5053UY

DeterminacindeColiformes
Termotolerantesenaguasnaturales
superficialesosubterrneas,aguas
recreacionalesyaguasresiduales.

Tcnicadefiltracinpormembrana

Elaborado

S.CastroScarone
AnalistaMicrobiologa

Modificado
yRevisado

GabrielaPistone
JefadeSeccinMicrobiologa

Aprobado

S.CastroScarone
JefadeLaboratorio

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Coliformes
Termotolerantes
SECCION5

APLICACIN

1.1

Esta normativa tcnica se utiliza para la determinacin de Coliformes Termotolerantes en

aguas naturales superficiales o subterrneas, aguas recreacionales y aguas residuales
filtrando un volumen determinado de la muestra, y obteniendo resultados en 24 horas.

REFERENCIAS

2.1

Control de calidad analtico para verificar coliformes termotolerantes determinados por la

tcnica de filtracin por membrana para lograr un mayor reconocimiento de colonias
tpicas y no tpicas por parte del analista, 5072UY.

2.2

Manual de Control de Calidad Analtico Laboratorio DINAMA

2.3

Manual de Gestin de Calidad Laboratorio DINAMA

2.4

Manual de Calidad Laboratorio DINAMA

2.5

Rutas de Anlisis: RMB01

2.6

Instructivo de equipos: INE02, INE03, INE13, INE16, INE17, INE19, INE44, e INE46.

RESUMENDELMTODO

2.1

El grupo de bacterias coliformes termotolerantes para la tcnica de filtracin por

membrana se define como todos los bacilos gram negativos, aerbicos y algunos
anaerbicos facultativos, no formadores de endosporas, que cuando se incuban en medio
M-FC por 24 2 horas a 44.5 0.2 C desarrollan colonias color azul.

2.2

El principio de esta tcnica consiste en la filtracin de un volumen conocido de muestra a

travs de una membrana de nitrato de celulosa y su incubacin en un medio de cultivo
selectivo a 44.5C por 24 hs. Este medio selectivo y la temperatura de incubacin
disminuyen el desarrollo de bacterias no coliformes que afectaran negativamente el
crecimiento de los coliformes termotolerantes.

PRECAUCIONESDESEGURIDAD

4.1

El anlisis y el recuento deben ser realizados utilizando tnica y guantes descartables a fin
de evitar el riesgo de contraer enfermedades.

INTERFERENCIAS

5.1

Aguas con gran turbidez y baja densidad de coliformes termotolerantes; presencia de

txicos orgnicos como fenoles; existencia de una carga de bacterias no coliformes muy
grande.

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Termotolerantes
SECCION5

MUESTREOYPRESERVACION

6.1

La muestra debe ser colectada en frascos de vidrio, o de polipropileno autoclavable, de

boca ancha, y estriles. El frasco debe llenarse, dejando una cmara de aire para poder
homogeneizar la muestra antes de procesarla.

6.2

Cuando la muestra es de agua de ros, arroyos, lagos o reservorio, recolectar la muestra por
lo menos 15 cm debajo de la superficie y si es posible, contra corriente.

6.3

El tiempo entre la toma de la muestra y su anlisis debe ser el menor posible. Se aconseja
procesar la muestra el mismo da de obtenida. De no ser esto posible por razones prcticas,
la muestra debe ser almacenada en oscuridad y a una temperatura menor a 10C. Para
aguas naturales el perodo mximo de conservacin de la muestra es de 24 hs. Para
efluentes industriales es de 8 horas.

6.4

Para efluentes industriales lquidos que fueron clorados, el frasco debe contener tiosulfato
de sodio (Na2S203) en una concentracin de 100 mg/L de muestra para neutralizar el cloro
residual. En un frasco de muestreo de 120 mL, 0.1 mL de solucin de Na2S203 al 10% (p/p),
es suficiente para neutralizar 15 mg/L de cloro residual. Alternativamente, en un frasco de
muestreo de 500mL, agregar 40 mg de Na2S203. y esterilizar.

