Detectores

en cromatografa de lquidos
(espectromtricos, fluorescencia, refractmetro, dispersin de luz)



1. Introduccin 1
2. Detectores 2
2.1 Caractersticas generales de un detector 3
3. Detectores en cromatografa de lquidos. Clasificacin 4
4. Detectores espectromtricos
4.1
Detector UV-Vis 5
4.2
Detector UV onda fija 5
4.3
Detector onda variable 7
4.4
Detector de ordenamiento de diodos 7
5. Detector de fluorescencia 8
6. Detector de ndice de refraccin 10
6.1 Detector IR-Fresnel 11
6.2 Detector de deflexin 11
6.3 Detector interferomtrico 11
7. Detector de dispersin de luz 12
8. Incertidumbre en los detectores IR, UV, Fluorescencia 13
9. Sistema de toma y procesamiento de datos 13
10. Aplicaciones. Artculo 14
11. Conclusiones 17
12. Bibliografa 17



1. Introduccin

El detector es el mdulo del cromatgrafo de lquidos, situado a la salida de la columna, que
proporcionna de forma continua informacin acerca de la composicin del flujo que circula a
travs de l. Generalmente origina una seal elctrica continua, que debidamente amplificada y
registrada, constituye el denominado cromatograma, del que se extrae informacin cuantitativa y
cualitativa de la muestra inyectada. La existencia de un detector on-line eleva a la categora de
instrumento al cromatgrafo de lquidos.
Uno de los factores que han influido en el retraso del desarrollo de la cromatografa de
lquidos con respecto a la cromatografa de gases est relacionado con el sistema de deteccin. Las
concentraciones bajas de un soluto no modifican sustancialmente las caractersticas fsicas de la
porcin de fase mvil que lo contiene (por ejemplo densidad, constante dielctrica etc.) y son
indistinguibles respecto a variaciones producidas por el caudal y la temperatura, mientras que en
cromatografa de gases pequeas concentraciones de un vapor en un gas modifican crticamente
las propiedades del mismo. No existe en la actualidad un detector en cromatografa de lquidos
equivalente al detector de ionizacin de llama en cromatografa de gases. Otra diferencia
importante entre los sistemas de deteccin usandos en lquidos y gases consiste en que se trata de
adaptaciones a la situacin dinmica de principios instrumentales ampliamente desarrollados en
1

instrumentos (fotmetros, fluormetros, polargrafos etc.) mediante el empleo de celdas de flujo,

mientras que los empleados en cromatografa de gases tienen en general una concepcin y diseo
distintos a los instrumentos convencionales. Un aspecto a resaltar es la tendencia a incorporar
sistemas de deteccin continua tal es el caso como el espectrmetro de masas, RMN, tcnicas
espectroscpicas atmicas, etc.

2. Detectores

El detector es la parte del equipo cromatogrfico que permite ver y ubicar en tiempo y espacio
la posicin de cada componente de una muestra a la salida de la columna cromatogrfica. Se trata
del mdulo del cromatgrafo de lquidos, situado a la salida de la columna, que proporciona
informacin de forma continua acerca de la composicin del flujo que circula a travs de l.

Nmero de publicaciones

800
700
600

Deteccin UV

500
Deteccin uorescencia

400
300

Deteccin ndice de
refraccin

200
100
0
1976 1980 1984 1988 1992 1996 2000 2004 2008 2012

Deteccin dispersin de
luz

Ao de publicacin

Fig 1. Produccin de artculos de cromatografa de lquidos con diferentes detectores (grfico
obtenido por medio de la base de datos www.scopus.com)

Dependiendo del propsito final de la cromatografa se habla de cromatografa analtica
cuando solo se pretende conocer y cuantificar los componentes de una muestra. En cambio, se
habla de cromatografa preparativa cuando la tcnica aplicada permite, adems de conocer y
cuantificar los componentes de la muestra, separarlos fsicamente. La modalidad preparativa no
permite el uso de detectores destructivos, mientras que estos estn permitidos en la modalidad
analtica (Sogorb Snchez et. al 2004).
A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no hay
detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin de flama
y de conductividad elctrica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de
lquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores. En la fig. 1 se muestra el incremento con
respecto al tiempo de publicaciones que utilizan algunos detectores comnmente utilizados en
cromatografa de lquidos.

