Bioqumica - Electroforesis 1

Historia
El trmino electroforesis se refiere a una tcnica separativa que emplea un campo elctrico
aplicado que acta sobre partculas cargadas causando su movimiento a travs de una matriz.
El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937. Su trabajo
le vali el premio Nbel en 1948. Fue Tiselius quien desarroll el concepto de frente mvil
(moving boundary), que ms tarde se conoci como electroforesis de zona y se us para
separar protenas en solucin (1).
Entre 1940 y 1960 sobrevino un desarrollo de la electroforesis, aplicndose a diversas
molculas, desde protenas grandes hasta aminocidos e iones inorgnicos. A la electroforesis
de zona se sumaron adems el isoelectroenfoque y la isotacoforesis, basadas en diferentes
propiedades fsicas. Esto permiti realizar anlisis separados en una misma muestra o bien
realizar combinaciones de mtodos.
La distincin entre los tres mtodos tambin se da a nivel de las matrices empleadas en cada
una, que brindan ventajas comparativas dependiendo de la tcnica y de la muestra a separar.
As, se han usado geles de polmeros, papel y capilares. El papel es fcil de usar dado que no
es necesaria una preparacin previa, pero con el tiempo se ha privilegiado el uso de matrices
tipo gel. Smithies en 1955 introdujo el uso de geles de almidn (2), y dos aos ms tarde Kohn
us acetato de celulosa (3). En 1959 Ornstein y Davis (4) y Raymond y Weintraub (5) usan un
gel de poliacrilamida. Los capilares fueron introducidos por Jorgenson y Lukacs (6,7) a
principios de los 80.
Las tcnicas de deteccin han evolucionado con los aos tambin. Algunas de estas tcnicas
incluyen el teido qumico, tcnicas inmunoelectroforticas, anlisis bidimensional y varias
tcnicas de inmovilizacin en membranas.
Hoy la electroforesis se aplica principalmente al anlisis de muestras biolgicas. Es
ampliamente usada en anlisis de DNA para qumica forense y en la investigacin biolgica.

1. Tiselius, A., A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures, Trans.
Faraday. Soc., 33, 524, 1937.
2. Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of
normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.
3. Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta,
2, 297, 1957.
4. Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of
Eastman Kodak Co.), 1959.
5. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone
electrophoresis, Science, 130, 711, 1959.
6. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981.
7. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.

Principio general
La electroforesis separa partculas en base al movimiento inducido por un campo elctrico. El
campo elctrico resulta en la aplicacin de una fuerza sobre las partculas que es proporcional
a su carga o potencial de superficie. La fuerza resultante induce una velocidad diferente en las
distintas macromolculas. En otras palabras, si se aplica un campo elctrico durante un
perodo de tiempo dado a travs de una matriz que contiene una mezcla de macromolculas
con diferentes potenciales de superficie, las molculas estarn en diferentes lugares al detener
el campo.
El estudio del movimiento electrofortico se enfoca en el potencial elctrico en la superficie de
la macromolcula, y la relacin de ese potencial con la velocidad del objeto en el campo
elctrico. El potencial de superficie est causado por la interaccin de la superficie de la
molcula con el medio que la rodea. Una separacin de carga entre una capa delgada en la
superfice de la partcula y otra capa delgada en el medio alrededor de ella resulta de una
interfase entre las dos superficies. Esta separacin de carga resulta a su vez en una cierta
Bioqumica - Electroforesis 2
densidad de carga en cada capa y en consecuencia en un potencial elctrico entre capas. El
campo elctrico aplicado a la matriz acta sobre esta densidad de carga. As, las molculas de
la muestra y del solvente se movern en direcciones opuestas debido a las cargas diferentes.
Las macromolculas pueden separarse tambin en base a la carga. Esto es posible debido a
que cuanto ms grande sea una molcula mayor ser su superficie y tambin el potencial de
superficie (1,2,3).
Ambas capas delgadas, la de la macromolcula y la del solvente, son denominadas en
conjunto doble capa elctrica. Usando esta terminologa, al aplicar el campo elctrico las
porciones negativa y positiva de la doble capa de separan.
Para poder modelar matemticamente el fenmeno electrofortico, es necesario tratar esta
doble capa elctrica como un capacitor. As, la ecuacin para la diferencia de potencial a travs
de dos placas o capas puede ser expresada como:

