INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA QUÍMICA E

INDUSTRIAS EXTRACTIVAS

“PARTES DE UN CROMATÓGRAFO HPLC Y PASOS PARA UNA

INYECCIÓN MANUAL”

Materia:

Laboratorio de Técnicas de Separación

Profesora:

Diana Magallanes Galán

Integrantes:

Mendoza Torres María Ximena

Quintana Meraz Aarón Hernán

Velázquez Flores Sebastián

​ IM76 ​Sección​ “A”

Grupo 3
 1. Breve introducción teórica de la cromatografía de líquidos de alta
resolución (máximo 2 cuartillas, mínimo 1 cuartilla).
La cromatografía líquida de alta eficacia se encuadra dentro de la cromatografía de
elución. En ésta, un líquido (fase móvil) circula en íntimo contacto con un sólido u otro
líquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de sustancias (analitos)
en la corriente de fase móvil, cada analito avanzará a lo largo del sistema con una
velocidad diferente que dependerá de su afinidad por cada una de las fases. Esto
supone que después de terminado el recorrido de la muestra por la columna, cada
una de las sustancias introducidas en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es
decir, estarán separadas.

A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto

rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por
la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.

La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos

naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos
polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro
parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase
estacionaria activa.

La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor
gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.

Todo equipo de cromatografía líquida de alta resolución debe disponer de, al menos,
los siguientes módulos:

1. Reservorios o botellas para la fase móvil.

2. Sistema de bombeo.

3. Inyector (manual o automático).

4. Columna.

5. Uno o varios detectores en serie.

6. Sistema de tratamiento de resultados.

7. Botella para residuos.

En el proceso cromatográfico intervienen un conjunto de fuerzas que compiten de

manera selectiva por un compuesto (analito o soluto) para: (1) o bien fijarlo al relleno
de la columna o fase estacionaria; (2) o bien llevarlo disuelto en el eluyente de la
columna (fase móvil). Los distintos tipos de fuerzas entre fase estacionaria y solutos
definen los distintos tipos de cromatografía HPLC (Tabla 19.8). La mayor parte de los
rellenos en HPLC están basados en sílice, seguidos por los que utilizan la resina
sintética estirenodivinilbenceno. A diferencia de la cromatografía de gases, en HPLC
la elección de la fase móvil es determinante en la separación obtenida; en cambio, el
gas portador en cromatografía de gases no contribuye de manera importante al
proceso de separación, siendo su principal función transportar los componentes de la
mezcla a través de la fase estacionaria.

