EVALUACIN DE TRES PROTOCOLOS DE EXTRACCION DE DNA PARA EL

DIAGNSTICO DE HLB DE LOS CTRICOS MEDIANTE PCR CONVENCIONAL

EVALUATION OF THREE DNA EXTRACTION PROTOCOLS FOR THE DIAGNOSIS OF
CITRUS HLB BY CONVENTIONAL PCR
Cynthia Guadalupe Rodrguez-Quibrera1, Isidro Humberto Almeyda-Len2, Joaqun Velzquez- Monrreal3,
Vernica Cervantes-Espinosa1, Miguel ngel Ramrez-Guillermo4. 1CEIXTA-CIRGOC-INIFAP, Km 4.5
Carretera Martnez de la Torre-Tlapacoyan, Col. Rojo Gmez, CP 93600 Tlapacoyan, Veracruz, Mxico,
rodriguez.cynthia@inifap.gob.mx, 2CEGET-CIRNE-INIFAP, Km. 31 Carretera Montemorelos-China Exhacienda
Las Anacuas, C.P. 67400 General Tern, Nuevo Len, Mxico, almeyda.isidro@inifap.gob.mx, 3CETECOCIRPAC-INIFAP, Km 35 Carretera Colima, Manzanillo, CP. 28100 Tecomn, Colima, Mxico,
velazquez.joaqun@inifap.gob.mx, 4CEHUM-CIRGOG-INIFAP, Km 1 Carretera Huimanguillo-Crdenas, CP 86400
Tabasco, Tabasco, Mxico, ramirez.miguel@inifap.gob.mx
Resumen. El diagnstico eficiente del Huanglongbing (HLB) de los ctricos, mediante la tcnica de la Reaccin en
Cadena de la Polimerasa (PCR), depende en gran medida de la pureza del cido desoxirribonucleico (DNA)
utilizado. En este trabajo se evaluaron tres protocolos de extraccin de DNA (Murray y Thompson, Almeyda y
colaboradores y Rodrguez y colaboradores), para la deteccin del HLB mediante la tcnica PCR convencional. La
extraccin de DNA se realiz a partir de plantas de limn Mexicano colectadas en una huerta comercial de Tecomn,
Colima, infectada con HLB. Como testigo negativo se utiliz una planta de limn Mexicano sana resguardada bajo
condiciones de invernadero. Los resultados obtenidos, indican que el protocolo de extraccin de DNA ms eficiente
para la deteccin del HLB mediante PCR convencional fue el de Rodrguez y colaboradores.
Palabras claves: Extraccin, cido desoxirribonucleico, Huanglongbing, PCR.

Abstract. Efficient diagnosis of Huanglongbing (HLB) of citrus using the technique of the Polymerase Chain
Reaction (PCR) depends largely on the purity of used deoxyribonucleic acid (DNA). In this work were evaluated
three DNA extraction protocols (Murray and Thompson, Almeyda et al. and Rodrguez et al.), for detection of HLB
by conventional PCR. DNA extraction was performed from Mexican lime plants collected in a commercial orchard
of Tecomn, Colima, infected with HLB. As a negative control we used a healthy Mexican lime plant protected
under greenhouse conditions. The results obtained indicate that the DNA extraction protocol more efficient for HLB
detection by conventional PCR was the protocol of Rodriguez et al.
Keywords: Extraction, Desoxyribonucleic acid, Huanglongbing, PCR.