= 4ed / D (1)

La diferencia de potencial entre dos capas es conocida como potencial zeta, de all el smbolo.
d es la distancia entre las placas en cm, e es la carga por cm2, D es la constante dielctrica del
medio entre los platos. La ecuacin para la velocidad de una partcula en un campo elctrico
toma en cuenta el balance entre las fuerzas aplicadas a una partcula por un campo elctrico y
la fuerza de friccin que se opone al movimiento:
V=E (2)
En esta ecuacin V es la velocidad, E es igual al campo elctrico en volts/cm, y se representa
por la ecuacin (3).

= [( 0 )/ ] f( a) (3)

En la ecuacin (3) es la permitividad relativa, 0 es la permitividad del espacio libre (8.854 x

10-14 C/(V cm) y es la viscosidad en g/(cm s). En la funcin f( a), a es el dimetro de
partcula en cm y la recproca de (1/ ) es el espesor de la doble capa. Con esto en mente,
f( a) es 1 cuando la partcula tiene un dimetro mucho mayor que la doble capa y 1,5 cuando
el dimetro de la partcula es muy reducido en comparacin con la doble capa. Cuando los
dimetros son casi iguales, el comportamiento es complejo (2).
En la electroforesis en capilares deben ser tenidos en cuenta otros fenmenos, en especial el
flujo electroosmtico. La electroosmsis se da cuando el fluido migra con respecto a la carga
inmovilizada, en tanto que la electroforesis se da cuando la partcula migra con respecto al
fluido. El flujo electroosmtico generalmente esta minimizado en una matriz de polmero como
un gel, pero es significativa en canales abiertos como los capilares.
Uno de los problemas ms comunes en la electroforesis es la generacin de calor debido a la
resistencia elctrica del medio. Los efectos del calentamiento son un factor limitante en las
separaciones electroforticas. Cuanto mayor sea el campo elctrico aplicado, mayor la
resolucin. para poder mantener un elevado campo elctrico, se usan medios resistivos, lo que
resulta en la generacin de calor. La frmula para la generacin de calor est dada por la
ecuacin:
W=ExI (4)
en la cual W es la fuerza en watts e I es la corriente en amperios. La corriente y el campo
elctrico estn relacionados por la conductividad del medio segn la ley de Ohm
E = I/C (5)
En esta ecuacin C es la conductividad del medio en (W cm)-1. Es decir, cuanto menos
conductividad mayor campo elctrico es necesario. Esto significa que para tener mejor
resolucin, que se logra con un campo elevado, se necesita menor conductividad.
Bioqumica - Electroforesis 3

1. Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., John Wiley &
Sons, 1994, p. 356.
2. Alan Townshend, ed., Encyclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and
Company, 1995, p. 1041.
3. Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A.

Tipos de anlisis electrofortico.

Los diferentes tipos de anlisis pueden ser distinguidos por las propiedades fsicas de la
muestra que se van a emplear para su separacin o por el tipo de matriz usada. Los cuatro
tipos bsicos que se fundamentan en diferentes propiedades fsicas son: lmite mvil (moving
boundary), zona, isoelectroenfoque e isotacoforesis.

Lmite mvil (Moving Boundary)

Fue primeramente propuesta por Picton y Linde en 1892, pero fue completamente desarrollada
por Tiselius en 1930 (1). En este mtodo la muestra se coloca en una solucin buffer en un
tubo con forma de U. Se aplica un campo elctrico por medio de electrodos sumergidos en
cada extremo del tubo. Las partculas de la muestra pueden entonces migrar en relacin al
campo elctrico. Este mtodo usa solamente la carga de la partcula y el potencial z resultante
cuando la muestra se encuentra en contacto con el buffer. La direccin y velocidad de
migracin est determinada por la movilidad electrofortica de cada componente. Una
desventaja de este mtodo es que la mayora de los componentes no se separan limpiamente
sino que se superponen. Slo los componentes ms rpidos y los ms lentos pueden ser
parcialmente purificados. Otra desventaja es que los llamados lmites mviles de los
componentes de la mezcla no son visibles al ojo humano y se necesita de un buen equipo
ptico para la deteccin. Por esta razn esta tcnica ha cado en desuso.

