Buy ebook Bioluminescence Sung Bae Kim cheap price

Download Full Version ebook - Visit ebookmeta.
com
Bioluminescence Sung Bae Kim
https://ebookmeta.com/product/bioluminescence-sung-bae-kim/
OR CLICK HERE
DOWLOAD NOW
Discover More Ebook - Explore Now at ebookmeta.com

Instant digital products (PDF, ePub, MOBI) ready for you
Download now and discover formats that fit your needs...
Start reading on any device today!
Live Cell Imaging Sung Bae Kim
https://ebookmeta.com/product/live-cell-imaging-sung-bae-kim/
ebookmeta.com
Mechanics of Solids and Fracture 4th edition Ho Sung Kim
https://ebookmeta.com/product/mechanics-of-solids-and-fracture-4th-
edition-ho-sung-kim/
ebookmeta.com
Recent Developments in Neuroscience Research on Human

Motivation 1st Edition Sung-Il Kim
https://ebookmeta.com/product/recent-developments-in-neuroscience-
research-on-human-motivation-1st-edition-sung-il-kim/
ebookmeta.com
You Can Conquer Cancer A New Way of Living Ian Gawler
https://ebookmeta.com/product/you-can-conquer-cancer-a-new-way-of-
living-ian-gawler/
ebookmeta.com
Principles of Neural Science 6th Edition Eric R. Kandel
(Editor)
https://ebookmeta.com/product/principles-of-neural-science-6th-
edition-eric-r-kandel-editor/
ebookmeta.com
Process Safety for Engineers : An Introduction 2nd Edition

Ccps (Center For Chemical Process Safety)
https://ebookmeta.com/product/process-safety-for-engineers-an-
introduction-2nd-edition-ccps-center-for-chemical-process-safety/
ebookmeta.com
Advancing the Discipline of Regulatory Science for Medical

Product Development An Update on Progress and a Forward
Looking Agenda Workshop Summary 1st Edition And Medicine
Engineering National Academies Of Sciences
https://ebookmeta.com/product/advancing-the-discipline-of-regulatory-
science-for-medical-product-development-an-update-on-progress-and-a-
forward-looking-agenda-workshop-summary-1st-edition-and-medicine-
engineering-national-academi/
ebookmeta.com
Kiss the Girl 1st Edition Zoraida Cordova
https://ebookmeta.com/product/kiss-the-girl-1st-edition-zoraida-
cordova/
ebookmeta.com
Qualitative Researcher Vulnerability Negotiating

Experiencing and Embracing 1st Edition Bryan C Clift
Ioannis Costas Batlle Sheree Bekker Katharina Chudzikowski
Eds
https://ebookmeta.com/product/qualitative-researcher-vulnerability-
negotiating-experiencing-and-embracing-1st-edition-bryan-c-clift-
ioannis-costas-batlle-sheree-bekker-katharina-chudzikowski-eds/
ebookmeta.com
A Lion s Pride Catherine Hapka
https://ebookmeta.com/product/a-lion-s-pride-catherine-hapka/
ebookmeta.com
Methods in
Molecular Biology 2525
Sung-Bae Kim Editor
Bioluminescence
Methods and Protocols
Volume 2
Fourth Edition
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire Hatfield,
Hertfordshire, UK
For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was
the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all
biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by-
step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents
needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported
with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting
advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and
constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology
series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are
indexed in PubMed.
Bioluminescence
Methods and Protocols, Volume 2
Fourth Edition
Edited by
Sung-Bae Kim
Environmental Management Research Institute, National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology (AIST), Tsukuba, Ibaraki, Japan
Editor
Sung-Bae Kim
Environmental Management Research
Institute
National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology (AIST)
Tsukuba, Ibaraki, Japan
ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-2472-2 ISBN 978-1-0716-2473-9 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2473-9
© The Editor(s) (if applicable) and The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part
of Springer Nature 2022
This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part
of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation,
broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and
retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter
developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply,
even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations
and therefore free for general use.
The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been
made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
Cover Illustration Caption: Longitudinal BLI analysis of Australian bat lyssavirus (ABLV)-luc replication in the same
mouse on Day 3, Day 5, and Day 10 post-infection. For each image, BLI data are overlaid on a CT image of one B6
Albino mouse infected with ABLV-Luc. Scale bars indicate range of the pseudocolor intensity scale that is used to show
mean luminescence intensity (MLI) values. Intensity of viral replication is greatest in the brain.
This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer
Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
Preface
Bioluminescence means a “cold light,” a unique type of chemiluminescence taking place

inside a living organism. Historically, bioluminescence has been a source of fascination and
curiosity for many people. Bioluminescence from living organisms is so strong as to be
visible with naked eyes and intrinsically non-toxic to living organisms.
Nowadays, bioluminescence is utilized as a versatile optical readout in multidisciplinary
research areas, because it is advantageous in its low background intensity, high signal-to-
noise ratios, wide dynamic ranges, versatility, and suitability in the imaging of animal models.
Because of these distinctive virtues, bioluminescence has revolutionized molecular imaging
and bioanalysis of intracellular molecular events with higher quantitative properties.
In these protocol books, we highlight recent advances in molecular imaging techniques,
which may be immediately useful in global biolaboratories. The chapters are categorized
into nine major parts according to technological properties: (i) Establishment of Luciferins
and Luciferases, (ii) Basic In Vitro Applications, (iii) Basic In Vivo Applications,
(iv) Multiplex Imaging Platforms, (v) Heterogeneous Conjugates, (vi) Protein Fragment-
Complementation Assays, (vii) BRET-Based Imaging, (viii) Instrumentation, and
(ix) Software. We hope that this book has a role in directing and inspiring researchers to
create smarter imaging techniques of the next generation, being truly quantitative, highly
sensitive, and readily comprehended. All these efforts on advanced molecular imaging will
engender deeper understanding of biological systems and will break new ground in the
research fields of life science.
I am greatly honored to complete this project with the contributors of this book. They
generously accepted contributing one or multiple chapters for these books. The 66 chapters
in total, to which major research groups from around the world have contributed, truly
reflect the hottest research protocols regarding bioluminescence to date. I am thankful to
Professor John Walker and the publishing team for their timely advice and support. Finally, I
owe a special thank you to Young-Eun, my wife, and Yun and Hun, my children, for their
endless support.
I hope that this protocol book is genuinely practical and comprehensive guidance for
researchers and technical staff on how to proceed with bioluminescence studies in
laboratories.
Tsukuba, Ibaraki, Japan Sung-Bae Kim
v
Contents
Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
PART I HETEROGENEOUS CONJUGATES

1 Quantitative Assessment of the Efficacy of Near-Infrared
Photoimmunotherapy with Bioluminescence Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Ryuhei Okada, Aki Furusawa, Peter L. Choyke, and Hisataka Kobayashi
2 Evaluation of the Efficacy of Saracatinib-Loaded Nanoparticles
in Lymphatic Metastases of HNSCC with the Aid of Bioluminescence
Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Liwei Lang and Yong Teng
3 Reactive Oxygen Species-Responsive and Self-Illuminating Nanoparticles
for Inflammation and Tumor Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Xiaoqiu Xu, Qi Li, and Jianxiang Zhang
4 Antibacterial Activity Evaluation of ZnO, CuO, and TiO2 Nanoparticles
in Solution and Thin Films . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Christine Mielcarek, Rania Dadi, Anne Roynette, Alex Lemarchand,
Andrei Kanaev, Karim Senni, Mamadou Traore, and Rabah Azouani
5 BRET-Based Dual-Color (Visible/Near-Infrared) Molecular Imaging
Using a Quantum Dot/EGFP-Luciferase Conjugate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Setsuko Tsuboi and Takashi Jin
6 Polyhistidine-Tag-Enabled Conjugation of Quantum Dots and Enzymes
to DNA Nanostructures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Christopher M. Green, Divita Mathur, Kimihiro Susumu, Eunkeu Oh,
Igor L. Medintz, and Sebastián A. Dı́az
7 Real-Time Quantification of Cell Internalization Kinetics by Bioluminescent
Probes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Roxanne Castillo, Di Wu, Zheng Cao, Ran Yan, Kalea Fajardo, Jie Ren,
Yunfeng Lu, and Jing Wen
PART II PROTEIN FRAGMENT-COMPLEMENTATION ASSAYS
8 Quantitative Imaging of Retinoic Acid Activities in Living Mammalian Cells . . . 111

Sung-Bae Kim, Rika Fujii, and Ramasamy Paulmurugan
9 Bioluminescence-Based Complementation Assay to Correlate
Conformational Changes in Membrane-Bound Complexes
with Enzymatic Function . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
Sharon O’Neill and Ulla G. Knaus
10 The NanoBiT-Based Homogenous Ligand–Receptor Binding Assay . . . . . . . . . . 139
Ya-Li Liu and Zhan-Yun Guo
vii
viii Contents
11 Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-Based

Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
Alexander Pipchuk and Xiaolong Yang
PART III BRET-BASED IMAGING
12 Screening of Protein–Protein Interaction Modulators Using BRET-Based

Technology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Lucia R. Fernández, Jesica Mild, and Martin M. Edreira
13 TRUPATH: An Open-Source Biosensor Platform for Interrogating
the GPCR Transducerome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
Jeffrey F. DiBerto, Reid H. J. Olsen, and Bryan L. Roth
14 MERLIN: A BRET-Based Proximity Biosensor for Studying
Mitochondria–ER Contact Sites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Hector Flores-Romero and Ana J. Garcı́a-Sáez
15 Single-Cell NanoBRET Imaging with Green-Range HaloTag Acceptor. . . . . . . . 207
Ovia Thirukkumaran and Hideaki Mizuno
16 Method for Measuring Bioactive Molecules in Blood by a Smartphone
Using Bioluminescent Ratiometric Indicators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219
Mitsuru Hattori, Yukino Itoh, and Takeharu Nagai
17 BRET Sensors for Imaging Membrane Integrity of Microfluidically
Generated Extracellular Vesicles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227
Ramasamy Paulmurugan, Yi Liu, Uday Kumar Sukumar,
Masamitsu Kanada, and Tarik F. Massoud
18 In Vivo Assessment of Protein-Protein Interactions Using BRET Assay. . . . . . . . 239
Aaiyas Mujawar and Abhijit De
19 Live Cell Imaging of ATP Dynamics in Plant Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
Ryoichi Sato and Shinji Masuda
20 Bioluminescence Resonance Energy Transfer for Global DNA
Methylation Quantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267
Natsumi Taka, Yuji Baba, Yuka Iwasaki, and Wataru Yoshida
21 In Vivo Bioluminescent Imaging of Bone Marrow-Derived Mesenchymal
Stem Cells in Mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
Prakash Gangadaran, Ji Min Oh, Ramya Lakshmi Rajendran,
and Byeong-Cheol Ahn
22 In Vivo Imaging of Oxidative and Hypoxic Stresses in Mice Model
of Amyotrophic Lateral Sclerosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
Yasuyuki Ohta, Emi Nomura, Shinae Kizaka-Kondoh, and Koji Abe
PART IV INSTRUMENTATION
23 ATP Sensing Paper with Smartphone Bioluminescence-Based Detection . . . . . . 297
Maria Maddalena Calabretta, Ruslan Alvarez-Diduk, Elisa Michelini,
and Arben Merkoçi
Contents ix
24 Organ Bioluminescence Imaging Under Machine Perfusion Setting

for Assessing Quality of Harvested Organ Preservation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309
Yuhei Higashi, Jun Homma, and Hidekazu Sekine
25 Time-Lapse Bioluminescence Imaging of Hes7 Expression In Vitro
and Ex Vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321
Marina Sanaki-Matsumiya and Ryoichiro Kageyama
26 Bioluminescence-Optogenetics: A Practical Guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
Matthew A. Stern, Henry Skelton, Alejandra M. Fernandez,
Claire-Anne N. Gutekunst, Ken Berglund, and Robert E. Gross
27 Applications of Bioluminescence-Optogenetics in Rodent Models . . . . . . . . . . . . 347
Matthew A. Stern, Henry Skelton, Alejandra M. Fernandez,
Claire-Anne N. Gutekunst, Robert E. Gross, and Ken Berglund
28 One-Channel Microsliding Luminometer for Quantifying Low-Energy
Bioluminescent Lights. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365
Sung-Bae Kim and Ramasamy Paulmurugan
29 Compact Eight-Channel Light-Sensing System for Bioassays . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
Sung-Bae Kim, Sharon Seiko Hori, Negar Sadeghipour, Uday Kumar
Sukumar, and Ramasamy Paulmurugan
30 Characterization of Firefly Flashes at Various Temperatures in Different
Wavelength Regions. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387
Anurup Gohain Barua and Angana Goswami
31 Bioluminescent Monitoring of Circadian Rhythms in Isolated Mesophyll
Cells of Arabidopsis at Single-Cell Level . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 395
Shunji Nakamura and Tokitaka Oyama
PART V SOFTWARE
32 Exploring Phylogenetic Relationships and Divergence Times

of Bioluminescent Species Using Genomic and Transcriptomic Data . . . . . . . . . . 409
Danilo T. Amaral, Monique Romeiro-Brito, and Isabel A. S. Bonatelli
Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425
Contributors
KOJI ABE • National Center of Neurology and Psychiatry (NCNP), Tokyo, Japan
BYEONG-CHEOL AHN • BK21 FOUR KNU Convergence Educational Program of
Biomedical Sciences for Creative Future Talents, Department of Biomedical Science, School
of Medicine, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea; Department of
Nuclear Medicine, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu, Republic of
Korea; Department of Nuclear Medicine, Kyungpook National University Hospital,
Daegu, Republic of Korea
RUSLAN ALVAREZ-DIDUK • Nanobioelectronics and Biosensors Group, Catalan Institute of
Nanoscience and Nanotechnology (ICN2), CSIC, The Barcelona Institute of Science and
Technology, Barcelona, Spain
DANILO T. AMARAL • Departamento de Biologia, Centro de Ciências Humanas e Biologicas,
Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), Sorocaba, Brazil; Programa de Pos
Graduação em Biologia Comparada, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, Brazil
RABAH AZOUANI • EBI-Ecole de Biologie Industrielle, Cergy, France
YUJI BABA • Graduate School of Bionics, Tokyo University of Technology, Tokyo, Japan
ANURUP GOHAIN BARUA • Department of Physics, Gauhati University, Guwahati, India
KEN BERGLUND • Department of Neurosurgery, Emory University School of Medicine,
Atlanta, GA, USA
ISABEL A. S. BONATELLI • Departamento de Ecologia e Biologia Evolutiva, Universidade
Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brazil
MARIA MADDALENA CALABRETTA • Department of Chemistry “Giacomo Ciamician”,
University of Bologna, Bologna, Italy; Center for Applied Biomedical Research (CRBA),
Azienda Ospedaliero-Universitaria Policlinico S. Orsola-Malpighi, Bologna, Italy
ZHENG CAO • Department of Chemical and Biomolecular Engineering, School of
Engineering, University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA, USA
ROXANNE CASTILLO • Department of Chemical and Biomolecular Engineering, School of
PETER L. CHOYKE • Molecular Imaging Branch, Center for Cancer Research, National
Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA
RANIA DADI • LSPM-CNRS, Laboratoire des Sciences des Procédés et des Matériaux,
Université Paris 13, Sorbonne Paris Cité, Villetaneuse, France
ABHIJIT DE • Molecular Functional Imaging Lab, ACTREC, Tata Memorial Centre, Navi
Mumbai, India
SEBASTIÁN A. DÍAZ • Center for Bio/Molecular Science and Engineering, U.S. Naval
Research Laboratory Code 6900, Washington, DC, USA
JEFFREY F. DIBERTO • Department of Pharmacology, University of North Carolina at Chapel
Hill School of Medicine, Chapel Hill, NC, USA
MARTIN M. EDREIRA • Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales, Departamento de Quı́mica Biologica, Buenos Aires, Argentina; CONICET-
Universidad de Buenos Aires, Instituto de Quı́mica Biologica de la Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales (IQUIBICEN), Buenos Aires, Argentina; Department of
xi
xii Contributors
Pharmacology and Chemical Biology, School of Medicine, University of Pittsburgh,

