UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIAPAS CIENCIAS QUIMICAS

CAMPUS IV

PROTOCOLO DE TESIS

Determinacin de actividad enzimtica en cepas de Pleurotus ostreatus, empleando como base de crecimiento pasto Pangola (Digitaria decumbens)

TAPACHULA CHIAPAS;

I.- Planteamiento del problema

1.1 Antecedentes En un estudio realizado para tratamiento de efluentes industriales coloreados con Pleurotus spp se encontr que la produccin de lacasa de P. ostreatus est directamente relacionada con la cantidad de biomasa producida, al igual que en otras especies de Pleurotus, esto en Santiago de Cuba, Cuba. (Suyn Rodriguez, 2003). Gricelda y colaboradores en 1998, determinaron la produccin de biomasa y enzimas lignolticas por Pleurotus ostreatus en cultivo sumergido, y encontraron que las mejores condiciones de cultivo fueron: una concentracin de glucosa inicial de 5 g/l, pH inicial entre 5.5 - 6.5, y una temperatura de incubacin entre 26 y 29C. (K. Gricelda, 1998). As tambin en el 2002 se public un artculo de Mayer y Staples donde se mencion que la enzima Lacasa tiene un pH ptimo que vara de 3 a 7, as tambin se encontr que la actividad Lacasa fue mayor en presencia de paja de trigo y bagazo de caa a 12 y 20 das de incubacin. (Mayer y Staples 2002). Bukhalo y Solomko citaron una temperatura ptima para P. ostreatus de 25 1C, (Atkinson B, 1991). Y en 1986 Hadar y Cohen-Arazi, estimaron para P. ostreatus una temperatura ptima de 28C. Esto se debe a que cada especie y/o cepa tiene intervalos ptimos de temperatura, (Hadar,1986).

Parece ser que la produccin de lignina peroxidasa y lacasa est asociada al crecimiento de algunas especies de Pleurotus. (Das N, 1997).

1.2 Justificacin En la actualizad los descubrimientos, que se han encontrado al analizar y

experimentar en hongos, han asombrado a la sociedad cientfica, ya que han arrojado resultados sorprendentes en diversas reas, como la medicina, la biologa, e incluso en la nutriologa, y esto es, porque se han implementado nuevos mtodos de anlisis y nuevas reas de investigacin con respecto a estos organismos. Aqu en Tapachula Chiapas existe un centro de investigacin dedicado al estudio y conservacin del medio ambiente (ECOSUR), y dentro de sus instalaciones cuenta con un rea exclusiva al estudio de los hongos. Esta rea posee una coleccin de aproximadamente 1500 cepas de distintas
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especies y gneros de hongos, tanto comestibles como medicinales, de los cuales la mayora de ellos ya ha sido bien estudiado, sin embargo para el gnero Pleurotus sp existen en la coleccin ms de 100 cepas y en particular la espacie ostreatus cuenta con 20 cepas provenientes de distintos lugares. Como es la especie representativa de los hongos comestibles, se es necesario determinar las condiciones apropiadas para su cultivo y produccin, y de esta manera aseguramos que la demanda de consumo sea en lo absoluto suplementada.

II.- Objetivos

2.1 General:

Determinar la actividad enzimtica en cepas de Pleurotus ostreatus provenientes de distintos lugares, habiendo utilizado como base de crecimiento pasto Pangola (Digitaria decumbens) en todas las cepas.

2.2 Especficos:

Determinar la actividad enzimtica en las cepas de Pleurotus ostreatus. Comparar la actividad enzimtica entre las cepas de Pleurotus ostreatus. Evaluar la eficiencia biolgica de cada cepa. Determinar las condiciones favorables de crecimiento (Temperatura, pH y humedad) para cada cepa.