6.5

Para el caso de agua para beber, la concentracin del agente neutralizante puede
reducirse a 0.1 mL en un frasco de muestreo de 120 mL, de una solucin de Na2S203 al 3%
(p/p). Esto da una concentracin final en la muestra de 18mg/L y neutraliza hasta 5 mg/L
de cloro residual. Alternativamente, en un frasco de muestreo de 500mL, agregar 12 mg de
Na2S203 y esterilizar.

6.6

Cuando la muestra posee metales pesados (>1,0 mg/L), el frasco de muestreo debe
contener EDTA a pH 6.5 como agente quelante. Deben agregarse al frasco de muestreo
antes de la esterilizacin del mismo, 0.3 mL de una solucin de EDTA al 15% (p/p) cada 120
mL de muestra.

INSTRUMENTAL

7.1

Equipo de filtracin: embudo y portafiltro poroso que se puedan trabar entre s y sean
autoclavables; bomba de vaco; kitasato de 1 litro o mayor; trampa de agua entre el
kitasato y la bomba de vaco.

7.2

Balanzas de precisin

7.3

Incubadora a 44.5 0.2C.

7.4

Equipo de recuento: microscopio binocular con un aumento de 10 a 15X y una fuente de

luz fluorescente posicionada formando un ngulo de 60-80C con la placa (de preferencia).

7.5

Autoclave

7.6

Mecheros

7.7

Placas de Petri estriles, de plstico descartables (o de vidrio) de 47 mm de dimetro

aproximadamente u otro tamao adecuado.

7.8

Filtros de nitrocelulosa cuadriculados estriles de 0.45m 0.02m de dimetro de poro,

libre de glicerina y sin reas hidrofbicas, de 47 mm de dimetro.

7.9

Pinzas de acero inoxidable para filtros, sin extremidades rugosas.

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7.10 Tubos de ensayo de vidrio estriles para diluciones con tapa de algodn o de rosca.
7.11 Pipetas automticas de 1000 L y de rango variable (1-10mL), y punteros estriles para
cada una de las pipetas automticas .
7.12 Material de vidrio estril para preparacin del medio de cultivo.
7.13 Termmetros calibrados para controlar la temperatura de la incubadora.
7.14 Heladera a 1- 4,4 C.
7.15 Anzas
7.16 Cmara de Flujo Laminar
7.17 Microondas (de preferencia)
7.18 Cinta de revelado de autoclave

8 REACTIVOS
8.1

Peptona (Difco, BBL u Oxoid)

8.2

Etanol

8.3

Medio de cultivo M-FC Agar (Difco,BBL u Oxoid)

8.4

Agua destilada

9 PRECAUCIONESPARALAOPERACIN
9.1

El material de vidrio que se emplee en la realizacin del medio de cultivo, as como en el

procedimiento analtico debe estar lavado, enjuagado con agua destilada y esterilizado.

9.2

Las placas de petri de plstico deben estar estriles. Pueden ser reutilizadas despus de
lavadas y expuestas a la luz ultravioleta en condiciones de esterilidad por 30 min. Guardar
las placas en la oscuridad para evitar la fotorreparacin por no ms de 2 semanas despus
de esterilizadas. Dejar registro en la ruta de anlisis de la fecha de esterilizacin de las
mismas.

9.3

Los punteros de las pipetas automticas y los embudos de filtracin deben ser esterilizados
previo a su utilizacin.

9.4

Es imprescindible al iniciar el anlisis limpiar la mesada de trabajo con alcohol y realizar el

anlisis entre dos mecheros para mantener lo mejor posible las condiciones de esterilidad.

10 OPERACIONESPREVIAS
Preparacin del agua peptonada al 0,1%
10.1 Adicionar 1g de peptona a 1000mL de agua destilada, y disolver agitando. El pH final debe
ser 6.8.
10.2 Precintar la tapa del recipiente con cinta de revelado de autoclavado y esterilizar en
autoclave por 15 minutos a 121C.
10.3 Almacenar en heladera hasta un mximo de 30 das y rotular el recipiente indicando,
nombre del reactivo, fecha de elaboracin, y tcnico responsable.

