PARTE IV - Tcnicas microbiolgicas apropiadas

12. Tcnicas de laboratorio

Los errores humanos, las tcnicas de laboratorio incorrectas y el mal uso del equipo son la causa
de la mayora de los accidentes de laboratorio y las infecciones conexas.
En el presente captulo se compendian los mtodos tcnicos destinados a evitar o reducir al
mnimo los accidentes ms comunes provocados por esos factores.
Manipulacin segura de muestras en el laboratorio
La recogida, transporte y manipulacin de muestras en el laboratorio entraan un riesgo de
infeccin para el personal.
Recipientes para muestras
Los recipientes para muestras pueden ser de vidrio o, preferiblemente, de plstico. Deben ser
fuertes y no permitir fugas cuando la tapa o el tapn estn correctamente colocados. En el exterior
del recipiente no debe quedar ningn material. Los recipientes han de estar correctamente
rotulados para facilitar su identificacin. Los formularios de peticin de examen de la muestra no se
colocarn alrededor de los recipientes, sino por separado, preferiblemente en sobres
impermeables.
Transporte de muestras dentro de la instalacin
Para evitar fugas o derrames accidentales, deben utilizarse envases/embalajes secundarios (por
ejemplo, cajas) equipados con gradillas, de modo que los recipientes que contienen las muestras
se mantengan en posicin vertical. Los envases/embalajes secundarios pueden ser de metal o de
plstico, pero deben poderse tratar en autoclave o ser resistentes a la accin de los desinfectantes
qumicos; de preferencia, el cierre debe tener una junta que garantice la estanqueidad. Debern
descontaminarse peridicamente.
Recepcin de las muestras
Los laboratorios que reciban un elevado nmero de muestras deben destinar un local o zona
especial con este propsito.
Apertura de los envases/embalajes
El personal que recibe y desempaqueta las muestras debe conocer los riesgos para la salud que
entraa su actividad y debe estar capacitado para adoptar precauciones normalizadas (2),
particularmente cuando manipule recipientes rotos o con fugas. Los recipientes primarios de las
muestras deben abrirse en una CSB. Se dispondr de desinfectantes.
Uso de pipetas y dispositivos de pipeteo

1. Debe utilizarse siempre un dispositivo de pipeteo. El pipeteo con la boca estar prohibido.
2. Todas las pipetas tendrn tapones de algodn para reducir la contaminacin de los
dispositivos de pipeteo.
3. Nunca se insuflar aire en un lquido que contenga agentes infecciosos.
4. No debe mezclarse el material infeccioso aspirando y soplando alternativamente a travs
de una pipeta.
5. No se expulsarn a la fuerza los lquidos de una pipeta.
6. Son preferibles las pipetas aforadas con una muesca superior y otra inferior, ya que no
exigen la expulsin de la ltima gota.
7. Las pipetas contaminadas deben sumergirse completamente en un desinfectante
adecuado contenido en un recipiente irrompible y permanecer en l durante un tiempo
suficiente antes de tirarlas.
8. Debe colocarse un recipiente para las pipetas usadas dentro (no fuera) de la CSB.
9. No deben utilizarse para pipetear jeringuillas provistas de aguja hipodrmica.
10. En vez de agujas, existen dispositivos para abrir los frascos tapados con un diafragma que
permiten usar pipetas y evitar el uso de agujas y jeringuillas hipodrmicas.
11. Para evitar la dispersin del material infeccioso que caiga accidentalmente de una pipeta,
se recubrir la superficie de trabajo con material absorbente, que se desechar como
residuo infeccioso una vez utilizado.
 Tcnicas para evitar la dispersin de material infeccioso

1. A fin de evitar que su carga caiga prematuramente, las asas microbiolgicas deben tener
un dimetro de 23mm y terminar en un anillo completamente cerrado. Los mangos no
deben tener ms de 6cm de longitud para reducir la vibracin al mnimo.
2. Para evitar el riesgo de que se produzcan salpicaduras de material infeccioso al flamear las
asas en el mechero de Bunsen, se utilizar un microincinerador elctrico cerrado para
esterilizar las asas. Es preferible utilizar asas desechables que no necesitan volver a ser
esterilizadas.
3. Al secar muestras de esputo debe procederse con cuidado para evitar la creacin de
aerosoles.
4. Las muestras y los cultivos desechados destinados a la autoclave o a la eliminacin se
colocarn en recipientes impermeables, como las bolsas de desechos de laboratorio.La
parte superior se cerrar (por ejemplo con cinta de autoclave) antes de tirarlas a los
recipientes para desechos.
5. Las zonas de trabajo se descontaminarn con un desinfectante apropiado despus de
cada periodo de trabajo.