2.1 Caractersticas generales de un detector

Las caractersticas ideales que debe poseer un detector continuo empleado para HPLC se resume a
continuacin:

Adecuada sensibilidad. Aquello que constituye una adecuada sensibilidad no puede
evaluarse de forma cuantitativa. Aunque todos se utilizan extensamente y son adecuados
en ciertos casos, sin embargo, los menos sensibles no resultan convenientes para algunas
aplicaciones. En general, las sensibilidades de los detectores se encuentran en el intervalo
de 10-15 a 10-8 g de soluto/s.
Buena estabilidad y reproducibilidad
Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios rdenes de magnitud
Tiempo de respuesta corto que sea independiente del caudal
Alta fiabilidad y manejo sencillo. Hasta el punto de que el detector debera estar a prueba
de la impericia de operadores inexpertos
Respuesta semejante para todos los solutos, por el contrario, una respuesta selectiva y
altamente predecible para uno o ms tipo de solutos
Volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de la banda y no es
necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas, como es el caso
de los detectores para cromatografa de gases.
Insensible a cambios ambientales: presin, caudal, temperatura, etc. Es importante
tambin que sea insensible al cambio de composicin de la fase mvil en la modalidad no
isocrtica
Operacin continua durante largo tiempo y su empleo debe ser fcil y cmodo para el
analista
Automatizacin. Su funcionamiento debe ser asequible a la automatizacin para
incorporarlo a los instumentos CLAR comandados por un nico microprocesador.

Para evitar que se ensanchen los picos, el volumen del detector debe ser menor que el 20%
del volumen de la banda cromatografica. Las burbujas que puedan existir en el detector producen
ruido, y por eso se debe aplicar una contrapresin al detector, para impedir que se formen
durante la despresurizacin del eluyente (Harris, Daniel C. 2001).
Los errores ms comunes que surgen de la deteccin se refieren a la falta de estabilidad,
sensibilidad o linealidad. Estos problemas son poco frecuentes con los detectores UV debido a la
simplicidad de la deteccin ultravioleta y al desarrollo que los mismos han experimentado. A pesar
de ello, estos factores deben estudiarse adecuadamente, especialmente si se desean analizar
trazas. La linealidad, o rango lineal, es una condicin imprescindible en todo mtodo cuantitativo
en el cual se calcula la concentracin de analito en la muestra comparndola con un solo estndar.
En general la falta de linealidad se soluciona reduciendo la masa de soluto inyectado. Sin
embargo, es posible operar con sistemas no lineales siempre y cuando se utilice una curva de
calibracin como referencia cada vez que se realice el anlisis.

3. Detectores en cromatografa de lquidos. Clasificacin

Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Una serie de
clasificaciones de los detectores segn diferentes criterios y aspectos de la deteccin se encuentra
en la tabla 1. La distincin generalmente ms empleada diferencia dos grupos de detectores, los
que se basan en la medida de una propiedad de la disolucin responden a una propiedad del
efluente, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica
por la presencia de analitos. Por el contrario, los detectores basados en una propiedad del soluto
3

responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV, fluorescencia, o
corriente lmite, que no son inherentes a la fase mvil.
Los principales detectores a tener en cuenta en cromatografa de lquidos se muestran en
la tabla 2, de los cuales los detectores ultravioleta-visible, fluorescencia, ndice de refraccin y
electroqumicos son los ms comunes. En la mayora de los mtodos relacionados con HPLC el
detector utilizado es el detector de absorbancia UV-Vis de longitud de onda variable o de diodos
(DAD). Este hecho se debe a que ste detector, tiene la mejor combinacin de sensibilidad,
versatilidad y fiabilidad.. Sin embargo en el caso de especiacin orgranometlica, se pueden
emplear distintas tcnicas espectromtricas atmicas como detectores y en muchas ocasiones se
utilizan tcnicas de derivatizacin para aumentar el grado de detectabilidad en absorcin en UV-
Vis, fluorescencia o electroqumcia (Reyes & Walton, 2003)