Pittsburgh, PA, USA
KALEA FAJARDO • Department of Chemical and Biomolecular Engineering, School of
ALEJANDRA M. FERNANDEZ • Department of Neurosurgery, Emory University School of
Medicine, Atlanta, GA, USA
LUCIA R. FERNÁNDEZ • Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales, Departamento de Quı́mica Orgánica, Buenos Aires, Argentina; CONICET-
Universidad de Buenos Aires, Unidad de Microanálisis y Métodos Fı́sicos Aplicados a la
Quı́mica Orgánica (UMYMFOR), Buenos Aires, Argentina
HECTOR FLORES-ROMERO • Institute for Genetics, University of Cologne, Cologne, Germany;
Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases
(CECAD), University of Cologne, Cologne, Germany; Interfaculty Institute of
Biochemistry, Eberhard-Karls-Universit€ a t Tübingen, Tübingen, Germany
RIKA FUJII • Environmental Management Research Institute, National Institute of
Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Japan
AKI FURUSAWA • Molecular Imaging Branch, Center for Cancer Research, National Cancer
Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA
PRAKASH GANGADARAN • BK21 FOUR KNU Convergence Educational Program of
Biomedical Sciences for Creative Future Talents, Department of Biomedical Science, School
of Medicine, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea; Department of
Nuclear Medicine, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu, Republic of
Korea
ANA J. GARCÍA-SÁEZ • Institute for Genetics, University of Cologne, Cologne, Germany;
Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases
(CECAD), University of Cologne, Cologne, Germany; Interfaculty Institute of
Biochemistry, Eberhard-Karls-Universit€ a t Tübingen, Tübingen, Germany
ANGANA GOSWAMI • Department of Physics, Pandit Deendayal Upadhyaya Adarsha
Mahavidyalaya Dalgaon, India
CHRISTOPHER M. GREEN • Center for Bio/Molecular Science and Engineering, U.S. Naval
Research Laboratory Code 6900, Washington, DC, USA; National Research Council,
Washington, DC, USA
ROBERT E. GROSS • Department of Neurosurgery, Emory University School of Medicine,
Atlanta, GA, USA
ZHAN-YUN GUO • Research Center for Translational Medicine at East Hospital, School of
Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai, China
CLAIRE-ANNE N. GUTEKUNST • Department of Neurosurgery, Emory University School of
Medicine, Atlanta, GA, USA
MITSURU HATTORI • SANKEN (The Institute of Scientific and Industrial Research), Osaka
University, IbarakiOsaka, Japan
YUHEI HIGASHI • Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s
Medical University, Tokyo, Japan; Tokaihit Co., Ltd., Shizuoka, Japan
JUN HOMMA • Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s
Medical University, Tokyo, Japan
SHARON SEIKO HORI • Molecular Imaging Program at Stanford, Stanford University School
of Medicine, Palo Alto, CA, USA; Canary Center at Stanford for Cancer Early Detection,
Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA, USA
YUKINO ITOH • Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, Osaka, Japan
Contributors xiii
YUKA IWASAKI • Graduate School of Bionics, Tokyo University of Technology, Tokyo, Japan
TAKASHI JIN • RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Osaka, Japan
RYOICHIRO KAGEYAMA • Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University,
Kyoto, Japan; Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University,
Kyoto, Japan; RIKEN Center for Brain Science, Wako, Japan
MASAMITSU KANADA • Molecular Imaging Program at Stanford, Stanford University School
ANDREI KANAEV • LSPM-CNRS, Laboratoire des Sciences des Procédés et des Matériaux,
SUNG-BAE KIM • Environmental Management Research Institute, National Institute of
Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Ibaraki, Japan
SHINAE KIZAKA-KONDOH • School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of
Technology, Yokohama, Japan
ULLA G. KNAUS • Conway Institute, School of Medicine, University College Dublin, Dublin,
Ireland
HISATAKA KOBAYASHI • Molecular Imaging Branch, Center for Cancer Research, National
Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA
LIWEI LANG • Department of Oral Biology and Diagnostic Sciences, Georgia Cancer Center,
Augusta University, Augusta, GA, USA
ALEX LEMARCHAND • LSPM-CNRS, Laboratoire des Sciences des Procédés et des Matériaux,
QI LI • Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Third Military Medical
University (Army Medical University), Chongqing, China; Department of Biomedical
Engineering and Medical Imaging, Third Military Medical University (Army Medical
University), Chongqing, China
YA-LI LIU • Research Center for Translational Medicine at East Hospital, School of Life
Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai, China
YI LIU • Molecular Imaging Program at Stanford, Stanford University School of Medicine,
Palo Alto, CA, USA; Canary Center at Stanford for Cancer Early Detection, Stanford
University School of Medicine, Palo Alto, CA, USA
YUNFENG LU • Department of Chemical and Biomolecular Engineering, School of
TARIK F. MASSOUD • Molecular Imaging Program at Stanford, Stanford University School of
Medicine, Palo Alto, CA, USA; Canary Center at Stanford for Cancer Early Detection,
SHINJI MASUDA • Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology,
Yokohama, Kanagawa, Japan
DIVITA MATHUR • Center for Bio/Molecular Science and Engineering, U.S. Naval Research
Laboratory Code 6900, Washington, DC, USA; College of Science, George Mason
University, Fairfax, VA, USA
IGOR L. MEDINTZ • Center for Bio/Molecular Science and Engineering, U.S. Naval Research
Laboratory Code 6900, Washington, DC, USA
ARBEN MERKOÇI • Nanobioelectronics and Biosensors Group, Catalan Institute of
Nanoscience and Nanotechnology (ICN2), CSIC, The Barcelona Institute of Science and
Technology, Barcelona, Spain; Catalan Institution for Research and Advanced Studies
(ICREA), Barcelona, Spain
xiv Contributors
ELISA MICHELINI • Department of Chemistry “Giacomo Ciamician”, University of Bologna,

Bologna, Italy; Center for Applied Biomedical Research (CRBA), Azienda Ospedaliero-
Universitaria Policlinico S. Orsola-Malpighi, Bologna, Italy
CHRISTINE MIELCAREK • EBI-Ecole de Biologie Industrielle, Cergy, France
JESICA MILD • Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,
Departamento de Quı́mica Biologica, Buenos Aires, Argentina; CONICET-Universidad
de Buenos Aires, Instituto de Quı́mica Biologica de la Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales (IQUIBICEN), Buenos Aires, Argentina
HIDEAKI MIZUNO • Laboratory of Biomolecular Network Dynamics, Biochemistry, Molecular
and Structural Biology Section, Department of Chemistry, KU Leuven, Heverlee, Belgium
AAIYAS MUJAWAR • Molecular Functional Imaging Lab, ACTREC, Tata Memorial Centre,
Navi Mumbai, India
TAKEHARU NAGAI • SANKEN (The Institute of Scientific and Industrial Research), Osaka
University, IbarakiOsaka, Japan; Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka
University, Osaka, Japan
SHUNJI NAKAMURA • Department of Botany, Graduate School of Science, Kyoto University,
Kyoto, Japan
EMI NOMURA • Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Dentistry and
Pharmaceutical Sciences, Okayama University, Okayama, Japan
SHARON O’NEILL • Conway Institute, School of Medicine, University College Dublin, Dublin,
Ireland; Legend Biotech, Dublin, Ireland
EUNKEU OH • Optical Sciences Division, Code 5600, U.S. Naval Research Laboratory,
Washington, DC, USA
JI MIN OH • Department of Nuclear Medicine, School of Medicine, Kyungpook National
University, Daegu, Republic of Korea
YASUYUKI OHTA • Division of Neurology and Clinical Neuroscience, Department of Internal
Medicine III, Yamagata University School of Medicine, Yamagata, Japan
RYUHEI OKADA • Molecular Imaging Branch, Center for Cancer Research, National Cancer
Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA
REID H. J. OLSEN • Discovery Biology and GPCR Pharmacology, Exscientia PLC., Oxford,
UK
TOKITAKA OYAMA • Department of Botany, Graduate School of Science, Kyoto University,
Kyoto, Japan
RAMASAMY PAULMURUGAN • Molecular Imaging Program at Stanford, Stanford University
School of Medicine, Palo Alto, CA, USA; Canary Center at Stanford for Cancer Early
Detection, Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA, USA
ALEXANDER PIPCHUK • Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen’s
University, Kingston, ON, Canada
RAMYA LAKSHMI RAJENDRAN • Department of Nuclear Medicine, School of Medicine,
Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea
JIE REN • Department of Chemical and Biomolecular Engineering, School of Engineering,
University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA, USA
MONIQUE ROMEIRO-BRITO • Departamento de Biologia, Centro de Ciências Humanas
e Biologicas, Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), Sorocaba, Brazil
BRYAN L. ROTH • Department of Pharmacology, University of North Carolina at Chapel Hill
School of Medicine, Chapel Hill, NC, USA
ANNE ROYNETTE • EBI-Ecole de Biologie Industrielle, Cergy, France
NEGAR SADEGHIPOUR • Molecular Imaging Program at Stanford, Stanford University School
Contributors xv
MARINA SANAKI-MATSUMIYA • European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Barcelona,

Spain; Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japan
RYOICHI SATO • RIKEN Center for Sustainable Resource Science, Yokohama, Kanagawa,
Japan
HIDEKAZU SEKINE • Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo
Women’s Medical University, Tokyo, Japan
KARIM SENNI • EBI-Ecole de Biologie Industrielle, Cergy, France
HENRY SKELTON • Department of Neurosurgery, Emory University School of Medicine,
Atlanta, GA, USA
MATTHEW A. STERN • Department of Neurosurgery, Emory University School of Medicine,
Atlanta, GA, USA
UDAY KUMAR SUKUMAR • Molecular Imaging Program at Stanford, Stanford University
School of Medicine, Palo Alto, CA, USA; Canary Center at Stanford for Cancer Early
Detection, Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA, USA
KIMIHIRO SUSUMU • Optical Sciences Division, Code 5600, U.S. Naval Research Laboratory,
Washington, DC, USA; Jacobs Corporation, Hanover, MD, USA
NATSUMI TAKA • Graduate School of Bionics, Tokyo University of Technology, Tokyo, Japan
YONG TENG • Department of Oral Biology and Diagnostic Sciences, Georgia Cancer Center,
Augusta University, Augusta, GA, USA; Department of Hematology and Medical
Oncology, Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA,
USA
OVIA THIRUKKUMARAN • Laboratory of Biomolecular Network Dynamics, Biochemistry,
Molecular and Structural Biology Section, Department of Chemistry, KU Leuven,
Heverlee, Belgium
MAMADOU TRAORE • LSPM-CNRS, Laboratoire des Sciences des Procédés et des Matériaux,
SETSUKO TSUBOI • RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Osaka, Japan
JING WEN • Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, David
Geffen School of Medicine, UCLA AIDS Institute, University of California, Los Angeles,
Los Angeles, CA, USA
DI WU • Department of Chemical and Biomolecular Engineering, School of Engineering,
University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA, USA
XIAOQIU XU • Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Third Military Medical
University (Army Medical University), Chongqing, China; Laboratory of Human Disease
and Immunotherapies, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, China
RAN YAN • College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech
University, Nanjing, China
XIAOLONG YANG • Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen’s University,
Kingston, ON, Canada
WATARU YOSHIDA • Graduate School of Bionics, Tokyo University of Technology, Tokyo, Japan;
School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo University of Technology, Tokyo, Japan
JIANXIANG ZHANG • Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Third Military
Medical University (Army Medical University), Chongqing, China; State Key Lab of
Trauma, Burn and Combined Injury, Third Military Medical University (Army Medical
University), Chongqing, China
Part I
Heterogeneous Conjugates
Chapter 1
Quantitative Assessment of the Efficacy of Near-Infrared

Photoimmunotherapy with Bioluminescence Imaging
Ryuhei Okada, Aki Furusawa, Peter L. Choyke, and Hisataka Kobayashi
Abstract
Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is a cell-specific cancer therapy in which antibody–photo-
absorber conjugates (APCs) are activated by NIR light to induce rapid immunogenic cell death with
minimal off-target effects. In preclinical settings, bioluminescence imaging (BLI) is useful to quantitatively
assess the efficacy of NIR-PIT for both in vitro and in vivo experiments, especially in the early phase of
testing. Here, we describe the detailed methods of the experiments for NIR-PIT and evaluation of its
efficacy using BLI.
Key words NIR-PIT, Firefly, Luciferase, Luciferin, BLI
1 Introduction
Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is a target cell-

specific cancer treatment using an antibody–photoabsorber conju-
gate (APC) [1–3]. The photoabsorber used in this therapy is
IRDye700DX (IR700), which is activated by NIR light at
689 nm. APCs bind the surface of target cells 1–2 days after
intravenous (i.v.) injection. Subsequent NIR light exposure induces
rapid necrotic/immunogenic cell death (ICD) [4, 5]. The cells
treated with NIR-PIT show immediate swelling, bleb formation,
and rupture of the cell membranes within a few minutes with
minimal off-target effects [1, 6]. When cancer cells are targeted
by NIR-PIT, this rapid ICD releases various signaling molecules
and tumor-associated antigens from dying cancer cells, resulting in
the maturation of immature dendritic cells and following priming,
proliferation, and activation of CD8+ T cells [2]. A global phase III
human clinical trial of NIR-PIT targeting hEGFR in patients with
inoperable head and neck cancer is ongoing from May 2019
(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03769506). In
September 2020, the first APC for NIR-PIT, cetuximab-IR700
Sung-Bae Kim (ed.), Bioluminescence: Methods and Protocols, Volume 2,

