Universidad Complutense FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA II

GUIA DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA

Tercer Curso
2010/2011

INDICE

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO..............................................................................1 EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA.............................................................................................3 1. ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO..........................................................5 2. PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL......................................................................7 3. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.....................................................................................11 4. OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS.....................................................................................15 5. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.......................................................................................23 6. SIEMBRA Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS...........................................................................27 7. CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL...................................................................................31 8. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO BACTERIANO.. 33 9. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA ..........................................43 10. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR.................................................................................45 11. ANLISIS MICROBIOLGICO DE UN AGUA PROBLEMA......................................................... 49 ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS.......................................................57 BIBLIOGRAFA.....................................................................................................................................64 CALENDARIO.......................................................................................................................................65

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

- El acceso al laboratorio de prcticas slo se permite a los alumnos que estn realizando las prcticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. - Los laboratorios de investigacin son de acceso restringido al personal del Departamento. - Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se est trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prcticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio. - Debe respetarse la prohibicin de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningn objeto (bolgrafos...) o tocarse los ojos y nariz. - En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningn momento ropa u objetos personales. - Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, as como de los microscopios que haya usado. - Se deben usar los mecheros Bunsen con precaucin, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobar que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio.

- Est prohibido pipetear con la boca. - Ante un vertido accidental de material microbiolgico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo. - No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos. - No se manejarn los autoclaves o el material recin esterilizado si no se dispone de guantes apropiados. - La eliminacin de residuos, material desechable y material reciclable se realizar siguiendo las pautas de la prctica 1, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto. - Se deben lavar las manos con jabn antisptico ante cualquier sospecha de contaminacin y siempre antes de marcharse del laboratorio.

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Introduccin
Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa se requieren unas tcnicas especficas y diferentes de las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en condiciones aspticas: El material e instrumental que se va a utilizar, as como los medios de cultivo, deben ser sometidos a algn procedimiento de esterilizacin, eliminndose de ellos cualquier posible microorganismo. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse utilizando cultivos axnicos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola especie microbiana. La posibilidad de contaminacin est siempre presente porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: En el aire, en el agua, en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos. Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes normas: - El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estriles. - Los tubos o matraces deben ser tapados con algodn hidrfobo estril o cubiertos con un capuchn metlico, para impedir la entrada de microorganismos. Si se usan placas de Petri deben mantenerse tapadas mientras no se estn manipulando. - Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de siembra, pipetas, etc) deben ser previamente esterilizados.

Materiales empleados y forma de uso

- Asa e hilo de siembra: Antes de su utilizacin, se esterilizan sometindolos a la accin de la llama de un mechero hasta que el filamento quede incandescente. Luego se flamear la parte inferior del filamento. Una vez utilizados, deben flamearse de nuevo con el objeto de eliminar los microorganismos que quedan en ellos.

Figura I. Instrumentos para siembra de microorganismos

A: Asa de siembra B: Hilo de siembra C: Pipeta Pasteur D: Cayado

- Pipetas Pasteur: Son generalmente de vidrio y se utilizan para la transferencia de cultivos lquidos, diluciones de suero, etc con ayuda de un chupete de goma u otro sistema de aspiracin mecnica. Pueden utilizarse, con el extremo inferior cerrado, en sustitucin del hilo de siembra, cuando se realizan siembras en el interior del agar (en profundidad). Para ello se sella previamente el extremo de la misma con la llama del mechero.

Figura II. Pipetas

A: Pipeta automtica de 0,21 ml B: Pipeta automtica de 0,020,2 ml C: Pipeta de vidrio de 10 ml D: Pipeta de vidrio de 1 ml

- Varillas de vidrio macizo acodadas (cayados): Sirven para distribuir los microorganismos de la muestra sobre la superficie del medio de cultivo contenido en una placa de Petri. Se utilizarn previamente esterilizadas, impregnndolas en alcohol y pasndolas posteriormente por la llama del mechero. Tambin, pueden hacerse usando una pipeta Pasteur, sellando el extremo de la misma y acodndola con la llama del mechero. - Pipetas graduadas de vidrio o plstico: Se suministran ya estriles a los alumnos, dentro de estuches metlicos o bien empaquetadas de forma individual (envueltas en papel satinado o plstico para mantener su esterilidad), en cualquier caso deben abrirse cerca de la llama del mechero. La pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada, debe flamearse ligeramente antes de ser usada. Las pipetas llevan un algodn en la boquilla, que acta como filtro, para evitar la contaminacin y para impedir la llegada de lquido al sistema de succin. Dicho algodn debe permanecer en la boquilla durante el uso. Bajo ningn concepto se debe pipetear con la boca una muestra microbiolgica. Para pipetear suspensiones de microorganismos se utilizan chupetes o pipeteadores ms o menos sofisticados, como son las peras de goma provistas de vlvulas que permiten controlar la succin y el dispensado de los lquidos o los dispositivos semejantes a jeringas en los que se colo-

ca la pipeta y que operan por medio de un mbolo o con ayuda de bombas elctricas. - Tubos de ensayo con cultivos problema y placas Petri: Se destapan cerca de la llama del mechero utilizando para ello slo los dedos que quedan libres en la mano que sostiene el asa de siembra. Se flamea la boca del tubo, se toma una pequea muestra del cultivo con asa de siembra estril, previamente atemperada, y tras flamear de nuevo la boca del tubo colocamos el tapn. Todo el proceso se realiza cerca de la llama. Si el medio es lquido, se debe agitar el tubo antes de tomar la muestra, porque los microorganismos tienden a sedimentar. En el caso de que el medio sea slido (tubos de agar inclinado y placas Petri), la muestra se obtendr rozando ligeramente con el asa la zona en la que se aprecia masa microbiana. Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el menor tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones. - Medios de cultivo: Pueden ser lquidos, slidos y semislidos. Se distribuyen en matraces, tubos de ensayo y placas de Petri. Estas ltimas slo llevan medio slido. Su preparacin y esterilizacin se describe mas adelante. La composicin de los medios, colorantes y reactivos utilizados en prcticas se describe en el anexo del final de la gua.

El asa de siembra se maneja cogindola del mango como si fuera un lpiz

La boca del tubo se flamea despus de abrir y antes de cerrar

El tapn se maneja con el dedo meique de la mano derecha.

Toda la operacin se realiza cerca del mechero Bunsen

Figura III. Manejo del asa de siembra durante una inoculacin.

PRCTICA 1 ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO

En Microbiologa es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del material. Asimismo, es muy importante la recuperacin del material reciclable y la eliminacin del material desechable. Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos de tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material recogindose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solucin desinfectante, como por ejemplo una solucin diluida de leja, en la que permanecer antes de su lavado durante 24 horas. Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia orgnica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes fsicos o qumicos utilizados en la descontaminacin de los mismos, no puede asegurarse la total destruccin de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos ms largos de tratamiento que para la desinfeccin o la esterilizacin de material limpio. Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminacin de instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, as como de material desechable. A tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el autoclave sometindolos a la accin del vapor de agua a una atmsfera de sobrepresin (121 C) en ciclos ms prolongados de lo habitual (1 hora en lugar de 30 minutos). Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para eliminar toda materia extraa, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla crmica o cualquier otro procedimiento enrgico, tanto mecnico como qumico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales, el trozo de algodn que tienen en la boquilla. Algunos de los objetos sucios y contaminados (portaobjetos, pipetas, etc), despus de lavados, se sumergen en una mezcla sulfocrmica donde se dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavan con agua y se dejan escurrir. Los portas se secan con un pao de hilo limpio, procurando que no queden hilazas sobre la superficie. El material que contiene colorantes se trata, segn las condiciones del material, durante un tiempo variable con una solucin que puede ser de cido clorhdrico, ntrico o mezcla sulfocrmica. El resto del material (tubos de plstico, jeringas, etc) se trata con distintas soluciones desinfectantes como hipoclorito sdico, formol, etc, pero debe recordarse que se utilizan a concentraciones superiores a las utilizadas con otros fines.

PRCTICA 2 PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL

Introduccin
En Microbiologa se define esterilizacin como la destruccin o eliminacin total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluidas las endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad. El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado: - El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodn graso o tapones metlicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Adems, cuando se usa algodn, ha de cubrirse ste con un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodn que actuar como filtro, evitando la contaminacin del operario con los microorganismos de la muestra y que ste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metlicas, o bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur. - El material de plstico desechable ya se suministra estril y listo para su uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plstico selladas y se esterilizan con xido de etileno o radiaciones. - Las soluciones y medios de cultivo lquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave. Existen varios mtodos para llevar a cabo el proceso de esterilizacin y la eleccin de uno determinado viene condicionado por el tipo de material que se quiere esterilizar.

Material
Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de aire caliente, autoclaves, equipos de filtracin y materiales a tratar.

Tcnicas
El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras razones porque es el ms econmico y el ms fcil de controlar. El calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor hmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables de la estructura terciaria de las protenas, haciendo que stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad. La esterilizacin por calor seco puede hacerse por flameado o mediante estufas de aire caliente. I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, esptulas, etc. Consiste en someter directamente a la accin de la llama de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este mtodo es rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolbiles. II) Esterilizacin por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: Pipetas, matraces, tubos, etc. u otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (160-180C durante cerca de 2 horas). Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar lquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100C comenzaran a hervir y continuaran hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de ebullicin del agua a presin atmosfrica y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante

Objetivos
Conocer la importancia de la esterilizacin y familiarizarse con el manejo de los procedimientos ms frecuentemente utilizados para llevarla a cabo.

horas. Pero incluso en muestras en las que supisemos que no existen endosporas, esta metodologa puede implicar cambios en la concentracin de los componentes del medio, a causa de la fuerte evaporacin sufrida. El calor hmedo tambin se utiliza para la destruccin de los microorganismos siendo, como ya se ha comentado, a igual temperatura, mucho ms eficaz que el calor seco; con este tratamiento las enzimas se desnaturalizan rpidamente, al igual que las membranas celulares. Adems, el vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresin, es un eficaz transmisor de calor al interior de la clula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios mtodos: Ebullicin, vapor fluente y vapor saturado a presin: I) Ebullicin: El agua hirviendo (100C) tiene accin limitada, ya que aplicada durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podra utilizar el bao Mara o bao de agua hirviente (slo con fines de desinfeccin en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros mtodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc) como para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave. II) Vapor fluente: Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100C sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presin atmosfrica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100C, y se realiza el proceso durante tres das consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100C) durante 30-45 minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes. Si stas se encuentran presentes en la muestra germinan despus del calentamiento y estas formas vegetativas sern destruidas en los siguientes ciclos. Este mtodo de esterilizacin se denomina tambin esterilizacin fraccionada o tindalizacin. III) Vapor saturado a presin: La esterilizacin por esta tcnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmsfera extra de presin sobre la presin atmosfrica normal, elevndose con ello el punto de ebullicin del agua de 100C a 121C y consiguindose la destruccin de todos los microorganismos (salvo los termfilos extre-

mos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es tambin necesaria para la destruccin de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia trmica y que pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100C durante horas. El vapor de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenmeno que se acenta si el vapor es saturado y a sobrepresin. Esta tcnica de esterilizacin requiere el uso del autoclave.

Figura 2.1: Autoclave de cuba horizontal

El autoclave permite elevar la presin una o dos atmsferas sobre la presin atmosfrica, elevndose con ello la temperatura de ebullicin del agua que se encuentra en su interior. Consta de un recipiente metlico, generalmente de acero inoxidable, similar a una gran olla, en cuyo interior se introduce el material a esterilizar que se coloca sobre una rejilla o placa agujereada. Despus de cerrar cuidadosamente la tapa, se conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la temperatura en su interior. La salida continua del chorro de vapor a travs de la vlvula nos indica que el aire contenido en el interior del autoclave ha sido eliminado. La eliminacin de este aire es importante ya que la difusin del calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se alcanzar la temperatura esperada a la presin elegida y no se conseguir la esterilizacin. La vlvula se cierra cuando slo sale vapor de agua y, a partir de ese momento, comienza a elevarse la presin hasta una atmsfera sobre la presin normal, elevndose como consecuencia la temperatura hasta 121C. Transcurridos 15-20 minutos, en estas condiciones, el material se ha esterilizado. Es el incremento de temperatura por encima de los 100C y no la presin la que destruye los microorganismos. Si se esterilizan volmenes grandes de lquidos, es necesario mantener el material en el autoclave durante perodos de tiempo ms prolongados, pues se tarda ms en alcanzar los 121C en el

centro de un gran volumen. Una vez transcurrido el tiempo necesario, se apaga el autoclave y se deja descender la temperatura hasta que el indicador marque menos de 80C, que ser cuando la presin haya descendido hasta presin atmosfrica. Se abre ligeramente la espita para comprobar que no queda vapor a presin en el interior y ya se puede proceder a retirar todo el material esterilizado, dejndolo enfriar a temperatura ambiente. El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo, instrumentos, ropas, soluciones, jeringas, etc que puedan soportar altas temperaturas y una atmsfera de sobrepresin. Para la esterilizacin de materiales lquidos sensibles al calor, como algunos medios de cultivo, soluciones de antibiticos, enzimas, vacunas, etc. o tambin para gases, se utiliza la filtracin. En la esterilizacin por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la filtracin los retira de una forma mecnica, en lugar de destruirlos. La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeos como para retener clulas microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los denominados filtros de membrana y estn integrados por pequeas piezas de material sinttico, generalmente acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener poros con tamaos de 0,22 y 0,45 m, diseados para retener bacterias. La accin combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza qumica del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrar pasan a travs de la membrana con la ayuda del vaco generado, por ejemplo, con una bomba de vaco. Tanto los filtros de membrana como los equipos de filtracin con los que stos se usan deben ser esterilizados por otros mtodos, generalmente vapor saturado a presin en el autoclave. Los virus y algunas bacterias de tamao muy pequeo como, por ejemplo, los micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales.

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PRCTICA 3 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Introduccin
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varan segn las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos: - Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se siembra. - Han de mantenerse estriles hasta el momento de la siembra. Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categoras: Fsicos y qumicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presin osmtica; entre los requerimientos qumicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrgeno, las sustancias minerales, el oxgeno y determinados factores orgnicos de crecimiento. Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones adecuadas. 1.-Medios lquidos o caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos. 2.-Medios slidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les aade un agente solidificante. El agar es un polisacrido complejo que se obtiene de algas rodofceas de origen marino cuyas propiedades son de gran utilidad en la preparacin de medios de cultivo slidos: No es degradado enzimticamente por los microorganismos (a excepcin de algunos microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100C y permanece en estado lquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50C. Adems, una vez solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se lice. Generalmente el agar se aade, para solidificar un medio lquido, en una concentracin del 1,5%. Los medios con agar se envasan en tubo o en placa de Petri. 3.-Medios semislidos: Son similares a los medios slidos, pero la concentracin del agente solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los microorganismos. 4.-Medios fluidos: Son medios lquidos a los que se aade una baja proporcin de agar (por ejemplo, 0,075%), lo que les confiere un mayor viscosidad. Su uso es comn en la determinacin del tipo respiratorio de los microorganismos. B) Por su composicin 1.-Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos, ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Muchos de sus componentes proceden de la degradacin parcial de tejidos o productos animales, de plantas o de microorganismos que son fuente de aminocidos, azcares, lpidos, vitaminas y minerales. Ejemplos de dichos componentes son las peptonas o triptonas (protenas animales digeridas enzimticamente), el extracto de carne y el extracto de levadura. Como ya se ha mencionado, en estos medios suelen encontrarse azcares pero 11

Objetivos
Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo.

