ADN polimrfico

amplificado al azar (RAPD)

y regiones intermedias
entre secuencias simples
repetidas
Martha Graciela Rocha Munive,1 Andrea Gonzlez Gonzlez2 y
Xitlali Aguirre Dugua3

Introduccin
Como se ha visto en otros captulos de este libro, la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) cambi radicalmente los mtodos de anlisis a nivel molecular. Para estimar la diversidad gentica, se pueden amplificar mediante la
PCR diferentes regiones del genoma y comparar entre individuos, poblaciones

o especies diferentes. En especies para las que no se cuenta con suficientes

datos genmicos previamente publicados, o bien para las cuales se quiere
obtener informacin gentica de manera rpida y relativamente econmica,
se pueden emplear marcadores moleculares inespecficos. Estos marcadores
usan iniciadores (tambin llamados oligonucletidos o primers) que amplifican
Laboratorio de Biologa Molecular, Centro Nacional de Investigacin y Capacitacin Ambiental, Instituto Nacional de Ecologa. Av. San Rafael Atlixco # 186. UAM Iztapalapa
Edificio W, Planta baja. Col. Vicentina. C.P. 09349. Mxico, D. F. mrocha@ine.gob.mx
2
Laboratorio de Evolucin Molecular y Experimental. Departamento de Ecologa Evolutiva, Instituto de Ecologa, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Apartado
Postal 70-275 Ciudad Universitaria, C.P. 04510 Mxico, D.F. andreagg@gmail.com
1

Laboratorio de Ecologa y Evolucin de Recursos Vegetales. Centro de Investigaciones en Ecosistemas, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Antigua Carretera a
Ptzcuaro No. 8701, Col. Ex-Hacienda de San Jos de La Huerta C.P. 58190. Morelia,
Michoacn. spikesadx@hotmail.com.

101

al azar diferentes regiones en el genoma y generan un patrn de productos

de PCR o huella gentica (Wolfe y Liston 1998) que se visualizan mediante
una electroforesis en geles de agarosa o acrilamida (ver captulo de electroforesis de ADN). En este captulo nos referiremos en particular a los marcadores conocidos como RAPDs (del ingls Random Amplified Polymorphic DNA o
ADN polimrfico amplificado al azar) (Williams et al. 1990) y a los ISSRs (de

Inter-Simple Sequence Repeats o regiones intermedias entre secuencias simples repetidas). Para fines de los estudios de gentica de poblaciones, estos
marcadores son marcadores dominantes, lo cual significa que bajo el modelo
de un locus con dos alelos, la presencia de una banda representa al genotipo
dominante (tanto homcigo como hetercigo), mientras que una ausencia de
la banda representa al genotipo homcigo recesivo.
Los RAPDs son una tcnica que consiste en la amplificacin de segmentos
de ADN con iniciadores pequeos (generalmente de 10 nucletidos de longitud) de secuencias aleatorias no-palindrmicas, con un contenido de G + C
entre 50 y 80%, (Lynch y Milligan 1994). La secuencia del iniciador es elegida
a priori de manera arbitraria y slo se utiliza un iniciador por reaccin, que actuar al mismo tiempo como iniciador sentido y antisentido (Figura 1A). Los
fragmentos obtenidos se visualizan como un patrn de bandeo caracterstico
del individuo y cada banda observada se considera un locus. La presencia o la
ausencia de las bandas entre individuos se deben a cambios en la secuencia
(o a la prdida) de los sitios a los que se alinea el iniciador (Navarro 1999).
La insercin o eliminacin de nucletidos en la secuencia intermedia entre los
dos sitios de acoplamiento, aumentar o disminuir el tamao de la molcula
amplificada.
Los ISSRs amplifican fragmentos que se ubican entre las repeticiones de secuencias simples (simple sequence repeats o SSRs), tambin llamadas microsatlites (ver captulo de microsatlites). Los iniciadores de ISSRs suelen ser de
16 a 25 pares de bases (pb) y estn conformados por una secuencia repetida
de un di- o trinucletido complementario al microsatlite. Es posible agregar a
esta secuencia de 1 a 4 nucletidos degenerados aleatorios en el extremo 3 o
en el 5, que asegurarn que la amplificacin inicie siempre en el extremo 5 o
en el 3 del microsatlite (Figura 1B). Al igual que en los RAPDs, slo se utiliza un
iniciador por reaccin y ocurre la amplificacin cuando dos secuencias repetidas
(o microsatlites) se encuentran en orientacin invertida y a una distancia que
permita que la ADN polimerasa amplifique el fragmento completo, ya que si se
102