Methods in Molecular Biology, vol. 2525, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2473-9_1,
© The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2022
3
4 Ryuhei Okada et al.
(ASP1929), was conditionally approved and registered for clinical

use by the Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA)
in Japan. Although this technology originally targeted specific can-
cer cell antigen, it could equally well be applied to other unfavor-
able cells, such as immune suppressors, in the tumor
microenvironment. In preclinical settings, intratumoral immuno-
suppressive cells, such as regulatory T cells, were killed with appro-
priately targeted NIR-PIT [7–9], while cancer-cell-targeted
NIR-PIT was also administered. Results showed that this com-
bined approach was superior to monotherapy [10, 11]. The efficacy
of cancer-cell-targeted NIR-PIT can also be enhanced by combin-
ing it with systemic immune checkpoint inhibitors, such as anti-
PD-1 or anti-CTLA4, as demonstrated in syngeneic mouse cancer
models [12, 13].
Since the target cell killing occurs rapidly after exposure to NIR
light, bioluminescence (BL) (e.g., firefly luciferase (FLuc)) and
fluorescence (FL) (e.g., GFP) analyses are useful to quantitively
evaluate the efficacy of both in vitro and in vivo NIR-PIT preclinical
experiments. Luciferase–luciferin BL analysis relies on oxygen and
ATP levels in living cells and is superior to GFP FL because rapid
ATP loss impedes BL but does not immediately affect GFP FL
[14].
In this chapter, we describe step-by-step methods for the
in vitro and in vivo experiments to measure the effects of
NIR-PIT using BL. Although luciferase- and hEGFR- expressing
A431 (A431-luc) cell line and Panitumumab, a monoclonal anti-
body (mAb) against hEGFR, are exemplified in this chapter, the
methods could also be applied to other combinations of cell line
and mAb.
2 Materials
2.1 Manufacture of 1. 10 mM IRDye® 700DX NHS ester (IR700, LI-COR Biosci-

IR700 Conjugated ence) solution: dissolve 5 mg of IR700 NHS ester into
Monoclonal Antibody 255.9 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO). Store at 20 C in
(mAb-IR700 the dark.
Conjugate) 2. 20 mg/mL of Panitumumab as a monoclonal antibody. Store
at 4 C.
3. 0.1 M disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) solution
(pH 8–9): dissolve 1.42 g of Na2HPO4 into 100 mL of dis-
tilled water.
4. Phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4).
5. 13.5-mL Sephadex G-25 column.
6. Coomassie Brilliant Blue (CBB) protein assay reagent.
7. UV–Vis spectrophotometer (8453 Value System, Agilent).
Bioluminescence Imaging in NIR-PIT Experiments 5
Fig. 1 NIR light sources. Either LED or laser light source of 689 nm is used. Laser
diffusers consist of frontal and cylindrical diffusers. The light from a frontal
diffuser can be changed to a parallel beam with a collimator. For interstitial light
exposure, including endoscopic procedures, cylindrical diffusers are used
2.2 In Vitro PIT 1. A431-luc cell line (hEGFR- and FLuc-expressing cells).
2. Culture medium: add 50 mL of fetal bovine serum (FBS) and
5 mL of 100 antibiotics (penicillin–streptomycin; P/S) to
500 mL of RPMI 1640 medium with or without phenol red.
3. 0.05% (w/v) trypsin/EDTA solution: the diluted solution of
50 mL of 0.5% trypsin/EDTA with 500 mL of PBS.
4. Trypan blue stain solution.
5. NIR light source (e.g., LED or laser) (see Note 1, Fig. 1).
2.3 In Vivo PIT 1. Athymic nude mice, 6–8 weeks old.

2. Isoflurane and vaporizer system.
3. 5 mg/mL of pentobarbital solution.
4. 1-mL syringe and 2527-G needles.
2.4 Bioluminescence 1. D-luciferin solution: dissolve 1.0 g of D-luciferin in 66.6 mL of

Imaging (BLI) PBS to make a 15-mg/mL stock solution. Store at 20 C
before use.
2. BL imager (Photon Imager, Biospace Lab).
3 Methods
Carry out all procedures at room temperature (RT) unless other-

wise indicated.
Fig. 2 Purification of APC. (a) PBS is used for the purification of the APC. APC can be confirmed as a blue band
(solid arrow), while unconjugated dye remains at a higher level than the APC band (dashed arrow). (b) Just
before the APC collection. (c) Collection of the APC
3.1 Conjugation of 1. Mix 1 mg of Panitumumab (see Note 2) with 3.3 μL of 10 mM

IR700 with mAb IR700 (IR700/mAb molar ratio ¼ 5) in 0.1 M Na2HPO4
solution (adjust the volume in order to make the final total
solution volume to be 300–700 μL).
2. Incubate the above solutions at RT (20–25 C) for 60 min (see
Note 3).
3. Wash out the Sephadex G25 column with PBS.
4. Apply the mAB-IR700 mixture on the column.
5. Elute with PBS; collect only the blue-colored band (see Fig. 2).
6. Add 5 mL of the elate to 145 mL of CBB protein assay reagent
and measure the absorption at 595 nm as a reference with a
UV–Vis spectrophotometer to determine protein
concentration.
7. Separately determine the concentration of IR700 by photoab-
sorption at 689 nm to confirm the mean number of fluoro-
phore molecules conjugated to each mAb molecule (see
Note 4).
8. Store at 4 C in the dark before use.
3.2 In Vitro NIR-PIT 1. Harvest exponentially growing A431-luc cells with 0.05%
(w/v) trypsin/EDTA solution and centrifuge the cells for
3–5 min at 1500 RPM, at 4 C.
2. Count the cell number with trypan blue staining, and re-plate
the cells at appropriate density (2–3 105 cells) in each well of
the 12-well microplate.
3. Incubate 1 day in a CO2 incubator to allow the cell attachment
to the bottom of the well.
4. Aspirate the cell culture medium and add a fresh medium
containing mAb–IR700 conjugate (final concentration:
10 μg/mL). The optimal concentration of the mAb–IR700
conjugate will vary for each mAb; however, 10 μg/mL is
generally sufficient.
5. Incubate for 1 h at 4 or 37 C in a dark space (see Note 5).
6. Aspirate the cell culture medium, wash the cells with PBS, and
add phenol red-free complete medium (see Note 6).
7. Expose the cells to NIR light without the microplate cover.
8. Incubate for 1 h at 37 C.
9. Add 300 μg of D-luciferin (20 μL of D-luciferin solution) per
1 mL medium and incubate for 2 min (see Note 7).
10. Count the photon number for 10–30 s with a BL imager (see
Note 8, Fig. 3).
Fig. 3 BL assessment of in vitro NIR-PIT. Luciferase-expressing A431 cell line

and Panitumumab–IR700 conjugate are used. The treatment efficacy is
assessed in the presence or absence of APC and/or NIR light exposure. The
luciferase activity of the cells decreased only when the cells were incubated with
APC and exposed to NIR light. Abbreviations: APC+ and APC, with and without
antibody–photoabsorber conjugates; CPM, count per minute
3.3 In Vivo NIR-PIT 1. Harvest exponentially growing A431-luc cells with 0.05%
(w/v) trypsin, and collect the cells into a centrifuge tube with
the same volume of RPMI 1640 medium as the trypsin/EDTA
solution.
2. Centrifuge the cells for 3–5 min at 1500 rpm, at 4 C.
3. Resuspend the cell pellet with cold PBS and quantify the cells
with a hemocytometer or a cell counter and dilute cell suspen-
sion with PBS so that two million cells are contained in 100 μL
(see Note 9).
4. Keep the cell suspension on ice before use.
5. Anesthetize the mouse with 3% (v/v) isoflurane.
6. Mix the cell suspension thoroughly before injection.
7. Aspirate the cell suspension with a 1-mL syringe and 25–27 G
needle, and inject 100 μL of the cells subcutaneously into the
right dorsum of the mice. Withdraw the needle slowly.
8. Monitor the mouse daily and examine the tumor volume peri-
odically by caliper. Calculate tumor volume as (major axis of
tumor) (minor axis of tumor)2 0.5.
9. Once the tumor volume reaches ~100 mm3, assign the tumor-
bearing mice randomly to either the treatment group or non-
treatment control group (see Note 10).
10. Anesthetize the mice with isoflurane and slowly inject mAb–
IR700 conjugate into the tail vein with a 1-mL syringe and
27–30 G needle (see Note 11).
11. On the following day, confirm mAb–IR700 accumulation in
the tumor with in vivo FLFL imaging (see Note 12), followed
by anesthesia of the mice with isoflurane and intraperitoneal
(i.p.) injection of pentobarbital (~750 μg/body).
12. Expose the entire tumor to NIR light under deep anesthesia
(see Note 13, Fig. 4). Upon external NIR light exposure, place
a piece of aluminum foil with a hole of approximately half-inch
diameter (corresponding to the tumor) over the mouse to
ensure that the NIR light exposure is limited to the tumor
site. When performing interstitial light exposure, cylindrical
diffusers are placed through an i.v. catheter or endoscope.
13. Place the mice on heating pads and observe until the recovery
from anesthesia.
14. Monitor the mouse daily and examine the tumor volume
periodically by caliper.
15. Analyze treatment effects and survival outcomes by comparing
them with the control tumors (see Note 14).
Fig. 4 Light exposure in in vivo NIR-PIT. (a–c) An example of external light exposure. (a) Mouse is located
under the laser collimator (*). The black arrow represents the location of the tumor. (b) Upon NIR light
exposure, a piece of aluminum foil with a hole is placed over the mouse to shield the rest of the mouse. (c) NIR
light is applied onto the tumor site through the hole. (d) An example of interstitial light exposure. A cylindrical
diffuser is inserted through the intravenous (i.v.) catheter to allow deeper penetration of interstitial light
3.4 BL Assessment 1. Inject D-luciferin solution (15 mg/mL, 200 μL) i.p. before
of the Efficacy of In and after NIR-PIT under anesthesia with isoflurane.
Vivo NIR-PIT 2. Obtain cumulative images for 2–3 min with a BL imager (Pho-
ton Imager) 10–15 min after the injection of the luciferin
solution (see Note 15). Perform this imaging before and after
NIR-PIT (see Fig. 5).
3. For quantitative analysis, place regions of interest (ROIs) over
the entire tumor using analysis software that comes with the
imager or separate software.
4. Calculate the photon counts per minute of relative light units
(RLU).
5. Calculate %RLU as (RLU of post-treatment)/(RLU of
pre-treatment) 100.
6. Analyze the treatment effects by comparing them with the
control tumors.
Fig. 5 In vivo imaging before and after the NIR-PIT. Luciferase-expressing A431 cell line and Panitumumab–
IR700 conjugate are exemplified. Top: The 700-nm FL images. The FL of IR700 is immediately quenched after
the NIR light exposure. Bottom: The BL images with luciferase/luciferin reaction. The luciferase activity
dramatically decreases 1 day after the light exposure
4 Notes
1. To avoid accidents with laser light, all studies should be carried

out in accordance with laser safety regulations. Since the spec-
trum of laser light is more narrow and closely matched to the
absorbance of IR700 than that of LED, laser NIR-PIT has
superior efficacy to LED NIR-PIT in both in vitro and in vivo
experimental settings [15].
2. In clinical mAb preparations, vial excipients may inhibit conju-
gation reactions. By exchanging a solvent with a centrifugal
filter or dialysis of the antibody, the potential reaction inhibi-
tors can be eliminated.
3. Higher final concentrations of DMSO may inhibit conjuga-
tion. Reaction pH should be adjusted to 8–9 by adding
Na2HPO4 solution.
4. It is very important to determine an optimal conjugation num-
ber of IR700 molecules per mAb. Conjugating too many
IR700 molecules in 1 mAb may result in loss of the binding
affinity in vivo even while the same ratio is successful in vitro.
Our results indicate that 3–4 IR700 molecules per mAb mole-
cule work well for both in vitro and in vivo experiments;
however, the optimal ratio may be different for each mAb. It
is also important to confirm whether mAb and IR700 are
conjugated or not using HPLC and SDS-PAGE.
5. Dense accumulation of IR700 dyes to the cells may lead to

rapid cell death in response to even weak NIR light contained
in the room light so that the cells should be kept in a dark place
as much as possible.
6. Phenol red-free medium may be useful to avoid the absorption
of NIR excitation light.
7. The cells should be kept warm (e.g., use heating pads). The
photon count decreases in a cold environment.
8. The cell viability can also be measured with other alternative
assays, such as MTT assay or propidium-iodide staining with
flow cytometry.
9. The optimal number of cells for injection depends on cell types
and mouse strains. Consistent tumor “take rate” and tumor
growth rate are important for the treatment study.
10. When mice with colored hair (e.g., C57BL/6) are used, the
hair overlying the tumor site should be shaved before NIR-PIT
and imaging studies. Depilation-induced skin pigmentation,
which occurs within 1 week after hair removal, precludes accu-
rate NIR light exposure or measurement of BL [16]. When
repetitive light exposures or long-term assessment of BL is
needed, use white-haired or nude mice.
11. Make sure no air bubbles remain in the syringe. The
i.v. administration volume should not exceed 200 μL.
12. It is important to determine the point of the maximal IR700
accumulation within the tumor after mAb-IR700 injection.
The amount of IR700 uptake in the tumor is a major determi-
nant of NIR-PIT efficacy.
13. When using an LED light source, measure the power density
(mW/cm2) of the light and determine the distance between
the LED and target tumor, as power density, measured by an
optical power meter, dramatically decreases with distance.
When using a laser light source, we usually use the power
density of 100–150 mW/cm2. High power density may cause
thermal injury on the mouse skin [17].
14. Measurement of the tumor volume by caliper should be per-
formed by one person to reduce inter-observer errors.
15. The level of BL signal is the maximal between 10–15 min after
i.p. D-luciferin injection [18]. For consistency, the same delay
time should be applied in all BL experiments.
Acknowledgments
This work was supported by the Intramural Research Program of