Electroforesis de zona

Esta es la forma ms practicada de electroforesis. Este mtodo es parecido al de lmite de

movilidad dado que cada componente migra de acuerdo con su propia movilidad. La gran
diferencia es que se realiza sobre un medio soporte para lograr la completa separacin de cada
componente. Otra de las diferencias es que la muestra es aplicada en una banda angosta o
zona. En la electroforesis de lmite mvil los componentes tienden a mezclarse debido a
conveccin causada por gradientes de densidad o temperatura o por vibraciones mecnicas. A
travs del uso de soportes estos problemas son minimizados. Los medios ms comunes son
geles, papel o capilares.
En la electroforesis de zona los componentes son aplicados en una banda angosta rodeada por
buffer. Se aplica un campo elctrico y cada banda migra con una velocidad caracterstica
determinada por su movilidad electrofortica. Cada componente se separa de su vecino para
formar una zona pura. Las zonas puras se estabilizan por medio del soporte, que previene el
mezclado debido a corrientes de conveccin. Es un buen mtodo separativo dado que
efectivamente asla los componentes de la mezcla. Combinado con el uso de estndares
puede ser tan valioso como algunos tipos de cromatografa. El uso de un soporte poroso con
caractersticas de filtro permite la separacin debido a otra propiedad fsica, el tamao.
Los medios pueden estar contenidos dentro de un tubo o entre dos placas de vidrio. Los
extremos del tubo o de las placas se sumergen en un buffer apropiado y luego se aplica el
campo elctrico para comenzar el proceso separativo. este mtodo da una rpida idea de la
cantidad de componentes que tiene una mezcla biolgica.

Isoelectroenfoque
Bioqumica - Electroforesis 4
El isoelectroenfoque separa componentes usando un gradiente de pH. El gradiente va desde
un pH bajo en el nodo hasta un pH alto en el ctodo. Cuando se aplica un campo elctrico la
muestra migra segn su carga hasta que encuentra un pH igual a su punto isoelctrico, donde
la carga neta es 0 y en consecuencia se detiene. Cuando todos los componentes se detienen
se llega a un estado estacionario. Se usan geles como soporte, lo que minimiza la difusin una
vez que se llega al estado estacionario y el campo elctrico es eliminado. La clave del mtodo
es lograr un buen gradiente de pH. Se utilizan anfolitos cuyos pI rodean el rango de pH
deseado, p. ej. de 5 a 7. Se utilizan molculas anfotricas sintticas en mezclas complejas.
Estas molculas migran al aplicarse un campo elctrico hasta su pI, creando un gradiente de
pH. Los anfolitos pueden ser inmovilizados en el gel dando an mayor resolucin al mtodo. el
aparato es el mismo que se describiera para electroforesis de zona. el poder resolutivo del
mtodo es muy elevado, permitiendo la separacin de sustancias que difieran en su pI en
0,001 unidades de pH. Es un mtodo que lleva bastante tiempo, dado que cuanto ms se
acercan los componentes a su pI ms lentamente migran (poseen menos carga). La aplicacin
de voltajes elevados durante largo tiempo requiere refrigeracin
Referencias
Alan Townshend, ed., Encyclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and Company,
1995, p. 1041.
Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., John Wiley & Sons,
1994, p. 356.
Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A.
Bioqumica - Electroforesis 5
Soportes

Agarosa
Los geles de agarosa diluidos son bastante rgidos y fciles de manejar. Su tamao de malla
alto hacen que se empleen para separar macromolculas grandes como protenas o DNA. Los
geles de poliacrilamida sirven para separar ac. nucleicos de 25 a 2000 bp mientras que los
geles de agarosa pueden separar fragmentos hasta 10 veces ms grandes. As, se pueden
separar DNAs de tamao desde 1 Kbp a 20 kbp.

