UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE TECMAC.

APUNTES DE ANALISIS FISICOQUMICOS Y MICROBIOLGICOS

UNIDAD 5. ANLISIS DE VEGETALES.

INTRODUCCIN Uno de los problemas principales que afrontan los agricultores y profesionales son las memas en produccin, tanto en la calidad como en la cantidad en los cultivos, ya sea por la carencia de uno o mas elementos no esenciales para el crecimiento vegetal, como consecuencia de su precipitacin, inmovilizacin o fijacin o porque uno o varios macroelementos se encuentren en cantidades excesivas o niveles txicos. Para resolver dicho problema se han desarrollado mtodos de diagnstico entre los cuales se encuentran el anlisis de suelos (edafolgico), identificacin sintomatolgica, pruebas biticas y en ANLISIS VEGETAL, tambien conocido como ANLISIS FOLIAR o ANLISIS NUTRIMENTAL DE PLANTAS. Cuyo objetivo principal es el diagnosticar anomalias nutrimentales que puedan presentar las plantas de cultivo. Elementos diagnstico como la movilidad de los nutrimentos, variaciones en la forma, color, hbito y estado general de la planta son importantes as como condiciones del suelo, clima, manejo e incidencia de plagas y enfermedades. La identificacin de deficiencias latentes se hace determinando la concentracin de uno o varios nutrimentos, determinando su nivel en ZONA DE CARENCIA O DEFICIENCIA LATENTE. Cabe sealar que muchos de los nutrientes presentes en el suelo suelen ser antagonistas para otros causando una deficiencia de un elemento por exceso del otro, Por ejemplo, la absorcin excesiva de manganeso induce una deficiencia de hierro, alta fertilizacin con fsforo afecta la absorcin de zinc o un fuerte encalado puede restringir la asimiliacin de potasio.

MUESTREO. Es de suma importancia la colecta de material vegetal donde el muestreo en forma correcta arrojara resultados del anlisis representativos. Cabe sealar que se pueden analizar por separado los rganos en distintas etapas de desarrollo. Es importante considerar el nmero de partes a colectar o el nmero de plantas por muestra, ya que la distribucin de los elementos esenciales en la planta no es homogenea. Debido a las diferencias fisiolgicas y morfolgicas que existen entre especies y genotipos, la acumulacin de nutrimentos mostrar variaciones, ya que las diferentes especies de plantas y sus variedades respectivas pueden diferir en su respuesta a las presiones nutrimentale por deficiencia o exceso. Al colectar el material se debe de tener cuidado que la muestra no sea alterada qumicamente o contaminada por materiales extraos o por contacto con los contenedores y herramientas de muestreo. Las condiciones durante el transporte como la temperatura y la humedad pueden afectar la integridad de la muestra. El tejido vegetal fresco se puede guardar en bolsas de plstico a una temperatura de

5C sin exceder 24 h para su anlisis. Es mas recomendable el secado al aire libre y el empacado de bolsas de papel ventiladas. El rgano que habr de colectarse es de gran importancia ya que la acumulacin de nutrimentos en la planta es del todo diferencial y depender de diversos factores tanto endgenos como exgenos. Se debe de considerar la poca (estado fonolgico) pues la concentracin de los elementos disminuye conforme se va alcanzando la madurez, de tal manera que plantas muy jvenes sern siempre ms ricas en nutrimentos que las adultas. Previa definicin de la poca y rgano colectado es importante determinar el nmero de muestras. De forma general se puede calcular mediante la siguiente frmula. n = (t2 * N * V) / (t2 * V + NE2) Donde n: nmero de muestras para anlisis, N: nmero de individuos en la poblacin, E: lmite de error (tolerancia), t: grados de libertad (nivel de probabilidad en tablas de distribucin t student), V: varianza.

