Resumos BM I

Marcos históricos

 1865- Gregor Mendel: cruzamento de espécies de ervilhas diferentes: genes recessivos e dominantes;
 1869- Friedrich Miester: descobriu nu pus a “nucleína”
 1889- Richard Altmann: comprovou a natureza ácida da “nucleína”, denominando-a ácido nucleico
 1890: descoberta do RNA
 1912: denominou-se a unidade básica dos ácidos nucleicos – nucleótido
 1928 – Fredrick Giffith: descobriu um fator genético nas bactérias que modificava as bactérias inofensivas em
bactérias mortais – PRINCÍPIO DA TRANSFORMAÇÃO - Dois tipos de colónias: lisas (mortais) e rugosas
(inofensivas). Aqueceu as lisas e injetou-as no rato e este sobreviveu e de seguida injetou-o com as rugosas e
este morreu – Dna das bactérias combinou-se
 1944 – Oswald Avery, Colin Macleod e Maclyn Mccarty: demonstraram que o material genético é a molécula
de DNA
 1948: Chargaff`s Rule of Base Pairing: A+G = T+C
 1952 – Alfred Hershey e Martha Chase: comprovaram definitivamente que é o DNA e não as proteínas que
transmite a informação genética de geração em geração
 Rosalind Franklin: obteve a primeira imagem de raio-X do DNA
 1953 – Watson e Crick: apresentaram o modelo de dupla hélice para o DNA

Características do material genético

 “informação” complexa em “linguagem” simples

 O material genético (genótipo) codifica um determinado fenótipo
 Necessidade de se replicar sem erros
 Capacidade de variabilidade

Nucleósido – Base + Pentose

Ligação covalente através de uma ligação glicosídica entre o N da base com o grupo hidroxilo ligada ao carbono
-1 da pentose (carbonos da pentose: 1`, 2`, 3`, 4`, 5`)
Nucleótido – Base azotada + Pentose + grupo fosfato

Bases azotadas

 Anel heterocíclico de átomos de carbono e azoto

 Derivadas das estruturas purina e pirimidina
 Purinas – formadas por um anel duplo (penta- e hexa- anel), adenina (A) e guanina (G)
 Pirimidina – formadas por anel simples (hexa-anel), citosina (C), Timina (T) que é exclusivo do DNA e uracilo
(U) exclusivo do RNA.

Pentoses

 Açucar de 5 carbonos
 Ribose – RNA
 Desoxirribose – DNA (menos um grupo OH que a ribose o que torna o DNA mais sensível, sujeito a oxidação)
Grupo fosfato – ácido fosfórico

 H3PO4
 Responsável pela ligação sucessiva dos nucleótidos
 Para fazer ligação perde um OH

LIGAÇÃO DE FOSFODIÉSTER: entre nucleótidos na mesma cadeia

Propriedades físicas de nucleósidos e nucleótidos

 Solúveis em água
 Têm carga elétrica negativa em pHs fisiológicos
 Máxima absorção de luz U.V a 260 nm

Cadeia de DNA - Carbono 3` tem de estar livre para adicionar nucleótidos (junta-se um 5`)

Dupla hélice

 A forma predominante de enrolamento do DNA é para a direita ou no sentido contra-horário

 Fatores que estabilizam a dupla hélice:
o interações hidrofóbicas
o forças de van der Walls Entre as bases azotadas
o pontes de hidrogénio
o Interações iónicas: entre os grupos fosfato do DNA e os catiões (Mg2+) presentes na solução
fisiológica
 3 formas de DNA: B-DNA (mais comum), A-DNA e Z-DNA
 A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as proteínas

Desnaturação e renaturação

Desnaturação do DNA é a quebra de pontos de hidrogénio que unem cadeias duplas (por meios físicos e
químicos) . Renaturação ocorre quando a desnaturação é devido a meios físicos
Supercoiling positiva e negativa – ocorre para compactar o DNA

Topoisomerases - enzimas que adicionam ou removem rotações da dupla hélice de DNA, quebrando temporariamente
a dupla hélice, permitindo a rotação de uma cadeia em volta da outra, e depois ligando-a de novo

 Topoisomerase I: promove a quebra de uma cadeia, e reduz o supercoiling devido a remoção de rotações
 Topoisomerase II: promove a quebra de ambas as cadeias, adicionando ou removendo rotações

Cromatina

 Heterocromatina: cromatina mais condensada; geralmente mantém estado de condensação durante o ciclo
celular
 Eucromatina: menos condensada; com genes ativos (os que são traduzidos)