Uso de las cmaras de seguridad biolgica

1. Habr que explicar a todos los posibles usuarios el modo de empleo y las limitaciones de
estas cmaras (vase el captulo 10), tomando como referencia las normas nacionales y
las publicaciones pertinentes. El personal recibir protocolos escritos o manuales de
seguridad o de operacin. En particular, ha de quedar claro que la cmara no protege al
trabajador de derrames, roturas o tcnicas incorrectas.
2. La cmara no debe utilizarse si no funciona correctamente.
3. La ventana de vidrio transparente no debe abrirse mientras se est utilizando la cmara.
4. Los aparatos y materiales introducidos en la cmara deben reducirse al mnimo y no deben
bloquear la circulacin del aire en la cmara de distribucin trasera.
5. No deben utilizarse mecheros de Bunsen en el interior de la cmara, ya que el calor
producido perturbar el flujo de aire y puede daar los filtros. Puede permitirse el uso de un
microincinerador, aunque es preferible utilizar asas estriles desechables.
6. Todo el trabajo debe hacerse en la zona media o posterior de la superficie de trabajo y ser
visible a travs de la ventana.
7. El paso de personas por detrs del trabajador debe reducirse al mnimo.
8. El trabajador no debe alterar el flujo de aire al sacar y volver a introducir repetidas veces
los brazos.
9. Las rejillas de aire no deben estar bloqueadas con papeles, pipetas u otros materiales,
pues con ello se perturba el flujo de aire y puede provocarse la contaminacin del material
y la exposicin del trabajador.
10. La superficie de la CSB deber limpiarse con un pao empapado con un desinfectante
apropiado una vez terminado el trabajo y al final del da
11. El ventilador de la cmara se encender al menos 5 minutos antes de empezar el trabajo y
debe seguir funcionando al menos durante 5 minutos despus de concluido el trabajo.
12. Nunca se introducirn papeles en las CSB.

Tcnicas para evitar la ingestin de material infeccioso y su contacto con la piel y

los ojos

1. Las partculas y gotculas de mayor tamao (>5mm) que se desprenden durante las
manipulaciones microbiolgicas se depositan rpidamente en la superficie de las mesas y
en las manos del trabajador. ste llevar guantes desechables. Los trabajadores del
laboratorio evitarn tocarse la boca, los ojos y el rostro.
2. En el laboratorio no se deben conservar ni consumir alimentos o bebidas.
 3. En el laboratorio no se colocarn objetos en la boca (lpices, goma de mascar).
4. En el laboratorio no se aplicarn cosmticos.
5. La cara, los ojos y la boca deben estar protegidos con una pantalla o de algn otro modo
durante cualquier operacin que pueda provocar salpicaduras de material potencialmente
infeccioso.

Tcnicas para evitar la inyeccin de material infeccioso

1. La inoculacin accidental debida a heridas por objetos de vidrio rotos o astillados puede
evitarse mediante prcticas y procedimientos cuidadosos. El material de vidrio debe ser
reemplazado por material de plstico siempre que sea posible.
2. La inoculacin accidental puede producirse como consecuencia de heridas con agujas
hipodrmicas, pipetas de Pasteur de vidrio o vidrios rotos.
3. El nmero de accidentes causados por agujas hipodrmicas puede reducirse restringiendo
al mnimo el uso de jeringuillas y agujas (por ejemplo, existen dispositivos sencillos para
abrir los frascos con tapn de diafragma de modo que puedan usarse pipetas en lugar de
jeringuillas y agujas), o utilizando dispositivos especiales de seguridad para objetos
cortantes y punzantes cuando se hace imprescindible utilizar jeringuillas y agujas.
4. Nunca deben volver a cubrirse las agujas. Los artculos desechables debern colocarse en
recipientes resistentes a la perforacin que tengan tapa.
5. Las pipetas de Pasteur de vidrio deben sustituirse por otras de plstico.

