PRCTICA # 2 TCNICAS DE TINCIN Objetivo El alumno aprender y aplicar las tcnicas bsicas de tincin ms frecuentes.

Generalidades La coloracin es el proceso de teir artificialmente los microorganismos con colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscpico forma, agrupacin y estructuras) Un colorante es un compuesto orgnico que consta de anillos bencnicos y grupos cromforos ( agrupacin de tomos que da color a ciertos compuestos) y auxocromos ( sustituyentes como el grupo oxidrilo o el amino que mejoran las caractersticas de absorcin del cromforo) En el laboratorio de microbiologa se pueden usar los colorantes de varias formas como: a) Para teir bacterias y hacerlas visibles al microscopio b) Para mostrar estructuras del organismo estudiado. c) Para la identificacin de microorganismos en base a sus caractersticas de tincin, por ejemplo, si son o no alcohol-cido resistentes, si son Gram positivas o Gram negativas. d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y as poder estudiar selectivamente a los microorganismos que si crecen. TINCIN DE BACTERIAS La clula bacteriana intacta se tie fcilmente con colorantes bsicos como el cristal, azul de metileno y fucsina bsica, pero relativamente mal con colorantes cidos como la eosina. Un colorante bsico es aquel constituido por un agrupamiento de tomos orgnicos con carga positiva que ser la parte activa del colorante ya que tendr afinidad por los cidos nucleicos. Un colorante cido es aquel que se encuentra constituido por tomos orgnicos con carga neta negativa por lo cual tiene afinidad por el citoplasma. TIPOS DE TINCIN 1. Tincin simple. Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve para hacer ms fcilmente visibles a las bacterias sin resaltar ninguna caracterstica en especial. Una tincin simple se lleva a cabo cubriendo con colorante bsico un frotis seco y fijado al calor. El frotis se deja reaccionar con las clulas por un minuto y se lava suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o usar papel secante para que quede listo para observarse. 2. Tincin negativa. Este mtodo de tincin utiliza colorantes neutros o cidos ya que tienen poca afinidad por la clula bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo

en el que estn las bacterias pero la clula queda incolora y transparente, as pues las bacterias aparecen como pequeas reas iluminadas en un fondo oscuro. La tincin acdica con nigrosina, o neutral ( con tinta china) son las ms usadas. 3. Tincin diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras tanto fsica como qumicamente, por lo cual su reaccin ante algunos colorantes tambin ser diferente dando lugar as a grupos tintoreales caractersticos. Entre estos grupos estn los que se originan por la tincin descubierta por Hans Christian Gram, esta tincin divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo cual no solo sirve para diferenciarlas sino an para elegir la terapia adecuada en algunos casos. Existen otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiologa clnica como la de Ziehl- Neelsen. 4. Tincin estructural. Existen diferentes tipos de colorantes que de acuerdo a su afinidad se utilizan para teir y detectar ciertas estructuras de la clula bacteriana como son las esporas, los flagelos y las cpsulas. TINCIN SIMPLE MATERIAL 2 portaobjetos Asa bacteriolgica Aceite de inmersin Microscopio Mechero Azul de metileno de Leffler Cepa de Escherichia coli TCNICA 1. Preparar un frotis de E. coli de acuerdo a las indicaciones de la figura 1 y fijarlo al calor. 2. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar en reposo por un minuto. 3. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar. 4. Observar con el objetivo de inmersin. TINCIN NEGATIVA MATERIAL Y EQUIPO 4 portaobjetos Asa bacteriolgica Aceite de inmersin Microscopio Vaso de precipitado de 200 ml con fenol al 5% Nigrosina o tinta china Puente de tincin Cepa de Klebsiella pneumoniae TCNICA

1. Hacer una suspensin ligera en solucin salina de K. pneumoniae y mezclar una gota de esta suspensin con una pequea gota de nigrosina o tinta china en el borde central del portaobjetos. 2. Con el extremo de otro portaobjetos extender la gota a lo ancho del primer portaobjetos. Prepare un frotis delgado y otro grueso. 3. Deje secar al aire. NO SE DEBE FIJAR AL CALOR. 4. Observe con el objetivo de inmersin. TINCIN DE GRAM MATERIAL Y EQUIPO 3 portaobjetos Asa bacteriolgica Aceite de inmersin Microscopio Mechero Puente de tincin Cepas de Gram negativos ( Escherichia coli) y de Gram positivos (Staphylococcus aureus). Cristal violeta Yodo de Gram Etanol al 95% Safranina TCNICA 1. De acuerdo a la figura 1 preparar un frotis de E. coli, uno de S. aureus y uno con una mezcla de ambos microorganismos. 2. Dejar secar y fijar al calor como se indica. 3. Teir con cristal violeta por un minuto. 4. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir. 5. Cubrir el frotis con Yodo de Gram y dejar reposar por un minuto. 6. Enjuagar con agua corriente y escurrir 7. Decolorar con etanol al 95%. Para esto, incline el portaobjetos sobre la charola de tincin y aada goteando el etanol, dejando que corra por todo el frotis. Para un frotis delgado es suficiente con 10 a 20 segundos. 8. Detener la accin decolorante lavando con agua. 9. Contrastar con safranina por 20 a 30 segundos, enjuagar y dejar secar el frotis. 10. Examinar con el objetivo de inmersin. TINCIN DE ESPORAS MATERIAL Y EQUIPO 2 portaobjetos Asa bacteriolgica Aceite de inmersin Microscopio Mechero Papel filtro

Lmpara de alcohol Cepa de Bacillus subtilis cido actico al 5% Azul de metileno de Leffler TNICA 1. Hacer un frotis, secar y fijar al calor como se describe en la figura 1. 2. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar con la lmpara de alcohol hasta la emisin de vapores. Es importante que su puente de tincin est bien nivelado para que la fucsina no se escurra y el frotis no se seque al calentar. 3. Dejar en reposo por 5 minutos 4. Lavar con agua corriente 5. Decolorar con cido actico al 5% hasta que el frotis tome un ligero color rosa 6. Lavar con agua corriente 7. Teir durante 3 minutos con azul de metileno de Leffler 8. Lavar nuevamente con agua corriente, dejar secar y observar con el objetivo de inmersin

FIGURA 1 PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO

Presentacin de resultados 1. Dibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso: a) Tipo de tincin b) Nombre de la bacteria c) Caracterstica observada 2. Conteste el cuestionario 3. Conclusiones 4. Bibliografa