2. Hacer una descripción de las partes que generalmente tiene un equipo

HPLC, que se muestran en los videos de los siguientes links:
https://www.youtube.com/watch?v=QzySXjxkNlY
https://www.youtube.com/watch?v=zVC_BttoOKE
PARTE DEL EQUIPO DESCRIPCIÓN
Los reservorios utilizados para las fases móviles van
desde el sencillo frasco de disolvente hasta los sistemas
más complejos capaces de filtrar, desgasificar (purgar),
mantener una atmósfera inerte, termostatizar, agitar, etc.
Reservorios (Disolvente o fase Son frascos boecos, regularmente transparentes o color
móvil) ámbar. Algunos de los disolventes más utilizados en
HPLC son: metanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano,
isopropanol, diclorometano, acetona, acetato de etilo y
hexano. Es muy importante elegir disolventes con una
pureza adecuada para cromatografía líquida.
Es un dispositivo capaz de proporcionar a la fase móvil
la presión necesaria para atravesar, al flujo
Bombas
seleccionado, la columna y el resto del sistema. Las
presiones de estos equipos son de 1-600 bar.
El inyector es un dispositivo hermético que se encuentra
situado a la salida de la bomba y que permite, mediante
el empleo de válvulas, incorporar la muestra a la fase
Sistema de inyección móvil antes de la columna, sin pérdidas de presión que
alteren el flujo constante proporcionado por la bomba.
Los inyectores de válvulas, conocidos como inyectores
de bucle (loop), se utilizan prácticamente en el 100% de
 los cromatógrafos, destacando por la precisión de la
inyección y el mantenimiento de la presión de la bomba.
Los inyectores pueden ser manuales y automáticos. En
los manuales, se puede cambiar fácilmente el loop, que
es el que nos determina el volumen de muestra que
entra en la columna. ​Los inyectores automáticos o
automuestreadores trabajan de manera similar a los
inyectores de loop, permitiendo variar el rango de volumen
inyectado. Los automuestreadores suelen disponer de
termostatización, y presentan una mayor precisión que los
manuales, optimizando el rendimiento del equipo HPLC.
La columna es delicada y puede perder eficiencia y
resolución, muchas veces irrecuperables, por ejemplo
cuando se emplean disolventes indebidos o
incompatibles, incluso en proporciones pequeñas. Las
columnas HPLC llevan filtros a su entrada y salida, y
conviene filtrar disolventes y muestras. A pesar de ello,
es muy conveniente incorporar una precolumna en el
Pre-columna sistema. Las precolumnas se disponen antes de la
columna HPLC, aumentando la vida de la columna
cromatográfica. La precolumna retiene las partículas
sólidas y otros contaminantes presentes en la fase móvil,
así como otros componentes de la muestra que se unen
irreversiblemente a la fase estacionaria. Además, la
sílice (que constituye el relleno base de la mayoría de las
columnas) puede disolverse lentamente en la fase móvil.
La carcasa de las columnas suele ser de acero
inoxidable, ya que se trata de un material inerte,
resistente a las altas presiones y con el interior liso,
aunque también existen columnas de vidrio, PEEK e
incluso de polietileno flexible. Es importante utilizar una
columna con una longitud suficiente para separar los
compuestos de interés. El empleo de una columna más
larga de lo necesario implica un mayor consumo de
disolvente y de horas de trabajo. Las columnas más
Columna habituales para HPLC analítica tienen longitudes entre 5
y 30 cm. En cuanto al diámetro de las columnas de
HPLC, para columnas analíticas este suele ser de 1-5
mm; este diámetro es un compromiso entre el consumo
de disolvente, el tiempo de análisis y la resolución
cromatográfica. Por otro lado, suele ser necesario
controlar la temperatura de la columna. Así, la mayoría
de los equipos de HPLC suelen incorporar un horno que
permite mantener la temperatura de la columna en el
rango 20-100 ºC
El detector cromatográfico debe caracterizarse por una
Detector
gran sensibilidad, precisión y linealidad. Es preferible
 que el detector no se vea afectado por cambios en la
composición de la fase móvil (gradientes), que tenga un
tiempo de respuesta ràpida y un volumen de celda lo
más pequeño posible, de modo que no contribuya al
ensanchamiento de los picos. El volumen de celda del
detector suele ser de unos pocos microlitros, por lo que
toma la forma de un tubo estrecho capilar con un cierto
ensanchamiento en la zona de medida, llamada
microcámara. Es fundamental no sobrepasar los límites
máximos de presión y caudal para cada tipo de detector.
Los detectores de índice de refracción, también
denominados refractométricos, trabajan de forma
isocrática.
Detectores fluorimétricos, para analitos que son
fluorescentes por naturaleza y es poco sensible.
Detectores de arreglo de fotodiodos o UV-VIS, están
basados en la absorción de luz UV-VIS, definida por la
ley de Lambert-Beer. Pueden incorporar un sistema de
filtros o un monocromador. Los detectores de fotodiodos
son capaces de realizar un espectro completo del
contenido de la celda en aproximadamente medio
segundo. Los detectores de fotodiodos permiten estimar
la pureza de un pico analizando, a lo largo del mismo, el
cociente de las absorbancias a dos longitudes de onda
distintas. Permiten, además, identificar algunos de los
compuestos eluidos mediante la comparación de sus
espectros Uv-vIS con los contenidos en bibliotecas de
espectros.
Es un dispositivo que puede leer varios tipos de señales
Registrador
eléctrica
 3. Realizar un diagrama de bloques de los pasos para realizar una
inyección manual, en un cromatógrafo HPLC, de acuerdo al siguiente
video:

https://www.youtube.com/watch?v=W9zVpcHPGnE
 4. Responder el siguiente cuestionario:
● En donde puede ser aplicada la cromatografía HPLC.
En separación de especies no volátiles o termolábiles, su gran aplicabilidad a
sustancias de gran interés para la industria y los distintos campos de la ciencia,
por ejemplo: ácidos nucleicos, aminoácidos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas,
terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, etc.
● Realiza una tabla de las diferencias que hay entre cromatografía de
líquidos fase reversa y fase normal.

Fase Normal Fase Inversa

Fase estacionaria: Polar Fase estacionaria: No Polar
Fase móvil: No Polar Fase móvil: Polar
Elución: Menos polar Elución: Más polar
Separación de compuestos Separación de compuestos
Polares No Polares
Picos menos coleados Rápido equilibrio de la
Se estabiliza rápidamente a columna con la fase móvil
cambios de fase móvil Fácil, rápido y reproducible
Reproducible

● ¿Qué es una dilución isocrática y que es una dilución por gradiente?

❖ Dilución isocrática: La composición de la fase móvil permanece constante
durante la separación.
❖ Dilución por gradiente: La composición de va modificando durante la
separación.

● ¿Cómo influye este tipo de diluciones en la separación de un analito?