Introduccin
Mxico ocupa el quinto lugar a nivel mundial en la produccin de ctricos, con una
superficie establecida de 526 mil hectreas, de las cuales el 68.5% corresponde a naranja, 20.5%
a limn mexicano, 5.2% a limn persa, y el resto a toronjas mandarinas y tangerinas (Trujillo et
al., 2008). Esta citricultura se ve amenazada por el Huanglongbing de los ctricos (HLB), que es
una enfermedad altamente destructiva y de rpida propagacin (Jagoueix et al., 1994), originaria
de china y considerada la ms importante de los ctricos a nivel mundial (Bov, 2006). El HLB es
causado por una bacteria del gnero Candidatus Liberibacter spp., que no ha podido ser cultivada
artificialmente y est limitada al floema de las plantas. En la actualidad se han reportado tres
variantes de esta bacteria; Ca. L. asiaticus, Ca. L. africanus y Ca. L. americanus. En el 2009, el
2 Simposio Nacional sobre investigacin para el manejo del Pslido
Asitico de los Ctricos y el Huanglongbing en Mxico 2011

22

HLB fue diagnosticado en la citricultura nacional, detectndose la variante Ca. L. asiaticus, la

cual es transmitida por el pslido asitico de los ctricos Diaphorina citri (Da Graca, 2008). Este
insecto fue detectado por primera vez en el 2002 en el estado de Campeche y desde entonces se
ha dispersado a todas las reas productoras de ctricos del pas (Lpez et al., 2005).
La bacteria infecta a casi todas las especies, cultivares e hbridos de los ctricos. Los ms
susceptibles son la naranja dulce, la mandarina y lo hbridos de mandarina, adems, es hospedada
por otras variedades de plantas ornamentales (Halbert y Manjunath, 2004). Los daos que este
patgeno ocasiona es la reduciendo la produccin, calidad del fruto y posteriormente produce la
muerte gradual del rbol. Los sntomas en el rbol son amarillamiento de ramas laterales,
moteado y clorosis de hojas, frutos pequeos deformes y con sabor agrio o acido (Halbert and
Manjunath, 2004, Robles, 2008), los cuales varan de acuerdo al tiempo de infeccin, la etapa de
la enfermedad, etc. y pueden ser confundidos o enmascarados con los sntomas de otras
enfermedades como deficiencias de minerales como zinc, hierro, manganeso, calcio, etc. (Bov,
2006).
El impacto de esta enfermedad puede ser devastador en Mxico debido a la superficie de
ctricos que se tiene establecida y a la presencia del insecto vector. En las reas citrcolas del
mundo donde ha aparecido se han tenido que destruir millones de hectreas. De tal forma que en
Asia y frica ms de 60 mil rboles fueron erradicados. En Brasil del 2004 hasta el 2008 se han
eliminado 2 millones de rboles (Antunes, 2008) en Florida 285 mil rboles han sido removidos
por resultar positivos al HLB (Irey et al., 2008).
La enfermedad tambin es transmitida mediante injerto de yemas infectadas y se disemina
a travs del transporte de plantas enfermas. Por la naturaleza agresiva del patgeno, la mayora de
los rboles infectados mueren en un plazo de 3 a 10 aos y no existe cura para la enfermedad
(Salcedo et al., 2010), es por ello que un control adecuado del pslido vector, el uso de material
certificado libre de enfermedades y la deteccin oportuna del HLB, pueden evitar prdidas
catastrficas en la citricultura Mexicana.
Para el diagnstico del HLB, existe una tcnica de campo que se basa en el uso de una
solucin de yodo (el cual se puede adquirir en farmacias), la reaccin positiva al yodo se
manifiesta por un cambio en la coloracin del tejido debido a la concentracin de almidn
(Etxeberria et al., 2011), esta tcnica es de gran ayuda para la seleccin de muestras sospechosas
de estar infectadas con HLB. Sin embargo, resulta necesario certificar los resultados obtenidos
con la tcnica del tcnica del yodo mediante el diagnstico por PCR (Su, 2011), los resultados
obtenidos con ests dos tcnicas tienen un 90 % de correlacin (Thakushi et al., 2007). Por otra
parte, la eficiencia del diagnstico del HLB mediante PCR, depende en gran medida de la pureza,
cantidad y calidad del DNA extrado. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue evaluar la
eficiencia de tres protocolos de extraccin de DNA para el diagnstico del HLB mediante la
tcnica de PCR convencional.
Materiales y Mtodos
El trabajo se llev a cabo en los laboratorios de Virologa del Campo Experimental
Ixtacuaco en Veracruz y de Biotecnologa del Campo Experimental General Tern en Nuevo
Len, ambos pertenecientes al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y
Pecuarias.
Se evaluaron 3 protocolos de extraccin de DNA; el protocolo 1 reportado por Murray y
Thompson (1980), el protocolo 2 reportado por Almeyda et al., (2001) y el protocolo 3 reportado
2 Simposio Nacional sobre investigacin para el manejo del Pslido
Asitico de los Ctricos y el Huanglongbing en Mxico 2011

