Validaciones

Microbiolgicas en la
Industria Farmacutica
27 de Octubre 2014

Secretara de Extensin Universitaria

Facultad de Farmacia y Bioqumica
UBA
1

Sergio Iglesias
Licenciado en Ciencias Biolgicas
Universidad de Buenos Aires
2do. Jefe Microbiologa
GADOR S.A.
siglesias@gador.com.ar
2

Organigrama

Directorio

Direccin de Operaciones (Produccin)

Gerencia de Calidad (Garanta de Calidad)

Jefaturas de Control Qumico y Microbiologa

Departamento de Microbiologa

Control Microbiolgico
Produccin de medios de cultivo
Control de calidad (medios, reactivos, sistemas de
identificacin, etc.)
Desarrollo/Validacin de tcnicas analticas
Monitoreo de ambientes, sistemas de aire comprimido,
sistemas de agua, etc.)
Entrenamiento de personal (produccin, reas limpias, etc.)
Emisin de tcnicas y procedimientos
Auditoras (Regulatorias ANMAT, FDA, de Licenciatarias, a
Terceros, etc.)
Investigacin de desvos y resultados fuera de
lmites/especificaciones
4

Microbiologa en la Industria
Farmacutica

Muestras de productos no obligatoriamente estriles

(materias primas, productos intermedios,
comprimidos, cpsulas, lquidos, cremas, geles, etc.)
Muestras de productos estriles (inyectables,
colirios, disolventes, etc.)
Materiales de envase (frascos, pomos, jeringas, etc.)
Muestras de aguas (materia prima, lavado de
materiales y reas)
Muestras ambientales (superficies de equipos, aire,
personal, etc.)
Valoracin microbiolgica de antibiticos
5

Laboratorio de Microbiologa
Que un microorganismo est no significa que
se lo pueda detectar

No existe un medio comn ideal de crecimiento

para todos los microorganismos

Los medios y las condiciones de incubacin no

siempre son apropiados para todos los
microorganismos que puedan estar presentes

Bacteriostasis de ciertas drogas, presencia de

inhibidores, organismos injuriados, etc.

Organismos viables no cultivables (VNC)

6

Laboratorio de Microbiologa
Dentro del control de calidad es el nico
sector que puede contaminar la muestra con
lo mismo que est buscando.
El anlisis microbiolgico comienza al
momento de tomar la muestra. (reas de
muestreo, envases violados, abiertos, con
signos de humedad, etc.)
La contaminacin microbiana por lo general
no es homognea.

Slo se puede asegurar la

calidad de los resultados
microbiolgicos mediante la
implementacin en el
laboratorio de un

SISTEMA INTEGRADO
DE CALIDAD
8

Diseo del
laboratorio

Procedimientos

Equipamiento

Sistema de
Calidad

Entrenamiento

Validaciones

Investigacin
de MDD

VALIDACIONES

10

Tcnicas de Control microbiolgico

(productos estriles y no estriles)
Ensayos de efectividad antimicrobiana
Ensayo de endotoxinas
Ciclos de esterilizacin/despirogenacin
Media fill
Sistemas de agua
Limpieza equipos productivos
Sistemas alternativos mtodos rpidos
11

VALIDACIN DE
PROCESOS

12

Equipamiento
Los

instrumentos se calibran

pHmetros, balanzas, termmetros, dataloggers,

pipetas automticas, manmetros, etc.

Los

procesos se validan

Ciclos de esterilizacin de material de vidrio

Ciclos de esterilizacin de ropa
Ciclos de esterilizacin de medios de cultivo
Ciclos de descontaminacin de materiales
Ciclos de despirogenacin de materiales, etc
13

Esterilizacin por calor hmedo

autoclaves

En la validacin de procesos de
esterilizacin de medios de cultivos y/o
productos considerar:

Carga mxima
Carga mnima

Revalidacin: cada vez que se realizan

cambios importantes en el equipo o en
la carga o cada 6 meses o 1 ao.
14

VALIDACIN DE
TCNICAS DE ANLISIS

15

Tcnicas microbiolgicas
Recuento

(bacterias y hongos)
Microorganismos objetables (los
especificados y los no aceptados por
cuestiones sanitarias y/o del producto)
Esterilidad (presencia/ausencia)
Materias primas (principios activos/excipientes),
materiales (envases primarios), productos
intermedios y productos terminados.
16

LA VERIFICACIN DE LA APTITUD DE
LAS TCNICAS MICROBIOLGICAS SE
BASA EN LA DEMOSTRACIN DE QUE:

ni el material a ensayar,
ni el ensayo al que se lo somete
INHIBEN
LA MULTIPLICACIN DE LOS
MICROORGANISMOS QUE PUDIERAN
ESTAR PRESENTES EN LA MUESTRA.

17

PROCEDIMIENTO PARA LA VERIFICACIN

DE LAS TCNICAS MICROBIOLGICAS

Se debe desafiar la muestra

con bajos niveles de un inculo
(100 UFC)
de diferentes microorganismos y
luego de realizar el ensayo propuesto
(tcnica de control microbiolgico,
test de esterilidad, etc.) se deben
recuperar los mismos.
18

MICROORGANISMOS A UTILIZAR
Bacterias

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Staphylococcus aureus ATCC 6538
Escherichia coli ATCC 8739
Salmonella enterica ATCC 14028

Bacillus subtilis ATCC 6633

Clostridium sporogenes ATCC 11437
19

MICROORGANISMOS A UTILIZAR
Hongos

Candida albicans ATCC 10231

Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

Aislamientos ambientales

Cepario: cepas de referencia:

estndares microbiolgicos
20

Control de Cepario

Viabilidad
Pureza
Identificacin

21

Nota:El da de la inspeccin del

primer lote la autoridad sanitaria
puede exigir largar en paralelo al
control microbiolgico del
producto una corrida de aptitud
de la tcnica con un
microorganismo elegido por
ellos.
22

Uno debe demostrar que el mtodo elegido

de ensayo para la estimacin cualitativa y
cuantitativa de los microorganismos es
sensible, preciso y confiable en la
recuperacin de los microorganismos
presentes en la muestra.
Entendindose la necesidad de

eliminar o neutralizar cualquier

propiedad antimicrobiana
previa a la evaluacin de la carga
microbiana de la muestra.
23

Mtodos de neutralizacin de las propiedades

antimicrobianas tanto del producto como de
los agentes conservadores

1. Inhibicin qumica
2. Inhibicin enzimtica
3. Dilucin
4. Filtracin por membrana
5. Cambio de diluyente
6. Agregado de cationes bivalentes
24

Esquema para verificacin de

recuentos
1 ml

1 ml

1 ml

1 ml
TUBOS B

Cultivo
24 hs

TUBO A
% TRANSMITANCIA

C ()
Prod

C ()
Dil

Dil +
Prod +
Cepa

Dil +
Cepa

<100
UFC/placa

Comparar los recuentos

obtenidos entre el control + de
las cepas slo con diluyente
contra los recuentos de las
cepas en presencia del
producto y/o neutralizante
25

Esquema para verificacin de

microorganismos especficos
1 ml

1 ml

1 ml

1 ml
TUBOS C

Cultivo
24 hs

TUBO A
% TRANSMITANCIA

C ()
Prod

<100 UFC

C ()
Medio

Medio +
Prod +
Cepa

Medio
+ Cepa
C (+)

Comparar la recuperacin obtenida

entre el control + de las cepas slo
con medio de cultivo contra la
recuperacin de las cepas en
presencia del medio de cultivo con
producto y/o neutralizante

Medios selectivos y/o diferenciales

26

Verificacin de la aptitud de la tcnica

SE DEBE DEMOSTRAR:
QUE LA RECUPERACIN ES SIMILAR AL
CONTROL
(Microorganismos especficos y Test de Esterilidad)
Y/O QUE EL PROMEDIO DE UFC RECUPERADAS
DEL INCULO DEL PRODUCTO
NO ES MENOR AL 70% (USP <1227>)
O QUE LA REDUCCIN OBTENIDA
NO DIFIERE EN UN FACTOR MAYOR DE 2 (50%)
(Captulos armonizados), DE LAS UFC
RECUPERADAS EN EL INCULO CONTROL
(Recuentos)

Validacin de la tcnica
AL MENOS
3 RPLICAS
INDEPENDIENTES
DEL MTODO DEBEN SER
LLEVADAS A CABO.

