PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS

APOSTILA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA

PROFESSORA: JULIANA CAMPOS DE PINHO RESENDE

ALUNO: Maria Luíza Magalhães Rezende

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TURMA: Biomedicina - noturno

Sumário
AULA PRÁTICA 1....................................................................................................................................5

Ubiquidade microbiana............................................................................................................................5

Técnica de Microcultivo..........................................................................................................................7

AULA PRÁTICA 2..................................................................................................................................10

Controle do crescimento da população microbiana...............................................................................10

1- Controle da microbiota das mãos através de lavagem e uso de antissépticos.............................10

2- Antibiograma...............................................................................................................................13

AULA PRÁTICA 3..................................................................................................................................15

Isolamento de Staphylococcus spp. da cavidade nasal..........................................................................15

AULA PRÁTICA 4..................................................................................................................................17

Isolamento de Streptococcus spp. da orofaringe....................................................................................17

AULA PRÁTICA 5 - Microbiota do solo.............................................................................................19

Isolamento de Clostrídios do solo..........................................................................................................19

Contagem e isolamento de microrganismos do solo..............................................................................20

Bibliografia...............................................................................................................................................24
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AULA PRÁTICA 1
Ubiquidade microbiana

Introdução:

Os microrganismos encontram-se distribuídos por toda a biosfera fazendo parte do ecossistema onde
exercem influências no equilíbrio biológico da natureza. Encontram-se permanentemente ou
transitoriamente em todos os locais: no solo, nas águas, na superfície interna e externa do homem e dos
animais (pele, cavidade oral, estômago, intestinos) e vegetais (PELCZAR et alii, 1996).

São encontrados também na atmosfera, e o transporte destes microrganismos pelo ar constitui um grande
risco em termos de contaminação principalmente em áreas como indústrias e hospitais tornando-se
imperioso que se estude a composição da microbiota do ar pois quanto mais populoso e movimentado é
o ambiente mais rico em microrganismos que se disseminam pelas correntes aéreas e pela movimentação
do ar

Objetivos:

Demonstrar a presença e distribuição dos microrganismos no ambiente e no corpo humano

Observar a diversidade dos microrganismos.

Observar a morfologia das bactérias e leveduras através da Coloração de gram.

Material e Métodos:

Parte 1: Escolher um local na PUC, abrir 1 placa de Agar Sabouraud) e esperar 15 minutos, fechar a
placa e incubar: as placas a 28ºC/ 5 dias

Parte 2: Escolher um objeto, passar o swab e semear na superfície das placas de Agar simples. Fechar a
placa e incubar: Agar Simples a 37ºC/48h

Parte 3: Escolher uma parte do corpo, passar o swab e semear na superfície das placas de Agar BHI.
Fechar a placa e incubar a 37ºC/48h

Resultados:

Contar o número de colônias obtidas em cada uma das placas – correlacionar o número de colônias ao
local, lugar escolhido para a coleta.

Em Agar Sabouraud observar a macroscopia das colônias.

Escolher 1 colônia cremosa obtida em cada placa para execução da coloração de Gram
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Método de coloração de Gram:

1) Fazer o esfregaço em lâmina secá-lo próximo ao Bico de Bunsen e fixá-lo passando a lâmina sobre a
chama
2) Colocar a lâmina sobre o suporte e cobrir o esfregaço com solução de Cristal Violeta - Deixar atuar
por 1 minuto e lavar com água corrente.
3) Cobrir o esfregaço com Lugol - Deixar atuar por 1minuto e lavar com água corrente.
4) Descorar o esfregaço rapidamente com solução de éter-acetona, por 5 a 10 segundos – Lavar o
esfregaço com água corrente.
5) Cobrir o esfregaço com solução de safranina e deixar atuar por 20 a 30 segundos.
6) Lavar o esfregaço com água e secá-lo próximo ao Bico de Bunsen . (NÃO PASSAR A LÂMINA
SOBRE O FOGO)
7) Colocar 1 gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observar ao microscópio de imersão
( AUMENTO DE 1000X)
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Desenhar ou fotografar o que foi observado

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Técnica de Microcultivo

As colônias de fungos isoladas em Agar Sabouraud serão identificadas pela técnica de microcultivo.