Preparacin de las muestras. La preparacin de las muestras involucra las etapas previas al anlisis qumico y son: a) Limpieza del material para eliminar la contaminacin superficial. Con la finalidad de eliminar residuos de aspersiones de nutrimentos, insecticidas o fungicidas, Se realiza con el lavado del material con detergente al 0.1 0.3% seguido de un enjuague con agua destilada. Es de suma importancia si en el anlisis se determinar hierro o alumnio. El lavado debe ser lo mas pronto posible para evitar el lixiviado de nutrimientos. b) Secado de las muestras para detener la actividad enzimtica y acondicionar el material para la molienda.- paso esencial, secado inicial a temperatura ambiente y posteriormente a 80C. El secado a altas temperatura provoca descomposicin trmica. Por tanto, la temperatura sea lo suficientemente alta para inactivar enzimas resposables de la degradacin y para remover la humedad sin originar una descomposcin trmica c) Molienda para reducir el tamao y homogeneizar el material.- se realiza para facilitar su manejo y lograr una mayor homogeneidad. Los equipos mas probados son i. Molino Wiley (de cuchillas), ii. Molino Hammer (de martillos), iii. Mortero con pistilo y iv. Molino de porcelana (de bolas). d) Secado final hasta peso constante. Para comprobar la eliminacin de la humedad. En la conservacin de las muestras, stas deben ser transportadas en bolsas de papel para su transporte y en el laboratorio en un lugar fresco y seco (en congelacin)

PROCEDIMIENTOS ANALTICOS. Es comn que antes de cada tcnica analtica se realice una digestin previa, con la finalidad de destruir los componentes orgnicos y liberar los elementos minerales. De forma general, existen dos procedimientos, la digestin hmeda que utiliza combinaciones de cido ntrico, sulfrico, perclrico o clorhdrico, pero tambin

perxido de hidrgeno y metanol. En la digestin seca, los procedimientos varan en cuanto a temperatura y duracin en la mufla, Se recomienda que la temperatura no exceda 500C entre 2 a 8 hrs. Digestin HMEDA.- Es el procedimiento ms adecuado para determinar casi todos los elementos presentes en la fraccin mineral, usando cidos minerales de alta pureza para aumentar la precisin en la cuantificacin de microelementos. La oxidacin en medio lquido se realiza con las siguientes mezclas: cido sulfrico / perclrico / ntrico. cido sulfrico / nitrico, cido ntrico / perclrico / metanol. cido sulfrico / perxido de hidrgeno o cido sulfrico / selenio elemental / sulfato de sodio. Donde: cido ntrico: abastece oxgeno para la oxidacin y disminuye la tempratura cido perclrico: desdobla complejos orgnicos, evita espuma y proyeccin. cido sulfrico: transforma cationes a sulfatos, evita espectros en espectroscopia atmica por arco elctrico, diluye el cido perclrico, regula degradacin de compuestos orgnicos y deshidrata el silicio. Perxido de hidrgeno: aumenta el poder oxidante y disminuye el tiempo de digestin Metanol: solubiliza lipidos.

Digestin SECA: Es recomendable para determinar Silicio, Calcio, Magnesio, Sodio, Potasio y Fsforo, as como Cloro y Boro adicionando secuestrantes bsicos. Se realiza por incineracin con la adicin de cido sulfrico, sulfrico / etanol, xido de calcio / xido de magnesio, nitrato de calcio / nitrato de magnesio, xido de calcio / hidrxido de sodio o carbonado de sodio. Donde: cido sulfrico: oxida los compuestos orgnicos y transformacin a sulfatos de cationes. Etanol: incineracin inicial de las muestras por peroxidacin. cido actico: formacin de acetatos de los cationes. cido ntrico: formacin de nitratos de los cationes. xido de calcio: retiene elementos de inters como el cloro o el boro. Hidrxido de sodio y carbonado de sodio: agente secuestrante de elementos durante la ignicin. Compuestos inorgnicos Nitrgeno Total (Mtodo Kjeldahl) El nitrogeno orgnico y nitratos (cuando se adiciona cido saliclico) son convertidos a amoniaco en presencia de cido sulfrico, el cual posteriormente es destilado y recibido en cido brico para finalmente ser cuantificado con un cido fuerte en presencia del indicador verde de bromocresol-rojo de metilo. Los catalizadores utilizados son el cobre, selenio o mercurio, aumentando el punto de ebullicin del cido sulfrico al aadir a la reaccin sulfato de sodio y sulfato de potasio. La mezcla indicadora es verde a pH alcalino y roja en la regin cida. El punto final es de grisrosado a incoloro. El cido saliclico retiene nitratos en forma de salicilatos. La

cantidad de material vegetal es de 2 g. Secado a la estufa a 105C/5 h. Clculos: %N = mL H2SO4 * N del H2SO4 * 14 Fsforo (Mtodo del Vanadato-Molibdato Amarillo). Los iones vanadato, molbdato y ortofosfato reaccionan para dar un complejo de coor amarillo en soluciones cidas. La concentracin ptima de cido ntrico es de 0.5N, donde el color de reaccin se desarrolla satisfactoriamente. La concentracin de fsforo se determina mediante una curva de calibracin en un intervalo de 0 a 25 ppm. La absorbacia se lee a 470 nm. La alcuota de la muestra digerida y filtrada es generalmente de 1 mL (varia entre 5 a 8 mL), su variacin depende del contenido de fsforo esperado.