REALIZAR UN REPORTE
DE APTITUD
DEL MTODO DE
CONTROL
MICROBIOLGICO
Requerido en el registro del producto y
en la inspeccin de primer lote
29

Recordar que la verificacin del la

aptitud de la tcnica de control
microbiolgico es una exigencia de la
Autoridad Sanitaria para liberacin
de primer lote. Y es la nica forma
para asegurar que los resultados
obtenidos de recuperacin o
ausencia de microorganismos al
realizar el ensayo son confiables
30

VALIDACIN DE LA
EFICACIA DE
PRESERVACIN DE
UNA FRMULA

31

Ensayo de efectividad
antimicrobiana
USP <51> ANTIMICROBIAL
EFFECTIVENESS TESTING (AET)
Pharm. Eur. 5.1.3. EFFICACY OF
ANTIMICROBIAL PRESERVATION

Farmacopea Argentina Captulo 80

CONSERVANTES Eficacia
antimicrobiana. (EN REVISIN)
32

Ensayo de efectividad
antimicrobiana
Ciertos

productos deben asegurar, por

su actividad antimicrobiana per se o
gracias al agregado de conservantes,
condiciones protectoras
frente a una contaminacin microbiana
introducida inadvertidamente durante
su uso y/o a condiciones desfavorables
durante el almacenamiento
33

IMPORTANTE:
LOS CONSERVANTES O
PRESERVANTES
ANTIMICROBIANOS
NO DEBEN UTILIZARSE COMO
SUSTITUTOS DE BUENAS
PRCTICAS DE LABORATORIO
34

Todo agente antimicrobiano es

una sustancia txica, por lo que
su agregado debe estar
justificado.
(Organismos de control pueden cuestionar el
agregado de preservantes o su concentracin,
como as tambin el agregado de colorantes o
saborizantes)
35

Ensayo de efectividad
antimicrobiana
El

ensayo consiste en desafiar la

preparacin/formulacin a analizar
con un alto nivel de inculo y
determinar a distintos tiempos la
sobrevida de los microorganismos

36

Ensayo de efectividad
antimicrobiana
Se desafa el producto con un inculo de
diferentes microorganismos, hasta una
concentracin final de
1x105-1x106 UFC/ml g,
se almacenan las muestras inoculadas a 22,5
2,5C y se determina el comportamiento de
los microorganismos a distintos tiempos
(crecimiento, muerte o bacteriostasis)

37

Ensayo de efectividad
antimicrobiana

Alcance: <51> USP

Categora 1: Inyectables y otros parenterales

de mltiple dosis, incluyendo emulsiones,
productos ticos, nasales estriles y oftlmicos
acuosos
Categora 2: Productos acuosos de uso tpico,
nasales no estriles y emulsiones, incluyendo
las aplicadas a mucosa
Categora 3: Productos acuosos orales
(excepto anticidos)
Categora 4: Anticidos acuosos
38

Ensayo de efectividad antimicrobiana

Criterios de aceptacin <51> USP
Categora

Bacterias

Hongos y levaduras

Da 7: Reduccin de al menos 1 log desde

el recuento inicial
Da 14: Reduccin de al menos 3 log desde
el recuento inicial
Da 28: No se incrementa el recuento
obtenido el da 14