Nucleossoma

 Unidade básica da cromatina

 8 histomas a volta de DNA
 H3 e H4 são as proteínas mais conservadas
 H2A e H2B estão presentes em todos os eucariotas, mas têm sequências varáveis nas diversas espécies
 Função de H1 é fixar o nucleossoma
 As histonas H2A, H2B, H3 e H4 formam grupos de 8 proteínas (2 de cada) que se associam ao DNA em
intervalos de 146 pares de bases (nucleossoma)
 Solenoíde: compactação de nucleossomas
Estrutura cromossómica

DNA mitocondrial

 Genoma circular
 Sem intrões

Genoma procariota

 Cromossoma único – DNA circular (há exceções)

 Genomas pequenos, pouco genes organizados em operões

Genoma eucariota
Tamanho de genoma x nº de cromossomas

 Cromossomas variam e 55 a 250 Mb

 Nº cromossomas não está relacionado com o tamanho do genoma
 Diferenças devido a maior nº de sequências DNA repetidas nos genomas maiores

Genoma nuclear humano

 Linear
 23 cópias (46 cromossomas)
 A maioria das proteínas eucarióticas estão relacionadas a funções celulares essenciais
Tipos de sequencias repetitivas

 DNA de sequência simples – Satélite

 Contém milhares de cópias de sequências pequenas
 As suas densidades são variáveis, sendo que as sequências ricas em A e T são menos densas que as mais
ricas em G e C
 As sequências podem separar-se da cadeia de DNA de acordo com a sua densidade e são denominadas
de DNA´s satélites
 Não são transcritas, não contém informação genética e podem desempenhar um papel importante na
estrutura dos cromossomas
 SINEs e LINEs
 SINEs (elementos curtos dispersos) e LINEs (elementos longos dispersos)
 Sequências repetitivas de DNA espalhadas pelo genoma
 Podem mover-se por diferentes locais de DNA genómico, podendo regular a expressão dos genes ou ter
desempenhado um papel evolutivo importante, gerando diversidade genética

Replicação do DNA

 Todos os organismos duplicam o seu DNA com extrema precisão antes de cada divisão celular.
 Separação das cadeias de DNA ---- Cópia de cada cadeia que serve como molde ---- Síntese da nova cadeia
complementar
 Nucleótidos trifosfatos são adicionados ao -OH do carbono 3 da pentose.
 Libertação de Pirofosfato que é hidrolisado em ortofosfato

 A replicação do DNA é bastante fidedigna devido à geometria dos pares das bases e ao “Proof – Reading” das
polimerases (DNA polimerase II confirma a replicação feita pela DNA polimerase I)
Replicação semi – conservativa

 Duas fitas de DNA se desconectam e cada uma serve de modelo para a síntese de uma fita complementar
nova. O resultado são duas moléculas de DNA com uma fita original e uma fita nova.
 O modelo semi – conservativo foi testado por Meselson e Stahl em 1957, que marcaram o DNA de bactérias,
por várias gerações, usando isótopos de nitrogênio: E. coli em meio com N-15 e depois em meio com N-14.
 No final da experiencia haviam 3 tipos de DNA: N-15 + N-15 , N-15 + N-14 e N-14 + N-14

Origens da replicação e replicação bidirecional

A replicação em E. coli inicia-se num sítio específico do cromossoma, denominado origem de replicação, onde se
forma a forquilha de replicação que se expande bidireccionalmente via forquilhas de replicação (Y) até encontrar o
ponto de término. São sequencias ricas em AT que conferem maior fragilidade a estrutura.

Num cromossoma circular como o da bactéria E. coli, uma única origem de replicação é suficiente e as duas
forquilhas de replicação, em movimento, encontram-se no polo oposto do círculo ao completar o processo.

Os longos cromossomas de eucariontes contem múltiplas origens de replicação. As duas forquilhas em

movimento, a partir de um dado ponto de origem, avançam em direções opostas até encontrar as forquilhas em
movimento de origens vizinhas.