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Figura 1. Principio bsico de los RAPDs (A) e ISSRs (B). Las flechas sealan la direccin de sntesis de la cadena durante la reaccin de la PCR; el fragmento amplificado
est representado a un lado de las cadenas originales. En (B) se han incluido dos
nucletidos suplementarios arbitrarios en el extremo 5 del iniciador.

encuentran muy alejadas entre s, no se amplificar la regin. Asimismo, se ha

observado que al menos el 96% de las bandas de ISSRs segregan de manera
mendeliana (Tsumura et al. 1996).
Los RAPDs e ISSRs han sido utilizados para resolver una amplia gama de preguntas relacionadas con distintos mbitos de la biologa, en su gran mayora en
plantas (vase seccin de aplicaciones).

Protocolo

Equipo
Termociclador
Cmara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Sistema de fotodocumentacin de geles
Micropipetas de 2 L, 20 L y 200 L
Balanza
ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD)

103

Etapas de la tcnica

a) Seleccin de los indicadores

b) Extraccin del ADN genmico

c) Amplificacin por PCR

d) Electroforesis en gel

e) Lectura de presencia/ausencia
de bandas

f) Anlisis de los patrones de

bandas obtenidos

104

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Material
Tubos para PCR de 200 L y microtubos de 1.5 mL
Puntas nuevas estriles de 10 L y 200 L
Gradilla para tubos de PCR
Hielo
Esptula

Reactivos
Buffer 10X para PCR
Mezcla de deoxinucletidos dNTPmix 10 mM
Solucin de MgCl2 25 mM
Taq DNA polimerasa 5 U/l
Agua ultrapura grado biologa molecular
Iniciadores para ISSRs 10M
Buffer TBE 1X
Agarosa (CAS N 9012-36-6)
Buffer de carga 6X
Solucin de Bromuro de Etidio 10 mg/ml (CAS N 1239-45-8)
Marcador de peso molecular de 100pb Nota: en caso de que el rango de
tamaos obtenido no se cubra con este marcador se puede seleccionar
otro (vase el captulo de Electroforesis)

Mtodo
1. Preparar una mezcla de reaccin de acuerdo al nmero de muestras de ADN
que se van a analizar e incluir un blanco (mezcla para PCR sin ADN para que
acte como control negativo) y una muestra que se conoce que amplifica
para ese iniciador de manera ptima (control positivo). Agregar las soluciones de acuerdo a los volmenes de la Tabla 1. Es muy importante mantener
estas mezclas de reaccin en hielo.
2. A cada tubo de PCR agregar 1 l del ADN problema. Una vez preparados los
tubos con mezcla de reaccin y ADN molde colocarlos en el termociclador.
3. Correr el programa de amplificacin que se encuentra en la Tabla 2.
ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD)

105

4. Al final de la amplificacin, los productos se corren con electroforesis en un

gel de agarosa al 2% en TBE 1X (ver captulo de electroforesis de ADN).
5. Teir el gel con solucin de bromuro de etidio y visualizar la imagen en un
fotodocumentador de geles.
6. Para la lectura de los geles se recomienda emplear algn programa que
permita visualizar las bandas y estimar el peso molecular. Se deben identificar todas las bandas existentes en el conjunto de muestras y construir
una matriz en la que se ubiquen todas las bandas a manera de columna y
cada individuo en los renglones. Para cada individuo asignar un valor de 1 si
la banda est presente o de 0 si est ausente.
7. Una vez obtenida la matriz de datos verificar el formato requerido por cada
uno de los programas de anlisis para poder hacer los clculos de los parmetros poblacionales.
Tabla 1. Reaccin de PCR estndar
Reactivo
Buffer para PCR
Solucin MgCl2
Mezcla de dNTP
Iniciador*
Agua ultrapura
Taq DNA
polimerasa
ADN molde**

Ci

Cf

Volumen para una

reaccin de 20 l

10X

1X

2 l

25 mM

2.5 mM

2 l

10 mM
(2.5mM c/u)

0.5 mM

1 l

10 M

0.5 M

1 l

----

----

26.8 l

5U/l

1U

0.2 l

50 ng/l

50 ng

Volumen total

1 l
20 l

* Preparar una mezcla de reaccin por cada iniciador.