Abrir a placa perto do fogo e ajeitar a lâmina sobre o suporte de vidro;

Cortar um quadradinho de agar batata e colocá-lo sobre a lâmina. Com a alça em L coletar o fungo e
semeá-lo nos 4 cantos do meio sobre a lâmina. Cobrir o meio com a lamínula e molhar o algodão com
água destilada estéril;

Incubar as placas de microcultivo por 5 dias a 28ºC.

Montagem das lâminas:

Colocar 2 gotas de lactofenol (corante) sobre uma lâmina limpa e colocar sobre o lactofenol a lamínula
do microcultivo;

Observar ao microscópio inicialmente com a objetiva de 10X e após a visualização passar a objetiva de
40X;
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Resultados:

Discussões/ Conclusões:

1- O que ficou demonstrado nesta prática?

O microcultivo permite o estudo das estruturas de reprodução (tanto sexuadas quanto assexuadas) da
maioria dos fungos, facilitando a observação das principais características utilizadas para identificar tais
micro-organismos.

2- Por que nas placas de Agar Sabouraud normalmente não crescem bactérias?
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O Ágar Sabouraud é um método extremamente seletivo, pois seu pH, levemente ácido, favorece o
crescimento de dermatófitos e inibe algumas espécies bacterianas de interesse clínico, isso acontece
devido a presença de cloranfenicol, um antibiótico de amplo espectro que age contra as bactérias gram
negativas, gram positivas e riquétsias.
3- Por que utilizamos meios de cultura diferentes nesta prática?

Bactérias e fungos são microrganismos com características diferentes, por isso necessitam de meios
diferentes para sua nutrição e crescimento
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AULA PRÁTICA 2
Controle do crescimento da população microbiana

Introdução:

A condição sanitária de uma população humana ou animal é determinada pela sua capacidade de
controlar eficazmente as populações microbianas. Os processos podem ser muito específicos, como o
fornecimento de medicação eficaz na eliminação dos microrganismos infectantes, ou podem ser mais
gerais, como as práticas sanitárias utilizadas no lar e nos hospitais por exemplo. As principais razões
para desenvolver o controle de microrganismos são: prevenir a transmissão de infecções e doenças;
prevenir a contaminação ou o crescimento de microrganismos nocivos e prevenir a deterioração e o
dano de materiais por microrganismos.

1- Controle da microbiota das mãos através de lavagem e uso de antissépticos

Introdução:

A pele é um possível reservatório de diversos microrganismos que podem se transferir de uma superfície
para outra, por meio de contato direto (pele com pele), ou indireto, através do contato com objetos e
superfícies contaminadas. A higienização das mãos a medida individual mais simples e menos
dispendiosa para prevenir a propagação das infecções relacionadas à assistência à saúde. Recentemente,
o termo “lavagem das mãos” foi substituído por “higienização das mãos” devido à maior abrangência
deste procedimento. O termo engloba desde a higienização simples até a antissepsia cirúrgica das mãos.

Objetivos:

Demonstrar a importância da lavagem e do uso de antissépticos no controle da microbiota das mãos.

Material:

1 placas de petri com meio ágar simples marcada em 4 setores

Álcool 70%

PVPI

Papel toalha estéril

Detergente neutro

Métodos:

Rotular as placas :
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Setor 1 - dedo sujo;

Setor 2 – dedo lavado com detergente;

Setor 3 – dedo tratado com álcool 70%;

Setor 4 – dedo tratado com PVPI.

Cada aluno deverá imprimir a digital do dedo escolhido seguindo esquema acima

Incubar as placas a 37ºC por 48h.