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10.4 Dejar registro en la ruta de anlisis de la fecha de preparacin del agua peptonada.

Preparacin del medio de cultivo

10.5 El medio de cultivo debe prepararse segn instrucciones del fabricante en el envase, en
material de vidrio estril, sin necesidad de ser autoclavado. Disolver y fundir en horno
microondas o en bao Mara. Hervir 1minuto. El pH final del medio de cultivo debe ser 7,4
0.2. Dejar registro en la ruta de anlisis
10.6 Puede almacenarse a 1- 4,4 C por un perodo mximo de 14 das, ya sea en erlenmeyer,
frasco Schott o repartido en las placas.
10.7 Dejar registro en la ruta de anlisis de la preparacin de los medios de cultivo.

Preparacin de las Placas de Petri

10.8 Previo a la distribucin del medio de cultivo en las placas de Petri estriles, termostatizarlo
a 45C. Colocar aproximadamente 3 mL de medio por cada placa de 47 mm de dimetro,
bajo condiciones de esterilidad.
10.9 Dejar solidificar sobre la mesada de trabajo.
10.10 Almacenar en heladera de material estril (1- 4,4C) hasta su utilizacin.
10.11 Las placas de Petri antes de usarse deben rotularse en el fondo de las mismas con lpiz
graso, indicando nmero de muestra y dilucin efectuada.

Preparacin de tubos para diluciones

10.12 Estos tubos se preparan en caso de que sea necesario hacer diluciones de la muestra antes
de filtrar.
10.13 Colocar 9 0.2 mL de agua peptonada en tubos de ensayo. Tapar con algodn o tapa de
rosca. Colocar los tubos en una gradilla o cesto y cubrir con papel aluminio o papel de
embalaje.
10.14 Autoclavar por 15 minutos a 121C.
10.15 Conservar en heladera de material estril (1- 4.4C) hasta el momento de su uso, como
mximo 30 das.

11 ANALISISDELAMUESTRA
11.1 El volumen de muestra a ser filtrado se determina de acuerdo a la densidad bacteriana
esperada y el origen de la muestra. En caso de ser necesario se preparan diluciones en
cascada en los tubos de dilucin, adicionando 1mL de muestra o de la dilucin previa, a los
9 mL de agua peptonada. Se recomienda filtrar 2 volmenes diferentes de muestra en
mltiplo de 10. Si no se dispone de valores histricos de la muestra es conveniente filtrar
tres volmenes diferentes.
11.2 Conectar el equipo de filtracin con embudo estril. Colocar un filtro de nitrocelulosa
estril con la superficie cuadriculada hacia arriba sobre el portafiltros poroso del embudo
utilizando pinzas humedecidas en alcohol, flambeadas y a temperatura ambiente.

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Coliformes
Termotolerantes
SECCION5
11.3 Filtrar un volumen aproximado a 10 mL de agua peptonada estril para humedecer el filtro.
11.4 Homogeneizar la muestra agitndola o usando el vortex (si se hicieron diluciones en
tubos), y filtrar el volumen seleccionado.
11.5 Luego enjuagar el embudo filtrando aproximadamente 10 mL de agua peptonada estril.
Retirar el filtro con pinzas estriles y colocarlo en la placa de Petri sobre el medio, con la
parte cuadriculada hacia arriba, evitando la formacin de burbujas de aire, pasar
suavemente la pinza por el borde del filtro para sacar el aire. No tocar con la pinza el rea
de filtracin del filtro ya que se arrastran clulas bacterianas. Asegurarse de que todo el
filtro quede en contacto con el medio de cultivo. Cerrar la placa y colocarla en la mesada
para luego ser incubada.
11.6 Luego de filtrar cada muestra descontaminar los embudos humedecindolos con alcohol y
flambendolos. Una vez que el alcohol se consume hacer pasar suficiente agua peptonada
estril para lavar el sistema y enfriarlo ms rpidamente.
11.7 Si el volumen a filtrar es poco (1 mL) colocar en el embudo aproximadamente 10 mL de
agua peptonada estril y luego la muestra, para lograr una mejor distribucin de la misma
sobre la membrana al ser filtrada.
11.8 Siempre comenzar la serie de filtracin por la dilucin mayor para no contaminar el embudo.
11.9 Incubar las placas de Petri en posicin invertida, en la estufa de 44.5 0.2C durante 24
2 horas.