** El ADN no se agrega a la mezcla de reaccin, se agrega a cada tubo por separado.

Ci = concentracin inicial en el stock en que se conserva, Cf = concentracin final en
la mezcla de reaccin.

106

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Tabla 2. Programa de amplificacin

Etapa

Paso

Temperatura

Tiempo

Nmero de
ciclos

95 C

0:02:00

2
3

94 C

54 C
72 C

0:00:40

0:00:40
0:01:00

40

72 C

0:05:00

4 C

Recomendaciones
Actualmente existe una gran cantidad de iniciadores de RAPDs e ISSRs reportados que se encuentran disponibles para realizar ensayos en nuevas especies
de inters. Al iniciar un trabajo de investigacin en el que se desee aplicar esta
tcnica, se recomienda:
a) Buscar artculos publicados o tesis en los que se haya utilizado el marcador
en la especie de inters para identificar los iniciadores que se utilizaron y las
condiciones de la PCR aplicadas.
b) Cuando se desea trabajar con una especie para la cual no existen trabajos
publicados con estas tcnicas, se recomienda investigar los iniciadores utilizados en el mismo gnero o la misma familia a la que pertenece la especie
de inters. Cuando esto no sea posible, se recomienda utilizar iniciadores universales desarrollados para diversos organismos como por ejemplo la serie
No. 9 de la Unidad de Servicios de Protenas y cidos Nucleicos (NAPS) de la
Universidad de Columbia Britnica, Vancouver, Canad, para ISSRs; o la serie
OP-A y OP-B de Operon Technologies, Estados Unidos, para RAPDs.
c) Una vez elegidos los iniciadores con los que se ha decidido hacer los ensayos, se sugiere:

ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD)

107

 Probar los diferentes iniciadores en una condicin estndar de temperatura, nmero de ciclos y tiempo de alineacin. La temperatura de alineacin depende del contenido de GC del iniciador y usualmente oscila entre
los 45 y 65 C para ISSRs y alrededor de los 40 C para RAPDs.
Elegir los que hayan generado patrones de bandeo, aunque sean
dbiles.
Optimizar las condiciones iniciales de la PCR para esos iniciadores que
generaron resultados positivos. Esta optimizacin incluye modificar particularmente la temperatura, el tiempo de alineacin y la concentracin
de MgCl2. Se recomienda ensayar tres condiciones diferentes de cada
uno de estos elementos, y sus combinaciones.
Para realizar la electroforesis incluir dos marcadores de tamao, uno al
inicio y otro al final del gel, para evitar una asignacin errnea del tamao de la banda en caso de un corrimiento irregular de la electroforesis.
Para un ejemplo ver Tsumura y colaboradores (1996), quienes montaron
los marcadores de ISSRs para Pseudotsuga menziesii (Pinaceae) y Cryptomeria
japonica (Cupressaceae). Para atender problemas prcticos relativos al desarrollo de la PCR es recomendable consultar a Espinosa (2007).
Una vez definidas las condiciones, el desarrollo de los ISSRs sigue el protocolo
usual de la PCR (vase captulo de PCR). Es muy importante incluir controles positivos y negativos en cada una de las corridas, as como realizar todos los experimentos, desde la extraccin del ADN hasta la visualizacin en el fotodocumentador utilizando las mismas condiciones para que todos los resultados sean tanto
reproducibles como comparables. La visualizacin de los productos amplificados,
que suelen ir de 200 a 2000 pb, puede realizarse en geles de agarosa teidos
con bromuro de etidio o con geles de acrilamida teidos con plata. Los geles de
agarosa son los ms comunes debido a su facilidad de elaboracin, bajo costo
y facilidad de visualizacin. Sin embargo, es posible definir un mayor nmero de
bandas por iniciador cuando se utiliza poliacrilamida debido a los altos niveles de
resolucin que sta permite (Moreno et al. 1998).