Resultados:

Tabela: Observar as placas e anotar os resultados na tabela abaixo:

Nº de colônias totais

Bancadas Aluno 1 Aluno 2 Aluno 3 Aluno 4 Aluno 5

Placa 1 – dedo sujo

Placa 2 – dedo lavado com detergente

Placa 3- dedo tratado com álcool 70%

Placa 4- dedo tratado com antisséptico PVPI

Discussões/Conclusões:
1- Definir microbiota endógena microbiota transitória.

A microbiota endógena é a que permaneceu em todos os campos em que foram detectadas bactérias. A
microbiota transitória é aquela que foi removida ao longo do processo.
2- Por que as mãos podem servir como veiculadoras de contaminação?

As mãos constituem a principal via de transmissão de microrganismos durante a assistência prestada ao

paciente, e a higienização das mãos é uma das medidas mais eficaz para prevenir a infecção hospitalar.
3- Como explicar as diferenças observadas nas 4 placas?

O detergente não mata bactérias, mas ajuda a removê-las. O álcool 70% possui ótimo efeito bactericida
que atua desnaturando as proteínas da barreira de proteção das bactérias. Soluções de Iodopividona
liberam gradualmente o iodo, desempenhando um efeito germicida duradouro devido a sua ação residual
com liberação gradativa.
4- Qual foi o efeito da lavagem das mãos na população microbiana?

Foi observada uma redução significativa da população microbiana com a higienização das mãos e uso de
antissépticos.
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5- Como evitar as intoxicações alimentares e as infecções hospitalares utilizando-se desses procedimentos?

Higienização adequada de alimentos e equipamentos hospitalares, e antissepsia adequada das mãos antes
de entrar em contato com pacientes.

Bibliografia:

https://bvsms.saude.gov.br/higienizacao-das-maos-na-assistencia-a-saude/
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2- Antibiograma

Introdução:

Os antibióticos destroem as bactérias ou detêm a sua reprodução, tornando mais fácil para as defesas do
organismo eliminarem os microrganismos causadores de um determinado processo infeccioso.

O antibiograma é um teste que oferece como resultado padrões de resistência ou susceptibilidade de uma
bactéria específica a vários antimicrobianos (antibióticos ou quimioterápicos).

Objetivos:

Verificar o grau de sensibilidade/resistência de S. aureus a diferentes antibacterianos em meio sólido

Material:

1 placas de agar Mueller Hinton por bancada;

Discos de drogas variados para Gram positivos;

Swab;

Pinça;

Amostra líquida de Staphylococcus aureus.

Métodos:

Semear com auxílio do swab amostra da bactéria em placas de Agar Mueller Hinton cobrindo toda a
superfície;

Com a pinça distribuir 4 discos de drogas em pontos equidistantes da placa;

Pressionar levemente os discos na superfície da placa;

Incubar as placas a 37ºC por 48h .

Resultados:

Observar o aparecimento de halo inibição de crescimento bacteriano nas placas, medir o diâmetro do
halo com o auxílio do paquímetro, consultar a tabela de valores de halo(no final da apostila) e anotar os
resultados nas tabelas abaixo:

S. aureus ZONA DE INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO

Microrganismos (resistente/ intermediário/ sensível)

Antibióticos / Bancadas
Tamanho do halo de inibição Interpretação
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1 OXACILINA OXA 01 26mm Sensível

2 AMPICILINA AMP 10 27mm Sensível

3 CIPROFLOXACINA CIP 05 23mm Sensível

4 PENICILINA G/ BENZILPENICILINA PEN 10 10,2mm Resistente

Discussões/ Conclusões:

1- Quais os métodos de susceptibilidade a drogas podem ser utilizados em laboratório? Explique cada um
deles.