Tabla 1. Clasificacin de los detectores empleados en cromatografa de lquidos
.
Absoluta (Solute property)
Segn el tipo de medida
Relativa (Bulk property)
Detectores de concentracin
Segn propiedad general del soluto
Detectores de masa
Universal
Segn generalidad de la respuesta
Selectivo
Normal
Segn el tipo de salida de seal
Integral
Diferencial



Tabla 2. Detectores ms comunes en HPLC
Detector de dispersin de luz


Espectromtricos


Detector de absorcin UV-Vis
Tambin uno de los detectores ms
Detector de longitud de onda fija UV
populares de todos es el detector de
Detector de onda variable UV
absorcin UV-Vis, aunque su uso esta
Detector de fotodiodos en serie (DAD)
limitado porque no es un detector universal.
Detector de fluorescencia
Por el contrario, el detector de
Detector de espectrometra de masas
espectrometra de masas si es universal por
Electroqumicos
lo que se est utilizando cada vez ms
Detector electroqumico (ECD)
aunque todava es caro su mantenimiento.
Detector amperomtrico
Del detector utilizado dependen la exactitud,
Detector potenciomtirco
la precisin y el lmite de deteccin
Detector culombimtrico
conseguidos en la separacin de distintos
Detector conductimtrico
componentes (Gmez. & Valcrcel, 1988).
Otros
Detector de ndice de refraccin



4

4.
Detectores espectromtricos

La deteccin en cromatografa de lquidos en su mayora se lleva acabo en celdas de flujo en forma
de Z. La miniaturizacin de la celda de flujo de deteccin, en HPLC, disminuye el volumen
interno, lo que implica que disminuye la dispersin de los analitos y favorece el estrechamiento de
las zonas en que se encuentran una vez separados: los picos cromatogrficos son ms estrechos y
menos solapados entre s (Valcrcel & Crdenas, 2000). En su mayora los detectores de
absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la celda de flujo y
el otro a travs de un filtro. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representacin
del logaritmo del cociente de las dos seales detectadas en funcin del tiempo (Skoog, 2001).

4.1
Detector UV-Vis

Es el detector ms empleado en HPLC. Posee buena sensibilidad y rango lineal, y permite detectar
analitos en el orden de los nanogramos. No es destructivo y puede emplearse con gradiente de
disolventes, con la nica limitacin de que stos sean transparentes en la longitud de trabajo
(Skoog, 2001). En general permiten cambiar el volumen de su celda, tpicamente con volmenes
de 1 a 12 mL. Es un detector muy poco sensible a los cambios de caudal y de temperatura. El
detector UV opera en el rango de 190 a 350 nm, y suele extenderse a la zona visible del espectro
350-700 nm recibiendo as el nombre de detector UV-Vis. La concentracin del analito en la
muestra se determina por la aplicacin de la ley de Beer A=abc, donde A es la absorbancia, a es la
absortividad molar del analito, b es el camino ptico de la celda medido en cm y c es la
concentracin del analito en la muestra expresado en mol/L.
Existen dos tipos de detectores UV: los detectores de onda fija y los de longitud de onda
variable (Skoog, 2001).

4.2
Detector UV onda fija

Este detector opera a longitudes de onda prefijadas, determinadas por las lneas de emisin de su
lmpara, habitualmente de mercurio de baja presin. Como longitudes de onda de trabajo se
utilizan las bandas de emisin de la lmpara de mercurio, especialmente la fuerte lnea de 254 nm.

El verdadero monocromador del instrumento es la propia emisin de la lmpara pero,
para eliminar lneas de otras longitudes de onda lejanas a la lnea de trabajo se utilizan filtros de
interferencia (fig. 2). Adems de la longitud de onda de 254 nm, suelen emplearse filtros que
permiten trabajar a 313, 334, 365 nm. El empleo de filtros de xidos de fsforo permite trabajar
incluso a 280 nm. La lmpara de mercurio emiten a esa longitud de onda.

