adultos, machos ou fêmeas, o
total de células eritróides situa-se em torno de 38,5% e, ademais, que os
precursores da referida série eritróide distribuem-se de acordo com os seguintes
valores médios percentuais: proeritroblastos – 0 a 3,4%, eritroblastos basofílicos –
0,4 a 11,6%, eritroblastos policromatofílicos – 3,5 a 27,0% e eritroblastos
7
ortocromáticos – 0 a 25,8%. Além disso, que as células granulocitárias totais

perfazem cerca de 54,5% da celularidade medular. Também tem sido reportado
valores para linfócitos de 0 a 15,1%, plasmócitos de 0 a 4,3%, monócitos de 0 a
0,4%, megacariócitos de 0 a 1,0% e, finalmente, relação mielóide:eritróide (M:E)
normal é de em média 1,25:1 (JAIN, 1993).
O excesso de paratormônio (PTH), considerado atualmente como a principal
toxina urêmica (POLZIN, 2011), pode conduzir a graves alterações sistêmicas,
incluindo osteodistrofia renal (CHEW; DIBARTOLA, 1992), calcificação de tecidos
moles, hemorragias, intolerância a glicose, prurido, hiperlipidemia, entre outras
(MASSRY; GOLDSTEIN, 1979). Todavia, sua atuação direta ou indireta na
modulação da eritropoiese tem sido objeto de debates interessantes no meio
científico, sendo que alguns autores sugerem que o PTH seja capaz de suprimir a
eritropoiese tanto in vivo quanto in vitro (MEYTES et al., 1981; MACDOUGALL, 1995;
POLZIN, 2011). Rao, Shih e Mohini (1993) reportaram correlação positiva entre a
resistência à eritropoietina e o aumento do PTH, simultâneos à fibrose da medula
óssea.
O interferon gama (IFNγ), produzido por linfócitos T ativados e por células
natural killer, é um potente inibidor da hematopoiese. Tal linfocina possui importante
papel na fisiopatogenia das desordens hematopoiéticas associadas com aplasias
medulares e anemias aplásicas (SELLERI et al., 1995). Tem-se demonstrado que o
IFNγ é capaz de inibir as unidades formadoras de colônia (CFU) na medula óssea e
interferir na progressão dos precursores eritropoiéticos, dentro do ciclo celular, ou de
induzi-los à apoptose (SELLERI et al., 1996). Ademais, o IFNγ pode reduzir a
densidade de receptores de eritropoietina na superfície membranária das unidades
formadoras de colônia eritróides imaturas (MUTA; KRANTZ, 1993). Tais fatos
sugerem que o IFNγ inibe o crescimento dos progenitores hematopoiéticos,
possivelmente via apoptose (DAI; KRANTZ, 1999; CHOI et al., 2000).
Outras pesquisas têm demonstrado que a severidade da anemia nas doenças
infamatórias crônicas está relacionada ao aumento da concentração de interleucina-
1β (IL-1β). Assim, a redução da produção de EPO tem sido observada em doenças
associadas com excessiva produção de IL-1β. A IL-1β suprime a produção de
eritropoietina hepática e antagoniza seu efeito estimulador na proliferação dos
8
precursores eritróides na medula óssea (DINARELLO, 1992). Ademais, outros

trabalhos evidenciam que a IL-1β é capaz de inibir o crescimento in vitro de
unidades formadoras de colônias de eritrócitos humanos (CFU-E), na presença de
IFNγ (DINARELLO, 1996).
O fator de necrose tumoral alfa (TNFα) é considerado um regulador
bifuncional da hematopoiese, que, em doses pequenas e infrequentes, estimula o
desenvolvimento de células imaturas e, que, em doses altas e frequentes, induz um
decréscimo de progenitores eritrocitários (ZHANG et al., 1995). Semelhantemente ao
IFNγ, o TNFα também guarda relação com resposta medular eritropoiética
inadequada, nas anemias inflamatórias crônicas, suscitando síntese inadequada de
EPO, bem como inibindo a proliferação dos progenitores eritrocitários e reduzindo a
expressão de receptores membranários à EPO (MEANS JUNIOR, 1999).
A doença renal crônica (DRC), principal afecção renal dos cães (FINCO, 1995;
POLZIN; OSBORNE, 1995; POLZIN, 2011), reflete-se na perda da capacidade
excretora e concentradora dos rins, com redução da filtração glomerular e
consequente aumento nas concentrações plasmáticas de substâncias indesejáveis
que, no estado de higidez morfofuncional renal, são eliminadas (POLZIN et al., 2005).
Do ponto de vista diagnóstico, tanto para fins clínicos quanto experimentais, a
International Renal Interest Society (IRIS, 2009) 1 , determinou e padronizou o
estadiamento da DRC em 4 estádios: 1 – ausência de azotemia, 2 – azotemia leve,
3 – azotemia moderada e 4 – azotemia severa. Além disso, instituiu o
subestadiamento da DRC, tomando como base os valores obtidos para a razão
proteína/creatinina urinária (UPC) e pressão arterial sistêmica, do paciente.
O estado anêmico, de origem multifatorial, invariavelmente compõe o quadro
do binômio morbidade-mortalidade, evidenciado no plano clínico-patológico por
pacientes caninos portadores de DRC (WALLNER et al., 1976). Ademais, sabe-se
que os rins são os principais sítios de produção da eritropoietina nos cães (MORITZ
et al., 1997), e que várias substâncias presentes no soro de pacientes com DRC são
capazes de inibir a eritropoiese in vitro (POLZIN et al., 2005).
Com base nos resultados obtidos em estudos precedentes, observou-se que
a maioria dos cães em estádio 2 da DRC não apresentou anemia, e que apesar
1
http://www.iris-kidney.com/pdf/IRIS%202006%20Staging%20of%20CKD.pdf
9
disso, verificou-se a existência de reticulocitose. Anemia normocítica normocrômica

leve manifestou-se inicialmente nos cães em estádio 3, apresentando correlação
positiva com azotemia e hiperfosfatemia. Já o estádio 4 da DRC foi marcado por
severa anemia normocítica normocrômica arregenerativa, associada tanto aos
marcadores bioquímicos séricos creatinina e fósforo, quanto à presença de marcante
hipoplasia da série eritróide na medula óssea. Diante dos achados acima referidos
observou-se que, caninos doentes renais crônicos, provavelmente apresentaram
anemia normocítica normocrômica em decorrência de uma ação sinérgica entre
toxinas urêmicas e inibição da eritropoiese, in vivo (BORIN, 2011).
Com base na revisão de literatura precedente, esta tese teve por objetivo
geral aprofundar o estudo da anemia de cães nos diferentes estádios da doença
renal crônica por intermédio da quantificação de hormônios e citocinas indutores e
supressores da eritropoiese, correlacionando-os com as variáveis eritrocitárias
periféricas e centrais. Para tal, objetivou-se especificamente quantificar sericamente
eritropoietina e paratormônio, fator de necrose tumoral alfa, interleucina 3, interferon
gama e interleucina 1 beta, assim como realizar a avaliação hematológica completa
dos cães incluídos neste experimento, utilizando-se do hemograma, da contagem de
reticulócitos e pela realização da análise citológica da medula óssea (mielograma)
para obtenção das populações de precursores eritróides e dos índices eritrocitários
importantes para a avaliação global da eritropoiese.
10
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais e grupos experimentais
Neste ensaio foram incluídos 40 cães adultos, oriundos do canil