the National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cen-
ter for Cancer Research (ZIA BC011513).
References
1. Mitsunaga M, Ogawa M, Kosaka N, Rosen- associated regulatory T cells with near-infrared
blum LT, Choyke PL, Kobayashi H (2011) photoimmunotherapy. Sci Transl Med 8(352):
Cancer cell-selective in vivo near infrared 352ra110. https://do i.org/10.1126/
photoimmunotherapy targeting specific mem- scitranslmed.aaf6843
brane molecules. Nat Med 17(12): 8. Okada R, Maruoka Y, Furusawa A, Inagaki F,
1685–1691. https://doi.org/10.1038/nm. Nagaya T, Fujimura D, Choyke PL, Kobayashi
2554 H (2019) The effect of antibody fragments on
2. Kobayashi H, Choyke PL (2019) Near-infrared CD25 targeted regulatory T cell near-infrared
photoimmunotherapy of cancer. Acc Chem photoimmunotherapy. Bioconjug Chem
Res 52(8):2332–2339. https://doi.org/10. 30(10):2624–2633. https://doi.org/10.
1021/acs.accounts.9b00273 1021/acs.bioconjchem.9b00547
3. Kobayashi H, Griffiths GL, Choyke PL (2020) 9. Okada R, Kato T, Furusawa A, Inagaki F,
Near-infrared photoimmunotherapy: photoac- Wakiyama H, Choyke PL, Kobayashi H
tivatable antibody-drug conjugates (ADCs). (2021) Local depletion of immune checkpoint
Bioconjug Chem 31(1):28–36. https://doi. ligand CTLA4 expressing cells in tumor beds
org/10.1021/acs.bioconjchem.9b00546 enhances antitumor host immunity. Adv Ther
4. Ogawa M, Tomita Y, Nakamura Y, Lee MJ, (Weinh) 4(5):2000269. https://doi.org/10.
Lee S, Tomita S, Nagaya T, Sato K, 1002/adtp.202000269
Yamauchi T, Iwai H, Kumar A, Haystead T, 10. Maruoka Y, Furusawa A, Okada R, Inagaki F,
Shroff H, Choyke PL, Trepel JB, Kobayashi Fujimura D, Wakiyama H, Kato T, Nagaya T,
H (2017) Immunogenic cancer cell death Choyke PL, Kobayashi H (2020) Combined
selectively induced by near infrared photoim- CD44- and CD25-targeted near-infrared
munotherapy initiates host tumor immunity. photoimmunotherapy selectively kills cancer
Oncotarget 8(6):10425–10436. https://doi. and regulatory T cells in syngeneic mouse can-
org/10.18632/oncotarget.14425 cer models. Cancer Immunol Res 8(3):
5. Sato K, Ando K, Okuyama S, Moriguchi S, 3 4 5 – 3 5 5 . h t t p s : // d o i . o r g / 1 0 . 1 1 5 8 /
Ogura T, Totoki S, Hanaoka H, Nagaya T, 2326-6066.Cir-19-0517
Kokawa R, Takakura H, Nishimura M, 11. Okada R, Furusawa A, Vermeer DW, Inagaki F,
Hasegawa Y, Choyke PL, Ogawa M, Kobayashi Wakiyama H, Kato T, Nagaya T, Choyke PL,
H (2018) Photoinduced ligand release from a Spanos WC, Allen CT, Kobayashi H (2021)
silicon phthalocyanine dye conjugated with Near-infrared photoimmunotherapy targeting
monoclonal antibodies: a mechanism of cancer human-EGFR in a mouse tumor model simu-
cell cytotoxicity after near-infrared photoim- lating current and future clinical trials. EBio-
munotherapy. ACS Cent Sci 4(11): Medicine 67:103345. https://doi.org/10.
1559–1569. https://doi.org/10.1021/ 1016/j.ebiom.2021.103345
acscentsci.8b00565 12. Nagaya T, Friedman J, Maruoka Y, Ogata F,
6. Ogata F, Nagaya T, Okuyama S, Maruoka Y, Okuyama S, Clavijo PE, Choyke PL, Allen C,
Choyke PL, Yamauchi T, Kobayashi H (2017) Kobayashi H (2019) Host immunity following
Dynamic changes in the cell membrane on near-infrared photoimmunotherapy is
three dimensional low coherent quantitative enhanced with PD-1 checkpoint blockade to
phase microscopy (3D LC-QPM) after treat- eradicate established antigenic tumors. Cancer
ment with the near infrared photoimmu- Immunol Res 7(3):401–413. https://doi.org/
notherapy. Oncotarget 8(61): 10.1158/2326-6066.Cir-18-0546
104295–104302. https://doi.org/10. 13. Maruoka Y, Furusawa A, Okada R, Inagaki F,
18632/oncotarget.22223 Fujimura D, Wakiyama H, Kato T, Nagaya T,
7. Sato K, Sato N, Xu B, Nakamura Y, Nagaya T, Choyke PL, Kobayashi H (2020) Near-infrared
Choyke PL, Hasegawa Y, Kobayashi H (2016) photoimmunotherapy combined with CTLA4
Spatially selective depletion of tumor- checkpoint blockade in syngeneic mouse
cancer models. Vaccines (Basel) 8(3):528. Paus R (2001) A comprehensive guide for the
https://doi.org/10.3390/vaccines8030528 accurate classification of murine hair follicles in
14. Maruoka Y, Nagaya T, Nakamura Y, Sato K, distinct hair cycle stages. J Invest Dermatol
Ogata F, Okuyama S, Choyke PL, Kobayashi H 117(1):3–15. https://doi.org/10.1046/j.
(2017) Evaluation of early therapeutic effects 0022-202x.2001.01377.x
after near-infrared photoimmunotherapy 17. Okuyama S, Nagaya T, Ogata F, Maruoka Y,
(NIR-PIT) using luciferase-luciferin photon- Sato K, Nakamura Y, Choyke PL, Kobayashi H
counting and fluorescence imaging. Mol (2017) Avoiding thermal injury during near-
Pharm 14(12):4628–4635. https://doi.org/ infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT): the
10.1021/acs.molpharmaceut.7b00731 importance of NIR light power density. Onco-
15. Sato K, Watanabe R, Hanaoka H, Nakajima T, target 8(68):113194–113201. https://doi.
Choyke PL, Kobayashi H (2016) Comparative org/10.18632/oncotarget.20179
effectiveness of light emitting diodes (LEDs) 18. O’Neill K, Lyons SK, Gallagher WM, Curran
and lasers in near infrared photoimmunother- KM, Byrne AT (2010) Bioluminescent imag-
apy. Oncotarget 7(12):14324–14335. https:// ing: a critical tool in pre-clinical oncology
doi.org/10.18632/oncotarget.7365 research. J Pathol 220(3):317–327. https://
16. Müller-Röver S, Handjiski B, van der Veen C, doi.org/10.1002/path.2656
Eichmüller S, Foitzik K, McKay IA, Stenn KS,
Chapter 2
Evaluation of the Efficacy of Saracatinib-Loaded

Nanoparticles in Lymphatic Metastases of HNSCC
with the Aid of Bioluminescence Imaging
Liwei Lang and Yong Teng
Abstract
Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) remains a deadly disease despite concerted efforts to
improve its diagnosis and treatment in recent decades. Metastasis of advanced HNSCC nearly always occurs
first in neck lymph nodes before the development of distant metastasis. However, the development of
preclinical animal models and therapeutic treatments for metastatic HNSCC is lagged from bench to clinic.
In this protocol, we exemplify an orthotopic tongue tumor model that can recapitulate the cervical
lymphatic metastases of HNSCC and the application to study the effect of novel saracatinib-loaded
nanoparticles (Nano-Sar). By taking advantage of bioluminescence imaging (BLI), the present protocol
reveals the strong anti-metastatic efficacy of Nano-Sar in the experimental setup. Collectively, the protocol
with a novel metastatic mouse model shows great potential to evaluate treatments on metastatic diseases
with the aid of bioluminescent technology.
Key words HNSCC, The orthotopic model, Lymphatic metastases, Saracatinib, Nanoparticles,
Bioluminescence (BL)
1 Introduction
Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) accounts for

over 90% of head and neck cancer, ranking seventh of the most
common cancers globally [1, 2]. HNSCC arises from mucosal
surface of oral cavity, sinonasal cavity, pharynx, larynx, and naso-
pharyngeal, and more than 60% of patients with advanced HNSCC
(at tumor late-stage III and IV) develop marked local invasion and
regional lymphatic metastases [3]. Even with improved standard
therapies and currently approved immunotherapy, the 5-year over-
all survival rate of advanced HNSCC is less than 50% [2, 4].
Lymphatic metastasis of HNSCC is driven by molecular dysre-
gulations. Src is one vital member of the Src kinase family of
nonreceptor tyrosine kinases (SFKs), conducting signaling
Sung-Bae Kim (ed.), Bioluminescence: Methods and Protocols, Volume 2,

Methods in Molecular Biology, vol. 2525, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2473-9_2,
© The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2022
15
16 Liwei Lang and Yong Teng
transductions to regulate multiple cell biological processes, includ-

ing epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) for cancer metas-
tasis [5, 6]. HNSCC has been reported as one of several cancer
types with aberrant Src expression and elevated Src activation [5, 7,
8]. Saracatinib is a novel anilinoquinazoline inhibitor of Src activa-
tion, showing limited antitumor activity on advanced HNSCC in
Phase II clinical trials [9, 10]. Recently, we and others uncovered
that saracatinib is a potent anti-metastatic reagent through EMT
inhibition in HNSCC [10, 11]. To deliver saracatinib to the popu-
lation of HNSCC cells efficiently and specifically, we developed a
novel tumor-seeking saracatinib-loaded nanoparticles (Nano-Sar)
[10]. In the previous study, Nano-Sar has shown a superior inhibi-
tory effect on HNSCC metastasis in the subcutaneous xenograft
model compared with the free drug [10]. However, the subcutane-
ous xenograft model cannot recapitulate specific tumor microenvi-
ronment for local invasion and cervical lymphatic metastases [12],
which hinders the translation of Nano-Sar from bench to clinical
trial. Therefore, there is an urgent need to generate an orthotopic
tumor model for HNSCC to monitor lymph node metastasis using
in vivo imaging system and evaluate anti-metastatic effects of novel
drugs like Nano-Sar.
Condon-optimized firefly luciferase (FLuc, Luc2 for gene),
which generates strong bioluminescence (BL) signal in mammalian
cells, is an ideal reporter gene for tracking cancer cells in vivo.
HN12 cells were derived from lymph node metastatic lesions
belonging to one HNSCC patient, showing strong invasion poten-
tial in vitro and metastatic capacity to lymph nodes [13, 14]. In this
protocol, we introduce an orthotopic tongue tumor model with
lymphatic metastases by direct injection of HN12 cells that are
stably expressing Luc2 (i.e., HN12-Luc2) into the tongue of
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice. Moreover, we
apply this tongue tumor model to determine the effect of Nano-
Sar on cervical lymph node metastasis. Our approach has method-
ological advantages in evaluating cancer metastasis in preclinical
animal models using BL technology, which would advance the
development of novel treatments for metastatic HNSCC.
2 Materials
2.1 Reagents 1. Mammalian expression vector: pGL4.50 [luc2/CMV/Hygro]

(Promega; Madison, WI, USA) (see Note 1).
2. Hygromycin B (InvivoGen, San Diego, CA, USA).
3. Saracatinib-loaded nanoparticle (Nono-Sar) [10] (see Note 2).
4. Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega; Madison,
WI, USA).
Evaluating In Vivo Anti-Metastatic Effect of Nano-Sar 17
5. Lipofectamine™ 3000 transfection reagent (Invitrogen, Carls-

bad, CA, USA).
6. HN12 cells derived from primary tongue lesions and lymph
node metastases (see Note 3).
7. Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) containing 10%
(v/v) fetal bovine serum (FBS), 100 IU/mL penicillin, and
100 μg/mL streptomycin.
8. D-luciferin potassium salt (GoldBio, St Louis, MO, USA).
9. 96-well black-frame microplate (Nunc).
10. 35-mm culture dish.
2.2 Instrumentation 1. GloMax® 20/20 luminometer (Promega).

2. IVIS-200 in vivo imaging system (Xenogen Corporation, Wal-
tham, MA, USA) (see Note 6).
3. EZ-AF9000 autoflow anesthesia system (Palma, PA, USA).
2.3 Animals Six-week-old NSG mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME,
USA).
2.4 Software 1. Living Image Ver. 4.7.
3 Methods
3.1 Generation of 1. Seed HN12 cells in a 35-mm culture dish with 90% confluency,
HN12-Luc2 Cells (See and incubate cells at 37 C under 5% (v/v) CO2 overnight.
Note 4) 2. Transfect 1 μg of pGL4.50 into HN12 cells using
Lipofectamine 3000.
3. After 24 h following transfection, seed the cells in five 96-well
black-frame microplates using limiting dilution to obtain
monoclones.
4. Incubate the cells with 600 μg/mL of hygromycin B and select
hygromycin-resistant cells over 3 weeks.
5. Subculture single hygromycin-resistant resistant clones for
expansion.
6. Determine the FLuc expression in each clone using Steady-
Glo® Luciferase Reporter Assay system. Get the reading of
relative light unit with a GloMax® 20/20 luminometer.
3.2 Establishing the 1. Harvest HN12-Luc2 cells and prepare cell suspension with
Orthotopic Tongue DMEM medium/Matrigel (v/v, 3:1) mixture in a concentra-
Tumor Model in NSG tion of 4 105 cells.
Mice (See Note 5) 2. Anaesthetize NSG mice with isoflurane using an EZ-AF9000
auto flow anesthesia system, and inject 50 μL of HN12-Luc2
18 Liwei Lang and Yong Teng
Fig. 1 Nano-Sar inhibits lymph node metastasis of orthotopic tongue tumor in NSG mice. (a) The expression of
FLuc in HN12-Luc2 cells. The reading of relative light unit (RLU) is measured in 10,000 cells. (b) Lymph node
metastasis is monitored on Day 20 after indicated drug treatment by examining BLI using an IVIS-200 in vivo
imaging system. Representative BL images and quantitative data are respectively shown in the left and right
panels, **p < 0.01
cell suspension (2 104 cells) into the anterior part of the

mouse tongue.
3.3 Nano-Sar 1. Intravenously (i.v.) inject 100 μL of Nano-Sar (5 mg/kg) or its

Treatment and Lymph control nanoparticles (without saracatinib encapsulation) into
Node Imaging (Fig. 1) the HN12-Luc2-bearing mice (see Note 6), respectively. The
(See Note 5) nanoparticles are given once every 4 days for a total of 20 days.
2. Intraperitoneally (i.p.) inject the BL substrate D-luciferin
(150 mg/kg) into mice at the end of the animal experiment
(see Note 7).
3. Ten minutes after D-luciferin injection, image the biolumines-
cence intensity (BLI) of the lymph nodes using an IVIS-200
in vivo imaging system and quantify BLI using Living image
software (Fig. 1).
4 Notes
1. pGL4.50[luc2/CMV/Hygro] encodes a codon-optimized

FLuc reporter gene luc2 (Photinus pyralis) for mammalian
expression. It contains a synthetic hygromycin B-resistance
gene for HN12 cell selection.
2. Preparation and characterization of Nano-Sar as previously
described [10].
3. HN12 cells are a strain of the OPC-22 oral and pharyngeal
cancer cell line panel.
4. Ensure that all procedures for the use of human cell lines have
to be approved beforehand by an affiliated institutional bio-
safety committee.
Random documents with unrelated
content Scribd suggests to you:
Tämä nuoli näkyi olevan hyökkäyksen merkkinä. Samalla kuin se
suhisi ilmassa, esiintyivät apahien parhaat ratsastajat kentällä. Tulen
valossa näkyivät heidän hirveät, punaisella maalatut kasvonsa.
Heidän pitkät hiuksensa liehuivat tuulessa; nahkahihnat, joilla heidän
pukunsa oli koristettu, kiertyivät heidän nopeasti ratsastaessaan
käärmeen tavoin heidän ympärilleen, ja uhkamielisiä huutoja kuului
heidän joukostaan.
Tämän uhkaavan vaaran nähdessään, don Estevan sijoitti osan

miehistään, ne, joitten pyssyt kantoivat kauvemmaksi ja joitten silmä
oli harjaantuneempi, kukkulalle, josta he tulen valossa voivat nähdä
maalin luodillensa. Sitten syntyi hetkisen aselepo, kun loitommaksi
tunkeutuneet apahit selittivät perässä tuleville vihollisen aseman,
ennenkuin uskalsivat tehdä hyökkäyksen.
Nyt kajahti äkkiä sadoista kurkuista apahien kauhea sotaulvonta;

maa tärisi hevosien kavioissa, kun ne täydessä vauhdissa, luotien,
kivien ja nuolien sataessa, hyökkäsivät meksikolaisia vastaan.
Kolmelta taholta piiritti leirin liehuvatukkaisten soturien säännötön
joukko. Ulvonnan välillä kuuluivat pyssyjen pamaukset, niiden
välähdykset leimahtelivat yössä. Hevosia laukkaili ilman ratsastajaa
arolla, ja toiset ratsastajat koettivat vapautua kaatuneista
ratsuistaan. Pian muuttui taistelu käsikahakaksi mies miestä vastaan;
intiaanit koettivat hyökätä vaunulinnaan, jossa meksikolaiset olivat.
Taistelussa oli etevä sija kolmella miehellä, Orochella, Pedro