Potasio y Sodio (Espectroscopia atmica de emisin de flama, Flamometra) El potasio y el sodio son desempean funciones de regulacin osmtica y electroltica en plantas. El potasio adems funciona como activador enzimtico en ms de 50 vas metablicas, su concentracin vara de 0.2% hasta un 11% (mil veces mas que en en suelo). El sodio puede sustituir al potasio en muchos tipos de cultivo, aunque para muchos otros puede ser txico cuando esta presente en un 15% o mas en el suelo. La espectroscopia atmica de emisin es el mtodo de eleccin ya que es rpido, preciso y econmico. La muestra se obtiene de la digestin hmeda. Se debe de ajustar el equipo con una curva de calibracin. Tambin es recomendable determinarlos por absorcin atmica donde las de absorcin son 766.5 nm para potasio y 589 nm para el sodio. Clculos: %K,Na=(Transmitancia*Vol.Digestin*Vol.Dilucin*100)/(pendiente*peso muestra*alcuota)

Calcio y Magnesio (Espectroscopia atmica de absorcin) Las cantidades de calcio y magnesio van del 0.01 al 2% debido a la poca movilidad, tipo de cultivo, rgano colectado y estado fenolgico. La concentracin de calcio es de 2 a 4 veces mayor que la de magnesio. Estos elementos pueden cuantificarse por absorcin atmica tanto en una flama de oxido nitroso-acetileno, como en la de aireacetileno. La interferencias pueden ser eliminadas mediante el uso de sodio para la primera y en la segunda con EDTA o sales de lantano, estroncio o bario. En la flama de aire acetileno Mn, Al y fosfatos deprimen la respuesta (Fe, Na y K no afectan la respuesta). Para disminuir la interferencia por bicarbonatos es recomendable la acidificacin de la muestra a un pH entre 1.8 a 3.8. Al realizar el ajuste a cero de la curva de calibracin se realiza con una mezcla de oxido de lantano diluda 1;10. La respuesta lineal se conserva a concentraciones entre 0 a 10 ppm para calcio y de 0 a 1 ppm para magnesio.

Azufre total (digestin con cido ntrico / cido perclrico, turbidimetra) Las cantidades de azfre en la materia vegetal vara de 1500 a 5000 ppm (0.15 al 0.5%). En cido clorhdrico el in sulfato se precipita con cloruro de bario, generando cristales de sulfato de bario en suspensin, la cual se mide la densidad ptica para determinar su concentracin a 420 nm. La muestra predigerida con cido ntrico por

30 min. destruye la materia orgnica oxidable as como la oxidacin de sulfuros a partir de la hidrlisis de compuestos orgnicos. Concentraciones mayores de 40 ppm disminuyen la exactitud del mtodo por inestabilidad del sulfato de bario, la concentracin mnima detectable es de 1 ppm de sulfatos. La turbidez mxima se obtienen a partir de los 2 min mantenindose constantes entre 3 y 10 min. Es recomendable que se elimine materia en suspensin por filtracin. Concentracines mayores de 500 ppm de slice pueden interferir el mtodo.

Hierro (Espectroscopia atmica de absorcin) Los contenidos de hierro en vegetales oscilan entre 10 a 1500 ppm. Este elemento se puede determinar mediante absorcin atmica, con interferencias qumicas despreciables. El hierro se encuentra comnmente asociado a fosfatos, niquel, alumnio, calcio y sodio que no causan interferencias en el mtodo. Tampoco importa el estado de oxidacin de dicho elemento. Se requiere que el agua utilizada para su anlisis sea bidestilada o desionizada utilizando equipo de vidrio, evitando el contacto con superficies metlicas y polvo. Como el hierro se encuentra como elemento traza en muchos reactivos qumicos, es recomendable correr un blanco.