As origens de replicação estão localizadas em sequências específicas do DNA, sempre no mesmo ponto do
cromossoma onde se ligam proteínas especificas que permitem o inicio da replicação
O DNA é antiparalelo e bidirecional ou seja, uma cadeia ocorre no sentido 5’ → 3’ e a outra no sen do 3’ → 5’
Forquilhas de Replicação

Fita líder (leading strand): continua; primase age uma vez

Fita retardada (legging strand): descontinua; primase age várias vezes;

presentes os fragmentos Okazaki

Primase:

 Ribonucleoproteína
 Liga-se à helicase formando o Primossoma
 Sintetiza o RNA primer
DNA plimerases

 Enzimas que catalisam a reação de síntese do DNA

 Adiciona nucleótidos à extremidade 3’OH livre
 Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’
(endonuclease 5’>3’)
 Incapaz de fazer DNA sem molde (precisa ter extremidade 3’OH livre)
 Possui mecanismo de correcção de erros (exonuclease 3’>5’)
 Polimerase I - Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’→ 3’ ;
Atividade de exonuclease 3’→5’ Remove o primer de RNA da cadeia
descontínua.
 Polimerase II - Polimerase alternativa de reparação de erros no DNA
 Polimerase III - Catalisa a sintese da cadeia no sentido 5’→ 3’. É a
polimerase primária durante a replicação normal do DNA . antes de
acrescentar um nucleótido, volta atrás e verifica se errou.
Etapas na replicação

1. Iniciação
a. Reconhecimento das origens de replicação por um complexo proteico ( DnaA)
b. Abertura localizada da dupla cadeia de DNA pela DNA helicase ( DnaB)
c. Síntese do primer pela PRIMASE ( Dna G)

Implica um reconhecimento de cada sitio de origem do DNA pelos elementos intervenientes no processo: O
DNA terá que sofrer uma desnaturação com afastamento das duas cadeias, sendo depois estabilizado na cadeia
simples ao nível da origem para permitir a copia de cada uma das cadeias.

Elementos ativos que determinam a iniciação da replicação – fatores de iniciação – consistem em proteínas
dotadas de grande afinidade para o DNA em cadeia simples

A origem é definida por sequencias designadas ARS rodeadas por segmentos de DNA ricos em A-T (maior
fragilidade pois tem um menor nº de pontes de hidrogénio que G-C)

Ao nível da ARS dá-se a ligação de fatores proteicos de iniciação que obrigam a separação das cadeias e dão
entrada às proteínas que se fixam na matriz – DnaA é a proteína que desnatura de modo especifico o DNA ao nível da
origem. Este processo utiliza energia pela hidrolise de ATP.

Imediatamente a seguir dá-se a entrada da proteína DnaB para o complexo que impede a renaturação do DNA

DNA helicases quebram pontes de H que desenrola a hélice dupla do DNA e as duas cadeias simples são
estabilizadas por proteínas de ligação ao DNA de cadeia simples, designadas por proteínas SSB. Isto provoca um
superenrolamento resolvido pela ação da DNA girase (Topoisomerase I nos eucariotas) relaxando o stress contorcional
imposto pelo desenrolamento.
 2. Elongação
a. Síntese contínua na cadeia leading
b. Síntese descontínua na cadeia lagging

A cópia do DNA molde é iniciada com a síntese de um fragmento de RNA catalisada pela primase que irá ser
utilizado como primer. A cadeia polinucleotidica é sintetizada a partir do grupo 3´-OH do ultimo resíduo
ribonucleotídico do primer ao qual se vai ligar o resíduo 5´-P do primeiro desoxirribonucleotido da cadeia de DNA que
será enlogada por cópia do molde.

O processo de iniciação dá-se nas duas cadeias simultaneamente, uma com orientação 3´→ 5´´que dirige o
processo de replicação e é chamada de cadeia leading e outra na orientação 5´→ 3´ que é copiada num processo mais
complexo designada por cadeia lagging exigindo uma intervenção mais frequente dos fenómenos de priming.

É na cadeia lagging que encontramos os fragmentos de Okazaki que são moléculas formadas pelo primer de
RNA continuado pelo DNA nascente ate ao sitio onde novo primer é sintetizado sobre o DNA exposto pela abertura
progressiva do DNA molde. Assim o crescimento das cadeias neo-sintetizadasvai progredindo e obrigando o
afastamento das cadeias – forquilha de replicação.

A síntese completa do DNA implica a eliminação dos primers dos fragmentos de Okazaki e que os fragmentos
se liguem. Este processo é feito sob a ação da DNA polimerase δ que degrada o primer de RNA a partir da sua
extremidade 5´-P. A mesma DNA polimerase preenche as regiões eliminadas sintetizando DNA no local.

A DNA ligase une os fragmentos de Okazaki e a nova cadeia lagging fica completa. A DNA ligase também
corrige qualquer erro de posicionamento de nucleótidos introduzido pela DNA polimerase delta.