experimental e da rotina do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” (GLN) da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual
Paulista (Unesp), Câmpus de Jaboticabal. A utilização dos animais seguiu o
protocolo previamente aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)
(Protocolo nº 011861/11) da FCAV/Unesp, Câmpus de Jaboticabal, e nenhum
paciente fez parte deste estudo senão após consentimento expresso do proprietário,
por intermédio de preenchimento e subscrição de ficha de consciência e de
concordância com as condições do protocolo experimental. Os animais foram
distribuídos em quatro grupos experimentais, como a seguir:
Grupo Controle (GC): O grupo controle compôs-se de três fêmeas e sete
machos, todos sem raça definida e cujo peso oscilou entre 17,54±7,11 kg.
Apresentaram idades que variaram de seis a 12 anos (8±1,75 anos), sendo que
75% dos animais encontravam-se na faixa etária de seis a nove anos, e cujo
bom estado de saúde foi aquilatado com base em exames clínicos gerais,
laboratoriais de rotina e pela estimativa da taxa de filtração (clearance) de
creatinina endógena de 24 horas. Salienta-se que foi adotada a idade acima de
cinco anos para os animais do grupo controle, no sentido de se buscar
homogeneidade e validação dos achados hematológicos e medulares, pois a
morbidade é predominante nos pacientes caninos com DRC em idade mais
avançada (LEES, 2004) e a medula óssea pode sofrer alterações em sua
composição com o envelhecimento (SANTANA, 2000).
Grupo de Doentes Renais Crônicos: o grupo de doentes renais crônicos
compôs-se de 30 cães, de quaisquer gêneros, raça e idade, com diagnóstico de
DRC e sem histórico ou alterações clínicas e clínico-patológicas de outras
doenças. Tais cães foram subalocados segundo a classificação da IRIS para
DRC em um dos estádios 2, 3 ou 4 (Tabela 2) (IRIS, 2009), propiciando a
constituição dos grupos DRC2 (10 cães), DRC3 (10 cães) e DRC4 (10 cães),
11
respectivamente. As raças que integraram o grupo DRC foram Poodle (n=6),

Cocker spaniel (n=2), Weimaraner (n=2), Labrador retriever (n=1), Fox terrier
(n=1), São Bernardo (n=1), Chow Chow (n=1), Shih Tzu (n=1), Boxer (n=1) e
Maltês (n=1); sendo os 13 cães remanescentes sem raça definida. O grupo de
doentes renais crônicos estádio 2 (DRC2) compôs-se de quatro fêmeas e seis
machos, cujo peso oscilou entre 10,66±8,21 kg, com idades entre quatro e 15
anos (11±3,53 anos), sendo 50% situados na faixa etária entre oito e 10 anos.
No grupo DRC3 foram incluídos cinco fêmeas e cinco machos, cujo peso oscilou
entre 21,73±18,68 kg com idades variando entre quatro e 15 anos (10±3,8 anos),
sendo que 50% deles encontravam-se na faixa etária de 10 a 15 anos. Os cães
doentes renais crônicos classificados no estádio 4 (DRC4) perfizeram três
fêmeas e sete machos, cujo peso oscilou entre 17,91±14,05 kg com idades
variando entre quatro e 16 anos (9,5±4,24 anos), sendo 50% situado na faixa
etária de nove a 16 anos.
A idade e o peso foram considerados como critério de seleção dos animais do

grupo controle, os quais foram pareados com os animais dos grupos DRC; não
havendo, portanto, diferença significativa entre estas variáveis nos grupos estudados
considerando o grupo DRC como um todo (P=0,8358; P=0,3818, respectivamente)
ou subestadiando-o de acordo com a IRIS (P=0,3956; P=0,2106, respectivamente).
Como critério de inclusão no grupo DRC, foram levados em consideração a
evolução clinica da doença de mais de 15 dias e a constatação de valores de
creatinina sérica superiores a 1,4 mg/dL, após devida hidratação do paciente,
valores estes obtidos em dois ou três momentos diferentes e ao longo de algumas
semanas.
Tabela 2. Estadiamento da doença renal crônica canina segundo a International

Renal Interest Society (IRIS), 2009.
ESTÁDIO CREATININA (mg/dL)
1 – Não azotêmico <1,4
2 – Levemente azotêmico 1,4 – 2,0
3 – Moderadamente azotêmico 2,1 – 5,0
4 – Severamente azotêmico >5,0
12
Ainda, seguindo a classificação proposta pela IRIS (2009), as unidades

experimentais integrantes deste ensaio foram avaliadas quanto à proteinúria de
origem renal, bem como à hipertensão arterial sistólica (Tabela 3). A categorização
do paciente proteinúrico foi estabelecida somente após a exclusão de fatores pré e
pós-renais, de aumento da proteína na urina, além da confirmação e persistência da
proteinúria, com base na determinação do valor da razão proteína/creatinina urinária
(UPC), em diferentes momentos ou atendimentos clínicos (duas a três ocasiões com
intervalo mínimo de 15 dias). Da mesma maneira, os valores da pressão arterial
sistólica foram confirmados após três aferições realizadas em momentos ou
atendimentos diferentes.
Tabela 3. Subestadiamento da doença renal crônica canina segundo a International

Renal Interest Society (IRIS), 2009.
SUBESTÁDIOS VALOR DE UPC
Não proteinúrico (NP) <0,2
Proteinúria limítrofe (PL) 0,2 – 0,5
Proteinúrico (P) >0,5
PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA (mmHg)
Risco mínimo (0) <150
Baixo risco (1) 150 – 159
Risco Moderado (2) 160 – 179
Alto risco (3) ≥180
Aqui vale ressaltar que, diante das dificuldades impostas ao diagnóstico da

DRC em pacientes não azotêmicos, pela ausência de sinais clínicos e necessidade
da realização de exames que comprovassem a redução progressiva da taxa de
filtração glomerular, o grupo de pacientes DRC estádio 1 não foi incluído nesse
delineamento experimental. De outra parte, diante do fato dos pacientes DRC
estádio 2 não apresentarem sinais clínicos relacionados com a disfunção renal, à
exceção de poliúria e polidipsia, e estas serem manifestações comuns a diversas
doenças do trato geniturinário e sistêmicas, realizou-se prévia mensuração da
excreção fracionada de sódio afim de confirmar a presença de DRC nestes
pacientes.
Não foram incluídos no grupo controle e nos grupos de doentes renais
crônicos, pacientes que já tivessem sido submetidos a transfusões sanguíneas ou ao
tratamento com quaisquer fármacos indutores de hematopoiese, tais como
nandrolona, rhG-CSF (fator estimulador de colônia de granulócitos recombinante
13
humano), timomodulina e/ou rhEPO (eritropoietina recombinante humana), assim

como portadores de quaisquer comorbidades, incluindo hemoparasitose, neoplasia,
cardiopatias, dermatopatias, endocrinopatias, etc.
3.2 Obtenção das amostras
As amostras de sangue periférico foram obtidas por venipunção jugular e

envasadas em tubos a vácuo contendo K2-EDTA para realização das análises
hematológicas, e em tubos a vácuo sem anticoagulante para obtenção do soro, após
centrifugação, por 15 minutos à 800 G, em centrífuga refrigerada. As amostras de
soro, assim obtidas, foram congeladas a 80º C negativos para posteriores análises
bioquímicas, hormonais e quantificação de citocinas. Após anestesia local (lidocaína
a 0,2% sem vasoconstritor), amostras de medula óssea (0,5 mL) foram obtidas por
punção aspirativa do esterno com auxílio de agulhas hipodérmicas e recolhidas em
seringas contendo K2-EDTA. As amostras de urina, de cada parcela experimental,
foram obtidas preferencialmente por micção espontânea ou cateterização uretral.
3.3 Avaliação do quadro hematológico
Todas as análises laboratoriais referentes ao quadro hematológico, dos

