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INTRODUCCIN
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan
difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la
falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms
simple de aumentar el contraste entre la clula y el medio que la rodea
es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse tambin para
localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir entre tipos
diferentes de clulas.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma
antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin
por el calos es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con
sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de
la fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas
sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador y
siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce
generalmente el encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario,
hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de
manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no
pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen
alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos
colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos
nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos
son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes
son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas
protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo
Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los
colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la
clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de depsitos de
grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos
colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada

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con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta

sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido
tnico. El mordiente se
Combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora s
podr atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la
microscopia son suficientes los procedimientos simples de tincin. El
azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las
clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso
que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar
la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor
parte del material no celular no se tie.

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TABLA DE CONTENIDO
Pg.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

INTRODUCCION
TINCION DE GRAM
TINCIN DE GIEMSA
TINCIN WRIGHT
TINCIN DE FIELD
TINCIN DE ESPORAS
TINCIN NEGATIVA
TINCIN CIDO ALCOHOL
NEELSEN

RESISTENCIA

4
10
12
14
16
17
ZIEHL- 17

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1. TINCION DE GRAM
PRINCIPIO
La coloracin de Gram ha constituido, desde los albores de la
Bacteriologa, un elemento fundamental para la taxonoma e
identificacin.
Luego del descubrimiento casual realizado por el investigador dans
Christian Gram, pasaron muchos aos durante los cuales se efectuaron
las ms variadas especulaciones sobre el mecanismo de esta coloracin.
Resultaba indudable, sin embargo, su practicidad a los fines de la
identificacin. El conocimiento de las estructuras de las membranas
bacterianas, tanto en el aspecto fsico como en su composicin
molecular que fueron logrados a partir de la dcada del sesenta,
demostraron que la coloracin de Gram distingue dos grupos de
bacterias totalmente diferentes. Las bacterias Gram positivas que
presentan una gruesa capa de peptidoglicano como estructura
fundamental por sobre la membrana citoplasmtica, y las Gram
negativas, que encima de sta, presentan una delgada capa de
peptidoglicano, a la que se superpone una capa de lipopolisacridoslipoprotena, denominada membrana externa. La presencia de esta
membrana diferencia actualmente dos divisiones en sistemtica
bacteriana: las que no lo poseen, Firmicutes (Gram +) y las que s,
Gracilicutes (Gram -). La diferencia entre ambos grupos es pues de
enorme importancia taxonmica. El comportamiento como patgenos y
en la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ah que la
realizacin rpida de una coloracin de Gram, reviste enorme
importancia en Bacteriologa Clnica.

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Esta coloracin permite la clasificacin de las bacterias en GRAM

POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS SEGN LA COMPOSICION DE SU PARED
CELULAR.
Por esto el complejo de color formado con la pared de las bacterias
Gram positivas no puede ser removido con el agente decolorante que es
el alcohol acetona. La clula permanece de color azul violeta, en cambio
las bacterias Gram negativas, al decolorarse con el alcohol acetona, se
dejan colorear con la fuscina safranina, quedando de color rosado.

FUNDAMENTO.
El cristal violeta sirve como colorante bsico unindose a la pared
celular bacteriana, con al ayuda del mordiente que refuerza la unin del
colorante. Las bacterias GRAM POSITIVAS debido a la estructura y
composicin bioqumica de su pared celular retiene el complejo cristal
violeta-lugol y an despus del tratamiento con el decolorante conserva
el colorante bsico, por lo que se observan al microscopio de color azul
oscuro o violeta una vez concluida la tcnica de tincin.
Las bacterias GRAM NEGATIVAS pierden el colorante bsico cuando son
tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido
lipdico de la pared celular lo que aumenta la permeabilidad celular,
dando como resultado la prdida del complejo cristal violetalugol. Las
bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razn
por la cual estas clulas bacterianas se observan al microscopio de color
rosado una vez concluida la tcnica de tincin.
La tincin de Gram tiene valor diagnstico y puede ser aplicada a
diversos y mltiples tipos de especmenes clnicos como lquidos
corporales estriles (LCR), exudados, excreciones (orina), secreciones
(esputo), abscesos y tejidos. Tambin puede aplicarse a diferentes tipos
de materiales de uso hospitalario como catteres y soluciones para el
diagnstico y control de las enfermedades intrahospitalarias.

