INNOVACIN PARA EL DESARROLLO

Produccin industrial de penicilina

Un antibitico es un producto del metabolismo secundario de muchos seres vivos que inhibe el crecimiento de otros organismos o induce la muerte. Son molculas que actan sobre las membranas y paredes microbianas, la replicacin y la transcripcin del DNA, la sntesis de protenas y, en general, sobre el metabolismo de los microorganismos a diferentes niveles. La observacin de Alexander Fleming en 1929 de que los penicillum notatum inhiban el crecimiento de los estafilococos condujo al desarrollo del procese de produccin de la penicilina, inicindose la era de los antibiticos. Las penicilinas son antibiticos del grupo de los betalactmicos empleados profusamente en el tratamiento de infecciones provocadas por bacterias sensibles. Distintas penicilinas son producidas a partir de Penicillum chrysogeizuin por adicin de una apropiada cadena carboxlica en cantidad adecuada en el medio de cultivo, pero solamente tienen valor teraputico la penicilina G y la V.

Hay dos tipos de procesos para la produccin microbiologa de antibiticos: 1. El proceso superficial, mediante el cual el microorganismo productor de antibitico se desarrolla en forma de un almohadilla sobre la superficie de un medio lquido, en bandejas o frascos, o en la superficie de un sustrato solido hmedo finamente fragmentado; por ejemplo, virutas de madera o salvado de trigo. 2. El proceso de inmersin, mediante el cual el microorganismo se desarrolla en un medio lquido mantenido bajo agitacin mecnica y aireacin continuas, de modo que el microorganismo se desarrolla de manera uniforme y homognea en la forma de una suspensin de clulas aisladas o pequeos agregados o colonias en todas reas del lquido de cultivo.

Produccin de penicilina por inmersin

El proceso de inmersin acelera en forma notoria el desarrollo y facilita la manipulacin de cantidades importantes de microorganismos. Este proceso es mucho ms eficiente que los procesos superficiales y, por lo tanto, es el nico procedimiento factible para la produccin comercial en gran escala.

Etapa I. Preparacin de la materia prima

Etapa de desarrollo en el laboratorio Normalmente la cepa de produccin es mantenida como esporos liofilizados o en nitrgeno lquido. Otra alternativa es mantener el desarrollo vegetativo en nitrgeno lquido o congelado a -70 C. El desarrollo del inculo se lleva a cabo a 25 C en agares inclinados y matraces erlenmeyers, para inocular los tanques de sembrado (etapa de proliferacin o propagacion) es necesario disponer de un gran nmero de esporos (conidios). Usando un medio para esporulacin (semillas de cereales, afrecho de trigo humedecido, pan integral, etc.) se preparan los conidios de la cepa utilizada. La concentracin de esporas (ptima 5x103/ ml) y la formacin de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Luego de 6-10 dias los cultivos estn bien esporulados y puede inocularse un tanque de sembrado donde los conidios germinan y generan en 1-2 das un micelio activo, suficiente para inocular un fermentador.

Desarrollo en tanques de sembrado El inoculo para el fermentador se obtiene incrementando en forma progresiva la magnitud del crecimiento a travs de una serie de tanques de sembrado; se pasa de un tanque a otro trasfiriendo el producto bajo presin de aire a travs de caeras estriles. En general este inoculo masivo equivale a un 5-10% de la partida principal; por lo tanto, los tanques de siembra equivalen a alrededor de 1/10 del volumen del tanque de gran tamao subsiguiente. La transferencia vegetativa continua del hongo en medios artificiales conduce a una prdida de la capacidad productora de penicilina (degeneracin fisiolgica), en consecuencia, es necesario minimizar la cantidad de transferencias intermedias entre el cultivo madre y la partida final.

Medio de cultivo para la fermentacin En la fermentacin el medio de cultivo es diferente al de proliferacin, ya que ahora se trata de favorecer la elaboracin del antibitico por sobre el desarrollo del micelio. Los antibiticos, as como los pigmentos, son metabolitos secundarios. Medio de produccin tpico Licos de maz (solidos)...2% a 5% Lactosa bruta..2% a 3% Carbonato de calcio...0.5% a 1% El medio de cultivo utilizado para la produccin comercial de penicilina por lo general contiene material nitrogenado natural, nitrato, cido -aminoadpico, harina de semillas de algodn o alcohol de maz (un producto intermedio de la industria de la molienda del maz), lactosa, precursor de la cadena lateral, un agente tensioactivo y sales minerales (incluido el sulfuro), tambin se adicionan compuestos inorgnicos conteniendo hidrogeno, oxigeno, fsforo, azufre, potasio, magnesio, nitrgeno y trazas de hierro, cobre y zinc. Despus de ajustar el pH a 4,5-5,0, el medio de cultivo se pasa al fermentador.

