Isolated Cardiac Mitochondria

Isolated Cardiac Mitochondria.
(A partir del órgano)
Protocolo #1. https://doi.org/10.1152/ajpheart.1998.275.5.H1567
A partir del órgano:
1. Poner el tejido en cardíaco en buffer de aislamiento (sacarosa 50 mM, manitol 200

mM, KH 2 PO 4 5 mM, EGTA 1 mM, MOPS 5 mM y BSA 0,1%, pH 7,15 ajustado
con KOH) helado (0-4oC). Escindir. Eliminar atrios
2. Homogenizar pieces of ventricular myocardium (30 ml of isolation buffer per
heart) using a PT10/35 Polytron (Brinkman). Three 20-s homogenization cycles (on
ice).
3. Centrifugar x 10 min (750g). Colectar sobrenadante.
4. Centrifugar x 20 min (7000g). Colectar Pellet.
5. Resuspender pellet (30 ml isolation buffer with no EGTA). Centrifugar x 20 min
(7000g). Collectar Pellet.
6. Resuspender pellet (isolation buffer with no EGTA)
7. Medir Proteínas
Protocolo #2/ https://sci-hub.ren/10.1007/s00395-009-0007-5
1. Poner el tejido en cardíaco en buffer A de aislamiento (100 mM KCl, 50 mM 3-[N-

Morpholino]-propanesulfonic acid (MOPS), 5 mM MgSO4, 1 mM ATP, 1 mM
EGTA, pH 7.4)
2. Homogenizar pieces of ventricular myocardium (10 ml/g buffer B [buffer A +
0.04% bovine serum albumin (BSA)] using Dounce Homogenizer or PTFE
(Teflon) Potter Elvehjem.
3. Centrifugar x 10 min (800g). Colectar Sobrenadante ( isolation of subsarcolemmal
mitochondria (SSM))
5. Resuspender Pellet (isolation buffer A) centrifugar x 10 min(8000g). Colectar
Pellet
6. Lavar con buffer A y resuspender Pellet (isolation buffer A without ATP)
7. Resuspender el Pellet de la primera centrifugación (used for isolation of
interfibrillar mitochondria IFM) in buffer B (10 ml/g tissue) and after addition of 8
U/g of the protease nagarse incubated for 1 min on ice
8. Homogenizar using Dounce Homogenizer or PTFE (Teflon) Potter Elvehjem

(five strokes) and Centrifugar x 10 min (800g). Colectar Sobrenadante.
10. Lavar con buffer A y resuspender un pequeño volumen de buffer A (without ATP)
11. Medir Proteínas
Protocolo #3
1. Poner el tejido cardiaco en 50ml: 10mM Tris HCL =0.5 ml (1M Tris HCL), 250
mmol/L sucrosa =12.5ml (1M sucrosa) y 5 tablets of protease inhibitor (Pierce
Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets, ThermoFisher, catalog A32959)
Ph 7.0.
2. Homogenizar con un mortero de Teflón en un tubo de vidrio y centrifugar 800g x
10. Min. Colectar sobrenadante.
3. Centrifugar 10 000 g x 20 min. Colectar Pellet y Sobrenadante.
4. Centrifugar sobrenadante 105 000g x 60 min para separar microsomas de la
fracción citosólica.
5. El Pellet se resuspende según uso posterior.
Isolated Cardiac Mitochondria. (A partir del cultivos celulares)
Protocolo #1
1. Resuspenda el sedimento celular en 11 ml de tampón hipo RSB helado y transfiera
las células a un Homogeneizador Dounce de 15 ml. Alternativamente, resuspender
el sedimento celular en 9 mL de tampón hipo RSB helado y transferir 3 ml de las
células a la vez a un homogeneizador Potter-Elvehjem de 5 ml.
2. Deje que las células se hinchen durante 5 a 10 minutos. Verifique el progreso de la
hinchazón usando un microscopio de contraste de fase.
3. Rompa las células hinchadas con varios golpes del mortero B. Para cada golpe,
presione el mortero hacia abajo del tubo, manteniendo una presión firme y
constante.
4. Compruebe el grado de homogeneización con un microscopio de contraste de fase.
Si la lisis celular tuvo éxito, deben estar presentes núcleos desnudos (esferas lisas
con nucléolos obvios en el interior), orgánulos más pequeños (objetos oscuros y
granulares) y una pequeña cantidad de células intactas (esferas grandes con
apariencia granular). De ocho a nueve núcleos desnudos por cada célula completa
es un resultado muy bueno. Intentando cualquier cosa mejor generalmente resulta en
un aumento del número de núcleos dañados, lo que aumenta el número de
mitocondrias atrapado en el sedimento nuclear durante la primera centrifugación.
5. Añada inmediatamente 8 ml de tampón de homogeneización MS 2,5 × para obtener

una concentración final de tampón de homogeneización MS 1 ×. Cubra la parte
superior del homogeneizador con Parafilm y mezcle invirtiendo un par de veces.
(Guarde una porción del homogeneizado si se van a realizar ensayos de enzimáticos
más adelante).
6. Transferir el homogeneizado a un tubo de centrífuga para centrifugación diferencial.

Enjuague el homogeneizador con una pequeña cantidad de tampón de
homogeneización 1 × MS y agréguelo al homogeneizado. Lleve el volumen a 30
mL con tampón MS de homogeneización 1x.
7. Centrifugue el homogeneizado a 1300 g durante 5 min para eliminar los núcleos, las
células intactas y fragmentos de membrana.
8. Vierta el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio. La parte superior del

sedimento estará suelta, así que tenga cuidado de no acumularlo con el
sobrenadante.
9. Repetir paso 6 y 7 (2 veces más.)

10. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y sedimente las
mitocondrias entre 7.000 y 17.000 g. durante 15 min.
11. Deseche el sobrenadante y limpie el interior del tubo con un Kimwipe. (toallita)
12. Lave las mitocondrias resuspendiendo el sedimento en tampón 1 × MS y repitiendo

los 7.000 g–17.000 g de sedimentación. (Este lavado no es necesario si se va a
realizar un gradiente de densidad escalonada de sacarosa.)
13. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en un tampón adecuado para

trabajos posteriores. Las mitocondrias se pueden almacenar a -80 ° C durante al
menos 1 año para algunos fines (por ejemplo, aislamiento de proteínas).
Recetas:
MS Homogenization Buffer (1×)
210 mM mannitol
70 mM sucrose
5 mM Tris-HCl (pH 7.5)
1 mM EDTA (pH 7.5)
The buffer should be ice cold before use.
MS Homogenization Buffer (2.5×)

525 mM mannitol
175 mM sucrose
12.5 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2.5 mM EDTA (pH 7.5)
RSB Hypo Buffer

10 mM NaCl
1.5 mM MgCl2
10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
Protocolo#2 doi:10.1038/nprot.2006.478
Antes de empezar:
-Encender la centrifuga y meter los rotores en la nevera.
-Poner el Potter-Elvehjem en hielo.
-Añadir IP al buffer
1. Protocolo de pase celular + lavado con PBS y @
- Partimos de 2 P150 de Hek 293T al 80-90% confluencia, para ello sembramos
2x106 células por placa 3 días antes.
- Lavar con PBS 1x.
- Añadir 2 ml de tripsina por placa.
- Recoger en 10 ml de medio cada placa.
- Centrifugar 5á 1200 rpm.
- Eliminar el medio y lavar con PBS (juntar el pellet).
- Centrifugar 5á 1200rpm.
- Retirar el PBS y poner en hielo.
2. Enriquecimiento Mitocondrial
- Resuspender en 3 ml de IBc con IP frío.
- Homogeneizar las células en un potter colocado previamente en hielo.
- Hacer 40-50 pases a máxima potencia (se puede tomar una muestra observarla al
microscopio para comprobar que las células se han lisado totalmente).
- Lavar el potter con 1ml de buffer IBc.
- Transferir el homogenado a un falcon.
- Centrifugar 600g. 3á 4ºC.
- Recoger el sobrenadante en 2 eppendorf de 2ml.
- Centrifugar 7000g. 10´4ºC.
- Desechar el sobrenadante.
- Resuspender en 200ul de Buffer IBc frío (juntamos los dos pellets en un eppendorf
de 1,5 ml).
- Centrifugar 7000g. 10á 4ºC.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet según el uso posterior.
3. Uso Posterior
- WB: resuspender en RIPA (BR20x) con IP para extraer proteína y cuantificar.
- Blue Native: resuspender en buffer IBc con IP para cuantificar.
Recetas
Sacarosa 1 M.
Disolver 342,3g de sacarosa en 1 litro de agua destilada. Mezclar bien y preparar

alícuotas de 20 ml y congelar a -20ºC.
Tris-MOPS 0,1 M
Disolver 12,1 g de Tris en 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4 usando

MOPS en polvo. Llevar la solución a 1 litro y guardar a 4ºC
Tris-HCl 1 M
Disolver 121,14 g de Tris en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 con HCl y
llevar el volumen a 1 litro. Guardar a temperatura ambiente.
EGTA-Tris 0,1 M
Disolver 38,1 g de EGTA en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 con Tris
en polvo y llevar el volumen a 1 litro. Guardar a 4ºC.
Inhibidor de proteasas (IP)

Roche ref. 11873580001 (4ºC)
Diluir una pastilla en 2ml (stock 25X) y hacer alícuotas de 50ul. Guardar a -20ºC.
Buffer para aislar mitocondrias IBc

Tris-MOPS 0,1M 10ml
EGTA-Tris 20ml (1ml según el protoclo original)
Sacarosa 1M 20ml
Llevar a 100ml con agua destilada
Ajustar el pH a 7,4

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(A partir del órgano)

Protocolo #1. https://doi.org/10.1152/ajpheart.1998.275.5.H1567

A partir del órgano:

1. Poner el tejido en cardíaco en buffer de aislamiento (sacarosa 50 mM, manitol 200

Protocolo #2/ https://sci-hub.ren/10.1007/s00395-009-0007-5

1. Poner el tejido en cardíaco en buffer A de aislamiento (100 mM KCl, 50 mM 3-[N-

8. Homogenizar using Dounce Homogenizer or PTFE (Teflon) Potter Elvehjem

Isolated Cardiac Mitochondria. (A partir del cultivos celulares)

5. Añada inmediatamente 8 ml de tampón de homogeneización MS 2,5 × para obtener

6. Transferir el homogeneizado a un tubo de centrífuga para centrifugación diferencial.

8. Vierta el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio. La parte superior del

9. Repetir paso 6 y 7 (2 veces más.)

12. Lave las mitocondrias resuspendiendo el sedimento en tampón 1 × MS y repitiendo

13. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en un tampón adecuado para

MS Homogenization Buffer (2.5×)

RSB Hypo Buffer

Disolver 342,3g de sacarosa en 1 litro de agua destilada. Mezclar bien y preparar

Disolver 12,1 g de Tris en 500 ml de agua destilada y ajustar el pH a 7,4 usando

Inhibidor de proteasas (IP)

Buffer para aislar mitocondrias IBc

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