Das 7, 14 y 28: No se
incrementa el recuento inicial

Da 14: Reduccin de al menos 2 log desde

el recuento inicial
Da 28: No se incrementa el recuento
obtenido el da 14

Das 14 y 28: No se incrementa el

recuento inicial

Da 14: Reduccin de al menos 1 log desde

el recuento inicial
Da 28: No se incrementa el recuento
obtenido el da 14

Das 14 y 28: No se incrementa el

recuento inicial

Das 14 y 28: No se incrementa el

recuento calculado inicialmente

Das 14 y 28: No se incrementa el

recuento inicial

39

Ensayo de efectividad
antimicrobiana
Cepas a utilizar:

Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Candida albicans
Aspergillus brasiliensis

ATCC 8739
ATCC 6538
ATCC 9027
ATCC 10231
ATCC 16404

Aislamientos ambientales
Posibles contaminantes durante su uso
Microflora del sistema de agua.
40

Ensayo de efectividad
antimicrobiana
Primero: se inocula la formulacin a ensayar
Segundo: los recuentos en los tiempos
correspondientes (6hs, 1, 7, 14 28 das) se
realizan siguiendo la tcnica de recuento con
la verificacin de aptitud realizada
(incorporando neutralizantes, aplicando la
dilucin correcta, etc.)

41

Ensayo de efectividad
antimicrobiana
PERMITE DETERMINAR SI EL PRODUCTO Y/O
FORMULACIN CUMPLEN CON LOS CRITERIOS
DE ACEPTACIN SEGN A QU CATEGORA
PERTENECE
PERMITE EN LA ETAPA DE FORMULACIN DEL
PRODUCTO ESTUDIAR Y MAXIMIZAR EL
AGREGADO DE CONSERVANTES Y DETERMINAR
EL MS EFECTIVO Y EL MENOS COSTOSO

42

Anlisis de formulaciones de
un producto
1, 2, 3 y 4 son distintos conservantes
o distintas concentraciones del mismo

Log de los
recuentos
1

Horas/Das
43

Ensayo de efectividad
antimicrobiana
IMPORTANTE
La fecha de vencimiento de un
producto deber establecerse
no slo en base a estudios de
estabilidad sino tambin
teniendo en cuenta los
resultados obtenidos en los
ensayos de efectividad
antimicrobiana
44

Anlisis de riesgo
aw
Va
administra
cin

Historia

Riesgo
microbio
lgico

Resultados
Validacin

Origen
materias
primas

Antimicro
bianos

Proceso
elaboracin

45

Utilidad del Ensayo de Efectividad Antimicrobiana

en la evaluacin de riesgos

Permite mi producto el desarrollo bacteriano o

tiene propiedades bactericidas y/o
bacteriostticas? (filtracin, calidad de reas
de produccin, etc.)
Hay algn microorganismo que pueda alterar
las caractersticas de mi producto? (ej.
Pseudomonas) (calidad del agua)
Puede ser protegido mi producto modificando
el envase? Debo utilizar un envase estril?
Cmo debe ser la calidad microbiolgica de
las materias primas para mi producto?
Debo realizar el control microbiolgico lote a
lote o puedo justificar no hacerlo?
46

VALIDACIN DEL
SISTEMA DE
PRODUCCIN DE
AGUA
47

Aguas en la industria
farmacutica
Agua

potable (drinking water)

Agua purificada (PW)
Agua para inyectables (WFI)

48

Sistemas de obtencin
Destilacin
Intercambio

inico

Filtracin
smosis

inversa

49

Requisitos microbiolgicos
Recuento
Ausencia

de microorganismos
objetables
Esterilidad
Endotoxinas
50

Validacin del sistema de

agua
Verificar el mejor mtodo de
recuperacin de la flora propia del
sistema (medio de cultivo, mtodo y
condiciones de incubacin)
Verificacin anual incluyendo las 4
estaciones de resultados consistentes
que cumplen especificaciones y estn
bajo control

51

Validacin del sistema de

agua
DQ (Design qualification)
IQ (Instalation qualification)
OQ (Operation qualification
PQ (Performance qualification)(un ao)
Fase 1 (muestreo diario intensivo, fijacin mant.
preventivo y sanitizacin) (1 mes)
Fase 2 (muestreo diario intensivo) (1-2 meses)
Fase 3 (muestreo frecuente y fijacin de lmites
de alerta y accin)

