CENTRO UNIVERSITÁRIO UNA

CURSO DE FARMÁCIA

ANA PAULA PILÓ CAMPOS

BARBARA ALANISE RIBEIRO

DÁRIO OLIVEIRA DUARTE JÚNIOR

JÉSSICA SABATELE MARIANO SOARES

PATRÍCIA DE MOURA ALMADA

DESENVOLVIMENTO DE FILME DE ALGINATO ASSOCIADO A VITAMINAS,

Aloe vera OU MEL NO TRATAMENTO DE FERIDAS E QUEIMADURAS

Belo Horizonte - MG
2023
 CENTRO UNIVERSITÁRIO UNA

CURSO DE FARMÁCIA

ANA PAULA PILÓ CAMPOS

BARBARA ALANISE RIBEIRO

DÁRIO OLIVEIRA DUARTE JÚNIOR

JÉSSICA SABATELE MARIANO SOARES

PATRÍCIA DE MOURA ALMADA

DESENVOLVIMENTO DE FILME DE ALGINATO ASSOCIADO A VITAMINAS,

Aloe vera OU MEL NO TRATAMENTO DE FERIDAS E QUEIMADURAS

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado como requisito para obtenção
do título de Bacharel em Farmácia do
Centro Universitário UNA.

Orientadora: Profª. Marina Pereira Rocha

Co-orientador: Prof. Juliano Albergaria

Belo Horizonte - MG
2023
 APRESENTAÇÃO

O presente estudo prático teve por objetivo propor o desenvolvimento e a

avaliação de filmes de alginato de sódio associados a componentes da
formulação de produtos farmacêuticos, sendo uma alternativa no tratamento de
feridas causadas por queimaduras. O trabalho é apresentado na forma de artigo
científico.
DESENVOLVIMENTO DE FILME DE ALGINATO ASSOCIADO A VITAMINAS,
Aloe vera OU MEL NO TRATAMENTO DE FERIDAS E QUEIMADURAS

Ana Paula Piló Campos1, Barbara Alanise Ribeiro1, Dário Oliveira Duarte Júnior1, Jéssica Sabatele
Mariano Soares1, Patrícia de Moura Almada1, Marina Pereira Rocha1, Juliano Douglas Silva
Albergaria1.
1
Centro Universitário UNA, Campus Aimorés, Rua dos Aimorés, 1451 - Lourdes, Belo
Horizonte - MG, 30140-071

RESUMO
Ferimentos causados por queimadura ainda são um desafio clínico devido à
gravidade do dano tecidual, à desidratação da ferida e o longo período no
processo de recuperação do paciente. O desenvolvimento de curativos que
melhor se adaptam as feridas cutâneas tem ganhado atenção na literatura.
Dentre os vários curativos para feridas, os materiais a base de alginato
demostraram ser adequados por permitir o carreamento e liberação prolongada
de ativos que favoreçam a regeneração tecidual, como diferentes tipos de
vitaminas e substâncias naturais. Entre essas, estão a Aloe vera e o mel por
apresentarem características cicatrizantes. Nesse contexto, o presente estudo
teve o objetivo propor o desenvolvimento e a avaliação de filmes a base de
alginato de sódio contendo Álcool Polivinílico ou glicerina como agentes
plastificantes, associados a Aloe vera ou mel, como alternativa no tratamento de
feridas causadas por queimaduras. Os filmes desenvolvidos foram
caracterizados por Microscopia Eletrônica de Varredura e óptica (MEV) e
Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), além de
serem avaliados segundo seu potencial antimicrobiano e citotoxicidade em
culturas de fibroblastos (ensaio de MTT - 3-(4,5 dimetiltiazol-2il) – 2,5 –
difeniltetrazólio - Thermo Fisher Scientific). As características físicas dos filmes
demonstram ser favoráveis devido a presença de estrutura porosa o que
favorece a liberação gradativa de ativos do material como também maior
superfície de contato para melhor aderência dos filmes. Os resultados de FTIR
permitiram a identificação dos grupos funcionais característicos de cada ativo
incorporado como o mel, Aloe vera, óleo de girassol, vitamina E e Vitamina A.
Na avaliação da atividade antibacteriana para Staphylococcus aureus e
Pseudomonas spp, todos os grupos não apresentaram característica inibitória.
Já os ensaios in vitro de citotoxicidade demonstraram maior viabilidade celular
para todos os filmes formulados com Aloe vera, principalmente com glicerina, e
menor viabilidade celular para o filme associado a glicerina contendo mel. Assim
sendo, sugere-se que os filmes a base de glicerina apresentam uma maior
liberação dos ativos e que a Aloe vera seria um candidato interessante na
formulação de curativos para queimaduras, uma vez que favoreceu a
proliferação de fibroblastos, conforme visto no teste de citotoxicidade.

Palavras-chave: Alginato de sódio; filme de alginato; tratamento de feridas;

hidrocoloides.
 1. INTRODUÇÃO

As queimaduras apresentam importante causa de mortalidade e

morbidade em todo o mundo. Essas podem ser causadas por diferentes tipos de
fontes, como térmica, química, elétrica ou radiação (FAYYAZBAKHSH, 2022).