III.- Marco terico

3.1 Pasto pangola (Digitaria decumbens) El pasto pangola o pongola (Digitaria decumbens) es hierba forrajera perenne originaria de Sudfrica. Se cultiva para pastoreo de ganado en Amrica, siendo apreciada por su resistencia a la sequa, su versatilidad en cuanto a los suelos y su rpido crecimiento.3

La pangola es un pasto estolonfero, vigorosa, de porte semierecto, que cubre densamente el suelo. Alcanza los 100 cm de altura. Presenta hojas lineales, de entre 7 y 9 mm de ancho, lisas por ambas caras, con la vaina ovalada y ligeramente pubescente. La lgula es membranosa, de cerca de 3 mm de largo. Presenta una inflorescencia en espiga al extremo de un largo pednculo, formada por espculas glabras de flores estriles.6 Es originaria del Transvaal sudafricano; es introdujo en 1935 a Estados Unidos, donde la Estacin Experimental Agrcola de Gainesville, Florida, desarroll variedades de uso comercial. Hoy se emplea en toda Amrica, en especial en Mxico y Venezuela. 6 Nativa de clima tropical, tolera bien los regmenes subtropicales en condiciones moderadas de lluvia, con ms de 800 mm anuales. Se cultiva entre el nivel del mar hasta los 2.000 msnm, aunque el rendimiento es muy inferior por encima de los 1.200 msnm. Es susceptible a las heladas. 6 Crece en varios tipos de suelos, desde arenosos hasta arcilloso-pesados, prefiriendo los francoarcillosos y francoarenosos bien drenados. Tolera mal el exceso de humedad, y si bien soporta cortos perodos de inundacin el anegamiento prolongado la ahoga. Es marcadamente acidfila, y bastante exigente en cobre. 6 La inmensa mayora de las plantas no produce semilla viable, por lo cual se propaga por estolones. Se utilizan an verdes, pero ya no suculentos, utilizndose unos 1500 a 2000 kg/ha para la siembra al voleo. Resiste bien el pastoreo y el pisoteo mientras no se la ramonee constantemente a ras de suelo, por lo que se emplea para ceba intensiva, as como para produccin de heno. Puede cultivarse conjuntamente con Trifolium repens o Lotonomis bainesii, que son menos exigentes en nitrgeno. 6

3.2 Pleurotus ostreatus

La grgola, champin ostra o pleuroto en forma de ostra (Pleurotus ostreatus) es un hongo comestible, estrechamente emparentado con la seta de cardo (Pleurotus eryngii), que se consume ampliamente por su sabor y la facilidad de su identificacin.1

P. ostreatus presenta un sombrero de 5 a 20 cm de dimetro, con el pie desplazado hacia un lado y creciendo habitualmente junto a otros ejemplares superpuestos. La superficie es lisa y brillante; de color gris o gris oscuro, y en ocasiones gris pardo o azulado. El margen del sombrero cambia con la edad, siendo enrollado en los ejemplares jvenes y abierto en los adultos. 1

Tiene las lminas apretadas, delgadas, recurrentes y de color blanquecino. La carne es firme, algo dura en los ejemplares adultos, y de sabor y olor agradables. Crece en la superficie de tocones y troncos de maderas blandas como el chopo, lahaya o el sauce, entre otros. Bastante comn. La seta de ostra, como otras setas, representa una fuente importante de selenio. El selenio es muy importante para el metabolismo humano, y ha demostrado ser uno de los micronutrientes que poseen un mayor efecto antioxidante y de proteccin contra algunos tipos de cncer. Su alto contenido en polisacridos conlleva una accin beneficiosa sobre el sistema inmunolgico. 2

Comparte con el resto de setas comestibles el hecho de contener un tipo de glcidos que las enzimas humanos no pueden digerir, pero que pueden ser fermentados parcialmente por las bacterias del colon de manera que se comportan en el aparato digestivo humano de manera similar a la fibra alimentaria. La fibra y estos glcidos se hinchan con el agua y regulan el trnsito intestinal. Las setas tambin aumentan la excrecin de cidos biliares y tienen propiedades antioxidantes y hipocolesterolemiantes. 2

Pleurotus ostreatus es un hongo comestible, al respecto se han realizado muchas investigaciones relacionadas con su valor nutricional y su importancia econmica en la industria alimentaria. En el rea de la medicina se ha encontrado que el gnero Pleurotus lleva a cabo actividades antibacteriales, antivirales, antitumorales, hematolgicas e hipocolesterolmica.