Mtodos de anlisis
Debido a que cada vez es ms sencillo y barato realizar la genotipificacin a gran
escala de diferentes organismos, se vuelve necesario el uso y conocimiento de
108

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

diferentes paquetes computacionales para llevar a cabo el anlisis estadstico

de los datos.
En esta seccin se describirn los programas ms comnmente utilizados
para obtener diferentes parmetros de gentica de poblaciones a partir de
marcadores dominantes, una buena revisin de los programas comnmente
empleados en la actualidad para el anlisis de gentica de poblaciones puede
encontrarse en Excoffier y Heckel (2006). Para este captulo, se realiz una seleccin de los programas y la mayora de estos se puede adquirir de manera
gratuita en Internet. Para obtener resultados ms slidos se sugiere utilizar diferentes programas de acuerdo a la informacin que cada uno puede proveer.
Existen paquetes multiusos que producen resultados que describen la diversidad
gentica al interior y entre poblaciones principalmente; otros estn enfocados
a un nivel individual y a la historia ms reciente de las poblaciones, mientras que
los programas ms especializados estiman parmetros poblacionales bajo escenarios evolutivos especficos. Estos ltimos utilizan estadstica bayesiana para
la estimacin de parmetros, lo cual facilita la incorporacin de conocimiento
previo para obtener estimados ms reales (Excoffier y Heckel 2006).

Paquetes multiuso
a) Arlequin
Plataforma: Windows, Mac, Linux
Sitio para descargarlo: http://lgb.unigecmpg.unibe.ch/arlequinsoftware/
arlequin3/
Autores: Laurent Excoffier, Stephan Schneider y David Roessli, Laboratorio
de gentica de poblaciones y cmputo del Instituto de Zoologa, Universidad de
Bern.
Este programa puede llevar a cabo diferentes anlisis de gentica de poblaciones que incluyen la estimacin de frecuencias genticas, estadsticos F (estructuracin gentica), desequilibrio de ligamiento, pruebas de neutralidad al interior
de las poblaciones, prueba de Mantel y anlisis de diversidad gentica entre y
al interior de poblaciones. Asimismo, una caracterstica relevante de este programa es que permite calcular una variedad de medidas de distancias genticas
las cuales incluyen Jukes y Cantor, el parmetro de distancia de Kimura 2 y la
distancia de Tamura-Nei, cada uno de stos con o sin la correccin gamma a las
ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD)

109

tasas de evolucin. Otra caracterstica especial es que permite llevar a cabo un

anlisis jerrquico (correlacin de la diversidad haplotpica a diferentes niveles de
subdivisin jerrquica) de la estructura gentica basado en la aproximacin de la
AMOVA (Analysis of Molecular Variance) (Excoffier et al. 1992) para as saber
cmo se encuentra repartida la variacin gentica en distintos niveles jerrquicos
(individuo, poblacin, grupos de poblaciones, especie).
b) Genetix
Plataforma: Windows 95, Windows NT o versiones posteriores.
Sitio para descargarlo: http://www.genetix.univ-montp2.fr/genetix/genetix.
htm.
Autor: K. Belkhir. Laboratorio de genomas, poblaciones e interacciones,
CNRS UMR 5000, Universidad de Montpellier II, Montpellier (Francia).

La parte relevante de este programa es que calcula las distancias genticas

de Nei y de Cavalli-Sforza ambas con o sin correccin de sesgos. Asimismo, calcula los ndices bsicos de diversidad gentica, estadsticos F, prueba de Mantel,
de desequilibrio de ligamiento entre loci multiallicos, as como la particin de
este desequilibrio para calcular la estructura poblacional. Arroja resultados con
intervalos de confianza basados en permutaciones o tcnicas de re-muestreo.
Es un editor de datos bastante conveniente.
c) TFPGA (Tools For Population Genetics Analysis)
Plataforma: Windows.
Sitio para descargarlo: http://bioweb.usu.edu/mpmbio/index.htm
Autor: Mark P. Miller, Departamento de Biologa, Universidad de Utah,
Logan, Utah, EE.UU.
Programa bsico para el anlisis de parmetros de gentica de
poblaciones.
Calcula distancias genticas, estadstica descriptiva, estadsticos F y
pruebas de equilibrio Hardy-Weinberg, de diferenciacin gentica, prueba de
Mantel y anlisis de UPGMA. Asimismo, permite el anlisis jerrquico de los
datos (Miller 1997).