El cambio de lmpara permite incluso trabajar a otras longitudes de onda, por ejemplo a
214 nm con una lmpara de Zn, a 229 nm con una lmpara de Cd.

Fig. 2. Esquema de un detector de UV de onda fija

4.3

Detector onda variable

5


Este detector es simplemente un espectrofotmetro, en el cual se reemplaza el compartimiento
de cubetas por una celda de flujo.

Es mucho ms verstil que el detector de longitud de onda fija ya que al tener red de
difraccin permite seleccionar libremente la longitud de onda de trabajo. Se puede escoger as la
longitud de onda de mxima absorcin del analito para aumentar la sensibilidad de medicin.
Emplea una lmpara de emisin continua, de Deuterio o Xenn (fig. 3). La luz emitida por la
lmpara se enfoca en un monocromador, habitualmente una red halogrfica de difraccin, y la luz
monocromtica escogida se dirige hacia la celda de medida y de all hacia el fotomultiplicador
(Quattrocchi, et al 1992).

Fig. 3. Esquema de un detector de UV de onda variable


4.4
Detector de ordenamiento de diodos

Uno de los ltimos adelantos en los detectores UV es el denominado ordenamiento de diodos (fig.
4). En los dispositivos convencionales, la red de difraccin se ubica antes de la celda, la que
recibe luz monocromtica seleccionada por la red. En los detectores de ordenamiento de diodos
se emplea un sistema ptico invertido: la celda se ilumina con luz blanca, es decir, no
monocromada y la luz emergente de la celda llega a la red de difraccin y all es dispersada hacia
el elemento fotosensible. En lugar de una fotocelda se emplea un conjunto de fotoceldas o
fotodiodos montados en un chip de slicio (Quattrocchi, et al 1992). De esta forma, se consigue
medir no solo la luz transmitida a una longitud de onda, sino todo el espectro de absorcin del
eludo en tiempo real (ventaja multiplex).

Fig. 4. Detector de ordenamiento de diodos compuesto por (1) lmpara de Deuterio; (2) Sistema
de lentes; (3) Chopper; (4) celda; (5) red de difraccin; (6) ordenamiento de fotodiodos

Es el detector ideal para realizar el desarrollo de los mtodos analticos por HPLC, ya que
permite asegurar, dentro de ciertos lmites, la integridad de un pico cromatogrfico. El nico
problema que presenta es que no es un detector universal, ya que solamente detecta aquellos
6

compuestos que presentan la absorcin en esta zona del espectro. Afortunadamente existe una
amplia gama de compuestos que tienen sta propiedad. En l se incluyen todos los compuestos
aromticos, los alquenos y todos aquellos compuestos que presentan enlaces mltiples entre C, N,
O y S. nicamente se elije otro detector cuando:

El analito presenta poca o ninguna absorcin en el UV o Visible
El analito, a las concentraciones en las que se encuentra en la muestra, presenta poca
absorcin en el UV o Visible
Existen interferencias en la muestra
Se necesita informacin estructural cualitativa

5.
Detector de fluorescencia

La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las molculas son excitadas por la absorcin
de radiacin electromagntica. Las especias excitadas se relajan al estado fundamental, liberando
su exceso de energa en forma de fotones. Una de las caractersticas ms atractivas de los
mtodos de fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres
rdenes de magnitud mejor que las de la espectroscopia de absorcin, porque la sensibilidad de
los primeros se puede reforzar, sea aumentando la energa del haz de excitacin o por
amplificacin de la seal del detector. Es de destacar que ninguna de estas opciones mejora la
sensibilidad de los mtodos basados en los procesos de absorcin porque el parmetro en la ley
de Beer basado en la concentracin es el logaritmo de una proporcin:

!
log
=

Al aumentar la energa P0 se incrementa proporcionalmente P y no tiene efecto sobre la
sensibilidad. De manera parecida, incrementando la amplificacin de la seal del detector se
influye en las dos magnitudes medidas de forma idntica, lo que evita cualquier mejora. No
obstante, los mtodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los mtodos de absorcin
debido al nmero relativamente limitado de sistemas qumicas que se pueden hacer fluorescer. En
general, los mtodos de fluorescencia son de uno a tres rdenes de magnitud ms sensibles que
los mtodos basados en la absorcin. Existen dos tipos de instrumentos:

Fluormetros: utilizan como fuente una lmpara de Hg a baja presin, que funciona a 254,
546, 691, 793 nm, estas longitudes de onda se aslan con filtros y un tubo
fotomultiplicador es el detector.
Espectrofluormetros: la fuente empleada es una lmpara de arco de xenn, de alta
presin, se necesita radiacin continua de 300 a 1300 nm, son de doble haz, tienen dos
sistemas de monocromacin para aislar la longitud de onda deseada, la otra radiacin
obtenida se divide en dos, una al fotomultiplicador de referencia y la otra para por la
muestra (fig. 5).

Fig 5. Esquema de un detector de fluorescencia

La fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente pequeo de sistemas que
incorporan caractersticas estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos
de desactivacin sin radiacin se reduzcan hasta el punto que la reaccin de emisin puede
competir cinticamente. Para analitos que no poseen fotoluminiscencia nativa se utiliza la
derivatizacin. Este tratamiento puede ser necesario para reducir la polaridad de las especies y de
este modo poder usar columnas de reparto y no de intercambio inico, para aumentar la
respuesta del detector para todos los componentes de la muestra o bien, para aumentar
selectivamente la respuesta del detector para determinados componentes de la muestra (Skoog,
2001).
Los procedimientos de derivatizacin se dividen en precolumna y postcolumna.
La derivatiazacin postcolumna involucra los siguientes pasos: separacin de los analitos
en la columna cromatogrfica, introduccin de un reactivo de de derivatizacin en el sistema
efluente de la columna; paso de los lquidos combinados a travs de un colector mezclador
seguido por un espiral de reaccin y finalmente bombeo de los analitos derivatizados a travs del
sistema de deteccin.
Por otro lado, en la derivatizacin precolumna, la mezcla de analitos se hace reaccionar
con el agente derivatizante antes de ser separados. Las tcnicas difieren principalmente de las
condiciones de reaccin. Para este proceso, se deben satisfacer los siguientes requerimientos:

Reacciones rpidas bajo condiciones moderadas para dar rendimientos cuantitativos del
derivado
Los derivados deben ser estables por varios das, de preferencia a temperatura ambiente
para permitir el anlisis automatizado de varias muestras.
No debe haber interferencias del reactivo, productos de ruptura o reacciones secundarias.
Debe haber una respuesta lineal a los intervalos de concentracin tpicos de la mayora de
las aplicaciones.
Los derivador deben tener factores de respuesta molar razonablemente similares.

6.
Detector de ndice de refraccin

8

Los detectores de ndice de refraccin son universales y responden a todos los solutos, son muy
sensibles a los cambios de temperatura, pero no as a la de concentracin. Son diferenciales, el
disolvente que va hacia la columna pasa a travs de la cubeta y el eluyente de la columna pasa por
la otra mitad.
Los compartimientos estn separados por una placa de vidrio montada con un ngulo tal
que si las dos disoluciones tienen ndices de refraccin diferentes, se produce una desviacin del
haz incidente. La desviacin del haz es amplificada y registrada (Skoog, 2001).. El esquema de este
detector se presenta en la figura 6.