3. Terminação
a. Reconhecimento de sequências, sobre as quais se fixam proteínas, bloqueando o movimento de
progressão da forquilha de replicação
 As enzimas ligases são também responsáveis pelo passo final da replicação dos genomas circulares da E. coli
e de alguns vírus, em que as duas extremidades de DNA neo-sintetizadas, correspondentes aos sítios de terminação
são ligadas entre si levando a circularização da molécula copiada.

Ao sítio de terminação (TER), em E. coli, ligam-se proteínas denominadas Tus. Supõe-se que estas
proteínas inibam as helicases impedindo, desta forma, o avanço do garfo de replicação e provocando a
parada da síntese. No final da replicação do cromossoma circular de E. coli produzindo-se dois cromossomas filhos
inter-conectados que serão separados pela ação de topoisomerases.

Replicação nos eucariotas

 A replicação é um acontecimento mais raro nos eucariotas do que nos procariotas. A iniciação da replicação é
muito regulada
 O DNA não se encontra “nú” na célula, mas sob a forma de cromatina. Esta encontra-se organizada sob a
forma de nucleossomas.
 Nível superior de organização implica complexidade maior para a replicação
 Fase S do ciclo celular - A síntese de DNA tem início, em muitas origens diferentes
 A replicação produz uma única cópia de cada molécula. Bloqueio da iniciação da replicação até ao próximo
ciclo celular
 A replicação do genoma inteiro deve estar concluída antes da passagem à fase G
  Nos fragmentos de Okasaky, os primers são removidos por uma Rnase H que é complementado por uma
polimerase com atividade proofreading.
o Proofreading: Após a síntese de uma sequência, as DNA polimerase alfa e beta retrocedem para
verificar (rever) se o último NT está bem emparelhado. Se não estiver bem emparelhado,
a atividade polimerase é inibida; Ativa-se então a sua atividade exonucleásica de 3’-5’.
Removem, então, o nucleótido mal emparelhado e substituem-no; De seguida, a replicação continua.
 A finalização da replicação é feita com a formação de estruturas complexas no topo do cromossoma, os
telómeros

Replicação nos telómeros

O Telómero, é essencial para a estabilidade dos cromossomas e também importante na segregação

dos mesmos durante a meiose. As sequências teloméricas encontradas em vários organismos consistem
de repetições em série de sequências simples tais como 5'-TTAGGG-3', típica de vertebrados

Os comprimentos dos Telómeros podem ser mantidos pela atividade de uma enzima que se liga especificamente
às regiões de DNA dos telómeros, a Telomerase, que é unicamente expressa em determinadas células.

A Telomerase possui dois domínios:

 TERC: componente de RNA que serve de primer para a replicação dos telómeros;
 TERT: componente enzimático proteico que tem atividade de transcriptase reversa (enzima que
realiza o processo de transcrição ao contrário).
 A Telomerase, mais propriamente a transcriptase reversa, estende a cadeia lagging, pelo que a extremidade
3’ do DNA parental fica ainda maior. Este fragmento da extremidade 3’ serve de molde para a introdução de primers
(Primase) e síntese de fragmentos de Okazaki (DNA polimerase alfa), permitindo assim a replicação da extremidade
5’ da cadeia complementar

Recombinação do DNA

 O genoma de um organismo tem uma enorme plasticidade, facto para o qual contribui a recombinação
genética - troca de material genético.
 Consiste num rearranjo de sequências homologas de DNA
 Gerar novas combinações de genes/alelos. Ex: crossing-over da meiose;
 Gerar novos genes. Ex: rearranjo de imunoglobulinas;
 Integrar elementos de DNA específicos. Ex: vírus;
 Reparar DNA- Reparação Pós-Replicação

Recombinação homologa

 entre sequências de DNA semelhantes - homólogas;