110

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

d) Popgene
Plataforma: Windows 3.11, 95, 98, 2000, ME y NT, Mac: PowerPc, G3 y G4,
con instalacin previa de Virtual PC o Soft Windows.
Sitio para descargarlo: http://www.ualberta.ca/~fyeh/index.htm
Autor: Francis Yeh, Departmento de recursos renovables, Universidad de
Alberta, Canad.
La versin actual (1.32) est diseada especficamente para el anlisis de
marcadores codominantes y dominantes utilizando datos haploides y diploides.
Realiza clculos de estadstica descriptiva (frecuencias allicas, diversidad gentica, distancias genticas, estadsticos G y F) as como flujo gnico, pruebas de
neutralidad, desequilibrio de ligamiento, estructura multilocus y dendrogramas.
e) SPAGeDi (Spatial Pattern Analysis of Genetic Diversity)
Plataforma: Windows, Mac (PC virtual), DOS.
Sitio para descargarlo: http://www.ulb.ac.be/sciences/ecoevol/spagedi.
html.
Autores: Olivier Hardy y Xavier Vekemans, Laboratorio de Eco-etiologa
evolutiva, Universidad Libre de Bruselas, Blgica.
Originalmente diseado para caracterizar la estructura gentica espacial
de las poblaciones e individuos mapeados utilizando datos genotpicos de cualquier nivel de ploida. Las estimaciones de diferenciacin y parentesco entre los
individuos y las poblaciones (basados en comparaciones pareadas) se correlacionan con las distancias geogrficas va un anlisis de autocorrelacin espacial
o por regresin lineal. Asimismo, calcula diferentes parmetros de diferenciacin gentica, parentesco, endogamia, coeficientes de fraternidad, tamao de
vecindarios, dispersin gnica a partir de patrones de aislamiento por distancia, patrones filogeogrficos. Los resultados estn basados en permutaciones
y tcnicas de re-muestreo (Hardy y Vekemans 2002).
f) Genepop
Plataforma: DOS, Windows (ventana de comandos).
Sitio para descargarlo: http://kimura.univ-montp2.fr/~rousset/Genepop.
htm.
ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD)

111

Autores: Michel Raymond y Franois Rousset, Equipo gentico y ambiental

del Instituto de Ciencias de la Evolucin de la Universidad de Montpellier II,
Francia.
Calcula los estimadores bsicos de gentica de poblaciones (diversidad gentica, estadstica descriptiva), as como el nmero de migrantes por generacin utilizando el mtodo de alelos raros de Slatkin. Pone a prueba los supuestos de equilibrio de Hardy-Weinberg y equilibrio de ligamiento. Las pruebas y
los intervalos de confianza estn basados en cadenas de Markov y tcnicas de
re-muestreo (Raymond y Rousset 1995).
g) GelCompar II
Plataforma: Windows.
Sitio de internet (no hay una versin gratuita de este programa): http://
www.applied-maths.com/gc/gc.htm.
Programa de anlisis de geles que permite el agrupamiento de los datos segn
los patrones de bandeo que definen la huella gentica o fingerprint. Implementa
algoritmos filogenticos (matrices de distancia) y lleva a cabo tambin anlisis
de parsimonia generalizada. Es un excelente procesador de imgenes ya que tiene una interfase grfica que permite armar las matrices de presencia/ausencia
de bandas con mayor facilidad. No se encuentra disponible de modo gratuito, se
requiere comprarlo.
h) Fingerprinting II Informatix Software
Plataforma: Windows, Macintosh.
Sitio de internet (no hay una versin gratuita de este programa): http://
www.bio-rad.com.
BioRad, division de Sadtler, EE.UU.
Permite el anlisis de fingerprints implementando tcnicas de agrupamiento a partir de los patrones obtenidos en los geles. Se requiere comprarlo.

112

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Programas que realizan anlisis de individuos

Structure
Plataforma: Windows, Mac, Linux, Unix, DOS.
Sitio para descargarlo: http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html.
Autores: Peter Donnelly, Daniel Falush, Matthew Stephens, Jonathan
Pritchard, William Wen y Noah Rosenberg, Departamento de Gentica Humana,
Universidad de Chicago, EE.UU.
Permite la obtencin de parmetros de la estructura poblacional de genotipos multilocus. La caracterstica especial de este programa es que detecta la estructura gentica entre grupos de individuos as como tambin la
proporcin de nuevos inmigrantes cuyos ancestros fueron tambin inmigrantes (anlisis de admixtura). Reporta tambin las distancias genticas entre
poblaciones inferidas virtualmente y las poblaciones ancestrales, identifica
zonas hbridas as como la asignacin de los individuos a esas poblaciones
virtuales. Asimismo, asume equilibrio de Hardy-Weinberg al interior de los
grupos, calcula el equilibrio de ligamiento debido a la admixtura y trabaja
con datos diploides y haploides. Finalmente, estima los parmetros utilizando
estadstica bayesiana y cadenas de Markov (Pritchard et al. 2000, Falush et
al. 2003, 2007).