Manganeso (Espectroscopia atmica de absorcin) Los contenidos de manganeso en plantas varia dende 5 a 3000 ppm, incluso en algunos cultivos se puede encontrar hasta mas de 1000 ppm. Dicho elemento puede determinarse por absorcin atmica en la forma en que se encuentre (cloruro, sulfato, nitrato o permanganato). La presencia de Cr, Co, Fe, Mg, Ni y Zn an en altas concentraciones No afectan la respuesta al manganeso, sin embargo, el zinc puede originar una disminucin en la absorcin si esta como sulfato. Tambin la presencia de altas concentraciones de aluminio interfieren ligeramente en la absorcin del manganeso. En presencia de cido perclrico, el manganeso es extrado en digestin hmeda y como su absorcin depende de su valencia, es recomendable reducir el manganeso a su forma divalente en presencia de nitrato de sodio o cloruro de hidroxilamina.

Cobre (Espectroscopia atmica de absorcin) El cobre en plantas se encuentra en concentraciones muy pequeas, generalmente entre 2 a 50 ppm. Por absorcin atmica dicho elemento se encuentra libre de interferencias, independientemente del anin con el que este combinado (cloruros, sulfatos o nitratos). Elementos como el Zn, Fe, Al, Sn, Ni, Na y Pb, comnmente encontrados con el cobre no influyen en su absorcin aun en altas concentraciones. Como los destiladores generalmente estn hechos de cobre, es conveniente redestilar el agua en un equipo de vidrio o desionizarla por intercambio catinico.

Zinc. (Espectroscopia atmica de absorcin) El contenido de zinc en plantas esta del orden de 5 a 10 ppm. En su determinacin por absorcin atmica, la mezcla de aire acetileno es la mas usada, aunque puede utilizarse la mezcla aire propano, aire-hidrgeno y xido nitroso-acetileno. Soluciones de cloruro, nitrato o sulfato de zinc tienen idntica absorcin, los iones de Al, Cu, Ni,

Fe, fosfatos, Cd, Mg, Sn y Ag no interfieren aun en grandes cantidades. Un mtodo alterno para su determinacin es la tcnica colorimtrica de la ditizona que es sensible y precisa.

Molibdeno (Espectroscopia atmica de absorcin) Los contenidos de molibdeno en plantas son del orden de 0.1 a 45 ppm aunque existen reportes tan altos como 150 a 200 ppm en condiciones particulares. La absorcin atmica usando flama de aire-acetileno u xido nitroso-acetileno son los mas utilizados. El Cd, Cr, Cu, Fe, Pb, Zn y Sn no interfieren con el mtodo an en grandes concentraciones. Si no se dispone del equipo de absorcin atmica, se puede determinar su concentracin por el mtodo colorimtrico del tiocianato.

Boro (Colorimetra con Curcumina y cido oxlico) Existen una variedad de mtodos para la determinacin del boro en plantas, sin embargo, los mas utilizados son el de la quinalizarina, carmn y curcumina. El primero tiene la desventaja de presentar interferencias como la temperatura constante, disociacin del cido utilizado y la presencia de agentes oxidantes. El mtodo de carmn es muy sensible (0.05 ppm) pero es necesario utilizar un medio fuertemente cido para desarrollar color en la reaccin. El procedimiento de la curcumina permite una mayor sensibiliad, aunque metales como el Fe, Mo, Ti, Ta y Zr desarrollan el mismo complejo colorido que el boro, aunque el nico interferente por su concentracin es el hierro. Su ventaja principal es que no es necesario un control estricto de la temperatura ya que se lleva a cabo entre 55 y 110C y el complejo rosacianina se forma con un cido mineral fuerte en medio lquido acuoso. La curcumina (1-7bis(4 hidroxi 3 metoxifenil) 1,6 heptadieno, 3,5) es evaporada a sequedad en solucin alcalina con boro y desarrolla un color amarillo al ocurrir la protonacin del complejo. Al agregar cido acetico-cido sulfrico, el color cambia a rojo prpura llamado rosacianina, soluble en etanol y estable por varias horas. El volumen de curcumina debe ser 4 veces mayor al volumen de la alcuota. Es conveniente regular la temperatura entre 55 +/- 3C. Reactivos con cantidades apreciables de boro por ser envasados en recipientes de borosilicato deben de evitarse