23

por Rodrguez et al., (2010). Para cada protocolo, se utilizaron por duplicado diez muestras de
limn Mexicano provenientes de Tecomn, Colima. Nueve muestras fueron colectadas en una
huerta comercial conocida como Zona Cero infectada con HLB y una muestra sana resguarda
bajo condiciones de invernadero (Cuadro 1). Como control positivo se uso una planta de limn
Mexicano previamente diagnosticada por PCR (convencional y tiempo real) como positiva a
HLB.
Cuadro 1. Muestras de limn Mexicano utilizados para la extraccin del DNA con los tres protocolos evaluados.
NO.
MUESTRA
1

DESCRIPCIN
rbol 6 hilera 32

NO.
MUESTRA
6

rbol 7 hilera 33

rbol 5 hilera 32

rbol 8 hilera 33

rbol 7 hilera 32

rbol 32 hilera 34

rbol 2 hilera 33

rbol 3 hilera 34

rbol 6 hilera 33

1 0 1 0 1 0

DESCRIPCION

r b o l

s a n o

Protocolo 1. Se trituraron 500 mg de nervaduras centrales y peciolos de hojas y se

transfirieron a un tubo eppendorf de 2 ml agregando 1ml de la solucin de extraccin CTAB
(NaCl 0.7 M, CTAB 1%, Tris-HCl (pH 8,0) 50 mM, EDTA 10 mM y mercaptoethanol 0.2%). La
mezcla se incub durante 60 min a 60 C con mezclas ocasionales por inversin. Se recuperaron
500 l del sobrenadante y se le agreg un volumen igual de sevag (cloroformo / alcohol
isoamlico 24:1) y se homogeniz por inversin. Se centrifug a 13,000 rpm durante 10 min, se
extrajeron 300 l de la fase acuosa y se agregaron 300 l de sevag, la muestra se incub durante
30 minutos a temperatura ambiente y se centrifug a 2000 rpm por 5 min, se recuper el
sobrenadante en un tubo eppendorf de 1.5 ml y se le adicionaron 4 volmenes de isopropanol y se
dej precipitar dos horas a -20C. Se centrifug a 10,000 rpm durante 20 minutos a temperatura
ambiente y se elimino el sobrenadante, el precipitado se lav dos veces con etanol al 70% fro
(centrifugando a 10,000 rpm durante 15 min), el precipitado se seco a temperatura ambiente y se
resuspendi en 50 l de agua mQ estril y se almacen a 4C hasta su uso.
Protocolo 2. Se trituraron 500 mg de la nervadura central de las hojas en 2 ml de solucin
de extraccin 2-ME/CTAB precalentada a 65 C (2 % p/v CTAB, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 20
mM EDTA pH 8.0, 1.4 M NaCl, 1 % p/v polivinylpyrrolidona 40,000), con -mercaptoethanol a
una concentracin final de 0.2 %, se transfirieron 750 l de la muestra macerada a un tubo
eppendorf de 1.5 ml estril y se incubo durante 45 minutos a 65 C, despus del perodo de
incubacin se le agrego un volumen de 750 l de sevag (cloroformo-alcohol isoamlico 24:1) y se
centrifugo a 10,000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente, se recupero la fase acuosa y se
le agreg 1 volumen de sevag, se centrifug a 10,000 rpm durante 10 min a temperatura
ambiente, se recuper la fase acuosa y se le agreg 0.5 volumen de acetato de amonio (7.5 M), se
dejo 10 min en hielo y se centrifug por 10 min a 14,000 rpm a temperatura ambiente. Para
precipitar el DNA, al volumen recuperado se le agreg 0.6 volumen de isopropanol y se dej
precipitar dos horas a -20C. Se centrifug a 10,000 rpm durante 10 minutos a temperatura
ambiente y se elimino el sobrenadante, el precipitado se lav dos veces con etanol al 70% fro

