Relatório Imunodiagnósticos - Daiane Val

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
DEPARTAMENTO DE MORFOFISIOLOGIA VETERINÁRIA/CCA

CURSO: MEDICINA VETERINÁRIA
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA VETERINÁRIA
DOCENTE: MARIA DO SOCORRO PIRES E CRUZ
RELATÓRIO 3: IMUNODIAGNÓSTICO (DPP E ELISA)
DAIANE VAL DE MELO SOUZA
TERESINA, 2024
INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral canina é uma doença parasitária causada pelo

protozoário Leishmania infantum. Transmitida por mosquitos flebotomíneos, ela
afeta cães e pode ser transmitida aos humanos. Os sintomas incluem perda de
peso, fraqueza e lesões na pele.
O teste DPP (Dual Path Platform) é uma técnica imunocromatográfica utilizada
para diagnosticar a leishmaniose visceral canina. Ele é projetado para detectar a
presença de anticorpos anti-Leishmania no sangue do cão. O teste é baseado na
interação entre antígenos específicos de Leishmania e os anticorpos presentes no
soro sanguíneo do animal. Se anticorpos contra o parasita estiverem presentes,
uma linha colorida aparecerá, indicando um resultado positivo.
O objetivo da atividade foi identificar se as amostras de três animais
apresentavam resultados negativos ou positivos para leishmaniose, utilizando o
Teste DPP.
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Suporte DPP com Proteínas Recombinantes K28 de Leishmania chagasi e

Proteína A Conjugada ao Ouro Coloidal, absorvidos em Membranas de
Nitrocelulose;
2. Tampão de corrida;
3. Soro, plasma e sangue;
4. Luvas;
5. Conjugado concentrado;
6. Micropipetador calibrado;
7. Lancetas descartáveis.
8. Alças coletoras;
PROCEDIMENTO
A amostra de soro foi aplicada no poço utilizando um micropipetador, seguido pela

adição de 2 gotas de tampão de corrida para facilitar a ligação dos antígenos e
anticorpos. Após 5 minutos, foram adicionadas 5 gotas de tampão de corrida na
área do tampão, aguardando-se 15 minutos. Durante esse período, o conjugado se
une aos anticorpos específicos, resultando em uma linha avermelhada na área do
teste em caso de presença de anticorpos para Leishmania. A ausência de
anticorpos resulta na não visibilidade da linha avermelhada na área do teste.
Independentemente do resultado, uma linha avermelhada na área de controle é
esperada, indicando a condição adequada dos reagentes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Por meio do método micromacroscópico e tiras de nitrocelulose, realizamos um
teste para analisar os antígenos no fluido biológico, visando detectar a presença de
um antígeno específico relacionado a uma doença.
Durante o teste, a adição de cinco gotas de soro a um poço, seguidas por duas
gotas de tampão de corrida, provocou o deslocamento do soro. Após a introdução
de mais quatro gotas de tampão, observou-se o movimento do fluido em direção à
área contendo anticorpos imunoenzimados.
A detecção bem-sucedida do deslocamento do soro e a migração do fluido para a
área com anticorpos imunoenzimados sugerem a presença do antígeno específico
relacionado à doença em questão. Esses resultados indicam a eficácia do teste na
identificação do antígeno-alvo no fluido biológico, fornecendo informações valiosas
para diagnóstico e monitoramento da condição de interesse.
1. Suporte DPP composto por dois poços (zona de aplicação) e membrana de

Nitrocelulose;
2. Amostra sorológica do paciente;
3. Conjugado Concentrado;
4. Solução de Tampão de Corrida;
5. Suporte DPP com resultado positivo para presença de antígenos da leishmaniose

visceral canina (presença das linhas de Teste e de Controle)
CONCLUSÃO:
A partir deste experimento, é possível concluir que a metodologia empregada,
utilizando o teste de suporte com os componentes de existência, proporcionou
resultados indicativos. A presença de duas linhas de teste nos dois poços sugere a
validação dos elementos analisados, reforçando a eficácia do procedimento na
detecção dos componentes em questão. Essa observação positiva respalda a
confiabilidade do método para verificar a existência dos elementos específicos
analisados no experimento.
REFERÊNCIAS:
TIZARD, Ian R. Imunologia veterinária. 9. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2014.
TORRES, Ane Pamela Capucci. Programa de orientação para controle de

Leishmaniose Visceral canina. 2017
SCHIMMING, Bruno Cesar et al. Leishmaniose visceral canina: revisão de literatura.

Revista científica eletrônica de medicina veterinária, p. 1-17, 2012.
Imagens: arquivo pessoal

INTRODUÇÃO
O teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é uma técnica

imunoenzimática utilizada para detectar a presença de substâncias específicas,
como antígenos ou anticorpos, em amostras biológicas. O ELISA é amplamente
empregado em laboratórios de diagnóstico para identificar diversas condições,
incluindo infecções, alergias, e até mesmo para avaliação de processos de
produção em biotecnologia.
O procedimento básico do ELISA envolve a fixação do antígeno (ou anticorpo) alvo

em uma superfície sólida, como um poço de microplaca. Em seguida, a amostra
biológica é adicionada, permitindo que os componentes específicos presentes na
amostra interajam com o antígeno (ou anticorpo) fixado. Após lavagem para
remover materiais não ligados, um segundo anticorpo marcado com uma enzima é
adicionado.
Se o antígeno (ou anticorpo) de interesse estiver presente na amostra, o segundo

anticorpo se ligará, formando um complexo antígeno-anticorpo-enzima. A detecção
ocorre pela adição de um substrato para a enzima, resultando na produção de um
produto colorido ou fluorescente. A intensidade da cor ou da fluorescência é
proporcional à quantidade de antígeno ou anticorpo presente na amostra.
O ELISA pode ser realizado em diferentes formatos, como indireto, direto,

competitivo ou sanduíche, adaptando-se à natureza do alvo a ser detectado. Essa
versatilidade torna o teste ELISA uma ferramenta valiosa em pesquisa biomédica e
diagnóstico clínico.
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Placa Sensibilizada - contendo Placa de poliestireno dividida em 12 tiras xom