52

Validacin del sistema de

agua
Se continua con monitoreo constante tanto
del sistema de alimentacin, produccin y
distribucin de agua.
No olvidar que el agua es una de las
materias primas ms importantes en la
industria farmacutica y cosmtica, siendo
el elemento de limpieza fundamental de
equipos y reas de produccin. Y que
donde hay agua hay microorganismos
(biofilms)

53

VALIDACIN DE
LIMPIEZA DE
EQUIPOS DE
PRODUCCION

54

Validacin de limpieza
Definicin

de limpieza: es el proceso de
remocin de potenciales contaminantes
(qumicos y/o microbiolgicos) de los
equipos de produccin y el
mantenimiento de esta condicin de tal
forma que los equipos puedan ser
usados en forma segura en
subsecuentes procesos de elaboracin.
55

Validacin de limpieza
Factores a considerar:
Limpieza (agentes de limpieza y
procedimientos)
Sanitizantes (tipos y procedimientos)
Almacenamiento (condiciones y
lmites)

56

Validacin de limpieza
Validacin

del mtodo analtico

(qumico)
Mtodos

microbianos de anlisis y
muestreo:
hisopados (tipo de hisopos y
procedimiento del hisopado)
placas de contacto
recuperacin de lavados y filtracin
57

Validacin de limpieza
Consideraciones desde el punto de vista
microbiolgico:
1) Efectuar controles un vez finalizada la
limpieza
2) Efectuar controles luego del
almacenamiento de equipos (verificar
puntos crticos, o-rings, tornillos,
aberturas, etc) y definir tiempos mximos
permitidos)

58

Validacin de limpieza
Fundamental: calidad del agua.
Libre de contaminantes qumicos (sales,
compuestos orgnicos, etc)
Libre de microorganismos (bacterias,
hongos)
Libre de endotoxinas ( para productos
parenterales)

59

Validacin de limpieza
Lmites ms usados:
Para recuentos:
<25 50 UFC/25 cm2
Para lavados:
<100 UFC/ml (PW)
<10 UFC/100ml y 0,25 E.U/ml (WFI)

Considerar no slo recuento sino presencia

de microorganismos objetables
60

VALIDACIN DEL
ENSAYO DE
ENDOTOXINAS

61

Endotoxinas Bacterianas (EB)

Tienen la propiedad de que al ser inyectadas

generan fiebre
Se originan en bacterias Gram negativas.
Son lipopolisacridos (LPS) de alto peso molecular.
Liberacin mayoritaria en la lisis celular.
Txicas. (pueden causar shock y muerte)
Estables frente a condiciones extremas de
tratamiento
No son retenidas por los filtros esterilizantes
convencionales de 0,45 m
62

Endotoxinas Bacterianas (EB)

Despirogenacin o eliminacin de EB:
Calor

seco: 180C 3 hs./ 250C 30 min.

cidos
Bases
Agentes Oxidantes
Agentes
Nota: La esterilizacin por calor hmedo
(autoclave a 121C/15 min) no elimina EB
63

Validaciones EB
Ciclos

de despirogenacin

Tcnica

analtica: activacin/inhibicin

Perodos

de almacenamiento de las

muestras

64

Ensayo de EB
Ensayo del Lisado de Amebocitos de Limulus
(ensayo LAL) (antes en conejo)
Reaccin de gelificacin debido a una reaccin
enzimtica en cascada.
Metodologa:
Gel en tubo
Tcnicas Fotomtricas: ensayos
cromognicos o turbidimtricos, de punto
final o cinticos.