Cloruros (Turbidimetra y Potenciometra) Las cantidades excesivas de este elemento en suelo inducen toxicidad en plantas, aunque es esencial pues su concentracin en plantas oscila entre 0.25 a un 1% en tejido vegetal seco. Es considerado un micronutriente que participa en la evolucin del oxgeno (fotolisis del agua) en el fotosistema II. Adems mantiene la presin osmtica de las vacuolas, afecta la regulacin estomtica e incrementa la hidratacin del tejido vegetal. El cloruro como anin compite en su absorcin con nitratos, fosfatos y sulfatos. Generalmente las plantas deficientes en cloro muestran clorosis (amarillamiento) de hojas jvenes y marchitamiento generalizado de la planta. Su exceso ocasiona amarillamiento prematuro foliar, quemaduras de puntas y mrgenes de hojas, bronceado y abscisin de las hojas. El mtodo turbidimtrico toma los filtrados de la digestin hmeda en presencia de cido ntrico concentrado se le adiciona nitrato de plata el cual forma Cloruro de

Plata que se lee a 400 nm. En el mtodo potenciomtrico se prepara una curva tipo con 1000, 100 y 10 ppm de KCl. Despus se prepara el potencimetro y se lee en mVolts. Las lecturas se interpolan en la curva tipo al valor que corresonda en concentracin.

Compuestos nitrogenados y oxalatos. Aminocidos libres (mtodo de la Ninhidrina) Los aminocidos (aa) son biomolculas integradas por un extremo amino, carbono quiral con su residual y un extremo carboxilo, pueden estar solos o interactuar en forma covalente mediante el enlace peptdico (AMIDO) para la formacin de protenas. Se han identificado 21 aa esenciales, aunque existen muchos mas que participan en forma aislada o en pequeos pptidos en la economa celular. La reaccin con la Ninhidrina es utilizada para su deteccin y medicin cuantitativa de aa y pptidos. El resultado de la reaccin da una sustancia llamada Azul de Ruherman que tiene un color violaceo con una de mxima absorcin a 540 nm, la excepcin es la prolina que da una coloracin amarilla ( max a 440 nm). Su medicin cuantitativa se basa en la ley de Beer. Los aa del tejido vegetal seco se obtienen con una agitacin a 180 rpm/min por 15 min.. Calculos Mg.aa = (Absorbencia*Vol.extraccin*Vol.dilucin*100*Fact.Dil)/ (pendiente*peso(mg)*alcuota)

Protenas solubles (Mtodo de Lowry) Las protenas son macromolculas de alto peso molecular y de gran complejidad que cumplen infinidad de funciones en la economia celular, son polmeros constituidos por aa. En un enlace amido llamado peptdico. Uno de los mtodos para su determinacin es el de Lowry que cuantifica protenas solubles en la muestra a partir del reactivo de Folin que son sales de cobre. La determinacin se realiza por curva tipo, donde la cantidad de protena presente por gramo de planta se considera las diluciones hechas y el peso original de la muestra

Nitratos (Mtodo de Cataldo) Las plantas absorben el nitrogeno como nitrato, amonio, aa y como urea. El nitrato es la forma nitrogenada ms abundante en suelo. Las races absorben los nitratos y los reducen y almacenan en vacuolas o transportados al tejido foliar. Su reduccin es ms activa durante el da que en la noche gracias a la mayor disponibilidad de sustratos carbonados y al poder reductor de la fotosntesis. El complejo formado por la nitracin del cido saliclico en condiciones fuertemente cidas presenta una mxima absorcin a 410 nm en una solucin bsica a pH>12. La absorbencia del cromoforo formado es proporcinal a la concentracin de nitratos, Ni los iones amonio, nitrito y cloruros no interfieren en la reaccin.

N-uredos (Mtodo de Young y Conway) En la mayora de los cultivos la urea puede ser metabolizada probablemente

hidrolizada por la ureasa para formar dos molculas de amonio y una de anhdrido carbnico. Ciertos compuestos nitrogenados contienen uniades de urea llamados uredos. La citrulina, alantona y el cido alantico son ejemplos de uredos en plantas. Son una forma importante de transportar nitrogeno. El mtodo para su determinacin se basa en el color desarrollado por los uredos conla feninhidraina y ferricianuro de potasio en un medio cido. (reaccin de Rimini-Schryver). Su determinacin es a partir de la extraccin de protenas solubles. Se realiza por curva tipo basado en la ley de Beer. La concentracin de uredos (alantoina/alantoato) se calcula por interpolacin en la curva tipo.