2 Simposio Nacional sobre investigacin para el manejo del Pslido

Asitico de los Ctricos y el Huanglongbing en Mxico 2011

24

(centrifugando a 10,000 rpm durante 15 min), dejando secar el precipitado a temperatura

ambiente, se resuspendi en 100 l de agua mQ estril y se almacen a 4C hasta su uso.
Protocolo 3. Se cort con navaja estril en trozos muy pequeos los peciolos y
nervaduras centrales de las hojas, se coloc 500 mg del material vegetal en tubo eppendorf de
2ml y se adicion 1.5 ml de solucin de extraccin 2-ME/CTAB precalentada a 65 C (2% de 2mercaptoethanol + 2% p/v CTAB, 1 M Tris-HCl pH 8, 0.5 M EDTA pH 8, 1.4 M NaCl, 1% p/v
polivinylpyrrolidona. En este protocolo se incluyeron diferentes tiempos de incubacin de las
muestras que fueron; 30 min, 60 min, 90 min y 120 min a 65C, las muestras fueron
homogenizadas con vortex cada 30 min. Se transfirieron 800 l de sobrenadante a un tubo
eppendorf estril de 2 ml, adicionando 800 l de sevag (cloroformo-alcohol isoamlico 24:1) y se
homogenizaron por inversin, se centrifugo a 13000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente,
se recuperaron 500 l de sobrenadante en un tubo nuevo estril de 1.5 ml, adicionando 0.5
volumen de acetato de amonio (7.5 M) y 0.6 volumen de isopropanol, se dej precipitar 45 min a
-20 C, se centrifug a 13000 rpm durante 20 min a 4C, se desech el sobrenadante evitando el
desprendimiento de la pastilla y se lavo dos veces con 1 ml de etanol frio al 70%, centrifugando a
13000 rpm durante 10 min a 4C, se dejo secar la pastilla a temperatura ambiente, finalmente se
hidrato con 50 l de agua mQ estril y se almaceno a -20C hasta su uso.
Los parmetros evaluados en el DNA obtenido fueron: integridad (electroforesis en gel de
agarosa al 0,8 %, teido con bromuro de etidio y analizado bajo luz UV) (Sambrook et al., 1989),
pureza y concentracin (cuantificacin del DNA por espectrofotometra a lecturas de 260 y 280
nm mediante el equipo Bexkman Coulter TM), y calidad del DNA (viabilidad para la
amplificacin en la tcnica de PCR).
Deteccin de Candidatus Liberibacter asiaticus. La deteccin de Ca. Liberibacter
asiaticus, se realiz por PCR convencional, utilizando los iniciadores OI1 (5-GCG CGT ATG
CAA TAC GAG CGG CA-3) y OI2c (5- GCC TCG CGA CTT CGC AAC CCA T-3),
diseados sobre la secuencia del gen ribosomal 16S de Ca. Liberibacter sp., que amplifican un
fragmento de un tamao aproximado de 1160 pares de bases (pb). Para la amplificacin se
emplearon las siguientes condiciones: Buffer para PCR 1X, dNTPs 250 M, MgCl2 2.5 mM,
iniciadores OI1/OI2c a 20 pmol cada uno, DNA Taq-Polimerasa (INVITROGEN) 1.5 U y DNA
50 ng, en un volumen final de 25 l. Las condiciones de la PCR fueron: Un ciclo a 94C por 3
minutos, seguido de 35 ciclos a 94C por 30 segundos, 62C por 30 segundos y 72C por 60
segundos, con una extensin final a 72C por 10 minutos (Jagoueix et al., 1996). Se determin el
porcentaje de amplificacin, al analizar los productos de PCR mediante electroforesis en geles de
agarosa al 1.5 % (10 l de cada producto de PCR), teido con bromuro de etidio (0.5 mg/mL) y
observados mediante luz ultravioleta.
Resultados y Discusin
En los tres protocolos evaluados y en las variantes del protocolo 3 se observ buena
integridad del DNA obtenido (Figura 1), lo cual se corrobor con el rango de pureza cuantificado
mediante espectrofotometra, los valores de las lecturas de absorbancia a 260nm/280nm y el
cociente de las dos lecturas se indican en el Cuadro 2. Se considera como nivel de pureza
aceptable cuando los valores del cociente de las dos lecturas se encuentra entre 1.8 a 2. Todas las
extracciones de DNA se encontraban en un rango de pureza aceptable, sin embargo, los
resultados en la concentracin y el porcentaje de amplificacin fueron variables (Cuadro2).