Podem ser usadas a Oxacilina, Ampicilina e Ciprofloxacina contra o crescimento de S. aureus, pois esta
bactéria demonstrou sensibilidade a tais antibióticos. Não é recomendado o uso da Penicilina para tal
função pois a bactéria é resistente à ela.

2- Qual a importância do antibiograma dentro dos hospitais?

Os resultados do antibiograma são interpretados e usados para tomar decisões sobre tratamento.

3- Você é favorável ao uso indiscriminado de antibióticos? Justifique-se.

Não. O uso indiscriminado de antibióticos pode alterar a resistência das bactérias causadoras de doenças,
tornando o medicamento ineficaz, além de alterar a microbiota natural do organismo.
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AULA PRÁTICA 3
Isolamento de Staphylococcus spp. da cavidade nasal.

Introdução:

O gênero Staphylococcus pertence a família Micrococcaceae que compreende cerca de 20 espécies. São
cocos Gram-positivos isolados agrupados em aspecto de cachos de uva irregulares, imóveis, não
esporulados, aeróbios e não capsulados (LENNETTE et alii, 1993).

Os estafilococos são tradicionalmente divididos em coagulase-positivos (capazes de coagular o plasma

humano ou de coelho) e coagulase-negativos. As amostras humanas coagulase-positivas são
classificadas como Staphylococcus aureus existindo subgrupos da espécie baseados na susceptibilidade
a vários bacteriófagos. A fagotipagem não é um procedimento de rotina em diagnóstico laboratorial, mas
é muito importante em investigações epidemiológicas. A identificação dos estafilococos coagulase-
negativos está geralmente limitada a duas espécies: S. epidermidis e S. saprophyticus.

Objetivos:

Isolar amostras de S. aureus na cavidade nasal de portadores

Estudar o S. aureus quanto a morfologia tintorial, patogenicidade e sensibilidade a antibióticos.

Qualificar a microbiota nasal dos estudantes.

Material:

2 tubos de agar manitol

2 swabs

Métodos:

2 alunos/bancada

Inserir o swab na cavidade nasal e semear o swab na superfície do meio manitol

Incubar os tubos a 37ºC por 48h

Leitura:

Após a leitura da coloração do tubo fazer um esfregaço da cultura e corar pelo Gram

Observar a presença de cocos gram positivos em cachos

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Resultados:

Mudança de cor no meio manitos para vermelho, que indica não portador de S. aureus, mas portador
outras espécies do gênero Staphylococcus

Discussão/Conclusões:

1- Quais as principais espécies pertencentes a este grupo?

S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus.

2- Qual a importância do S. aureus e qual o seu habitat natural?

O Staphylococcus aureus é uma bactéria do grupo dos cocos gram-positivos que faz parte da microbiota
humana, mas que pode provocar doenças que vão desde uma infecção simples, como espinhas e
furúnculos, até as mais graves, como pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico e
septicemia, entre outras. O "habitat" natural do Staphylococcus aureus é o organismo animal, onde pode
ser encontrado na saliva, na mucosa nasal, na pele e no tubo digestivo.

3- Como demonstrar a patogenicidade do S. aureus ?

S. aureus pode expressar múltiplos fatores de virulência, como capacidade de formação de biofilme, a
qual pode apresentar implicações na prática clínica, pois permite o estabelecimento microbiano em
diversos ambientes, tais como fístulas, cateteres, válvulas cardíacas dentre outras superfícies bióticas ou
abióticas.
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AULA PRÁTICA 4
Isolamento de Streptococcus spp. da orofaringe

Introdução:

Os estreptococos, da família Streptococcaceae são caracterizados como cocos Gram-positivos,

anaeróbios facultativos, não produtores de catalase e de citocromo-oxidase. Os estreptococos com
relevância clínica são homofermentadores, sendo o ácido lático o produto final da fermentação da
glicose.