Fig. 6. Esquema de un detector de ndice de refraccin

No puede utilizarse con programacin de disolventes porque el cambio de la composicin de la
fase mvil se acompaa del cambio de su ndice de refraccin. Como consecuencia, no puede
estabilizarse la lnea base. Existen tres tipos diferentes de detectores de ndice de refraccin:
Fresnel, Deflexin e Interferomtrico (Remington, 2003)

6.1 Detector IR-Fresnel

Es un detector diferencial que utiliza dos celdas, una de medicin que es atravesada por el eludo
de la columna, y una celda de referencia por la cual fluye la fase mvil pura. Opera segn la ley de
Fresnel, que establece que la cantidad de luz reflejada en una interfase lquido/vidrio vara con el
ngulo de incidencia y con el ndice de refraccin del lquido. Posee una celda de medicin
pequea, del orden de 3 mL que est constituida por un prisma, una base de acero pulida y un
sello de tefln entre ambos. Para cubrir todo el rango de ndice de refraccin (h=1.33 a 1.63) se
utilizan dos prismas, el primero se utiliza con disolventes de fase reversa y el segundo con
disolventes de fase normal. Para evitar el calentamiento de la celda por radiacin entre sta y la
lmpara se coloca un filtro infrarrojo (Quattrocchi, et al 1992).

6.2 Detector de deflexin

Es un detector diferencial que, a diferencia del Fresnel, slo usa un prisma para todo el rango de
ndices de refraccin, pero empleando celdas de mayor tamao, del orden de los 8 a 10 mL. Una
celda contiene la fase mvil pura, y a travs de otra celda fluye el eludo de la columna. Cuando se
produce un cambio de ndice de refraccin en la celda de muestra, se produce un cambio en la
trayectoria del haz luminoso que es registrado por el sistema ptico (Quattrocchi, et al 1992).

6.3 Detector interferomtrico

En este detector la luz emitida por la fuente luminosa se polariza y divide en dos haces por un
divisor de onda. Luego se focalizan ambas ondas y atraviesan la celda de referencia y la de medida.
Finalmente se recombinan por una segunda lente y por un divisor de onda para llegar al
9

fotomultiplicador. Cuando se produce una diferencia entre los ndices de refraccin de ambas
celda tiene lugar un cambio de fase entre ambas ondas y esto origina una diferencia en la
intensidad de luz que llega al fotomultiplicador.

7. Detector de dispersin de luz

Estos detectores han demostrado su utilidad en la determinacin de pesos moleculares de
polmeros y pptidos. Su funcionamiento es el siguiente: el efluente de la columna pasa a travs
de un nebulizador y se convierte en gotitas finas con un gas N2, que se conducen a un tubo donde
se evaporan y se origina analito slido. Las partculas de analito pasan a travs de un haz lser. La
radiacin dispersdada se detecta de forma perpendicular al flujo, con un fotodiodo de Si. Su
respuesta es la misma para todos los solutos no voltiles, es ms sensible que el ndice de
refraccin. Su representacin grfica se observa en la figura 7. (Barquero Quirs, 2004)

Fig 7. Diagrama de las etapas de deteccin por dispersin de luz

8. Incertidumbre en los detectores IR, UV, Fluorescencia

El ruido de fondo producido por el detector de ndice de refraccin (IR) se ve influenciado por los
cambios en la composicin del efluente de la columna, presin y temperatura. La concentracin
de 1 ppm corresponde a un cambio en el ndice de refraccin de aproximadamente 10-7 unidades
IR, debido a las fluctuaciones de la composicin de la fase mvil.

La temperatura puede causar un efecto considerable en la respuesta del detector. Se ha
reportado que un cambio en 1C puede causar un cambio de 6x10-4 unidades IR. Con respecto a la
10

presin, sta puede cambiar la densidad del lquido y como consecuencia el IR, sin embargo el
cambio en la temperatura afecta ms que la presin, aunque sta ltima compromete la
estabilidad de la lnea base.
En la deteccin por fluorescencia, el pH, composicin de la fase mvil (incluyendo oxgeno
disuelto) juegan un papel importante, por ejemplo la longitud de onda de emisin e intensidad de
fluorescencia los compuestos aromticos ionizables son dependientes del pH. La respuesta de
muchos compuestos es dependiente de la temperatura, causando una disminucin en intensidad
de 1-2% por C. Tambin a altas concentraciones la fluorescencia llega a ser no linear.
En la deteccin de UV, los principales errores dependen en gran medida de la longitud de
onda seleccionada y general se observa que al aumentar la longitud de onda de trabajo la
incertidumbre aumenta. Los gases disueltos alteran la lnea base (N2 y He reducen la absorbancia a
la mitad) y en algunos casos promueven la aparicin de picos fantasma (V. J. Barwick, 1999).