Etapa II. Biorreaccin

Fermentadores Para la fabricacin de penicilina se utilizan tanques cerrados estacionarios, conocidos como tanques fermentadores, con una capacidad de 20000 a 115000 litros. La mayora de estos tanques esta provista de mezcladores a hlice o turbina y un dispositivo mecnico para distribuir aire estril, el cual se encuentra acoplado en la regio del mezclador para alcanzar un mximo efecto de dispersin. Los tanques tienen una compuerta de acceso desarmable en la parte superior, visores y salidas para lneas de muestreo a vlvula y cmaras de alimentacin accesorias, lo que la inoculacin manual si fuera necesaria (sobre todo en el caso de tanques de sembrado pequeo) y el agregado de otros materiales (estriles), como agentes antiespuma, durante la fermentacin. Todas las salidas de los tanques estn constantemente expuestas a un chorro de vapor para minimizar el riesgo de contaminacin. El medio de cultivo se esteriliza mediante vapor a alta presin con enfriamiento ulterior-. Durante el desarrollo del hongo la temperatura se mantienen automticamente entre 23C y 25C. El aire comprimido introducido en los fermentadores es esterilizado por filtracin a travs de cartuchos de tamao adecuado esterilizados al vapor y rellenados, por ejemplo, con lana de vidrio. El aire estril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitacin facilita su uniforme distribucin en el seno del lquido.

La fermentacin de penicilina es un proceso aerbico con una velocidad de absorcin volumtrica de oxgeno de 0,4-0,8 mM/l min. La aireacin presenta un problema especial en esta fermentacin, debido a que al incrementarse la biomasa, y por consiguiente la demanda de O2, aumenta tambin la viscosidad del medio, lo cual crea una resistencia importante para la transferencia de oxgeno. La velocidad de aireacin requerida est entre 0,5-1,0 volmenes de aire (volumen de lquido)-1 min-1 dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Se debe cuidar en esta fase no tener un exceso de glucosa debido a que el mismo puede ocasionar una inhibicin de la actividad o de la sntesis de enzimas involucradas en la biosntesis de penicilina. Al cabo de unas 50 a 90 horas el crecimiento se va haciendo ms lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por completo. Condiciones especiales del fermentador Caractersticas especficas de penicilina que debe ser considerado cuando se intenta fermentacin: La mayora de las penicilinas constituyen caldos filamentosos que son pseudoplstico (no Newtoniano) en la naturaleza. Esto significa que pueden ser difciles de mezclar, debido a su alta (Y no constante) viscosidad. Asimismo, el aumento de la viscosidad del caldo puede obstaculizar la transferencia de oxgeno. Lo que nos lleva al siguiente punto. La penicilina es un organismo aerbico, por lo tanto la tasa de suministro de oxgeno es crtico a la fermentacin. As, el reactor debe tener un suministro de oxgeno eficiente sistema. El pH ptimo para el crecimiento de la penicilina es de 6,5. As, el reactor debe mantener pH eficientemente (esto se hace con frecuencia mediante la adicin de NaOH). Los problemas de estabilidad de deformacin no existen y el mantenimiento de la cepa cuidado es obligatorio. Duplicacin de la biomasa es de aproximadamente 6 horas.

Etapa III. Purificacin

Actualmente la extraccin con solventes es la base para la separacin y purificacin de la penicilina. El primer paso consiste en separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vaco tipo cilndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 - 4 C con el objeto de disminuir la degradacin enzimtica y qumica durante las etapas de extraccin posteriores.

Las penicilinas G y V son cidos fuertes (pKa entre 2.5 - 3.1). Las formas cidas son solubles en muchos solventes orgnicos y se pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 - 3.0. La extraccin se puede realizar en operaciones continuas, a contracorriente en extractores centrfugos en etapas mltiples, a temperaturas de 0 - 3 C. Otra posibilidad es el empleo de mezcladores estticos o decantadores, los cuales tienen en menor costo de inversin. Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan en medio cido con una cintica de primer orden a una velocidad proporcional a la temperatura y recproca con respecto al pH. Esto hace que la vida media en condiciones de eficiente extraccin en medio cido sea muy reducida. Sin embargo como la forma V en tales condiciones es ms estable que la G, si el objetivo es obtener 6-amino penicilnico (6-APA) la produccin de penicilina V es ms aconsejable. La extraccin de penicilina se puede realizar en una o ms etapas sucesivas, con una acidificacin del caldo filtrado con H2SO4 o H3PO4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante (0,003 - 0,1% P/P, en el solvente), realizndose la extraccin y concentracin en extractores centrfugos. Dependiendo de las especificaciones de uso final, el solvente conteniendo penicilina se puede tratar con carbn para separar pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmente no se realiza debido a las bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientos obtenidos. La cristalizacin se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los valores crticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concentracin de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalizacin a partir de un solvente se requiere tambin un exceso de Na + o K+, siendo los cristales recuperados en un filtro rotatorio a vaco. Estos cristales son lavados y presecados con un solvente voltil que tambin separa impurezas coloreadas. El secado definitivo se puede realizar con aire caliente, vaco o calor radiante.

Bibliografa
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