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REACTIVOS. La tincin de Gram utiliza en orden estricto de primero a

cuarto los siguientes reactivos:
1. CRISTAL VIOLETA o violeta de genciana: COLORANTE BASICO
2. LUGOL DE GRAM: MORDIENTE
3. ALCOHOL - ACETONA: DECOLORANTE
4. FUSCINA (SAFRANINA): COLORANTE DE CONTRASTE
TCNICA
1. Marcar y realizar un extendido delgado de la muestra clnica o de una
colonia sobre un portaobjetos (placa) y dejar secar.
2. Fijar el material a estudio a la placa pasndola 2 o 3 veces por la
llama de un mechero evitando el excesivo calentamiento.
3. Colocar la placa sobre un soporte y cubrirla con cristal violeta durante
un minuto.
4. Lavar con agua corriente.
5. Cubrir la placa con lugol de Gram durante un minuto.
6. Lavar con agua corriente.
7. Cubrir la placa con alcohol-acetona durante 30 segundos.
8. Lavar con agua corriente.
9. Cubrir la placa con fuscina ( safranina) durante un minuto.
10. Lavar con agua corriente.
11. Dejar secar al aire
12. Observar al microscopio con aceite de inmersin, objetivo de 100X,
condensador abierto totalmente para que la luz pase y se obtenga
buena iluminacin.

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RESULTADO
Microorganismos Gram Positivos
Microorganismos Gram Negativos

Azul-Violeta
Rosa-Rojo

CONTROL DE CALIDAD
Los controles puedes realizarse con bacterias Gram Positivas
(estafilococos) y bacterias Gram Negativas (Escherichia Coli). Para ello
deben utilizarse cultivos procedentes de medios de cultivo incubados
durante 18-24 horas.
NOTAS SOBRE EL EMPLEO

La tcnica descrita anteriormente puede modificarse de acuerdo

con las preferencias del operador para lograr mayor o menor
intensidad de coloracin, lo cual implica variaciones en los
tiempos de tincin, decoloracin, lavado.
Se ha encontrado que el mal uso del ALCOHOL ACETONA Solucin
decolorante para GRAM en la fase de decoloracin puede llegar a
decolorar los grmenes GRAM POSITIVOS.
Cultivos y preparaciones viejas pueden dar resultados atpicos. Es
por ello que se recomienda utilizar cultivos de 18-24 h como
mximo o extensiones recientes.
Asimismo, es importante controlar la fijacin por el calor (dos-tres
pasos de un segundo por llama suave); un exceso del mismo
puede dar coloraciones errneas.
Agua altamente clorada puede debilitar la coloracin de
contraste.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Las soluciones deben almacenarse entre 15C y 30C y

protegidos
de la luz. Despus de abierto el contenido almacenado entre 15C
y
30C y protegidos de la luz es estable hasta la fecha de caducidad
Indicada en la etiqueta.

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Temperaturas inferiores a 15C puede precipitar colorantes de las

soluciones colorantes.
Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.

lactobacilos

Bacterias Gram positivas

Bacterias Gram negativas

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Bacterias Gram
intracelulares

negativas

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2. TINCIN DE GIEMSA
PRINCIPIO
El tpico color de los ncleos celulares, mayoritariamente rojo prpura,
se basa en la interaccin molecular entre eosina y un complejo azur B
ADN. Ambos colorantes forman el complejo. La intensidad de la
coloracin depende del contenido de azur B y de la relacin entre azur B
y eosina amarilla. El resultado de tincin puede ser influido por
diferentes factores como el valor del pH de la solucin y de la solucin
tampn, las substancias tampn (amortiguadores), el tiempo de tincin
y la fijacin.
MUESTRAS
Se deben usar lminas nuevas y prelavadas con alcohol de 96% para
quitar la grasa. Se toman dos (2) lminas, una para la gota gruesa y la
otra para el extendido, se limpia el dedo del paciente con Alcohol, y deja
secar. Se realiza la puncin, la primera gota se descarta y con las
lminas se recoge una sola gota en cada una de ellas. (No se debe tocar
la piel con la lmina). En una de las placas se hacen movimientos
circulares hasta alcanzar un dimetro de 1 cm para la gota gruesa, en la
otra lamina se hace un extendido delgado y corto.

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PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO GOTA GRUESA
1. Se deja secar la lamina durante 20 minutos.
2. Se des hemoglobiniza con Azul de Metileno Fosfatado, sumergiendo la
lamina por 5 segundos y se lava varias veces con buffer fosfatado.
3. Se deja secar la lmina.
4. Realizar la Coloracin de Giemsa preparando 1 gota de Colorante y 1
ml de Buffer (Aprox. 3 ml por cada lamina). Se colorea la lmina 15
minutos boca abajo.
5. Se lava con agua del chorro y se deja secar.
PROCEDIMIENTO DEL EXTENDIDO
1. Se deja secar la lmina durante 10 minutos.
2. Se fija el extendido con alcohol metlico durante 3 a 5 minutos y se
deja secar.
3. Se realiza la Coloracin de Giemsa que se prepara 2 gotas de Giemsa
y 1 ml de Buffer Fosfatado (Aprox. 3 ml por cada lmina).
4. Se colorea la lmina boca abajo durante 30 minutos y se lava con
agua del chorro y se deja secar.