Programas especializados
Hickory
Plataforma: Windows.
Sitio para descargarlo: http://darwin.eeb.uconn.edu/hickory/hickory.html
Autores: Kent E. Holsinger y Paul O. Lewis, Departamento de Ecologa y
Biologa Evolutiva, Universidad de Connecticut, EE.UU.
Permite obtener estimadores de los ndices F, utilizando estadstica
Bayesiana. Se caracteriza por tener poca certeza en los coeficientes de endogamia debido al uso de marcadores dominantes (Holsinger et al. 2002).

ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD)

113

Anlisis estadstico de marcadores dominantes

Al utilizar marcadores dominantes se obtiene slo la presencia de las bandas
amplificadas o su ausencia, de manera que no se puede discernir entre el hetercigo portador de una copia y el homcigo dominante portador de dos copias. Dado que los hetercigos no pueden ser distinguidos, las frecuencias se
estiman a partir de los individuos sin banda, considerados como homcigos
recesivos. En un locus, la frecuencia del alelo recesivo (q) es simplemente la
raz cuadrada de la frecuencia de las ausencias (x), asumiendo que la poblacin
se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg: x = q2 y la frecuencia del alelo
dominante es p = 1-q. Por ello, al analizar los datos obtenidos con marcadores
dominantes se asume que: 1) cada uno de los marcadores representa un locus
mendeliano en el cual el marcador visible, el alelo dominante, est en equilibrio
de Hardy-Weinberg con un alelo recesivo y 2) los alelos marcados para diferentes loci no migran a la misma posicin en el gel (Lynch y Milligan 1994, citado
por Rentera 2007).
Para solucionar esta limitante, se han realizado anlisis de la progenie o
de tejidos haploides (por ejemplo, megagametofitos en pinos) para cada individuo que porta el alelo dominante (Isabel et al. 1999), aunque esto requiere de gran cantidad de trabajo, o en el peor de los casos los tejidos haploides
no estn disponibles para el anlisis. En los primeros trabajos con marcadores dominantes, para conocer las frecuencias allicas se requera de un conocimiento previo del coeficiente de endogamia (Zhivotovsky 1999), o bien
tratar al fenotipo multilocus como un haplotipo y usar un ndice de similitud
o distancia euclidiana, para describir la distancia entre los haplotipos en un
anlisis de varianza molecular (Excoffier et al. 1992).
Se ha estudiado con particular atencin la manera en que se pueden obtener resultados ms confiables al utilizar estos marcadores y se han llegado
a diferentes conclusiones. Por ejemplo, un trabajo definitorio en la manera en
que se pueden analizar estos marcadores, fue el publicado por Lynch y Milligan
(1994) en donde hacen una serie de recomendaciones para evitar el sesgo en
los clculos de frecuencias allicas. Por ejemplo, proponen excluir aquellos loci
con menos de tres alelos nulos (es decir, aquellos en los que no se observa la
presencia de banda) y usar muchos loci para compensar la posibilidad de no estimar de manera correcta los alelos recesivos. Estos mismos autores tambin
sugieren trabajar con tamaos poblacionales grandes (de 100 individuos o de
114

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

2 a 10 veces ms que cuando se usan marcadores co-dominantes). Usando

esta serie de correcciones, los valores obtenidos con marcadores dominantes
se asemejan a los obtenidos con marcadores co-dominantes (como las isoenzimas o microsatlites) para la misma especie. Se ha demostrado que cuando
se tienen muchos loci polimrficos, y muchos individuos por poblacin los estimadores tradicionales calculan de manera adecuada la heterocigosis (Krauss
2000). Recientemente, Nybom (2004) recomienda analizar como mnimo de
30 a 80 loci, aunque si se usan de 100 a 200 loci se obtienen valores an ms
confiables (Mariette et al. 2002), lo que es plausible usando marcadores como
los AFLPs (ver captulo de AFLPs).
Existen otras alternativas al uso de la suposicin de equilibrio de HardyWeinberg, por ejemplo el anlisis de diversidad usando el ndice de Shannon: de
acuerdo a Dawson y colaboradores (1995), el ndice de Shannon no es sensible
a efectos del sesgo causado por la incapacidad de detectar a los hetercigos. Por
otro lado, el anlisis de varianza molecular (AMOVA) usa distancias euclidianas
para determinar las diferencias entre los perfiles de ISSRs o RAPDs (o cualquier
otro marcador dominante), que al ser comparados como fenotipos, tambin evita la suposicin de equilibrio.