Tipos de medios de cultivo

Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayora de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos slo la adicin de agua o la esterilizacin. Los medios de cultivo pueden clasificarse: A) Por el estado fsico en que se encuentran

en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa. Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el caldo nutritivo, que contiene peptona y extracto de carne. 2.-Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos qumicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. As, un medio definido que permita el desarrollo de un microorganismo hetertrofo y "poco exigente", como E. coli, debera contener sales inorgnicas y fuentes de carbono y nitrgeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y cobre, se encuentran generalmente presentes como contaminantes de los productos qumicos antes citados, en cantidades suficientes para el crecimiento. C) Por su utilizacin: Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos requerimientos nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra un microorganismo que se encuentre en un bajo nmero y que pueda ser enmascarado por otros microorganismos presentes en un nmero ms elevado. En esos casos es recomendable utilizar medios de cultivo que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva, favorezcan el crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser: 1.-Medios selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los dems. Algunos de estos medios contienen un agente selectivo como antibiticos, productos qumicos, colorantes, etc. Entre los agentes selectivos podemos citar el cloruro sdico, que en concentracin elevada inhibe la mayora de los microorganismos excepto los microorganismos halotolerantes, como son los estafilococos, o la azida de sodio, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro de la porfirina del sistema citocromo, permitiendo seleccionar los estreptococos, que carecen de este sistema, as como otros Gram positivos. De la misma manera, la bilis y sales biliares convierten los medios de cultivo a los que se aaden en selectivos para enterobacterias ya que, adems de inhibir a muchos microorganismos Gram positivos, en concentraciones

elevadas inhiben tambin a otras bacterias Gram negativas. Los colorantes, como el verde brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo tambin inhibidor para la mayora de las bacterias intestinales excepto para Salmonella. Este colorante es la base del medio Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento de Salmonella a partir de muestras fecales. Los medios selectivos pueden serlo tambin por su pH, as el agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias. 2.-Medios diferenciales: Son aquellos diseados para distinguir unos microorganismos de otros, a partir de una poblacin mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos medios de cultivo ponen de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. Por ejemplo, el agar sangre es un medio nutritivo enriquecido y es a la vez un medio diferencial, ya que permite reconocer aquellos microorganismos capaces de producir hemlisis. Otros medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradacin de un nutriente especfico (generalmente un azcar) por el cambio de color que se origina cuando ste es metabolizado, como en el caso del medio CLED. Los medios diferenciales pueden ser adems selectivos, si se aaden agentes que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos. En este caso va a ser posible distinguir diferentes tipos microbianos dentro del limitado grupo de microorganismos que pueden crecer. As, el medio Levine es selectivo para las bacterias Gram negativas por contener dos colorantes, eosina y azul de metileno, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. Es tambin un medio diferencial, porque distingue las bacterias que fermentan la lactosa (con produccin de cido) de las no fermentadoras. La formacin de cidos a partir de lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie de las colonias, que aparecen de color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre en el caso de E. coli, las colonias presentan adems un brillo metlico. El agar MacConkey es otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entricas; la fermentacin de lactosa con liberacin de productos cidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio.

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Figura 3.1: Preparacin de medios de cultivo

Figura original del "Manual Prctico de Microbiologa" (Daz y cols.)

Bao a 55C

MEDIOS LQUIDOS (CALDOS)

AGAR INCLINADO

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Preparacin de los medios de cultivo

La preparacin de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercializacin de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo slo necesario la adicin de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio lquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada. A continuacin el caldo se envasa en los recipientes adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizndolos. La preparacin de un medio slido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y aadir agar al 1,5% o bien utilizar un medio slido comercial. Independientemente de la forma elegida para hacerlo, la preparacin de los medios de cultivo slidos requiere procedimientos especiales, ya que el agar es insoluble en agua. Por ello, una vez aadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta 100C, para permitir que el agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes disueltos. El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan. Los medios slidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posicin vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posicin adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra. Si se desean preparar placas de Petri, se utilizar el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verter en placas vacas en un ambiente asptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estril en tubos, que se fundirn al bao Mara cuando se vayan a preparar las placas. Si se han de incorporar al medio compuestos termolbiles, como vitaminas o antibiticos, se esterilizarn stos por filtracin y se aadirn al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante. La conservacin de los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es preferible conservarlos a 4C para retrasar su deshidratacin.

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PRCTICA 4 OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS

Introduccin
La morfologa de los microorganismos puede examinarse de dos formas: Observando microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando clulas muertas teidas con colorantes. El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus caractersticas (morfologa, tamao, movimiento, etc). Sin embargo, las microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fcilmente al microscopio ptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ah que se utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles. Los colorantes son compuestos aromticos solubles en agua (generalmente en forma de sales), que contienen un in orgnico coloreado y otro in inorgnico. Pueden dividirse en dos grupos: cidos y bsicos. El colorante es cido si la porcin coloreada tiene carga negativa, es decir, si tiene un anin coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras de la clula que presenten la misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se denomina bsico si la porcin coloreada es el catin, cargado positivamente y con afinidad por estructuras de la clula con carga negativa, como es la superficie celular. Las bacterias toman mejor los colorantes bsicos, como son el cristal violeta, el azul de metileno y la safranina. La eosina es un colorante de tipo cido, as como la nigrosina.

EXAMEN EN FRESCO

Objetivo
Observar microorganismos vivos en el microscopio de campo claro. Estudiar su morfologa y agrupacin, apreciar las diferencias de tamao entre organismos procariticos y eucariticos y aprender a diferenciar el movimiento browniano de la movilidad de los microorganismos.

Material
Asa de siembra, portaobjetos y cubreobjetos (o portaobjetos excavados), cultivos de microorganismos (Proteus mirabilis y Saccharomyces spp.) y microscopio.

Tcnica
Para la observacin de microorganismos sin teir se pueden utilizar dos tipos de preparaciones: Montaje hmedo y montaje en gota pendiente. - En el primer caso, depositar una gota de la muestra tomada con asa de siembra previamente flameada, en un portaobjetos y colocar sobre la misma un cubreobjetos presionando suavemente. - En el segundo caso, depositar una gota de la muestra en el centro de un cubreobjetos limpio y colocarlo invertido sobre el pocillo de un portaobjetos excavado, de manera que la gota no se

Figura 4. 1. Montaje hmedo entre portaobjetos y cubreobjetos

Figura 4. 2. Montaje en gota pendiente.

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mueva ni tome contacto con los lados o el fondo de la depresin. Utilizar el microscopio con el objetivo de 40 aumentos, disminuyendo la cantidad de luz incidente sobre la muestra con ayuda del diafragma o bajando el condensador. Un exceso de luz dificultar la observacin de los microorganismos, ya que poseen el mismo ndice de refraccin que el medio circundante (el vidrio del portaobjetos y el lquido en el que se encuentran suspendidos). Si se utiliza el objetivo de inmersin se debe colocar una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos. Para reducir la evaporacin de la muestra con el calor desprendido por el foco luminoso y que los microorganismos pierdan su movilidad, debe realizarse la operacin rpidamente o bien sellar los bordes del cubreobjetos con parafina. Observar la forma y el tamao de los microorganismos, comparando las levaduras (clulas eucariticas) con las bacterias (clulas procariticas). Describir su movilidad, diferenciando el movimiento browniano, debido a la colisin de los microorganismos con las molculas del lquido que los rodea, de la verdadera movilidad. La movilidad se manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos a grandes distancias y en una direccin determinada, aunque a veces pueden apreciarse rotaciones o giros. Los desplazamientos cortos y sin sentido se deben al movimiento browniano.

3.-Tincin estructural: Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que pueden estar presentes en los microorganismos. En las tinciones estructurales se colorea nicamente una parte de la clula. Se utilizan este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cpsulas, endosporas, flagelos o inclusiones (almidn, polifosfato, etc.).

Tcnica general
En la mayora de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a continuacin: 1- Realizar una extensin con el asa de siembra esterilizada, para ello se toma una pequea gota de cada uno de los cultivos y se extiende en un portaobjetos limpio. Si el cultivo procede de un medio slido, se coloca una gota de agua en el portaobjetos y se mezcla con una pequea porcin de la muestra hasta formar una suspensin homognea, extendindola con el fin de obtener una fina pelcula. Posteriormente, se deja secar al aire o en la parte alta de la llama del mechero, pero no se debe eliminar el lquido calentando el portaobjetos a la llama porque pueden distorsionarse las clulas. 2- Fijar la muestra. La fijacin tiene como finalidad coagular el protoplasma de las clulas y hacer que se adhieran al portaobjetos, siendo el calor el mtodo ms utilizado para la fijacin, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol (metanol) u otros compuestos qumicos. La fijacin con calor se recomienda cuando se trabaja con muestras de un cultivo slido; en muestras obtenidas de un cultivo lquido es mejor hacer la fijacin con metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor nmero de clulas. Es necesario que la extensin se haya secado antes de proceder a la fijacin, por ello se debe esperar hasta que el lquido de la misma se evapore. La fijacin por calor se lleva a cabo pasando varias veces la preparacin seca a travs de la llama de un mechero, con la extensin hacia arriba. El calor desnaturaliza las protenas y suele matar al microorganismo. Es importante no excederse en este proceso, para evitar que las bacterias se deformen o se rompan, siendo suficiente que el portaobjetos se note caliente sobre el dorso de la mano, pero no demasiado. 3- Realizar la tincin. Para ello es necesario cubrir la preparacin con abundante colorante y dejarlo actuar durante algn tiempo. 4- Pasado ese tiempo, lavar con agua las preparaciones teidas para eliminar el exceso de colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo del portaobjetos, que se mantendr inclinado durante este proceso. No se debe dirigir el

TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS

Existen distintos tipos de tincin: 1.-Tincin simple: Aquella en la que slo se utiliza un colorante, que generalmente tie a los microorganismos. Este tipo de tincin se denomina directa. Si el colorante proporciona una coloracin al fondo, sin alterar el aspecto de las clulas, que permanecen sin teir, la tincin se denomina negativa. La tincin simple permite observar morfologa celular, tamao y agrupacin de los microorganismos. 2.-Tincin diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en funcin de diferencias en su estructura y composicin qumica. La tincin de Gram y la cido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la pared celular bacteriana, son las ms utilizadas.

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Figura 4.3. Tcnica de extensin de una muestra sobre portaobjetos.

agua con demasiada fuerza sobre la preparacin para no arrastrar la muestra. 5- Eliminar el exceso de agua del portaobjetos golpendolo ligeramente con cuidado por el canto. Permitir que se seque la preparacin, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien dejndola secar al aire, aunque lleva ms tiempo. 6- Examinar la preparacin al microscopio, con el objetivo de inmersin (100x), colocando, previamente, una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin.

Material
Asa de siembra, portabojetos, cultivos bacterianos de microorganismos (Escherichia coli y Staphylococcus aureus), colorantes, microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica
1- Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y proceder a su fijacin. 2- Realizar la tincin cubriendo la preparacin con abundante colorante y dejarlo actuar durante algn tiempo. Para la fuchsina fenicada bastan de 15 a 30 segundos, para el cristal violeta es suficiente de 30 a 45 segundos y para el azul de metileno de 3 a 5 minutos. 3- Lavar con agua las preparaciones teidas y continuar con la tcnica tal y como se indica previamente. 4- Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin. Observar la forma y dispo-

TINCIN SIMPLE

Objetivo
Estudiar las caractersticas de los microorganismos en cultivo, es decir, tamao, forma y agrupacin de las clulas.

Figura 4.4. Procedimiento general para realizar una tincin.

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sicin de los microorganismos teidos con el colorante.

Tincin de Gram
Es uno de los procedimientos de tincin ms tiles en la identificacin de microorganismos, ya que divide a stos en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. En esta tcnica es necesario utilizar varias soluciones: 1.- Un primer colorante bsico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y que reacciona con las clulas (cargadas negativamente), colorendolas. 2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las clulas. Parece ser que el mordiente (solucin diluida de yodo) se combina con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la clula. 3.- Un agente decolorante, como el etanol de 95% o una solucin de alcohol:acetona (3:1), que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer colorante de algunas bacterias, decolorndolas. 4.- Un colorante de contraste, igualmente de carcter bsico pero de distinto color que el primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teir slo a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Los organismos que resisten la decoloracin y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecern de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos. Aquellos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloracin, se clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglucano, mientras que en Gram negativas, aunque la pared est tambin constituida por pptidoglucano, es ms delgada y presenta adems una membrana externa con lipopolisacridos. Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratacin y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipdica ms externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano. La tincin de Gram es ms reproducible cuando se aplica a cultivos jvenes de bacterias, ya que las bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden aparecer como Gram negativas.

TINCIN NEGATIVA

Objetivo
Conocer el tamao y la morfologa de los microorganismos, realizando una coloracin del fondo, sin que se coloreen las bacterias o las estructuras que se tratan de observar.

Material
Asa de siembra, portaobjetos, cultivo bacteriano de microorganismos (Escherichia coli y Staphylococcus aureus), nigrosina al 10%, microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica
1- Depositar una gota de solucin de nigrosina al 10% sobre un portaobjetos. 2- Homogeneizar sobre dicha gota la muestra microbiolgica con el asa de siembra previamente esterilizada. 3- Dejar secar al aire. 4- Examinar la preparacin con el objetivo de inmersin. Los microorganismos aparecern sin teir, en contraste con el fondo oscuro, pudindose apreciar su tamao, forma y agrupacin caractersticas Alternativamente, esta tincin se puede realizar con una cierta cantidad de sarro dentario, extrado recientemente con un palillo estril,

TINCIN DIFERENCIAL
La tincin diferencial colorea selectivamente ciertos tipos de clulas, ya que los colorantes que se utilizan reaccionan de modo diferente con los distintos microorganismos, generalmente debido a diferencias en la estructura y/o composicin qumica de la pared celular de stos. Estas tcnicas son de gran inters en la identificacin y la clasificacin de las bacterias, y la ms utilizada es la tincin de Gram.

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Objetivo
Aprender una tcnica de coloracin diferencial e interpretar los resultados obtenidos en la misma, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram negativas.

porque sus paredes celulares contienen un elevado porcentaje de lpidos (en su mayora cidos miclicos). Siendo, por ello, impermeables a los colorantes y a otros compuestos qumicos en solucin acuosa. Esta caracterstica hace que estos microorganismos no se coloreen bien con los reactivos de la tincin de Gram. Debido a esta gruesa capa de compuestos lipdicos en su pared, se deben utilizar mtodos especiales para forzar la entrada del primer colorante utilizado (fucsina fenicada). De ah, que se caliente la preparacin cubierta con este colorante durante un tiempo establecido (el fenol tambin facilita la entrada de la fucsina). Una vez que el colorante ha penetrado en la pared celular, la decoloracin con cido y con alcohol resulta tan difcil que dichos microorganismos permanecen coloreados de rosa, mientras que el resto de las bacterias tomarn el colorante de contraste, azul de metileno. Esta tincin tiene una gran aplicacin en clnica, ya que permite diferenciar microorganismos patgenos como Mycobacterium tuberculosis, en muestras patolgicas como esputos y secreciones bronquiales.

Material
Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianos de microorganismos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Neisseria spp.), colorantes, solucin de lugol, etanol de 95% o solucin de alcohol:acetona (3:1), microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica
Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que debern encontrarse en fase exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la fijacin, siguiendo la tcnica ya descrita. Para la coloracin se seguir el siguiente protocolo (modificacin de Hucker): 1- Teir durante un minuto con la solucin cristal violeta. 2- Lavar el exceso de colorante con agua. 3- Cubrir la extensin con una solucin diluida de yodo (lugol), que actuar como mordiente, durante un minuto. 4- Lavar con agua el exceso de lugol. 5- Decolorar con etanol de 95%, cubriendo la preparacin y dejando actuar durante 30 segundos. Alternativamente, se puede utilizar una solucin de alcohol:acetona (3:1), dejndola resbalar unos segundos sobre la muestra. 6- Lavar con agua abundante para eliminar el resto del disolvente. 7- Colorear con safranina durante un minuto (coloracin de contraste). 8- Lavar con agua y dejar que la preparacin se seque. 9- Examinar las preparaciones al microscopio, con aceite y usando el objetivo de inmersin. Las bacterias Gram positivas aparecern coloreadas de violeta, mientras que las Gram negativas se observan de color rosa.