2 Simposio Nacional sobre investigacin para el manejo del Pslido

Asitico de los Ctricos y el Huanglongbing en Mxico 2011

25

Figura 1. Electroforesis del DNA extrado de una misma muestra de limn Mexicano con los 3 protocolos evaluados.
Carriles 1 y 2 extraccin protocolo 1, carril 3 y 4 extraccin protocolo 2, carriles 5 y 6 extraccin protocolo 3 con 30
min de incubacin, carriles 7 y 8 extraccin protocolo 3 con 60 min de incubacin, carriles 9 y 10 extraccin
protocolo 3 con 90 min de incubacin y carriles 11 y 12 extraccin protocolo 3 con 120 min de incubacin.

Las concentraciones ms altas de DNA (g/l) se obtuvieron con los protocolos 1 (1.10
g/l) y 2 (2.01 g/l), en el protocolo 3 con incubacin de 90 y 120 min se obtuvo una
concentracin de 0.20 y 0.36 g/l respectivamente, para las incubaciones de 30 y 60 min, se
obtuvieron concentraciones de DNA inferiores a 0.2g/l.
A pesar de que con el protocolo 1 se obtuvo alta concentracin de DNA, el porcentaje de
amplificacin fue de 83.3 % para el (Cuadro 1 y Figura 2), lo anterior, pudo ser ocasionado por la
presencia de inhibidores de la DNA Taq-polimerasa utilizada en la PCR. Con el protocolo 2 y el
protocolo 3 con un periodo de incubacin de 90 y 120 min se obtuvo un 100% de amplificacin
(Cuadro 2 y Figuras 3 y 4). Sin embargo, la sensibilidad de deteccin, considerada como la
intensidad del fragmento amplificado en el gel de agarosa fue mayor con el protocolo 3 con un
periodo de incubacin de 90 y 120 min. (Figuras 4 y 5). Con el mtodo 3 a una incubacin de 30
y 60 min, el porcentaje de amplificacin fue de 33.3 y 55.5 % respectivamente (Cuadro 2).
Cuadro 2. Valores promedio de la concentracin de DNA, rango de pureza y porcentaje de amplificacin del HLB
obtenidos en cada protocolo a partir de 10 muestras.
Protocolo

Total de
muestras

Integridad*

Concentracin de
DNA
g/l []

Rango de
pureza
260/280 []

Porcentaje de
amplificacin por PCR
convencional

20

+++

1.10

1.90

83.3 %

2
3 (incubacin 30 min)
3 (incubacin 60 min)
3 (incubacin 90 min)
3 (incubacin 120 min)