animais experimentais, foram realizadas no Laboratório de Patologia Clínica
Veterinária (LPCV) “Professor Dr. Joaquim Martins Ferreira Neto” do Hospital
Veterinário GLN/FCAV/Unesp, Câmpus de Jaboticabal, SP.
3.3.1 Eritrograma e leucograma
As contagens globais de eritrócitos, leucócitos, teor de hemoglobina, volume

globular ou hematócrito, volume corpuscular médio (VCM) e concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM), foram obtidos com o auxílio de um
contador automático de células 2 . A partir da contagem leucocitária global e da
fórmula leucocitária relativa, obteve-se a fórmula leucocitária absoluta, por uma regra
2
ABC Vet – HORIBA ABX – São Paulo/Brasil.
14
de três simples e os valores foram comparados com os valores de referência para a

espécie canina adotados no LPCV/FCAV/Unesp, Câmpus de Jaboticabal (Apêndice
A).
3.3.2 Reticulocitometria
Alíquotas de sangue total (100 PL) foram incubadas com igual quantidade
de Azul Brilhante Cresil, em banho-maria, à 37oC, por 15 minutos. Após a incubação
esfregaços sanguíneos foram confeccionados e contracorados com uma mistura de
Metanol, May-Grunwald e Giemsa. As contagens de reticulócitos foram, então,
conduzidas em ensaio cego, por profissional treinado e experiente. Com o auxílio de
um microscópio, objetiva de imersão (obj10x), foram realizadas contagens de
hemácias maduras e de reticulócitos em 20 campos uniformemente distribuídos. A
contagem absoluta dos reticulócitos foi obtida a partir da contagem global de
hemácias por uma regra de três direta.
3.4 Bioquímica sérica e urinária
As provas bioquímico-séricas e urinárias foram igualmente conduzidas junto

ao LPCV “Prof. Dr. Joaquim Martins Ferreira Neto” do Hospital Veterinário “GLN” da
FCAV/Unesp, Câmpus de Jaboticabal, SP e os valores foram comparados com os
valores de referência para a espécie canina (Apêndice B).
As amostras de soro foram processadas para determinação das
concentrações de creatinina (método Jaffé modificado), ureia (método enzimático),
proteína total (método biureto), albumina (método verde de bromocresol), cálcio total
(reação cromogênica com cresolftaleína complexona) e fósforo (método de Daly e
Ertingshausen modificado). Nas amostras de urina foram determinadas as
concentrações de creatinina (método Jaffé modificado) e proteína (método vermelho
de pirogalol). Tanto no caso das provas bioquímico-séricas, como urinárias, utilizou-
se o sistema Labtest para diagnóstico e as leituras foram realizadas em
espectrofotômetro semi-automático3.
3
Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, MG, Brasil.
15
Para o cálculo da razão proteína/creatinina urinária (UPC) utilizou-se a

fórmula:
UPt (mg/dL)
UPC =
Ucr (mg/dL)
*Sendo: UPC a razão proteína/creatinina urinária, UPt a concentração urinária de proteínas e Ucr a
concentração urinária de creatinina.
As concentrações séricas e urinárias de sódio foram determinadas utilizando-

se método íon-seletivo4. Para os cálculos da excreção fracionada de sódio utilizou-
se a fórmula que se segue:
UNa (mEq/L) x Scr (mg/dL)
EFNa = x 100
Ucr (mg/dL) x SNa (mEq/L)
*Sendo: EFNa = Excreção fracionada de sódio; UNa = concentração urinária de sódio; Scr =
concentração sérica de creatinina; Ucr = concentração urinária de creatinina; SNa = concentração
sérica de sódio.
3.5 Urinálise
Os caracteres físicos da urina tais como coloração e aspecto foram

avaliados macroscopicamente. A densidade urinária foi mensurada em refratômetro
digital5. Para a sedimentoscopia as amostras foram centrifugadas a 800 G durante
cinco minutos, sendo o sobrenadante reservado para análise da UPC e o sedimento
para confecção da lâmina com vistas à sedimentoscopia. A preparação entre lâmina
e lamínula foi analisada a fresco, empregando-se objetivas secas com aumento de
10 a 40x, para realização das contagens de cada tipo de elemento organizado, por
campo.
3.6 Aferição da pressão arterial sistólica
A pressão arterial sistólica (PAS) foi aferida, e sempre que possível foi
avaliada em três momentos distintos, por método indireto, utilizando-se de manguito
inflável aplicado ao redor do membro torácico direito, entre o cotovelo e o punho,
para ocluir o fluxo sanguíneo. Com auxílio de contenção física do paciente foi obtida
a média de cinco aferições. O manguito utilizado correspondeu a 40-50% da
4
ISLAB – Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, MG, Brasil.
5
ATAGO – Tóquio/Japão.
16
circunferência da extremidade envolvida, e para tanto foi empregado manguito

habitualmente utilizado na área de medicina pediátrica, tamanho infantil e neonatal.
A PAS foi então aferida por meio da detecção do fluxo sanguíneo nas artérias
superficiais do carpo utilizando-se de um aparelho ultrassônico com doppler
vascular6.
3.7 Avaliação citológica da medula óssea
As preparações citoscópicas de medula óssea (MO), devidamente fixadas e

coradas, foram avaliadas em ensaio cego, por profissional treinado e experiente.
Qualitativamente, e utilizando-se de objetiva seca (aumento de 10x), as
preparações microscópicas de MO foram analisadas e classificadas, segundo sua
celularidade, em normo, hiper ou hipocelular e quantidade de gordura (normal,
aumentada ou diminuída).
Quantitativamente, e utilizando-se de objetivas de imersão (aumento de
1000x) procederam-se as contagens absolutas de 500 precursores celulares das
séries eritróide (proeritroblastos, eritroblastos basofílicos, eritroblastos
policromatofílicos e eritroblastos ortocromáticos) e mielóide, e de outras células
diferenciadas (linfócitos, plasmócitos e monócitos) e seus precursores (Figura 2),
para enfim, estabelecer-se as contagens relativas e absolutas da população total
eritróide, mielóide e de outras células diferenciadas, assim como o índice de
maturação eritrocitária (EMI), relação mielóide eritróide (M:E) e relação dos
precursores eritróide imaturos e maduros (I:Me) utilizadas para avaliação da
eritropoiese, como apresentado na Tabela 4, justo a seguir.
Tabela 4. Cálculo das diferentes relações e índices para a investigação da

eritropoiese.
FÓRMULA EMPREGADA
Relação M:E Número de células mielóides (incluindo precursores eosinofílicos e basofílicos) /
Número de células eritróides nucleadas
Relação I:Me Número de proeritroblastos + eritroblastos basofílicos / Número de eritroblastos
policromatofílicos e ortocromáticos
EMI (1/I:Me) Número de eritroblastos policromatofílicos e ortocromáticos/ Número de
proeritroblastos + eritroblastos basofílicos
* Adaptado de Mischke e Busse (2002). M:E, relação mielóide eritróide; I:Me, relação dos precursores eritróides
imaturos e maduros; EMI, índice de maturação eritrocitária.
6
MICROEM – Ribeirão Preto, SP/Brasil
17
Figura 2. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea canina à microscopia