8 poços cada, impregnada com antígeno recombinante de L. infantum;
2. Conjugado concentrado (100X) -Soluçãode anticorpo anti-IgG de cão ligado a
peroxidase;
3. Lavagem concentrada (20X)
4. Substrato TBM;
5. Solução de parada;
6. Pipetas
PROCEDIMENTO
Preparação Prévia:
Os poços foram impregnados com antígeno de Leishmania. Em seguida, foram
pipetados soros positivos e negativos nos poços designados, e o conjugado
(anticorpos com enzima) foi adicionado nos poços correspondentes.
Procedimento Principal:
Foi pipetado 100 μl de conjugado diluído em cada poço, foi homogeneizado e
foram cobertas as cavidades com selador de placas, incubando por 30 minutos à
temperatura ambiente. Após uma lavagem nos poços, foram pipetados 100 μl de
substrato e TMB em cada poço, foram cobertos novamente e incubados por 10
minutos. Nesse período, foi observada a mudança de cor (transparente para azul)
em alguns poços, indicativa da reação antígeno-anticorpo-enzima. Finalizou-se
pipetando 100 μl de solução de parada de ácido sulfúrico em cada poço,
aguardando mais 10 minutos para interromper a reação enzimática.
1.Placa de teste ELISA após lavagem e adição de substrato enzimático (é possível
observar a mudança de cor em alguns poços)
RESULTADO E DISCUSSÕES
O teste de ELISA, conduzido mediante ao procedimento das amostras, revelou os

seguintes resultados para a interação de antígenos-anticorpos, associados à
mudança de coloração de azul para amarelo:
● Amostra A: Resultado positivo;

● Amostra B: Resultado negativo;
● Amostra C: Resultado positivo;
● Amostra D: Resultado negativo;
● Amostra E: Resultado negativo;
● Amostra F: Resultado negativo.
Esses achados indicam a presença de anticorpos específicos em amostras A e C,

enquanto as amostras B, D, E e F apresentaram resultados negativos. A mudança
de coloração para amarelo sugere uma reação positiva à presença do antígeno de
interesse.
As soluções nas microcavidades foram amostradas para a leitura das absorbâncias
em duplo comprimento de onda, 450nm/630nm, dentro do intervalo de 10 minutos
(positivo exibindo coloração amarela e negativo permanecendo transparente).
CONCLUSÃO:
A partir deste experimento, é possível concluir que o teste de ELISA aplicado às

amostras revelou resultados distintos na interação de antígenos-anticorpos. As
amostras A e C demonstraram uma resposta positiva, indicando a presença de
anticorpos específicos, enquanto as amostras B, D, E e F apresentaram resultados
negativos.
Esses achados sugerem a variabilidade na presença do antígeno de interesse nas

diferentes amostras analisadas. A mudança de coloração de azul para amarelo
corrobora a reação positiva, reforçando a eficácia do teste na detecção da interação
entre antígenos e anticorpos.
REFERÊNCIAS:
FERREIRA, Paulo RB et al. Teste de ELISA indireto para diagnóstico sorológico de

leishmaniose visceral em canídeos silvestres. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 33,
p. 528-534, 2013.
Imagens: arquivo pessoal.

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A leishmaniose visceral canina é uma doença parasitária causada pelo

1. Suporte DPP com Proteínas Recombinantes K28 de Leishmania chagasi e

A amostra de soro foi aplicada no poço utilizando um micropipetador, seguido pela

1. Suporte DPP composto por dois poços (zona de aplicação) e membrana de

5. Suporte DPP com resultado positivo para presença de antígenos da leishmaniose

TORRES, Ane Pamela Capucci. Programa de orientação para controle de

SCHIMMING, Bruno Cesar et al. Leishmaniose visceral canina: revisão de literatura.

Imagens: arquivo pessoal

O teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é uma técnica

O procedimento básico do ELISA envolve a fixação do antígeno (ou anticorpo) alvo

Se o antígeno (ou anticorpo) de interesse estiver presente na amostra, o segundo

O ELISA pode ser realizado em diferentes formatos, como indireto, direto,

1. Placa Sensibilizada - contendo Placa de poliestireno dividida em 12 tiras xom

O teste de ELISA, conduzido mediante ao procedimento das amostras, revelou os

● Amostra A: Resultado positivo;

Esses achados indicam a presença de anticorpos específicos em amostras A e C,

A partir deste experimento, é possível concluir que o teste de ELISA aplicado às

Esses achados sugerem a variabilidade na presença do antígeno de interesse nas

FERREIRA, Paulo RB et al. Teste de ELISA indireto para diagnóstico sorológico de

Imagens: arquivo pessoal.

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