Separacin de suero

1. Slo realizar este trabajo personal de laboratorio debidamente capacitad

2. El personal llevar guantes y equipo protector de ojos y mucosas..
3. Slo una buena tcnica permite evitar o reducir al mnimo las salpicaduras y los aerosoles.
La sangre y el suero se deben pipetear con cuidado en lugar de verterlos. El pipeteo con la
boca estar prohibido.
4. Una vez usadas, las pipetas se sumergirn por completo en un desinfectante apropiado y
permanecern en l durante un tiempo suficiente, hasta que se eliminen o se laven y
esterilicen para volverlas a utilizar.
5. Los tubos de ensayo que se desea eliminar y que contienen cogulos de sangre u otros
materiales se colocarn, nuevamente con sus tapas, en recipientes impermeables
apropiados que se tratarn y esterilizarn en la autoclave o se incinerarn.
6. Habr que disponer de desinfectantes apropiados para limpiar las salpicaduras y los
derrames de material (vase el captulo 14).

Uso de las centrifugadoras

1. El funcionamiento mecnico satisfactorio es un requisito de la seguridad microbiolgica del

empleo de centrifugadoras en el laboratorio.
2. Las centrifugadoras se utilizarn segn las instrucciones del fabricante.
3. Las centrifugadoras deben colocarse a una altura tal que los trabajadores puedan ver la
cubeta para colocar correctamente los soportes y los cestillos
4. Los tubos de la centrifugadora y los recipientes de muestras destinados al uso en la
centrifugadora deben estar fabricados de vidrio grueso o, preferiblemente, de plstico, y
deben inspeccionarse para detectar defectos antes de usarlos.
5. Los tubos y los recipientes para muestras deben estar siempre bien cerrados (con tapn de
rosca si es posible) para la centrifugacin.
6. Los cestillos deben cargarse, equilibrarse, cerrarse y abrirse en una CSB.
 7. Los cestillos y los soportes se deben emparejar por el peso y equilibrar correctamente con
los tubos en su sitio.
8. El espacio que debe dejarse entre el nivel del lquido y el borde de cada tubo de
centrifugacin debe ser especificado en las instrucciones del fabricante.
9. Para equilibrar los cestillos vacos se emplear agua destilada o alcohol (propanol al 70%).
No se emplear suero salino ni solucin de hipoclorito porque ambos productos corroen los
metales.
10. Para los microorganismos de los grupos de riesgo 3 y 4 se utilizarn cestillos de
centrifugadora de cierre hermtico (cestillos de seguridad).
11. Cuando se utilicen rotores de cabeza angular, debe velarse por que el tubo no est
excesivamente cargado, ya que puede haber fugas del lquido.
12. El interior de la cubeta de la centrifugadora se inspeccionar a diario para observar si
existen manchas o suciedad en el rotor. Si stas son manifiestas, se deben examinar de
nuevo los protocolos de centrifugacin.
13. Los rotores y los cestillos de la centrifugadora deben observarse diariamente para detectar
signos de corrosin y grietas.
14. Los cestillos, los rotores y la cubeta de la centrifugadora deben descontaminarse despus
de cada uso.
15. Despus del uso, los cestillos se depositarn en posicin invertida a fin de vaciar el lquido
utilizado para equilibrar.
16. Al utilizar centrifugadoras pueden expulsarse partculas infecciosas transportadas por el
aire. Esas partculas salen despedidas a una velocidad demasiado alta para que las
retenga el flujo de aire de la cmara si la centrifugadora est funcionando en una CSB
tradicional con abertura frontal de las clases I y II. Si se colocan las centrifugadoras en
CSB de clase III se evita que los aerosoles emitidos se dispersen ampliamente. No
obstante, el empleo de una buena tcnica de centrifugacin y de tubos tapados
correctamente ofrece proteccin suficiente contra los aerosoles
infecciosos y la dispersin de partculas.