Diazilla ja Barajalla. He seisoivat toistensa rinnalla, astuivat toisinaan
taaksepäin, välttääksensä intiaanein pitkiä keihäitä, toisinaan
hyökkäsivät eteenpäin iskuja antaakseen. He kehoittivat toisiansa
huudoilla ja loivat tuon tuostakin silmäyksen päällikköön, joka oli
paikalla, missä vaan tarvittiin.
Niinkuin jo mainittiin oli levinnyt se huhu, että hän tiesi
rikkaimman kultasuonen, mikä maassa oli, ja se enensi suuresti
sellaisten miesten kuin Barajan ja Orochen rohkeutta ja intoa
taistelussa. Taistelun näin raivotessa sattui sotatapparan isku
Orochen päähän; hän olisi varmaan ollut mennyttä miestä, ellei
hänen paksu huopahattunsa olisi iskun voimaa laimentanut; hän
vaipui kuitenkin maahan. Kun hän kokonaan huumaantuneena
taasen koetti nousta, nojasi hän vastustajaansa, jonka iskun voima
myöskin sai horjahtamaan, ja toisella kädellään vaunun aisaan
saavuttaaksensa tasapainon. Diaz tarttui intiaanin käteen, veti hänet,
pitäen kiinni vaunun pyörästä, vastustamattomalla voimalla luokseen
ja tempasi hevosen seljästä alas. Hän ei ollut vielä ehtinyt maahan,
kun meksikolaisen miekka katkaisi hänen kaulansa.
Kun ampujista ei enää ollut hyötyä taistelun raivotessa mies

miestä vastaan, tulivat he taistelijain joukkoon. Tämä auttoi
melkoisesti valkoisia, sillä varsinkin sillä puolen, jossa don Estevan ja
Cuchillo olivat, oli vähän miehiä. Tosin oli urhoollinen päällikkö, jonka
katseet ehtivät kaikkialle, useammankin veroinen; hyvällä pyssyllään,
jota hän taitavasti käytti, pelasti hän usean uhkaavasta kuolemasta,
mutta ei hän kuitenkaan olisi voinut kestää kauvan vihollisten
suurempaa mieslukua vastaan, kun Cuchillokin vain heikosti häntä
auttoi.
Tämä kurja roisto, joka oli pettänyt toverinsa apaheille ja

tahallansa tämän verisen taistelun aikaansaanut, piti enemmän
huolta omasta pelastuksestaan ja turvallisuudestaan kuin vihollisista.
Hänen vieressään seisoi hänen satuloitu hevosensa, joka seurasi
kaikkia hänen liikkeitänsä kuin uskollinen koira isäntäänsä, ja rosvo
näkyi aavistavan, miten taistelu päättyisi, kun hän äkkiä horjahti,
astui muutaman askeleen taaksepäin, ikäänkuin kuolettavasti
haavoitettuna ja kaatui raskaasti maahan.
Don Estevan yksin huomasi sen ja sanoi kylmäverisesti: nyt meillä

on yhtä pelkuria vähemmän. Mutta kaatuneen hevonen riensi
kaatuneen luo ja hirnumisella osoitti sääliänsä. Muutaman hetken
pysyi kaatunut liikkumattomana, sitten nosti hän hiljaa päätänsä ja
loi tarkastavan silmäyksen ympärilleen; pian seisoi äsken kuolleelta
näyttänyt jaloillaan, käsi sydämellä, ikäänkuin tahtoisi hän pidättää
poistuvaa eloa, ja astui horjuen muutaman askeleen ja vaipui sitten
hiljaa maahan, etäälle siitä paikasta, johon ensin oli kaatunut.
Hänen hevosensa seurasi häntä. Mutta Cuchillo kieritti itsensä sille

puolen varustusta, jossa ei intiaaneja ollut, odotti siinä hetken,
konttasi sitten vaunun pyörien väliin ja oli pian leirin ulkopuolella.
Siellä nousi hän ylös yhtä nopeasti ja varmasti kuin ainakin.

Synkän riemun hymy kajasti hänen kasvoiltansa. Nopeasti irroitti hän
kahden vaunun väliset ketjut, siten tehden hevoselleen pääsypaikan.
Hän vihelsi ja hevonen riensi ulos. Pian istui hän satulassa. Hän
painoi kannukset hevosen kylkiin, ja molemmat katosivat nopeasti
pimeään.
Sillä aikaa kaatui monta sotilasta kummaltakin puolen. Puoleksi

palaneet risukasat valaisivat punertavalla valollaan taistelun verisiä
jälkiä, raivostuneitten vihollisten huudot, nuolten suhina ja alituiset
pyssynlaukaukset seurasivat lakkaamatta toisiaan.
Intiaaniratsastajain kamalat kasvot näyttivät tulen valossa vieläkin
kamalammilta; toisinaan olivat ne näkyvissä, toisinaan katosivat yön
pimeyteen.
Yhdellä paikalla olivat intiaanit alituisesti hyökkäillen päässeet
varustukseen. Vaunuvarustuksen tämän puolen puolustajat olivat
joko kuolleet tahi haavoitettuina vetäytyneet takaisin, vihollisia näytti
nousevan maasta yhä lukuisemmin. Se oli ratkaiseva hetki; hirveä
sekasorto vallitsi, kun taistelijat sekaantuivat toisiinsa, ja intiaanien
hiustöyhdöt liehuivat ylinnä. Mutta pian taasen sulkeutui seikkailijain
katkennut rivi ja he ehkäisivät leiriin tunkeutuneiden apahien
peräytymisen.
Oroche, Baraja ja Pedro Diaz, jotka rikkirevityin, verisin vaattein

riensivät apuun, kohtasivat vihollisen aivan edessään, ja päättivät
yhdistynein voimin uskaltaa viimeisen ponnistuksen.
Katkaistun joukon keskellä, jonka keihäät ja tapparat erotuksetta

sattuivat peljästyneisiin hevosiin ja muuleihin, samoin kuin
miehiinkin, herätti erityistä huomiota roteva päällikkö, jota hänen
heimonsa nimitti Pantterikissaksi. Baraja kutsui urhoollisen Diazin
saapumaan. Kun intiaanipäällikkö kuuli tämän nimen, alkoi hän
katsella, ken sen omistaja oli. Hänen silmänsä leimusivat ja hän
kohotti keihäänsä, lävistääksensä Diazin, joka Barajan käskyä
noudattaen saapui. Tällä hetkellä katkaisi Oroche puukollansa
hevosen kintut. Intiaani kaatui hevosensa mukana maahan ja pudotti
keihäänsä. Diaz anasti sen, ja kun apahi nousi toiselle polvelleen ja
tempasi lyhyen miekkansa, tunkeutui hänen pudottamansa aseen
kärki syvälle hänen rintaansa. Hän oli saanut kuolin-iskun, mutta ei
ääntäkään päässyt hänen huuliltaan, hänen silmänsä eivät
kadottaneet ylpeätä, uhkaavaa katsettaan ja hänen kasvoillaan voi
nähdä yhden ainoan toivon.
— Pantterikissalla on sitkeä henki, sanoi hän, ja kädellä, jonka

voimaa lähenevä kuolema ei vielä ollut vähentänyt, tarttui hän
päättävästi keihään varteen, josta Diaz vielä piti kiinni. Viimeinen
taistelu alkoi nyt. Joka ponnistuksella, minkä apahi teki vetääksensä
vihollisensa luoksensa ja kuristaaksensa hänet, tunkeutui keihään
kärki yhä syvemmälle. Pian raukenivat hänen voimansa; keihäs
tempautui äkkiä hänen rinnastaan ja jäi Diazin käteen, intiaani vaipui
maahan, loi vielä uhkaavan silmäyksen vastustajaansa, eikä liikkunut
enää.
Kun heidän päällikkönsä näin oli kaatunut Diazin voittamana,

saavutti sama kohtalo pian toisetkin apahit, samalla kun heidän
toverinsa turhaan kokivat tunkeutua vaunujen lävitse. Yksi ainoa
intiaani istui vielä leirissä hevosen seljässä. Hetkisen katseli hän
ympärilleen hehkuvin silmin kuin tiikeri ja kajahutti sitten
sotahuutonsa. Mutta sitä tuskin erotti tuon raivokkaan kiljunnan
joukosta, joka kuului leirin ulkopuolelta. Silloin käytti apahi
hyväksensä hetkisen hämminkiä, jolloin varustuksen aukko oli
taistelijoista tyhjä, loikautti hevosensa aukosta ja oli taasen
miestensä luona.
Pedro Diaz yksin oli huomannut tämän rohkean ratsastajan eikä

hän leppymättömässä intiaanivihassaan voinut sallia niin hyvän
saaliin menettämistä. Viipymättä hyppäsi hän hevosensa selkään,
jonka oli saanut don Augustin Penalta ja lähti ajamaan pakenevaa
takaa. Hänen kädessään riippui kannikkeessa pitkä ja leveä
toledolais-miekka, jossa oli ylpeät espanjalaiset sanat: Älä paljasta
syyttä, älä pistä tuppeen kunniatta!
Terä oli verestä punaisena. Hän piti toista kättään silmiensä

edessä, käyttäen sitä varjostimena katsellessaan pimeyteen. Äkkiä
huomasi hän intiaaniratsastajan sen valovyön ulkopuolella, jonka
melkein sammuneet risukasat loivat.
Sitä miestä Diaz etsikin. Intiaani hyppäytti raivoissaan hevostaan
edes takaisin ja päästi uhkaavia huutoja. Diaz muisti ne sanat, jotka
don Augustin oli lausunut hevosen antaessaan: Sen intiaanin, jota
tällä hevosella ajatte takaa, täytyy ratsastaa tuulen siivillä, jos hän
aikoo päästä pakoon, olkoonpa suurikin se ennätys, jonka hän on
päässyt teidän edellenne. Diaz päätti nyt koetella, minkä verran
perää noissa sanoissa oli.
Kannusten kiihoittama jalo eläin hyppäsi intiaanien kaatamain

varustusten yli, ja hetkisen kuluttua olivat molemmat ratsastajat
toistensa vieressä. Intiaani heilutteli tapparaansa, valkoinen ahdisti
häntä verisellä miekallaan. Muutaman silmänräpäyksen saattoi
nähdä merkillisen kilpailun, jossa molemmat ratsastajat koskettivat
voittaa toisensa rohkeudessa ja taitavuudessa. Molemmat varmistivat
väitettä, että meksikolaiset ja intiaanit ovat maailman parhaita
ratsastajia; apahin tappara iski meksikolaisen miekan palasiksi, niin
että kappaleet sinkosivat loitolle. Sitten tarttuivat molemmat
ratsastajat toisiinsa, koettaen nostaa toisiansa satulasta; molemmat
tuntuivat olevan kiinni kasvaneita hevoseen.
Vihdoinkin onnistui Diazin vapautua vihollisestaan. Hän antoi

hevosensa astua takaperin ja päästyänsä muutaman askeleen
intiaanista, kannusti hän hevostansa niin tuntuvasti, että se hyppäsi
pystyyn ja hetkisen näytti olevan intiaanin päällä. Samassa nosti
meksikolainen, päästämättä jalkaansa jalustimesta, oikean jalkansa
ja musersi yhdellä ainoalla, suuren, raskaan rautaisen jalustimen
potkauksella vihollisensa pääkallon, niin että intiaanin kuljetti hänen
hevosensa pois kuolleena, mutta vielä satulassa.
Tämä viimeinen sankarityö päätti kauvan kestäneen taistelun.

Muutamia nuolia suhisi Diazin ympärillä osumatta häneen, ja hänen
toverinsa ottivat hänet vastaan riemuhuudoilla, yhtä kuuluvilla kuin
apahin kiljunta.
Diaz otti toisen miekan katkenneen sijaan. Ikäänkuin

molemminpuolisesta suostumuksesta seurasi nyt hetken lepo, joka
oli tervetullut. Ehti kysyä jotain ystävältään ja tuntea taasen
toisensa.
— Paimen-raukka! huudahti Baraja. Jumala hänen sielunsa

armoonsa ottakoon! Hänen kuolemansa on suuri vahinko meille.
Minä kaipaan hänen juttujansa…
— Vielä enempi tulee meidän kaivata kelpo Cuchilloa, opastamme;

hänkin on kuollut, keskeytti Oroche.
— Teidän ajatuksenne ovat vielä hieman sekaisin sen lyönnin

johdosta, jonka saitte päähänne, sanoi Diaz, koetellen uuden
miekkansa notkeutta. Ellei tuota kelpo Cuchilloa, niinkuin te häntä
nimitätte, olisi ollut, ei meidän tänä iltana olisi tarvinnut menettää
pariakymmentä toveriamme, sillä ainakin niin monta täytyy meidän
huomenna haudata. Cuchillo teki väärin siinä, että kuoli liian
myöhään. Hänen tähtensä en tahdo rukoilla, Jumalaa olemaan
hänen sielulleen armollinen.
Sillä aikaa neuvottelivat intiaanit keskenään. Diazin viimeinen

sankarityö, kuolema, joka oli useampia heistä kohdannut valkoisten
leirissä, ja meksikolaisten luodit, jotka olivat useita tehneet
taisteluun kykenemättömiksi, olivat harventaneet heidän rivejänsä.
Intiaanit eivät milloinkaan koeta itsepäisesti pysyä aikeessaan, jonka
huomaavat mahdottomaksi. Tätä omituista kansaa kuvaava on
erikoinen viisauden ja kuoleman halveksimisen sekoitus. Viisaus
kehoitti heitä palaamaan, ja sen he panivat toimeen yhtä nopeasti
kuin äskeisen rynnäkön. Mutta retkeilijäin täytyi noudattaa
toisenlaista menettelyä. Heidän täytyi koettaa käyttää hyödyksensä
voittoa, josta huhu oli tunkeutuva syvälle erämaihin ja joka oli
tekevä heidän matkansa turvallisemmaksi. Sen vuoksi otettiinkin don
Estevanin käsky lähteä ajamaan takaa pakenevia, ilolla vastaan.
Parikymmentä ratsastajaa hyppäsi satulaan, eikä Pedro Diaz ollut
viimeisiä. Miekka toisessa kädessään, ohjakset ja lasso toisessa,
katosi hän pian tovereinensa meksikolaisten leirin läheisyydestä.
Uuden hyökkäyksen varalta ryhtyivät leirissä olevat, vaikka he

olivat enemmän tai vähemmän haavoitettuja, huolellisesti
korjaamaan varustusta niiltä paikoilta, joista se oli rikottu. Sen
tehtyään laskeusi jokainen, väsyneenä taistelun ponnistuksista,
nälän ja janon vaivaamana, verestä kostealle kentälle hetkeksi
lepäämään; ei poistettu edes leirissä olevia ruumiita. Yön
juhlallisessa hiljaisuudessa valaisi kuu ja nuotioitten vähitellen
sammuva tuli sekä hetkellistä lepoa nauttivia, että niitä, jotka eivät
enää milloinkaan heräisi ja jotka lepäsivät hajallaan toisten joukossa.
Noin tunnin kuluttua nousi eräs mies vitkaan ylös. Kekäle kädessä
tarkasteli hän jokaista ruumista.
Toisinaan valaisi palava kekäle intiaanisoturin kasvoja, toisinaan

hänen rinnallaan lepäävän valkoisen; toisinaan vei hänet hiljainen
valitus tai kuolon korina jonkun haavoitetun luo, mutta joka paikassa
teki tuo yöllinen tarkastelija tyytymättömyyden liikkeen.
Tämän kuolon hiljaisuuden vallitessa herätti heikko ääni etsijän

huomion. Ympäröivässä hämärässä koki hän saada selkoa, mistä
ääni tuli. Vihdoinkin erään makaavan heikko käden liikunta ohjasi
hänet. Hän läheni kuolevaa ja tunsi hänet.
— Tekö se olettekin, Benito raukka, sanoi mies, ja hänen kasvonsa
osoittivat syvää sääliä.
— Niin, sanoi vanha paimen, vanha Benito kuolee erämaassa,

jossa hän melkein aina on elänyt… en sentään tiedä, ken olette,
silmäni ovat sumuiset. Elääkö Baraja vielä?
— Elää, vastasi mies, hän on intiaaneja takaa ajamassa, ja palaa

pian sanoaksensa teille viimeiset jäähyväiset.
— Se on epäiltävää, sanoi Benito. Olen perinnöksi jättänyt

