Василий Владимирович Бартольд родился в семье биржевого маклера немецкого происхождения. В 1887 году окончил 8-ю петербургскую гимназию. Поступил в Петербургский университет на факультет восточных языков. Окончил университет в 1891 году, с 1892 года там же и работал. Средства отца позволили Бартольду не останавливаться перед расходами для пополнения своего образования, в том числе за границей, осуществления поездок и путешествий.
В 1900 году, по защите диссертации «Туркестан в эпоху монгольского нашествия» (части 1-я и 2-я, СПб., 1898—1900), Бартольд получил степень доктора истории Востока.
Преподавал в Петербургском университете, ежегодно совершая поездки в страны Востока.
В 1901 году В. Бартольд назначен экстраординарным, в 1906 году ординарным профессором Петербургского университета; в 1904 году производил археологические раскопки в окрестностях Самарканда; в 1910 году избран членом-корреспондентом Академии наук, в 1913 — ординарным академиком по разряду «литература и история азиатских народов».
В мае 1913 года предпринял научную поездку по Южному Уралу, Сибири и Центральной Азии, посетил города Оренбург, Уфа, с.Стерлибашево Стерлитамакского уезда Уфимской губернии.
После Октябрьской революции возглавил Коллегию востоковедов, созданную в 1921 году при Азиатском музее. Одной из важных задач, к решению которых он был подключен в первые же годы Советской власти, стало создание письменности для бесписьменных народов РСФСР и СССР и замена арабского алфавита на кириллицу.
В 1924—1926 годах бывал в Баку, где принимал деятельное участие в организации посредством профессоров петербургского и казанского университетов восточного факультета в Азербайджанском университете. Специально для студентов этого университета прочел циклы лекций «История Азербайджана», «О месте прикаспийских областей в истории мусульманского мира», где дал анализ исторического значения отдельных городов Азербайджана, в частности, Баку.
В Баку встречался с учеными, преподавателями, с местной администрацией, осматривал музеи, мечети, шахский дворец, крепость, кладбища. Кроме работы в Баку, занимался вопросами сохранения мавзолеев Низами, Фирдоуси и Коркута и переводил азербайджанский эпос «Сказание о Деде Коркуте».
Знакомился и переводил некоторые рукописи из собрания библиотеки Азербайджанского университета и библиотеки им Сабира. Читал доклады на заседаниях «Историко-Этнографической секции Общества Обследования и Изучения Азербайджана» в Бакинском Доме Просвещения, и на Первом Всесоюзном Тюркологическом съезде в Баку (1926). Сведения, собранные им о городе Баку, входят в статью «Баку» в его «Энциклопедии ислама».
В январе 1927 года по предложению Н. Я. Марра приглашен в Ленинградскую библиотеку в качестве консультанта по работам Восточного отделения с оплатой из научых кредитов, а с 1 февраля 1928 года зачислен нештатным сотрудником. В 1929 году вновь был консультантом. В Восточном отделении Бартольд руководил работой сотрудников, занимавшихся каталогизацией книг на персидском и других языках. Согласно трудовому договору на Бартольда возлагалось также описание «рукописей турецких, арабских, персидских и, в первую очередь, рукописей бывшего Крымского ханства».
С 1927 по 1930 год занимался описанием рукописей регулярно, как правило, два раза в неделю, по понедельникам и четвергам, посещая Петербургскую Библиотеку. Всего было описано около 500 рукописей: арабские («Новая серия»); собрание Н. В. Ханыкова; собрание А. С. Фирковича; персидско-таджикские («Персидская новая серия»); тюркоязычные («Турецкая новая серия»). Труды Бартольда представляли исключительную ценность, т. к. позволили ввести в науч. оборот неизвестные ранее материалы.
Согласно пятилетнему плану, составленному им самим в 1929 году, предполагал посвятить каталогизации несколько лет, однако преждевременная смерть помешала ему завершить работу.
Автор множества работ по истории ислама, организатор и редактор журнала «Мир ислама», а затем «Мусульманский мир», один из отцов-основателей русской школы востоковедения.