O tratamento de feridas por queimadura ainda é um desafio clínico devido

à gravidade do dano tecidual, à desidratação da ferida, o longo período no
processo de recuperação do paciente, as possíveis complicações infecciosas na
ferida, além da adesão a terapia, visto que alguns tratamentos causam dor
equivalente ao da queimadura (REZENDE, 2001). As características desejadas
para curativos de queimaduras são consideradas antimicrobiana, calmante,
absorção/liberação controlada de água, de fácil remoção, transparente e indolor
(FAYYAZBAKHSH, 2022).

Dentre os vários curativos para feridas, os materiais a base de alginato,

produto natural e atóxico, podem formar diferentes tipos de estruturas como
filmes, hidrogéis e microesferas de liberação prolongada de ativos, sendo a
característica mais importante do alginato a capacidade de absorver e reter o
exsudato da ferida e possuir propriedades hemostáticas (KOEHLER, 2017).
Além disso, as formulações a base de alginato são estáveis e permitem a
manipulação em conjunto com vários compostos e substâncias, como os ácidos
graxos essenciais, vitaminas, ativos antimicrobianos e outros (MALPASS et al.,
2013; MASELLA et al., 2013).

Para a produção de filmes à base de alginato, diferentes cátions podem

ser usados no processo de reticulação. Nessa linha, o cálcio é um cátion
polivalente relevante para atuar como agente reticulante (SEN GUPTA et al.,
2012), pois permite a atração eletrostática entre os resíduos de ácido gulurônico
do alginato por meio da troca de íons de sódio com o cálcio. Essa interação
química resulta em uma estrutura chamada caixa de ovo, permitindo a
incorporação de ativos e componentes em uma formulação farmacêutica
favorável no tratamento de queimaduras (JIANG et al., 2017).

Entre os ácidos graxos essenciais, o ácido linoleico é o principal

empregado em formulações de uso tópico no tratamento de queimaduras. Isto
porque os ácidos graxos linoleico (ômega 6) e alfa-linolênico (ômega 3)
apresentam importante papel nas funções celulares normais, como na
participação da síntese de prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos
(MANHEZI et al., 2008). Algumas vitaminas, também de característica oleosa,
são empregadas nas formulações voltadas para o tratamento de queimaduras,
como a vitamina E e A. Essas apresentam funções antioxidantes, modulação da
produção de eicosanoides, estimuladoras das etapas de fibroplasia colágena e
epitelização (MAGALHÃES, 2007).

Com o intuito de reduzir a dor e acelerar o processo de cicatrização, a

Aloe vera tem sido usada em doenças de pele e cicatrização de feridas por ser
um potente agente hidratante e possuir ação antimicrobiana (PEREIRA, et al.,
2014). Outra substância natural que tem sido amplamente estudada é o mel
orgânico, uma vez que apresenta vários compostos fenólicos, enzimas e
açúcares com potencial antioxidante, anti-inflamatório e antimicrobiano. Algumas
das vantagens do uso do mel para soluções de cicatrização de feridas é a
epitelização, promoção da angiogênese, além de proporcionar um ambiente
úmido na ferida, o que gera condições favoráveis para a cicatrização devido a
aceleração do reparo dérmico (SCEPANKOVA, et al., 2021).

Nos filmes de alginato para a recuperação de peles queimadas, o uso de

umectantes como o propilenoglicol e a glicerina, bem como o uso de Álcool
Polivinílico, são empregados para melhorar a plasticidade do hidrogel e/ou atuar
como conservante. Já a lecitina é empregada como emulsificante e agente
solubilizante (MORSELLI, 2014). Nesse contexto, o atual trabalho propõe o
desenvolvimento e a avaliação de filmes de alginato de sódio associados a
componentes da formulação de produtos farmacêuticos, sendo uma alternativa
no tratamento de feridas causadas por queimaduras.

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Queimaduras

As queimaduras são feridas parciais ou totais da pele e seus anexos,

podendo atingir camadas como a epiderme, derme, tecidos celulares
subcutâneos, músculos, tendões e ossos. Estas lesões podem ser classificadas
quanto a sua etiologia em térmicas, elétricas, químicas e por radiação
(JESCHKE, 2020) e são caracterizadas de acordo com a sua gravidade,
profundidade e tamanho. Nas queimaduras superficiais (primeiro grau) ocorre a
vermelhidão da pele, a dor sentida é de duração limitada, não há formação de
bolhas e afeta apenas a camada mais externa da pele (epiderme) sem
comprometimento hemodinâmico. As queimaduras profundas de espessura
parcial (segundo grau) apresentam envolvimento dérmico, que se subdividem
novamente em superficiais e profundas. As queimaduras superficiais de segundo
grau atingem apenas a derme capilar, apresentando bolhas com base rósea e
úmida, além da presença de eritema, formação de cicatrizes leves e
consideradas dolorosas. As queimaduras profundas de segundo grau se
estendem até a derme reticular com bolhas secas e indolores, devido à
destruição parcial dos receptores de dor. As queimaduras de espessura integral
(terceiro grau) se estendem pela epiderme e derme com danos profundos e
indolor. Essa queimadura varia de aspecto esbranquiçado com textura de couro
a cor negra carbonizada, necessitando de tratamento com intervenção cirúrgica
ou enxertia cutânea (LIMA, 2006; BRASIL, 2012; JESCHKE, 2020.)
No Brasil e no mundo, as queimaduras apresentam importante causa de
mortalidade e morbidade, ocorrendo com elevada frequência. Segundo a
Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 180 mil pessoas vêm
ao óbito tendo como causa queimaduras graves pôr fogo a cada ano. No Brasil,
o Ministério da Saúde registra cerca de um milhão de novos casos por ano.
Desse total, apenas 100 mil atendimentos são registrados em hospitais com taxa
de óbito equivalente a 2,5% (MALTA, et al., 2020).
A queimadura, principalmente em casos mais graves, exige atenção e
cuidados imediatos. Isto porque as queimaduras aumentam os riscos de
infecção por via cutânea, além de poder apresentar efeitos sistêmicos que levam
a complicações renais, cardiovasculares, hematológicas e respiratórias (VALE,
2005). Cuidados a longo prazo também são exigidos, com inúmeras consultas
ambulatórias para trocas de curativo, procedimentos cirúrgicos durante o
tratamento e reconstrução estética (MALTA, et al., 2020).
2.2 Estratégias para o tratamento de queimaduras