Objetivo
Aprender una tcnica de coloracin diferencial, estudiar la morfologa y las propiedades de los microorganismos cido-alcohol-resistentes y diferenciar estos microorganismos de otros que no lo son.

Material
Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianos de microorganismos (Mycobacterium smegmatis y Staphylococcus aureus), colorantes, solucin cido-alcohlica (3% HCl en etanol 95 %) o bien cido ntrico al 33% y etanol de 95%, microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica
A. Mtodo de Ziehl-Neelsen 1- Preparar una extensin que contenga una mezcla de Staphylococcus aureus y Mycobacterium smegmatis, secar y fijar como ya se ha descrito. 2- Cubrir la preparacin completamente con fucsina fenicada y calentar cuidadosamente a la llama de un mechero hasta emisin de vapores, evitando la ebullicin. Se realiza invirtiendo el mechero y pasando la llama bajo la preparacin peridica19

Tincin de cido-alcohol-resistentes
Es otra importante tincin diferencial que permite distinguir aquellas bacterias que una vez teidas resisten a la decoloracin por cidos y alcoholes. Estas bacterias pertenecen a los gneros Mycobacterium y Nocardia y se caracterizan

mente. Esta operacin se repite durante 5 minutos, aadiendo colorante conforme ste se evapora. La preparacin no debe quedar seca en ningn momento. 3- Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 4- Decolorar mediante la adicin de 8 10 gotas de cido ntrico al 33% y dejar actuar a temperatura ambiente de 30 a 40 segundos. Lavar con agua y decolorar con etanol de 95% hasta que la muestra tome un ligero color rosa (unos 30 segundos). Alternativamente se puede decolorar con solucin cido-alcohlica durante 20 segundos. 5- Lavar nuevamente con agua y hacer la coloracin de contraste aplicando solucin acuosa de azul de metileno o bien azul de metileno de Loeffler durante un minuto. 6- Lavar con agua el exceso de colorante y secar la preparacin como ya se ha indicado. 7- Examinar la muestra teida al microscopio con el objetivo de inmersin. Los bacilos cido-alcohol-resistentes son largos y finos y aparecern en grupos, teidos de color fucsia, mientras que las clulas que no son cido-alcohol-resistentes aparecern de color azul, tras la tincin del contraste. B. Mtodo en fro o de Kinyoun Se trata de una modificacin del mtodo anterior en la cual el proceso de tincin se realiza de la manera siguiente: 1- Preparar una extensin de la muestra, secar y fijar como se ha descrito. 2- Cubrir la preparacin con fucsina fenicada de Kinyoun y dejar actuar durante 5-15 min a temperatura ambiente. 3- Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 4- Decolorar la preparacin con solucin cidoalcohlica durante 20 segundos. 5- Lavar nuevamente con agua y hacer la coloracin de contraste aplicando solucin acuosa de azul de metileno o bien azul de metileno de Loeffler durante un minuto. 6- Lavar con agua el exceso de colorante y dejar secar la preparacin. 7- Examinar la muestra teida al microscopio con el objetivo de inmersin. Los microorganismos cido-alcohol-resistentes aparecern teidos de color fucsia, mientras que las clulas no cidoalcohol-resistentes aparecern de color azul.

nismos que carecen del contraste necesario para poderse observar con el microscopio ptico. Los procedimientos y colorantes utilizados permiten teir selectivamente una porcin de la clula, como pueden ser endosporas, flagelos, cpsulas, etc.

Tincin de esporas (endosporas)

Las endosporas son estructuras que se forman en el interior de ciertos tipos de bacterias, entre los que destacan las pertenecientes a los gneros Clostridium y Bacillus. A diferencia de la clula vegetativa de la que procede, la endospora es resistente a factores ambientales adversos: Altas temperaturas, compuestos qumicos txicos y tambin a los colorantes. Sin embargo, existen colorantes como el verde malaquita que, con ayuda del calor, pueden penetrar en ella. Una vez teidas, no perdern el colorante en el lavado con agua y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el colorante de contraste. La posicin y morfologa de las esporas en el interior de la bacteria tiene inters taxonmico, ya que es de utilidad para diferenciar especies dentro de un mismo gnero.

Objetivo
Aprender una tcnica de tincin estructural e interpretar los resultados obtenidos, reconocer las esporas teidas y observar su forma y su localizacin en las bacterias.

Material
Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianos de microorganismos (Bacillus subtilis, Bacillus cereus y Bacillus sphaericus), colorantes, microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica (mtodo de Wirtz)

Los cultivos bacterianos debern encontrarse en fase estacionaria, para que se favorezca la esporulacin. Con ellos se preparan extensiones en portaobjetos y tras secar al aire se fija con calor segn ya ha sido indicado. 1- Se cubre la preparacin con solucin de verde malaquita, calentando con el mechero hasta la emisin de vapores. Se realiza invirtiendo el mechero y pasando la llama bajo la preparacin peridicamente. Esta operacin se repite durante 5 minutos, evitando que la muestra hierva y que se evapore completamente el colorante, aadiendo ms colorante en caso necesario. 2- Lavar con agua el exceso de colorante.

TINCIN ESTRUCTURAL
Las tinciones estructurales se utilizan para poner de manifiesto partes especficas de los microorga-

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3- Aplicar la solucin de safranina, como colorante de contraste, durante 30 segundos. 4- Lavar con agua y secar la preparacin 5- Examinar con objetivo de inmersin, anotando la morfologa y disposicin de las endosporas en las dos especies de Bacillus. Las esporas de B. subtilis son ovaladas y aparecen en posicin subterminal no deformante, coloreadas de verde, en el interior de las formas vegetativas, con forma bacilar y que estn teidas de rosa. Las esporas de B. sphaericus son esfricas, aparecen en posicin terminal, estando la clula deformada por el tamao de la espora.

de metileno alcalina de Loffler. Se deja actuar de 3 a 5 minutos. 2- Eliminar el colorante con agua y secar al aire o con ayuda de un papel secante. 3- Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin, observando los grnulos metacromticos coloreados de azul intenso, mientras que el citoplasma celular aparece de color azul ms claro. B. Mtodo de Albert 1- Aplicar sobre la muestra seca y fijada suavemente al calor, el colorante de Albert y teir durante 5 minutos. Lavar con agua el exceso de colorante y aplicar una solucin de lugol dejando actuar durante 5 minutos. 2- Lavar con agua y dejar secar. 3- Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin. En este caso los corpsculos metacromticos se observan como puntos verde oscuro o negros dentro de una clula de color verde plido.

Tincin de corpsculos metacromticos

Los corpsculos metacromticos, tambin denominados grnulos de volutina, son inclusiones citoplasmticas que aparecen en algunas bacterias y que, aunque su funcin no es conocida en detalle, podran considerarse una reserva de energa. Estn constituidos principalmente por polifosfatos y presentan una gran afinidad por colorantes bsicos, de manera que cuando stos se utilizan para teir las bacterias, los corpsculos metacromticos se tien ms intensamente que el resto de los componentes celulares. Aunque estas inclusiones aparecen en muchos tipos de bacterias, su presencia resulta de especial inters en microorganismos patgenos como es Corynebacterium diphtheriae, siendo una prueba ms para su identificacin.

Tincin de cpsulas
Las cpsulas son estructuras producidas por algunas bacterias bajo determinadas condiciones ambientales que juegan un papel importante en la patogenicidad del microorganismo, interfiriendo con la accin fagoctica de los leucocitos. Por su composicin qumica no se tien normalmente con colorantes bsicos, como cristal violeta o safranina, de ah que, aunque existen varios mtodos para su observacin, el ms simple consiste en hacer una tincin negativa con tinta china o nigrosina. Las cpsulas, al estar constituidas por polmeros coloidales muy hidratados, se distorsionan con facilidad y se contraen en los pasos de desecacin y fijacin, por lo que es conveniente hacer lun examen en fresco de las mismas utilizando la tcnica del montaje hmedo.

Objetivo
Demostrar la presencia de corpsculos metacromticos en algunas bacterias.

Material
Asa de siembra, portaobjetos, muestra de yogur, colorantes, solucin de lugol, microscopio y aceite de inmersin. Lactobacillus delbrueckii sub. bulgaricus y Streptococcus thermophilus forman parte de la biota caracterstica del yogur, presentando la primera especie corpsculos metacromticos.

Objetivo
Poner de manifiesto la presencia de cpsulas bacterianas y observar su morfologa.

Tcnica
Hacer las preparaciones usuales con las bacterias, evitando un exceso de calor en la fijacin y en el secado. Se pueden seguir dos procedimientos: A. Mtodo de Leffler 1- Aplicar sobre la muestra, seca y fijada suavemente a la llama del mechero, la solucin de azul

Material
Asa de siembra, portaobjetos y cubreobjetos, cultivo bacteriano de microorganismos (Klebsiella pneumoniae), nigrosina al 10% o tinta china, papel de filtro, microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica
1- Colocar un asa de solucin de nigrosina o de

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tinta china en un portaobjetos y mezclar con un asa de cultivo bacteriano. 2- Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la muestra evitando que se formen burbujas y presionar el mismo con un papel de filtro hasta obtener una capa fina del material que se va a observar, absorbiendo el papel secante el exceso de la muestra. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las manos con jabn desinfectante.

3- La observacin de la muestra se hace con objetivo de 40 aumentos o con objetivo de inmersin, utilizando en este caso, una gota de aceite de inmersin. Conviene cerrar el diafragma del condensador para incrementar el contraste de las clulas. Para retrasar la evaporacin de la muestra deben sellarse los bordes del cubreobjetos con aceite de parafina. Las cpsulas aparecern como zonas claras, transparentes, alrededor del microorganismo, que aparecer refrctil sobre un fondo oscuro.

Figura 4.3. Ejemplos de morfologa bacteriana al microscopio ptico.

A.Staphylococcus en tincin Gram (objetivo 100x) B. Escherichia en tincin simple (objetivo 100x) C. Bacillus en tincin Gram (objetivo 100x) D. Pseudomonas en tincin negativa (objetivo 100x) E. Bacterias de morfologa filamentosa (actinomiceto) en fresco (objetivo 40x) F. Observacin en fresco de clulas de la levadura Candida (objetivo 40x).

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PRCTICA 5 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Introduccin
En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros. Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. - Obtener colonias separadas, utilizando uno o ms mtodos. - Estudiar la morfologa de cada colonia.

Material
Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, jarra de anaerobiosis, placas de Petri con medio de cultivo slido y suspensiones de microorganismos.

Serie de diluciones conocidas de la muestra

Cayado

Figura 5.1. Siembra por extensin en superficie. Tcnicas

Existen distintas tcnicas que pueden utilizarse: a) Extensin en superficie con cayado Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previa-

Objetivos
- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri.

Figura 5.2. Siembra por estra en superficie.

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mente esterilizado, en todas las direcciones hasta que est completamente seco. Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de microorganismo. La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas. Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables (unidades formadoras de colonia o UFC) en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado. b) Estra mltiple en superficie Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar. Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias. c) Dilucin en masa En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La homogeneizacin de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posicin invertida). Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente slo se utiliza para determinar el nmero de microorganismos viables (unidades formadoras de colonia o UFC) en una muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o

microaerfilos. Medio fundido Medio atemperado fundido Inculo Inculo atempera calibrado calibrado

Homogeneizar Homogeneiz

Figura 5.3. Siembra por dilucin en masa o inclusin en agar. Condiciones de incubacin
Estas siembras pueden realizarse tanto con microorganismos aerbicos como anaerbicos. En el caso de los anaerobios, las placas no se llevan a incubar directamente a la estufa, sino que se introducen previamente en una jarra especial en la que exista un ambiente libre de oxgeno, denominada jarra de anaerobiosis (Fig. 5.4). Para crear un ambiente de anaerobiosis en el interior de estas jarras, se utiliza una preparacin comercial que elimina el O2 y desprende CO2. La atmsfe- de anaerobiosis. ra va reducindose y, para verificar que el ambiente es anaerbico, se coloca dentro de la jarra una tira de papel impregnada en un indicador que vira de color en presencia de CO2. El indicador suele ser azul de metileno, que es de color azul cuando se expone al aire y se vuelve incoloro cuando est totalmente reducido. Incubar las placas en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada.

Figura 5.4. Jarra

Resultados
a) Extensin en superficie: Tras el perodo de incubacin se examinarn las placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrn diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc. Esta tcnica de siembra, adems de permitir que

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se distingan las colonias por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La expresin de este recuento se hace en "unidades formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una procede de un slo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos stos tienden a formar agregados). A partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio. b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incubacin, se observarn las colonias aisladas en alguna regin de la placa inoculada. Con esta tcnica se logra la separacin de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien que proceden de muestras homogneas, pero en las que existe un elevado nmero. En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la morfologa colonial.

c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que estn en la superficie tendrn distintas caractersticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfologa. Como ya se ha comentado, esta tcnica generalmente se utiliza para el recuento de microorganismos viables (unidades formadoras de colonia o UFC) en una muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o microaerfilos.

Figura 5.6. Aislamiento y recuento por dilucin en masa. Figura 5.5. Aislamiento por estra en superficie.

Forma
Puntiforme

Borde
Entero

Elevacin
Plana Plana Elevada Elevad Convexa Convex Crateriforme Crateriform Acuminada Acumina

Superficie
LisaLisa o o rugosa

Puntifor me Circular Circular

Rizoide

Entero

Ondulado

Ondulad o
Lobulado

Mate o Mate o brillante

Seca o cremosa Seca o Invasiva o Invasiva o superficial

Rizoide Irregular Lobulad o

Filamentoso Filamentoso

Irregular

Filamentosa

Filamentos a

Figura 5.7. Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio slido.

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PRCTICA 6 SIEMBRA Y CULTIVO DE MICRORGANISMOS

Objetivos
- Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo: caldo, agar inclinado y medio semislido sembrado en profundidad. - Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo. - Comprobar la movilidad de determinados microorganismos. - Comprobar el crecimiento de microorganismos tanto aerobios como anaerobios utilizando las tcnicas apropiadas.

Tcnica
a) En medio lquido con asa: Transferir aspticamente, con el asa de siembra, una pequea muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recin sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento. b) En medio lquido con pipeta: Introducir aspticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada en el medio lquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estril. Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada.

Material
Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur o pipetas graduadas, parafina estril, suspensin de microorganismos y medios de cultivo lquidos, fluidos, semislidos y slidos.

Figura 6.1. Inoculacin de un caldo de cultivo.

Figura 6.2. Siembra en un tubo con agar inclinado.

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Figura 6.3. Inoculacin de un medio semislido por picadura con hilo de siembra.
c) En medio semislido: La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporcin menor de agar que los medios slidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirndolo A B posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivn podra originar un patrn de crecimiento que se interpretara errneamente como movilidad bacteriana. Incubar durante 2448 horas a la temperatura ptima de crecimiento. d) En medio slido (agar inclinado): Figura 6.4. Con el asa de siem- Aspecto de cultivos bra estril tomar los en agar inclinado (A) microorganismos de y semislido (B) tras la muestra e inocular la incubacin. el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea inclinada. Incubar en estufa durante 28-48 horas a la temperatura ms adecuada. e) Siembra en profundidad En tubo con medio semislido vertical o fluido: Se utilizan los medios V.L. (Viande et levures, 28 Buttiaux et al.) o medio fluido de tioglicolato, que deben ser hervidos en un bao Mara durante 15 20 minutos, antes de ser inoculados, para eliminar el oxgeno disuelto. Sembrar los medios, una vez atemperados a 45-50C. Con el asa de siembra o con una pipeta Pasteur estril, con el extremo cerrado, se realiza un movimiento en espiral de arriba a abajo y de abajo a arriba, para distribuir la muestra homogneamente, sin agitar el tubo durante la siembra para evitar la entrada de aire. Con la misma finalidad, solidificar rpidamente el medio de cultivo sumergiendo el tubo en agua fra. Los medios VL y tioglicolato pueden utilizarse tambin para determinar el tipo respiratorio, como se describe en los resultados (Fig. 6.6). Tambin es posible realizar esta prueba en caldo o en placa: Si el medio utilizado es lquido, agregar una capa de parafina estril para impedir la difusin del O2 al medio. Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada. En placa: Transferir 1 ml del inculo a una placa de Petri estril vaca y aadir el medio de cultivo fundido y atemperado a 45-50C, homogeneizando mediante giros repetidos de la placa, hasta que el inculo se haya distribuido uniformemente. Una vez solidificado el agar, aadir una segunda capa de medio de cultivo.