En la resolución la dilución por gradiente es mejor puesto que dura menos tiempo,
los picos son más altos y estrechos. En la dilución isocrática el tiempo es
muchísimo mayor, provocando picos más ensanchados.
● ¿Cuáles son los eluyentes más comunes usados en cromatografía
HPLC?
Hexano, Tetracloruro de carbono, cloroformo, cloruro de metileno, dioxano,
acetonitrilo, metanol, isopropanol, agua.
 ● ¿Cuáles son características de una columna de HPLC?
Se construyen normalmente de acero inoxidable, la mayoría tienen una longitud de
10 a 30 cm, los tipos de básicos de relleno utilizado son: pelicular y partícula
porosa, las de sílice son las más comunes.
● ¿Qué columnas se usan en fase reversa y cual en fase normal?
Fase normal:​ Kinetex HILIC, Luna Silica, Onyx Silica, Luna CN
​Fase reversa:​ Kinetex C18, XB - C18, Phenyl – Hexyl, EVO C18
● ¿Por qué es importante filtrar la fase móvil y las muestras antes de se
introducidos en un cromatógrafo de HPLC?
Para eliminar posibles contaminantes, que pueden estar en la muestra y pueden
afectar en la determinación de los compuestos presentes en dicha muestra.
● ¿Cuáles son los tipos de detectores más comunes en HPLC?
Descríbelos de manera breve.
❖ Detector índice de refracción:​ en general su funcionamiento se basa en los
cambios del índice de refracción de la fase móvil por la presencia de un soluto.
❖ Detectores electroquímicos:​ se basa en métodos electro analíticos como la
amperometría, coulombimetría, voltamperometría, detectan compuestos
electroactivos, susceptibles de sufrir reacciones de oxidación o reducción.
❖ Detector de absorbancia en UV:​ mide la absorbancia a una o varias
longitudes de onda en el ultravioleta o en el visible
❖ Detector de fluorescencia:​ es un detector muy sensible ya que miden la
emisión fluorescente por parte de los analitos.

● ¿Cuáles son las características y función de una bomba en el

cromatógrafo HPLC?
La función de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de
pulsos de la fase móvil través de la columna, sin que el flujo sea influido
por la presión en cabeza de columna, ya que esta puede variar por
obstrucción de las líneas de conducción, del filtro de la cabeza de la
columna.
Sus características son:
❖ Estar construido con materiales químicamente inertes frente a la
fase móvil.
❖ Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
❖ Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un
amortiguador de estas.
 ❖ Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de
columnas.
❖ El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del
tiempo, ya que depende la reproducibilidad de los tiempos de
retención.
El siguiente video puede ser de utilidad para responder el cuestionario anterior:
https://www.youtube.com/watch?v=_wbzerZFrcc

5. Realizar una conclusión individual de la importancia de conocer el

funcionamiento básico de un cromatógrafo HPLC.

Mendoza Torres María Ximena

Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un importante método analítico
utilizado para separar y cuantificar los componentes de muestras líquidas. Es un tipo de
cromatografía en columna en el que por acción de una bomba, se hace pasar una mezcla
de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente conocido como fase
móvil. La fase móvil pasa a través de una columna cromatográfica, que contiene la fase
estacionaria a un flujo especificado. La separación de los compuestos ocurre en base a la
interacción de éstos con la fase móvil y la fase estacionaria. ​La cromatografía evolucionó
a partir del uso de la fase estacionaria polar y de un eluyente no polar como componente
principal de la fase móvil, por ello se consideró la práctica normal, de ahí el nombre de
fase normal. Si bien este modelo separó componentes basados ​en su naturaleza polar,
hubo una gran cantidad de mezclas de analitos que no eran polares y tenían
características hidrofóbicas que necesitaban separación.

El uso de una fase estacionaria no polar, con una fase móvil polar ayudó a separar estos
analitos hidrofóbicos. Dado que esta práctica es inversa a la fase normal, se utiliza el
término fase reversa.

Los distintos procedimientos que utiliza la cromatografía de líquidos tiende a ser

complementarios en cuanto a sus campos de aplicación, por lo cual, es el método más
moderno para la realización de cromatografías y recientemente es una de las técnicas
más utilizadas en la industria química y de alimentos, ya que ofrece la posibilidad de
identificar y cuantificar sus componentes mediante el uso de sustancias patrón.
Quintana Meraz Aarón Hernán
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) nos permite trabajar con
macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales
poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso
molecular, ya que al utilizar diferentes tipos de fases estacionarias dependiendo
de lo que necesitemos nos abre un campo de posibilidades en especial si se
necesita mejorar la precisión de los análisis. La técnica no es difícil de usar, pero
hay que tomar en cuenta varios factores, todo dependiendo de lo que vamos a
analizar, tener experiencia manejando la muestra y las condiciones específicas
nos daría mejores resultados

Velázquez Flores Sebastián

El cromatógrafo HPLC es particularmente útil para la separación de materiales
con grandes pesos moleculares que presentan una volatilidad muy baja y no
pueden separarse mediante cromatografía de gases. Se usa principalmente en
la biotecnología, en ciencias y la industria farmacéutica. Consta de una serie
de un serie de elementos indispensables los cuales son el sistema se
suministró de fase móvil en el cual se encuentra el depósito de disolventes y
bomba de alta presión, el sistema de inyección y el detector continuo. Es
necesario saber el funcionamiento de dichas partes del cromatógrafo ya que
dependiendo del tipo me muestra, será el tipo de detector, el relleno de
columna a utilizar, como a su vez el elegir el tipo de dilución ya sea isocrática o
por gradiente, dependiendo de lo mejor nos convenga ya que esta
cromatografía es el más utilizada y que mejorará considerablemente la
precisión de los resultados.