de luz. Em A e B estão ilustrados monocamadas de hemácias,
permeadas por precursores mielóides e eritróides, e importante
componente adiposo (obj10x). Em C e D está destacada a
monocamada de hemácias, formando visíveis cordões, e deixando
antever a proporcionalidade e a distinção no padrão de cromatina das
células precursoras eritróides e mielóides da medula óssea (obj40x).
Em E, F, G e H estão evidenciadas células precursoras eritróides e
mielóides, na qual se estabelece a quantificação das células
medulares com vistas à obtenção do mielograma e, em cujas
ilustrações, diferentes estádios evolutivos eritrocitários estão
identificados (seta): PE, proeritroblasto; EB, eritroblasto basofílico; EP,
eritroblasto policromatofílico; EO, eritroblasto ortocromático (obj100x).
Coloração May-Grünwald-Giemsa. Jaboticabal, 2014.
18
3.8 Dosagens dos hormônios e citocinas séricos
Os testes pilotos e as dosagens de eritropoietina7 e paratormônio8, bem como

de IL-1β 9 , IL-3 10 , TNFα 11 e IFNγ 12 foram conduzidas utilizando-se de ensaios
imunoenzimáticos (ELISA) de acordo com as recomendações descritas pelo
fabricante, nas dependências do Laboratório Pesquisa do Departamento de Clínica e
Cirurgia da FCAV/Unesp, Câmpus de Jaboticabal, SP.
Os referidos kits são ensaios imunoenzimáticos do tipo ELISA sanduíche para
determinações quantitativas in vitro de EPO, IL-1β, IL-3, TNFα e IFNγ, e inibição
competitiva para determinação do PTH no soro canino. As placas de microtitulações
fornecidas nestes kits são pré-revestidas com anticorpos monoclonais específicos
para cada variável. Resumidamente, padrões e amostras foram adicionados aos
poços da placa de microtitulação com anticorpo policlonal conjugado à biotina. Em
seguida, as microplacas foram incubadas após a adição do conjugado de avidina e
peroxidase de rábano (HRP). Uma solução de substrato TMB foi adicionada a cada
poço e apenas os poços que continham a variável analisada, anticorpo conjugado à
biotina e enzima conjugada à avidina apresentaram mudança de cor. As reações
foram finalizadas pela adição de uma solução de ácido sulfúrico e as mudanças de
cor medidas espectrofotometricamente13 em comprimento de onda de 450 nm. As
concentrações dos hormônios e citocinas séricos dos cães com DRC e do grupo
controle foram, então, determinadas através de análises por regressão linear pela
comparação das densidades ópticas (D.O.s) das amostras com as curvas padrões
no momento das análises estatísticas.
A sensibilidade para os ensaios acima referidos, ou limite inferior de detecção
(LLD), foi definida como a menor concentração de proteína que pode ser
diferenciada a partir de zero (determinada a partir da média das D.O.s de 20
repetições do padrão zero e seus desvios-padrão). Nenhuma reatividade cruzada
significativa ou interferência entre os parâmetros caninos e análogos foi observada
7
E90028Ca ELISA KIT, Uscn Life Science Inc., Wuhan, China.
8 E90866Ca ELISA KIT, Uscn Life Science Inc., Wuhan, China.
13
Leitora de microplacas, iMark, Bio-Rad, Japão.
19
nos kits utilizados de acordo com o fabricante. Os limites de detecção para PTH, IL-
1β, IL-3, IFNγ, TNFα e EPO foram 2,8 pg/mL, 7,3 pg/mL, 7,8 pg/mL, 13,8 pg/mL, 6,9
pg/mL e 0,042 U/L, respectivamente. A exemplo do trabalho realizado por Pereira et
al. (1994), também neste caso, às amostras cujas concentrações encontraram-se
abaixo do limite de detecção, atribuíram-se lhes valores equivalentes aos referidos
limites de detecção.
3.9 Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise de variância do programa estatístico

JMP® (SAS) e GraphPad Prism software. Todos os resultados foram submetidos ao
teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e análise de via única ou teste de
Friedman, com posterior avaliação pelo teste t student ou Tukey, quando mais de
duas variáveis foram avaliadas. Valores de P<0,05 foram considerados significativos.
As correlações entre as concentrações dos fatores estimuladores e supressores da
eritropoiese com as variáveis eritrocitárias periféricas e centrais, bem como com os
marcadores bioquímico-séricos da funcionalidade renal, foram obtidas pelo teste de
Pearson para as variáveis que se apresentaram normalmente distribuídas e pelo
teste de Spearman para os dados não paramétricos.
20
4. RESULTADOS
4.1 Provas de função renal
As variáveis utilizadas na definição do perfil bioquímico-sérico para

fundamentação, avaliação e classificação dos pacientes portadores de DRC, de
acordo com a International Renal Interesting Society (IRIS), revelaram-se
apropriadas, posto que os níveis de creatinina, ureia e fósforo sérico, revelaram-se
significativamente, e gradativamente, crescentes com a progressão da doença
quando comparados àqueles dos animais controle. Da mesma forma, a bioquímica
urinária confirmou o crescente aumento da excreção fracionada do sódio, UPC e
pressão arterial sistólica com a progressão do quadro nos pacientes com DRC e, por
outro lado, valores compreendidos dentro do intervalo de normalidade para os
controle (EFNa ≤ 1 %; UPC < 0,3; PAS entre 120-160 mmHg). Adicionalmente, no
caso da densidade urinária, ela também se manteve dentro do intervalo fisiológico
para animais controle e significativamente reduzida nos animais acometidos por
DRC (Tabela 5).
Tabela 5. Valores médios e desvios-padrão obtidos para o perfil morfofuncional renal

em cães controle (CG) e doentes renais crônicos nos estágios 2 (DRC2),
3 (DRC3) e 4 (DRC4). Jaboticabal, 2014.
GC DRC2 DRC3 DRC4 p

Creatinina (mg/dL) 1,04±0,04a 1,79±0,06a 3,46±0,13b 7,33±0,97c <0,0001
Ureia (mg/dL) 29,93±3,61a 93,61±9,47a 154,3±11,94b 233,7±23,66c <0,0001
Fósforo (mg/dL) 4,40±0,20a 4,52±0,36a 6,39±0,74ab 9,64±2,43b 0,0166
Cálcio total (mg/dL) 10,01±0,23 9,80±0,42 10,84±0,33 10,83±0,33 0,0792
Proteína total (mg/dL) 7,13±0,18 6,67±0,40 6,18±0,16 6,47±0,22 0,0719
Albumina (mg/dL) 3,01±0,26 2,50±0,35 2,52±0,52 2,66±0,43 0,0667
DU 1,041±0,08a 1,018±0,02b 1,013±0,03bc 1,011±0,02c <0,0001
PAS (mmHg) 133,8±7,44a 172,5±13,09b 184,4±30,41b 193,6±34,73b 0,0002
UPC 0,07±0,01a 0,91±0,28ab 1,39±0,47b 1,39±0,28b <0,0001
EFNa (%) 0,43±0,06a 0,94±0,11ab 3,16±0,74b 6,85±1,18c <0,0001
DU, densidade urinária; UPC, razão proteína/creatinina urinária; PAS, pressão arterial sistólica; EFNa,
excreção fracionada de sódio. Variáveis seguidas de letras diferentes na mesma linha diferem
significativamente entre os grupos estudados (P<0,05).
21
4.2 Eritrograma e leucograma
Os dados obtidos para o eritrograma dos cães controle e naqueles acometidos