Barajalle vanhan toverin, vanhan ystävän; ken olettekin, lausukaa
hänelle viimeinen tervehdykseni, rakastakoon hän häntä, niinkuin…
— Veljenne varmaankin?
— Vielä enemmän, hevoseni.
— Kyllä sanon hänelle viimeiset terveisenne, luottakaa siihen.
— Kiitoksia, vastasi ukko. Elämäni on pian lopussa. Intiaanit eivät

minua ottaneet hengiltä nuoruudessani, kun olin heidän vankinansa,
vaan he ovat tappaneet minut vanhoilla päivilläni, ottamatta minua
vangiksi; se…
Tässä vaikeni ukko — viimeisen kerran.
— Nyt on loppu, lisäsi hän niin heikolla äänellä, että kuuntelija

tuskin kuuli.
— Hän oli rehellinen ja uskollinen palvelija, sanoi mies itsekseen.

Rauha hänelle.
Sitten jatkoi hän kuolleitten tarkastamista. Vihdoin kääntyi hän
huolestuneena ja väsyneenä turhasta etsimisestä entiselle
paikalleen. Don Estevan siinä etsi Cuchilloa kuolleitten joukosta,
mutta ei löytänyt häntä. Ja taasen näytti kuoleman kylmä ja
yksitoikkoinen hiljaisuus vallitsevan leirissä, ikäänkuin viimeinenkin
elävä olisi kuolemaan laskeutunut.
Nuotiot valaisivat heikosti, kun ihmisäänet ja hevosten kavioiden

kopina ilmaisivat apahia takaa-ajaneiden palaavan. Sama mies, joka
äskenkin oli ylhäällä, nousi taasen, meni heitä vastaan ja kysyi yhtä
ja toista. Toisten ratsastajien astuessa alas ratsuilta meni Pedro Diaz
hänen luoksensa.
— Sennor Estevan, sanoi hän, takaa-ajo ei ole onnistunut.

Ainoastaan pari pakenevaa olemme keihäillämme lävistäneet, ja
olemmepa lisäksi menettäneet yhden miehistämme. Minulla on
kuitenkin vanki; kuulustelemmeko häntä?
Näin sanoen irroitti Diaz lassonsa satulasta ja osoitti tummaa

esinettä, joka oli juoksusolmulla kiinni. Se oli intiaani, jota hän
armottomasti oli vetänyt perässään yli kivien ja kantojen, ja joka
melkein joka askeleella oli menettänyt osan ruumiistansa niin ettei
hän enää näyttänyt ihmiseltä.
— Hän oli hengissä, kun hänet löysin! huudahti seikkailija, mutta

nuo intiaanikoirat ovat sellaisia että he mieluummin kuolevat kuin
puhuvat.
Naurahtamatta tälle julmalle leikille, viittasi don Estevan Pedro

Diazin seuraamaan itseänsä. Kun kaikki olivat laskeutuneet levolle ja
hiljaisuus taasen vallitsi, sanoi don Estevan:
— Diaz, me olemme nyt matkamme perillä; huomenna sijoitamme
leirimme kultalaakson läheisyyteen; mutta jotta vaivamme tulisivat
palkituiksi täytyy meidän estää petoksen niitä tyhjäksi tekemästä. Te
olette kauvan, mutta ette kyllin kauvan, tuntenut Cuchillon. Jo
nuoruudesta alkaen on hän pettänyt ne, joita kohtaan hän on
enemmän ystävyyttä osoittanut. En tiedä, mikä pahe hänessä on
enimmän vallalla, mutta hänen kasvonsa ovat huono kuvastin hänen
mustasta sielustaan. Hän möi minulle kultalaaksoa koskevan
salaisuuden, ja murhaamalla toverinsa pääsi hän yksin tämän
salaisuuden omistajaksi. Olen aina pitänyt Cuchilloa silmällä; toissa
iltana herätti minussa levottomuutta hänen katoamisensa, mutta se
voipi olla näissä erämaissa helposti sattuva tapaus; tuo hyökkäys,
joka oli viedä henkemme, on kuitenkin epäluulojani kartuttanut;
apahit ovat olleet hänen kätyrejänsä.
— Minustakin, vastasi Diaz, tuntuu hänen epäröimisensä

epäilyttävältä, mutta löytyy helppo keino: pidetään sotaneuvottelu,
näytetään Cuchillon petos toteen ja ammutaan hänet.
— Jo taistelun alussa määräsin hänelle paikan läheisyydessäni,

voidakseni pitää silmällä häntä; hän ei tiennyt, mitä tehdä, kunnes
näin hänen kaatuvan, nähtävästi kuolettavasti haavoitettuna; nyt
olen tarkastellut kaatuneet, löytämättä merkkiäkään Cuchillosta.
Välttämätöntä on siis, että viipymättä lähdemme ajamaan häntä
takaa, eikä häntä tarvitse kauvan etsiäkään. Cuchillo ei voi olla
muualla kuin matkalla kultalaaksoon; sieltä meidän tulee etsiä häntä.
Kehoittakaa sotilaitamme olemaan varuillansa jo odottamaan takaisin
tuloamme, ottakaa Oroche ja Baraja mukaanne, ja sitten kaikin nelin
ratsastamme kultalaaksoon.
— Varmaan on Cuchillo siellä, vastasi Diaz, ja huolimatta siitä, että
hän on päässyt edelle, löydämme hänet joko mennessämme tai
palatessamme.
— Kultalaaksossa hänet kohtaamme, sanoi don Estevan; laakson

nähtyänne voitte päättää, onko se sellainen paikka, jonka Cuchillon
kaltainen mies jättää heti sinne saavuttuansa.
Diaz meni täyttämään päällikön käskyjä. Don Estevan pystytti

taasen telttansa, jotta hänen poissa ollessaankin tähtilippu liehuisi
leirissä; sitten heittäysi hän vuoteellensa ja nukkui kuin sotilas, joka
ponnistuksista uupuneena levähtää taistelukentällä. Hetken kuluttua
saapui Diaz.
Don Estevan nousi heti, sillä hän oli nukkunut vaatteissaan.

Satuloittu hevonen odotti häntä. Oroche ja Baraja olivat jo satulassa.
— Diaz, sanoi don Estevan puoliääneen ennen lähtöään, kysykää,

onko lähettämäni etsijä palannut.
Diaz kysyi vartioilta, mutta sai kieltävän vastauksen.
— Varmaan on Gayferos — se oli miehen nimi — murhattu, sanoi

Diaz. Don Estevan astui satulaan, ja kaikki neljä lähtivät nelistämään
kultalaaksoa kohti. Ainoastaan vartiat valvoivat leirissä.
11.
UIVA SAARI.
Samaan aikaan kokoontuivat intiaanit nuotion ääreen
neuvottelemaan, miten uudelleen hyökkäisivät kullanetsijäin leiriin;
mutta tällä välin palatkaamme me noiden kolmen miehen seuraan,
jotka pitkäksi ajaksi olemme syrjään jättäneet.
Oli noin neljän aika iltapäivällä. Erämaassa oli hiljaista, usva alkoi
hitaasti nousta joesta, jossa se saari oli, mihin Rosenholz, Fabian ja
José olivat asettuneet.
Suuria haapoja ja salavia kasvoi Rio Gilan rannoilla pyssyn

kantaman päässä mainitulta saarelta. Puut olivat niin lähellä rantaa,
että niiden juuret ulottuivat kauvaksi veteen. Puiden välissä oli
reheviä pajupensaita ja köynnöskasvia. Mutta melkein saarta
vastapäätä oli aukea paikka, jossa ei mitään kasvullisuutta ollut.
Tähän olivat villien hevosten ja puhvelien laumat raivanneet

tiensä, kun tulivat joelle juomaan. Saaresta voi siis tämän avonaisen
paikan yli nähdä kauvaksi arolle.
Tuon pikku saaren olivat alkujaan muodostaneet puunrungot,

joiden juuret olivat tarttuneet pohjaan. Muita puita oli tarttunut
tähän esteeseen; muutamissa oli vielä lehdet ja oksatkin, toiset
olivat aikoja sitten kuivuneet, juuret olivat kietoutuneet toisiinsa, ja
näin oli lautta muodostunut. Se oli tapahtunut jo aikoja sitten, sillä
nousuveden irroittamaa ruohoa oli tarttunut oksien väliin ja siten
täyttänyt aukot. Tuulen tuoma tomu oli vielä muodostanut ikäänkuin
maankamaraa tälle uivalle saarelle.
Saaren rannoilla kasvoi vesikasvia. Meheviä pensaita, kahilaa ja

vihertävää salavaruohoa oli kasvanut runkojen väliin ja muutamia
suuria salaviakin kohosi sen syvimmällä paikalla.
Tämä omituinen lautta oli noin kuuden jalan levyinen ja rotevakin
mies voi siinä pensaiden taakse piiloutua.
Aurinko vaipui vähitellen taivaan rannalle ja pensaitten varjot

pitenivät. Täten syntynyt miellyttävä vilpoisuus oli houkutellut
Fabianin laskeutumaan levolle. Rosenholz näytti vartioivan tätä
lyhyttä unta, jota nuorukainen nautti marssin vaivojen perästä, jonka
kestäessä he olivat olleet alituisesti vaarassa. José taasen koki
vilvoitella itseänsä siten, että kasteli jalkojansa vedessä.
— Katso, sanoi vanha metsästäjä hetken kuluttua jälkimäiselle,

tuolla joen toisella rannalla nousee tomu-pilvi ilmaan; siinä on
kesyttämätön hevoslauma, joka tahtoo tulla juomaan, ennenkun
menee yöksi kaukaisille laidunmailleen. Tuossa ne tulevat koko
ylpeässä komeudessaan, jonka Jumala on suonut kesyttömille
hevosille, niiden silmät hehkuvat, sieramet ovat levällään, harja
liehuu tuulessa. Mielinpä herättää Fabianin, että hän saisi nähdä ja
ihailla niitä.
— Anna hänen maata, Rosenholz, sanoi José.
— Mutta tämä komea näytelmä, joka häneltä jää näkemättä!

Kuinka iloisina nuo jalot eläimet juoksentelevat, vapaudestaan
hurmautuneina.
— Siihen asti, kuin intiaanit ajavat niitä takaa; silloin

juoksentelevat ne peloissaan, sanoi José.
— Näetkö, nyt ovat ne juosseet tiehensä yhtä nopeasti kuin

myrskyn ajama pilvi. Nyt muuttuu näky; näetkö tuota hirveä tuolla,
jonka kiiluvat silmät ja tumma pää tuon tuostakin näkyvät puiden
välistä. Se vainuu jotain, se kuuntelee. Tuolla se tulee juomaan. Se
on kuullut jotain ääntä, se kohottaa päänsä; noita vesipisaroita, jotka
tippuvat sen suusta, voisi luulla valuvaksi kullaksi, kun aurinko kultaa
ne tuollaisiksi. Mutta nyt ei poika saa enää maata.
— Anna hänen maata, sanon.
Kanadalaisen pää vaipui miettivänä rinnalle ja hän antautui

kaihomielisten unelmien valtaan, luoden salaisen silmäyksen
nukkuvaan kasvattipoikaansa. José veti puhvelinnahkaiset
saappaansa taasen jalkaansa.
— Kas niin, mitä sanoin. Etkö kuule tuota ilkeää ulvontaa? Hirvi
rukka!
— Enkö nyt herätä Fabiania? kysyi kanadalainen.
— Herätä! vastasi espanjalainen.
Ja vanha metsästäjä kosketti nuorukaiseen, lausuttuaan ensin

tämän nimen, ettei hän äkillisesti herätessään peljästyisi.
Sarvet pitkin selkää, kaula paisuneena ja pää taaksepäin

voidakseen avonaisilla sieramillaan saada tarpeeksi ilmaa suuriin
keuhkoihinsa pakeni hirvi nopeasti pitkin aavikkoa. Hänen jäljessään
näkyi joukko nälkäisiä susia, toiset valkoisia, mutta useimmat mustia.
Nämä pedot ajoivat tavattomalla nopeudella hirveä takaa.
Tämä oli pitkän matkan edellä, mutta hiekkakukkuloilla, joita oli

aavikolla, saattoi matkustajan silmä etäällä taivaan rannalla nähdä
vartioiksi asetettuja susia, jotka tarkoin pitivät silmällä toveriensa
ponnistuksia ajaa hirvi heidän luoksensa. Mutta tuo jalo eläin ei
näyttänyt huomaavan tai huolivan niiden siellä olosta, sillä se pakeni
yhä sinnepäin.
Kun eläin oli ehtinyt jonkun matkan päähän näistä vartioista,
pysähtyi se hetkeksi hengittämään.
Hirvi oli suljettuna yhä ahtaampaan piiriin. Äkkiä kääntyi se takaa-

ajavia susia kohti, ja koetti viimeisen kerran hyökätä näitten läpi.
Mutta sen ei onnistunut hypätä tuon ulvovan lauman yli, se putosi
keskelle joukkoa. Muutamat takaa-ajajista musertuivat sen jalkojen
alle, toisia lennätti se kaarena ilmaan. Sitten riensi eläinraukka
raahaten erästä sutta joka oli iskeynyt kiinni sen toiseen reiteen,
verisenä, kieli suusta riippuvana joen rannalle, vastapäätä sitä
paikkaa, jossa nuo kolme metsästäjää katselivat tuota harvinaista
ajoa.
— Tämä on kaunista, tämä on ihanaa! huudahti Fabian käsiään

taputtaen ja metsästysinnon kuumeessa, joka kaikissa ihmisissä
saattaa inhimilliset tunteet vaikenemaan.
— Niin, eikö tämä ole ihanaa, sanoi vanha kanadalainen

onnellisena metsästysinnossaan ja nähdessään Fabianin niin iloisena.
Odota, lapseni, näemme vielä ihanampiakin näytelmiä. Tässä näet
vain kehnoimman osan Amerikan erämaita, mutta jahka pääset
Josén ja minun kanssani suurien jokien ja suurien järvien rannoille
pohjoiseen…
— Eläin on vapauttanut itsensä vihollisistaan, keskeytti hänet