 Requer extensa homologia genética, ou seja, complementaridade entre os nucleótidos de 2 cadeias de
cromossomas diferentes, ou mesmo de zonas do mesmo cromossoma que estejam repetidas ou invertidas.
 Usualmente a recombinação envolve a quebra de duas moléculas de DNA na mesma região, onde as
sequências são muito semelhantes, e a junção de um DNA ao outro, o que resulta num processo de
"crossing-over".
 Não há alteração de bases.
 Ocorre na meiose, na formação dos gametas e permite que diferentes alelos do mesmo gene formem novas
combinações para serem “testadas”.
 O mecanismo molecular foi explicado por Holliday and Whitehouse (1964).
 Depende da complementaridade entre bases.
 Neste tipo de recombinação o local de troca pode estar localizado em qualquer zona da região homóloga e
não implica a alteração do arranjo dos genes nos cromossomas. O processo é mediado por enzimas e pode
dar-se segundo dois modelos:
o Recombinação por copy choice dá-se durante a replicação, quando duas cadeias de DNA próximas e
homólogas estão a ser replicadas simultaneamente e, a dada altura, trocam de cadeia molde
o Recombinação por breakage and rejoining não se dá durante o decorrer da replicação e requer que
as duas cadeias de DNA homólogas sofram um corte no mesmo local.
 Em ambos os casos, há o cruzamento de duas cadeias de DNA e a formação de heteroduplexes – regiões da
molécula de DNA formadas por cadeias de origens diferentes. À zona de cruzamento dá-se o nome de
junção de Holliday e da sua resolução pode resultar uma recombinação com ou sem alteração de genes
 Heteroduplexes não-recombinantes:
o Para separar as duas moléculas é então necessário cortar as cadeias cruzadas ao nível da junção. Se
o corte for horizontal então, após a ligação das cadeias obtém se moléculas iguais às originais.
  Heteroduplexes recombinantes
o se o corte for vertical verifica-se a recombinação propriamente dita, pois só neste caso há alteração
na composição da cadeia.

Mecanismos de reparação do DNA

Mutação – alteração de matéria genético (DNA) que após ser passada a mRNA e posteriormente traduzida para uma
proteína alterada, leva a uma diferente expressão fenotípica.

Mutações somáticas – ocorrem em células somáticas durante a replicação do DNA

Mutações herdadas - ocorrem durante a meiose na formação dos gametas em células germinativas
Mutações génicas – ocorrem dentro de um gene; Afetam a sequência de bases do gene que codifica uma determinada
proteína.

 Substituição – de uma base por outra

 Inserção – uma base a mais
 Deleção – uma base a menos

Mutações cromossómicas – afetam os cromossomas

 Numéricas – Mais ou menos cromossomas (exemplo da trissomia 21)

 Estrutural – translocação de cromossomas

Substituição de bases

 Transições – permuta de purina por purina ou pirimidina por mirimidina

 Transversões – permuta de purina por pirimidina ou vice – versa (fenotipicamente mais grave que causa um
desequilíbrio na cadeia)

Deleções ou inserções

 Frame – Shift – inserção ou deleção de uma base

 In-frame – inserção ou deleção de codões (3 pb)

Expansão de repetição – tipo de in-frame

 Ocorre no DNA antes da formação de gametas

 Trata-se da repetição pequenas sequências de DNA de 3 ou 4 pares de bases que se repetem em série
 Passada as gerações
 Existem várias doenças associadas a esta mutação
Efeito no fenótipo – Substituição de bases

 Missense – a permuta de base forma um diferente codão que codifica outro aa e pode provocar má
formação da proteína
 Nonsense – a permuta da base forma um codão stop que faz parar a tradução (proteína truncada); causa
mais dano que missense
 Mutação silenciosa – a troca de base não tem qualquer efeito na proteína
 Mutação neutra – Tradução de um aa diferente mas é da mesma família e não tem qualquer efeito funcional
na proteína
Causas de mutações no DNA

 Causas internas/ intrínsecas:

o Intermediários metabólicos
o Radicais oxidativos
o Erros na replicação (causadas pela DNA/ recombinação
 Causas externas/ extrínsecas:
o Radiações
o Químicos carcinogénicos
o Agentes intercalantes no DNA

Lesões no DNA

 Formação de dímeros de pirimidinas

o Formação de ligações covalentes entre pirimidinas adjacentes
oDímeros de timina são mais comuns – pode causar cancro
oCausadas por radiação UV
oTambém designados por Fosfodímeros Ciclobutanos
 Deporinação espontânea
oRemoção de uma purina
oHidrolise da ligação N-glicosilada entre a desoxirribose e a bases azotadas ( Purinas) – Erros na
replicação
oAssim acontecem as deleções – mutação espontânea mais frequente

 Desaminação das bases espontânea

o Remoção de um grupo amino da base azotada por hidrolise
o Formação de bases não naturais/bases alteradas
o Desaminação pode também ser induzida por químicos