CONTROL DE CALIDAD
El control de calidad en la microscopia de extendidos sanguneos
depende directamente de la formacin y experiencia del profesional que
validara la calidad de los extendidos, coloracin, etc.
El control debe realizarse incluyendo en cada proceso un portaobjetos de
control positivo

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3. TINCIN WRIGHT
PRINCIPIO
El tpico color de los ncleos celulares, mayoritariamente rojo prpura,
se basa en la interaccin molecular entre eosina y un complejo azur B
ADN. Ambos colorantes forman el complejo. La intensidad de la
coloracin depende del contenido de azur B y de la relacin entre azur B
y eosina amarilla. El resultado de tincin puede ser influido por
diferentes factores como el valor del pH de la solucin y de la solucin
tampn, las substancias tampn (amortiguadores), el tiempo de tincin
y la fijacin.
MUESTRAS
Se deben usar laminas nuevas y prelavadas con alcohol de 96% para
quitar la grasa. Deben utilizarse frotis frescos de sangre total o frotis
frescos procedentes de sangre anti coagulada con EDTA. Los frotis ms
gruesos (p.ej., mdula sea) generalmente requieren tiempos de tincin
ms largos.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar en una placa un extendido de la muestra con el borde de otra
placa. Dejar secar.
2. Colocar los frotis de sangre completamente secos, en la gradilla de
tincin adecuada.
3. Cubrir el portaobjetos con 12 ml de R1 Colorante de Wright Solucin.
4. Tras 1 minuto, aadir un volumen igual de BUFFER GIORDANO PH: 7.0
PARA WRIGHT, soplar para homogenizar hasta permitir que la mezcla
adquiera un brillo verde metlico.
5. Se deja actuar de 3 a 6 minutos.

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6. Lavar con agua corriente, dejar secar a temperatura ambiente.

7. Leer al microscopio con objetivo de 40X o 100X y aceite de inmersin.

CONTROL DE CALIDAD
El control de calidad en la microscopia de extendidos sanguneos
depende directamente de la formacin y experiencia del profesional que
validar la calidad de los extendidos, coloracin, etc.
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Las soluciones deben almacenarse entre 15C y 30C y protegidos

de la luz. Despus de abierto el contenido almacenado entre 15C
y 30C y protegidos de la luz es estable hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta.
Temperaturas inferiores a 15C puede precipitar colorantes de las
soluciones colorantes.
Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.

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4. TINCIN DE FIELD
PRINCIPIO
La coloracin de FIELD es una coloracin acuosa basada en la coloracin
de Romanovsky que consiste en dos soluciones (Solucin A y Solucin B)
y una solucin tampn (amortiguadora).
La coloracin de FIELD es una coloracin rpida para la identificacin de
Hemoparasitos.
El
tpico
color
de
los
ncleos
celulares,
mayoritariamente rojo prpura, se basa en la interaccin molecular
entre eosina y un complejo azur A- ADN. La intensidad de la coloracin
depende del contenido de azur A y de la relacin entre azur A y eosina
amarilla. El resultado de tincin puede ser influido por diferentes
factores como el valor del pH de la solucin y de la solucin tampn, las
substancias tampn (amortiguadores), el tiempo de tincin y la fijacin.
MUESTRAS
Se deben usar lminas nuevas y prelavadas con alcohol de 96% para
quitar la grasa.
Se limpia el dedo del paciente con Alcohol, y deja secar. Se realiza la
puncin, la primera gota se descarta y con la lmina se recoge una sola
gota. (No se debe tocar la piel con la lmina). Con la ayuda de otra
lmina se hace un extendido delgado y corto.
PROCEDIMIENTO
La lamina con el extendido debe estar completamente seca, y se
procede de la siguiente manera:
1. Sumrjase el portaobjeto de 1 a 3 segundos en la SOLUCIN A.
Escurra sobre un papel.

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2. Introduzca suavemente en AGUA AMORTIGUADORA 3 segundos.

Escurrir.
3. Sumrjase de 1 a 4 segundos en SOLUCIN B. Escurrir.
4. Introduzca en AGUA AMORTIGUADORA 3 segundos. Escurrir.
5. Se seca a temperatura ambiente.
CONTROL DE CALIDAD
El control de calidad en la microscopia de extendidos sanguneos
depende directamente de la formacin y experiencia del profesional que
validara la calidad de los extendidos, coloracin, etc.
El control debe realizarse incluyendo en cada proceso un portaobjetos de
control positivo.
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Las soluciones deben almacenarse entre 15C y 30C y protegidos

de la luz. Despus de abierto el contenido almacenado entre 15C
y 30C y protegidos de la luz es estable hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta.
Temperaturas inferiores a 15C puede precipitar colorantes de las
soluciones colorantes.
Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.