Recuento
11.10 Las colonias tpicas de coliformes termotolerantes son de distintas tonalidades de azul. Las
colonias grises o crema son consideradas como no coliformes, aunque exiten colonias de
E.coli atpicas que se presentan de color crema por lo que se recomienda realiza la
verificacin a posteriori.
11.11 El recuento de colonias se realiza en las placas que contengan entre 20 y 60 colonias de
coliformes tpicas y no ms de 200 colonias de cualquier tipo.

12 ANLISISDEDATOS
12.1 La ecuacin que se emplea es la siguiente:
C. Termotolerantes (ufc/100mL) = colonias de coliformes contadas x 100
mL de muestra filtrados
Ufc corresponde a Unidades Formadoras de Colonias.
12.2 Si las colonias crecen unindose sobre la membrana se informa como crecimiento
confluente con o sin presencia de coliformes y se sugiere la realizacin de otro muestreo
del mismo punto.
12.3 Si el nmero de colonias tpicas de coliformes termotolerantes fuera entre 20 y 60 pero la
placa posee ms de 200 colonias de cualquier tipo, se informa como mayor al recuento
realizado y se aconseja la realizacin de otro muestreo en ese punto.
12.4 Si el nmero de colonias tpicas es mayor a 60, el recuento se realiza siguiendo alguno de
los procedimientos que se detallan a continuacin y se informa como valor estimado.

Dividir la placa en 4 cuadrantes, contar en uno, multiplicar por cuatro.

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Termotolerantes
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Contar 10 cuadrados del filtro al azar, promediar, multiplicar por el nmero total de
cuadrados del filtro.

12.5 Si el recuento es cero, hay dos casos a considerar:

Cuando el volumen filtrado es de 100 mL, se informa <1 ufc/100 mL.

Cuando el volumen filtrado es menor 100 mL, considerar 1 ufc en el mayor volumen
filtrado, calcular la densidad de coliformes termotolerantes, y expresar los
resultados como < valor obtenido.

12.6 Si el nmero de colonia a contar es menor a 20 se suman los recuentos de todas las placas,
se divide entre la suma de los volumen filtrados, y se multiplica por 100. El resultado se
expresa como ufc/100ml. Por ejemplo si se examinan 50, 25 y 10 ml, y el conteo en dichas
placas es de 15, 6 y <1 respectivamente, el resultado es el siguiente:
25 coliformes /100mL = (15+6+0)* 100
(50+25+10)
12.7 Dejar registro en las rutas de anlisis, del intervalo de confianza al 95% que se espera para
dicho recuento de coliformes termotolerantes (ufc/100mL).

Para recuentos menores a 20 ufc/100ml, utilizar la siguiente tabla :

Limites de confianza para la determinacin de coliformes por Membrana Filtrante,
utilizando resultados expresados en ufc/100 ml de muestra. Fuente: APHA, 21ed.
N de colonias de coliformes
contadas
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

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Limites de Confianza al 95%

Lmite inferior
Lmite superior
0.0
0.1
0.2
0.6
1.0
1.6
2.2
2.8
3.4
4.0
4.7
5.4
6.2
6.9
7.7
8.4
9.2
9.9
10.7
11.5
12.2

3.7
5.6
7.2
8.8
10.2
11.7
13.1
14.4
15.8
17.1
18.4
19.7
21.0
22.3
23.5
24.8
26.0
27.2
28.4
29.6
30.8

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Coliformes
Termotolerantes
SECCION5