Aplicaciones

Diversidad y estructuracin gentica de poblaciones

Los datos obtenidos por medio de RAPDs e ISSRs han permitido conocer los
patrones de diversidad y estructuracin gentica presente en las especies de
plantas en funcin de su ciclo de vida, distribucin geogrfica y estrategias
reproductivas. Por ejemplo, se ha visto que las especies con polinizacin cruzada con un rango de distribucin amplio y ciclos de vida largos son genticamente ms diversas y mantienen esta variacin dentro de sus poblaciones, en
comparacin con las especies que cuentan con caractersticas ecolgicas contrastantes (es decir, plantas anuales, auto-polinizadas y de distribucin local;
Nybom y Bartish 2000, Nybom 2004). Tambin se han buscado patrones en la
diversidad en animales, por ejemplo, en el bivalvo Gemma gemma (Veneridae)
(Casu et al. 2005).
Particularmente, los ISSRs han permitido conocer los patrones de diversidad
gentica en especies de plantas silvestres como por ejemplo, Calamagrostis
ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD)

115

porteri (Poaceae),

(Esselman et al. 1999), Kochia (Chenopodiaceae)

(Mengistu y Messersmith 2002), Guizotia abyssinica (Asteraceae)(Petros et

al. 2007); as como para variedades de especies cultivadas como Coffea arabica (Rubiaceae) (Aga et al. 2005) entre otros.
En Mxico, los RAPDs se han utilizado para evaluar poblaciones silvestres y
domesticadas de chile (Capsicum annuum, Solanaceae) (Oyama et al. 2006).
Ambos marcadores se han empleado en estudios del gnero Agave (Navarro
1999, Navarro-Quezada 2003, Aguirre 2004, Gonzlez 2004, Coln 2006,
Trejo 2006, Scheinvar 2008, Rives 2009).

Discriminacin de taxa a nivel especfico e infraespecfico

Los ISSRs han sido empleados para discriminar taxa a nivel de especie y por
debajo de ste, particularmente para la distincin de cultivares en especies
de importancia agrcola, as como para identificar poblaciones o taxa genticamente nicos con fines de conservacin (ver ms adelante). Algunos
estudios representativos se han hecho con arroz (Oryza sativa, Poaceae)
(Blair et al. 1999, Joshi et al. 2000, Nagaraju et al. 2002, Saini et al. 2004),
trigo (Nagaoka y Ogihara 1997, Ammiraju et al. 2001, Pujar et al. 2002),
cebada (Fernndez et al. 2002), coliflor (Bornet et al. 2002a), papa (Bornet
et al. 2002b), algodn (Liu y Wendel 2001), jitomate (Kochieva et al. 2002,
Tikunov et al. 2003) y lneas hbridas comerciales de maz (Kantety et al.
1995).
Estrechamente ligado a la identificacin de cultivares puede mencionarse el
uso de los ISSRs en fingerprinting, ya que los perfiles nicos identificados para
cada cultivar se pueden utilizar posteriormente en su seguimiento y control.
Con este fin se ha utilizado esta tcnica en el mantenimiento de colecciones ex
situ de cacao (Theobroma cacao, Sterculiaceae; Charters y Wilkinson 2000).
Para una revisin sobre el uso de los ISSRs en especies de importancia agrcola
vase Pradeep y colaboradores (2002).

Conservacin
Estos marcadores se han utilizado para estimar y comparar la diversidad y la
estructura gentica de taxa raros o con presiones de conservacin (Rocha y
Gasca 2007, Smith y Bateman 2002, Ge et al. 2003); as como para la evalua116

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

cin del xito de estrategias de conservacin de la diversidad gentica de algunas especies basadas en reas protegidas o reservas (Ramesha et al. 2007).

Relaciones filogenticas
Aunque no es el marcador idneo para examinar la taxonoma y las relaciones
genticas entre especies, los ISSRs se han utilizado para discernir las relaciones
de cercana entre cuatro especies del gnero Hyobanche (Orobanchaceae) y
para la identificacin de especies dentro del gnero Morus (Moraceae, Wolfe y
Randle 2001, Vijayan et al. 2004).