65

Ensayo de EB
Interferencias:
pH de la muestra + lisado reactivo
Concentracin inadecuada de cationes divalentes
(tanto deplecin como altas concentraciones)
Alta osmoralidad (inhibicin por sales, azcares)
Metales pesados (inhibicin)
Detergentes (afectan a la polimerizacin)
Inhibidores/activadores de proteasas
Activadores no especficos
66

VALIDACIN DEL
PROCESO DE
LLENADO ASPTICO

67

Media Fill
Es

la simulacin del llenado asptico

con la finalidad de demostrar la
capacidad que tiene un proceso para
producir productos estriles con
determinados materiales, equipos,
servicios, personal y bajo
condiciones de trabajo controladas.

68

Llenado asptico
Soluciones

lquidas (viales o ampollas)

Liofilizados

Suspensiones
Ungentos,

geles o emulsiones

Polvos

69

Validacin Media Fill

Procesos
Materiales
Equipos
Personal
Controles Operativos
Condiciones Ambientales
Intervenciones al proceso (paradas de
mquina, ajuste volumen, reparaciones, etc.)

70

Disposicin 2819/2004 ANMAT

La

validacin del proceso asptico

debe incluir la simulacin del
proceso utilizando un medio
nutritivo, esta simulacin se debe
realizar como una validacin inicial
con tres ensayos de simulacin
satisfactorios consecutivos

71

Disposicin 2819/2004 ANMAT

La

simulacin del proceso debe

repetirse a intervalos definidos y
despus de cualquier
modificacin significativa del
equipo y proceso

72

Media Fill
Los

ensayos de simulacin del

llenado asptico se realizan
despus de la calificacin de los
equipos y validacin de los
procesos de esterilizacin, del
adecuado entrenamiento del
personal y bajo un programa de
monitoreo ambiental adecuado.
73

Media Fill
Se

debe realizar un GPT (Growth

Promotion Test Test de promocin
del crecimiento) al medio de cultivo al
inicio del ensayo de Media Fill y al final
de la incubacin de las muestras.
(luego de 14 das, 7 das a 20-25c,
hongos, y 7 das a 30-35C, bacterias.)

74

Media Fill
En caso de existir unidades que
evidencien crecimiento microbiano debe
realizarse una investigacin de la causa
de dicho desvo, aunque se cumpla el
criterio de aceptacin
Ver resultados de anlisis de aguas,
monitoreo ambiental de aire, de
superficies, de personal (guantes/ropa),
recuento de partculas, etc.

75

Historia o Presente?
Louis

Pasteur (1822-1895)
Robert Koch (1843-1910)
Walther Hesse (1846-1911)
Fanny Eilshemius (1850-1934)
Richard Petri (1852-1921)
Hans Christian Gram (1853-1938)
Raymond Sabouraud (1864-1938)
76

1800?..2014

77

Mtodos
Microbiolgicos
Alternativos
Rapid Microbiological Methods
RMMs
78

REGISTROS/INFORMES
(Recuentos, tinciones, halos, colonias, etc.)

TIEMPO (7-14-18 das!!)

AUTOMATIZACIN
(Repetibilidad/Reproducibilidad)

IDENTIFICACIN (Objetividad)
ORGANISMOS VIABLES NO CULTIVABLES
(VNC)

79

Recordar:
Resultados en tiempo real o
prximos a un
acontecimiento, permiten
tomar acciones correctivas
tempranas (efectividad)
80

COLIFORMES / E. coli

Mtodos de recuento de colonias

automticos
Son rpidos
Permiten guardar

registros
Son independientes del operador
Los registros fotogrficos aportan
informacin de los tipos de colonias
que se encuentran en los recuentos
Permiten auditar los resultados con
posterioridad al anlisis
82

Mtodos de recuento de colonias

automticos

83

Medicin de autofluorescencia
celular

Mtodo no destructivo que utiliza una

cmara con tecnologa digital de
imgenes que detecta y cuenta las
colonias en una placa que contienen
slo 50 clulas por colonia
(microcolonias) mucho antes que
sean visibles al ojo humano que
detecta las colonias a partir de
1.000.000 de clulas o ms por
colonia
84

