Aula Biotecnologia de Algas para Estudantes 2023

1
Biotecnologia de Algas
Manipulação Genética de
Microalgas
Por: Mestre, Mariamo J. M. Parruque - 2023

2
Objectivos
Metodologias de manipulação de:
- Cianobactérias (procariótas)
- Microalgas eucariótas
3
Biotecnologia
 Qualquer tecnologia que utiliza sistemas biológicos,

organísmos vivos, ou seus derivados,
 Para produzir/fabricar ou modificar produtos ou processos
para utilização específica
Porque MooAlgas 4
 São responsáveis por um sequestro de
CO2 mais eficaz - Fotossintese
 Permitem a produção de várias

moléculas (proteínas, insecticidas,
vacinas, ácidos gordos , carotenóides,
polissacáridos, vitaminas, esteróis,
antioxidantes)
 Rápido crescimento (são unicelulares)
 Têm um ciclo de vida muito curto

5
Porque manipulação genética?
 Melhorar as características de crescimento – floculação e

sedimentação;
 Possibilidade de crescimento em meio solido – vivem na água;
 Utilizar substratos de crescimento mais baratos;
 Possibilidade de crescimento e Produção de metabolitos

secundários em bio-reactores;
 Possibilidades de sintetizar proteínas terapêuticas recombinantes
 Manipular vias metabólicas para aumentar os níveis produção

de metabolitos desejáveis
6
Duas técnicas de manipulação genética
1. Mutagenese e selecção
2. Tecnologias de DNA
recombinante
7
Manipulação Genética de
Microalgas
1. Mutagenese
e
Selecção
8
Mutagenese
 Processo através do qual a informação genética
de um organísmo e alterada de modo estável
resultando numa mutação;
 Resulta em m.pontuais, inserções e delecções,

duplicações;
 Ela pode ocorrer de forma espontanêa na

natureza ou de forma artificial por exposição a
agentes mutagénicos
9
Mutagenese - desvantagens
1. Dependência nas qualidades

naturais das algas;
2. Dificuldade de produzir
recombinantes genéticos
estáveis – versos transientes
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Tecnologias do DNA
Recombinante
(Introdução de genes novos)
11
Organismo Modelo
Chlamydomonas reinharditii
12
Característica de C. reinhardtii
 Alga verde unicelular
 Filo Chlorophyta
 Cresce rapidamente em culturas

axênicas, meio sólido e líquido
 Possui habilidade de crescer tanto em

condições fotossintéticas assim como
heterotróficas
13
Característica de C. reinhardtii
 Possui habilidade de crescer tanto como haploide assim como

diploide (como as leveduras)
 Permite a trasnformação do genoma nuclear assim como do

genoma dos cloroplastos e das mitocóndrias
 É facilmente selecionado através do uso de marcadores

auxotróficos
 É útil para análises de alelos recessivos

14
Genoma de C. reinhardtii
 Possui um genoma nuclear que compreende 17 cromossomas

com um tamanho total de ~ 120 Mb.
15
3 Genomas de C. reinhardtii
Nuclear, Cloroplastos, mitocondrias
16
Chlamydomonas reinharditii
Organísmo modelo
17
Crítico!!!
Apesar do enorme potencial, as técnicas moleculares

são subdesenvolvidas em microalgas em comparação
com plantas, fungos e bactérias superiores
 Avanços no sequenciamento de genoma,

 E nas tecnologias de edição de genoma
Fornecem impulso para aprimorar a pesquisa e

desenvolvimento da área
18
Potencial das M. algas - investimento
 O Programa de Espécies Aquáticas (ASP)
 Nos EUA O Departamento de Energia (DOE)

financiou o Programa para desenvolver
combustíveis de transporte renováveis, a partir
de algas cultivadas em lagoas abertas
Linha do tempo e marcos na 19
pesquisa de microalgas
Principais inovações na pesquisa de algas
Linha do tempo e marcos na 20
pesquisa de microalgas
Aplicações da biotecnologia
21
O sistema CRISPR-Cas
 É uma tecnologia de edição de genes que permite fazer

alterações precisas e específicas no DNA de um organismo.
 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic

Repeats) é uma série de sequências repetitivas de DNA
encontradas em muitas bactérias e arqueias;
 Cas (CRISPR-associated proteins) refere-se às proteínas que

trabalham em conjunto com o CRISPR para cortar e editar o
DNA.
 Foi descoberto como um mecanismo de
defesa bacteriano contra vírus invasores -
Streptococcus pyogenes
 Foi adaptado para uso em biologia

molecular;
O sistema
 A técnica envolve a introdução da enzima
CRISPR-Cas Cas (geralmente a Cas9) e um guia RNA
que se liga ao DNA alvo específico que se
deseja modificar;
 A enzima Cas9 corta o DNA nesse local

específico, permitindo a adição, remoção ou
alteração do DNA como desejado.
22
23
Principais tipos de sistemas CRISPR-Cas:
Tipo I: Tipo II:

Apresenta uma proteína Apresenta uma proteína
efetora do tipo Cas3 e um proteína efetora do tipo Cas9
complexo de proteínas e uma única proteína auxiliar
auxiliares que incluem chamada de RNA guia
proteínas Cas5, Cas6 e Cas7. (sgRNA).
Tipo IV:
Tipo III:
Apresenta uma proteína de
Apresenta uma proteína de
efetora do tipo Cas12 e um
uma proteína efetora do tipo
RNA guia (crRNA) que é
Cas10 e um complexo de
processado em múltiplos
proteínas auxiliares que
fragmentos curtos pelo
incluem proteínas Cas5, Cas6 e
complexo de proteínas
Cas7.
auxiliares.
24
Etapas do processo de aplicação do
sistema CRISPR-Cas nas microalgas
 1. Seleção do sistema CRISPR-Cas a ser usado
 2. Design dos guias RNA: que irão guiar a enzima Cas para o local
específico do DNA a ser editado, são complementares ao DNA alvo
25
3. Entrega do sistema CRISPR-

Etapas do Cas:
processo de
aplicação
do sistema
CRISPR-
Cas nas ex: métodos de
transformação,
microalgas: eletroporação,
bombardeamento de
partículas, etc.
26
3. Sistema de transferência de genes
em microalgas
27
Etapas do processo de aplicação do
sistema CRISPR-Cas nas microalgas:
 4. Seleção e
Cultivo de células
editadas
 5. Verificação da
edição genética:
ex: por
sequenciamento
28
Diagrama esquemático de todo o processo
técnico de
manipulação de genes de algas
Os mutantes isolados 29
pertencem a 8 categorias
principais:
- Mutantes resistentes
- Mutantes auxotróficos
- Mutantes sensíveis à temperatura
- Mutantes sensíveis à luz UV
- Mutantes sensiveis a radiação (raio x)
- Mutantes deficientes para o processo fotossintético
(pigmentos) e de fixação do nitrogénio ou metabolismo
do carbono
- Mutantes morfológicos
- Mutantes condicionais
Dada a facilidade de isolamento, os mutantes resistentes

constituem a classe mais numerosa dentro das
cianobactérias: a drogas, toxinas, luz UV, cianofagos, etc.
30
Particularidades das microalgas – origens de
replicação
 Os Vectores devem possuir origens de replicação

reconhecíveis pelos hospedeiros a serem utilizados
na clonagem, na recepção ou na expressão do
gene de interesse.
 Os Vectores devem ser híbridos:

cianobatéria+ cianobactéria
cianobatéria + E. coli (pBR322)
cianobactéria+cosmidios
31
Particularidades das microalgas –
marcadores de seleção
 É necessário adicionar marcadores genéticos de

seleção aos plasmídios das cianobactérias
 Genes de resistência a antibióticos – gene ble de

resistência a Zeamicina e fleomicina – é usado para
selecionar clones transgénicos em várias espécies de
algas
 Genes de resistência a herbicidas – amigos do

ambiente
 Várias enzimas metabólicas - amigos do ambiente

32
Promotores
Os promotores Vectores de expressão - permitirem

altas taxas de transcrição dos genes clonados –
Devem ser Sequências regulatórias dos genes para

a produção de pigmentos fotossintéticos e de
ficobiliproteinas (promotores fortes)
33
Indutores
 Luz – Proteína Induzida pela Luz (LIP) – 400pb
 Iões de nitrato e amónia
 Gene da metionina sintase (METE) - repressor