por DRC evidenciaram que a severidade da anemia progride nos cães em estádios
mais avançados da DRC, sendo tal severidade traduzida por valores
significativamente decrescentes do hematócrito, hemoglobina e hemácias. A
resposta reticulocitária afigurou-se como regenerativa no grupo DRC estádio 2 e
arregenerativa nos demais estádios da doença renal (estádios 3 e 4 – contagens
absolutas de reticulócitos abaixo de 50.000 céls/µL). Salienta-se que os índices
eritrométricos VCM e CHCM apresentaram-se dentro da estreita faixa de
normalidade para a espécie canina, achado que permite classificar,
morfologicamente, um estado de anemia normocítica normocrômica.
Por outro lado, ainda que não tenham sido verificados leucopenia e,
tampouco, alterações nos valores absolutos de granulócitos e monócitos nos grupos
estudados, observou-se significativa redução na contagem de linfócitos nos cães do
estádio 4 da DRC quando comparado aos cães do grupo controle (Tabela 6).
Tabela 6. Valores médios e desvios-padrão obtidos para o eritrograma e leucograma

em cães controle (CG) e naqueles nos estádios 2 (DRC2), 3 (DRC3) e 4
(DRC4) da doença renal crônica canina. Jaboticabal, 2014.
GC DRC2 DRC3 DRC4 p

ERITROGRAMA
Hematócrito (%) 50,48±4,36a 40,99±7,80b 33,74±5,88bc 28,87±5,83c <0,0001
Hemácias (x106/ µL) 7,27±0,67a 5,99±1,14b 4,88±1,01bc 4,16±1,01c <0,0001
Hemoglobina (g/dL) 16,25±1,98a 13,03±2,45b 10,89±1,57bc 9,11±1,77c <0,0001
Reticulócitos (céls/µL) 40.943±7.887a 94.606±22.973b 39.824±7.929a 20.138±8.102a 0,0033
VCM (fL) 69,49±3,02 68,41±3,71 69,47±3,92 69,88±3,97 0,8766
CHCM (g/dL) 32,10±1,40 31,79±1,17 32,41±1,35 31,62±1,08 0,6424
LEUCOGRAMA
Leucócitos totais
9.425±2.801 9.388±2.524 7.700±2.584 7.000±1.971 0,1718
(céls/µL)
Monócitos (céls/ µL) 375,5±91.30 265,1±52.01 168,4±30,84 211,6±70,40 0,1442
Granulócitos (céls/ µL) 7.653±2.944 7.135±2.322 6.136±2.109 6.084±2.265 0,5180
Linfócitos (céls/ µL) 1.615±199,1a 1.374±141,7ab 1.180±119,8ab 811,4±115,3b 0,0127
Variáveis seguidas de letras diferentes na mesma linha diferem significativamente entre os grupos
estudados (P<0,05).
22
Para melhor visibilização do comportamento das variáveis hematológicas,

cujos valores médios foram obtidos de cães controle e daqueles acometidos por
DRC, vide as Figuras 3 e 4, apresentadas a seguir.
Figura 3. Representação gráfica dos valores médios do eritrograma dos cães

controle (GC) e doentes renais crônicos nos estádios 2 (DRC2), 3
(DRC3) e 4(DRC4). Jaboticabal, 2014.
3
Linfócitos (x 10 céls/uL)
3
Granulócitos (x 10 céls/uL)
3
Monócitos (x 10 céls/uL)
3
Leucócitos totais (x 10 céls/uL)
Figura 4. Representação gráfica dos valores médios do leucograma dos cães

controle (GC) e dos doentes renais crônicos nos estádios 2 (DRC2), 3
(DRC3) e 4(DRC4). Jaboticabal, 2014.
23
4.3 Citologia da medula óssea
Qualitativamente, as medulas dos animais controle apresentaram-se

predominantemente com padrão normocelular (70%). Houve predomínio de medulas
hipocelulares em todos os grupos de DRC, sendo esta leve em 62.5% dos DRC2,
moderada em 37.5% dos DRC3 e severa em 62.5% dos DRC4. Ademias, não foi
observado nenhum grau de mielodisplasia em nenhum cão deste estudo.
A população de precursores mielóides foi quantificada em sua totalidade,
enquanto a linhagem eritróide foi quantificada em sua totalidade e quanto à ordem
de maturação de seus precursores (proeritroblastos, eritroblastos basofílicos,
policromatofílicos e ortocromáticos). Tais variáveis acrescidas dos cálculos dos
índices e relações importantes à avaliação da eritropoiese podem ser apreciados na
Tabela 7.
Tabela 7. Valores médios e desvios-padrão obtidos para as variáveis citológicas da

medula óssea com vistas à avalição da eritropoiese em cães controle (CG)
e naqueles nos estádios 2 (DRC2), 3 (DRC3) e 4 (DRC4), da doença
renal crônica canina. Jaboticabal, 2014.
GC DRC2 DRC3 DRC4 p

Proeritroblastos (%) 0,49±0,15 0,69±0,19 0,58±0,16 1,37±0,62 0,2820
Eritroblastos basofílicos (%) 2,32±0,57 3,94±0,69 3,88±0,78 2,58±0,36 0,1590
Eritroblastos Policromatofílicos (%) 32,73±1,78a 26,92±2,63ab 28,74±1,90ab 20,93±2,63b 0,0201
Eritroblastos Ortocromáticos (%) 5,90±0,42a 3,63±0,73ab 3,42±0,59b 3,52±0,56b 0,0181
Total de Precursores Eritróides (%) 42,02±1,71a 33,20±3,47ab 39,84±3,35ab 28,86±3,19b 0,0170
Total de Precursores Mielóides (%) 55,08±1,40 61,55±2,29 55,52±3,24 62,40±2,47 0,0790
Relação M:E 1,25±0,05a 1,63±0,13ab 1,49±1,12ab 2,79±0,46b 0,0009
Relação I:Me 0,11±0,05 0,11±0,06 0,11±0,05 0,12±0,04 0,9592
Índice de maturação eritrocitária
11,54±2,44 13,55±4,23 10,82±1,96 7,86±1,35 0,5745
(EMI)
estudados (P<0,05).
Verifica-se que houve redução no número de eritroblastos policromatofílicos,

nos cães do grupo DRC4, assim como na população eritróide global, fato que
corrobora o aumento crescente da relação M:E. A eritropoiese foi
complementarmente avaliada por intermédio do índice de maturação eritróide (EMI –
do inglês erythroid maturation index) e da relação dos precursores eritróides
24
imaturos e maduros (I:Me). Neste sentido, embora de forma não significativa pôde-
se observar redução relativa dos valores médios do EMI e aumento do I:Me nos
cães em estádio terminal da DRC, quando comparados aos cães dos demais grupos.
A distribuição das células precursoras eritrocitárias, bem como do comportamento
dos índices eritrocitários de maturação podem ser melhor observados nas
representações gráficas da mediana e dos intervalos interquartis que se seguem
(Figura 5), quanto nas Figuras 6, 7, 8 e 9.
A B
C D
Figura 5. Representações gráficas (mediana e intervalos interquartis) dos

percentuais de precursores eritróides (A), relação mielóide/eritróide
(M:E) (B), relação de precursores eritróides imaturos e maduros
(I:Me) (C) e índice de maturação eritrocitário (EMI) (D) dos cães
controle e com doença renal crônica nos estádios 2 (DRC2), e
(DRC3) e 4 (DRC4). Jaboticabal, 2014.
25
Figura 6. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea de um exemplar do grupo

controle à microscopia de luz. Ilustrações da franja do esfregaço medular
estão representadas em A (obj4x) e B (obj10x). O corpo da lâmina está
representado em C (obj4x) e D (obj40x), destacando, nesta última, a
células precursoras eritróides e mielóides da medula óssea. Em E, estão
evidenciadas as células precursoras eritróides e mielóides em grande
aumento, na qual se estabelece a quantificação das células medulares
com vistas à obtenção do mielograma (obj100x). Coloração May-
Grünwald-Giemsa. Jaboticabal, 2014.
26