El agar se asla de algas rojas del

gnero Rhodophycae y consiste en dos
componentes, agarosa y agaropectina.
La agarosa es apropiada para
electroforesis porque es prcticamente
neutra. La cadena se compone de
residuos alternantes de D-galactosa y
3,6-anhidro-L-galactosa, con cadenas
laterales de 6-metil-D-galactosa. La
agarosa adopta una estructura tridimensional de doble hlice cuya cavidad central es
suficientemente grande como para acomodar agua (hasta un 99.5%). Estas cadenas forman un
gel estable usado como matriz. Al preparar el gel, la agarosa y el buffer se calientan hasta
disolver la agarosa. La solucin se vuelca en un contenedor hasta que se enfra y se gelifica.
Luego de cargada la muestra el gel entero se sumerge en una solucin buffer y se aplica un
campo elctrico para realizar la corrida.

enfriado

En solucin Preformado del gel Agarosa gelificada

Generalmente se usa agarosa al 0.5% a 2% (p/v). La agarosa es muy fcil de trabajar porque
no necesita de un entrecruzante u otros agregados para formar la matriz y es barata. La
electroforesis en agarosa se puede combinar con la transferencia de Southern, PCR, y
fluorescencia.
La introduccin de estndares de peso molecular en calles adjuntas a la muestra permite la
estimacin del tamao de los cidos nucleicos separados.
Bioqumica - Electroforesis 6

Armado del gel de agarosa

Volcado de la agarosa fundidad

Insercin del peine: formacin del pocillo

donde se siembra la muestra

Gel listo para sembrar y correr

Esquema de la separacin de una Fotografa de una mezcla de ADN

mezcla de ADN en un gel de separada en un gel de agarosa. A la
agarosa derecha el tamao de los marcadores
de masa.
+
Polo negativo
(nodo)
ADN grande

ADN pequeo

Polo positivo
(ctodo)

-
Bioqumica - Electroforesis 7
Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

Estos geles separan la mayora de protenas y oligonucletidos de peso menor a aprox. 200
kDa. Estn formados por monmeros de acrilamida (CH2=CHCONH2) polimerizados en largas
cadenas por un reactivo entrecruzante (crosslinker) que mantiene la estructura estable. El ms
comn es la N,N'-metilenbisacrilamida[(CH2CHCONH)2CH2]. Otros reactivos tiles a este fin
son el etilendiacrilato y N,N'-dialiltartardiamida (DATD).
El entrecruzamiento del monmero de acrilamida con el comonmero es lo que determina el
tamao de poro de la matriz, a travs del ajuste del porcentaje de ste en el gel. La
composicin del gel puede ser expresada de dos maneras: %T y %T,%C. %T es el porcentaje
en peso de monmero total, acrilamida ms el entrecruzante. Un gel al 15% tendr 15% p/v de
acrilamida ms bisacrilamida. Cuanto mayor el porcentaje, menor el tamao de poro. %T,%C
es una manera de expresar en porcentaje de entrecruzante en relacin con el %T. 15%T,
5%Cbis significa que hay un 15% p/v acrilamida ms bisacrilamida, y que la bisacrilamida es el
5% del peso total de acrilamida presente. Hay entonces dos maneras de controlar el tamao de
poro, variando %T o %C. Para cualquier %T, un 5% de entrecruzamiento da el menor tamao
de poro.
A diferencia de la agarosa, los geles de poliacrilamida requieren aditivos para ayudar a
polimerizar el gel. El persulfato de amonio es un iniciador, y el tetrametilendiamina (TEMED) es
el catalizador de la reaccin. El TEMED causa que el persulfato de amonio produzca radicales
libres que a su vez causan la polimerizacin. La mezcla debera ser desgaseada dado que el
O2 interfiere con la reaccin.