34
Trasformação do Genoma
Nuclear
35
Vantagens da transformação do
genoma nuclear
 Pode se induzir no núcleo a expressão de proteínas que são

excretadas nos cloroplastos ou mitocôndrias
 Permite efectuar modificações trasnlacionais nas proteínas

produzidas
 Permite a excreção de proteínas de interesse
 É importante na produção industrial de proteínas

recombinantes
 E na obtenção expressão estável

36
Transformação do genoma dos
cloroplastos
 A primeira transformação estável ocorreu no genoma

dos cloroplastos de C. reinhardtii
 Principal vantagem – o transgene pode ser

directamente inserido por recombinação homóloga
 No genoma nuclear a integração pode ser aleatória –

requere processos intensivos de rastreio
37
 Apesar do núcleo ser o alvo

preferencial para a expressão de
transgenes,
A modificação do genoma dos

cloroplastos apresenta muitas
vantagens:
38
Vantagens da transformação do
genoma dos cloroplastos
 Maiores níveis de expressão de metabólitos de

interesse (há vários cloroplastos)
 Possibilidade de introdução de genes agrupados

em operões (muitos genes podem ser expressos
num único RNAm policistrónico)
 Introdução precisa do transgene no genoma por

recombinação homóloga
39
Exemplos de produtos da biotecnologia de algas
40
Barreiras técnicas a ultrapassar
 Embora as microalgas se
apresentem como alternativa
promissora
 Váriasbarreiras técnicas devem ser

ultrapassadas para que seu uso seja
economicamente viável:
41
Barreiras técnicas a ultrapassar
Produção da biomassa em larga escala em sistemas

exteriores;
 Eliminação de espécies invasivas nos tanques de
cultura;
 Optimização dos métodos de extracção de baixo
consumo de energia
 de métodos de recolha de baixo consumo de
energia;
 Baixa penetrância luminosa em culturas de elevada
densidade
42
Prespectivas
 A possibilidade de utilizar micro-algas
transgénicas na bioremediação;
 Como biosensores de poluentes (metais

pesados);
 a utilização de micro-algas na mitigação do

efeito de estufa, em sistemas de lagoas
abertas.

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Por: Mestre, Mariamo J. M. Parruque - 2023

Metodologias de manipulação de:

 Qualquer tecnologia que utiliza sistemas biológicos,

 Permitem a produção de várias

 Rápido crescimento (são unicelulares)

 Têm um ciclo de vida muito curto

 Melhorar as características de crescimento – floculação e

 Possibilidade de crescimento em meio solido – vivem na água;

 Utilizar substratos de crescimento mais baratos;

 Possibilidade de crescimento e Produção de metabolitos

 Possibilidades de sintetizar proteínas terapêuticas recombinantes

 Manipular vias metabólicas para aumentar os níveis produção

 Resulta em m.pontuais, inserções e delecções,

 Ela pode ocorrer de forma espontanêa na

1. Dependência nas qualidades

 Alga verde unicelular

 Cresce rapidamente em culturas

 Possui habilidade de crescer tanto em

 Possui habilidade de crescer tanto como haploide assim como

 Permite a trasnformação do genoma nuclear assim como do

 É facilmente selecionado através do uso de marcadores

 É útil para análises de alelos recessivos

 Possui um genoma nuclear que compreende 17 cromossomas

Apesar do enorme potencial, as técnicas moleculares

 Avanços no sequenciamento de genoma,

Fornecem impulso para aprimorar a pesquisa e

 O Programa de Espécies Aquáticas (ASP)

 Nos EUA O Departamento de Energia (DOE)

 É uma tecnologia de edição de genes que permite fazer

 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic

 Cas (CRISPR-associated proteins) refere-se às proteínas que

 Foi adaptado para uso em biologia

 A enzima Cas9 corta o DNA nesse local

Tipo I: Tipo II:

3. Entrega do sistema CRISPR-

Dada a facilidade de isolamento, os mutantes resistentes

 Os Vectores devem possuir origens de replicação

 Os Vectores devem ser híbridos:

 É necessário adicionar marcadores genéticos de

 Genes de resistência a antibióticos – gene ble de

 Genes de resistência a herbicidas – amigos do

 Várias enzimas metabólicas - amigos do ambiente

Os promotores Vectores de expressão - permitirem

Devem ser Sequências regulatórias dos genes para

 Luz – Proteína Induzida pela Luz (LIP) – 400pb

 Iões de nitrato e amónia

 Gene da metionina sintase (METE) - repressor

 Pode se induzir no núcleo a expressão de proteínas que são

 Permite efectuar modificações trasnlacionais nas proteínas

 Permite a excreção de proteínas de interesse

 É importante na produção industrial de proteínas

 E na obtenção expressão estável

 A primeira transformação estável ocorreu no genoma

 Principal vantagem – o transgene pode ser

 No genoma nuclear a integração pode ser aleatória –

 Apesar do núcleo ser o alvo

A modificação do genoma dos

 Maiores níveis de expressão de metabólitos de