Uso de homogeneizadores, agitadores, mezcladores y desintegradores ultrasnicos

1. No deben utilizarse homogeneizadores domsticos (de cocina) en los laboratorios, pues

pueden tener fugas o desprender aerosoles. Los mezcladores y homogeneizadores de
laboratorio de tipo Stomacher son ms seguros.
2. Los tapones y los recipientes o frascos deben estar en buenas condiciones, sin
deformaciones ni fisuras. Los tapones deben ajustar bien y las juntas deben estar en buen
estado.
3. Durante el funcionamiento de los homogeneizadores, agitadores y desintegradores
ultrasnicos se produce un aumento de la presin dentro del recipiente, con lo que pueden
desprenderse entre la tapa y el recipiente aerosoles con materiales infecciosos. Se
recomiendan los recipientes de plstico, en particular de politetrafluoroetileno (PTFE),
porque el vidrio puede romperse y liberar material infeccioso, e incluso herir al trabajador.
4. Durante su utilizacin, hay que recubrir los aparatos con una funda fuerte de plstico
transparente, que se desinfectar una vez usada. Siempre que sea posible, estos
aparatos, con su funda de plstico, se utilizarn dentro de una CSB.
5. Una vez terminada la operacin, el recipiente se abrir en una CSB.
6. Las personas que utilicen desintegradores ultrasnicos deben llevar proteccin auditiva.

Uso de trituradores de tejidos

1. Los trituradores de vidrio deben sostenerse envueltos en una pieza de material absorbente
y con la mano enguantada. Son ms seguros los trituradores de plstico (PTFE).
2. Los trituradores de tejidos deben utilizarse y abrirse en una CSB.
Mantenimiento y uso de refrigeradores y congeladores

1. Los refrigeradores, congeladores y recipientes de nieve carbnica deben descongelarse y

limpiarse peridicamente; se eliminarn todos los tubos, ampollas y otros objetos que se
hayan roto durante el almacenamiento. Durante la limpieza se debe utilizar proteccin
facial y guantes de goma gruesa. Despus de la limpieza se desinfectarn las superficies
interiores de la cmara.
2. Todos los recipientes almacenados en refrigeradores y congeladores deben llevar
etiquetas bien claras con el nombre cientfico del contenido, la fecha de almacenamiento y
el nombre de la persona que los ha almacenado. Los materiales sin etiquetas y anticuados
deben tratarse en la autoclave y desecharse.
3. Debe mantenerse un inventario del contenido de los refrigeradores y congeladores.
4. No deben guardarse nunca soluciones inflamables en refrigeradores, excepto si estos son
a prueba de explosin. En las puertas de los refrigeradores se colocarn advertencias al
respecto.

Tcnicas para abrir ampollas que contengan material infeccioso liofilizado

Conviene abrir con precaucin las ampollas de material liofilizado pues, al estar cerradas a presin
reducida, la entrada brusca de aire puede dispersar el contenido en la atmsfera. Las ampollas
deben abrirse siempre dentro de una CSB. Para abrir las ampollas se recomienda el siguiente
procedimiento:

1. En primer lugar, descontaminar la superficie exterior de la ampolla.

2. Hacer con la lima una marca en el tubo, cerca de la mitad del tapn de algodn o celulosa,
si lo hay.
3. Sujetar la ampolla en un algodn empapado en alcohol para proteger las manos antes de
romperla por la marca.
4. Retirar con cuidado la parte superior y tratarla como si fuera material contaminado.
5. Si el tapn sigue estando por encima del contenido de la ampolla, retirarlo con una pinza
estril.
6. Reconstituir la suspensin aadiendo el lquido lentamente para evitar la formacin de
espuma.

Almacenamiento de ampollas que contengan material infeccioso

Las ampollas que contienen material infeccioso no se deben sumergir nunca en nitrgeno lquido,
ya que las que estn fisuradas o mal cerradas podran romperse o explotar al sacarlas. Si se
necesitan temperaturas muy bajas, las ampollas slo se deben almacenar en la fase gaseosa que
queda por encima del nitrgeno lquido. Tambin pueden almacenarse los materiales infecciosos
en congeladores mecnicos o nieve carbnica.
Al retirar las ampollas del almacenamiento en fro, el personal deber llevar protegidos los ojos y
las manos. Las ampollas conservadas por estos procedimientos se descontaminarn por fuera
siempre que se saquen del lugar de almacenamiento.