Essas bactérias fazem parte da nossa flora bucal, logo a transmissão é larga. Através do beijo, de um
talher, da saliva enfim, por contato direto. E também estão em nosso intestino, trato respiratório e na
pele. Entretanto, são facilmente extinguidas quando detergentes são utilizados na assepsia, mas resistem
muito bem à desidratação. Algumas poucas espécies causam doenças para os humanos, a maioria não.

Objetivos:

Isolar amostras de Streptococcus spp., conhecer sua morfologia, coloração e arranjo

Estudar alguns aspectos típicos do gênero (cultivo e identificação)

Material:

2 placas de agar sangue

2 swabs

2 tubos de tioglicolato

Métodos:

2 alunos/bancada

Inserir o swab na profundidade da garganta

Semear o swab primeiramente na superfície do agar sangue e posteriormente semeá-lo no meio líquido
de tioglicolato

Incubar as placas e os tubos a 37ºC por 48h

Leitura:

Observar a presença de hemólise (zona clara ao redor das colônias) no agar sangue

Observar o crescimento no meio tioglicolato

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Fazer um esfregaço a partir do tioglicolato, corar pelo gram

Observar a presença de cocos gram positivos em cadeias longas

Desenhar o que foi visto

Resultados:

Não houve hemólise no agar sangue; aparecimento de ‘bolinhas’ no meio tilglicolato.

Discussões/ Conclusões:

O padrão de hemólise dos glóbulos vermelhos de sangue no meio agar de sangue permite distinguir
bactérias hemolíticas e não-hemolíticas, tais como Streptococcus pyogenes (causadora da faringite) que
causa a lise completa dos glóbulos vermelhos do sangue produzindo halos transparentes à volta das
colónias, Streptococcus mutans (causa cárie dentária), que não é hemolítica, e Streptococcus
pneumoniae (causadora de pneumonia bacteriana) que lisa parcialmente os glóbulos vermelhos do
sangue.
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AULA PRÁTICA 5 - Microbiota do solo

Isolamento de Clostrídios do solo

Introdução:

O gênero Clostridium inclui todos os bacilos Gram-positivos anaeróbios capazes de formar endosporos.
Apesar da maioria dos membros do gênero ser anaeróbios estritos algumas espécies são aerotolerantes
podendo crescer em meios sólidos expostos ao ar. Esses microrganismos são ubíquos, sendo encontrados
no solo, na água e esgoto e como parte da microbiota normal do trato gastrointestinal de animais e seres
humanos. A maioria das espécies são saprófitas inócuos, entretanto algumas delas são patógenos
humanos bastante conhecidos como é o caso de C. tetani (agente do tétano) e C. botulinum (agente do
botulismo) (MURRAY et alii, 2000).

Objetivos:

Isolar Clostrídios do solo

Observar em lâmina a morfologia destes microrganismos

Material:

1 tubo de meio de Tarozzi

Amostra de solo fervido

Pipetas de vidro

Métodos:

Inocular 1 mL de solo fervido no interior do meio de tarozzi.

Incubar os tubos a 37ºC por 48h

Leitura:

Observar alterações no meio

Fazer um esfregaço em lâmina e corar pelo gram procurando bacilos gram-positivos com esporos
terminais.

Resultados:

Discussões/ Conclusões:
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Contagem e isolamento de microrganismos do solo

Introdução

Os fungos possuem uma gama abrangente de utilização, entre as suas finalidades importantes está a
agricultura. Em dois processos biológicos é possível fazer uso desses organismos: para promover o
biorrendimento (neste processo os fungos trabalham como solubilizadores de nutrientes do solo,
maximizando a produção das plantas) e promover o biocontrole (os fungos fazem o trabalho de
bioinseticidas e biofungicidas, facilitando o manejo nas plantações). Os fungos fazem a decomposição
da matéria orgânica e disponibilizam nutrientes para as plantas.

Objetivos:

Conhecer e comparar as populações de microrganismos presentes no solo.