O tratamento de queimaduras tem como principal objetivo o cobrimento

da ferida, evitando complicações sépticas, metabólicas e funcionais, onde em
uma lesão completamente contaminada e aberta, tais complicações podem
ocorrer. Além do cobrimento da ferida, o tratamento tem como objetivo a
eliminação do tecido desvitalizado (PAGGIARO et al., 2012). Os procedimentos
iniciais frente ao paciente queimado são: afastamento do paciente da fonte de
calor, utilizar um pano úmido para o resfriamento da área, a água deve estar em
temperatura ambiente para não ocorrer uma hipotermia e, dependendo da
queimadura, é necessário o desbridamento. Logo após os cuidados iniciais, são
utilizados fármacos específicos com propriedades cicatrizantes e
antimicrobianos associados aos curativos no local, oferecendo condições ideais
para a repitelização (PAGGIARO et al., 2012)

Ativos naturais como a Aloe vera e o Mel são empregados no tratamento

de feridas e queimaduras por possuírem ação antioxidante, anti-inflamatória e
antimicrobiana, acarretando um processo acelerado de cicatrização e uma
melhora significativa no tratamento da ferida. (SCEPANKOVA, et al., 2021). O
extrato de Aloe vera apresenta diversas substâncias que possuem efeitos
regeneradores e anti-inflamatórios, como a bradiquinase (enzima), as auxinas e
giberelinas (hormônios) e ácido salicílico (FERREIRA, 2013).
Por sua vez, o mel mostrou eficácia no tratamento das queimaduras por
promover uma rápida diminuição da congestão passiva e do edema local, além
de estimular a epitelização e apresentar ação antibacteriana contra cepas gram-
negativas e gram-positivas (SUBRAHMAYAM, 1996). Isto porque o mel promove
uma barreira viscosa que impede a invasão de micro-organismos, bem como a
perda de fluidos das lesões. Há também presença de enzimas como a catalase,
que promove efeito osmótico suficiente para inibir o crescimento microbiano, e
formação de peróxido de hidrogênio com efeito antimicrobiano (PAIM et al.;
1991).
Outro composto interessante para formulação de curativos para
queimaduras é o óleo de girassol, por se tratar de um composto abundante em
ácido linoléico (AL). O AL exerce um importante papel como mediador pró-
inflamatório, provocando um aumento considerável da migração de leucócitos e
macrófagos. Ele também é capaz de regular processos que precedem a
mitogênese de células fibroblásticas. O óleo de girassol apresenta como
constituintes majoritários da sua fração tocoferólica a forma alfa-tocoferol (1,49
IU/mg) e a forma gama-tocoferol (0,14 IU/mg). Portanto, o óleo de girassol é uma
importante fonte do ácido graxo essencial (AGE), AL e vitamina E (DECLAIR,
1999). Referente a vitamina E (tocoferol), essa apresenta elevada atividade
antioxidante, protegendo as membranas celulares dos radicais peroxila e
espécies mutagênicas de óxido de nitrogênio (ENGIN et al., 2009).
A vitamina A também apresenta característica lipossolúvel com atividades
antioxidantes, regeneradora dérmica, renovadores epidérmicos e tensores.
Estudos demonstram que a utilização dos retinóides estimula as atividades e
multiplicação dos queratinócitos e fibroblastos, resultando em aumento na
produção de colágeno e melhorando a firmeza, espessura e resistência da pele
(RYAN et al., 2016).
Além dos ativos, a base selecionada para a formulação ou produção de
filmes para curativos deve ser considerada para melhorar a absorção do
exsudato e auxiliar na cicatrização. O alginato é amplamente utilizado por ser
biodegradável, não aderir à pele e possuir alta absorção (SOOD et al., 2014),
sendo uma boa escolha no desenvolvimento de curativos.

2.3 Filme de alginato

O alginato é um polissacarídeo obtido principalmente de algas marrons e

são compostos por ácidos carboxílicos de subunidades monoméricas de ácido
β-D-manurônico (M) e ácido α-L-gulurônico (G), unidos por ligações 1,4-
glicosídicas (Figura 1). A proporção e o arranjo dos blocos M e G resultam em
variações das propriedades físicas do alginato (GARCIA-CRUZ et al., 2008;
MAURSTAD et al., 2008).
Figura 1. Estruturas moleculares de sequências de subunidades de ácido gulurônico e ácido
manurônico.

Legenda: A) bloco G; b) bloco M e c) bloco MG.