Fabian, se juoksee suoraan jokeen.
Vesi loiskahti korkealle hirven hypätessä jokeen, sitten nähtiin sen

pään ja sarvien sukeltavan esiin vaahdosta ja samoin takaa-ajajien,
nälästä ja raivosta ulvovien susien, verisine silmineen; muutamat
pelkurimmat juoksivat edes takaisin rannalla ja päästivät valittavan
ulvonnan.
Hirvi oli nyt aivan lähellä saarta, jossa sen kuoleman-taistelun
näkijät olivat, kun rannalla olevat sudet lakkasivat ulvomasta ja
pakenivat äkkiä.
— Mitä se on? huudahti José, mistä tuo äkillinen pelko, joka ne

valtasi?
José oli tuskin lausunut nämä sanat, ennenkun näkyi toinen

näytelmä, joka vastasi hänen kysymykseensä.
— Kumartukaa alas, kumartukaa alas, Jumalan tähden! Piiloutukaa

ruohostoon! huudahti hän itse ensimäisenä tehden sen, — intiaanit
ovat myöskin metsästämässä.
Ja nyt näkyikin toisia peljättävämpiä metsästäjiä tuolla avaralla

metsästys-alalla, joka erämaassa on jokaiselle tulijalle avoinna.
Noin kymmenkunta noita kesyttämättömiä hevosia, joiden

kanadalainen ja José äsken olivat nähneet tulevan joelle juomaan,
nelisti peljästyneenä poikki aavikon. Muutamat intiaaniratsastajat,
jotka ratsastivat satuloimattomilla hevosilla, jotta ne helpommin ja
nopeammin juoksisivat, ajoivat peljästyneitä hevosia takaa.
Ratsastajat istuivat kyyryissään hevosiensa seljässä, niin että polvet
melkein ulottuivat leukaan, joten hevoset voivat liikkua nopeammin.
Aluksi näkyi vain kolme intiaania, mutta pian ilmestyi noin
parikymmentä. Muutamat olivat varustetut keihäillä, toiset heiluttivat
ilmassa lassojaan, ja kaikki päästivät tuon ulvonnan, jolla he
ilmaisevat iloaan ja suruaan.
José loi kysyvän silmäyksen kanadalaiseen, ikäänkuin olisi

tahtonut häneltä kysyä, oliko hän ottanut lukuun tämän ikävän
vaihdoksen tehdäksensä heidän seikkailija-elämänsä rakkaaksi ja
miellyttäväksi Fabianille. Ensi kerran tällaisten olojen vallitessa peitti
kanadalaisen kasvoja kalman vaaleus. Synkkä, mutta puhuva silmäys
oli hänen vastauksensa Josén kysymykseen.
— Tämä merkitsee, ajatteli José, että liian suuri rakkaus

ihmisolennon sydämessä, olkoon hän muuten kuinka urhoollinen ja
peloton tahansa, saattaa hänet vapisemaan rakastamansa henkilön
tähden, ja se siis todistaa, etteivät meidän kaltaisemme seikkailijat
saa kiintyä mihinkään tässä maailmassa. Kas vaan Rosenholzia,
hänen rohkeutensa vaipuu, kuin olisi hän nainen.
Melkein varmaa sentään oli, ettei edes intiaanin tottunut silmä

voinut heidän pakopaikkaansa keksiä. Kun ensimäinen peljästys oli
ohi, seurasivat metsästäjät kylmäverisemmin heidän liikkeitään.
Vielä jonkun hetken ajoivat ratsastajat pakenevia hevosia.

Epälukuiset esteet, joita on näillä näennäisesti tasaisilla aavikoilla,
kuopat, kukkulat, teräväpiikkiset kaktuskasvit, eivät heitä
pidättäneet. Hiljentämättä nopeaa ratsastustaan, näitä esteitä
välttämättä, ajoivat intiaanit rohkeudella, jota ei mikään voinut
ehkäistä. Fabian, joka itse oli rohkea ratsastaja, katseli ihastuksella
noiden uskalikkojen ratsastustaitoa, mutta varovaisuus, jota
metsästäjien oli käyttäminen piilottaaksensa itsensä intiaaneilta,
ehkäisi häneltä suurimmaksi osaksi tuon suurenmoisen, mutta
kamalan metsästysnäyn, jonka esineeksi he itsekin helposti voivat
joutua.
Ääretön aavikko, joka vielä äsken oli autio, oli äkkiä muuttunut
mellastuksen ja hämmingin näyttämöksi. Tuon ahdinkoon pakotetun
hirven oli uudelleen täytynyt palata rannalle, josta se tuulen
nopeudella pakeni, susien ulvoen ajaessa sitä takaa. Kesyttömät
hevoset juoksivat intiaanien edessä, joiden huuto ei ollut vähempi
kuin petojenkaan. Kaiku toisti susien ja apahien kamalaa kiljuntaa.
Nähdessään Fabianin, joka hehkuvin silmin seurasi kaikkia näitä

meluavia liikkeitä, olematta levoton vaarasta, jonka uhkaama hän
ensi kerran oli, koetti Rosenholz turhaan saavuttaa tuon
itseluottamuksen, joka hänet oli aina pelastanut.
— Tällaista, alotti hän, eivät kaupunkien asukkaat milloinkaan saa

nähdä, tällaista näkee vain erämaassa.
Mutta vastoin hänen tahtoansakin vapisi hänen äänensä ja hän

vaikeni, tuntien, että antaisi vuoden elämästään säästääksensä
kasvatiltaan tämän. Hänen tuskansa lisääntyi vielä enemmän.
Näky kävi, suuresti muuttumatta, vieläkin juhlallisemmaksi; uusi

näyttelijä, jonka osa tuli olemaan yhtä kamala kuin lyhytkin, ilmestyi.
Se oli ratsastaja, jonka ystävykset puvusta tunsivat valkoiseksi.
Tuo onneton, jonka intiaanit huomasivat, joutui nyt heidän takaa-

ajonsa yksinomaiseksi esineeksi. Kesyttömät hevoset, sudet ja hirvi
olivat kadonneet sumuiseen etäisyyteen. Ainoastaan
intiaaniratsastajat olivat jäljellä ja muodostivat suuren puoliympyrän,
jonka keskellä valkoinen ratsastaja oli. Ollen yksin niin monen
vihollisen keskellä loi hän epätoivon ja tuskan katseita kaikille
suunnille. Mutta intiaaneja oli kaikkialla, paitsi joen puolella. Tälle
suunnalle täytyi hänen paeta, ja äkkiä lähti hän ratsastamaan saarta
kohti.
Mutta hetkinen, jonka hän oli epäröinyt minne pakenisi, oli riittänyt
päästämään intiaanit lähemmäksi.
— Tuo onneton on hukassa, yrittäköön mitä tahansa, huudahti
Rosenholz; hän ei ehdi enää joen ylitse.
— Rosenholz, José, huudahti Fabian, sallimmeko kristityn tulla

murhatuksi silmäimme edessä, jos voisimme pelastaa hänet?
José loi kysyvän silmäyksen Rosenholziin.
— Minä olen vastuunalainen sinun hengestäsi, Fabian, niin totta

kuin Jumala on, sanoi kanadalainen juhlallisesti, mutta en olisi
elämästämme varma, ellemme pysyisi piilossa, kun meitä on vain
kolme kahtakymmentä vastaan. Kolmen miehen henki ja etupäässä
sinun, Fabian, on kalliimpi kuin yhden, ja sentähden täytyy meidän
jättää tuo raukka kohtalonsa huomaan.
— Mutta olemmehan varustuksessa, jatkoi jalomielinen Fabian.
— Olemmeko varustuksessa? kysyi Rosenholz, — nimitätkö tätä

heikkoa suojaa, näitä pajupensaita ja kaisloja varustukseksi?
Luuletko noitten lehtien kestävän luotia? Ei suinkaan. Vaikka
intiaaneja on nyt ainoastaan kaksikymmentä, ei tarvita muuta kuin
että laukaus pyssystämme kaataa yhden noista punaisista
perkeleistä, ja niin kokoontuu heitä heti satamäärä tänne. Jumala
antakoon anteeksi kovasydämisyyteni, mutta se on välttämätön.
Fabian ei enää pyytänyt, kun Rosenholz tämän seikan mainitsi. Se

olikin aivan pätevä, eikä Fabian tiennyt, että intiaanien päävoima oli
hyökännyt don Estevanin leiriin.
Valkoinen ratsastaja pakeni kuin ihminen, jolla ei ole muuta

pelastuksen toivoa kuin hevosensa nopeus. Voitiin jo erottaa hänen
kasvonpiirteensä, jotka olivat pelon valtaamat. Hän oli ainoastaan
kahdenkymmenen askeleen päässä joesta, kun erään intiaanin lasso
saavutti hänet; onneton tempautui satulasta ja putosi raskaasti
maahan.
12.
MUSTALINTU.
Syntyi syvä hiljaisuus tuon riemuhuudon jälkeen, jolla intiaanit

tervehtivät onnettoman ratsastajan putoamista. Saarella olevat
miehet vaihtoivat hämmästyksen ja säälin silmäyksiä.
— Jumalan kiitos! sanoi Fabian, he eivät ole tappaneet häntä.
Ja vanki nousi todellakin ylös, vaikka oli pudotessaan saanut

kolahduksia, ja eräs apahi irroitti häntä ympäröivän lasson.
Rosenholz ja José pudistivat päätään.
— Sitä pahempi hänelle, sillä nyt olisivat hänen kärsimyksensä

lopussa, sanoi José; — tuo intiaanien äänettömyys on merkkinä siitä,
että he miettivät, millä tavoin tappaisivat hänet. He pitävät paljon
ansiokkaampana yhden valkoisen miehen kuin kokonaisen
hevoslauman vangiksi ottamista.
Hevosiltaan astumatta ympäröivät intiaanit vangin, joka

hämmästyneenä katseli ympärilleen, mutta näki vain liikkumattomia,
vaskenkarvaisia kasvoja. Sitten alkoivat he neuvotella keskenään.
Muuan intiaani, joka näytti joukon johtajalta ja joka tummemman
ihonsa ja päähineessään olevien mustien höyhenien kautta erosi
toisista, astui alas hevosen selästä, ikäänkuin hän ei olisi välittänyt
neuvottelusta, vaan hänellä olisi ollut tärkeämpiä tehtäviä. Hän antoi
ohjakset eräälle apahille, joka ne kunnioittavasti otti. Sitten tuli
päällikkö suoraan saarta kohti. Rannalle päästyään näkyi hän etsivän
jälkiä maasta.
Kanadalaisen sydän sykki kovasti, sillä intiaani osoitti selvästi, että

hän epäili jotain.
— Ehkäpähän tuo koira, sanoi Rosenholz hiljaa Josélle, vainuaa

ihmislihaa?
— Kenties, vastasi José.
Mutta maan olivat leveältä tallanneet rantaan juomaan tulleet

hevoset, eikä intiaani voinut siinä ihmisjälkiä keksiä. Sitten lähti hän
joen rantaa ylöspäin, jatkaen tarkastustaan.
— Tuo kirottu mies epäilee, sanoi Rosenholz, ja hän on löytävä

jäljet puolen penikulman päässä, jossa astuimme jokeen,
kahlataksemme tälle saarelle. Sanoinhan sinulle, José, jatkoi
kanadalainen hieman katkerasti, että meidän olisi pitänyt mennä
veteen kaksi penikulmaa ylempänä, mutta et sinä eikä Fabian
myöntynyt, ja minä olin tyhmä suostuessani siihen.
Tämän sanottuaan löi kelpo kanadalainen rintaansa iskun, joka

olisi katkaissut tavallisen miehen kylkiluut.
Neuvottelu vangin kohtalosta oli nyt kai päättynyt, sillä äkkiä

kuultiin äänekkäitä riemuhuutoja, arvattavasti jonkun intiaanin
esityksen johdosta. Mutta ensin oli odottaminen päällikön tuloa ja
suostumusta. Eikä tämä ollut kukaan muu kuin sama sotilas, jonka jo
olemme tulleet tuntemaan Mustalinnun nimellä.
Tämä jatkoi tarkastelujaan rannalla ja käveli jokea ylöspäin.

Ehdittyänsä sille paikalle, jossa Rosenholz tovereinensa oli astunut
jokeen saarelle kahlataksensa, ei hän enää epäillyt vakoojan
ilmoitusta ja päätti käyttää sitä hyväksensä.
Heti, kun Mustalintu oli varmistunut metsästäjäin saarella olosta,

palasi hän hitain askelin joukkonsa luo. Ensin kuunteli hän, mihin
päätökseen intiaanit olivat tulleet, vastasi muutamalla sanalla ja
viittasi kädellään, että heidän tuli odottaa; sitten lähti hän hitain
askelin joen rannalle, annettuansa käskyn viidelle ratsastajalle, jotka
heti poistuivat täyttämään saamaansa käskyä.
Vesikasvit rehottivat vihannuudessaan, tuulen henki sai saaren

rannalla olevien salavien heikot oksat liikkumaan, mutta saari näytti
yhtä autiolta kuin silloinkin, jolloin se oli avoin ainoastaan taivaan
linnuille ja juomaan tuleville puhveleille ja hevosille. Intiaania ei tämä
näennäinen hiljaisuus voinut pettää.
Intiaani teki kädestään puhetorven ja huusi puoleksi espanjan,

puoleksi intiaanien kielellä:
— Pohjoisen valkoiset soturit saavat näyttäytyä; Mustalintu on

heidän ystävänsä, ja samoin hänen johtamansa soturit.
Nämä sanat kuullessaan tarttui Rosenholz Josén käsivarteen. Hän

ja José olivat ymmärtäneet intiaanin sanat.
— Mitä vastaamme tuolle koiralle? kysyi hän.

— Emme mitään, vastasi José lyhyesti. Kaislikossa suhiseva tuuli
olikin ainoa vastaus, minkä intiaani sai.
Mustalintu jatkoi kuitenkin:
— Kotka voi apahien silmiltä salata jälkensä ilmassa,

vesiputouksesta nouseva lohi ei jätä uomaa jälkeensä, mutta
erämaan kautta kulkeva valkoinen mies ei ole kotka, eikä lohi.
— Eikä aasikaan, mutisi José, aasi nyt voisi ilmaista itsensä

äänellään.
Intiaani kuunteli taasen, mutta José lausui sanansa niin hiljaa,

etteivät ne kuuluneet.
— Pohjoisen valkoisia soturia, alkoi Mustalintu taasen tyynesti, on

ainoastaan kolme. Heitä on vain kolme kahtakymmentä vastaan, ja
punaihoiset antavat kunniasanansa, että tahtovat olla heidän
ystäviään ja liittolaisiaan.
— Mihinkähän tuo intiaani tahtoo meitä houkutella? sanoi

kanadalainen hiljaa Josélle.
— Antaa hänen jatkaa, niin saamme kuulla, vastasi José, hän ei

ole vielä lopettanut, sen huomaan.
— Kun valkoiset soturit saavat tiedon Mustanlinnun aikeista,

tulevat he esiin piilostaan, jatkoi apahi-päällikkö, ja sen vuoksi
ilmaisen ne nyt. Etelän valkoisilla miehillä ei ole sama kieli, eikä
sama Jumala. Apahien käsissä on koko leirillinen etelän sotureita.
— Sitten käy kullanetsijäin nolosti, sanoi Rosenholz.