Para recuentos c mayores a 20 colonias, calcular el intervalo de confianza al 95%

usando la siguiente ecuacin: c 2 c
Por ejemplo, si un analista filtra 10 mL de muestra y el recuento de C. Termotolerantes en
el filtro es 60 colonias, aplicando la frmula anterior, el recuento ser 6015. Por
consiguiente el resultado final ser (6015)*10= 600150 ufc/100mL, siendo 10 el factor de
dilucin correspondiente a este ejemplo.
12.9 Interpretacin de resultados:
Al efectuarse la evaluacin de datos, se considera que un resultado ha excedido un valor
gua o estndar de calidad, cuando el lmite inferior para el intervalo de confianza de la
incertidumbre de la medicin es mayor que tal valor.
Por ejemplo, si el valor gua es de 500 ufc/100mL, un resultado de 500 50 ufc/100mL NO
excede la gua, ya que el lmite inferior (450), es menor a 500. En este ejemplo, el menor
recuento que excedera la gua es 551 50 ufc/100mL.

13 CONTROLDECALIDADANALITICO
13.1 Calidad del proceso analtico:
Control de esterilidad de los materiales empleados en el anlisis, filtrando al inicio y al final
del procesamiento de muestras, 100 mL de agua estril e incubando la placa con el filtro
bajo las mismas condiciones que las muestras. Si los controles indican contaminacin,
volver a analizar las muestras afectadas.
Control de las condiciones de incubacin cada vez que se analizan muestras (control de
temperatura de la incubadora)
Control de medios de cultivo a travs del empleo de cultivos puros de coleccin positivos y
negativos, cada vez que se analizan muestras.
Verificacin mensual del 5% de las muestras realizadas en el Sector, aislando de cada
muestra ambiental 10 colonias siguiendo el procedimiento Control de calidad analtico
para verificar coliformes termotolerantes determinados por la tcnica de filtracin por
membrana para lograr un mayor reconocimiento de colonias tpicas y no tpicas por parte
del analista , 5072UY. Cuando corresponda, ajustar el conteo basado en el porcentaje de
verificacin y expresar el resultado como coliformes termotolerantes verificados. Si no es
posible hacer las verificaciones en el momento, aislar las colonias en tripticasa soya agar
(TSA) y guardarlas en la heladera a 1- 4.4 C hasta que se puedan procesar.
13.2 Control de la precisin:
Para el control de la precisin del mtodo se debe establecer el Criterio de Precisin tal
como se detalla en el Manual de Control de Calidad Analtico. Dicho criterio debe ser
establecido para los diferentes tipos de aguas que sean analizados por la tcnica de
membrana filtrante.

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Termotolerantes
SECCION5

Al comienzo de nuevos programas de monitoreo hacer la mayor cantidad posible de

muestras por duplicado para obtener un nuevo criterio de precisin rpidamente. Una vez
que esta establecido el criterio de precisin, analizar el 10% de las muestras que ingresan
al Sector cada da por duplicado (siendo el mnimo de duplicados a realizar igual a 1), y
calcular el logaritmo de cada par de duplicados. La diferencia entre ambos no debe superar
el valor de precisin previamente establecido.
Reproducibilidad: Chequeo mensual de recuento entre analistas, aceptando como mximo
una variacin del 10%.
13.4 Repetibilidad: Chequeo mensual del recuento de un mismo analista a travs de la
duplicacin de los conteos de una misma placa, aceptando como mximo una variacin
del 5%.

14 BIBLIOGRAFIA
14.1 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water
and wastewater. 21ed. APHA, AWWA, WPCF, 2005. Mtodo N: 92222D Fecal Coliform
Membrane Filter Procedure .
14.2 WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Guidelines for safe recreational water
environments . Vol 1: Coastal and fresh waters. 2003. Genova.
14.3 DIRECTIVE 2006/7/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 15
February 2006 concerning the management of bathing water quality and repealing
Directive 767160/EEC. Official Journal of the European Union. 2006.
14.4 Poltica de la CAEAL (Canadian Association for Environmental Analytical Laboratories) para
la estimacin de la incertidumbre de la medicin en los ensayos ambientales. Anexo 3:
Incertidumbre
de
la
medicin
para
ensayos
de
microbiologa.
http://www.caeal.ca/uncertaintypolicy.html

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