20
20
20
20
20

++++
+
++
++++
++++

2.01
0.10
0.17
0.20
0.36

2.01
2.20
2.30
1.90
2.00

100.0%
33.3%
55.5%
100.0%
100.0%

*Intensidad en los geles de agarosa al 0.8%: + muy tenue, ++ tenue, +++ intenso, ++++ muy intenso
[]= Promedio de 20 muestras

2 Simposio Nacional sobre investigacin para el manejo del Pslido

Asitico de los Ctricos y el Huanglongbing en Mxico 2011

26

Figura 2. Deteccin de Ca. Liberibacter asiaticus, mediante PCR convencional utilizando el DNA obtenido con el
protocolo 1. M= Marcador de peso molecular Ladder 100 (INVITROGEN). Pozos 1 al 9 muestras infectadas con
HLB y pozo 10 muestra sana de limn Mexicano.

Figura 3. Deteccin de Ca. Liberibacter asiaticus, mediante PCR convencional utilizando el DNA obtenido con el
protocolo 2. M= Marcador de peso molecular Ladder 100 (INVITROGEN). Pozos 1 al 9 muestras infectadas con
HLB y pozo 10 muestra sana de limn Mexicano.

Figura 4. Deteccin de Ca. Liberibacter asiaticus, mediante PCR convencional utilizando el DNA obtenido con el
protocolo 3 con una incubacin de 90 min. M= Marcador de peso molecular Ladder 100 (INVITROGEN). Pozos 1 al
9 muestras infectadas con HLB y pozo 10 muestra sana de limn Mexicano.

2 Simposio Nacional sobre investigacin para el manejo del Pslido

Asitico de los Ctricos y el Huanglongbing en Mxico 2011

27

Figura 5. Deteccin de Ca. Liberibacter asiaticus, mediante PCR convencional utilizando el DNA obtenido con el
protocolo 3 con una incubacin de 120 min. M= Marcador de peso molecular Ladder 100 (INVITROGEN). Pozos 1
al 9 muestras infectadas con HLB y pozo 10 muestra sana de limn Mexicano.

Conclusiones
Con los tres protocolos de extraccin evaluados se obtiene buena concentracin de DNA.
Con el protocolo 2 y el 3 con periodos de incubacin a 90 y 120 min se obtiene un 100% de
amplificacin de Ca. Liberibacter asiaticus, sin embargo, el protocolo 3 con incubacin a 120
min, prob ser ms sensible en la deteccin de la bacteria causante del HLB ya que se amplifican
los fragmentos con mayor intensidad.
Agradecimientos. Se agradece al CONACYT-SAGARPA- 3067090 por el financiamiento
otorgado para la realizacin de este trabajo, el cual forma parte del proyecto nacional de
investigacin Manejo de la enfermedad Huanglongbing (HLB) mediante el control de
poblaciones del vector Diaphorina citri (Hemptera:psyllidae), el pslido asitico de los ctricos.
A la Dra. Moramay Naranjo Morera, por la capacitacin impartida sobre la extraccin de DNA
genmico de ctricos a la primera autora de este trabajo.
Literatura citada
Almeyda Len I.H., Rocha Pecha M.A., Pia Razo J. y Martnez Soriano P. 2001. The use of
polymerase chain reaction and molecular hybridization for detection of phytoplasmas in
different plant species in Mexico. Revista Mexicana de Fitopatologa 19:1-9.
Antunes Thiago. 2008. Situacin actual de HLB en Brasil y programa de erradicacin.
Presentacin en Power Point. Memoria electrnica del Taller Internacional sobre el
Huanglongbing y el Pslido asitico de los ctricos. Hermosillo, Sonora. Mayo de 2008.
Bov JM. 2006. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease in citrus. J
Plant Pathol 88:7-37.
Da Graca, J.V. 2008. Biology, History and World Status of Huanglongbing. En Memoria
electrnica del Taller Internacional sobre el Huanglongbing y el Pslido asitico de los
ctricos. Hermosillo, Sonora. Mayo de 2008.
Etxeberria E., Gonzalez P., William Dawson and Timothy Spann. 2011. An Iodine-Based Starch
Test to Assist in Selecting Leaves for HLB Testing. http://edis.ifas.ufl.edu/hs375