Nitrgeno reducido (mtodo de Nessler) Las plantas acumulan y transportan el nitrgeno como nitratos, sin embargo, algunos cultivos lo movilizan en forma reducida como amonio tanto en los aa, amidas y el ion amonio. El mtodo de Nessler cuantifica todo el nitrgeno reducido soluble que se encuentre en el tejido vegetal, con una sensibilidad de hasta 5 g de N. Su determinacin se hace a partir del sobrenadante proveniente de la extraccin para protenas, donde la alcuota se le adiciona el reactivo de Nessler y se lee a 420 nm despus de 10 min. de reposo. La concentracin de amonio en el tejido vegetal se hace por curva tipo a partir de la interpolacin.

Oxalatos (Titulacin con permanganato) Los oxalatos se encuentran solubles en agua (de sodio y potasio) e insolubles (de calcio y magnesio). Estas sales orgnicas son sintetizadas por las plantas para balancear el exceso de sodio, y dependera directamente de la concentracin de sodio en suelo. Muchos vegetales acumulan el cido oxlico por diferentes rutas, principalmente su precursor es el glioxilato que se oxida por la enzima LDH produciendo oxalatos, si el pH en el citosol aumenta tambin incrementa su concentracin, los cuales reaccionan con cationes como el Ca, Mg, Na y K y as balancear las cargas. El contenido de oxalatos solubles depende del lugar y estacin del ao, llegando a su mximo nivel al final del verano y principios de otoo, La ingesta de vegetales con altos contenidos de oxalatos en el ganado origina problemas renales. El mtodo de titulacin del oxalato con permanganato es util para su determinacin en muestras de origen vegetal. Clculos: N KMnO4 = Peso del oxalato de sodio / (mequivalentes de oxalato * gasto de KMnO4) El Volumen del permanganato se resta el consumido por el blanco.

Mtodos de anlisis enzimtico. Las enzimas se extraen de los tejidos vegetales y su actividad se expresa como la cantidad de sustrato convertido a producto por una cantidad conocida de extracto enzimtico en un periodo determinado. Aunque algunas enzimas soportan hasta 100C por varios minutos, la mayora se desnaturalizan a temperaturas entre 50 y 60C. Las enzimas vegetales participan en la absorcin de nutrimentos y debido a su participacin universal en los procesos fisiolgicos en los cultivos ntimamente relacionados con la nutricin vegetal.

Nitrato Reductasa (NR) En la absorcin de nitratos en plantas, participan la Nitrato Reductasa (NR) que reduce el nitrato a nitrito y posteriormente la Nitrito Reductasa (NiR) reduce el nitrito a amonio para su posterior incorporacin como grupo amino a los aminocidos que constituyen a las protenas. En la mayora de los tejidos vegetales los nitratos inducen un incremento en la actividad de la NR, cuya respuesta esta acoplada al aumento de la actividad de la NiR que previene la acumulacin de niveles txicos de nitritos. La NR se encuentra presente en plantas superiores y es el primer eslabn en la incorporacin del nitrato hasta protenas como grupo amino. La medicin de la actividad de esta enzima se hace por tres mtodos: In Vitro.- donde se determina colorimtricamente el nitrito formado en el extracto enzimatico vegetal, en presencia de nitrato, NADH y cofactores durante un tiempo determinado a pH y temperatura ptima. Este mtodo estiima la actividad mxima (potencial) proporcional a la cantidad de enzima en la muestra llamado Capacidad Enzimtica. In Vivo.- se aplica directamente a la enzima presente en el tejido vegetal en solucin de nitratos en oscuridad y ausencia de oxgeno, reduciendo el nitrato a nitrito, el cual se acumula y se excreta al medio donde se cuantifica. La cantidad de nitrito es proporcional a la actividad de NR en el tejido. No se adiciona NADH ni cofactores exgenos ya que estn presentes en el tejido vegetal. In Situ. Se aplica en hojas y rganos intactos, se efecta semejante al mtodo In Vivo sin adicionar nitrato exgeno, utilizndose solo el presente en el tejido vegetal, por tanto la reaccin solo dispone de un reductor endgeno

Glutamina sintetasa (GS). El amonio producido por la reduccin de los nitratos o en la fotorespiracin es fijado en la glutamina por la GS y vertido a otros componentes por transaminacin por la glutamato sintasa (GOGAT) o a la asparagina por la asparaginasa sintetasa (AS). Altas concentraciones de nitratos baja la actividad de la GS y el contenido de protena soluble. La NR esta correlacionada negativamente con la enzima GS y el contenido de protena soluble. El gen de la GS esta bajo control de la concentracin de los metabolitos nitrogenados de las clulas radicales. La medicin de la actividad de la GS es extractos vegetales se realiza por la cuantificacin del gama-glutamilhidroxamato (GHM). Donde: NH2OH + ATP + Glutamato gama-GHM + ADP + Pi. Los clculos se efectan a partir de la absortividad molar del gama-GHM 0.1 D.O. (540nm) = 0.66 mol de gama-GHM o en base a una curva tipo del mismo compuesto.