 Erros na replicação
o DNA polimerases podem não reparar todos os erros da replicação – 1 base errada / 10 milhoes pb
o Bases tautoméricas – as bases mudam a sua conformação (parecem outras bases) pois as pontes de
hidrogénio estão mais instáveis, assim A pode emparelhar com C e T com G: origina transições
  Danos oxidativos
o Radicais superoxido-O2; peroxido de hidrogénio- H2O2; radicais hidroxil-OH originam transversões
(mais graves)

Mutações induzidas (Agentes quimicos)

 Análogos de base – 5BU (utilizado em quimioterapias)

 Agentes intercalantes – brometo de etidio

o Intercala-se permanentemente entre as bases e as pontes de hidrogénio
o Torce a molécula de DNA fazendo com que esta não se possa replicar – forma alças e deleções

 Alquilação – EMS e gás mostarda

o Alteram a guanina que emperelha com uma timina
Mecanismos de reparação do DNA

Reparação direta

Reparação por Fotorreatividade Enzimática

 Fotoliase reconhece e liga- se ao dímero

 Absorção de luz → Conversão em monómeros
 Presente em baterias, plantas e animais
 Nos humanos os T=T são removidos por NER
 Enzima superóxido dismutase → catalisa a conversão dos radicais superóxido → peróxido de hidrogénio
 Enzima catalase → converte peroxido de hidrogénio em água
Reparação de bases alquiladas

 Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase) reconhece guanina alterada (O6-metilguanina forma
pareamento com a timina em vez da citosina) - metilação na posição O6 da guanina.
 Enzima transfere o grupo metila da O6-metilguanina para um resíduo de cisteína no seu centro ativo
 Guanina volta a emparelhar com citosina
 Enzima metilada fica inativa e não pode ser recuperada – alto grau de alquilação não é reparado)

REPARAÇÃO POR EXCISÃO DE BASES - BER

 Existe em procariotas e eucariotas

 Mecanismo de reparação para 1 base mal-emparelhadas
 Uma única base lesada é identificada e removida da molécula de DNA
 O BER é um mecanismo importante para a sobrevivência das células
 Mutações nas enzimas envolvidas no mecanismo levam a cancro
 Repara a maioria das desaminações:
o Adenina- Hipoxantina
o Guanina- xantina
o Citosina- uracil
 Repara bases alquiladas e oxidadas

Este tipo de reparo tem início com a ação de DNA glicosilases que reconhecem e removem bases lesadas da cadeia
do DNA pela quebra da ligação N-glicosilada, a qual mantém a base nitrogenada associada com o esqueleto de açúcar-
fosfato - há formação de sítio apurínico ou apirimidínico

O sítio apurínico ou apirimidínico (AP) será reparado por AP endonucleases que cliva ligação fosfodiéster 5´, ou
seja, realizam a quebra do esqueleto açúcar-fosfato na região 5’ deste. O resultado dessa quebragera duas
terminações: uma 3’-OH e outra 5’-fosfato-desoxirribose.

Após a ação das AP endonucleases é necessário que ocorra a remoção de resíduos 5’-fosfato-desoxirribose. Essa
etapa é realizada pela enzima DNA desoxirribo-fosfodiesterase (dRpase), para que uma DNA polimerase possa
reconhecer e complementar a lacuna gerada pela retirada do nucleotídeo ( I nos procariotas e α nos eucariotas). A
DNA ligase junta os “topos” dos nucleóticos.

REPARAÇÃO POR EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS (NER)

 NER é um mecanismo importante para remoção de nucleótidos de uma cadeia de DNA danificada
 Deteta e corrige tipos de avarias que distorcem a dupla hélice de DNA
 Existe em procariotas e eucariotas mas com mecanismos e componentes diferentes
 Repara lesões extensas no DNA tais como:
 o Bases alteradas quimicamente
o Dímeros de pirimidinas
 Procariotas:

As enzimas-chave formam um complexo chamado endonuclease de excisão ABC. UvrA é a enzima de reconhecimento
da lesão. Ela forma um complexo A2B1 com UvrB, se liga no sítio da lesão, desenrola o DNA causando uma modificação
conformacional em uvrB que facilita a sua adesão no sítio da lesão.

UvrA se dissocia do complexo UvrB-DNA, que forma um sítio específico para a ligação da enzima uvrC - uvrB faz uma
incisão 3' abaixo da lesão, que causa uma mudança conformacional no complexo, facilitando UvrC a fazer uma incisão
5' acima da lesão.