Resultados
a y b) En los cultivos lquidos no tiene lugar la formacin de colonias, por lo tanto se examinar la existencia de enturbiamiento ms o menos intenso, la formacin de una pelcula o velo sobre la superficie, la aparicin de sedimento en el fondo del tubo, etc. La utilizacin de medios de cultivo lquidos permite la obtencin de una poblacin microbiana grande, con un elevado nmero de microorganismos, para ser utilizados posteriormente.

c) En medio semislido se podr comprobar si el microorganismo es o no mvil, ya que en el primer caso se observar que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectndose turbidez. Por eso es tan importante que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por el mismo sitio de inoculacin. Los microorganismos inmviles crecern nicamente a lo largo de la picadura (ver Fig. 6.5). Este tipo de siembra en picadura sirve, tambin, como mtodo de conservacin de microorganismos anaerobios facultativos. d) En medio slido (agar inclinado) se observar el aspecto general del medio y la aparicin de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerbicos o anaerbicos facultativos. Adems, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos perodos de tiempo, a temperaturas de 4C.

e) En medio semislido vertical (V.L.) o fluido (tioglicolato) los microorganismos pueden crecer en la parte superior del medio si son aerobios estrictos, en la zona inferior del medio si son anaerobios estrictos y a lo largo de todo el medio, en el caso de anaerobios aerotolerantes. Los anaerobios facultativos crecern tambin por todo el tubo, aunque preferentemente en superficie. Por ltimo, si se trata de microorganismos microaerfilos, aparecer crecimiento en una pequea zona intermedia, prxima a la superficie (ver Fig. 6.6). Observar tambin el aspecto del crecimiento y el desprendimiento de gas. En la siembra en placa en profundidad, se debe anotar si ha habido crecimiento de colonias en toda la masa del agar.

Figura 6.5. Prueba de movilidad en agar semislido.

1. Microorganismo mvil. 2. Microorganismo inmvil. 3. Tubo control sin inocular.

Figura 6.6. Comportamiento de los microorganismos en tubos con medio VL.

1. Aerobios estrictos 2. Anaerobios estrictos 3. Anaerobios facultativos 4. Anaerobios aerotolerantes 5. Microaerfilos

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PRCTICA 7 CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL

Introduccin
El control microbiolgico ambiental es necesario para la evaluacin de la calidad microbiolgica de zonas estriles en la industria farmacutica y quirfanos, as como en estudios de la microbiota en ambientes naturales. El aire contiene en suspensin diferentes tipos de microorganismos, especialmente bacterias y hongos. La presencia de uno u otro tipo depende del origen, de la direccin e intensidad de las corrientes de aire y de la permanencia y supervivencia de los microorganismos. Algunos se encuentran en forma de clulas vegetativas, pero lo mas frecuente son las formas esporuladas debido a que sobreviven mejor en atmsferas secas. En el aire se aislan bacterias esporuladas, tpicamente del gnero Bacillus, as como actinomicetos. Adems son frecuentes los cocos Gram positivos como Micrococcus y Kocuria y los bacilos pleomrficos Gram positivos de los gneros Arthrobacter, Corynebacterium y otros. Los bacilos y cocos Gram negativos se encuentran en escasa proporcin debido a que no sobreviven a la desecacin. Respecto a los hongos, los que ms frecuentemente se aslan son hongos filamentosos como Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria o Mucor y levaduras como Rhodotorula o Candida La tcnica que se emplea rutinariamente en anlisis microbiolgico ambiental es la sedimentacin por gravedad. Este mtodo permite determinar la carga microbiana de un ambiente problema. Los microorganismos suspendidos en el polvo o aerosoles sedimentan sobre la superficie de un medio rico, no selectivo o bien en medios selectivos contenidos en placas de Petri. Una vez tomada la muestra mediante la apertura de las placas en el ambiente deseado, stas se incubarn en las condiciones que favorezcan el crecimiento del tipo de microorganismos que deseemos estudiar, normalmente a temperatura ambiente y en aerobiosis.

Figura. 7.1. Control microbiolgico ambiental.

Aspecto tpico de una placa de gravedad mostrando la diversidad microbiana de un ambiente.

Material
Asa de siembra, una placa de Petri con agar triptona soja, una placa de Petri con agar Sabouraudcloranfenicol, portaobjetos, colorantes para tincin simple y de Gram, solucin de azul de lactofenol, cinta adhesiva transparente, microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica
Llevar las placas cerradas, con cuidado de que no se abran durante el transporte, al ambiente cuya carga microbiolgica se desee evaluar. Retirar la tapa y dejar las placas abiertas, durante 30 minutos, en un lugar representativo de dicho ambiente. Pasado este tiempo, cerrar las placas e incubarlas. La placa de agar triptona soja se incuba durante 2-das a 30-37 C, con el fin de estudiar la aparicin de colonias bacterianas. La placa de Sabouraud-cloranfenicol, medio selectivo para hongos, se incuba de 3 a 5 das a 22-24 C.

Objetivo
Observar y caracterizar someramente, mediante observacin macroscpica y microscpica, la diversidad microbiana de un ambiente elegido por el alumno.

Resultados
Se observar la aparicin paulatina de diversos tipos de colonias. Aparecern en primer lugar 31

colonias bacterianas y al cabo del segundo o tercer da de incubacin se observarn las colonias de levaduras, que se asemejan a las bacterianas, as como las caractersticas colonias algodonosas de los hongos filamentosos. Se anotarn las caractersticas ms importantes de las colonias, segn la descripcin que aparece en la figura 5.7 y se realizar un estudio microscpico de cada una de ellas. Tras la tincin de Gram de las distintas colonias bacterianas que aparezcan en la placa, se observar todo tipo de microorganismos, con predominio de cocos y bacilos esporulados Gram positivos, frecuentemente dispuestos respectivamente en sarcinas y en cadenas. Los bacilos irregulares que se observaran, tienen pared de Gram positivos, pero se decoloran fcilmente y en A B C

las preparaciones aparecern como Gram negativos o teidos de forma irregular, en bandas o en los extremos. Estos bacilos son muy pleomrficos: unos tienen forma de maza, se agrupan en empalizada o recordando letras chinas; otros poseen un ciclo de crecimiento de bacilo a coco y algunos originan filamentos. La observacin microscpica de hongos filamentosos se realizar mediante tincin con azul de lactofenol. Para ello, se pone una tira de cinta adhesiva transparente sobre el micelio, con el fin de que las hifas y esporas queden adheridas. Se aade una gota de azul de lactofenol en el centro del portaobjetos y se adhiere la cinta adhesiva al mismo. El color azul facilita la visualizacin del micelio en fresco, utilizando el objetivo de 40 aumentos. D E

Figura 7.2. Morfologa de algunas bacterias comunes en el aire al microscopio ptico.

A. Micrococcus. Tincin de Gram (obj. 100x). B. Bacilos regulares (Bacillus) en tincin Gram (obj. 100x). C y D. Bacilos irregulares: Corineformes (C) y Arthrobacter (D). Tincin de Gram (obj. 100x). E. Actinomiceto. Tincin de azul de lactofenol (obj. 40x). A B C

Figura 7.3. Morfologa de hongos al microscopio ptico.

A. Levaduras en tincin con cristal violeta (obj. 100x). B. Penicillium. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x). C. Cladosporium. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x). D. Mucor. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x). E. Aspergillus. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x). F. Alternaria. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x).

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PRCTICA 8 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO BACTERIANO

Introduccin
El aislamiento de los distintos microorganismos contenidos en una muestra problema se lleva a cabo sobre la superficie de un medio de cultivo slido contenido en una placa de Petri, siguiendo la tcnica de la siembra por estra mltiple en superficie. Los medios de cultivo que se van a utilizar dependen del tipo de muestra y de los microorganismos presentes en ella, pero deben ser medios slidos en placa. As, se usarn: Medios nutritivos generales, medios selectivos, medios diferenciales o bien medios enriquecidos, si los microorganismos que se van a aislar son nutricionalmente exigentes. Uno de los medios de cultivo que se podran utilizar con este fin es el agar CLED, un medio diferencial que contiene lactosa y un indicador de pH (azul de bromotimol) que permite apreciar la fermentacin cida del azcar por el viraje del indicador de pH, de color verde a amarillo. Su deficiencia en electrolitos impide la invasin de la placa por microorganismos mviles, como son las especies del gnero Proteus, facilitando as su aislamiento y posterior identificacin; la presencia de cistina permite el crecimiento de los coliformes dependientes de ella. La identificacin de los distintos microorganismos aislados se lleva a cabo realizando una serie de pruebas bioqumicas, por las que se van a poner de manifiesto la produccin de ciertas enzimas. En algunas ocasiones es necesario emplear otros medios no bioqumicos, basados en tcnicas serolgicas. sitarn otros medios de cultivo y diferentes reactivos, que se indican en cada caso concreto.

Tcnica
Para el aislamiento de bacterias, se realiza la siembra de una muestra del cultivo mixto, mediante la tcnica de estria mltiple en la superficie del medio CLED. Incubar las placas en posicin invertida a 37 C durante 24-48 horas. Tras la incubacin, se observarn los distintos tipos de colonias desarrolladas en la superficie del medio. Se debern anotar las caractersticas ms importantes que puedan ser tiles en una identificacin preliminar. Para estudiar la pureza de los cultivos se llevar a cabo una tincin de Gram de los distintos tipos de colonias aisladas. Posteriormente, se efectuar un nuevo aislamiento en placas de agar nutritivo con cada una de las diferentes colonias crecidas en las placas de CLED. Despus de incubar 24 horas a 37 C, se proceder a la identificacin de cada uno de los distintos cultivos puros que se hayan obtenido.

Identificacin
Con cada uno de los cultivos puros se realiza una tincin de Gram.

IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS

Con los cultivos Gram positivos que presentan morfologa de cocos se realizan distintas pruebas como son:

Objetivo
Aplicar la tcnica de la siembra por estra mltiple en superficie, para la obtencin de cultivos axnicos o puros para, posteriormente, proceder a la identificacin de cada uno de los distintos microorganismos aislados.

Prueba de la catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos, excluyendo los estreptococos.

Material
Asa de siembra, cultivo mixto de bacterias, placas de agar CLED y agar nutritivo. Adems, dependiendo del microorganismo a identificar, se nece-

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Material
Agua oxigenada de 30 volmenes, cultivo bacteriano y portaobjetos.

negativa, se trata del gnero Streptococcus u otros relacionados y estudiaramos la hemlisis en agar sangre: - -hemlisis (hemlisis incompleta, color verdoso) - -hemlisis (hemlisis completa, incoloro) En el caso de cocos Gram positivos catalasa positiva se comprueba la utilizacin de la glucosa.

Tcnica
En un portaobjetos se depositan una o dos gotas de agua oxigenada de 30 volmenes y se pone en contacto con ella una colonia de los microorganismos a estudiar con ayuda del asa de siembra.

Utilizacin de la glucosa (O/F)

Es una prueba til para distinguir aquellos microorganismos que son incapaces de utilizar la glucosa anaerbicamente de aquellos que lo pueden hacer.

Interpretacin
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa positivo) del gnero Streptococcus (catalasa negativo). En el caso de cocos Gram positivos, catalasa

Material
Cultivo bacteriano, dos tubos con medio HughLeifson, pipeta Pasteur y un tubo con vaselina estril.

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Tcnica
Se utilizan dos tubos de medio de cultivo, que se hierven brevemente antes de utilizarlos para eliminar el oxgeno disuelto. Una vez atemperados, se inoculan con ayuda de una pipeta Pasteur, llegando al fondo y ascendiendo hacia la superficie. Dejar solidificar ambos tubos y recubrir uno de ellos con vaselina estril. Incubar a 37 C durante 48 horas.

espora (terminal, subterminal o central), su forma (ovales o esfricas) y si deforman o no a la clula, proporciona informacin til para la posterior identificacin de la especie. A continuacin cabe realizar una prueba de tipo respiratorio (siembra en profundidad en medio semislido vertical VL o en medio fluido de tioglicolato, como se describe en la prctica 6). Esto permitira distinguir entre los dos principales gneros: Clostridium (anaerobio) y Bacillus (aerobio o anaerobio facultativo). Algunos aspectos de la identificacin de especies del gnero Clostridium se tratan en la Prctica 12 de esta gua. Para distinguir las especies del gnero Bacillus, resulta til la realizacin de las siguientes pruebas: Tipo de crecimiento en caldo. Esta prueba se realiza inoculando el microorganismo en un tubo de caldo nutritivo e incubando a 30-37 C durante 24-72 horas estticamente. Es caracterstica la aparicin de crecimiento en la superficie del caldo formando un velo en algunas especies del gnero Bacillus (como B. subtilis). Otras originan en este medio turbidez (como B. cereus), sedimento y produccin de pigmentos. Tipo respiratorio. Esta prueba (ver prctica 6) tambin permite distinguir entre diferentes especies dentro del gnero Bacillus. Por ejemplo, la especie B. cereus es anaerobio facultativo mientras que B. subtilis es aerobio. Fermentacin de manitol y produccin de lecitinasa (medio de Mossel) Se siembra una placa de medio de Mossel mediante aislamiento por estra en superficie a partir de una colonia de Bacillus. Incubar a 30-37C durante 24 horas, en posicin invertida. Este medio es selectivo para Gram positivos, pues contiene polimixina B, que inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram negativas. Adems, se trata de un medio diferencial que nos permitir detectar las especies fermentadoras de manitol por el viraje a amarillo del indicador en presencia de cidos. Este medio tambin permite detectar las bacterias productoras de lecitinasa, que hidroliza la lecitina de la yema de huevo contenida en el medio formando un precipitado blanco opaco alrededor de la colonia. B. cereus da lugar a unas colonias incoloras-rosadas (manitol negativas) con halo opaco debido a la produccin de lecitinasa. Otras especies como, por ejemplo, B. subtilis dan lugar a colonias amarillas debido a la fermentacin del manitol y carentes de halo opaco.

Interpretacin
Las bacterias fermentadoras producen cido de la glucosa independientemente de la presencia de oxgeno (va fermentativa). Por tanto, los dos tubos viran a amarillo (+/+). En este caso, se tratara de un microorganismo del gnero Staphylococcus. Las bacterias que requieren O2 (respiracin aerbica; va oxidativa) slo utilizan la glucosa en el tubo descubierto. Dado que el medio es capaz de detectar la acidificacin producida por el CO2 disuelto slo virar a amarillo el tubo sin cubrir de vaselina (+/-). En este caso, se tratara de Micrococcus. Si no vira ninguno (-/-) la bacteria no utiliza la glucosa como fuente de carbono o bien lleva a cabo una fermentacin no cida. Para la posterior identificacin de las especies del gnero Staphylococcus recurriramos a otras pruebas bioqumicas, como son DNAsa y coagulasa.

IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM POSITIVOS

Con los cultivos Gram positivos con morfologa de bacilos se realiza una tincin de esporas por el mtodo de Wirtz, como se describe en el apartado correspondiente de la Prctica 4 de esta gua. - En el caso de que no sean formadores de esporas, se observar la morfologa. Si se trata de bacilos largos de forma regular, cabe sospechar de gneros como Lactobacillus, entre otros. Si, por el contrario, se observan formas irregulares, como de bastn, engrosadas en un polo, podra tratarse de bacterias corineformes, como las pertenecientes al gnero Corynebacterium. Otro gnero caracterstico es Arthrobacter, que aparece pleomrfico, mezclando formas cocoides y bacilares. - En el caso de bacilos Gram positivos con endosporas, la observacin de la posicin de la

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IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM NEGATIVOS

Con los cultivos de cocos Gram negativos se realizan las pruebas de la catalasa (ya descrita) y oxidasa; ambas son positivas en el caso de Neisseria y Moraxella. La identificacin se completara mediante pruebas bioqumicas, principalmente de fermentacin de azcares.

utilizacin de la glucosa (oxidativa o fermentativa) (ya descrita). Pseudomonas utiliza la glucosa por va oxidativa y Vibrio lo hace, adems, por va fermentativa. La incapacidad de utilizar glucosa por las dos vas mencionadas es una caracterstica importante de Alcaligenes. La identificacin de especies de Pseudomonas se hace por la produccin de pigmentos en agar F y agar P.

Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa)

Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de electrones en la respiracin aerbica, transfiriendo electrones al oxgeno, con la formacin final de agua.

Produccin de pigmentos
Es una prueba til para poner de manifiesto la formacin de compuestos pigmentados por microorganismos no fermentadores.

Material
Tiras de papel con reactivo de oxidasa, pipeta Pasteur y cultivo microbiano.

Material
Placas de agar F (medio King B) y agar P (medio King A) y cultivo bacteriano.

Tcnica
Con una pipeta Pasteur, cerrada y cargada de bacterias, se trazan rayas sobre una tira de papel impregnada en solucin acuosa al 1% de cloruro de tetrametil para-fenilen-diamina.

Tcnica
Inocular cada una de las placas de agar F y agar P con los microorganismos, trazando con el asa estras paralelas. Incubar a 37C durante 24 horas, en posicin invertida.

Interpretacin
En caso positivo el papel cambia de color pasando a prpura y negro en 10-20 segundos, como consecuencia de que el reactivo se oxida en presencia de citocromo c oxidasa formndose azul de Wuster. En caso negativo la tira de papel no cambia de color.

Interpretacin
La presencia de Pseudomonas aeruginosa sobre la placa de agar F se manifiesta por la aparicin de un pigmento amarillo fluorescente (fluorescena o pioverdina) y un pigmento azul (piocianina) sobre la placa de agar P. La composicin de sales de cada uno de estos dos medios potencia la produccin de uno de los pigmentos e inhibe la del otro. Sim embargo, P. fluorescens slo produce fluorescena.

IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

- La identificacin de los bacilos Gram negativos puede iniciarse con la prueba de la oxidasa (ya descrita). Cualquier organismo que d positivo en esta prueba queda excluido de la familia Enterobacteriaceae, cuyos miembros no poseen la enzima citocromo c oxidasa. Los microorganismos oxidasa positiva pueden clasificarse en fermentadores de glucosa y no fermentadores; por ello, estos dos grupos de microorganismos se identifican mediante la prueba de

Los microorganismos oxidasa negativa, se van a identificar mediante una serie de pruebas bioqumicas que comienzan con la siembra en medio Kligler. Segn los resultados obtenidos, se continuar con otras pruebas de identificacin: Produccin de indol, movilidad, crecimiento en citrato, produccin de ureasa, rojo de metilo, Voges-Proskauer y desaminacin de la fenilalanina.

Siembra en medio Kligler

Esta prueba se suele usar en la identificacin ini-

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cial de bacilos Gram negativos y especialmente de enterobacterias. En este estudio se observa la fermentacin de lactosa y/o glucosa con produccin de cido y/o gas y la produccin de SH2.

Material
Asa e hilo de siembra, tubos con medio Kligler y cultivo bacteriano.

ms aerbicas, all la bacteria respira y la produccin de cido es menor, permaneciendo esa zona de color rojo. Si el microorganismo sembrado no fermenta la glucosa con produccin de cidos, todo el tubo toma una coloracin roja. Incluso, una vez que la glucosa ha sido degradada la bacteria comienza a utilizar los aminocidos, liberndose aminas, que elevan el pH, por lo que el color rojo puede ser ms intenso. - Fermentacin de lactosa Se pone de manifiesto por el viraje a amarillo del indicador, tanto en el fondo del tubo como en la superficie. La concentracin de lactosa es diez veces mayor que la de glucosa, con lo que la produccin de cido formado es tan elevada que hace virar el indicador en todo el tubo. El hecho de que la fermentacin de lactosa enmascare la de la glucosa no tiene importancia, ya que para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar glucosa. Si la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa, una vez que la glucosa ha sido degradada, como ya se ha comentado, la bacteria comienza a utilizar los aminocidos, liberndose aminas, que neutralizan la pequea cantidad de cidos presentes en la porcin inclinada del medio y elevan el pH. Por lo tanto, la zona inclinada del tubo aparecer de color rojo intenso y el fondo de color amarillo debido a la fermentacin previa de la glucosa. - Produccin de gas La produccin de gas en la fermentacin se manifiesta por la aparicin de burbujas, rotura o elevacin del agar del fondo del tubo. - Produccin de SH2 Para detectar la produccin de SH2 a partir de tiosulfato sdico debe incorporarse al medio de cultivo un indicador, dado que el SH2 es incoloro. Para tal fin se suele utilizar alguna sal de hierro que reacciona con el SH2, para producir un precipitado negro de sulfuro de hierro. La produccin de SH2 tiene lugar en ambiente cido, de ah que el

Tcnica
Los tubos de medio Kligler se inoculan con el hilo de siembra, tomando microorganismos de la colonia que se va a identificar y haciendo una picadura hasta el fondo del tubo, continuando la siembra con asa por estra en la superficie. Incubar a 37C durante 24 horas y observar los resultados.

Interpretacin
Como ya se ha comentado, este tipo de siembra se realiza, en general, para la identificacin de enterobacterias. La interpretacin de los resultados se har de A B C D la forma siguiente: - Fermentacin de glucosa Se aprecia en el viraje a amarillo del indicador de pH (rojo de fenol) nicamente en la parte inferior del tubo. Esto es debido a la pequea proporcin de glucosa que existe en el medio (0,1%), que al ser fermentada en el fondo del tubo, donde existen condiciones de anaerobiosis, produce suficiente cido para que vire el indicador, pero no a medida que nos aproximemos a la superficie, donde las condiciones son

Amarillo Rojo

Negro

Figura 8.1. Distintos resultados de la prueba Kligler:

A: Glucosa +, Lactosa B: Glucosa +, Lactosa -, SH2 + C: Lactosa +, Gas + D: Lactosa +, SH2 +

precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la glucosa. As, un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro.

Reduccin de nitratos
La reduccin de nitratos a nitritos es una caracterstica propia de varios microorganismos que uti-

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lizan nitrato como aceptor final de electrones en la respiracin anaerbica. Esta prueba es til en la identificacin de microorganismos pertenecientes a las enterobacterias aunque tambin sirve para identificar otros microorganismos.

Interpretacin
El desarrollo de una coloracin roja en el medio de cultivo, tras la adicin de los reactivos, pone de manifiesto la presencia de nitritos y por tanto la prueba de reduccin de nitratos se considera positiva. Este color se debe a la formacin de un compuesto coloreado, denominado p-sulfobencenoazo--naftilamina. Si no se desarrolla color, la prueba puede considerarse negativa (no se han reducido los nitratos) o bien se han reducido originando otros compuestos (amonaco, nitrgeno molecular, xido ntrico u xido nitroso) por lo que la lectura se corresponde con un falso negativo. En este caso se puede aadir al medio de cultivo una pequea cantidad de polvo de zinc, que reduce los nitratos del medio a nitritos. El desarrollo de un color rojo, indica la existencia de nitratos en el medio y confirma que la reaccin es negativa.

Material
Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, solucin de cido sulfanlico al 8 por mil y solucin de -naftilamina al 5 por mil (ambos en cido actico 5N) y polvo de zinc.

Tcnica
Inocular el medio lquido e incubar a 37C durante 24-48 horas. Pasado ese tiempo, aadir al cultivo unas gotas de solucin de -naftilamina y unas gotas de solucin de cido sulfanlico. 38

Produccin de indol
El indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido triptfano. La presencia de la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la hidrlisis del triptfano y su desaminacin, produciendo indol, cido pirvico y amonaco.

slo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmvil o mvil.

Crecimiento en citrato
Algunos microorganismos utilizan el citrato presente en el medio de cultivo como nica fuente de carbono, esta caracterstica es importante en la identificacin de microorganismos pertenecientes a las enterobacterias.

Material
Medio de cultivo con peptona, cultivo bacteriano y reactivo de Ehrlich, o bien reactivo de Kovacs.

Tcnica
Inocular el medio con el microorganismo e incubar a 37C durante 24-48 horas. Transcurrido ese tiempo, aadir al cultivo 1 ml de reactivo de Ehrlich o de Kovacs (para-dimetilaminobenzaldehido en solucin), resbalando por la pared del tubo sin agitar.

Material
Un tubo con medio citratado de Simmons y cultivo bacteriano.

Tcnica
Sembrar en la superficie inclinada del medio e incubar a 37C durante 24-48 horas.

Interpretacin
La aparicin, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehdo del reactivo originando un complejo de color rojo.

Interpretacin
En caso positivo, el medio de cultivo vira de color verde a azul. Si el microorganismo utiliza el citrato como fuente de carbono, tambin utiliza las sales inorgnicas de amonio como fuente de nitrgeno, lo que da lugar a una alcalinizacin del medio. Esto se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH azul de bromotimol, de verde a azul intenso, a la vez que se observa crecimiento en la superficie.

Movilidad
Es otra caracterstica til en la identificacin de los microorganismos. Se puede llevar a cabo observando el crecimiento en un medio semislido.

Produccin de ureasa
La ureasa es una enzima presente en numerosos microorganismos. Esta enzima cataliza la hidrlisis de la urea, con produccin de dixido de carbono y amonaco, lo que causa una alcalinizacin del medio.

Material
Hilo de siembra, medio semislido (agar movilidad), y cultivo bacteriano.

Tcnica
Sembrar, por picadura, con hilo de siembra en medio semislido, incubando a 37C durante 48 horas.

Material
Un tubo con agar urea de Christensen y cultivo bacteriano.

Interpretacin
La baja concentracin de agar de este medio permite que las bacterias se desplacen si son mviles. Por ello, observando si el crecimiento est

Tcnica
Inocular el medio de cultivo mediante estra en superficie e incubar a 37C durante 24 horas.

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Interpretacin
Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome color fucsia, debido a la alcalinizacin del mismo por produccin de amonio a partir de la urea, que se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH (rojo de fenol).

Tcnica
Inocular el medio lquido e incubar a 37 C durante 24-48 horas. Despus de la incubacin, se aade a 1 ml del cultivo 0,5 ml de -naftol y 1 ml de solucin de sosa, agitando vigorosamente en presencia de oxgeno atmosfrico y se deja reposar durante 10 minutos.

Interpretacin

Prueba del rojo de metilo

Esta prueba consiste en comprobar si el microorganismo en estudio fermenta la glucosa con produccin de cidos (succnico, lctico, actico, etc.) o va cido mixta.

El desarrollo de un color rosa en el tubo, transcurridos 10 minutos desde la adicin de los reactivos, indica que la prueba es positiva, es decir, que la acetona se ha oxidado pasando a diacetilo.

Material
Un tubo de medio Voges-Proskauer, cultivo bacteriano y reactivo rojo de metilo.

Desaminacin de la fenilalanina (APP)

La fenilalanina es un aminocido cuya desaminacin por medio de una desaminasa, da lugar a la formacin de amoniaco y de cido fenilpirvico, el cual puede detectarse por la adicin de un reactivo.

Tcnica
Inocular el medio lquido e incubar a 37C durante 24-48 horas. Transcurrido ese tiempo aadir, a 2 ml del cultivo, 5 gotas de la solucin de rojo de metilo y agitar ligeramente.

Material
Un tubo de medio agar fenilalanina, cultivo bacteriano y solucin de cloruro frrico al 10%.

Interpretacin
En caso positivo aparece un color rojo estable, lo que indica una produccin de cidos elevada que disminuye el pH del medio. Un color anaranjado no indica que la prueba sea positiva, ya que otros microorganismos pueden producir pequeas cantidades de cidos.

Tcnica
Sembrar el microorganismo en la superficie del medio agar fenilalanina e incubar a 37C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo aadir 4 5 gotas de la solucin de cloruro frrico sobre la superficie del agar.

Interpretacin

Prueba de Voges-Proskauer
Consiste en comprobar si el microorganismo estudiado fermenta la glucosa siguiendo la va butiln gliclica, detectando un producto intermedio en la reaccin que es el acetil-metil-carbinol o acetona.

La prueba se considera positiva cuando aparece una coloracin verde intensa. Esto se debe a que las bacterias que poseen fenilalanina desaminasa, transforman el aminocido en cido fenilpirvico, que da reaccin coloreada con el cloruro frrico.

Material
Un tubo de medio Voges-Proskauer, cultivo bacteriano, solucin de -naftol y solucin de sosa.

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Interpretacin global de las pruebas de identificacin de bacilos Gram negativos fermentadores de glucosa Una vez realizadas todas las pruebas determinar el gnero con ayuda de la siguiente tabla:

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PRCTICA 9 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA DE UN ANTIBITICO

Introduccin
La tcnica de dilucin en caldo permite determinar la actividad de un agente antimicrobiano sobre un microorganismo, en forma de concentracin mnima inhibitoria (CMI): La menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento. A partir de este dato puede determinarse si es posible tratar una infeccin causada por ese microorganismo con ese antimicrobiano. Si la CMI es menor que la concentracin de antimicrobiano que se alcanza en los tejidos de cuerpo humano, el tratamiento puede tener xito y el microorganismo se considera sensible; en caso contrario fracasar y el microorganismo se considera resistente. Un antibiograma es un estudio de la sensibilidad de un microorganismo dado a distintos antimicrobianos. Las distintas especies y estirpes microbianas presentan distintos grados de sensibilidad a los diversos agentes, de ah que sea necesario hacer una evaluacin para poder seleccionar el compuesto ms apropiado para el tratamiento de una infeccin bacteriana. 2.- Preparacin de las diluciones de antibitico a) Rotular los tubos de caldo Meller-Hinton: 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 y 0 g/ml. b) Pipetear 1 ml del tubo que contiene la solucin de ampicilina (16 g/ml) al marcado con 8. c) Mezclar bien pipeteando y transvasar 1 ml al tubo siguiente (4 g/ml). d) Repetir el paso anterior hasta llegar al tubo marcado con 0.25 g/ml, del que se desecha 1 ml. No aadir antibitico al tubo marcado 0. 3.- Siembra: Tomar una muestra del cultivo de E. coli con una pipeta Pasteur e inocular una gota en cada tubo de la serie de diluciones (incluidas las de 16 y 0 g/ml). Finalmente, incubar los tubos a 37 C durante 20 h.

Interpretacin
Al da siguiente, observar si hay turbidez en los tubos. De los que no presenten crecimiento, el que contenga la concentracin ms baja de antibitico corresponder a la CMI. El tubo que no contiene antibitico debe estar turbio (control positivo).

Objetivo
Determinar la sensibilidad o resistencia a un antibitico de una bacteria aislada, utilizando el mtodo de dilucin en caldo.

Material
Cultivo bacteriano en medio lquido de Escherichia coli, 7 tubos con 1 ml de caldo Meller-Hinton, solucin de ampicilina (16 g/ml) en caldo MellerHinton (2 ml), pipetas de 1 ml y pipetas Pasteur.