DRC2 à microscopia de luz. Ilustrações da franja do esfregaço medular
27

28

29
4.4 Fatores indutores e supressores da eritropoiese
Na avaliação dos fatores considerados supressores da eritropoiese pode-se

verificar aumento nas concentrações de PTH e TNFα nos cães do grupo DRC4
quando comparados àqueles do grupo controle, enquanto as concentrações de IL-1β
e IFNγ não apresentaram diferenças entre os grupos estudados. Ademais, nenhuma
alteração significativa foi verificada com relação aos fatores considerados indutores
da eritropoiese, embora se possa admitir uma tendência à redução das
concentrações de EPO e IL-3 à medida que ocorre a progressão da DRC (Tabela 8).
Tabela 8. Valores médios e desvios-padrão obtidos para os fatores indutores (EPO e

Il-3) e supressores (PTH, IL-1β, TNFα e IFNγ) da eritropoiese avaliados
em cães controle (GC) e doentes renais crônicos nos estádios 2 (DRC2),
3 (DRC3) e 4 (DRC4). Jaboticabal, 2014.
GC DRC2 DRC3 DRC4 p

EPO (U/L) 1,83±0,33 1,81±1,09 1,24±0,44 1,15±0,29 0,783
IL-3 (pg/dL) 13,42±1,04 12,02±0,64 12,00±0,49 10,72±0,72 0,143
PTH (pg/dL) 2,80±0,00a 7,43±2,62ab 12,85±7,04ab 31,06±11,91b 0,026
IL-1β (pg/dL) 8,74±0,51 10,23±0,80 9,96±0,85 9,75±0,46 0,391
TNFα (pg/dL) 11,06±2,40a 58,43±10,16ab 35,34±16,00ab 92,20±26,82b 0,009
IFNγ (pg/dL) 27,99±5,16 23,96±5,85 22,80±4,43 22,03±5,63 0,865
estudados (P<0,05).
As concentrações séricas de creatinina apresentaram correlação positiva com

o PTH (P<0,0001; r=0,6409) e com o TNFα (P=0,0069; r=0,4755), e negativa com a
hemoglobina (P<0,0001; r=-0,6628), reticulócitos (P=0,0122; r=-0,4518) e com a
interleucina 3 (P<0,0177; r=-0,4961).
Com exceção da interleucina 1 beta, os demais fatores supressores e
indutores da eritropoiese apresentaram graus variados de correlação com as
variáveis citológicas da medula óssea, as quais se relacionam diretamente com a
eritropoiese. Houve correlação positiva dos níveis de eritropoietina com os valores
relativos e absolutos encontrados para os eritroblastos policromatofílicos (P=0,0472;
r=0,4091) e com o Índice de Maturação Eritróide - EMI (P=0,0228; r=0,4627). De
outra parte a IL-3 apresentou correlação positiva com os eritroblastos basofílicos
(P=0,0143; r=0,5518). Já, o níveis de PTH correlacionaram-se negativamente com
aqueles obtidos para taxa de hemoglobina (P=0,0124, r=-0,5126), reticulócitos
30
(P=0,0499; r=-0,3477), eritroblastos policromatofílicos (P=0,0359; r=-0,4302) e

precursores eritróides totais (P =0,0383; r=-0,4252), bem como relação mielóide:
eritróide M:E (P=0,0320; r=-0,4388). Adicionalmente, os níveis séricos de TNFα
correlacionaram-se negativamente com as taxas de hemoglobina (P=0,0268, r=-
0,4611), número de eritroblastos ortocromáticos (P=0,0261; r=-0,4357). Por outro
lado, os níveis de IFNγ apresentaram correlação negativa com os eritroblastos
policromatofílicos (P=0,0131; r=-0,4803), Índice de Maturação Eritróide-EMI
(P=0,0336; r=-0,4180), contagem total de precursores eritróides (P=0,0374; r=-
0,4102), assim como com os precursores mielóides totais (P=0,0131; r=-0,4801).
31
5. DISCUSSÃO
Esta tese teve como principal enfoque verticalizar o estudo da anemia de

caninos portadores de doença renal crônica, posto que, mesmo tratando-se de tema
mundialmente conhecido, a origem multifatorial do estado anêmico em vários
mamíferos, inclusive no homem, e particularmente no cão, ainda suscita muitos
questionamentos. Assim, tomando por base a hipótese de que a dinâmica dos
hormônios e citocinas supressores e indutores da eritropoiese esteja alterada nos
cães com DRC, foi aventada a possibilidade de se avaliar as concentrações dos
hormônios EPO, PTH, bem como das citocinas TNFα e IFNγ e interleucinas 3 e 1β,
e de se estabelecer correlações entre tais fatores e diferentes variáveis eritrocitárias
obtidas por intermédio do hemograma e do mielograma.
Foram verificados que os níveis séricos obtidos para os fatores IL-3 e IFNγ
não diferiram na comparação entre cães controle e aqueles em diferentes estádios
da DRC. Da mesma forma, não foram verificadas diferenças com relação às
contagens relativas e absolutas de proeritroblastos (PE) e eritroblastos basofílicos
(EB). Levando-se em consideração que o IFNγ tem sido apontado, dentre as
citocinas, como um dos mais potentes inibidores da proliferação das CFU-E e das
BFU-E (MUTA; KRANTZ, 1993; DAI; KRANTZ, 1999; CHOI et al., 2000) e que a
interleucina 3 é um fator de crescimento hematopoiético de multilinhagens, atuando
principalmente nas fases iniciais da hematopoiese em sinergismo com outras
citocinas (McCUBREY et al., 1991; PRCHAL, 2010; AKDIS et al., 2011), conjectura-
se que estes dois fatores não estejam particularmente envolvidos na gênese da
anemia da DRC, e que a causa da hipoplasia eritróide não está diretamente
relacionada ao desbalanço dos compartimentos de precursores eritróides imaturos.
Em contrapartida, verificou-se correlação negativa evidenciada por aumento
sérico de PTH e TNFα e redução significativa nas contagens relativas e absolutas de
eritroblastos policromatofílicos (EP) e ortocromáticos (EO) nos cães do grupo DRC4,
observando-se inclusive que estes últimos já se encontravam reduzidos desde o
estádio 3 da DRC. Tais achados alertam para o fato de que a exacerbação do
processo inflamatório não participe apenas perifericamente, por meio das
manifestações da uremia (YILMAZ et al., 2011), mas também interferindo no
32
processo proliferativo e de amadurecimento dos precursores eritróides, em face da