Cuanto mayor sea el tamao de poro, menor resistencia al avance encontrarn las molculas,
para un mismo tamao de poro, entonces, migrarn ms rpido aquellas molculas ms
pequeas y/o las ms cargadas. es decir, la velocidad de movimiento depende de la relacin
carga/masa (q/m). El tipo de gel descripto en las figuras anteriores corresponde al tipo
discontinuo, en el que existen dos tipos de geles, el de concentracin y el de separacin. El gel
Bioqumica - Electroforesis 8
de concentracin es un gel de malla
abierta, que tiene como finalidad
concentrar la muestra en una banda
angosta antes de que entre en el gel
de separacin. As, el ancho de cada
banda se mantiene en un mnimo y se
optimiza la separacin.
Los geles de poliacrilamida pueden
realizarse en condiciones tales que se
conserve la estructura nativa de las
protenas, denominados geles nativos
o no desnaturalizantes; o en
condiciones desnaturalizantes. en cuyo caso se conoce
como geles con SDS o SDS-PAGE, en alusin al detergente
usado como agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de
sodio. Las diferencias son importantes. En un gel no
desnaturalizante se puede observar a una protena migrando
con su forma nativa y es importante cuando luego se van a
hacer ensayos de actividad en el mismo gel o luego de eluir
a la protena que se ha purificado del gel. En ocasiones este
mtodo puede ser
usado con fines preparativos cuando no existen otros
recursos para purificar la protena. tambin se puede
estimar la masa nativa de la protena, pero es un proceso
largo y trabajoso que bien puede ser sustituido por
tcnicas cromatogrficas. Por otra parte, no puede
usarse a menos que todos las protenas posean una
relacin q/m ms o menos parecida. En caso de ser
necesario usar PAGE, se debe correr la muestra junto a
patrones de masa conocida como referencia y esto debe

ser hecho a varias concentraciones de poliacrilamida, lo

que implica correr otros tantos geles. Luego se grafica el
log de Rf de cada estndar contra el porcentaje del gel
obteniendo una pendiente para cada protena de peso
conocido. El Rf, o relacin de frente, es la relacin entre
el camino recorrido por la molcula y el frente de solvente
o un soluto (normalmente coloreado para una mejor
visualizacin) de muy bajo peso molecular. El tamao de
la protena se conoce extrapolando el valor obtenido para
la pendiente de la misma en el grfico B.
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200 22

20
180 A B
18
Ferritina (pend = -18.6)
160 16

14
140
12
Log Rf

-Pendiente
Ovotransferrina (pend = -7.2) 10
120

8
100
6

80 4
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 100 200 300 400 500 600

Gel (%) Masa molec (kDa)

La electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) es una de las

tcnicas ms usadas en el laboratorio moderno. El SDS se une a las protenas a razn de dos
molculas por aminocido, desplegando la cadena y confirindole una carga negativa que
aumenta proporcionalmente al largo (peso molecular) de la cadena polipeptdica. de esta
manera, la migracin depende ya no de la relacin q/m sino slo de la masa, y esta tcnica
puede as ser usada ventajosamente para determinar tamaos moleculares de polipptidos.
resulta necesario adems reducir los puentes disulfuro de las protenas a fin de lograr el
desplegado toral de la cadena. Nuevamente, una vez corrido y teido el gel se determina la
posicin en el gel de cada banda de las protenas estndar, de la muestra en cuestin y se
calcula el Rf. Finalmente, se grafica el log del peso molecular versus el Rf de cada estndar y
por extrapolacin se obtiene el tamao de la protena desconocida.

Origen
PM estndar Rf
116 0.34
110
97.4 0.38 89
100
90
80
116 66 0.46 68 70
97,4 60

66 48.5 0.56 50

48,5 29 0.69 40

30

29
Bandas 20

desconocidas
a 0.40 10
0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Frente b 0.47

Electroforesis en papel

El papel fue uno de los primeros soportes usados en electroforesis. En contraste con los geles,
el papel (p. ej. Whatman 3MM (0.3mm) y Whatman No. 1 (0.17 mm) no requiere preparacin. El
papel tampoco tiene cargas que interfieran con la separacin de las muestras. La muestra se
aplica directamente al papel. En cada extremo hay una solucin buffer a la que se aplica el
campo elctrico. Se pueden aplicar adems molculas patrn y pigmentos marcadores para
controlar la migracin de las muestras. Los mejores resultados se obtienen cuando la direccin
de movimiento de las muestras es paralela al eje de las fibras del papel. El voltaje aplicado es
mayor que en el caso de los geles de acrilamida dado que la resistencia del papel es mayor.
una desventaja es que el tamao de poro no puede ser fcilmente controlado como en el caso
de los geles, y la tcnica es poco sensible y difcil de reproducir.
Bioqumica - Electroforesis 10