Medicin de la
autofluorescencia celular

Growth Direct - Rapid Micro Biosystems

85

Medicin de la
autofluorescencia celular

86

Bioluminiscencia ATP
ATP+ D-Luciferin + O2
Luciferase

AMP + Oxyluciferin + CO2 + PPi

+Luz
(RLU: relative light units)

87

Bioluminiscencia ATP
ATP

en todos los microorganismos

ATP en microorganismos en activa
divisin o no
Deteccin sobre:
Superficies (Controles ambientales)
Medios lquidos (Carga microbiana)
Filtracin en Membranas (Recuentos)

88

Bioluminiscencia ATP

89

Bioluminiscencia ATP

90

Medicin del consumo o

produccin de gases
Cuando

un microorganismo
crece produce o consume
gases.
Estos gases se pueden medir en
dispositivos cerrados con
detectores especficos

Medicin del consumo o

produccin de gases
Pueden medirse los cambios de
presin por produccin de gases
(Ej. CO2) o consumo de gases
(Ej. O2), as como la deteccin
colorimtrica del CO2

Medicin del consumo o

produccin de gases

Impedancia/Conductividad
Los microorganismos creciendo en
medios de cultivo metabolizan
nutrientes orgnicos dbilmente
cargados (grandes protenas,
hidratos de carbono de cadenas
largas, etc.) a metabolitos altamente
cargados (aminocidos,
monosacridos, radicales libres,
etc.)

Impedancia/Conductividad
Estos nuevos metabolitos generan
cambios en las propiedades
elctricas de los medios de cultivo
(Ej. aumento de la conductividad,
disminucin de la resistencia, etc.) ,
que son medibles mediante
electrodos, y la respuesta es
correlacionable con la cantidad de
microorganismos presentes en la
muestra

Impedancia/Conductividad

96

Epifluorescencia
Direct epifluorescent filtration technique (DEFT)

Los microorganismos son

concentrados por filtracin y se
tien con un colorante
fluorescente (ej: naranja de
acridina). Los recuentos se
realizan con un microscopio con
epifluorescencia.

Epifluorescencia
Direct epifluorescent filtration technique
(DEFT)

98

Hibridizacin / Anticuerpos
Fluorescense in situ hybridization (FISH)

Igual que DEFT pero utilizando

hibridizacin con
oligonucletidos o anticuerpos
marcados fluorescentes
especficos para secuencias de
rRNA microbiano o antgenos
especficos

Hibridizacin / Anticuerpos

100

Citometra en fase slida

Solid phase cytometry

Una membrana filtrante se utiliza

para retener los microorganismos
y se utiliza un fluorforo,
inicialmente no fluorescente, que
fluoresce al ser metabolizado
enzimticamente al introducirse
en las clulas (ej: enzima esterasa)

Citometra en fase slida

Solid phase cytometry

102

Citometra en fase slida

Solid phase cytometry

103

Citometra de flujo
Flow cytometry

Los microorganismos
marcados con el fluorforo
son detectados en
suspensin, al pasar a travs
de una celda de medicin

Citometra de flujo
Flow cytometry

105

Recuento de partculas inertes y

biolgicas al mismo tiempo
Esta

tecnologa est basada en un

sistema ptico que detecta
simultneamente el tamao de la
partcula a travs de la desviacin del
lser y la fluorescencia UV inducida
por el lser de metabolitos celulares
(incluyendo esporas). Diferenciando
microbios de partculas inertes.

Recuento de partculas inertes y

biolgicas al mismo tiempo

107

Mtodos bioqumicos
totalmente automatizados
para identificacin
Basados en el metabolismo
celular (consumo de
hidratos de carbono,
presencia-ausencia de
enzimas, etc.)

Mtodos bioqumicos
totalmente automatizados

109

Mtodos inmunolgicos
Basados en la especificidad
de la reaccin antgenoanticuerpo para detectar
componentes celulares.
(mtodos de aglutinacin,
mtodos de ELISA, etc.)
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Mtodos inmunolgicos

Placas de ELISA

Tiras reactivas

111

Perfil de cidos grasos

Fatty acid profiles

La composicin de los cidos

grasos celulares son estables, bien
conservados y muestran un alto
grado de homogeneidad dentro de
los diferentes grupos taxonmicos.
Los cidos grasos son cuantificados
por cromatografa gaseosa de alta
resolucin y el patrn obtenido es
comparado en una base de datos y
as poder identificar aislamientos.