Fosfatasa cida (FA) Las fsfatasas catalizan la hidrlisis de steres y anhdridos del cido fosfrico que actan sobre fosfolpidos e hidrolizan cidos nublicos. Este grupo de enzimas incluyen a las nucleadas, glicerofosfatasas y fitasas. Las cuales a su vez se subdividen en fosfomonoesterasas, fosfodiesterasas y fosfotriesterasas, basada en el

nmero de enlaces ster en el sustrato respectivo. Pero tambin este tipo de enzimas se pueden clasificar en funcin de su pH ptimo de actividad, de tal forma que las fosfatasas cidas tienen un pH ptimo entre 4 y 6 y las alcalinas con pH entre 9 y 11. El p-Nitrofenilfosfato (p-NPP) es el sustrato ms comn en la estimacin in Vitro de la actividad de la fosfatasa en extractos vegetales. Esta tcnica consiste en la estimacin colorimtrica del p-nitrofenol liberado como resultado de la accin enzimtica. Los moles de p-nitrofenol transformados por gramo de materia fresca por hora se calculan por curva tipo.

Fosfoenol Piruvato Carboxilasa (PEPCasa). El principio bsico en la determinacin de la PEPCasa consiste en acoplar su actividad a la registrada por la Malato DesHidrogenasa (MDH) que emplea como sustrato el producto de la PEPCasa (oxalato, oxalacetato) y la coenzima NADH para formar malato. En este mtodo se mide la oxidacin del NADH durante 5 a 10 min. de reaccin a 30C que se lee en un espectrofotmetro a 340 nm. De tal forma que: FosfoEnolPiruvato + HCO3-1 PEPCasa/Mg2+ Oxalacetato MDH/NAHD Malato + NAD+ Lo que se mide no es la actividad in Vivo sino su actividad potencial In Vitro al agregar los sustratos Fosfoenol Piruvato y Bicarbonato. Esta determinacin se hace en forma indirecta midiendo la desaparicin de NADH o la aparicin de NAD+. Donde: Mmol de NADH ox. (min-1g-1MF) = [A * VE * VTE]/[6.22 * t * v * g] Donde: A: diferencia de absorbencia a tiempo 1 menos absorbencia al tiempo cero VE: Volumen Total del ensayo (mL) VTE: Volumen Total de Extraccin (mL) t: Intervalo de tiempo (min) NADH v: Alcuota de extracto en el ensayo (mL) g: masa de material fresco (g) 6.22: Coeficiente de extincin molar del

INTERPRETACIN DE RESULTADOS. Los pasos generales para la interpretacin de los resultados son: A) Clculo de las concentraciones nutrimentales B) Evaluacin de las relaciones nutriimentales C) Comparacin con: Valores lmite o crticos, Rangos de abastecimiento y Curvas de calibracin nutrimental D) Otras alternativas E) Integracin de la informacin, anlisis del suelo y su manejo F) Interpretacin G) Diagnstico

H) Recomendacin Existen diferentes formas de expresar la concentracin de los nutrientes como equivalente qumico / peso equivalente, moles, porcentaje peso/volumen o porcentaje volumen/volumen. En general los equivalentes qumicos (Eq) son comnmente expresados en miliequivalente meq = Eq/1000. Tambin es comun expresarlos en mg/L o partes por milln (ppm), porciento en peso de tal forma que: Ppm (mg/L) = me/L * Peso Equivalente % = ppm/104 me/L = ppm/Peso Equivalente. ppm = % * 104

- Para los clculos volumtricos %A = (Gasto*Normalidad titulante*me analito*100)/ Peso muestra. - En los clculos gravimtricos es comn utilizar el Factor Gravimtrico Fg = Peso Analito/Peso Molecular de sustancia pesada. - En las tcnicas espectrofotomtricas se aplica: i. Curva Tipo donde A = a[analito] + intercepto (ecuacin de regresin en trminos de la Ley de Beer. Ii. Ley de Beer: A = abc = bc = 2 log%T