Precauciones normalizadas en relacin con la sangre y otros lquidos corporales, tejidos y

excreciones
Las precauciones normalizadas (que incluyen las precauciones universales (19)) estn
concebidas para reducir el riesgo de transmisin de microorganismos de fuentes de infeccin tanto
reconocidas como no reconocidas (2).

Recogida, etiquetado y transporte de muestras

 1. Se seguirn siempre las precauciones normalizadas (2); se usarn guantes en todos los
procedimientos.
2. La toma de sangre de personas y animales estar a cargo de personal capacitado.
3. En las flebotomas, los sistemas convencionales de aguja y jeringuilla se sustituirn por
dispositivos de seguridad al vaco de un solo uso que permitan recoger la sangre
directamente en tubos de transporte o de cultivo con tapn y que inutilicen la aguja
despus del uso.
4. Los tubos se colocarn en recipientes apropiados para el transporte al laboratorio (vase el
captulo 15 para ms informacin sobre los requisitos de transporte) y dentro del
laboratorio (vase en el presente captulo la seccin sobre transporte de muestras dentro
del servicio). Los formularios de peticin de examen se colocarn en bolsas o sobres
impermeables separados.
5. El personal de recepcin no debe abrir estas bolsas.

Apertura de tubos de muestras y muestreo del contenido

1. Los tubos de muestras deben abrirse en una CSB.

2. Deben usarse guantes. Tambin se recomienda proteger los ojos y las mucosas (gafas de
seguridad de tipo mscara o viseras).
3. Las prendas de proteccin se complementarn con un delantal de plstico.
4. Para sacar el tapn, ste se agarrar con un trozo de papel o de gasa con el fin de evitar
salpicaduras.

Vidrio y objetos punzantes y cortantes

1. Siempre que sea posible, se sustituir el material de vidrio por material de plstico. Slo se
utilizar vidrio duro especial para laboratorio (borosilicato); se desechar todo artculo que
est astillado o agrietado.
2. No se utilizarn agujas hipodrmicas para pipetear (vase tambin el apartado Tcnicas
para evitar la inoculacin de material infeccioso en el presente captulo).

Extensiones y frotis para el examen microscpico

La fijacin y tincin de muestras de sangre, esputo y heces para el microscopio no destruye
necesariamente todos los organismos o los virus de las extensiones. stas deben manipularse con
pinzas, almacenarse cuidadosamente y descontaminarse o tratarse en autoclave antes de
eliminarlas.

Equipo automtico (desintegradores ultrasnicos, mezcladores vorticiales)

1. El equipo debe ser cerrado para evitar la dispersin de gotitas y aerosoles.

2. Los efluentes se recogern en recipientes cerrados y se tratarn en la autoclave o se
eliminarn.
3. El equipo se desinfectar al final de cada sesin de trabajo, siguiendo las instrucciones del
fabricante.

Tejidos

1. Se utilizarn fijadores a base de formol

2. Se evitarn los cortes de material congelado. Cuando sea necesario, el criostato estar
protegido y el trabajador llevar visera de seguridad. Para la descontaminacin, la
temperatura del instrumento se elevar a 20C, como mnimo.
Descontaminacin
Para la descontaminacin se recomiendan hipocloritos y desinfectantes de alto nivel. Las
soluciones de hipoclorito recin preparadas contendrn cloro disponible a razn de 1 g/l para uso
general, y de 5 g/l para limpiar derrames de sangre. Para la desinfeccin de superficies puede
utilizarse glutaraldehdo (vase el captulo 14).
Precauciones con materiales que puedan contener priones
Los priones, tambin conocidos como virus lentos, se asocian a las encefalopatas
espongiformes transmisibles, en particular la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (incluida la nueva
variante), el sndrome de Gerstmann-Strussler-Scheinker, el insomnio familiar letal y el kuru en el
ser humano; la tembladera en el ganado ovino y caprino; la encefalopata espongiforme bovina en
el ganado bovino, y otras encefalopatas transmisibles en el reno, el alce y el visn. Aunque la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob se ha transmitido a seres humanos, no parece que existan casos
demostrados de infecciones asociadas al laboratorio provocadas por ninguno de esos agentes. Sin
embargo, es prudente observar ciertas precauciones en la manipulacin de material procedente de
personas y animales infectados o posiblemente infectados.
La seleccin de un nivel de bioseguridad para trabajar con materiales asociados a las
encefalopatas espongiformes transmisibles depender de la naturaleza del agente y de las
muestras que vayan a estudiarse, y se realizar en consulta con las autoridades nacionales. Las
mayores concentraciones de priones se localizan en los tejidos del sistema nervioso central. Los
estudios en animales indican que tambin se encuentran concentraciones elevadas en el bazo, el
timo, los ganglios linfticos y el pulmn.