Perfil de cidos grasos

Fatty acid profiles

113

Espectrofotometra de masa
Espectros especie-especficos se obtienen
al someter aislamientos de
microorganismos al calor y analizar los
productos obtenidos por espectofotometra
de masa. O cuando clulas enteras son
sometidas a intensa ionizacin y los
productos obtenidos se analizan por
espectrofotometra de masa denominada
MALDI-TOF (matrix-assisted laser
desorption/ionization time of flight mass
spectrometry)

Espectrofotometra de masa

115

Espectrofotometra de masa
BACTERIAS
HONGOS

116

Marcadores de ADN
Se utilizan
oligonucletidos que
hibridizan con
marcadores genticos
especie-especficos

HIBRIDIZACIN

118

HIBRIDIZACIN

119

PCR Polymerase chain reaction

Se amplifican regiones del genoma
(DNA o RNA) del microorganismo
especie-especficas y se determina
la presencia o ausencia de dichas
regiones

PCR
Polymerase chain reaction

121

Mtodos basados en fagos

Esta tcnica caracteriza e identifica
microorganismos explotando la alta
especificidad de infeccin que
poseen ciertos fagos a determinadas
especies bacterianas. Se puede medir
la infeccin mediante placas de lisis
o por medicin de los fagos
marcados dentro de las clulas
bacterianas.

Mtodos basados en fagos

123

Anlisis gentico Ribotyping

Esta tcnica caracteriza e identifica
microorganismos usando
fragmentos de restriccin de los
cidos nucleicos celulares que son
sometidos a electroforesis y luego,
son hibridizados con secuencias
homlogas a regiones que codifican
para el rRNA generando as un
patrn especie-especfico

125

EN EL CASO DE UTILIZAR MTODOS

MICROBIOLGICOS ALTERNATIVOS
(por razones econmicas, de conveniencia,
adaptabilidad a automatizacin o anlisis
computarizado de los datos, ventajas en la
sensibilidad, precisin, rapidez, etc.)

ES REQUERIDA LA VALIDACIN DE
ESTOS NUEVOS MTODOS
126

LA VALIDACIN CONSISTE EN
DEMOSTRAR QUE LA NUEVA
METODOLOGA ES SIMILAR O
PROVEE UNA VENTAJA CON
RESPECTO A LOS MTODOS
DE FARMACOPEA
127

Diferencia importante

Mtodo automatizado: Es un mtodo

basado en el mismo principio que el de
Farmacopea, donde se automatiza una
parte. (Ej. Recuentos de colonias en agar
con contadores automticos)
Mtodo alternativo: Es un mtodo
basado en un principio diferente al de
Farmacopea (Ej. Recuentos de clulas
basados en actividad enzimtica )

PARMETROS A VALIDAR
EXACTITUD
PRECISIN
ESPECIFICIDAD
LMITE DE DETECCIN
LMITE DE CUANTIFICACIN
LINEALIDAD
INTERVALO (Rango)
TOLERANCIA
(Fortaleza/Resistencia/Ruggedness)
ROBUSTEZ
REPETIBILIDAD

129

Ensayo
cualitativo

Ensayo
cuantitativo

Ensayo de
identificacin

EXACTITUD

PRECISIN

ESPECIFICIDAD

LIMITE DE DETECCIN

LMITE DE CUANTIFICACIN

TOLERANCIA

ROBUSTEZ

X
X

X
X

X
X

Parmetro

LINEALIDAD
INTERVALO

REPETIBILIDAD

130

Link del Manual de

Microbiologa.
Sin cargo como e-book.

http://www.aam.org.ar/vermas_
publicaciones.asp?102
131

132