A remoção da lesão requer a ação da helicase, no caso a Helicase II (uvrD),que retira o oligômero excisado e de UvrC
e o "gap" que resulta disto é reparado pela ação de uma polimerase (DNA polimerase I) que por sua vez desloca a
enxima UvrB, selando-se a cadeia de fosfato com a DNA ligase

 Eucariotas

Reconhecimento dano (XPA-XPC) → interação com TFIIH →a vidade de helicase

Incisão da cadeia lesada em ambos os lados : 3’ (XPG) e ERCC1-XPF: endonuclease que corta a cadeia em 5’

Sintese do novo fragmento DNA

Mismatch Repair

Direcionado por metilação de sequências GATC na fita que é sintetizada após a replicação. Além da DNA
polimerase, SSB (single strand binding protein),helicase, exonuclease e DNA ligase três enzimas especializadas - mut
S, mut L e mut H - são requeridas.

O mut S se liga nas bases mal pareadas. O mut H se liga na sequência GATC. a proteína mut H atua como
endonuclease sítio-específica clivando a fita não metilada na porção 5' do G no GATC marcando a fita para ser
reparada.

A proteína mut L se liga ao mut S e mut H do complexo. Uma vez que a clivagem ocorreu, a fita de DNA não
metilada é degradada do sítio de clivagem até a região de mal pareamento e replicada com DNA novo. Esta fase final
utiliza o restante das enzimas listadas acima.

Figura 1 - EUCARIOTAS

Reparo por recombinação

Se durante a replicação cromossomal, uma forquilha de replicação encontra uma lesão (por exemplo um
dímero de timina) antes da ação do reparo por excisão ou da ação do sistema de fotoliase (ou depois que tudo foi
tentado e a lesão permaneceu...), a DNA polimerase irá parar a replicação no dímero encontrado(e retomar o processo
vários pares de base adiante, a partir do lugar onde for inserido outro primer de RNA).Esta região será então reparada
por recombinação entredois dúplexes de DNA na forca de replicação
Transcrição do DNA

Transcrição – síntese de RNA a partir de uma cadeia de DNA molde

Dogma central da BM:

Nos procariotas

 Estrutura do gene procariota

o Região UTR é transcrita mas nunca é traduzida em proteínas

o Toda a região codificante nos procariotas dá origem a aminoácidos
o Só os seres eucariotas em operões que são regulados pelo promotor
 Número variável de regiões codificantes
 Regiões intercistrónicas (entre dois operões) variam de 1 a 40 pb
 Aproximadamente 20 a 30% dos genes estão em operões

 Transcrição:

A síntese de RNA é feita apartir da cadeia mnolde de DNA, que é complementar a cadeia codificante (cadeia que
é copiada, xom substituição de T por U)

A transcrição é feita sempre no sentido 5´-> 3´; sequencias que antecedem o ponto de inicio localizam-se montante
(upstream) e as que se sucedem localizam-se jusante (downstream). Valores positivos para upstream e negativos para
downstream

A enzima que sintetiza o DNA é a RNA polimerase: reconhece o promotor, desnatura quebrando as pontes de H,
mantem a cadeia de DNA aberta, renatura e termina a síntese.

 As RNA’s polimerases são capazes de iniciar por si só o processo de síntese, diferentemente das
DNA’s polimerases, que não são capazes de iniciar o processo de síntese, ou seja, não conseguem adicionar o
primeiro nucleotídeo a partir do ponto de inicio da duplicação (para isso ocorrer, é necessário que a primase
sintetize um primer e agora ela vai adicionando os nucleotídeos na extremidade OH livre).
 síntese ocorre SOMENTE na direção 5’ → 3’, pois a síntese deve ser feita obrigatoriamente a
partir dos nucleotídeos trifosfatados para que haja a quebra do trifosfato, gerando energia necessária para
a formação da ligação fosfodiester.
  Tem 5 subunidades: Holoenzima (α2ββωσ) é separado em dois componentes - centro catalítico – sintetiza
RNA factor σ- ligação estável à região promotora

Nos procariotas a RNA polimerase vai reconhecer regiões especificas do promotor, as regiões consenses onde
as subunidades β encaixam perfeitamente. Uma destas regiões é 10 bases upstream (-10), mais especificamente na
TATA Box onde as cadeias de DNA separam-se. Outra região é a -35 que tem como sequencia comum TTGA.
  Terminação independente de rho (RNA heliclase)

RNA forma estruturas secundárias pois na sua cadeia tem bases complementares entre si (feitas pelo terminador)
e formando esta espécie de “loop” RNA polimerase solta-se

 Terminação dependente de rho

Nos eucariotas

 Estrutura de um gene eucariota

Um gene é toda a Sequência de DNA necessária para a síntese de um RNA funcional (rRNA, tRNA, microRNA, etc) ou
de um polipeptídeo que pode ser uma proteína ou peptídeos funcionais.