9. Sistema de toma y procesamiento de datos

El resultado del ensayo cromatogrfico es, por un lado, la obtencin de fracciones separadas de
los componentes de la muestra, y por el otro, la de un grfico o cromatograma, de cuya
interpretacin pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas (Quattrocchi, et al 1992).
Este registro y la eventual manipulacin se obtienen a partir de la seal proveniente del detector
por medio de un sistema de toma y procesamiento de datos, entre los que se puede citar estn:

Registrador grfico: convierte la seal en un grfico del tipo X-Y
Integrador: permite no slo obtener un registro grfico (cromatograma) sino tambin su
tratamiento matemtico para el clculo de concentraciones.
Computadora: bsicamente, el integrador es una computadora de uso muy especfico. En
este punto, se puede hablar de una computadora de escritorio, que permite con el
software apropiado tanto el registro grfico del cromatograma como los clculos
apropiados, la manipulacin de datos, el almacenamiento de ensayos, generacin de
reportes, e incluso el manejo global de varios cromatgrafos. Como las computadoras
necesitan seales digitalizadas, se necesita una interfase analgica-digital que convierta la
seal analgica entregada por el detector,

10. Aplicacin.
Determination of metoprolol in human plasma and urine by high-performance liquid
chromatography with fluorescence detection

El metoprolol pertenece al grupo de medicamentos llamados b-bloqueadores. Los b-bloqueantes
son antagonistas de las acciones endgenas de las catecolaminas adrenalina y noradrenalina, en
particular sobre el receptor adrenrgico-, parte del sistema nervioso simptico. El metoprolol se
usa para tratar la presin arterial alta (hipertensin). Tambin se usa para aliviar la angina (dolor
de pecho) y para prevenir que se presenten ms ataques al corazn en aquellos pacientes que
hayan padecido anteriormente uno de estos ataques. Su estructura se presenta en la figura 8 (a)
as como la del atenolol, el cual es el estndar interno (b).

(a)

11

(b)

Fig. 8. Estructura qumica de (a) metoprolol y del estndar interno (b) atenolol

En la literatura se han sido reportado varios mtodos para la determinacin de metoprolol
en plasma humano y fludos biolgicos: GC-MS, HPLC, LC-MS y LC-MS/MS. B. Yilmaz y
colaboradores proponen un mtodo sensible, especfico y rpido, HPLC con deteccin de
fluorescencia, para determinar metoprolol en pacientes con hipertensin. El mtodo fue validado
y se evalu linealidad, estabilidad, precisin y exactitud de acuerdo a los requerimientos de la gua
de ICH. Adems se estableci un bajo lmite de deteccin (LOD) del rango de ng/mL. Al mismo
tiempo este mtodo fue utilizado para un estudio de farmacocintica en plasma y orina de
humano. En la tabla 3 se observan las caractersticas del sistema cromatogrfico y el
procedimiento de preparacin de muestra se muestra en la fig 9.

Tabla 3. Condiciones de operacin para la determinacin de metoprolol por HPLC con deteccin
de fluorescencia

Caractersticas del sistema cromatogrfico:
HPLC Perkin Elmer serie 200
Detector de fluorescencia 276 nm (excitacin) y 296 nm (emisin)
Fase mvil, metanol:agua (50:50, v/v) + 0.1% TFA
Columna C18 (5 mm, 4.65 mm x 250 mm id)
Flujo 1 mL/min


Agitacin
Agitacin
Evapora

cin con
5s
30s



N2, 40C
0.5 mL
3
mL
0.5 mL
FO
1 mL
plasma
etilace
NaOH
MeOH
Centrifugaci
tato:
+
1M
n 3000 rpm, 7
dietilt
X mL IS
min.
20 L


Fig 9. Procedimiento de extraccin del metoprolol
HPLC

Las curvas de calibracin se preparadon a partir de una solucin stock de metoprolol (1
mg/mL), sta solucin fue diluda posteriormente para obtener una concentracin de 1 mg/mL,
para plasma el rango de trabajo fue de 3-200 ng/mL y 5-300 ng/mL para orina. Las muestras
biolgicas se obtuvieron de pacientes con hipertensin arterial y se colectaron a diferentes
tiempos para poder llevar a cabo el estudio de farmacocintica.