Electroforesis capilar

Se emplean tubos capilares de vidrio rellenos con buffer o gel. Los capilares son un medio
apropiado ya que poseen una gran relacin de superficie a volumen que permite el uso de
elevados voltajes sin tanto calentamiento como en el caso de las matrices de gel. Sin embargo,
debido al tamao de los geles existen problemas con la cantidad de muestra a aplicar y los
lmites de deteccin.
En un capilar de 1 mm de dimetro interno, la capacidad es de 0.03 ml/cm de largo de capilar,
y se carga aproximadamente entre 1/100 a 1/1000 de volumen de muestra. Se han diseado
detectores en lnea que detectan cantidades muy pequeas a medida que la muestra va
corriendo en el gel. Estos detectores emplean conductividad, efectos de Doppler basados en
lser, o lsers que detectan absorbancia o fluorescencia.
La completa eliminacin de la muestra luego de la corrida es un problema en esta
electroforesis. Algunos capilares estn recubiertos en su superficie interna y otros estn llenos
de gel. Debido a su costo, no son descartables y en consecuencia toda la muestra debe ser
eliminada del capilar luego de la corrida. Esto puede ser un problema severo en capilares que
a veces miden hasta 100 cm de longitud y en los que a veces la muestra puede resultar
adsorbida en la superficie interna. El recubrimiento de las superficie con pelculas especiales
ayuda a resolver este problema al aumentar la velocidad de electroosmosis a lo largo de las
paredes con lo que el tubo se limpia ms fcilmente.

La electroforesis capilar se
est volviendo una tcnica
ampliamente usada. Las
separaciones son rpidas,
se realizan a alto voltaje y
requieren una
automatizacin mnima.
Esta matriz es ventajosa
adems porque evita los
efectos de calentamiento
que pueden ocurrir en geles
y porque los datos estn en
forma de un registro, un
perfil en papel en vez de en
un gel teido. En la figura adjunta se muestra esquemticamente el diseo bsico de la
electroforesis capilar. La muestra se aplica en un extremo del tubo y la aplicacin de voltaje
causa la migracin de las molculas, que al ir pasando por un detector envan una seal que se
registra en un trazo luego de ser procesada.

Anlisis del gel

Luego de separar una muestra por electroforesis, los compnentes son usualmente invisibles a
simple vista. Se requiere entonces el empleo de tcnicas de teido con colorantes o
autoradiografa para cuantificar los componentes. tambin se puede realizar densitometra o
transferencia a una membrana.
Teido
La tincin de protenas puede realizarse con diferentes reactivos: negro amido (Amido Black),
azul brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue), rojo Ponceau o teido con plata. El
negro amido y el rojo Ponceau interaccionan con protenas a las que se pueda acceder
fcilmente, como aquellas que han sido transferidas a una membrana de nitrocelulosa. El azul
de Coomassie y la tincin con plata son ampliamente usados por su reaccin con una amplia
gama de protenas y su alta sensibilidad, mucho mayor que el negro amido (5 veces ms para
Bioqumica - Electroforesis 11
Coomassie). La tincin con plata es hasta 100 veces ms sensible que la tincin de
Coomassie, pero es un mtodo ms laborioso, requiere cuidados especiales y se usa slo
cuando se requiere un tratamiento especial o la concentracin de protena es muy baja.
Luego del teido, las bandas pueden ser cuantificadas por densitometra. Se digitaliza la
imagen del gel o se fotografa y luego se analiza con un densitmetro y se procesan los datos
con programas especiales.
La autoradiografa es otra tcnica que utiliza la densitometra para cuantificar el contenido de
protena o c. nucleicos. Las muestras radiactivas son corridas en el gel. Luego el gel es
secado y puesto en contacto con una pelcula de rayos X. Las bandas radiactivas velan las
porciones de pelcula en contacto con ellas y as el patrn de bandas es visible luego del
revelado.