— Jos pohjan soturit tahtovat yhdistää pitkät pyssynsä
intiaaneihin, niin saavat he heidän kanssaan jakaa ne aarteet ja
hevoset, jotka ovat etelän miesten, sekä heidän päänahkansa, ja
sitten tanssivat intiaanit ja valkoiset heidän ruumiittensa ympärillä.
Rosenholz ja José katsahtivat kummastuneina toisiinsa.
— Kuules tuota pakanaa! sanoi Rosenholz suutuksissaan.
Käyttäen intiaaneille omituisia vertauksia, jatkoi hän:
— Hän luulee jaguaria sakaaliksi. Jollei Fabian olisi täällä, niin

pyssyni luoti antaisi vastauksen.
Mutta intiaania ei näiden kolmen miehen vaitiolo pettänyt; hän oli

varma siitä, että he olivat saarella.
— Yhtä helppoa on, alkoi hän taasen, seurata valkoisten jälkiä kuin
aavikkojen puhvelin. Puhvelin jäljet ilmaisevat intiaanille sen ijän,
lihavuuden tai laihuuden, sen juoksun nopeuden vieläpä päivänkin,
milloin se on paikalla ollut. Uivan kätkyen, kaislikon takana on siis
mies, yhtä väkevä kuin puhveli, ja pitempi kuin pisin pyssy; hänen
kanssaan on puoleksi etelästä, puoleksi pohjoisesta kotoisin oleva
soturi, sekä nuori soturi etelän rotua, mutta näiden liitto
ensinmainitun kanssa todistaa, että he ovat etelän valkoisten
vihollisia, sillä heikompi etsii aina väkevämmän ystävyyttä ja on sen
puolella.
— Noiden koirien tarkka-älyisyys on hämmästyttävä, sanoi

Rosenholz
Josélle.
— Sanot niin, kun se on mairittelevaa sinulle, vastasi José, jonka
itserakkautta oli loukattu.
— Odotan valkoisen vastausta, jatkoi Mustalintu kuunnellen.

Kuulen, lisäsi hän, ainoastaan kohisevan virran ja tuulen, joka sanoo:
"Valkoiset luulottelevat paljon, mikä on perätöntä; he luulevat, että
intiaanien silmät ovat niskassa, että bisonin jäljet ovat
näkymättömät, ettei luoti pysty kaislikkoon." Mustalintu nauraa
tuulen vastaukselle.
— Kas vaan! sanoi José; intiaani puhuu selvää kieltä, hän sanoo,
mitä on sydämellään; eipä ollut hullumpaa, että tahtoi meistä
liittolaisia.
— Voi, huudahti kanadalainen surullisesti, jospa olisimme astuneet

jokeen kaksi penikulmaa ylempänä. — Hyljätystä ystävästä tulee
peljättävä vihollinen.
Nyt viittasi Mustalintu vankia astumaan lähemmäksi. Valkoinen teki

käskyn mukaan. Päällikkö viittasi sormellaan saarta ja näytti
avonaista paikkaa kaislikossa.
— Voiko valkeanaaman pyssystä sattua luoti tuonne ruohostoon.
Mutta vanki käsitti vain nuo muutamat espanjalaiset sanat, jotka

intiaani sekotti äidinkieleensä, ja seisoi ääneti, vapisevana. Silloin
lausui Mustalintu muutaman sanan eräälle soturilleen, joka antoi
valkoiselle pyssyn, ja nyt hän viittoen selitti vangille, mitä tahdottiin.
Onneton kullanetsijä tähtäsi, mutta pelko saattoi koko hänen
ruumiinsa niin vapisemaan, ettei hän voinut pitää pyssyä vakavana.
— Tuo mies-raukka ei osaa saareenkaan, sanoi José
huolimattomasti, ja ellei intiaanilla ole parempaa keinoa saadaksensa
meidät puhumaan, niin piru vieköön en lausu sanaakaan, ennenkuin
huomenna.
Valkoinen ampui, mutta hänen pyssynsä luoti putosi veteen

muutaman tuuman syrjään saaresta.
Mustalintu nyökäytti halveksivasti; sitten kääntyi hän, etsien

katseellaan jotain.
— Niin, sanoi José, etsi sinä vaan luotia ja ruutia sotilaittesi

keihäitten ja jousien joukosta.
Juuri kun José oli lausunut nämä lohduttavat sanat, palasivat nuo
viisi ratsastajaa, jotka olivat poistuneet päällikön käskystä; he olivat
kiireestä kantapäähän varustetut, heillä oli pyssyjä ja jousia. He
olivat uudestaan noutaneet aseensa, jotka olivat panneet pois,
voidaksensa helpommin ajaa takaa hevosia, ja taasen poistui viisi
ratsastajaa.
— Asia alkaa käydä arveluttavaksi, sanoi Rosenholz surullisesti.
— Jos hyökkäisimme heidän päällensä, kun heitä on vain

viisitoista, sanoi José.
— Ei, sanoi kanadalainen, olkaamme ääneti ja hiljaa, intiaani ei ole

varma vielä.
— Niinkuin tahdot.
Ja José alkoi tähystellä puiden takaa.

Intiaanipäällikkö otti itse pyssyn ja meni rannalle.
— Mustanlinnun käsi ei vapise kuin kuivunut ruoho tuulessa, sanoi

intiaani, kohotti pyssynsä ja ojensi sen saarta kohti; pyssy oli
vakavana ja liikkumattomana hänen voimakkaissa käsissään. —
Mutta ennenkuin intiaani ampuu, jatkoi hän, odottaa hän vastausta
saarelle piiloutuneilta valkoisilta; hän laskee sataan asti.
— Mene minun taakseni, Fabian, sanoi Rosenholz.
— Ei, minä jään tähän, sanoi Fabian päättävästi. Minä olen nuorin;
en saa peljätä vaaraa, vaan koetan suojella teitä.
— Lapsi, sanoi kanadalainen, etkö näe, että minun ruumiini on

joka taholta kuutta tuumaa leveämpi sinun ruumistasi. Jos tekisin
mielesi mukaisesti, tarjoaisimme intiaanin pyssylle kahdenkertaisen
maalin.
Saattamatta kaislan korttakaan liikahtamaan konttasi kanadalainen

Fabianin eteen.
— Antakaa olla näin, sanoi José tyynesti; ei ole ihmisellä ollut

jalompaa kilpeä kuin tuon jättiläisen sydän, joka nyt on levoton
teidän tähtenne.
Intiaanipäällikkö kuunteli laskiessaan pyssy kädessä, mutta, paitsi

veden solinaa, kaikkialla vallitsi syvä äänettömyys.
Mustalintu ampui, puun oksia lensi ilmaan, mutta kun metsästäjät

olivat polvillaan toistensa takana, eivät he tarjonneet erittäin suurta
pilkkaa; luoti lensi heidän ohitsensa vähän matkan päästä.
Mustalintu odotti hetken, sitten huusi hän:

— Intiaani on erehtynyt, hän huomaa erehdyksensä ja etsii
muualta valkoisia sotureita.
— Kukapa sitä uskoisi, sanoi José; tuo koira on asiastaan

varmempi kuin ennen. Kiusaaja päästää meidät hetkeksi, kunnes on
murhannut tuon raukan, eikä se kauvan kestä, sillä valkoisen
tappaminen on näytelmä, jota intiaani ei pitkälle heitä.
— Mutta emmekö voisi mitään tehdä tuon onnettoman hyväksi,

jota kauhea kidutus odottaa, sanoi Fabian.
— Siitä ei puhumistakaan; toivon kuitenkin, että jokunen

odottamaton seikka tulee avuksemme, sanoi kanadalainen luotuaan
Joséhen silmäyksen. Mitä José sanoneekin, on sentään mahdollista,
että intiaani epäilee, mutta jos näyttäymme, ei hän enää epäile.
Hän kävi miettiväksi.
— Liittäytyminen noihin perkeleihin, vaikkapa se tapahtuisikin itse

don Estevania vastaan, olisi kurjaa pelkuruutta. Mutta mitä tehdä…
mitä tehdä, lisäsi hän surullisesti.
Toinenkin pelko teki hänet levottomaksi. Hän oli nähnyt Fabianin

antautuvan suuriin vaaroihin, kun hänen verensä kuohui. Mutta
omasiko Fabian tuon kylmäverisyyden, tuon tyynen rohkeuden, joka
ei pelkää kuolemaa, ei tulistu?
Äkkiä lausui kanadalainen päättävästi:
— Kuule Fabian, voinko sinulle puhua miehen tavoin? Eivätkö

sanat, jotka kuulet, saa vertasi pelosta hyytymään?
— Miksi epäilette rohkeuttani? sanoi Fabian
teeskentelemättömästi, mutta lempeästi moittivalla äänellä. Mitä
sanottekin, kuuntelen sitä vaalenematta; mitä teettekin, sen minäkin
teen vapisematta.
— Don Fabian on oikeassa, José! huudahti kanadalainen. Kas

kuinka hänen silmänsä hehkuvat rohkeudesta.
Sydän riemuitsevana painoi hän Fabianin rinnoillensa ja jatkoi

juhlallisesti:
— Ei ole ennen kolme miestä ollut niin suuressa vaarassa kuin me;
vihollisemme ovat seitsemän kertaa lukuisammat meitä. Vaikka
jokainen meistä kaataisikin kuusi noita koiria, ovat he sittenkin lähes
yhtä lukuisat kuin mekin.
— Olemme kerran ennenkin sen tehneet, sanoi José.
— Sitten teemme sen toisenkin kerran, huudahti Fabian.
— Hyvä, lapseni, sanoi Rosenholz, mutta mitä tapahtuneekin, niin

emme elävänä antaudu noiden pirujen käsiin. Katso tänne, Fabian,
lisäsi hän äänellä, johon koetti saada enemmän lujuutta ja samalla
vetäen tupestaan pitkän, leveän puukon, — jos me ruuditta ja
ampumaneuvoitta olisimme heidän käsiinsä joutumaisillamme ja jos
tämä ase kädessäni olisi ainoa pelastuskeino, mitä sanoisit?
— Sanoisin: iske isäni, kuolemme yhdessä!
— Niin, niin! huudahti kanadalainen sanomattomalla riemulla

katsellen sitä, joka häntä nimitti isäkseen, — täten ei meidän
tarvitsisi erota.

Buy ebook Bioluminescence Sung Bae Kim cheap price

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Buy ebook Bioluminescence Sung Bae Kim cheap price

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Buy ebook Bioluminescence Sung Bae Kim cheap price

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Download Full Version ebook - Visit ebookmeta.

Bioluminescence Sung Bae Kim

Discover More Ebook - Explore Now at ebookmeta.com

Start reading on any device today!

Live Cell Imaging Sung Bae Kim

Mechanics of Solids and Fracture 4th edition Ho Sung Kim

Recent Developments in Neuroscience Research on Human

You Can Conquer Cancer A New Way of Living Ian Gawler

Process Safety for Engineers : An Introduction 2nd Edition

Advancing the Discipline of Regulatory Science for Medical

Kiss the Girl 1st Edition Zoraida Cordova

Qualitative Researcher Vulnerability Negotiating

Sung-Bae Kim Editor

For further volumes:

Methods and Protocols, Volume 2

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Bioluminescence means a “cold light,” a unique type of chemiluminescence taking place

Tsukuba, Ibaraki, Japan Sung-Bae Kim

PART I HETEROGENEOUS CONJUGATES

PART II PROTEIN FRAGMENT-COMPLEMENTATION ASSAYS

8 Quantitative Imaging of Retinoic Acid Activities in Living Mammalian Cells . . . 111

11 Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-Based

PART III BRET-BASED IMAGING

12 Screening of Protein–Protein Interaction Modulators Using BRET-Based

24 Organ Bioluminescence Imaging Under Machine Perfusion Setting

32 Exploring Phylogenetic Relationships and Divergence Times

Pharmacology and Chemical Biology, School of Medicine, University of Pittsburgh,

ELISA MICHELINI • Department of Chemistry “Giacomo Ciamician”, University of Bologna,

MARINA SANAKI-MATSUMIYA • European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Barcelona,

Quantitative Assessment of the Efficacy of Near-Infrared

Key words NIR-PIT, Firefly, Luciferase, Luciferin, BLI

Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is a target cell-

Sung-Bae Kim (ed.), Bioluminescence: Methods and Protocols, Volume 2,

(ASP1929), was conditionally approved and registered for clinical

2.1 Manufacture of 1. 10 mM IRDye® 700DX NHS ester (IR700, LI-COR Biosci-

2.3 In Vivo PIT 1. Athymic nude mice, 6–8 weeks old.

2.4 Bioluminescence 1. D-luciferin solution: dissolve 1.0 g of D-luciferin in 66.6 mL of

Carry out all procedures at room temperature (RT) unless other-

3.1 Conjugation of 1. Mix 1 mg of Panitumumab (see Note 2) with 3.3 μL of 10 mM

Fig. 3 BL assessment of in vitro NIR-PIT. Luciferase-expressing A431 cell line

1. To avoid accidents with laser light, all studies should be carried

5. Dense accumulation of IR700 dyes to the cells may lead to

This work was supported by the Intramural Research Program of

Evaluation of the Efficacy of Saracatinib-Loaded

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) accounts for

Sung-Bae Kim (ed.), Bioluminescence: Methods and Protocols, Volume 2,

transductions to regulate multiple cell biological processes, includ-

2.1 Reagents 1. Mammalian expression vector: pGL4.50 [luc2/CMV/Hygro]

5. Lipofectamine™ 3000 transfection reagent (Invitrogen, Carls-

2.2 Instrumentation 1. GloMax® 20/20 luminometer (Promega).

2.4 Software 1. Living Image Ver. 4.7.

cell suspension (2 104 cells) into the anterior part of the

3.3 Nano-Sar 1. Intravenously (i.v.) inject 100 μL of Nano-Sar (5 mg/kg) or its

1. pGL4.50[luc2/CMV/Hygro] encodes a codon-optimized

Tämän uhkaavan vaaran nähdessään, don Estevan sijoitti osan

Nyt kajahti äkkiä sadoista kurkuista apahien kauhea sotaulvonta;

Taistelussa oli etevä sija kolmella miehellä, Orochella, Pedro

Kun ampujista ei enää ollut hyötyä taistelun raivotessa mies

Tämä kurja roisto, joka oli pettänyt toverinsa apaheille ja

Don Estevan yksin huomasi sen ja sanoi kylmäverisesti: nyt meillä