Tcnica
1.- Preparacin del inculo Esta tcnica slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello, previamente se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa. La preparacin del inculo se realiza sembrando una colonia aislada del microorganismo en estudio en un tubo de caldo Mueller-Hinton e incubando a 37 C durante 18-20 h.

Figura 9.1. Determinacin de la CMI.

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PRCTICA 10 ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR

Objetivo
Se pretende evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria de crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el de difusin en agar o de Kirby-Bauer. con un patrn de turbidez n 0.5 de McFarland (0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M y 99,5 ml de cido sulfrico 0,36 M). Esto equivale aproximadamente a una densidad de 108 clulas/ml. Diluir si es necesario la suspensin o aadir ms inculo.

1. Preparacin del inculo

La tcnica de antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello, previamente se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.

2. Siembra y colocacin de los discos

Material
Placas con medio de cultivo Meller-Hinton, hisopo, pinzas y discos de 6 mm de dimetro impregnados con antibitico.

Material
Tubo con 10 ml de solucin salina y cultivo de la bacteria problema.

Tcnica
Impregnar una torunda con la suspensin del inculo; escurrirla contra la pared del tubo y sembrar con ella toda la superficie de la placa, mediante estras cruzadas en varias direcciones. Antes de 15 minutos deben colocarse los discos de antibiticos. Con pinzas flameadas y fras (o con un aplicador automtico) se disponen los discos sobre las placas, de forma que disten unos 15 mm del borde de la placa y unos 30 mm entre s. En una placa de 9 cm caben 6 discos. Adherir cada disco al agar presionando ligeramente con las pinzas. A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 37C .

Tcnica
Cultivar la bacteria aislada en un tubo de medio lquido apropiado (caldo nutritivo, infusin cerebro-corazn) o preparar una suspensin directa a partir del cultivo en placa usando el siguiente mtodo: Tomar de una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solucin salina frotando en la pared del tubo (Figura 10.1). Homogeneizar bien y ajustar la densidad ptica

3. Lectura
Se realiza a las 16-20 horas. Medir el dimetro de los halos con calibrador o regla graduada, considerando la zona que esta libre de crecimiento. En caso de bacteriostticos es aceptable un ligero velo dentro del halo. La presencia de colonias en el interior del halo indica contaminacin, cultivo mixto o aparicin de resistencia. Consultar el siguiente cuadro para interpretar el antibiograma. Teniendo en cuenta la especie bacteriana y el antibitico, decidir si la bacteria es sensible (S), resistente (R) o su sensibilidad no puede definirse con claridad (intermedio o indeterminado: I).

Figura 10.1. Preparacin de una suspensin

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Tabla 10.1. Criterios de interpretacin de antibiogramas a

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Figura. 10.2.
Antibiograma por difusin en agar: Respuesta de Staphylococcus aureus frente a cuatro diferentes antibiticos. Las lneas indican el dimetro del halo de inhibicin.

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PRCTICA 11 ANLISIS MICROBIOLGICO DE UN AGUA PROBLEMA

Introduccin
Para conocer la calidad sanitaria de un agua destinada al consumo humano, es necesario realizar anlisis peridicos. Los microorganismos que se encuentran en el agua pueden ser autctonos (propios del agua) y alctonos (procedentes del suelo, aire, hombre o animales). Los microorganismos propios del agua tienen una temperatura de crecimiento de 22C, mientras que los procedentes del intestino del hombre y otros animales crecen mejor a temperaturas de 37C a 44C. Los mtodos oficiales de anlisis microbiolgicos y los criterios sanitarios de la calidad de aguas potables de consumo humano aparecen especificados en el BOE de 21 de febrero de 2003, Real Decreto 140/2003. muestras se conservan a temperatura ambiente (en la oscuridad, sin sobrepasar los 25C), su anlisis debe comenzar antes de que hayan transcurrido 6 h desde el momento de la toma de muestras. En circunstancias excepcionales, las muestras pueden conservarse a una temperatura de 4C durante un periodo mximo de 24 h antes de su anlisis.

2.- Recuento de microorganismos cultivables (Norma UNE-EN ISO 6222: 1999)

Se consideran como microorganismos cultivables todas las bacterias aerobias o anaerobias facultativas, levaduras o mohos capaces de formar colonias en el medio y en las condiciones de ensayo descritos posteriormente. Este recuento de colonias es til para evaluar el estado de los recursos de agua en su origen y la eficacia del proceso de tratamiento de las aguas destinadas al consumo humano e indica la limpieza y el estado de los sistemas de distribucin. De igual modo, permite detectar cambios anmalos en el nmero de microorganismos en la red de distribucin. As, todo aumento repentino del nmero obtenido puede advertir de la existencia de un foco de contaminacin y requerira su inmediata investigacin. Para hacer este recuento se emplean placas con medio agar extracto de levadura en las que se siembra un volumen conocido de agua. La incubacin se llevar a cabo a 22C durante 72 horas.

1.- Toma de muestras

Las muestras que se tomarn para el anlisis deben ser representativas del agua a estudiar, para determinar a partir de ellas su calidad microbiolgica y, de acuerdo con ella, poder calificar dicho agua como "apta o no apta para el consumo humano". Por consiguiente, las muestras deben reflejar la composicin microbiana del agua a analizar. Hay normas para la toma de muestras de aguas segn sus distintas procedencias (grifos, pozos, depsitos, lagos, ros, manantiales, etc.). En cualquier caso, siempre para su recogida deben utilizarse frascos estriles y deben recolectarse cantidades comprendidas entre 500 y 1000 ml. Cuando se estime probable que el agua a analizar contenga trazas de cloro, cloramina u ozono, ser necesario neutralizar su efecto bactericida en el momento del muestreo (Real Decreto 1138/1990 del 14 de septiembre). Para ello se aadir una cantidad suficiente de tiosulfato sdico. Para un volumen de 250 ml son suficientes 0,2 ml de una solucin acuosa al 3% de Na2S2O35H2O. Para la preparacin de la muestra, la filtracin y la siembra sobre los medios de aislamiento, debe seguirse los mtodos descritos en las Normas ISO. Es preferible iniciar el examen de las muestras inmediatamente despus de su toma. Si las

Material
Muestra de agua. 4 placas de Petri estriles. 1 pipeta de 1 ml estril. 4 tubos con medio agar extracto de levadura. Estufa regulada a 22C.

Tcnica
- Marcar cada placa con el nmero de la muestra, la dilucin y la fecha, preparando placas duplicadas para cada volumen de muestra examinada. - Homogeneizar la muestra, agitando el frasco

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varias veces. - Depositar, con pipeta estril, en dos placas 1 ml y en las otras dos 0,1 ml del agua problema. - Aadir el medio de cultivo (15-20 ml), fundido y atemperado a 45C, sobre las placas. - Mezclar por rotacin suave de las placas sobre la mesa. - Cuando el medio est completamente solidificado, invertir las placas y llevar a incubar a la temperatura de 22C.

Resultados
Efectuar el recuento de colonias eligiendo las placas cuyo nmero est comprendido entre 30 y 300. El recuento no se efectuar en placas que contengan menos de 30 colonias, excepto en el caso de aquellas siembras con agua sin diluir. Si no hay colonias en las placas sembradas con muestra sin diluir, los resultados se expresan como "no detectado en un mililitro". Si todas las placas tienen ms de 300 colonias, el resultado obtenido se dar como "> 300" o como "valores aproximados". El resultado, correspondiente a la media del recuento de ambas placas, se expresar como nmero de unidades formadoras de colonias presentes en 1 ml de la muestra (UFC/ml) en 72 h de crecimiento a 22C.

interpretar dado que algunas bacterias coliformes viven en el suelo y en aguas dulces superficiales y, por tanto, no tienen siempre un origen intestinal. La presencia de bacterias coliformes en el agua de abastecimiento, aunque no pruebe de forma concluyente una contaminacin de origen fecal, s puede indicar fallos en el tratamiento de depuracin o en la red de distribucin del agua. La identificacin de las cepas aisladas puede permitir en ocasiones obtener informacin acerca de su origen. Los coliformes agrupan ciertas especies bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, de morfologa bacilar, Gram negativas, anaerobias facultativas, oxidasa-negativa, no esporuladas y que fermentan la lactosa con produccin de cido a 37C en 24-48 horas.

C D

3.- Deteccin y recuento de bacterias indicadoras de contaminacin fecal

La investigacin en el agua de bacterias indicadoras de contaminacin fecal (Escherichia coli y otros coliformes, enterococos y Clostridium perfringens) es de gran inters ya que su presencia indica que ese agua puede estar contaminada por otras bacterias patgenas que viven en el intestino del hombre y de los animales de sangre caliente.

Figura 11.1. Equipo de filtracin a vaco

A. Filtro de celulosa de 045 m de dimetro de poro. B. Depsito para la muestra o medio. C. Depsito para la muestra o medio filtrados. D. Sistema de vaco. MTODO DE FILTRACIN Se utiliza para la determinacin del nmero de coliformes y E. coli, mediante filtracin de volmenes determinados del agua a analizar a travs de filtros de membrana e incubacin de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.

3.1.- Deteccin y recuento de Escherichia coli y de bacterias coliformes (Norma UNE-EN ISO 9308-1: 2000)
La presencia y el nivel de contaminacin fecal constituye un factor importante en la evaluacin de la calidad de un agua y del riesgo de infeccin que representa para la salud humana. El anlisis de muestras de agua para detectar la presencia de E. coli, que normalmente habita en el tracto intestinal del hombre y otros animales de sangre caliente, proporciona una indicacin de este tipo de contaminacin. Los resultados del anlisis de bacterias coliformes pueden resultar difciles de

Material
- Membranas filtrantes estriles de steres de celulosa, de 0'45 m de poro. - Pinzas de extremos planos. - Equipo de filtracin por vaco. - Placas de Petri con agar lactosa-trifeniltetrazoliotergitol 7 (Agar de lactosa TTC con heptadecilsulfato de sodio o tergitol 7). - Estufas a 37C y 44C.

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Tcnica
- Colocar un filtro de membrana estril sobre el sistema de filtracin, utilizando pinzas estriles. Adaptar el embudo y filtrar 100 ml de la muestra de agua previamente homogeneizada. - Retirar el embudo y, con unas pinzas esterilizadas, transferir la membrana sobre el medio de cultivo agar de lactosa TTC de modo que la superficie de filtracin quede hacia arriba. Es importante que la membrana quede homogneamente apoyada sobre el medio de cultivo. - Invertir la placa e incubar durante 24-48 horas a 37C. - El empleo de un filtro de membrana adicional para la incubacin a 44C puede evitar los problemas causados por el crecimiento de otras bacterias cuya procedencia no sea fecal.

37C, o un nmero representativo de ellas (diez como mnimo), sobre una placa de agar triptona soja (TSA). Adems, todas y cada una de estas colonias se resiembran en otros tantos tubos con caldo de cultivo con triptfano. A continuacin: - Se incuba la placa de agar TSA a 37C durante 24 horas y se lleva a cabo la prueba de la oxidasa, tal y como se indica en la prctica 9. - Se incuban los tubos con caldo de cultivo con triptfano a 44 C durante 24 h; tras dicha incubacin, se comprueba la produccin de indol aadiendo de 0,2 ml a 0,3 ml de reactivo de Kovacs o Ehrlich. La aparicin de una coloracin roja en la superficie del caldo confirma la produccin de indol. Se realiza un recuento de todas las colonias lactosa-positiva que dan una reaccin oxidasa negativa y se consideran como bacterias coliformes. Se realiza un recuento de todas las colonias lactosa-positiva que presentan reaccin oxidasa negativa y dan reaccin indol positiva y se consideran como Escherichia coli.

Resultados, confirmacin y recuento

Se examinan las membranas y se cuentan como bacterias lactosa-positivas todas las colonias, sin tomar en consideracin el tamao, que originen un viraje de color a amarillo del indicador del medio por debajo de la membrana, consecuencia de la acidificacin tras la fermentacin de la lactosa. NOTA: Aunque no est incluido en la normativa se realizar una tincin de Gram sobre una de las colonias lactosa-positivas que confirme la presencia de bacilos Gram negativos. Para realizar el recuento de coliformes se cuentan las colonias lactosa-positivas que hayan aparecido sobre la superficie del filtro, despus de la incubacin a 37C, y se expresan como nmero de UFC presentes en 100 ml de agua. A continuacin, es necesario llevar a cabo los ensayos confirmativos siguientes: - Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa) Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de electrones en la respiracin aerbica, transfiriendo electrones al oxgeno, con la formacin final de agua. - Produccin de indol El indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido triptfano. La presencia de la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la desaminacin reductiva del triptfano produciendo indol, cido pirvico y amonaco. Para realizar estos ensayos confirmativos, se resiembran preferiblemente todas las colonias lactosa-positivas obtenidas en la placa incubada a

Expresin de los resultados

A partir del recuento del nmero de colonias caractersticas presentes en la membrana y teniendo en cuenta los resultados de los ensayos de confirmacin efectuados, se calcula el nmero de UFC de coliformes y de E. coli presentes en 100 ml de muestra.

3.2.- Deteccin y recuento de enterococos (Norma UNE-EN ISO 7899-2: 2001)

Los enterococos pueden considerarse como indicadores de contaminacin fecal. Sin embargo, es conveniente recordar que algunos enterococos que se encuentran en las aguas pueden proceder ocasionalmente de otros hbitats. Mediante los mtodos descritos a continuacin pueden detectarse y cuantificarse las especies: Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans y E. hirae. Adems, pueden determinarse ocasionalmente otras especies de Enterococcus y algunas especies de Streptococcus (en particular S. bovis y S. equinus). Estas especies de Streptococcus no tiene una supervivencia larga en en agua y probablemente no puedan determinarse cuantitativamente. Como enterococos intestinales se consideran aquellos microorganismos capaces de reducir el cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) y de hidrolizar la esculina en las condiciones y sobre los medios especificados ms abajo.

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MTODO DE FILTRACIN Se utiliza para la determinacin del nmero de enterococos intestinales mediante filtracin de un volumen determinado del agua a analizar a travs de filtros de membrana e incubacin de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.

3.3.- Deteccin y recuento de Clostridium perfringens (incluidas las esporas)

Los bacterias incluidas en el gnero Clostridium tienen morfologa bacilar, son Gram positivas, anaerobias estrictas y capaces de formar esporas. La especie C. perfringens est normalmente presente en heces. Sus esporas son resistentes al calor, a los procesos de desinfeccin y a los tratamientos de depuracin habituales de las aguas (cloracin), por lo que su supervivencia en agua es mayor que la de las formas vegetativas, incluidos E. coli y los enterococos. La diferenciacin de C. perfringens de otras especies de Clostridium, se basa en su capacidad de fermentar la sacarosa con produccin de cido, en su incapacidad de fermentar la celobiosa (debido a la ausencia de -D-glucosidasa) y en la produccin de fosfatasa cida. MTODO DE FILTRACIN Se utiliza para la determinacin del nmero de C. perfringens mediante filtracin de un volumen determinado del agua a analizar a travs de filtros de membrana e incubacin de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.

Material y tcnica
- Siguiendo el mtodo de filtracin descrito para el recuento de coliformes, se filtran 100 ml del agua a analizar previamente homogeneizada. - Se coloca el filtro de membrana sobre el medio de Slanetz y Bartley y se incuban las placas a 37C durante 48 h.

Resultados, confirmacin y recuento

Tras la incubacin, se consideran como colonias tpicas de enterococos todas las que muestren un color rojo, marrn o rosado, en el centro o en toda la colonia, consecuencia de la reduccin del TTC (incoloro) a trifenilformazn (rojo). NOTA: Aunque no est incluido en la normativa se realizar una tincin de Gram sobre una de las colonias positivas que confirme la presencia de cocos Gram positivos en cadenas. Si hay colonias tpicas se realizar un ensayo confirmativo. Para ello, con ayuda de unas pinzas estriles, se transfiere el filtro de membrana con las colonias, sin invertirla, sobre una placa con agar bilis-esculina-azida, precalentada a 44C. Se incuba a 44C durante 2 h y se lee la placa inmediatamente. En este medio, los enterococos hidrolizan la esculina dando origen a esculetina (6,7-dihidrocumarina) que se combina con los iones Fe3+ formando un compuesto de color marrn a negro. Por tanto, se considera que todas las colonias tpicas que muestren un color de marrn a negro, en el medio circundante, dan reaccin positiva y se cuentan como enterococos.