Estudios recientes indican que los priones presentes en los tejidos de la lengua y del msculo
esqueltico tambin pueden suponer un riesgo de infeccin (2023).

Dado que es difcil conseguir la inactivacin completa de los priones, es importante insistir en que
se utilicen instrumentos desechables siempre que sea posible, as como una cubierta protectora
desechable para la superficie de trabajo de la CSB.

La principal precaucin que hay que adoptar es evitar la ingestin de material contaminado y la
puncin de la piel del trabajador. Adems, se tomarn las siguientes precauciones, ya que estos
agentes no son inactivados por los procesos normales de desinfeccin y esterilizacin del
laboratorio:

1. Se recomienda encarecidamente utilizar equipo exclusivo, es decir, no compartido con

otros laboratorios.
2. Se llevar ropa protectora (batas y delantales) y guantes (de malla de acero entre guantes
de goma para los anatomopatlogos) desechables.
3. Se recomienda encarecidamente el uso de material de plstico desechable, que puede
tratarse y eliminarse como residuo seco.
4. No deben utilizarse procesadores de tejidos debido a los problemas de desinfeccin.
Se utilizarn en su lugar frascos y vasos de boca ancha de plstico.
5. Todas las manipulaciones se realizarn en CSB.
6. Se tendr gran cuidado para evitar la produccin e ingestin de aerosoles, as como los
cortes y punciones de la piel.
7. Los tejidos fijados con formol seguirn considerndose infecciosos, aun despus de una
exposicin prolongada al formol.
8. Las muestras histolgicas que contengan priones quedan sustancialmente inactivadas por
la exposicin durante 1h al cido frmico al 96% (24, 25).
9. Los residuos del lugar de trabajo, incluidos los guantes, las batas y los delantales
desechables, se tratarn en la autoclave utilizando un esterilizador de vapor para
sustancias porosas a 134137 C durante un ciclo de 18 minutos, o seis ciclos sucesivos
de 3 minutos cada uno, seguidos de incineracin.
10. Los instrumentos no desechables, incluidos los guantes de malla de acero, deben
recogerse para ser descontaminados.
 11. Los residuos de lquidos infecciosos contaminados con priones deben tratarse durante 1h
con hipoclorito sdico con 20 g de cloro libre por litro (2%) (concentracin final).
12. Los procedimientos de vaporizacin con paraformaldehdo no disminuyen los ttulos de
priones. Los priones son resistentes a la radiacin ultravioleta. A pesar de ello, deben
seguir descontaminndose las cmaras por los mtodos habituales (formaldehdo
gaseoso) para inactivar otros agentes que puedan estar presentes.
13. Las CSB y otras superficies contaminadas por priones pueden descontaminarse con
hipoclorito sdico (20 g de cloro libre por litro: 2%) durante 1h.
14. Los filtros HEPA deben incinerarse a una temperatura mnima de 1000 C despus de
retirarlos. Otros pasos recomendados antes de la incineracin son los siguientes:
a. rociar la cara expuesta del filtro con laca para el cabello antes de retirarlo;
b. introducir los filtros en bolsas durante su extraccin, y
c. extraer el filtro HEPA desde la cmara de trabajo, de modo que la cmara de distribucin
inaccesible no se contamine.
15. Los instrumentos se sumergirn en hipoclorito sdico (20 g de cloro libre por litro: 2%)
durante 1h, y a continuacin se enjuagarn cuidadosamente en agua antes de tratarlos en
la autoclave.
16. Los instrumentos que no puedan tratarse en la autoclave pueden limpiarse mojndolos
repetidamente con hipoclorito sdico (20 g de cloro libre por litro: 2%) durante 1h. Se
enjuagar cuidadosamente a fin de eliminar los residuos de hipoclorito sdico..

Manual de bioseguridad en el laboratorio