Evaluacin de las relaciones nutrimentales. La interpretacin de resultados del anlisis vegetal se refiere a las relaciones nutrimentales. Esta relacin es importante, tanto en el sustrato donde crecen las plantas (suelo o soluciones nutritivas), como dentro de la planta misma. Altas concentraciones de algn elemento pueden reducir la proporcin absorbida de otro (antagonismo), causando una deficiencia de forma indirecta o inducida. Por ejemplo, alta relacin de Mn / Fe en el medio nutritivo favorece la deficiencia de hierro. Es muy importante considerar algunas otras interacciones que puedan originar desbalances entre pares ionicos: Zn/P, Zn/N, Fe/P, Cu/P, Mo/S, B/Ca, Zn/Fe, Fe/Mo, Cu/Fe, Cu/Mo, Cu/Zn, Ca/Mg, K/Mg y K/Ca. La concentracin de nutrimentos en solucin y su concentracin dentro de la planta afectan el crecimiento de la planta, cuyos factores que influyen son: Abastecimiento de nutrimentos. Rango de absorcin de los nutrimentos Distribucin de nutrimentos hacia los sitios funcionales Movilidad de los mismos dentro de la planta. Los principales criterios para interpretar los resultados del anlisis qumico vegetal son los niveles criticos, los rangos de concentracin y los ndices nutricionales Valores lmite o crticos: En una curva de respuesta, describe la relacin entre el rendimiento y la concentracin de nutrimentos en el tejido vegetal y es fundamental para establecer los niveles crticos y rangos de concentracin. Se define como valor, nivel o concentracin crtica a la concentracin de un nutrimento en un rgano y edad fisiolgica determinada, asociada con el 95% del rendimiento mximo. Estos valores son especficos para cada cultivo y se refieren a la concentracin del elemento en la planta, por arriba de la cual no habr respuesta a la fertilizacin o concentracin debajo de la cual se

presentan sntomas de deficiencia y disminucin del rendimiento. Rangos y curvas de abastecimiento nutrimental. Tambin llamados rangos crticos corresponden a los intervalos de concentracin nutrimental asociados con algunas zonas dentro de distintos segmentos de una curva de respuesta, resultante de relacionar los rendimientos con la concentracin como deficiencia aguda, deficiencia latente/hambre oculta, suficiencia o excesotoxicidad). La curva de respuesta tiene las siguientes etapas

A) Deficiencia Severa: concentracin nutrimental donde se observan claramente sntomas de deficiencia y severa reduccin del crecimiento y produccin. Tomando medidas correctivas inmediatas. B) Deficiencia Moderada o Latente: existe una disminucin del crecimiento o produccin, donde la planta NO muestra sntomas visibles de deficiencia. Cambios en las prcticas de fertilizacin corrigen estas deficiencias. C) Valor o Nivel Crtico de Deficiencia: se relaciona con la concentracin de nutrimentos donde otros factores de crecimiento se encuentran en un nivel ptimo que se asocia con el rendimiento o calidad mxima. Corresponde al 90-95% del rendimiento mximo. D) ptimo o Buen Abastecimiento: en este rango de concentracin nutrimental, los cambios que ocurran no provocan aumentos o disminucin del crecimiento o produccin. En estos niveles no es necesario realizar cambio alguno de fertilizacin. E) Exceso o Consumo de Lujo; rangos adecuados a txico o excesivo de nutrientes que se asocian con una produccin de calidad o vigor indeseable. En este nivel deben reducirse o suspenderse los niveles de fertilizacin hasta que bajen a niveles normales. F) Txico: son concentraciones nutrimentales extremadamente altas que se asocian a sntomas de toxicidad con reduccin de crecimiento, produccin, calidad y/o vigor excesivo. En este nivel se deben de tomar medidas correctivas inmediatas. G) Valor, Nivel o Concentracin Crtica de Toxicidad. Se ha definido como aquel que se asocia con una reduccin especfica del rendimiento mximo, generalmente el 80% de ste. Se observan sntomas visuales de toxicidad causados por excesiva absorcin. El crecimiento es pobre, raqutico, de calidad deficiente. No debe de fertilizarse. La curva de los diferentes grados de abastecimiento nutrimental generalmente es especfica para cada nutrimento, especie y cultivo. Un aspecto importante es la relacin N:P:K, considerando al nitrgeno como factor principal de la produccin.