Material y tcnica
- Siguiendo el mtodo de filtracin descrito para el recuento de coliformes, se filtran 100 ml del agua a analizar, previamente homogeneizado. - Se coloca el filtro de membrana sobre el medio de m-CP y se incuban las placas a 44C durante 24 h en condiciones de anaerobiosis.

Resultados, confirmacin y recuento

Tras la incubacin, se consideran como colonias tpicas de C. perfringens todas las que muestren un color amarillo opaco, consecuencia de la acidificacin del medio tras la fermentacin de la sacarosa. En general, el resto de las especies de Clostridium aparecen de color azul-verdoso si, adems de fermentar la sacarosa, son -D-glucosidasa positivas (hidrolizan el indoxil--D-glucsido) o de color prpura si no fermentan la sacarosa. NOTA: Aunque no est incluido en la normativa se realizar una tincin de Gram sobre una de las colonias positivas que confirme la presencia de bacilos Gram positivos. Si hay colonias tpicas de C. perfringens se realizar un ensayo confirmativo exponiendo dichas colonias a vapores de hidrxido amnico.

Expresin de los resultados

A partir del recuento del nmero de colonias caractersticas presentes en la membrana sobre el medio de Slanetz y Bartley y teniendo en cuenta el resultado del ensayo de confirmacin efectuado, se calcula el nmero de UFC de enterococos intestinales presentes en 100 ml de muestra.

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Se considera que todas las colonias que cambien a color rosa o rojo al cabo de 20 a 30 segundos dan reaccin positiva (la produccin de fosfatasa cida provoca la hidrlisis de la fenolftalena difosfato) y se cuentan como C. perfringens.

Recuento de esporas de Clostridium sulfito-reductores en tubos con agar de hierro y sulfito

Como se ha indicado, C. perfringens forma parte del grupo de los sulfito-reductores. Una tcnica clsica para el recuento de las formas de resistencia de clostridios sulfito-reductores implica su incubacin en tubos de medio de cultivo slido glucosado, que contiene sulfito sdico y una sal de hierro (agar de hierro y sulfito). Este recuento exige necesariamente un calentamiento de la muestra de agua para destruir las formas vegetativas de las bacterias.

Expresin de los resultados

A partir del recuento del nmero de colonias caractersticas presentes en la membrana sobre el medio m-CP y teniendo en cuenta los resultados del ensayo de confirmacin efectuado, se calcula el nmero de UFC de C. perfringens presentes en 100 ml de muestra.

Material:
- Tubos con 10 ml del agua problema. - Tubos con 10 ml de medio agar de hierro y sulfito a doble concentracin. - Tubos con agar agua. - 1 pipeta de 10 ml estril. OTROS MTODOS PARA LA DETECCIN DE Clostridium perfringens Aunque la normativa vigente propone realizar el anlisis ya descrito para la deteccin de C. perfringens, tambin seala la posibilidad de utilizar otros mtodos alternativos siempre que estn validados o acreditados por los laboratorios de anlisis de aguas.

Tcnica:
- Colocar 10 tubos del medio de cultivo en bao mara hasta fusin total del agar. - Calentar la muestra de agua en bao a 80C, durante cinco minutos, con objeto de destruir las formas vegetativas. A continuacin, atemperar hasta 60C aproximadamente. - Sembrar cada tubo de medio, atemperado a 4550 C, con 10 ml del agua a 60 C. - Mezclar y enfriar rpidamente, sumergindolos en agua fra. Recubrir con agar-agua en un espesor de 2-3 cm. - Incubar a 37 C durante 48-72 horas para la determinacin de esporas de clostridios sulfitoreductores, o bien a 45 C durante 24-48 horas para el recuento de esporas de C. perfringens.

Filtracin e incubacin en medio agar TSC

El agua problema se filtra como se ha descrito en la tcnica anterior y el filtro se incuba sobre medio agar TSC (Triptosa-Sulfito-Cicloserina). Este medio, muy utilizado en el anlisis microbiolgico de productos crnicos, proporciona un sustrato ptimo para el crecimiento de clostridios. Por su propiedad metablica de utilizar sulfitos como aceptores de electrones produciendo sulfuros, C. perfringens forma parte del grupo bacteriano de los sulfito-reductores. La reduccin del bisulfito a sulfhdrico se detecta por precipitacin de sulfuro ferroso con las sales de hierro incluidas en la formulacin del medio. Por tanto, esta especie produce colonias negras caractersticas. La cicloserina y otros antibiticos que suelen aadirse (polimixina B o kanamicina) actan como agente selectivo inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos. La incubacin se realiza durante 18-24 h a 44C en condiciones de estricta anaerobiosis. Despus de la incubacin se realizar el recuento de las colonias negras y expresar el resultado como UFC/100 ml de muestra.

Resultados:
Las colonias de Clostridium sulfito-reductores aparecern de color negro, debido a la reduccin del sulfito a sulfhdrico y posterior formacin de sulfuro ferroso por reaccin de ste con la sal de hierro. Transcurridas 48 horas, contar el nmero de colonias negras desarrolladas en la totalidad del agar. El resultado se expresar como nmero de esporas de clostridios sulfito-reductores en el volumen de agua sembrado (100 ml).

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OTRAS DETERMINACIONES

Rara vez se hacen otras determinaciones microbiolgicas en las aguas de abastecimiento aparte de las consignadas. As, cuando la determinacin de C. perfringens sea positiva y exista una turbidez mayor a 5 UNF (Unidad Nefelomtrica de Formacina) se determinarn, en la salida de ETAP

(Estacin de Tratamiento de Agua Potable) o depsito, si la autoridad sanitaria lo considera oportuno, Cryptosporidium u otros microorganismos o parsitos. De igual modo, slo en el caso de un brote epidmico se lleva a efecto la investigacin de microorganismos transmitidos a travs del agua como Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, etc.

NORMAS LEGALES VIGENTES

Real Decreto 140/2003 de 7 de febrero de 2003. BOE 21 de febrero de 2003 Artculo 17. Control de calidad del agua de consumo humano
"... (Tras el anlisis de una muestra de agua de consumo humano), el agua se podr calificar como "apta para el consumo" cuando no contenga ningn tipo de microorganismo, parsito o sustancia, en una cantidad o concentracin que pueda suponer un peligro para la salud humana; y cumpla con los valores paramtricos ..."

Caractersticas microbiolgicas Parmetros microbiolgicos (1)

Escherichia coli Enterococos Clostridium perfringens (incluidas las esporas)

Valor paramtrico
0 UFC/100 ml 0 UFC/100 ml 0 UFC/100 ml

Parmetros indicadores (2)

Recuento de colonias a 22C Coliformes

Valor paramtrico
100 UFC/ml 0 UFC/100 ml

(1) Parmetros de obligado cumplimiento. (2) En el caso de incumplimiento de estos parmetros, la autoridad sanitaria valorar la calificacin del agua como "apta o no apta para el consumo humano" en funcin del riesgo para la salud.

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ANEXO MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS

MEDIOS DE CULTIVO
razn de 9-10 ml por tubo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos y dejar solidificar en posicin inclinada.

Agar agua:
Agar 15 g Agua destilada, c.s.p.

Agar C.L.E.D
1000 ml Peptona de gelatina Extracto de carne Triptona Lactosa L-cistina Azul de bromotimol Agar Agua destilada, c.s.p. 4g 3g 4g 10 g 0,128 g 0,02 g 15 g 1000 ml

Aadir el agar al agua y calentar hasta la fusin del mismo, mezclando bien. Dispensar en tubos en volmenes de unos 3 ml y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Agar bilis-esculina-azida
Triptona Peptona Extracto de levadura Bilis de buey, deshidratada Cloruro sdico Esculina Citrato frrico amnico Azida sdica Agar Agua destilada c.s.p. 17,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 5,0 g 1,0 g 0,5 g 0,15 g 15 g 1000 ml Disolver los componentes en agua, a excepcin del agar, y ajustar el pH a 7,3. Aadir el agar y llevar a ebullicin hasta disolver por completo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. El medio estril y atemperado a 50C se dispensa en placas de Petri para obtener un espesor de 3-5 mm y se deja solidificar.

Agar de extracto de levadura

Triptona Extracto de levadura Agar Agua destilada c.s.p. 6,0 g 3,0 g 15 g 1000 ml

Disolver los componentes en el agua por calentamiento suave, a excepcin del agar. Ajustar el pH a 7,1. Aadir el agar y esterilizar en autoclave durante 15 min a 121C. Atemperar a 50-60C, repartir en placas de Petri para obtener un espesor de 3-5 mm y dejar solidificar. Las placas as preparadas pueden conservarse en la oscuridad hasta 2 semanas a 4C.

Agar citrato de Simmons

Sulfato de magnesio Fosfato dihidrgeno amnico Fosfato bipotsico Citrato sdico Cloruro sdico Azul de bromotimol Agar Agua destilada, c.s.p. 0,2 g 1g 1g 2g 5g 0,08 g 15 g 1000 ml

Disolver los componentes en el agua, a excepcin del agar, calentando suavemente. Ajustar el pH a 7,2. Aadir el agar y llevar a ebullicin para disolver por completo. Distribuir en tubos a razn de 15-20 ml. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Para su empleo, fundir el medio y mantener a 45C en bao de agua. Es recomendable no mantener el medio durante ms de 4 h a 45C. Transcurrido este tiempo el medio debe desecharse.

Agar de hierro y sulfito:

Triptona Sulfito sdico Citrato frrico Agar Agua destilada, c.s.p. 10 g 0,5 g 0,5 g 15 g 1000 ml

Disolver los componentes en el agua, a excepcin del agar, y ajustar el pH a 6,8. Aadir el agar y llevar a ebullicin envasando el medio en tubos, a

57

Disolver todos los componentes por calentamiento, a excepcin del agar y ajustar el pH a 7,1. Aadir el agar y llevar hasta ebullicin para la disolucin total del mismo. Repartir a razn de 20 ml por tubo y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Agar F (medio King B)

Peptona Fosfato bipotsico Sulfato magnsico Agar Agua destilada, c.s.p. 20 g 1,5 g 1,5 g 15 g 1000 ml

agar y llevar hasta ebullicin para disolver el medio por completo. Repartir en matraces a razn de 100 ml y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. En el momento de su empleo, fundir al bao Mara y aadir a cada matraz: - 5 ml de solucin acuosa de cloruro o bromuro de 2,3,5 trifenil-tetrazolio (TTC) al 0,05%, esterilizada por filtracin (dimetro de poro 0,22 m). Esta solucin debe mantenerse en la oscuridad. - 5 ml de solucin acuosa de heptadecilsulfato sdico (tergitol 7) al 0,2% esterilizada en autoclave a 121C durante 15 min. Mezclar bien y repartir en placas de Petri, dejando solidificar. El espesor del medio en las placas debe ser como mnimo de 5 mm.

Disolver los componentes en el agua, a excepcin del agar, y ajustar el pH a 7,0. Aadir el agar y 10 g de glicerol, calentando el medio hasta ebullicin para que se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Dejar enfriar y dispensar el medio estril en placas de Petri para obtener un espesor de 3-5 mm y se deja solidificar.

Agar m-CP
Triptosa Extracto de levadura Sacarosa L-cistena monoclorhidrato Sulfato magnsico heptahidratado Prpura de bromocresol Agar Agua destilada c.s.p. 30 g 20g 5g 1g 0,1 mg 40 mg 15 g 1000 ml

Agar fenilalanina
Extracto de levadura Fosfato bipotsico Cloruro sdico DL-fenilalanina Agar Agua destilada, c.s.p. 3g 1g 5g 2g 12 g 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar, calentando suavemente y ajustar el pH a 7,3. Aadir el agar calentando de nuevo hasta ebullicin y distribuir en tubos a razn de 9-10 ml por tubo. Esterilizar a 121C durante 15 minutos y dejar solidificar en posicin inclinada.

Disolver los componentes en el agua, a excepcin del agar, y ajustar el pH a 7,6. Aadir el agar y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Atemperar a 50-60C y aadir aspticamente: - 400 mg de D-cicloserina. - 25 mg de sulfato de polimixina B. - 60 mg de indoxil-b-D-glucsido (disueltos previamente en 8 ml de agua destilada estril). - 20 ml de solucin de fenolftalena difosfato al 0,5% esterilizada por filtracin (dimetro de poro 0,22 m). - 2 ml de solucin de cloruro frrico hexahidratado al 4,5% esterilizada por filtracin (dimetro de poro 0,22 m).

Agar lactosa-TTC con heptadecilsulfato sdico

Extracto de carne Peptona Lactosa Extracto de levadura Azul de bromotimol (solucin al 1%) Agar Agua destilada, c.s.p. 5g 10 g 20 g 6g 5 ml 20 g 1000 ml

Agar de Mossel (MYP: manitol-yema de huevo-polimixina)

Peptona Extracto de carne D-manitol Cloruro sdico Fosfato amnico Rojo fenol Agar Agua destilada, c.s.p. 10 g 1g 10 g 10 g 1g 0,025 g 15 g 1000 ml

Disolver los componentes en el agua caliente, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Aadir el

Disolver por calentamiento hasta ebullicin, enfriar

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a 50 C y ajustar el pH a 7,5. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Atemperar el medio a 45 C y aadirle 10 ml de emulsin de yema de huevo al 20% y 1 ml de solucin de sulfato de polimixina B (1 mg/ml) previamente esterilizada por filtracin por cada 110 ml de medio. Para preparar la emulsin de yema de huevo, remojar una docena de huevos de gallina en una solucin 1:100 de cloruro mercrico saturado en agua durante 1 min, romper las cscaras, separar la yema de la clara de once de los huevos y mezclarla con el otro huevo completo. Tomar 20 ml de la mezcla, aadirlos a 80 ml de una solucin de cloruro sdico al 0,9% y mezclar. Esterilizar por filtracin y atemperar a 45-50 C.

Disolver los componentes en el agua por calentamiento, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,1. Aadir el agar y llevar hasta ebullicin, repartiendo el medio en tubos de ensayo a razn de 15 a 20 ml por tubo. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos y dejar solidificar en posicin inclinada.

Agar P (medio King A)

Peptona Sulfato potsico Cloruro magnsico Agar Agua destilada, c.s.p. 20 g 10 g 1,4 g 15 g 1000 ml

Agar movilidad
Extracto de carne Peptona Cloruro sdico Agar Agua destilada, c.s.p. 3g 10 g 5g 4g 1000 ml

Disolver los componentes en el agua, a excepcin del agar, y ajustar el pH a 7,0. Aadir el agar y 10 g de glicerol, calentando el medio hasta ebullicin para que se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Dejar enfriar hasta 50 C y dispensar el medio estril en placas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar, calentando suavemente y ajustar el pH a 7,3. Aadir el agar calentando de nuevo hasta ebullicin y distribuir en tubos a razn de unos 5 ml por tubo. Esterilizar a 121C durante 15 minutos y dejar solidificar en posicin vertical.

Agar Sabouraud-cloranfenicol
Peptona Glucosa Agar Agua destilada, c.s.p. 10 g 40 g 15 g 1000 ml

Agar Meller-Hinton
Infusin de carne Peptona de casena Almidn soluble Agar Agua destilada, c.s.p. 300 g 17,5 g 1,5 g 17 g 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar, y ajustar a pH 7,3. Aadir el agar y calentar hasta ebullicin para que se disuelva por completo. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos y una vez atemperado a 50 C, dispensar en placas de Petri estriles a razn de unos 20 ml por placa, con el fin de obtener un espesor de 4 mm.