Introgresin e hibridacin
Se han utilizado para comprender patrones de especiacin hbrida en el gnero Penstemon (Scrophulariaceae, Wolfe et al. 1998a, 1998b), as como
eventos de hibridacin e introgresin en diversas especies (Galaev et al. 2003,
Natcheva y Cronberg 2007, Ducarme y Wesselingh 2005).

Ventajas y desventajas
Los RAPDs y los ISSRs son tcnicas moleculares que han mostrado ser muy
tiles en temas muy distintos. Como lo ejemplifican los estudios citados en el
presente captulo, tambin han podido ser aplicados en una gran variedad de
familias de plantas.
Desde el punto de vista tcnico, ambos marcadores se encuentran en
regiones distintas dentro del genoma, en regiones tanto codificantes como
no codificantes del ADN, de manera que producen informacin til para el
estudio de la diversidad gentica (Wolfe 2005). Tambin revelan niveles de
variacin ms altos que los RFLPs e isoenzimas (Williams et al. 1990, Lynch
y Milligan 1994, Zietkiewicz et al. 1994, Otero et al. 1997, Russell et al.
1997, Parker et al. 1998). Se trata en ambos casos de tcnicas relativamente fciles que no necesitan conocer con anticipacin la secuencia de ADN
del organismo de inters, ni de la construccin o el mantenimiento de una
librera genmica, adems permiten analizar varios loci en una sola reaccin
de PCR de manera que se puede obtener informacin de diferentes regiones
del genoma.
ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD)

117

Por otra parte, los ISSRs tienen varias ventajas sobre los RAPDs debido a que
los iniciadores para su amplificacin son ms largos y se pueden usar temperaturas de alineacin ms elevadas (Wolfe y Liston 1998), lo que produce una
mayor especificidad en la reaccin que evita los artefactos y hace que las bandas sean reproducibles (Nagaoka y Ogihara 1997, Wolfe et al. 1998a). Se ha
recomendado el uso de ISSRs sobre los RAPDs porque son altamente sensibles,
reproducibles y por presentar bajo costo (Nagaoka y Ogihara 1997). Con la evidencia generada en los ltimos aos en diferentes especies de plantas, y con los
estudios comparativos que se han realizado (por ejemplo Nybom 2004), se ha
demostrado que son una buena opcin para estudios de variacin gentica con
diferentes enfoques (Wolfe 2005).
Sin embargo, estos marcadores, presentan la desventaja de que, al igual
que en otros marcadores inespecficos, fragmentos del mismo tamao sean
originados en regiones no homlogas, lo que puede distorsionar las estimaciones de similitud gentica (Snchez de la Hoz et al. 1996). La naturaleza
molecular de estos polimorfismos slo puede ser conocida si las bandas son
secuenciadas. En el caso de los RAPDs la corta longitud de los iniciadores demanda que la amplificacin por PCR se d con una temperatura de alineacin
relativamente baja, lo cual aumenta la probabilidad de un alineamiento no especfico y la generacin de informacin ambigua.
Asimismo, ambos tienen la desventaja de ser marcadores dominantes,
cuyo uso ha sido cuestionado debido a las suposiciones que se deben hacer
para efectuar los anlisis de frecuencias allicas, de diversidad y de estructura
gentica (Szmidt et al. 1996).

Perspectivas
En los ltimos aos, se ha popularizado el uso de estadstica bayesiana en los
anlisis de estos marcadores. Estos mtodos permiten incorporar la incertidumbre acerca de diferentes modelos (ya sea que la poblacin est en equilibrio o que se tenga informacin previa acerca de la magnitud de la endogamia)
y usar esta informacin para estimar los niveles de diversidad y estructura gentica de manera ms precisa (Holsinger y Wallace 2004).
Para mayor informacin sobre la tcnica de ISSRs se recomienda visitar el
sitio de Andrea G. Wolfe de la Universidad de Ohio (EE.UU): http://www.biosci.
ohio-state.edu/~awolfe/ISSR/ISSR.html.
118

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Agradecimientos
Las autoras agradecen al Dr. Luis Eguiarte del Instituto de Ecologa de la UNAM,
quien fue nuestro tutor y nos introdujo al mundo de los ISSR y los RAPDs, as
como al Bil. Aldo Valera quien nos instruy en todo los aspectos prcticos
para implementar los ISSRs en el laboatorio.

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