Fonte: LEE; MOONEY, 2012.

As estruturas ácidas do alginato podem associar-se à sais como potássio,

cálcio e sódio para formação de reticulação polimérica. Desse modo, há a
formação de ligações cruzadas entre as moléculas do alginato e os íons
bivalentes, formando uma estrutura denomina em inglês de egg-box (Figura 2),
uma vez que a ligação de dois blocos G sucessivos ocasiona um orifício de
proporções ideais para a interação com íons (ABRAHAM, 2006; GARCIA-CRUZ
et al., 2008;).

Figura 2. Ilustração esquemática do modelo egg-box (caixa de ovos), com a zona de junção do
íon Ca2+ com o alginato.

Fonte: KOGA, 2017.

 Em geral, as reações de reticulação são utilizadas para a obtenção de
redes poliméricas com maior resistência, auxiliando na captura de moléculas
entre essas redes (ABBAH et al., 2012). Para a reticulação, o íon Ca2+ é o mais
usado, devido a sua baixa toxicidade. Entretanto, esta solução causa uma rápida
gelificação, resultante da alta solubilidade aquosa deste sal, de modo que a taxa
de gelificação é muito importante por controlar a resistência do filme e a
uniformidade (KUO, 2001).

O processo de reticulação para formação de filmes poliméricos de alginato

pode ser realizado pela adição da solução reticulante durante o preparo da
formulação ou após o seu preparo, com imersão de um pré-filme de alginato em
um banho reticulante. No primeiro processo é obtido um filme mais frágil, opaco
e não homogêneo. Já o segundo método permite a obtenção de filmes menos
solúveis em água e mais resistentes. Ressalta-se também que a concentração
e o tempo de exposição à solução iônica podem afetar as características físico-
químicas do filme (KOGA, 2017).

Após a formação do filme de alginato e sua desidratação por processo de

secagem, seja em temperatura ambiente ou estufa, ele torna-se quebradiço.
Para melhorar sua plasticidade e reduzir as forças intermoleculares nas cadeias
poliméricas, aumentando a flexibilidade e maleabilidade do filme, agentes como
o Álcool Polivinílico (PVA) são utilizados (VIEIRA et al., 2011; KOGA, 2017). O
PVA apresenta boa elasticidade e alta capacidade de absorção de água graças
às suas propriedades hidrofílicas (CHABALA, et al., 2018).

A combinação de alginato, seja em hidrogel, processos de emulsificação

ou formação de filmes, com agentes plastificantes permite o seu uso em
indústrias farmacêuticas por apresentar baixa toxicidade, boa
biodegradabilidade e biocompatibilidade. Um dos empregos descritos do
alginato associado a ativos farmacológicos é como componente de curativos
para feridas cutâneas (LEE; MOONEY, 2012).
3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

Os reagentes alginato de sódio (de algas marrons, W201502), cloreto de

cálcio di-hidratado (C3881) e lecitina (extraído da soja, pó liofilizado, P7443)
foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (MO, EUA). O alginato de sódio tem
uma viscosidade de 5 – 40 cps. Propilenoglicol, tocoferol (vitamina E), retinol
(vitamina A) e ácido graxo (óleo de girassol) foram adquiridos da EMFAL
Especialidades Químicas e Farmacêuticas. O mel foi adquirido da indústria
brasileira dos Apiários Mackllani LTDA. As folhas da planta Aloe vera foram
coletadas no município de Nova Lima (-19,9890247 X -43,8711954), Minas
Gerais, sendo identificadas do ponto de vista morfoanatômico como uma planta
com caules curtos e muitas raízes. As folhas surgem no nível do solo e são
grossas, carnudas e podem atingir de 30 a 60 cm de comprimento (Figura 3A).
A face dorsal é convexa, lisa e serosa, enquanto a face ventral das folhas é lisa
(GRINDLAY; REYNOLDS, 1986). Logo após serem colhidas manualmente, as
folhas foram lavadas com água corrente e detergente. Posteriormente, a
extração da polpa foi adaptada segundo RAMACHANDR et al. (2008). Desse
modo, as pontas das folhas foram aparadas no ápice (5 cm) e na base, seguida
por filetagem manual. Após, a polpa foi homogeneizada por um multiprocessador
por 15 minutos, seguido pelo uso de um liquidificador também por 15 minutos,
em temperatura ambiente. Obtido o gel, este foi transferido para um recipiente
de vidro, protegido da luz, mantido sob refrigeração. Após 24 horas, o gel foi
filtrado a vácuo (Figura 3B), para a retirada de material fibroso, obtendo-se,
assim, o gel puro para uso (Figura 3C), no qual foi mantido sob refrigeração e
protegido da luz.
Figura 3. Processo de obtenção do gel da Aloe vera.

B C

Legenda: Em a é observado os aspectos morfoanatômicos da planta. Em b observa-se a

extração por filtração à vácuo até a obtenção do gel puro para o uso (c). Fontes do autor.