12

La mayora de los compuestos farmacuticos pueden ser analizados con una columna C18,
debido a esto, el metoprolol fue analizado satisfactoriamente por cromatografa en fase reversa.
La correcta separacin se logr con las condiciones de la tabla 3, logrando de esta forma obtener
un tiempo corto para el analito (4.7 min). Los cromatogramas tpicos de esta determinacin se
pueden observar en la fig. 10.
En los cromatogramas se observa que el proceso de extraccin permite eliminar en su
mayora las interferencias endgenas de los fludos biolgicos. Cabe mencionar que el metoprolol
no necesito de una reaccin de derivatizacin para poder realizar su deteccin, esto quiere decir
que pertence al reducido grupo de sustancias con fluorescencia nativa. En la tabla 4 se resumen
los resultados obtenidos durante la validacin de este mtodo analtico.

Fig. 10. Cromatogramas representativos de plasma (izquierda)/ orina (derecha) (a) sin frmaco; (b)
fortificado con metoprolol (100 ng/mL) y atenolol (IS) (200 ng/mL); y (c) 2 h despus de la
administracin del frmaco a los pacientes.




Tabla 4. Resumen de la validacin del mtodo analtico

Parmetro
Plasma
Orina
Linealidad
3-200 ng/mL
5-300 ng/mL
Precisin
0.97 %
1.16 %
Exactitud
4.88 %
5.28 %
LOQ
3 ng/mL
5 ng/mL
LOD
1 ng/mL
1.5 ng/mL
Recobro
95.61.53%
96.41.75%

Finalmente el mtodo descrito en el artculo, fue utilizado para llevar acabo un estudio
farmacocintica cuya curva se observa en la fig 11. De ste grfico se obtienen importantes
parmetros como la concentracin mxima que alcanza el metoprolol en plasma, as como su vida
media entre otros parmetros. La utilizacin de deteccin de fluorescencia permite la obtencin
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de unos bajos LOD, lo cual hace que este mtodo de anlisis sea aplicable a estudios clnicos
donde las concentraciones de frmacos en fluido biolgico son muy bajas (B. Yilmaz et al, 2010)

Fig. 11. Concentraciones plasmticas de metoprolol en pacientes con hipertensin arterial despus
de una dosis nica de 100 mg


11. Conclusiones

El detector es un dispositivo electrnico que registra una propiedad fsico-qumica del material
eluido por la columna en funcin del tiempo. Los detectores actuales tienen un amplio rango
dinmico que, normalmente, permite trabajar en las escalas analtica y preparativa con el mismo
aparato. Los detectores actuales tienen sensibilidades que permiten la deteccin de
concentraciones muy pequeas y admiten rpidamente el cambio de una fase mvil a otra.
Para que el eludo de la columna cromatogrfica pueda ser evaluado, debe pasar por la
celda de un detector, la cual tiene, naturalmente, un volumen finito. El detector puede contribuir
de dos formas al ensanchamiento de banda, en funcin de su componente hidrulico (tubos de
ingreso a la celda, volumen y geometra de la celda) y su componente electrnico (la velocidad de
respuesta).
Evidentemente el volumen de esta celda debe ser pequeo, para que no vuelva a mezclar
los componentes que fueron separados en la columna. Adems del volumen de celda debe
considerarse su diseo, ya que celdas que induzcan flujos turbulentos son capaces de producir
dispersin, independientemente del generado por su volumen.


12. Bibliografa

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