No modelo eucariota existem exões e intrões (intrões são removidos no processamento); as regiões promotoras tem
muito mais elementos (tem a TATA box + outras sequencias importantes); regiões enhancer e o sitio de PoliA que é a
terminação do gene e pode estar muito distante da região promotora.
No eucariota o mRNA (após processamento) desloca-se do núcleo até ao citoplasma para ocorrer a tradução (apenas
o mRNA da origem a proteínas)

 RNA polimerase eucariótica:

o RNA Polimerase I – transcreve genes de rRNAs exceto o rNA 5s
o RNA Polimerase II – transcreve genes que codificam proteínas (hnRNA) e alguns snRNA; é muito
sensível (desnatura) ma presença de α-amanitina que é usada em tratamrntos de oncologia.
o RNA polimerase III – Transcreve tRNA; 5s rRNA; snRNAs

 Transcrição:

Para ocorrer a transcrição e a ação da RNA polimerase nos eucariotas é necessário os fatores de transcrição
(proteínas) que são os primeiros a chegar e ligam – se à TATA box (fator TFIID ou TBP - provoca uma distorção no DNA).

A sequência TATA box não é a única que sinaliza o início da transcrição, mas é a mais importante e universal.
 Outros TFII são ligados para formar o complexo de iniciação de transcrição:

Após a formação de um complexo de iniciação, a RNA-polimerase II deve ter acesso à fita-molde no ponto
inicial da transcrição.

O TFIIH, o qual contém uma DNA-helicase, torna possível este passo por hidrólise de ATP, desespiralização
do DNA e consequente exposição da fita-molde;

A RNA-polimerase II se mantém no promotor sintetizando pequenos fragmentos de RNA até sofrer uma
série de alterações estruturais que permitem sua saída do promotor e entrada na fase de extensão.

Um passo-chave para essa transição é a adição de grupos fosfato à “cauda” da RNA-polimerase (CTD-
domínio C terminal) - A fosforilização também promove a acumulação de factores de elongação.
 transcrição é iniciada quando se dá a fosforilação dos
resíduos de serina e trionina do CDT (carboxi terminal
domain), uma sequência de aminoácidos que faz parte
da RNA polimerase. Iniciada a transcrição, o complexo
de iniciação dissocia-se e o CDT fosforilado permite a
ligação de factores de transcrição que intervêm na
elongação e no processamento de RNA.

Primeiramente, as proteínas reguladoras de genes (ativadores transcricionais), devem se ligar a sequências

específicas do DNA e atrai a RNA-polimerase II para o início da transcrição.

A iniciação da transcrição necessita da presença do complexo proteico chamado de mediador, onde a RNA
polimerase necessita desse mediador para que ela possa reconhecer onde vai expressar o gene;

Finalmente, a iniciação da transcrição requer o recrutamento local de enzimas modificadoras de histonas para
que o DNA possa ser desenrolado;

As RNA-polimerases estão associadas a uma série de fatores de extensão, que atuam de forma a diminuir a
probabilidade de dissociação da RNA-polimerase;

A extensão da transcrição está fortemente associada ao processamento do RNA

Na terminação da transcrição em eucariotas, a RNA polimerase reconhece uma sequência de terminação e é
libertada cerca de 10-35 nucleótidos depois. As sequências de terminação, por exemplo AAUAAA, são sempre
semelhantes, embora possam não ser exatamente iguais em todos os genes.

CstF e CPSF se ligam a sequências nucleotídicas específicas sobre a molécula de RNA, proteínas adicionais se
associam para criar a extremidade 3´ do RNAm; inicialmente, o RNA é clivado e a enzima poli-A-polimerase
(PAP) adiciona um a um, aproximadamente 200 nucleotídeos (A)

Diferentemente das demais RNA-polimerases, a PAP não necessita de molde. Algumas proteínas de ligação à poli-A
permanecem ligadas enquanto o mRNA é transportado para fora do núcleo;Após a clivagem a RNA-polimerase
continua transcrevendo, mas logo a RNA-polimerase libera sua tensão sobre o DNA molde e para a transcrição;