3.2 Desenvolvimento do biomaterial

As soluções de alginato de sódio com concentração de 0,3 p/v foram

preparadas por dissolução do pó de alginato em água destilada, sob agitação
magnética até a dissolução completa. Para a obtenção das emulsões de
alginato/óleo foram adicionados os ativos oleosos da formulação e não oleosos
às soluções de alginato nas concentrações: PVA à 1%; glicerina à 1%;
propilenoglicol à 15%; tocoferol (vitamina E) à 2%; retinol (vitamina A) à 0,10%;
ácido graxo (óleo de girassol) à 1%; lecitina de soja à 1%; mel à 4% e gel de
Aloe vera à 10%. As emulsões foram mantidas sob agitação magnética por 15
minutos. Por fim, a emulsão foi vertida em placa de petri estéril com 90mm de
diâmetro e banhada com solução reticulante de cloreto de cálcio a 50 mM para
formação do filme. O filme foi seco à temperatura de 50ºC por 60 minutos. Os
melhores resultados foram utilizados no desenvolvimento das metodologias
posteriores.

3.3 Microscopia óptica e por varredura

A microscopia óptica foi realizada em microscópio óptico Olympus modelo

MIC-D no centro de microscopia da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG). Os filmes obtidos de alginato foram cortados e transferidos para lâmina
de microscópio, submetidos à ação de um feixe luminoso para observação nas
lentes de aumento de 40x, pela câmera Q Color 3.

A morfologia superficial dos filmes de alginato foram examinadas por

microscópio eletrônico de varredura (FEI Quanta 200 FEG) no mesmo centro de
microscopia. Antes da análise, as amostras foram pulverizadas com uma fina
camada de ouro por sputtering, para metalização.

3.4 Caracterização por FTIR- Infravermelho

A técnica de Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de

Fourier (FTIR) foi utilizada para avaliar as propriedades estruturais do tocoferol
(vitamina E), retinol (vitamina A), óleo de girassol, PVA, mel e Aloe vera (todos
em suas composições originais) e dos filmes de alginato. Os espectros FTIR
foram registrados com um Espectrômetro Perkin-Elmer (Waltham, MA, EUA) 100
com técnica U-ATR (refletância atenuada total universal) na faixa de número de
onda 4000–400 cm-1.

3.5 Antibiograma

Ensaios antimicrobianos foram realizados contra a cepa gram-positiva de

Staphylococcus aureus (S. Aureus) ATCC 29213 e contra a cepa gram-negativa
Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas ssp) ATCC 9027, utilizando o método
de difusão em disco proposto por Bauer et al. (1966) modificado. Desse modo,
foram cortados discos de 7 mm de diâmetro de cada filme a ser testado,
dispostos sobre a superfície do meio semeado com as suspensões dos micro-
organismos em placas de Petri contendo ágar PCA para S. Aureus e ágar BMI
para Pseudomonas ssp. Foram utilizados para preparar o inóculo bacteriano
padrão aproximadamente 108 UFC/mL (unidade formadora de colônia/ mililitro).
̊ , por 24 horas. Após este período, foram lidos
As placas foram incubadas a 37 C
os resultados através da medição do diâmetro do halo de inibição formado em
volta do disco. Os testes foram realizados em triplicata.
3.6 Teste de citotoxicidade

Fibroblastos Cat c03 foram cultivados na densidade de 2,5x104 células

por poço em uma placa de 24 poços. As células foram incubadas em atmosfera
úmida a 37°C e 5% de CO2 na presença de discos de alginato dos filmes
propostos no trabalho e avaliados nos períodos de 24 horas e 72 horas após o
plaqueamento para ensaios de viabilidade celular por MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-
2il) – 2,5 – difeniltetrazólio - Thermo Fisher Scientific). Para tal, 500μl de solução
de MTT / MTS (meio total suplementado com 10% de soro fetal bovino) foi
adicionada a cada poço após o tempo de cultivo proposto e depois incubado por
4 horas. A solução de MTT foi removida, os poços lavados com solução salina
(PBS) e 500 μl de ácido isopropanol (100 ml de isopropanol: 134 μl ácido
clorídrico) foi adicionado a cada poço para dissolver os cristais de formazan
formados pela reação de MTT. A solução em cada poço foi então transferida
para uma placa de 96 poços (100 μl/ poço), e as absorbâncias foram medidas a
595 nm utilizando um leitor ELISA (ELX800, BioTek®).

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Aspectos morfológicos dos filmes por microscopia

As avaliações morfológicas da superfície dos filmes de alginato por

microscopia óptica e por microscopia eletrônica de varredura evidenciaram
superfícies rugosas nos filmes contendo a A. vera e o mel, distinguindo-se nos
aspectos de distribuição destes.

A microscopia óptica na comparação entre os filmes formulados apenas com

o PVA como agente plastificante demonstrou um perfil de maior rugosidade de
superfície para o filme contendo A. vera (Figura 4A e B). Os filmes formulados
com glicerina (mel e A. vera) evidenciaram um padrão de superfície similar entre
eles, com uma organização pentagonal ou hexagonal (Figura 4C e D), bem
diferente dos filmes sem glicerina.

Na microscopia eletrônica de varredura, com magnificações acima de

10000x, foi possível observar que os filmes formulados sem a glicerina, os quais
contêm apenas o PVA como agente plastificante, apresentaram superfícies mais
homogêneas com as rugosidades bem distribuídas ao longo do filme (Figura 5A-
D). Tais rugosidades possuem características de cristas, com espessuras mais
definidas e padronizadas, de modo a formar regiões de sombras, representadas
por depressões (vales). Foi observado também, apenas nos filmes com A. vera
sem glicerina, a formação de blocos, semelhantes a rachaduras (Figura 5A e
B). Por fim, as cristas dos filmes formulados com A. vera demonstraram menos
espessas quando comparadas com as cristas dos filmes contendo mel.