DRC, reduzindo diretamente a população de precursores eritróides por força de uma
ação hipoproliferativa. Outra questão que merece consideração é a possível
diminuição da resposta dos receptores à EPO, em decorrência do processo
inflamatório crônico e pelo excesso de PTH, como já observado in vitro (RAO; SHIH;
MOHINI, 1993; MCDOUGALL, 1995; MACDOUGALL, 2001; YILMAZ et al., 2011), já
que não tem sido, convincentemente, documentada diminuição significativa da
concentração de EPO, em cães com DRC. Nesta mesma linha de raciocínio e
argumentação, outra evidência que dá suporte à teoria de resistência à EPO é o fato
dos cães com DRC, e portadores de quadros graves de anemia, responderem, pelo
menos temporariamente, à terapia de suplementação com eritropoietina
(LANGSTON; REINE; KITTRELL, 2003; WAKI et al., 2010; POLZIN, 2011). Assim
sendo, os resultados aqui obtidos apontam para o fato de que a anemia, nos
estádios finais da DRC, esteja muito mais correlacionada à redução da resposta dos
precursores eritróides à EPO do que propriamente à concentração sérica da EPO.
Apesar de tais indícios, não se pode ignorar a influência dos efeitos
supressivos do TNFα sobre as células produtoras de EPO, como já descrito in vitro
(BÉGUIN, 1992; CORAZZA et al., 1998; OZGUROGLU et al., 2000), bem como a
relativa redução da capacidade de produção de EPO pela diminuição da massa
funcional renal (POLZIN, 2011) e, além do mais, o fato de que a resposta das células
eritróides à EPO ser altamente dependente do suprimento adequado de nutrientes,
especialmente de ferro e vitaminas, condição geralmente prejudicada em pacientes
com anemia da doença crônica (RODRIGUEZ et al., 2001) e cães com DRC
(MCCOWN; SPECHT, 2011). Tais assertivas corroboram a origem da anemia
normocítica normocrômica arregenerativa na DRC, apresentando-se inclusive como
justificativas plausíveis à razão pela qual as concentrações de EPO em cães com
DRC não se elevam com o advento da hipóxia renal, como esperado diante do
quadro de anemia (BONAGURA, 1992; STRAIT; LATIMER; TARPLEY, 2005).
Terapias à base de eritropoietina tem sido indicadas a pacientes nos estádios
3 e 4 da DRC e que já apresentam diminuição significativa das variáveis
eritrométricas, e que cujo quadro clínico exteriorize sinais atribuíveis à anemia, tais
como hiporexia, letargia e fraqueza (POLZIN et al., 2005; MAY; LANGSTON, 2006;
33
NELSON; COUTO, 2009; POLZIN, 2011). Os resultados aqui obtidos, analisados e

devidamente interpretados, evidenciaram que apesar da eritropoietina ser apontada
na literatura como a principal vilã no desencadeamento da anemia na DRC, os
fatores supressores PTH e TNFα são importantes coadjuvantes, atuando não
somente na síndrome urêmica, mas provavelmente participando ativamente da
gênese da hipoplasia eritróide na medula óssea de cães com DRC. Ademais,
contrariando os insistentes informes de literatura, segundo os quais os anticorpos
anti-EPO exógena devem ocupar uma posição central no universo de preocupações
no tratamento da DRC, tanto em humanos (MACDOUGALL; COOPER, 2002) quanto
em animais (NELSON; COUTO, 2009; POLZIN, 2011), acredita-se que estratégias
utilizando-se de terapias adjuvantes anti-citocinas, especialmente anti-TNFα,
possam ser úteis à redução da resistência à EPO e aos demais efeitos deletérios
das citocinas proinflamatórias durante o tratamento da anemia de caninos
portadores de DRC.
Embora não tenha sido observada anemia nos cães do grupo DRC2, sugere-
se a possibilidade de que as agressões ao sistema hematopoiético já se iniciam
nesta fase, dado aumento significativo da contagem absoluta de reticulócitos no
sangue periférico. Entretanto, os resultados obtidos com a avaliação das
concentrações dos fatores supressores e indutores da eritropoiese não foram
suficientes para justificar tal ocorrência. O mesmo pode-se dizer da avaliação da
medula óssea, cujas importantes alterações foram verificadas, principalmente, nos
cães em estado mais avançado da DRC. Dentre as possibilidades, acredita-se que
exista uma maior participação de lesões do trato gastrintestinal gerando a perda de
sangue (POLZIN; OSBORNE, 1995; POLZIN, 2011) as quais, por sua vez, podem
ser agravadas pelo defeito na adesão plaquetária ao subendotélio vascular
(CASTILLO et al., 1986). Além do fenômeno acima referido, a literatura descreve
que a modificação na proporção de fosfolípides e colesterol na membrana dos
eritrócitos, promova aumento da fragilidade osmótica eritrocitária - FOE e diminuição
da meia-vida dos eritrócitos (AKMAL et al., 1985; SILVA, 2006). Estes resultados
suscitaram investigações mais aprofundadas a cerca das perdas sanguíneas ocultas
em cães com DRC, e embora estes sejam dados inéditos e ainda não publicados por
este grupo de pesquisa, constatou-se que as perdas sanguíneas pelo trato
34
gastrintestinal têm início já a partir do estádio 2 da DRC e acentuam-se a medida

que a DRC evolui.
Mesmo não tendo sido um dos objetivos deste estudo, verificou-se
significativa redução nas contagens de linfócitos nos pacientes com DRC estádio 4.
Utilizando-se de imunofenotipagem celular por meio da técnica de citometria de fluxo,
a linfopenia em cães, severamente azotêmicos, já havia sido previamente
documentada por Kralova, Leva e Toman (2010) e Borin-Crivellenti et al. (2014),
corroborando a vulnerabilidade imunológica dos cães em estádios mais avançados
da DRC e elicitando a necessidade de avaliação do quadro leucocitário periférico
destes animais.
Os resultados deste ensaio contemplam pela primeira vez a descrição
detalhada da população eritróide de cães portadores de DRC nas diversas fases da
doença. Modificações na hematopoiese têm sido comumente associadas a infecções
crônicas por patógenos virais, bacterianos e protozoários, tais como Murine
Cytomegalovirus, Salmonella Typhimurium (COTTERELL; ENGWERDA; KAYE,
2000), e Leishmania sp. (ABREU et al. 2011). Ainda que alguns estudos
precendentes contemplem parâmetros e índices medulares aqui avaliados, a
comparação dos resultados obtidos neste experimento com aqueles de outros
autores fica comprometida ao considerar-se que a origem da anemia da doença
renal crônica é multifatorial, na qual destacam-se a participação das toxinas
urêmicas, da inflamação crônica e da deficiência no aporte de nutrientes necessários
à eritropoiese (YILMAZ et al., 2011; POLZIN, 2011; MCCOWN; SPECHT, 2011).
Dentre os índices avaliados, a relação M:E é considerada um importante
componente da avaliação da medula óssea, e juntamente com a celularidade global
e o hemograma, permite avaliar se a eritropoiese e/ou granulopoiese estão
hipoplásicas, normais ou hiperplásicas (TYLER et al., 2009). Neste experimento,
observou-se que os cães com anemia severa decorrente da DRC apresentaram
elevações significativas na relação M:E em face da hipoplasia da série eritróide, sem
comprometimento da linhagem mielóide.
No caso da punção aspirativa de medula óssea com vistas à obtenção do
mielograma, procurou-se adotar as estratégias utilizadas em estudos anteriores
(BORIN, 2011; BORIN-CRIVELLENTI et al., 2014), cuja escolha de acesso recaiu no
35
osso esterno, sob anestesia local, com base em dois fundamentos principais:
primeiramente, pelo fato de cães com DRC serem considerados pacientes ASA 4
pela Sociedade Americana de Anestesiologia, ou seja, pacientes portadores de
doença sistêmica grave que configura-se como uma ameaça constante à vida, e cuja
realização de anestesia geral está contraindicada (FLEISHER, 2005); e, em segundo
lugar, em razão das amostras de medula óssea obtidas do esterno serem
equivalentes em qualidade às obtidas na crista ilíaca e úmero de cães saudáveis
(DEFARGES et al., 2013). Em tais manobras de obtenção de fragmentos de medula
óssea, foi verificado que os cães toleraram bem o procedimento e as amostras
obtidas do esterno apresentaram excelente qualidade para confecção dos
esfregaços sanguíneos, sua coloração e exames quali-quantitativos. Ademais,
considerando-se a complexidade da execução do mielograma, os resultados obtidos
neste ensaio permitem sugerir que a avaliação da medula óssea, com fito de se
proceder às contagens globais dos diferentes precursores eritróides e mielóides para
obtenção da relação M:E, seja realizada estritamente diante de pacientes
severamente anêmicos e que não se enquadrem no estádio da DRC, segundo
variáveis de classificação estabelecidas pela IRIS (2009), ou ainda quando se queira
acompanhar a terapia com eritropoietina.
36
6. CONCLUSÕES
Tomando-se como base as condições de realização deste ensaio e em