Material:

1 béquer com 90ml de água destilada estéril

1 espátula

Solo coletado

1 placa de agar sabouraud.

Métodos:

Com a pipeta, recolher 0,5 ml da solução de solo e semear na superfície do Agar Sabouraud

Incubar as placas a 28ºC /5 dias

Leitura:

Observar as placas de Agar sabouraud e Agar simples e contar o número de colônias obtidas em cada
placa.

Resultados:

O número de colônias foi diminuindo à medida que a concentração da diluição diminuía.

Agar sabouraud: 10-3 - 18 colônias; 10-4 - 5 colônias; 10-5 - 2 colônias

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Discussões/ Conclusões:

Presença de inúmeras bactérias.

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Anexo: Tabela1: Tabela dos principais antimicrobianos e valores dos halos de inibição

ANTIBACTERIANO INTERMEDIÁRIO SENSÍVEL

RESISTENTE

ÁC. NALIDÍXICO ≤ 13 14-18 ≥ 19

AMICACINA (AMI) ≤ 14 15-18 ≥ 19

AMPICILINA (Gram +) (AMP) ≤ 11 12-13 ≥ 14

AMPICILINA (Gram - ) ≤ 28 - ≥ 29

AZTREONAM (ATN) ≤15 16-21 ≥ 22

BACITRACINA ≤ 8 9-12 ≥ 13

CARBENICILINA (CAR) ≤ 17 18-22 ≥ 23

CEFOPERAZONA (CFP) ≤ 15 16-20 ≥ 21

CEFOTAXIMA (CTX) ≤ 14 15-22 ≥ 23

CEFOXITINA (CFO) ≤ 14 15-17 ≥ 18

CEFTAZIDIMA (CAZ) ≤ 14 15-17 ≥ 18

CEFTRIAXONA (CRO) ≤ 12 13-15 ≥ 16

CEFALOTINA (CFL) ≤ 14 15-17 ≥ 18

CIPROFLOXACIN (CIP) ≤ 16 17-21 ≥ 22

CLINDAMICINA (CLI) ≤ 14 15-16 ≥ 17

CLORANFENICOL (CLO) ≤ 12 13-17 ≥ 18

ERITROMICINA (ERI) ≤ 13 14-17 ≥ 18

ESTREPTOMICINA ≤ 11 12-14 ≥ 15

GENTAMICINA (GENE) ≤ 12 13-14 ≥ 15

IMIPENEM ≤ 13 14-15 ≥ 16

KANAMICINA ≤ 13 14-17 ≥ 18

NEOMICINA ≤ 12 13-16 ≥ 17

NITROFURANTOINA (NIT) ≤ 14 15-16 ≥ 17

NORFLOXACIN (NOR) ≤ 12 13-16 ≥ 17

NOVOBIOCINA ≤ 17 18-21 ≥ 22

OXACILINA (OXA) ≤ 10 11-12 ≥ 13

PENICILINA G (PEN) (Staphylococcus) ≤ 28 - ≥ 29

PENICILINA G ≤ 14 ≥ 15
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PERFLACIN (PEF) ≤ 15 16-18 ≥ 19

RIFAMPICINA (RIF) ≤ 11 12-18 ≥ 19

SULF +TRIMETROPIN (SUT) ≤ 10 11-15 ≥ 16

SULFONAMIDA (SUL) ≤ 12 13-16 ≥ 17

TEICOPLANIN ≤ 14 15-17 ≥ 18

TETRACICLINA (TET) ≤ 14 15-18 ≥ 19

TOBRAMICINA (TOB) ≤ 12 13-14 ≥ 15

VANCOMICINA (VAN) ≤ 9 10-11 ≥ 12

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Bibliografia
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https://diarural.com.br/entenda-a-importancia-dos-fungos-e-bacterias-para-o-solo/
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https://www.bioblog.com.br/fungos-sua-importancia-para-a-agricultura/