A análise de espessura das cristas mostrou que o filme contendo PVA + A.

vera apresentou a maioria das cristas entre 400 nm a 500 nm (Gráfico 1A),
enquanto o filme contendo PVA + mel apresentou a maioria das cristas na
espessura entre 700 nm a 900 nm (Gráfico 1B).

O padrão de formação de cristas observado nesses filmes pode ser favorável

dentro da proposta do trabalho por aumentar a superfície de contato do filme
com a pele. Isto permitiria uma melhor aderência do filme na ferida ou
queimadura. De acordo com Ribeiro et al. (2012), filmes para tratamento de
feridas na pele devem ter uma estrutura que permita um melhor contato
filme/pele, além de uma estrutura porosa para estabelecer a liberação gradativa
de ativos do material. Além disso, a porosidade favorece também o transporte
de nutrientes e oxigênio para dentro e para fora da matriz extracelular exposta
no ferimento (BEATRIZ et al., 2011).

Diferentemente, na avaliação morfológica dos filmes de alginato formulados

com PVA e glicerina (Figura 5 E-H), observou-se a formação de rugosidades
distribuídas de modo heterogêneo ao longo da superfície, com um aspecto
amorfo. Entretanto, sugere-se que os filmes incorporados com PVA, glicerina e
A. vera apresentaram rugosidades em maior relevo comparado aos que foram
formulados com PVA, glicerina e mel.

Outro aspecto observado na morfologia de superfície dos filmes contendo

glicerina é a presença de poros bem definidos (Figura 6 C e D). Diferentemente
destes, a não percepção dos poros em filmes contendo apenas o PVA é, muito
provavelmente, em decorrência das cristas, uma vez que as depressões (vales)
ocultam a sua visualização (Figura 6 A e B).
 Figura 4. Microscopia óptica dos filmes de alginato contendo Aloe vera e Mel.

Legenda: a) rugosidades de superfície bem definidas; b) superfície de aspecto mais liso com
rugosidades aparentemente de menor relevo; c e d) superfícies organizadas de forma
pentagonal hexagonal.
Figura 5. Microscopia eletrônica de varredura dos filmes de alginato contendo Aloe vera e Mel.

Legenda: a e b) filme de alginato com PVA e Aloe vera, nos aumentos de 5000X e 10000x,
respectivamente; c e d) filme de alginato com PVA e mel, nos aumentos de 5000X e 10000x,
respectivamente; e e f) filme de alginato com glicerina, PVA e Aloe vera, nos aumentos de
5000X e 10000x, respectivamente; g e h) filme de alginato com glicerina, PVA e mel, nos
aumentos de 5000X e 10000x, respectivamente. As setas brancas evidenciam as separações
em blocos (semelhante a rachaduras) dos filmes de PVA + Aloe vera.
Figura 6. Microscopia eletrônica de varredura dos filmes de alginato contendo Aloe vera e Mel

Legenda: a) filme de alginato com PVA e Aloe vera; b) filme de alginato com PVA e mel; c)
filme de alginato com glicerina, PVA e Aloe vera; d) filme de alginato com glicerina, PVA e mel.
Todos estão expressos no aumento de 15000X. As setas brancas evidenciam a presença de
poros na superfície dos filmes.
Gráfico 1: Distribuição de espessura das cristas apresentadas nos filmes de alginato com PVA
+ Aloe vera e PVA + mel.

4.2 Caracterização por FTIR- Infravermelho

O teste de FTIR é uma técnica que atribui bandas de absorção ou

transmitância em relação aos grupos funcionais, possibilitando identificar
estruturas moleculares quando irradiadas com infravermelho. A técnica foi
utilizada no presente estudo devido à importância de conhecer a formação de
complexos e interação entre os grupos funcionais, a fim detectar a presença dos
compostos utilizados para o desenvolvimento dos filmes de alginato com mel e
A. vera. DERKACH et al. (2019), obtiveram em seus estudos sobre as interações
entre gelatina e alginato de sódio pico para o alginato com banda de absorção
característica em 1.037 cm-1, também observado em nosso trabalho (Gráfico 2
A e B), correspondente a reticulação de alginato com íons de cálcio, uma vez
que esse pico é indicativo de ligação covalente parcial entre o cálcio e os átomos
de oxigênio de grupos de éter C-O-C (FELTRE et al., 2020).

Nas amostras de Vitamina A e E, segundo FELTRE et al. (2020), a

transmitância observada nas regiões 3000-2800 cm-1 é devido ao estiramento
C-H da ligação dupla de grupos metil e metileno. Dessa forma, em nossas
amostras, os valores dos picos em 2923 cm-1 e 2853 cm−1 na vitamina A,
vitamina E e óleo de girassol estão relacionados com o estiramento assimétrico
e simétrico das vibrações do grupo –CH (metileno). Os demais espectros nas
vitaminas A e E, bem como no óleo de girassol, surgem: de vibrações de
estiramento de C=O em 1744 cm-1 e; CH2 com vibrações em tesoura em 1456
cm-1. Todos os picos anteriormente apresentados para os compostos oleosos
foram também observados nos filmes produzidos. Ainda referente aos óleos,
outros picos são apresentados em 1159 cm-1, correspondendo a vibrações de
estiramento C–O (AHMED et al., 2005; FELTRE et al., 2020), e em 722 cm-1
correspondendo a uma característica da vibração de balanço sobreposta de CH2
e vibração fora do plano de olefinas cis-dissubstituídas (VLACHOS et al., 2006;
ROHMAN & MAN, 2010).