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5. TINCIN DE ESPORAS
Se utiliza para teir las estructuras de resistencia llamadas endosporas
bacterianas.
PROCEDIMIENTO
1. Sobre el portaobjetos con la preparacin se echa verde malaquita
que tie las clulas de verde.
2. Luego se lava con agua destilada con lo que las clulas se quedan
3. incoloras y las endosporas permanecen verde.
4. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color
rosa mientras que las endosporas continan con su color verde del
verde malaquita.

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6. TINCIN NEGATIVA
Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin
teir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve,
por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin
negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los
constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como
la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal)
o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa
es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en
microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia
de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.

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7. TINCIN CIDO ALCOHOL RESISTENCIA ZIEHL-NEELSEN

Esta tincin sirve principalmente para clasificar micobacterias y

actinomicetos, que tienen un alto contenido en lpidos y en cidos
miclicos y que no pueden ser calificadas por la tincin de Gram. Para
empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina fenol,
en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las
clulas se tien de rosa, tanto las cido alcohol sensibles como las
resistentes. Despus se usa un decolorante orgnico que hace que las
bacterias cido alcohol sensibles se decoloren mientras que las cido
alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tincin de Gram se utiliza
un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que
tie las clulas cido alcohol sensibles de color azul quedando las
clulas cido alcohol resistentes de color rosa.

PROCEDIMIENTO
1.

Preparacin del frotis

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2.

Extensin de la muestra

3.

Fijacin

1. agregar Carbol fucsina

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2. Calentar hasta la emisin

de vapor por
minutos
Mantener
el
calor
10
minutos,
Evitar
la
ebullicin, Dejar enfriar

3. Lavar con agua

4. Decoloracin con alcohol

cido
mximo
3
minutos ,lavar con agua
posteriormente

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5. Tincin de contraste: azul

de
metileno
por
un
minuto

6. Enjuagar

7. Secado

8. Examen sistemtico de la
extensin

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9. Coloracin
calidad

con

10.
Observacin
microscpicas
B.A.A.R.

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buena

de

TECNICA DE LECTURA.
Para el examen es necesario microscopio binocular con objetivo de
inmersin (1 00 x) y oculares de aumento moderado.
1. Examinar un mnimo de 100 campos microscpicos. La lectura
debe hacerse de manera sistemtica y estandarizada.
2. Empezar la lectura del frotis en el centro del extremo izquierdo de
la lmina. ajustando levemente con el tomillo micromtrico.
3. Despus de haber examinado un campo microscpico. mover la
lmina en forma longitudinal, para examinar el siguiente campo
hacia la derecha. De esta manera. examinar todos los campos
microscpicos, desde el principio hasta el fin de la longitud central
del frotis. El nmero de campos microscpicos que corresponde a
la longitud del frotis es de 100 aproximadamente.

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4. Se considera campo microscpico , aquel en el cual se observan

elementos celulares de origen bronquial (leucocitos. fibras
mucosas y clulas). Los campos en los que no aparezcan dichos
elementos, no deben contabilizarse en la lectura.
5. Cuando no se encuentren bacilos cido-alcohol resistente (BAAR),
en 100campos; se debe hacer una nueva bsqueda ms cuidadosa
en otros 100 campos. Mover la lmina unos milmetros hacia atrs
y leer una segunda longitud del mismo (de derecha a izquierda).
6. Los bacilos tuberculosos se observan como bastoncitos delgados y
rojos ligeramente curvos. ms o menos granulosos, aislados,
pareados o en grupos. estacndose claramente contra el fondo
azul. Calcular el nmero de bacilos vistos por campo.
7. Al finalizar el examen, separar el objetivo de la lmina. retirarla y
verificar la identificacin con el nmero grabado en la lmina y
anotar el resultado en el libro de registro.
8. Antes de examinar un nuevo frotis. limpiar el lente de inmersin
con papel para limpiar lentes o algodn
9. . Limpiar el aceite de la lmina y guardarla para su envi al control
de calidad.
INFORME DE RESULTADOS

NMEROS
DE
B.A.A.R
ENONTRADOS
no
se
observa
B.A.A.R
De 1-9 B.A.A.R

CAMPOS
INMERCION
OBSERVADOS
100 campos

DE REPORTE

Negativo
100 campos
Numero exacto de
bacilos observados
en los 100 campos

De 0-1 B.A.A.R

100 campos
+

De 1-10 B.A.A.R

50 campos
++

Mas de 10 B.A.A.R

20 campos
+++

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