2 Simposio Nacional sobre investigacin para el manejo del Pslido

Asitico de los Ctricos y el Huanglongbing en Mxico 2011

28

Halbert, S.E., and K.L. Manjunath. 2004. Asian citrus psyllids (Sternorrhyncha: Psyllidae) and
greening disease of citrus: A literature review and assessment of risk in Florida. Florida
Entomologist 87(3):330-353.
Irey, M. S., T. Gast and J. Snively. 2008. Economic impact of managing Huanglongbing in
groves at southern gardens citrus. En Memoria electrnica del Taller Internacional sobre el
Huanglongbing y el Pslido asitico de los ctricos. Hermosillo, Sonora. Mayo de 2008.
Jagoueix, S., Bove, J. M. & Garnier, M. 1994. The phloem-limited bacterium of greening disease
of citrus is a member of the asubdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol 44, 379
386.
Jagoueix, S., Bov, J. M. & Garnier, M. 1996. PCR detection of the two Candidatus
liberobacter species associated with greening disease of citrus. Mol Cell Probes 10, 4350.
Lpez-Arroyo, J.I., M.A. Pea, M.A. Rocha Pea, y J. Loera. 2005. Ocurrencia en Mxico del
pslido asitico Diaphorina citri (Homoptera: Psyllidae), pp. C68. En: Memorias del VII
Congreso Internacional de Fitopatologa. Chihuahua, Chih., Mx.
Murray M.G and Thompson W.F. 1980. Rapid isolation of high molecular weight plant
DNA. Nucl. Acids Res. 8 (19): 4321-4326.
Robles Garca P. L. 2008. Manual tcnico para la deteccin y manejo del Huanglongbing de los
ctricos. Direccin General de Sanidad Vegetal. SENASICA, SAGARPA. 39 p.
Rodrguez Quibrera C.G., Alans Martnez E.I, Velzquez Monrreal J., Almeyda Len I.H., 2010.
Optimizacin de la Tcnica de Extraccin del DNA de plantas de ctricos para el diagnstico
del HLB. En Memoria electrnica del 1er Simposio Nacional sobre Investigacin sobre el
Manejo del Pslido asitico de los ctricos y el Huanglongbing en Mxico, Monterrey, Nuevo
Len. Diciembre 2010.
Salcedo, D., R. Hinojosa, G. Mora, I. Covarrubias, F. De Paolis, C. Cntora y S. Mora. 2010.
Evaluacin del impacto econmico de Huanglongbing (HLB) en la cadena citrcola
mexicana. IICA. Oficina del IICA en Mxico. Mxico, D.F.
http://portal.hlbcolima.org/descargas/item/59-cadena-citricola-mexicana.html
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, M. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2nd ed. Cold Spring Harbor.
Su, H. 2011. A Rapid, Less-Costly and Accurate Detection of Citrus Greening (HLB) Pathogen
in the Aspac Region (Year 2). http://www.agnet.org/library/ac/2008m/
Takushi T. Toyozato T., Kawano S. Ooshiro A. Numazawa M, Tokeshi. 2007. Scratch method
for simple, rapid diagnosis of citrus Huanglongbing using iodine to detect hight
accumulation of starch in the citrus leaves. Jpn. J. Phytopathol. 73:3-8.
Trujillo Arriaga, J., H.M. Snchez Anguiano, y P.L. Robles Garca. 2008. Situacin actual y
perspectivas del Huanglongbing y el Pslido asitico de los ctricos en Mxico. En Memoria
electrnica del Taller Internacional sobre el Huanglongbing y el Pslido asitico de los
ctricos. Hermosillo, Sonora. Mayo de 2008.

2 Simposio Nacional sobre investigacin para el manejo del Pslido

Asitico de los Ctricos y el Huanglongbing en Mxico 2011

29