Referente às bandas encontradas na análise do PVA, segundo ANJU et

al. (2021), a região de 1732 cm-1 está relacionada ao alongamento assimétrico
e simétrico do grupo C-H e 1744 cm-1 ao estiramento de C=O, no qual também
é observado nos filmes formulados. De acordo com o mesmo autor, a adição de
PVA nas formulações pode aumentar a formação de pontes de hidrogênio na
mistura ajudando em sua estabilização e plasticidade. A banda 837 cm-1
presente no PVA puro e nos dois filmes correspondem ao grupo de ligação C-O-
C (CHABALA, et al., 2018).

Quanto aos espectros observados nas regiões de 3317-3270 cm-1 nas

amostras dos filmes e dos componentes PVA e mel correspondem ao
estiramento dos grupos hidroxila (OH), relacionado à hidratação das amostras
(BUNACIU et al., 2022). Segundo ANJU et al. (2021), a A. vera também exibe
picos na mesma região.
 Por fim, a amostra de mel apresentou picos similares aos descritos na
literatura, com espectros de transmitância nas regiões de 2931 cm-1 e 1640 cm-
1 correspondentes, respectivamente, ao alongamento C-H em ácidos
carboxílicos e ao NH3 em aminoácidos livres. A faixa espectral entre 1175- 940
cm-1 corresponde ao alongamento C-O em carboidratos, como sacarose,
glicose e frutose (SABERIAN et Al., 2021).

Ao observar os picos dos ativos utilizados na formulação com os exibidos

nos filmes, é possível evidenciar a sua presença. Todavia, alguns compostos,
por apresentarem grupos funcionais similares, podem apresentar também os
mesmos picos de vibração. Sendo assim, sugere-se o uso em conjunto de outras
técnicas para melhorar a caracterização dos biomateriais, como análise térmica
por Termogravimetria (TGA).
Gráfico 2: Espectro de FTIR dos filmes de alginato e dos ativos utilizados

Legenda: Em a estão os filmes formulados com mel, enquanto em b os filmes formulados com
Aloe vera.
4.3 Caracterização por antibiograma

Os filmes de alginato com mel e com Aloe vera na avaliação antimicrobiana

não comprometeram a proliferação de bactérias S. aureus e P. aeruginosa, uma
vez que não foi observado a formação de halos de inibição (Figura 7) Tais halos
foram observados nos contrapontos do teste (controles) com discos de
antibióticos de 7,1 mm e 5,8 mm no plaqueamento de p. aeruginosa para
cloranfenicol e tetraciclina, respectivamente. No plaqueamento de S. aureus os
valores encontrados foram de 15,1 mm e 8,5 mm para ampicilina e tetraciclina,
respectivamente.

No presente estudo, esperava-se observar a ação antimicrobiana dos ativos

de mel e A. vera nos filmes desenvolvidos. Todavia, dado o oposto à hipótese
apresentada, sugere-se que diferentes fatores podem influenciar nos resultados
obtidos, tais como a qualidade do mel obtido, sendo adquirido em meio comercial
para fins alimentícios. Já os resultados controversos da A. vera podem ser
atribuídos pela diferença de adaptação do processo de extração e processo de
desenvolvimento do filme, além da quantidade de compostos
farmacologicamente ativos, incluindo resistanol, saponina e ácido crisofânico
(DIAS, 2018). Desse modo, estudos in vitro utilizando o extrato de gel bruto da
A. vera são de difícil execução e interpretação, dada a complexidade de suas
substâncias ativas (CHOI, 2003).

A concentração utilizada dos ativos para o desenvolvimento dos biomateriais,

segundo GOPE et al. (2022), podem ser responsáveis pelo insucesso no efeito
antimicrobiano. Em seu estudo foi demonstrado que a concentração de mel e
manteiga ghee, obtida a partir do leite de vaca, em 4% cada, foi a adequada para
obter ação antimicrobiana. Entretanto, o mesmo estudo atribui os resultados
positivos principalmente a ghee, uma vez que esta atuou em sinergismo com o
mel, potencializando os efeitos um do outro, diferente do nosso estudo que
utilizou o mel como único ativo antimicrobiano. Referente a A. vera, seus efeitos
antimicrobianos foram observados nos estudos de DIAS (2018), através do
método de microdiluição com a alteração colorimétrica do meio, sendo testados
os micro-organismos: S. aureus, E. cloacae, A. baumanii, P. aeuruginosa, E. coli
e C.albicans. Todavia, a atividade encontrada foi somente bacteriostática, uma
vez que se observou o crescimento bacteriano no teste de Concentração
Bacteriostática Mínima (CBM).

Dessa maneira, entendemos que a concentração dos ativos presentes no mel

e na A. vera com propriedades antimicrobianas, estavam bem abaixo do
necessário para inibição do crescimento bacteriano, uma vez que estudos já
demonstraram que melhores resultados poderiam ser obtidos com o isolamento
de substâncias bioativas desses compostos (DIAS, 2018). Somado a isso, a
caracterização do mel e da A. vera para avaliação das concentrações de seus
diversos ativos, bem como a determinação da concentração inibitória mínima
(CIM) e da Concentração Bacteriostática Mínima (CBM) de ambos os ativos são
fatores significativos para as perspectivas futuras.
Figura 7. Antibiograma dos filmes de alginato.