Es fundamental que el hongo que se va a cultivar se identifique correctamente desde el punto de vista taxonmico, ya que de ello dependern las tcnicas que se utilizarn en el cultivo. La produccin de este hongo es el resultado de la utilizacin de los residuales de fcil biodegradacin, la cual en un ambiente particular requiere de la presencia de los microorganismos apropiados, que en muchas ocasiones pueden consistir en una comunidad microbiana compleja. 4

Para que esto suceda el ambiente debe ser apto tanto para el crecimiento de los microorganismos como para la produccin de reacciones qumicas de transformacin en velocidades significativas. Hay que tener en cuenta factores que son muy importantes en los que se citan: caractersticas del sustrato, concentracin de nutrientes, temperatura, pH, humedad, entre otros. 5

Las ventajas de cultivar Pleurotus, con respecto a otros hongos son las siguientes:

Son agentes biolgicos capaces de convertir materia orgnica no comestible y de bajo valor econmico en un producto con un importante valor agregado. 5

No se requiere de sustratos preformados. Se pueden cultivar en sustratos sin fermentar previamente. 5

Fructifica bien en residuos con bajo contenido de nitrgeno produciendo frutos con alto contenido de ese elemento. 5

Se caracteriza por un rpido crecimiento micelial que facilita una colonizacin activa de los residuos lignocelulsicos y otro tipo de residuos contaminados. 5

Los requerimientos de temperatura y humedad no son estrechos e inflexibles. 5 Pueden tolerar altas concentraciones de CO2 en la atmsfera ambiental. 5 La cosecha de cuerpos fructferos es sencilla. 5

El sustrato remanente despus de finalizado el ciclo constituye un residuo con un alto grado de descontaminacin. 5

3.2.1 Generalidades sobre su cultivo

El cultivo de esta seta es posible realizarlo con diferentes tcnicas, pero en todas ellas lo fundamental consiste en sembrar el micelio sobre un sustrato hmedo (casi siempre pasteurizado), incubarlo a 20-25 C, mientras permanece cubierto con plstico y, por ltimo, mantenerlo descubierto en sitios muy hmedos y frescos, generalmente a, menos de 15 C, hasta que salgan las setas. 7

3.2.2 Siembra e incubacin

La siembra consiste en mezclar el micelio con el sustrato ya preparado, de un modo uniforme. La cantidad de micelio comercial vara entre 1 y 4 % del peso hmedo. A mayor cantidad el desarrollo del hongo ser ms rpido y abundante pero la temperatura tambin ser mayor, lo que perjudicar al desarrollo del micelio. 7

El micelio se prepara en laboratorio, germinando las esporas en placas con agar-maltosa u otros medios de cultivo. Despus se hace crecer sobre granos de cereales esterilizados, y una vez colonizados se realiza la incubacin en un ambiente cerrado para evitar la contaminacin o la deshidratacin y para mantener una humedad del 85 %.
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La duracin de esta etapa puede variar, pero en general es de cuatro semanas, tiempo que tarda el micelio en cubrir toda la caja (el sustrato se torna completamente blanco) y en empezar a aparecer unos puntos pequeitos y en cantidad llamados primordios (las primeras manifestaciones de los cuerpos fructferos de las setas) ya que indican que es el momento de llevarlas a fructificacin. 7 3.2.3 Condiciones ambientales para el crecimiento de hongos

Las condiciones ambientales ptimas para el crecimiento de hongos se las miden a travs de factores fsicos o qumicos, como temperatura, humedad, pH, etc.; sin embargo hay otro tipo de condiciones ambientales extremadas tales como una escasez de nutrientes esenciales. 8