Disolver todos los componentes en el agua, excepto el agar, y ajustar el pH a 5,6. Aadir el agar y calentar hasta la ebullicin, mezclndolo suavemente para que se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar hasta 50 C y aadir cloranfenicol a partir de una solucin madre filtrada hasta una concentracin final de 50 mg/L. Dispensar el medio estril en placas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.

Agar sangre
Utilizar una base de agar nutritivo o de otro medio ms rico, como el agar triptona soja, al que se aadir en condiciones aspticas, una vez esterilizado en autoclave a 121C durante 15 minutos y atemperado a 45-50C, un 5% de sangre de caballo desfibrinada estril. Mezclar suavemente para evitar la formacin de burbujas y dispensar en placas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.

Agar nutritivo
Peptona Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro sdico Agar Agua destilada, c.s.p. 5g 1g 2g 5g 15 g 1000 ml

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Agar triptona soja

Triptona Peptona de soja Cloruro sdico Agar Agua destilada, c.s.p. 15 g 5g 5g 15 g 1000 ml

posicin inclinada con poca superficie y mucho fondo.

Agua de peptona
Peptona Cloruro sdico Agua destilada, c.s.p. 10 g 5g 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Aadir el agar y calentar hasta la ebullicin, mezclndolo suavemente para que se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar hasta 50 C y dispensar el medio estril en placas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.

Disolver todos los componentes en el agua calentando suavemente y ajustar el pH a 7,2. Dispensar en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Caldo de cultivo con triptfano Agar TSC (triptosa-sulfito-cicloserina)

Triptona Peptona de soja Extracto de levadura Bisulfito sdico Citrato de hierro amoniacal Agar Agua destilada c.s.p. 15 g 5g 5g 1g 1g 15 g 1000 ml Triptona L-Triptfano Cloruro sdico Agua destilada c.s.p. 10 g 1g 5g 1000 ml

Disolver los componentes en el agua por calentamiento suave. Ajustar el pH a 7,5. Repartir en tubos a razn de 3 ml por tubo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min.

Disolver todos los componentes en el agua, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,4. Aadir el agar y calentar hasta la ebullicin, mezclndolo suavemente para que se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Dejar enfriar hasta 50 C, aadir cicloserina a partir de una solucin madre filtrada hasta una concentracin final de 0,4 g/ml. Dispensar el medio estril en placas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.

Caldo nitratado
Extracto de carne Peptona Nitrato potsico Agua destilada, c.s.p. 3 g. 5 g. 1 g. 1000 ml

Agar urea de Christensen

Peptona Glucosa Cloruro sdico Fosfato monopotsico Rojo de fenol Agar Agua destilada, c.s.p. 1g 1g 5g 2g 0,012 g 15 g 1000 ml

Disolver en el agua todos los componentes por calentamiento suave y ajustar el pH a 6,9. Dispensar en tubos a razn de 10 ml por tubo y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min.

Medio fluido de tioglicolato

L-cistina Cloruro sdico Glucosa monohidrato Extracto de levadura Digerido pancretico de casena (triptona) Tioglicolato sdico Solucin de resazurina sdica al 0,1% Agar Agua destilada, c.s.p. 0,5 g 2,5 g 5,5 g 5g 15 g 0,5 g 1 ml 0,75 g 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar, y ajustar el pH a 6,8. Aadir el agar y calentar hasta ebullicin. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 50C y aadir aspticamente 100 ml de una solucin acuosa de urea al 20% esterilizada por filtracin. Mezclar bien y distribuir en tubos estriles a razn de 9-10 ml por tubo, dejando solidificar en 60

Aadir el tioglicolato sdico o el cido tiogliclico a

la solucin formada por el resto de los componentes, excepto la solucin de resazurina sdica y el agar que se aaden despus de ajustar el pH a 7,10,2. Calentar hasta disolucin total y distribuir en tubos de 9 x 180 mm a razn de 5 ml por tubo y esterilizar a 121C durante 20 minutos. Mantener los tubos en posicin vertical.

Glucosa Citrato frrico Tiosulfato sdico Cloruro sdico Rojo de fenol Agar Agua destilada, c.s.p.

1g 0,3 g 0,3 g 5g 0,05 g 12 g 1000 ml

Medio de Hugh-Leifson
Frmula para la diferenciacin de bacterias Gram negativas: Triptona Cloruro sdico Fosfato bipotsico Agar Agua destilada, c.s.p. 2g 5g 0,3 g 3g 1000 ml

Disolver en el agua los componentes, excepto el agar y el rojo de fenol, y ajustar el pH a 7,4. Aadir el agar y el rojo de fenol, calentando hasta ebullicin para disolver el medio por completo. Dispensar en tubos a razn de 12-15 ml por tubo y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Dejar solidificar los tubos en posicin inclinada de manera que se obtenga una buena base.

Medio de Slanetz y Bartley

Triptosa Extracto de levadura Glucosa Fosfato dipotsico Azida sdica Agar Agua destilada c.s.p. 20,0 g 5,0 g 2, 0 g 4,0 g 0,4 g 15 g 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, a excepcin del agar y ajustar el pH a 7,1. Aadir 15 ml de azul de bromotimol al 0,2% y el agar, calentando hasta ebullicin para que se disuelva por completo. Distribuir en cantidades de 100 ml y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Atemperar a 45-50C y aadir aspticamente a 100 ml de medio estril, 10 ml de una solucin de glucosa al 10% esterilizada por filtracin, mezclando a fondo. Dispensar aspticamente cantidades de 5 ml en tubos de cultivo estriles de 9 x 180 mm. Mantener los tubos en posicin vertical. Frmula para estafilococos y micrococos (modificacin de Baird-Parker): Triptona Extracto de levadura Glucosa Agar Agua destilada, c.s.p. 10 g 1g 10 g 2g 1000 ml

Disolver en el agua los distintos componentes por calentamiento, a excepcin del agar. Ajustar el pH a 7,2. Aadir el agar. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Atemperar a 50-60C y aadir, aspticamente a 1000ml de medio estril, 10 ml de una solucin acuosa al 1% de cloruro de 2, 3, 5-trifeniltetrazolio (TTC) esterilizada por filtracin (0,2 m). (se debe proteger la solucin de TTC de la accin de la luz y descartarse cuando aparezca una coloracin rosada). Mezclar bien, repartir en placas de Petri para obtener un espesor de 3-5 mm y dejar solidificar. Las placas as preparadas pueden conservarse en la oscuridad hasta 2 semanas a 4C.

Disolver todos los componentes en el agua, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Aadir 20 ml de prpura de bromocresol al 0,2% y el agar, calentando hasta la disolucin total del medio. Dispensar en tubos de 9 x 180 mm a razn de unos 5 ml por tubo y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Mantener los tubos en posicin vertical.

Medio de Voges-Proskauer
Peptona Glucosa Fosfato bipotsico Agua destilada, c.s.p. 7g 5g 5g 1000 ml

Medio Kligler
Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Lactosa 3g 3g 20 g 10 g

Disolver en el agua todos los componentes por calentamiento suave y ajustar el pH a 6,9. Dispensar en tubos a razn de 10 ml por tubo y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min.

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Medio V.L. (para cultivo en profundidad)

Peptona Cloruro sdico Extracto de carne Extracto de levadura Clorhidrato de L-cistena Glucosa Agar Agua destilada, c.s.p. 10 g 5g 2g 5g 0,3 g 2g 6g 1000 ml

Disolver el compuesto en el etanol y almacenar en un frasco oscuro y en refrigeracin durante un tiempo no superior a una semana, ya que es sensible a la luz y a la temperatura. Por ser un reactivo inestable, conviene que sea preparado justo antes de usarse.

Azul de lactofenol
cido lctico Fenol Azul de anilina Glicerol Agua destilada, c.s.p. 20 ml 20 g 0,05 g 40 ml 20 ml

Disolver todos los componentes en el agua, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,4-7,5. Calentar hasta la total disolucin del medio y envasar en tubos de 9 x 180 mm, a razn de 5 ml por tubo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Mantener en posicin vertical.

Disolver el fenol en cido lctico, glicerol y agua, calentando suavemente. Luego agregar el azul de anilina (azul algodn, azul de Poirrier)

COLORANTES Y REACTIVOS
Azul de metileno cido ntrico
Solucin al 33% en agua destilada. Solucin al 0,3% en agua destilada.

Azul de metileno de Loeffler cido sulfanlico

cido sulfanlico cido actico 5N 8g 1000 ml Azul de metileno Etanol de 95% Solucin acuosa de hidrxido potsico al 0,01% (p/v) 0,3 g 30 ml 100 ml

Disolver por calentamiento suave en una campana de gases.

Preparar una solucin saturada de azul de metileno aadiendo el colorante en el etanol. Aadir entonces, 30 ml del sobrenadante a la solucin de hidrxido potsico.

Agua oxigenada
Solucin al 3% en agua destilada.

Cloruro frrico
Solucin al 10% en agua destilada.

-Naftilamina
-Naftilamina cido actico 5N 5g 1000 ml

Colorante de Albert
Azul de toluidina Verde malaquita cido actico glacial Etanol Agua destilada, c.s.p. 0,15 g 0,20 g 1g 2 ml 100 ml

Disolver por calentamiento suave en una campana de gases.

-Naftol
-Naftol Etanol de 96 6g 100 ml

Mezclar todos los componentes y filtrar despus de 24 horas.

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Cristal violeta oxalatado (modificacin de Hucker)

Solucin A: Cristal violeta Etanol de 95% Solucin B: Oxalato amnico Agua destilada, c.s.p. 10 g 100 ml

agregar el yodo. Una vez disuelto, se agrega el agua restante. Guardar en frascos de color mbar.

Nigrosina de Dorner
Nigrosina Agua destilada, c.s.p. 10 g 100 ml

1g 1000 ml

Mezclar 20 ml de la solucin A y 80 ml de la solucin B. Guardar durante 24 horas y filtrar a travs de papel de filtro.

Aadir la nigrosina al agua y mezclar en un matraz. Calentar en un bao de agua hirviendo durante 20-30 minutos. Ajustar el volumen final a 100 ml con agua. Como la nigrosina puede contaminarse con microorganismos, aadir 0,5 ml de formol como conservador. Filtrar dos veces a travs de un papel de filtro doble.

Etanol de 95% (vol/vol) Reactivo de Ehrlich Fuchsina fenicada

Fuchsina bsica Fenol Etanol de 95% Agua destilada, c.s.p. 0,3 g 5 ml 10 ml 100 ml p-Dimetilaminobenzaldehdo Etanol de 95% cido clorhdrico concentrado 4g 380 ml 80 ml

Disolver la fuchsina en el etanol y disolver el fenol, una vez fundido, en el agua. Mezclar y dejar reposar varios das. Filtrar a travs de papel antes de su uso.

Disolver lentamente el reactivo en el alcohol, con ayuda de un agitador magntico y a temperatura ambiente, y aadir entonces el cido. Guardar en frigorfico y protegido de la luz.

Reactivo de Kovacs Fuchsina fenicada de Kinyoun

Fuchsina bsica Fenol Etanol de 95% Agua destilada 4g 8g 20 ml 100 ml p-Dimetilaminobenzaldehdo Alcohol amlico o butlico (exento de bases orgnicas) cido clorhdrico ( = 118 g/ml) 5g 75 ml 25 ml

Disolver la fuchsina en el etanol y disolver el fenol, una vez fundido, en el agua. Mezclar y dejar reposar varios das. Filtrar a travs de papel antes de su uso.

Hidrxido sdico
Solucin de hidrxido sdico al 40% en agua destilada.

Disolver el aldehdo en el alcohol y aadir el cido cuidadosamente. Proteger la solucin de la luz y conservar a 4C. Es conveniente que la coloracin del reactivo se encuentre entre el amarillo claro y el marrn claro (algunas muestras de alcohol amlico no dan resultados adecuados y toman un color oscuro al mezclarse con el aldehdo.

Rojo de metilo Lugol (solucin yodo-yodurada)

Yoduro potsico Yodo Agua destilada, c.s.p. 2g 1g 300 ml Rojo de metilo Etanol de 95% Agua destilada, c.s.p. 0,2 g 600 ml 1000 ml

Disolver el rojo de metilo en el etanol, con ayuda de un agitador magntico y a temperatura ambiente. Aadir entonces el agua destilada.

Disolver el yoduro potsico en un poco de agua y

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Safranina
Safranina O Etanol de 95% Agua destilada, c.s.p. 0,25 g 10 ml 100 ml

BIBLIOGRAFA
Beishir, L. "Microbiology in practice. A selfinstructional laboratory course". 5 Ed. Harper Collins Pub. Inc., 1991. Case, C.L. y T.R. Johnson. "Laboratory experiments in Microbiology". 5 Ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1997. Claus, G.W. "Understanding microbes: A laboratory textbook for microbiology". 1 Ed. W.H. Freeman and Co. New York, 1989. 9g 1000 ml Collins, C.H. y P.M. Lyne. "Microbiological methods". 8 Ed. Hodder Arnond Publications. 2004. Gamazo, C., Lpez-Goi, I. y Daz, R. "Manual prctico de Microbiologa". 3 Ed. Masson, S.A. Barcelona, 2005. Forbes, B.A., D.F. Sahm y A.S. Weissfeld. "Bailey y Scott Diagnstico Microbiolgico". 12 Ed. Mdica Panamericana, 2009. Gerhardt, P., R.G. Murray, W.A. Wood y N.R. Krieg "Methods for general and molecular bacteriology". American Society for Microbiology, Washington, 1994. Harley J. Microbiology Lab Manual 7 Ed. Mc Graw Hill, 2008. Koneman, E., Allen, S., Janda, W., Winn, W., Procop, G., Schrenckenberger, P. y Woods, G. "Diagnstico microbiolgico. Texto y atlas en color". 6 Ed. Panamericana, 2008. Seeley, H.W., P.J. Vandemark y J.L. Lee. "Microbes in action. A laboratory manual of Microbiology". 4 Ed. W.H. Freeman, New York, 1991.

Disolver la safranina en el etanol y aadir entonces el agua destilada.

Solucin decolorante cido-alcohlica

cido clorhdrico concentrado Etanol 95% 3 ml 97ml

Solucin salina
Cloruro sdico Agua destilada, c.s.p.

Disolver el cloruro sdico en el agua por calentamiento suave y ajustar el pH a 6,6. Dispensar en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Verde malaquita
Solucin al 5% en agua destilada.

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PRIMERA SEMANA
LUNES

Preparacin de Esterilizacin medios de cultivo de medios de cultivo lquidos y slidos

Observacin de microorganismos en fresco y por tincin simple Tincin de Gram

MARTES

MIRCOLES

JUEVES

Siembras Microorganismos aerbicos y anaerbicos. Tipo respiratorio Lectura e interpretacin de las siembras y del tipo respiratorio Informe

Control ambiental

VIERNES

Tincin de Gram de las colonias bacterianas

Tincin negativa Anlisis microbiolgico de aguas de consumo humano Lectura y ensayos Aislamiento de la confirmativos de mezcla problema coliformes y C. perfringens Tincin de esporas Lectura del Lectura y ensayo aislamiento. confirmativo de Tincin de Gram enterococos y de coliformes y reaislamiento en CLED Recuento de colonias a 22C Informe Lectura de las pruebas de identificacin. Pruebas complementarias Lectura y siembra de pruebas complementarias Lectura de pruebas complementarias Informe Tincin de corpsculos metacromticos Identificacin de las bacterias de la mezcla problema

SEGUNDA SEMANA
LUNES

Tincin de las colonias bacterianas. Observacin de hongos Informe

MARTES

MIRCOLES

JUEVES

Antibiogramas Mtodos de difusin y dilucin Lectura de los antibiogramas Informe

Tincin AAR

Examen Siembra en agar CLED

VIERNES

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