Legenda: As imagens evidenciam a ausência de halo de inibição do crescimento bacteriano

para Pseudomonas e S. aureus. O contraponto com discos de antibióticos indicou halos de 7,1
mm e 5,8 mm para Pseudomonas e 15,1 mm e 8,5 no plaqueamento de S. aureus.

4.4 Teste de citotoxicidade

Para a análise de citotoxicidade dos filmes de alginato foi realizado o teste de
viabilidade celular por ensaio de MTT. A média de todos os grupos foram
comparadas com a média do grupo controle nos períodos de 1 e 3 dias após
plaqueamento das células (Gráfico 3). Observou-se perda de viabilidade celular
em ambos os períodos para o grupo contendo mel no filme com glicerina. O
grupo contendo mel, mas não formulado com glicerina não apresentou diferença
estatística na comparação. Referente aos filmes formulados com A. vera, todos
os grupos apresentaram maior viabilidade celular com diferença estatística,
independente do período ou da formulação avaliados (apenas com PVA ou PVA
+ Glicerina).

Os resultados permitem inferir que os filmes contendo glicerina apresentaram

maior taxa de liberação dos ativos, intensificando a influência desses no cultivo
celular. Isto porque a presença de glicerina na formulação pode ter diminuído a
reticulação do filme, com formação de porosidades (já observados na MEV –
Figura 6). Já as formulações sem a glicerina permitem uma maior interação
entre as moléculas de alginato, fazendo uma liberação mais lenta e gradativa
dos ativos. Esse fato justifica a não citotoxicidade observada no filme contendo
mel sem glicerina em comparação com o grupo controle, uma vez que as
concentrações dos componentes presentes no mel foram liberadas em menor
proporção.

Embora muitos estudos tenham demonstrado os potenciais benefícios do mel

na cicatrização de feridas, MINDEN-BIRKENMAIER et al. (2018) apresentaram
em seu trabalho de revisão os efeitos citotóxicos do composto em vários modelos
celulares e animais. Assim sendo, os dados publicados pelos autores fornecem
uma janela de cautela sobre os perigos do uso de concentrações inadequadas
de mel em feridas ou outras aplicações terapêuticas. Experimentalmente,
LEONG et al. (2012), constatou-se elevada morte celular de neutrófilos humanos
in vitro em amostras com altas concentrações de mel (>50 mg/mL). Da mesma
forma, as altas doses de mel, com concentrações acima de 3% v/v, podem
causar efeitos inibitórios superiores a 50% na formação de vasos sanguíneos
durante processos de cicatrização (RIZQI et al., 2019). Sugere-se com os
resultados encontrados no presente trabalho e com bases na literatura que filmes
formulados com mel para cicatrização de feridas apresentam baixas
concentrações a fim de favorecer os reais efeitos benéficos do composto.

Quanto aos filmes contendo a A. vera, os resultados mostraram positiva

citocompatibilidade na cultura de fibroblastos, com maior viabilidade celular em
todos os períodos estudados. Dados da literatura demonstram que a A. vera
estimula a angiogênese por aumentar a expressão de fatores de crescimento,
como bFGF eTGFb1, em células fibroblásticas e, consequentemente, endoteliais
em experimentos com camundongo (HORMOZI et al., 2017). A angiogênese,
bem como a atividade proliferativa e síntese de matriz extracelular por
fibroblastos são eventos importantes no processo de cicatrização tecidual, sendo
esses achados favoráveis para a aplicação do filme proposto no atual trabalho
na cicatrização de feridas e queimaduras. Segundo GONTIJO et al. (2013), o
aumento da concentração de A. vera em formulações voltadas para regeneração
tecidual tem um efeito direto no aumento da viabilidade celular. De fato, em
nosso trabalho evidenciamos que filmes formulados com glicerina contendo A.
vera, possivelmente por liberarem em um curto período uma maior quantidade
do ativo no meio de cultivo celular, resultou em maior viabilidade celular quando
comparado com filmes formulados com A. vera sem a presença de glicerina. Por
fim, a A. vera não apenas estimula o crescimento e a atividade de fibroblastos,
mas também pode favorecer o aumento de colágeno tecidual e ácido hialurônico
no tecido de granulação (NASERI-NOSAR; et al., 2018).

Gráfico 3. Viabilidade celular de fibroblastos por ensaio de MTT nos períodos de 24 horas e 72
horas.

Legenda: Em a observa-se que o grupo de PVA+G+M apresentou citotoxicidade, enquanto os

filmes formulados com Aloe vera aumentou a viabilidade celular. O mesmo é observado em b.
*p<0,5%.

5. CONCLUSÃO
Conclui-se que os filmes a base de glicerina apresentam uma maior
liberação dos ativos com maior presença de poros e que a Aloe vera seria um
candidato interessante na formulação de curativos para queimaduras, uma vez
 que favoreceu a proliferação de fibroblastos. Nenhum dos filmes produzidos
apresentou efeito inibitório na proliferação de S. aureus e P. aeruginosa.

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