função dos resultados aqui alcançados, conclui-se que:
As concentrações séricas dos fatores indutores e supressores da
eritropoiese, assim como os resultados do mielograma dos cães do DRC2
assemelharam-se aos do grupo controle.
A constatação de reticulocitose no grupo DRC2 alerta para o fato de
fatores externos a medula óssea podem estar precocemente causando perda ou
destruição dos eritrócitos.
A anemia em cães com DRC está relacionada ao aumento nas
concentrações de PTH e TNFα, e a exacerbação dos referidos fatores supressores,
bem como a hipoplasia da série eritróide, representada principalmente pela redução
da população de eritroblastos policromatofílicos e ortocromáticos, constituem,
parcialmente, a base da gênese e do agravamento do estado anêmico nas fases
mais avançadas da DRC em cães.
37
7. REFERÊNCIAS
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44
APÊNDICES
Apêndice A. Valores de referência para o eritrograma e leucograma canino.
Tabela A1. Parâmetros eritro-leucométricos de referência para a espécie

canina.
PARÂMETROS VALORES
6
Hemácias (x10 /μL) 5,5 - 8,0
Hemoglobina (g/dL) 12,0 - 18,0
Hematócrito (%) 37 - 55
VCM (fL) 60 - 77
CHCM (g/dL) 31 - 34
Leucócitos totais (céls/μL) 6.000 – 18.000

Basófilos (céls/μL) 0
Eosinófilos (céls/μL) 120 – 1.800
Bastonetes (céls/μL) 0 - 500
Segmentados (céls/μL) 3.600 – 13.800
Linfócitos (céls/μL) 720 – 5.400
Monócitos (céls/μL) 180 – 1.800
Fonte: Laboratório de Patologia Clínica Veterinária “Professor Dr. Joaquim Martins
Ferreira Neto” do Hospital “Governador Laudo Natel”, FCAV/Unesp – Câmpus de
Jaboticabal, SP.
45
Apêndice B. Valores bioquímicos de referência para a espécie canina.
Tabela B1. Parâmetros bioquímicos de referência para a espécie canina.
PARÂMETROS VALORES
Creatinina (mg/dL) 0,5 – 1,5
Ureia (mg/dL) 15 – 65
Proteína total (mg/dL) 5,8 – 7,9
Albumina (mg/dL) 2,6 – 4,0
Cálcio total (mg/dL) 8,6 – 11,2
Fósforo (mg/dL) 2,2 – 5,5
Fonte: Laboratório de Patologia Clínica Veterinária “Professor Dr. Joaquim Martins
Ferreira Neto” do Hospital “Governador Laudo Natel”, FCAV/Unesp – Câmpus
de Jaboticabal, SP.

Fatores Indutores E Supressores Da Eritropoiese em Caninos Doentes Renais Crônicos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP

FATORES INDUTORES E SUPRESSORES DA

Sofia Borin Crivellenti

FATORES INDUTORES E SUPRESSORES DA

Sofia Borin Crivellenti

Orientador: Prof. Dr. Aureo Evangelista Santana

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de

1. Citocinas. 2. Hormônios. 3. Mielograma. I. Título. II.

Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da

SOFIA BORIN CRIVELLENTI – nascida em 29 de junho de 1983 na cidade de

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo

À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual

Ao meu “orientador americano” Prof. Dr. Chen Gilor da Faculdade de Medicina

A equipe do Laboratório de Patologia Clínica “Prof. Dr. Joaquim Martins Ferreira

À banca de qualificação do doutorado, composta pela Profa. Dra. Márcia Ferreira da

Aos pesquisadores do laboratório de patologia clínica Nathan Cruz, Letícia Anai,

À minha sogra Eliana Viccari Zuccolotto Crivellenti e ao meu sogro Hildebrando

Às minhas famílias Souza, Cavalheiro, Martins, Borin, Crivellenti e Zuccolotto! Avós,

E, finalmente, ao meu esposo Leandro Zuccolotto Crivellenti, por seu apoio

LISTA DE TABELAS................................................................................ iii

Tabela 2. Estadiamento da doença renal crônica canina segundo a

Tabela 3. Subestadiamento da doença renal crônica canina segundo

Tabela 4. Cálculo das diferentes relações e índices para a

Tabela 5. Valores médios e desvios-padrão obtidos para o perfil

Tabela 6. Valores médios e desvios-padrão obtidos para o

Tabela 7. Valores médios e desvios-padrão obtidos para as variáveis

Tabela 8. Valores médios e desvios-padrão obtidos para os fatores

Figura 2. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea canina à

Figura 3. Representação gráfica dos valores médios do eritrograma

Figura 4. Representação gráfica dos valores médios do leucograma

Figura 5. Representações gráficas (mediana e intervalos

Figura 6. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea de um

Figura 7. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea de um

Figura 8. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea de um

visíveis cordões, e deixando antever a proporcionalidade e

Figura 9. Fotomicrografias de aspirado de medula óssea de um

BFU-E – burst eritróide MO – medula óssea

FATORES INDUTORES E SUPRESSORES DA ERITROPOIESE EM CANINOS

RESUMO – Este estudo teve como objetivo a quantificação sérica de hormônios e

Palavras-chave: eritropoietina, IFNγ, interleucinas, mielograma, paratormônio, TNFα

ERYTHROPOIESIS STIMULATOR AND SUPPRESSOR FACTORS IN DOGS

Keywords: erythropoietin, IFNγ, interleukins, myelogram, parathyroid hormone,

Há relativamente pouco tempo se reconhece que a eritropoiese é um

O processo pelo qual as células progenitoras hematopoiéticas produzem

Tabela 1. Nomenclatura da série eritróide.

A EPO é o fator de crescimento hematopoiético responsável pela estimulação

A maneira pela qual a EPO estimula a diferenciação, proliferação e maturação

Figura 1. Esquema ilustrativo da eritropoiese nos mamíferos. A partir da CFU-E,

Com relação aos valores do mielograma, a partir de preparações

ortocromáticos – 0 a 25,8%. Além disso, que as células granulocitárias totais

precursores eritróides na medula óssea (DINARELLO, 1992). Ademais, outros

disso, verificou-se a existência de reticulocitose. Anemia normocítica normocrômica

3.1 Animais e grupos experimentais

Neste ensaio foram incluídos 40 cães adultos, oriundos do canil

respectivamente. As raças que integraram o grupo DRC foram Poodle (n=6),

A idade e o peso foram considerados como critério de seleção dos animais do

Tabela 2. Estadiamento da doença renal crônica canina segundo a International

Ainda, seguindo a classificação proposta pela IRIS (2009), as unidades