3.2.4 Temperatura

La mayora de los hongos son mesfilos; crecen a temperaturas moderadas en un intervalo de 10 a 40C. Para fines prcticos, la mayora de los hongos crecen bien a temperatura ambiente. Mientras que las temperaturas de 30 a 37C, que por lo comn son idneas para las bacterias, son inadecuadas para muchos hongos. 8

Pocos hongos son termfilos y crecen en el intervalo de 20 a 50C, con una temperatura ptima de (o cerca de) 40C y un lmite mximo de 60 a 62C. 8

3.2.5 Concentracin de iones hidrgeno

Las respuestas de los hongos al pH son en gran medida por otros factores no relacionados, sin embargo, en el laboratorio muchos hongos crecen en un intervalo de pH de 4,5 a 8,0., y muestran un amplio intervalo de pH ptimo de 5,5 a 7,5. 8

Una buena parte de la informacin acerca del pH proviene de estudios sobre las enzimas de los hongos que por lo general tienen un pH ptimo entre 5,0 y 5,5. Muchos otros factores son afectados por el pH, incluyendo la permeabilidad de la membrana y el grado de disociacin de las molculas en iones. Por lo tanto, es posible que un hongo sea incapaz de absorber nutrientes esenciales a un cierto valor de pH, o bien encuentre niveles txicos de compuestos, dependiendo del grado de toxicidad en la forma disociadas o en la no disociada. 8 Adems, los hongos a menudo alteran el pH del medio en el que crecen y los hacen por:

Absorcin selectiva e intercambio de iones, Produccin de CO2 o NH3, Produccin de cidos orgnicos

En cuanto al crecimiento a niveles extremos de pH, hay varios hongos acidfilos o tolerantes al cido, pero slo hay unos cuantos (si acaso los hay) verdaderamente basfilos. 8

3.2.6 Humedad

Existen varias formas de definir la disponibilidad de agua para un organismo. Los miclogos a menudo se han referido a humedad relativa (HR) en equilibrio, en cuyo caso el 70% de HR es, para fines prcticos, el lmite inferior para el crecimiento de los hongos, aunque algunos crecen con mucha lentitud a una HR menor de 65%. Los hongos muestran un comportamiento muy variado con respecto a la disponibilidad de agua, pero en general son ms tolerantes a la escasez de agua que otros organismos. 4

3.2.7 Luz

La parte visible del espectro (longitudes de onda entre 380 y 729 nm) tiene poco efecto, hasta donde se sabe, en el crecimiento vegetativo de los hongos, aunque puede tener efectos importantes en la esporulacin. 4 La radiacin ultravioleta en la regin de 200 300 nm tiene efectos mucho ms pronunciados en el crecimiento vegetativo. Esta radiacin produce mutaciones y dao letal al resultar afectado el DNA. 4

A diferencia del crecimiento vegetativo, el desarrollo de las estructuras reproductoras sexuales y asexuales es a menudo afectado por la luz. 4

IV.- Tipo de estudio:

Experimental Prospectivo Transversal Descriptivo

V.- Procedimientos para la recoleccin de informacin, instrumentos a utilizar y mtodos para el control y calidad de los datos
5.1 Procedimiento: 1. Sembrar cada cepa del hongo P. ostreatus, en estado micelial, en placas con medio de cultivo Agar Extracto de Malta. 2. Preparar el sustrato (pasto Pangola) para su posterior siembra con el inculo. Esto se hace, mezclando pasto Pangola, agua (determinada cantidad para una humedad aproximada a 60%), hidrxido de sodio (para un pH final del sustrato de 8-9) 3. Colocar el inculo en el sustrato e incubar a 24 C y una humedad relativa de 90% durante 20 das. 4. Cosechar las setas, rotular y conservar en congelacin. 5. Tomar una muestra representativa de cada cepa y realizar un anlisis de humedad, tamao, color, aspecto, textura, olor y sabor, de cada una. 6. Realizar la determinacin de la actividad enzimtica de cada cepa, mediante espectrofotometra. 6.1.- Para Manganeso peroxidasa: 6.1.1.- Reactivos: a) MnSO4 1mM b) Malonato de Sodio 50 mM pH= 4.5 c) H2O2 1mM 6.2.- Para Lacasa: 6.2.1.- Reactivos: a) Acetato de sodio 100 mM pH 4.5 b) Reactivo ABTS 6.3.- Para Fenol oxidasa: 6.3.1.- Reactivos: a) Fosfato monopotsico 0.5 M b) Fosfato disdico 0.5 M c) Catecol 6.4.- Para Aril Alcohol oxidasa: 6.4.1.- Reactivos:

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a) Veratryl alcohol 5 mM b) NaHPO4 C) NaH2PO4 7. Comparar las lecturas de absorbancia de todas las cepas. 5.2 Instrumento: 1. Cajas petri con Agar Extracto de Malta 2. Mescladora de pastura con capacidad de 20 kg 3. Bolsas de polietileno con capacidad de 1 kg 4. Balanza granataria con capacidad mxima de 10 kg 5. Balanza analtica 6. Espectrofotmetro

VI.- Calendario de trabajo

Periodo a realizar la actividad Actividad a realizar ENERO Sembrar cada cepa del hongo P. ostreatus, en placas con medio de cultivo Extracto de Malta. Preparar el sustrato para su posterior EL 20 siembra con el inculo. Colocar el inculo en el sustrato e incubar a 24 C y una humedad relativa de 90%. Cosechar las setas, rotular. Tomar una muestra representativa de cada cepa y realizar un anlisis de EL 2 humedad, tamao, color, aspecto, textura, olor y sabor, de cada una. EL 11 EL 21 DEL 1 AL 20 FEBRERO MARZO ABRIL

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Realizar la determinacin de la actividad enzimtica de cada cepa, mediante espectrofotometra. Comparar las lecturas de absorbancia DEL 1 AL 10 de todas las cepas. DEL 10 AL 31

VII.- Bibliografa y fuentes

1. GEA, F.J. (2002) Plagas y enfermedades del gnero Pleurotus spp. In: Snchez JE, Royse DJ (eds) La biologa y el cultivo de Pleurotus spp. Limusa, Mxico. 205-224. 2. MUEZ, M. A.; PARDO, J. (2002) La preparacin del substrato. In: Snchez JE, Royse DJ (eds) La biologa y el cultivo de Pleurotus spp. Limusa, Mxico. 157-186. 3. MUEZ, M.A. (1994) Bases para el cultivo de Pleurotus. In: I Jornadas Tcnicas del Champin y otros Hongos Comestibles en Castilla-La Mancha. Patronato de Promocin Econmica, Diputacin Provincial de Cuenca, Espaa. 129-141. 4. PARDO, J.; PERONA, M. A.; PARDO, A. (2008) Materiales y tcnicas para la elaboracin de sustratos de cultivo de Pleurotus spp. In: Patronato de Desarrollo Provincial, Diputacin Provincial de Cuenca (ed) Avances en la tecnologa de la produccin comercial del champin y otros hongos cultivados, 3 (Actas de las IV Jornadas Tcnicas del Champin y Otros Hongos Comestibles en Castilla-La Mancha). 11-31. 5. Ramos G. Pleurotus Ostreatus Cultivado en residuos de palma aceitera como importante fuente proteica para la dieta humana. Tesis de Grado, Escuela superior politcnica del Chimborazo, facultad de ciencias qumicas. 2007. 6. Sherameti I, Varma A.,Soil Biology: Soil Heavy Metals.New York,2010. 7. SIMN, A. (2010) Calidad y mantenimiento poscosecha del champin blanco. Consejera de Agricultura, Ganadera y Desarrollo Rural, Gobierno de La Rioja. Logroo, Espaa. 58 pp. 8. Tropicos.org. Missouri Botanical Garden. Consultado el 28 de enero de 2010.

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