Transferencia (Blotting)

En las transferencias, las protenas o c. nucleicos son transferidos a una membrana. La

transferencia puede ser realizada mediante la aplicacin de un campo elctrico o por difusin
con un buffer.
Estructura bsica de una transferencia de Western
Western blotting. En el caso
de protenas, se usan
membranas de nitrocelulosa
(NC) o poliviniliden
difluoruro (PVDF). La
transferencia se hace
poniendo en contacto el gel
con la membrana y
estableciendo luego un
campo elctrico que haga
migrar la protena hacia la
membrana. Las protenas Soporte plstico
quedan as expuestas en la
superficie de la membrana, Panel de
a la que se adsorben muy fibr a Papel
de filtr o
fuertemente. De esta Papel Soporte plstico
manera se puede hacer uso Membr ana de de filtr o
de molculas grandes para nitr ocelulosa Panel de
revelar su presencia, como Gel fibr a o esponja
rgida
anticuerpos. La membrana
Armado del sandwich de transferencia
se incuba con los anticuerpos y la
presencia de estos en lugares
especficos de la membrana se revela
por diversas tcnicas. Por ejemplo, se nitrocelulosa

pueden utilizar anticuerpos secundarios, fibra

que reaccionan con los primarios, y que

buffer
llevan unidas enzimas o protenas que soporte plstico se
utilizan en la deteccin final (por
quimioluminiscencia, fluorescencia o densitometra). Esta tcnica permite detectar protenas
presentes en baja cantidad en una muestra compleja. Puede hacerse cuantitativa y de esa
manera permite estimar el nivel de esa protena in vivo.
Bioqumica - Electroforesis 12

Armado final del

equipo de
transferencia
-
6
+
7

1. Soporte plstico 2. Membrana 3. Gel 4. Fibra 5. Cuba 6. Electrodos 7. Sandwich armado

en su lugar 8. Alambre de platino del nodo (existe otro en el lado opuesto, no visible
en esta figura)
Bioqumica - Electroforesis 13

Western blotting - Revelado

Producto coloreado
Sustrato incoloro insoluble
-P
-P

-P Pi
-P -P

Molcula conjugada
Anticuerpo 2rio

Anticuerpo 1rio
Membrana
Protena

Anticuerpo primario: generado en conejo (IgG) contra la protena de inters

Anticuerpo secundario: generado en cabra contra IgG de conejo
Molcula conjugada: fosfatasa alcalina. En el ejemplo mostrado hidroliza un sustrato
incoloro fosforilado, que al defosforilarse produce una molcula insoluble coloreada
que precipita sobre la membrana en el lugar en que se encuentra la protena de inters.
Podra ser otra enzima que acte sobre otro tipo de sustrato o directamente podra llevar
la seal sobre s, por ejemplo un compuesto fluorescente.

Western blotting

Gel de policrilamida con Membrana con las protenas electro-

varias bandas de protena transferidas y reveladas con un
anticuerpo especfico contra una de ellas

Southern blotting. En la tcnica de Southern, la membrana que contiene un ADN transferido se

incuba con RNA o DNA complementario al ADN de inters. La tcnica de Northern (Northern
blotting) es similar excepto que la molcula transferida es RNA. La transferencia se realiza
luego de separar la muestra que contiene el DNA por electroforesis, poniendo luego en
contacto el gel con la membrana y estableciendo una corriente de buffer a travs del gel y
hacia la membrana que arrastra al ac. nucleico y lo deposita sobre la membrana.
Bioqumica - Electroforesis 14

Membrana
transferida Autoradiografa
Membrana
Gel
Papel de filtro
Hibridizacin

Solucin alcalina

PAGE

La deteccin se realiza por hibridizacin con un fragmento de DNA complementario, es decir

que contiene la secuencia complementaria que le permite establecer interacciones tipo Watson
y Crick. Este fragmento llamado sonda puede ser ms corto que el DNA a detectar y puede
estra marcado de diversas maneras de forma de facilotar la deteccin. Puede contener
nucletidos marcados radiactivamente, con lo cual ser necesario realizar una autoradiografa
(en el caso de la figura que se presenta como ejemplo), o poseer otro tipo de marca, como un
fluorforo (grupo fluorescente) o una enzima.
Bioqumica - Electroforesis 15
Enzima o
fluorforo

Sonda
marcada

DNA
transferido

Membrana

Enzima o
fluorforo

Sonda
marcada
DNA
Hibridizacin
transferido

Membrana

Sustrato Producto

SEAL

Luz Fluorescencia
Sonda
marcada
DNA Revelado
transferido

Membrana